CN113854280B

CN113854280B - 一种低温保存液及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN113854280B
Application number: CN202111036115.2A
Authority: CN
Inventors: 邱培; 朱宇; 廖传荣; 黄敏
Original assignee: Accurate International Biotechnology Guangzhou Co ltd
Current assignee: Accurate International Biotechnology Guangzhou Co ltd
Priority date: 2021-09-06
Filing date: 2021-09-06
Publication date: 2022-05-31
Anticipated expiration: 2041-09-06
Also published as: CN113854280A

Abstract

本发明提供一种新型的低温保存液及其制备方法和应用，所述低温保存液按照终浓度组成包括：FBS，30‑70％；Cultrex UltiMatrix RGF BME，5‑15％；海藻糖，1‑5g/L；羟乙基淀粉，10‑30g/L；LB‑100，0.1‑5μM；RGFP109，10‑100nM；Cynarin，10‑100μM；以上成分均溶于基础培养基中，调节pH到6.5‑7.6范围内，以上百分浓度为体积分数。该低温保存液应用在生物样本低温保存，与已知低温保护剂相比，能够更好的保护细胞避免冰晶及渗透压的损伤，减少长时间低温保存引起线粒体损伤、内质网应激而造成的细胞凋亡，同时最大程度保持细胞内生物大分子的稳定性。

Description

一种低温保存液及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物样本保存技术领域，具体涉及一种新型的低温保存液及其制备方法和应用。

背景技术

在精准医疗的时代背景下，生物样本已经广泛应用于治疗肿瘤、免疫系统疾病、糖尿病以及新药研发等生物医学领域。脐带血、精子卵子和干细胞等样本需要在长时间保存和复温后的活性和功能不受影响，才能在临床治疗中使用。新兴发展的干细胞治疗、基因治疗和免疫治疗等生物治疗手段，也需要高质量的生物样本作为基础。作为保存生物样本生物信息、临床数据以应用于生物医学研究的科研手段，优质的保存技术应防止生物样本在保存期间产生变异，影响后科研及应用的可靠性。

低温环境能长期保护样本中生物大分子的信息完整性，维持细胞和组织活性，为医学科学研究提供保障。低温保存法主要含缓慢降温及低温保存两个步骤，容易导致细胞外冰晶的形成。由于细胞外形成冰晶，导致胞外溶质浓度升高，为重新恢复渗透压的平衡，渗透浓度梯度驱动细胞内液穿过半透膜，在降温速率缓慢的情况下，细胞体积收缩、胞内脱水，产生溶质性损伤；在降温速率较快的情况下，易造成细胞内冰晶的形成。而在复温过程中，由于胞外冰晶融化使水分渗入细胞内，会使细胞内出现再结晶的现象，最终对细胞造成损伤。所以，低温保存的损伤主要来自溶质性损伤和冰晶损伤，这两个问题的解决办法是使用低温保护剂，并采用合适的冷却和复温速率。

传统的低温保护剂分为渗透性和非渗透性两大类。渗透性保护剂包括DMSO、乙二醇、丙二醇、丙三醇、甲酰胺和乙酰胺等多元醇类；非渗透性保护剂主要包括单糖、双糖、多糖类以及聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮等高分子化合物。渗透性保护剂可以渗透进细胞膜内，与胞内水分发生水合作用，增加溶液的黏性，抑制水的结晶过程，达到保护的目的。同时，渗透性保护剂在降温过程中减小了细胞脱水引起的皱缩，非渗透性保护剂通常溶于水，但不能穿过细胞膜，主要与渗透性保护剂配合使用促使细胞脱水，并中和渗透性保护剂的细胞毒性；复温时，提供一个高渗环境，防止水分子进入细胞太快而引起膨胀死亡。但低温保护剂会在其冰点温度附近时产生细胞毒性，而亲油性低温保护剂通常也具有细胞毒性，严重影响生物样本冻存复苏后的活性，同时造成样本及试剂的浪费。

除此之外，目前的低温保存技术尚存在诸多问题需要解决：1)由于RNA与蛋白质的不稳定性，长时间保存可能带来不同程度的降解；2)添加低温保护剂保存可以使细胞保持活性，但是由于冰晶损伤、渗透压损伤及保护剂等外来物质的添加，不可避免会给细胞带来一定程度的损伤；3)低温对细胞、组织形态结构及功能的影响；4)低温对DNA、RNA和蛋白等生物大分子的影响。因此研究针对生物样本中细胞、组织的低温保存技术具有重要意义。

