CN111793110B - 一种无dmso的冷冻保存液在干细胞冻存中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种无DMSO的冷冻保存液在干细胞冻存中的应用。本发明的冷冻保存液以每100mL体积计，含有仿生控冰材料0.01‑50.0g，多元醇5.0‑30mL，水溶性糖1‑30g，血清0‑30mL，余量为缓冲液，所述仿生控冰材料选自PVA和/或氨基酸类仿生控冰材料。本发明的冷冻保存液不含有DMSO，在用于冷冻保存干细胞时，能达到与商业化冷冻保存液(含有15％DMSO)同等甚至更高的细胞、组织存活率和功能表达稳定性，具有较高的保存效率。其中，既无DMSO也无血清的冷冻保存液，进一步解决了目前临床普遍使用的商业化冷冻保存液因含有血清而造成的稳定性差，可带入寄生性生物污染物质等问题。本发明的冷冻保存液组成简单，且原料来源方便，成本低廉。

Description

一种无DMSO的冷冻保存液在干细胞冻存中的应用
本申请要求2019年4月9日向中国国家知识产权局提交的专利申请号为201910281978.2，发明名称为“一种无DMSO的冷冻保存液及其制备方法”的在先申请，以及专利申请号为201910281986.7，发明名称为“一种肽类化合物和含有该化合物的冷冻保存液”的在先申请的优先权。上述两件在先申请的全文通过引用的方式结合于本申请中。
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种无DMSO的冷冻保存液及其在干细胞冻存中的应用。
背景技术
冷冻保存技术自问世以来，成为自然科学领域不可缺少的研究方法之一，已被广泛采用。随着生活水平的提高和医学技术的发展，人类生殖细胞(精子、卵母细胞)、性腺组织等的冷冻保存成为保存生育力的重要手段。另外，随着世界人口老龄化加剧，对捐赠的可用于再生医学和器官移植的人源性细胞、组织或器官的冷冻保存的需求也极速增加。因此，如何高效的冷冻保存珍贵的细胞、组织以及器官资源已成为生命科学领域的重要课题。
目前最常用的冷冻保存方法为玻璃化冷冻。玻璃化冷冻技术虽然在快速冷冻过程中可使细胞内外的液体直接成为玻璃态而避免了冷冻过程中因冰晶形成而导致的损伤。但是，在复温过程中，现有的冷冻保存试剂不能有效的控制冰晶的生长，从而损害细胞。二甲基亚砜(DMSO)是体外细胞培养常用的助溶剂和渗透类细胞冻存保护剂，然而，DMSO在临床患者试验时产生不良副作用；同时DMSO还具有强的细胞毒性，且不同种类的细胞对于DMSO浓度的敏感性不同，导致DMSO为主要保护剂成分的冻存试剂对细胞的毒副作用，其应用受到限制。目前玻璃化冷冻方法通常使用的高浓度(≥15％)的DMSO，严重影响冷冻保存对象复苏后的存活率甚至(子代)安全性以及功能表达。综上，目前采用的冷冻保存试剂不具备复温过程中有效控制冰晶生长的能力，同时存在试剂毒性大的问题。
发明内容
为改善现有技术的上述缺陷，本发明提供一种无DMSO的冷冻保存液及其制备方法和应用。
本发明提供如下技术方案:
一种无DMSO的冷冻保存液，以每100mL体积计，含有仿生控冰材料0.01-50.0g，多元醇5.0-45mL，水溶性糖0.1-1mol L-1，血清0-30mL，余量为缓冲液，所述仿生控冰材料选自聚乙烯醇PVA和/或氨基酸类仿生控冰材料。所述冷冻保存液中不含有二甲基亚砜(DMSO)。
根据本发明，所述氨基酸类仿生控冰材料选自聚氨基酸(聚合度≥2，优选聚合度为2～40，例如聚合度为6、8、15、20等)、氨基酸、肽类化合物中的一种或两种以上。
根据本发明，所述肽类化合物为多肽(优选2-8个氨基酸组成的肽，例如2肽、3肽、4肽)、糖肽衍生物、式(I)所示化合物，
Figure BDA0002409683450000021
其中，R选自取代或未取代的烷基，所述取代的基团可以选自-OH、-NH2、-COOH、-CONH2等，例如，R为取代或未取代的C1-6烷基，优选R为-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2COOH；n为大于等于1而小于等于1000的整数，例如可以为1～100范围内的整数。在本发明的一些实施方式中，n为2、3、4、5、6、7、8、9、10的整数。
根据本发明，所述多元醇可以为C2-5的多元醇，优选C2-C3的二元醇、三元醇，例如乙二醇，丙二醇，丙三醇中的任一种。
根据本发明，所述水溶性糖可以为非还原性双糖、水溶性多糖、糖酐中的至少一种，例如选自蔗糖、海藻糖、水溶性纤维素(例如羟丙基甲基纤维素)、聚蔗糖；优选蔗糖、羟丙基甲基纤维素。所述水溶性糖可以起到保护细胞膜和避免细胞沉降的作用。
根据本发明，所述缓冲液可以为DPBS、hepes-buffered HTF缓冲液、或其他细胞培养缓冲液中的至少一种。
根据本发明，所述血清针对人源性冷冻保存对象可选人血清白蛋白或其替代物，例如：十二烷基磺酸钠SDS，针对非人源性冷冻保存对象可选胎牛血清或牛血清白蛋白。
根据本发明的冷冻保存液，所述仿生控冰材料可以为PVA，所述PVA含量为0.1-6.0g，例如0.5-5.0g；具体地，可以为1.0g、2.0g、3.0g、4.0g。
根据本发明的冷冻保存液，所述仿生控冰材料可以为聚氨基酸或氨基酸，所述聚氨基酸或氨基酸的含量为0.01-50g，例如1.5-50g；具体地，可以为8.0g、10g、15g、20g、30g、40g。
根据本发明的冷冻保存液，所述控冰材料可以为PVA与聚氨基酸的组合，例如由0.1-5.0g的PVA和1.0-9.0g的聚氨基酸组成。
根据本发明的冷冻保存液，所述控冰材料可以为PVA与氨基酸的组合，例如由0.1-5.0g的PVA和8.0-35g的氨基酸组成。
根据本发明的冷冻保存液，以每100mL计，所述多元醇含量为6.0-28mL，例如7.0-20mL，10-15mL。
根据本发明的冷冻保存液，以每100mL计，所述血清含量为0.1-30mL，例如5.0-20mL，10-15mL。
根据本发明的冷冻保存液，所述冷冻保存液以每100mL计，优选血清含量为0；
根据本发明的冷冻保存液，每100mL冷冻保存液中所述水溶性糖含量为0.1-1.0mol L-1，例如0.1-0.8mol L-1，0.2-0.6mol L-1；具体地，例如0.25mol L-1，0.5mol L-1，1.0mol L-1.
根据本发明的冷冻保存液，其pH为6.5-7.6，例如为6.9-7.2。
作为本发明的一个实施方案，所述冷冻保存液以每100mL体积计，由如下组分组成：
Figure BDA0002409683450000041
优选，所述冷冻保存液以每100mL体积计，由如下组分组成：
Figure BDA0002409683450000042
作为本发明的一个实施方案，所述冷冻保存液以每100mL体积计，由如下组分组成：
Figure BDA0002409683450000043
优选，以每100mL体积计，由如下组分组成：
Figure BDA0002409683450000051
作为本发明的一个实施方案，所述冷冻保存液以每100mL体积计，由如下组分组成：
Figure BDA0002409683450000052
优选：所述冷冻保存液以每100mL体积计，由如下组分组成：
Figure BDA0002409683450000053
作为本发明的一个实施方案，所述冷冻保存液以每100mL体积计，由如下组分组成：
Figure BDA0002409683450000054
Figure BDA0002409683450000061
优选：所述冷冻保存液以每100mL体积计，由如下组分组成：
Figure BDA0002409683450000062
本发明还提供所述冷冻保存液的制备方法，包括如下步骤：将仿生控冰材料溶解于缓冲液中，冷却到室温后调节pH，将除血清外的其他组分溶解于剩下的缓冲液中，冷却后混合，再次确认或调节pH并补齐余量缓冲液，血清于使用时加入。