发明内容

针对现有技术存在的问题和缺陷，本发明提供一种新型的低温保存液及其制备方法和应用。本发明的技术方案为：

第一方面，本发明提供一种新型的低温保存液，按照终浓度组成包括：FBS， 30-70％；Cultrex UltiMatrix RGF BME，5-15％；海藻糖，1-5g/L；羟乙基淀粉， 10-30g/L；LB-100，0.1-5μM；RGFP109，10-100nM；Cynarin，10-100μM；以上成分均溶于基础培养基中，调节pH到6.5-7.6范围内，以上百分浓度为体积分数。

可选地，所述低温保存液还包括：4-羟乙基哌嗪乙磺酸，10-50mM；诺氟沙星，1-5mg/L；维生素E，150-250μg/L中的至少一种。

优选地，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。

第二方面，本发明提供上述低温保存液的制备方法，包括：按照低温保存液的组成配料；先采用基础培养基溶解海藻糖和羟乙基淀粉，然后依次将LB-100、 RGFP109、Cynarin加入该混合溶液中，最后将FBS、Cultrex UltiMatrix RGF BME 与该溶液混合均匀，调节pH到6.5-7.6范围内，过滤，即得。

进一步地，当所述低温保存液还包括：4-羟乙基哌嗪乙磺酸，10-50mM；诺氟沙星，1-5mg/L；维生素E，150-250μg/L中的至少一种，所述制备方法还包括：在最后将FBS、Cultrex UltiMatrix RGF BME与该溶液混合均匀的步骤中，进一步加入4-羟乙基哌嗪乙磺酸、诺氟沙星、维生素E混合均匀。

进一步地，所述低温保存液采用氢氧化钠溶液调节pH值。

进一步地，所述低温保存液于2～8℃条件下冷藏备用。

第二方面，本发明提供上述低温保存液在生物样本低温保存中的应用。

进一步地，所述应用的具体方法包括：将生物样本处理后悬浮于所述低温保存液并分装至冻存管中；采用梯度降温程序将冻存管降温后放入液氮中，在 -196℃中保存。

优选地，所述梯度降温程序从0℃开始，以-1℃/min速率降至-80℃，然后于-80℃平衡20～30min。

进一步地，所述生物样本包括组织、细胞或者类器官。

进一步地，将所述生物样本处理为0.1×0.1×0.1cm³～5×5×5cm³体积大小或者(1-10)×10⁶个/ml细胞。

本发明提供了一种新型的低温保存液，是一种生物样本低温保护剂，与已知低温保护剂相比，能够更好的保护细胞避免冰晶及渗透压的损伤，减少长时间低温保存引起线粒体损伤、内质网应激而造成的细胞凋亡，同时最大程度保持细胞内生物大分子的稳定性。本发明低温保存液特点总结如下：

1)本发明低温保存液与已知低温保护剂相比，能够更好的保护细胞避免冰晶及渗透压的损伤，同时无明显的生物毒性；

2)本发明低温保存液通过多种成分的合理调配，能够减少长时间低温保存引起线粒体损伤、内质网应激等造成的细胞凋亡，提高复苏成功率；还可以增加体系内抗氧化能力，抑制细胞凋亡，增加复苏后组织细胞的活性；

3)本发明低温保存液能够最大程度保持细胞内生物大分子的稳定性。

附图说明

图1为本发明实施例8培养的肺癌类器官培养光镜图，其中，图(a)为冻存前，图(b)为冻存复苏后。

图2为本发明实施例9和对比例3的基因表达检测结果。

图3为本发明实施例11培养的小鼠肠类器官培养光镜图，其中，图(a)为冻存前，图(b)为冻存复苏后。

图4为本发明实施例12基因表达检测结果。

图5为本发明对比例2培养的肺癌类器官培养光镜图。

具体实施方式

在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

实施例1

肠癌组织的冻存

本实施例提供一种肠癌组织的低温保存液及保存方法，所涉及的低温保存液组成如下：FBS，40％；Cultrex UltiMatrix RGF BME，7.5％；海藻糖，2g/L；羟乙基淀粉，20g/L；LB-100，0.5μM；RGFP109，20nM；Cynarin，40μM；以上成分均溶于DMEM/F12培养基中，溶解混匀后用NaOH调pH至7.4，以上百分浓度为体积分数。保存方法如下：

1)将肠癌组织用手术剪刀剪碎为0.2×0.2×0.2cm³的小块。

2)将剪碎的组织转移至冻存管后，加入1-2ml上述保存液浸没组织。

3)采用梯度降温程序将冻存管降温后放入液氮中，在-196℃中保存；梯度降温程序从0℃开始，以-1℃/min速率降至-80℃，然后于-80℃平衡30min。

实施例2

肺癌类器官的冻存

本实施例提供一种肺癌类器官的低温保存液及保存方法，所涉及的低温保存液组成如下：FBS，50％；Cultrex UltiMatrix RGF BME，5％；海藻糖，1.2g /L；羟乙基淀粉，10g/L；LB-100，1μM；RGFP109，50nM；Cynarin，20μM； 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，40mM；以上成分均溶于DMEM/F12培养基中，溶解混匀后用NaOH调pH至6.8，以上百分浓度为体积分数。保存方法如下：

1)取1-2ml细胞回收液消化含肺癌类器官的胶滴，37℃，3-10min，将胶滴吹散。

2)加入10ml无菌Hank’s平衡盐溶液，离心，1000rpm，3min。

3)弃去上清液，加入1ml本发明保存液，转移至冻存管中。

4)采用梯度降温程序将冻存管降温后，放入液氮中保存，梯度降温程序同实施例1。

实施例3

卵巢癌细胞SK-OV-3的冻存

本实施例提供一种卵巢癌细胞的低温保存液及保存方法，所涉及的低温保存液组成如下：FBS，60％；Cultrex UltiMatrix RGF BME，5％；海藻糖，2.5g /L；羟乙基淀粉，15g/L；LB-100，4μM；RGFP109，60nM；Cynarin，50μM；诺氟沙星，1.5mg/L；以上成分均溶于DMEM/F12培养基中，溶解混匀后用 NaOH调pH至7.0，以上百分浓度为体积分数。保存方法如下：

1)取1-2ml胰酶消化含卵巢癌细胞SK-OV-3，消化2-5分钟至细胞分散。

2)加入5ml 1640培养基，离心，1000rpm，3min。

3)弃去上清液，加入1ml本发明保存液，转移至冻存管中。

实施例4

小鼠肝脏组织的冻存

本实施例提供一种小鼠肝脏组织的低温保存液及保存方法，所涉及的低温保存液组成如下：FBS，30％；Cultrex UltiMatrix RGF BME，10％；海藻糖，5g /L；羟乙基淀粉，25g/L；LB-100，2μM；RGFP109，10nM；Cynarin，20μM；以上成分均溶于DMEM/F12培养基中，溶解混匀后用NaOH调pH至7.4，以上百分浓度为体积分数。保存方法如下：

1)将小鼠肝脏组织用手术剪刀剪碎为0.5×0.5×0.5cm³的小块。

2)将剪碎的组织转移至冻存管后，加入1-2ml本发明保存液浸没组织。

3)采用梯度降温程序将冻存管降温后，放入液氮中保存，梯度降温程序同实施例1。

实施例5

小鼠肠类器官的冻存

本实施例提供一种小鼠肠类器官的低温保存液及保存方法，所涉及的低温保存液组成如下：FBS，70％；Cultrex UltiMatrix RGF BME，12％；海藻糖，1.5 g/L；羟乙基淀粉，15g/L；LB-100，2.5μM；RGFP109，20nM；Cynarin，40 μM；4-羟乙基哌嗪乙磺酸，20mM；诺氟沙星，4mg/L；维生素E，200μg/L；以上成分均溶于DMEM/F12培养基中，溶解混匀后用NaOH调pH至7.2，以上百分浓度为体积分数。保存方法如下：

1)取1-2ml细胞回收液消化含小鼠肠类器官的胶滴，37℃，3-10min，将胶滴吹散。

2)加入10ml无菌Hank’s平衡盐溶液，离心，1000rpm，3min。

3)弃去上清液，加入1ml本发明保存液，转移至冻存管中。

实施例6

细胞株A2780的冻存

本实施例提供一种细胞的低温保存液及保存方法，所涉及的低温保存液组成如下：FBS，35％；Cultrex UltiMatrix RGF BME，15％；海藻糖，1.0g/L；羟乙基淀粉，30g/L；LB-100，2μM；RGFP109，100nM；Cynarin，80μM；维生素E，180μg/L；以上成分均溶于DMEM/F12培养基中，溶解混匀后用NaOH 调pH至7.0，以上百分浓度为体积分数。保存方法如下：