根据本发明的制备方法，包括如下步骤：
(1)将PVA溶解于一部分缓冲液中，冷却到室温后调节pH，得到溶液1；
(2)任选地，将聚氨基酸或氨基酸溶解于一部分缓冲液，冷却到室温后调节pH，形成溶液2；
(3)将水溶性糖溶解于另一部分缓冲液中，待水溶性糖全部溶解后加入除血清外的其他组分，制得溶液3；
(4)待溶液1、任选地溶液2、和溶液3冷却至室温后混合，调节pH值并定容补足余量缓冲液至预定体积，得到所述冷冻保存液。
根据本发明的制备方法，包括如下步骤：
(1)将聚氨基酸或氨基酸溶解于一部分缓冲液，冷却到室温后调节pH，形成溶液1；
(2)任选地，将PVA溶解于一部分缓冲液中，冷却到室温后调节pH，得到溶液2；
(3)将水溶性糖溶解于另一部分缓冲液中，待水溶性糖全部溶解后加入除血清的其他组分，制得溶液3；
(4)待溶液1、任选地溶液2、和溶液3冷却至室温后混合，调节pH值并定容补足余量缓冲液至预定体积，得到所述冷冻保存液。
根据本发明的制备方法，当所述冷冻保存液含有血清时，所述血清在所述冷冻保存液使用时添加。
根据本发明的制备方法，PVA溶解是将PVA在温浴加热中溶解，例如水浴或者油浴加热；例如水浴温度为60-95℃，优选80℃。优选溶解PVA时，所述溶解包括搅拌步骤。在一个实施方案中，所述聚氨基酸或氨基酸的溶解为超声辅助溶解。
本发明提供一种无DMSO的冷冻平衡液，以每100mL体积计，含有PVA0-5.0g，聚氨基酸0-15g，多元醇5.0-45mL，血清0-30mL，缓冲液余量。
根据本发明的冷冻平衡液，所述PVA含量为0.1-5.0g，优选含有PVA0.5-2.5g，例如0.1g、0.5g、1.0g、2.0g。
根据本发明的冷冻平衡液，所述聚氨基酸含量为0-15g，优选0.5-8g，例如0.1g、0.5g、1.0g、8.0g。
根据本发明的冷冻平衡液，所述多元醇含量为6.0-28mL，例如7.0-20mL，10-15mL。
根据本发明的冷冻平衡液，所述血清含量为0.1-30mL，例如5.0-20mL，10-15mL。作为本发明的一个实施方案，所述血清的含量为0。
作为本发明的一个实施方案，所述冷冻平衡液以每100mL体积计，含有多元醇7.5-15mL，血清10-20mL，DPBS余量。
作为本发明的一个实施方案，所述冷冻平衡液以每100mL体积计，含有PVA1.0-5.0g，多元醇7.5-15mL，缓冲液余量。
本发明的冷冻平衡液中，所述PVA、聚氨基酸、多元醇和血清可从冷冻保存液相应组分的种类中选择。
本发明还提供上述冷冻平衡液的制备方法，包括将各组分溶解于缓冲溶液中，血清单独存放，在使用时添加。
本发明进一步提供一种无DMSO的冷冻保存用试剂，包括上述冷冻平衡液和上述冷冻保存液，所述冷冻平衡液和冷冻保存液分别独立存在。
根据本发明的冷冻保存用试剂，所述冷冻保存液的血清含量为0，所述冷冻平衡液以每100mL体积计，含有PVA 1.0-5.0g，多元醇7.5-15mL，缓冲液余量；优选所述冷冻平衡液以每100mL计，含有PVA 0.5-2.5g，多元醇7.5-15mL，缓冲液余量。
根据本发明的冷冻保存用试剂，其中所述冷冻平衡液以每100mL体积计，包括如下组分：
Figure BDA0002409683450000081
所述冷冻保存液以总体积100mL计，包括如下组分:
Figure BDA0002409683450000082
根据本发明，所述PVA选自等规PVA、间规PVA和无规PVA的一种或两种以上的组合，例如所述PVA的间同规整度为15％-60％，优选45％-60％，例如为50％-55％。
根据本发明，所述PVA可选自分子量为10-500kDa或者更高分子量的PVA，例如分子量为10-30kDa、30-50kDa、80-90kDa、200-500kDa。
根据本发明，所述PVA可选自水解度为大于80％的PVA，例如水解度为80％-99％、82-87％、87％-89％、89％-99％、98％-99％。