1)取1-2ml胰酶消化含细胞株A2780，消化2-5分钟至细胞分散。

2)加入5ml 1640培养基，离心，1000rpm，3min。

3)弃去上清液，加入1ml本发明保存液，转移至冻存管中。

4)采用梯度降温程序将冻存管降温后，放入液氮中保存。

实施例7

实施例1的肠癌组织解冻后细胞活性检测

实施例1的肠癌组织保存1个月后，按照下述方法进行解冻及活性检测：

1)将冻存管从液氮中取出，然后直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。

2)从37℃水浴中取出冻存管，1000rpm离心3min，弃去上清。

3)加入2mg/ml IV型胶原酶500ul，37℃消化30min。

4)加入DMEM/F12培养基5ml终止消化，1000rpm离心3min，吸弃上清保留至500ul左右。

5)重悬细胞并通过细胞计数仪统计单位重量的组织收获的细胞数及活率。

最终冻存前后单位重量的组织收获的细胞数及活率如表1所示：

表1肠癌组织解冻后细胞数及活率

分组	细胞总量	活细胞比例
			冻存前	6.23×10<sup>7</sup>	79.27％
本发明冻存后	5.46×10<sup>7</sup>	77.84％
			对比例1冻存后	6.12×10<sup>7</sup>	25.26％

实施例8

实施例2的肺癌类器官的冻存复苏及培养

实施例2的肺癌类器官保存2个月后，按照下述方法进行复苏及培养：

1.取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。

2.从37℃水浴中取出冻存管，移至生物安全柜，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上肺癌培养液，混匀。

3. 1000rpm离心3min。

4.弃去上清液，加入120μl肺癌类器官培养液重悬类器官，加入150μl Matrigel混匀，滴至35mm培养皿，静置5min，移入培养箱，倒置，40min后，补2-4ml肺癌类器官培养液，37℃培养箱静置培养。

5.次日更换一次培养液，继续培养6天后，可得肺癌类器官如图1所示，结构形态与冻存前类似，活性良好。

实施例9

实施例3的卵巢癌细胞SK-OV-3复苏后培养及活性检测

实施例3的SK-OV-3细胞保存40天后，按照下述方法进行复苏及活性检测：

2.从37℃水浴中取出冻存管，移至生物安全柜，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上1640培养基，混匀。

3. 1000rpm离心3min。

4.弃去上清液，加入120μl 1640培养基(含10％血清)重悬细胞，转移至细胞培养瓶，37℃培养箱静置培养。

5.次日更换一次培养液，继续培养3天后，使用胰酶消化2-5min收获细胞。

6.将细胞提取RNA并进行qPCR基因表达检测，结果如图2所示。如图2 所示，从结果可以看出，冻存前后细胞基因表达特性基本相同，说明用本发明冻存液保存后的细胞维持了原细胞的基因表达特性。

实施例10

实施例4的小鼠肝脏组织解冻后类器官培养

实施例4的小鼠肝脏组织保存1个月后，按照下述方法进行解冻及活性检测：

2)从37℃水浴中取出冻存管，1000rpm离心3min，弃去上清。

3)加入2mg/ml IV型胶原酶500ul，37℃消化30min。

最终冻存前后单位重量的组织收获的细胞数及活率如表2所示：

表2小鼠肝脏组织解冻后细胞数及活率

分组	细胞总量	活细胞比例
			冻存前	8.94×10<sup>7</sup>	93.75％
冻存后	7.58×10<sup>7</sup>	90.37％

实施例11

实施例5的小鼠肠类器官的复苏后及培养

实施例5的小鼠肠类器官保存2个月后，按照下述方法进行复苏及培养：

3. 1000rpm离心3min。

4.弃去上清液，加入120μl小鼠肠类器官培养液重悬类器官，加入150μ lMatrigel混匀，滴至35mm培养皿，静置5min，移入培养箱，倒置，40min 后，补2-4ml肺癌类器官培养液，37℃培养箱静置培养。

5.次日更换一次培养液，继续培养5天后，可得小鼠肠类器官如图3所示，结构形态与冻存前类似，活性较好。

实施例12

实施例6的细胞株A2780复苏后的鉴定及活性检测

实施例6的细胞株A2780保存40天后，按照下述方法进行复苏及活性检测：

3. 1000rpm离心3min。

6.将细胞提取RNA并进行qPCR基因表达检测，结果如图4所示。如图4 所示，从结果可以看出，冻存前后细胞基因表达特性基本相同，说明用本发明冻存液保存后的细胞维持了原细胞的基因表达特性。