根据本发明，所述聚氨基酸可选自赖氨酸、精氨酸、脯氨酸、苏氨酸、组氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、甘氨酸等中至少一种的均聚物(聚合度≥2)。例如为聚-L-脯氨酸、聚-L-精氨酸中的一种或两种以上的组合。所述聚氨基酸优选聚合度为2-40，更优选聚合度为2-20，例如聚合度为6、8、15、20等。
根据本发明，所述多肽为两种以上不同氨基酸组成，可选自L-Thr-L-Arg(TR),L-Thr-L-Pro(TP),L-Arg-L-Thr(RT),L-Pro-L-Thr(PT)，L-Thr-L-Arg-L-Thr(TRT),L-Thr-L-Pro-L-Thr(TPT),L-Ala-L-Ala-L-Thr(AAT)中的一种或两种以上。所述多肽可经本领域已知的多肽合成方法进行制备，例如固相合成法合成多肽。
根据本发明，所述糖肽衍生物为葡萄糖内酯(GDL)或其他糖类与亲冰氨基酸通过化学键合而组成的分子，例如：GDL-L-Thr，GDL-L-Gln,GDL-L-Asn,GDL-L-Phe，GDL-L-Tyr，-GDL-L-Val，GDL-L-Ser等。所述糖肽衍生物可以由本领域已知的糖类化合物与氨基酸的反应方法合成，例如可以经固相合成或者使糖类化合物和氨基酸在有机溶剂中反应合成。
根据本发明，所述肽类化合物具有式(1)-式(8)所示任一结构：
Figure BDA0002409683450000091
Figure BDA0002409683450000101
Figure BDA0002409683450000111
根据本发明，所述式(I)所示化合物具有如下任一所示的结构：
Figure BDA0002409683450000112
本发明冷冻保存液和冷冻平衡液中，各组分用量均以100mL溶液总体积为基准，余量为缓冲液。
本发明还提供上述冷冻保存液或冷冻平衡液或冷冻保存试剂的应用，用于细胞、组织或器官的冷冻保存；例如用于卵母细胞、精子或干细胞、卵巢组织、胚胎或卵巢器官的冷冻保存。
进一步地，本发明提供上述冷冻保存液在干细胞冷冻保存中的应用。
根据本发明的实施方案，所述干细胞为本领域已知的具有分化功能的各种干细胞，例如全能干细胞、多能干细胞或者专能干细胞，包括但不限于胚胎干细胞、各类间充质干细胞(例如脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞等)、造血干细胞等。
根据本发明的实施方案，干细胞冷冻保存采用微滴法，例如所述干细胞冷冻保存的应用包括如下步骤:将冷冻保存液加入干细胞中，吹打分散，制成干细胞悬液，将干细胞悬液置于冷冻载片上，液氮(-196℃)冷冻保存。
根据本发明的实施方案，冷冻保存的干细胞的解冻包括将置有干细胞的冷冻载片置于a-MEM培养基中，37℃解冻。
本发明中“冻存”和“冷冻保存”具有相同含义，可互换使用，指通过低温对某种物质或者细胞、组织、器官进行保存，使其保持其本来的理化和/或生物活性、生理生化功能。
有益效果
本发明提供的冷冻保存液和冷冻平衡液，不含有DMSO，在用于冷冻保存小鼠卵母细胞、胚胎时，能达到与商业化冷冻保存液(含有体积浓度为15％DMSO)同等甚至更高的细胞、组织存活率和功能表达稳定性，具有较高的保存效率。其中，既无DMSO也无血清的冷冻保存液，进一步解决了目前临床普遍使用的商业化冷冻保存液因含有血清而造成的稳定性差，易带入寄生性生物污染物质等问题。本发明的冷冻保存液组成简单，且原料来源方便，成本低廉，用于干细胞冷冻保存可以保持良好的存活率。
附图说明
图1为新生3天的小鼠新鲜卵巢器官切片染色照片；
图2为对比实例7冻存的完整卵巢器官解冻后切片染色照片；
图3为应用实例14冻存的完整卵巢器官解冻后切片染色照片；
图4为应用实例15冻存的完整卵巢器官解冻后切片染色照片；
图5为应用实例16冻存的完整卵巢器官解冻后切片染色照片；
图6为性成熟的小鼠新鲜卵巢组织切片染色照片；
图7为对比实例8冻存的卵巢组织切片解冻后切片染色照片；
图8为应用实例17冻存的卵巢组织切片解冻后切片染色照片；
图9为应用实例18冻存的卵巢组织切片解冻后切片染色照片；
图10为应用实例19冻存的卵巢组织切片解冻后切片染色照片。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的制备方法做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明实施例中采用的PVA为间同规整度为50％-55％，分子量为13-23kDa，水解度98％。
本发明实施例中冷冻液中采用聚-L-脯氨酸聚合度为8或者15，分子量为795和1475；聚L-精氨酸聚合度为8，分子量为1267。解冻液中聚-L-脯氨酸聚合度为8，分子量为795。
本发明实施例中存活率为3-12次重复实验的存活率平均值。
实施例1.小鼠卵母细胞和胚胎冷冻保存
1.制备冷冻保存液：按以下配方配制冷冻保存液
冷冻保存液A:每100ml中含有如下组分：
物质 用量
聚-L-脯氨酸(g) 1.5
PVA(g) 2.0
乙二醇(mL) 10
蔗糖(mol L<sup>-1</sup>) 0.5
DPBS(mL) 余量
将2.0g的PVA在80℃水浴中加热并磁力搅拌溶于25mL的DPBS中，调节pH为7.0，为溶液1；将1.5g的聚-L-脯氨酸超声溶于另外20mL的DPBS中，调节pH为7.0，为溶液2；将17g(0.05mol)的蔗糖(蔗糖在冷冻保存液中终浓度为0.5mol L-1)超声溶解于25mL的DPBS中，待蔗糖全部溶解后依次加入10mL的乙二醇，为溶液3，待溶液1、溶液2及溶液3恢复至室温，再将三种溶液混匀，调节pH为7.0，并用DPBS定容补齐余量至总体积100mL，备用。
冷冻保存液B:每100ml中含有如下组分：
物质 含量
L-Arg(g) 8.0
L-Thr(g) 4.0
PVA(g) 2.0
乙二醇(mL) 10
蔗糖(mol L<sup>-1</sup>) 0.5
胎牛血清(mL) 20
DPBS(mL) 余量
冷冻保存液配液步骤：将2.0g的PVA在80℃水浴中加热并磁力搅拌溶于20mL的DPBS中，调节pH为7.1，为溶液1；将8.0g的L-Arg和4.0g的L-Thr溶于20mL的DPBS中，调节pH为7.1，为溶液2；17g(0.05mol)的蔗糖(蔗糖在冷冻保存液中终浓度为0.5mol L-1)超声溶解于20mL的DPBS中，待蔗糖全部溶解后加入10mL的乙二醇，为溶液3；待溶液1、溶液2及溶液3恢复至室温，再将三种溶液混均，调节pH值为7.1并用DPBS定容补齐余量至总体积的80％，使用时加入20mL的血清。
冷冻保存液C:
每100ml中含有如下组分：
Figure BDA0002409683450000141
Figure BDA0002409683450000151
将2.0g的PVA在80℃水浴中加热并磁力搅拌溶于25mL的DPBS中，调节pH为6.9，为溶液1；17g(0.05mol)的蔗糖(蔗糖在冷冻保存液中终浓度为0.5mol L-1)超声溶解于25mL的DPBS中，待蔗糖全部溶解后加入10mL的乙二醇，为溶液2，待溶液1及溶液2恢复至室温，再将两种溶液混均，调节pH值并定容补齐余量至总体积的80％，20mL血清单独存放待保存液使用时添加。
冷冻保存液D：
每100ml中含有以下组分：
物质 用量
PVA(g) 2.0
乙二醇(mL) 10
蔗糖(mol L<sup>-1</sup>) 0.5
DPBS(mL) 余量
将2.0g的PVA在80℃水浴中加热并磁力搅拌溶于30mL的DPBS中，调节pH为7.0，为溶液1；17g(0.05mol)的蔗糖(蔗糖在冷冻保存液中终浓度为0.5mol L-1)超声溶解于25mL的DPBS中，待蔗糖全部溶解后加入10mL的乙二醇，为溶液2，待溶液1及溶液2恢复至室温，再将两种溶液混均，调节pH值并定容补齐余量至总体积100mL，备用。