对比例1

本对比例提供一种肠癌组织的保存方法，与实施例7的区别在于保存液保存采用现有市售的低温保护剂，活性检测的结果如实施例7中表1所示，市售的低温保存液保存后细胞活性显著降低。

对比例2

本对比例提供一种肺癌类器官的冻存复苏及培养，与实施例8的区别在于保存液保存采用FBS+DMSO(比例9:1)作为低温保护剂，冻存复苏后培养6天结果如图5所示，细胞基本死亡，无法观察到正常肺癌类器官。

对比例3

本对比例提供一种细胞的冻存复苏及培养，与实施例9的区别在于保存液保存采用FBS+DMSO(比例9:1)作为低温保护剂，冻存复苏后qPCR基因表达检测，结果如图2所示，部分基因表达发生变化。

对比例4

本对比例提供一种肠癌组织的冻存方法，与实施例7的区别在于采用低温保存液不加入LB100，其他组分一样。在本对比例保存液液氮保存1个月后按实施例7的方法进行细胞活率测定，结果活细胞比例为57.23％，显著低于实施例7的77.84％％，说明LB-100至少对肠癌组织低温保存的效果有重要作用。

对比例5

本对比例提供一种肠癌组织的冻存方法，与实施例7的区别在于采用低温保存液将RGFP109替换成SB202190，其他组分一样。在本对比例保存液液氮保存1个月后按实施例7的方法进行细胞活率测定，结果活细胞比例为45.18％，显著低于实施例7的77.84％％，说明RGFP109对肠癌组织低温保存的效果有重要作用。

对比例6

本对比例提供一种肠癌组织的冻存方法，与实施例7的区别在于采用低温保存液将Cynarin替换成阿酚酸，其他组分一样。在本对比例保存液液氮保存1 个月后按实施例7的方法进行细胞活率测定，结果活细胞比例为48.67％，显著低于实施例7的77.84％％，说明Cynarin对肠癌组织低温保存的效果有重要作用右。

综上所述，本发明的低温保存液及保存方法能够较好的保护细胞避免冰晶及渗透压的损伤，减少长时间低温保存引起线粒体损伤、内质网应激而造成的细胞凋亡，提高复苏成功率；还可以增加体系内抗氧化能力，抑制细胞凋亡，增加复苏后组织细胞的活性。同时最大程度保持细胞内生物大分子的稳定性。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种低温保存液，其特征在于：按照终浓度组成包括：FBS，30-70%；CultrexUltiMatrix RGF BME，5-15%；海藻糖，1-5 g /L；羟乙基淀粉，10-30 g/L；LB-100，0.1-5μM；RGFP109，10-100 nM；Cynarin，10-100 μM；以上成分均溶于DMEM/F12培养基中，调节pH到6.5-7.6范围内，以上百分浓度为体积分数；还包括：4-羟乙基哌嗪乙磺酸，10-50 mM；诺氟沙星，1-5 mg/L；维生素E，150-250μg/L中的至少一种；所述低温保存液用于肠癌组织、肺癌类器官、卵巢癌细胞、小鼠肝脏组织、小鼠肠类器官、细胞株的低温保存。

2.权利要求1所述的低温保存液的制备方法，其特征在于：包括：按照低温保存液的组成配料；先采用DMEM/F12培养基溶解海藻糖和羟乙基淀粉，然后依次将LB-100、RGFP109、Cynarin加入该混合溶液中，再将FBS、Cultrex UltiMatrix RGF BME与该溶液混合均匀，进一步加入4-羟乙基哌嗪乙磺酸、诺氟沙星、维生素E中的至少一种混合均匀，调节pH到6.5-7.6范围内，过滤，即得。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述低温保存液采用氢氧化钠溶液调节pH值。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述低温保存液于2～8℃条件下冷藏备用。

5.权利要求1所述的低温保存液或者权利要求3或4所述的制备方法获得的低温保存液在生物样本低温保存中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述应用的具体方法包括：将生物样本处理后悬浮于所述低温保存液并分装至冻存管中；采用梯度降温程序将冻存管降温后放入液氮中，在-196℃中保存。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述梯度降温程序从0℃开始，以-1℃/min速率降至-80℃，然后于-80℃平衡20~30min。