2.制备冷冻平衡液：按以下配方配制冷冻平衡液
冷冻平衡液a：将2.0g的PVA在80℃水浴中加热并磁力搅拌溶于50mL的DPBS中，待PVA全部溶解，调节pH为7.0，加入7.5mL的乙二醇，混匀，用DPBS定容至100mL，备用。
冷冻平衡液b：总体积100mL，将7.5mL的乙二醇溶于72.5mL的DPBS中，混匀，使用时加20mL的血清。
对比例1：
冷冻平衡液1#：每1mL中含有7.5％(v/v)的DMSO,7.5％(v/v)的乙二醇，20％(v/v)的胎牛血清，余量为DPBS；
冷冻保存液1#：每1mL中含有15％(v/v)的DMSO,15％(v/v)的乙二醇，20％(v/v)的胎牛血清，0.5M蔗糖，余量为DPBS。
冷冻平衡液b：每1mL中含有7.5％(v/v)的乙二醇，20％(v/v)的胎牛血清，余量为DPBS；
冷冻保存液2#：每1mL中含有10％(v/v)的乙二醇，20％(v/v)的胎牛血清，0.5M蔗糖，余量为DPBS。
本发明实施例1和对比例1采用的解冻液配方有如下三种：
解冻液1#：解冻液I(含有1.0mol L-1蔗糖，20％的血清，余量为DPBS)；解冻液II(含有0.5mol L-1蔗糖，20％的血清，余量为DPBS)；解冻液III(含有0.25mol L-1蔗糖，20％的血清，余量为DPBS)；解冻液IV(20％的血清，余量为DPBS)。
解冻液2#：解冻液Ⅰ(含有1.0mol L-1的蔗糖，20mg mL-1的PVA，余量为DPBS)；解冻液Ⅱ(含有0.5mol L-1蔗糖，20mg mL-1的PVA，余量为DPBS)；解冻液Ⅲ(含有0.25mol L-1蔗糖，20mg mL-1的PVA，余量为DPBS)；解冻液Ⅳ(20mg mL-1的PVA，余量为DPBS)。
解冻液3#：解冻液I(含有1.0mol L-1的蔗糖，20mg mL-1的PVA，10mg mL-1的聚脯氨酸，余量为DPBS)；解冻液II(含有0.5mol L-1蔗糖，20mg mL-1的PVA，5.0mg mL-1的聚脯氨酸，余量为DPBS)；解冻液III(含有0.25mol L-1蔗糖，20mg mL-1的PVA，2.5mg mL-1的聚脯氨酸，余量为DPBS)；解冻液IV(20mg mL-1的PVA，余量为DPBS)。
应用例1：
采用上述实施例及对比例的冷冻平衡液以及冷冻保存液按表1和表2中的方案分别进行卵母细胞和胚胎冷冻保存。
1.卵母细胞冷冻保存
小鼠卵母细胞先置于冷冻平衡液中平衡5分钟；然后置于所制备的冷冻保存液中1分钟，将已在冷冻保存液中平衡后的卵母细胞放置于冷冻载杆上，然后快速投入液氮中(-196℃)中，并封闭载杆后继续保存；解冻时，将冻存的卵母细胞置于37℃的解冻液Ⅰ中平衡5分钟，再依次在解冻液Ⅱ-Ⅳ中各平衡3分钟；将解冻完毕的卵母细胞培养2小时后观察存活细胞数量，计算存活率(参见表1)。
2.胚胎冷冻保存
小鼠胚胎先置于冷冻平衡液平衡5分钟，然后置于所制备的冷冻保存液中50秒，将已在冷冻保存液中平衡的胚胎放置于冷冻载杆上，然后快速投入液氮(-196℃)中，并封闭载杆后继续保存；解冻时，将冷冻的胚胎置于37℃的解冻液Ⅰ中平衡3分钟，再依次在解冻液Ⅱ-Ⅳ中各平衡3分钟；将解冻完毕胚胎培养2小时，观察存活胚胎数量，计算存活率(参见表2)。
表1小鼠卵母细胞冷冻保存存活率
Figure BDA0002409683450000171
Figure BDA0002409683450000181
表2小鼠胚胎冷冻保存存活率
Figure BDA0002409683450000182
根据实施例1和对比例1中各实例的数据可以看出，应用实例1-6和应用实例7-8的冷冻保存试剂由于聚氨基酸和/或PVA等特殊仿生控冰材料的加入，能够达到优良的卵母细胞和胚胎存活率。具体而言，应用实例3和对比实例2的数据表明，本发明的冷冻保存液不含有DMSO，仍能够达到比现有商业化冻存液(含有15％DMSO)更优的冻存效果。应用实例2、6-8的数据进一步表明，平衡液、冷冻液和解冻液中均不加入DMSO和血清，在本发明中的仿生控冰材料和渗透性保护剂乙二醇等共同作用下，仍能达到优于现有商业化冻存液的冷冻保存卵母细胞和胚胎的存活率，并且比解冻液中含有血清的方案具有更好的效果(应用实例1、5)。本发明无DMSO的冷冻保存液和冷冻平衡液，通过各个组分协同作用，即便在不添加DMSO的情况下，用于卵母细胞和胚胎的冷冻保存均仍有良好的保存效果，解决了现有冻存液中因加入较大浓度的DMSO对于细胞或胚胎产生毒性的缺陷，进一步解决了目前临床普遍使用的商业化冷冻保存液因含有血清而造成的保质期短、易带入寄生性生物污染物质等问题。
实施例2：人脐带间充质干细胞的冷冻保存
1.制备冷冻保存液：按以下配方配制冷冻保存液
冷冻保存液E：总体积100mL，含有乙二醇10mL、血清20mL、蔗糖17g(0.5mol L-1)、聚L-精氨酸(聚合度为8)4.0g、PVA 1.0g、DPBS余量。
冷冻保存液F：总体积100mL，含有乙二醇25mL、血清20mL、蔗糖17g(0.5mol L-1)、L-Arg 16g、L-Thr 8g、DPBS余量。
冷冻保存液G：总体积100mL，含有乙二醇10mL、血清20mL、蔗糖17g(0.5mol L-1)、PVA 2.0g、DPBS余量。
冷冻保存液H：总体积100mL，含有乙二醇10mL，血清20mL、蔗糖17g(0.5mol L-1)、TR28g、DPBS余量。
冷冻保存液I：总体积100mL，含有乙二醇10mL、蔗糖17g(0.5mol L-1)、PVA 2.0g、DPBS余量。
冷冻保存液配制方法同实施例1。
其中，TR的制备方法如下：
(1)将2-氯三苯甲基氯树脂放入反应管中，加DCM(20mL g-1)，振荡30分钟。砂芯抽滤除去溶剂，加入三倍摩尔过量Fmoc-L-Thr(tBu)-OH，再加入8倍摩尔过量的DIEA,最后加入DMF溶解，振荡30分钟。甲醇封头30分钟。
(2)除去溶剂DMF，加20％哌啶/DMF溶液(10mL g-1)，5分钟后除去溶剂，再加入20％哌啶/DMF溶液(10mL g-1)，15分钟后除去哌啶溶液。取少量树脂，用乙醇清洗三次后，加入茚三酮试剂，105～110℃加热5分钟，变深蓝色为阳性反应。
(3)将上述反应得到产物用依次用DMF(15mL g-1，两次)、甲醇(15mL g-1，两次)以及DMF(15mL g-1，两次)清洗后，向反应管中加入用尽量少的DMF溶解的Fmoc-Arg(Pbf)-OH；两倍过量，HBTU两倍过量。之后，立刻加入8倍过量的DIEA，反应30分钟。
(4)抽掉溶液后，取少量树脂，用乙醇清洗三次后，加入茚三酮试剂，105～110℃加热5分钟，无色为阴性反应，即反应完全。
(5)将上述反应得到产物用依次用DMF(15mL g-1，两次)、甲醇(15mL g-1，两次)以及DMF(15mL g-1，两次)清洗后除去溶剂，加20％哌啶/DMF溶液(10mL g-1)，5分钟后除去溶剂，再加入20％哌啶/DMF溶液(10mL g-1)，15分钟后除去哌啶溶液，取少量树脂，用乙醇清洗后，加入茚三酮试剂，105～110℃加热5分钟，变深蓝色为阳性反应。
(6)将上述反应得到产物用依次用DMF(15mL g-1，两次)、甲醇(15mL g-1，两次)以及DCM(15mL g-1，两次)清洗后抽干树脂。
(7)使用切割液(15mL g-1，TFA：水：EDT：Tis＝95:1:2:2,V/V)将产物切割90分钟。并将切割液用氮气吹干，之后冻干，得到多肽粗品。
(8)用HPLC纯化多肽并转盐或脱盐，HPLC：tR＝4.8mins(纯化柱子型号：Kromasil100-5C18,4.6mm*250mm；梯度洗脱液：0.1％TFA乙腈溶液和0.1％TFA水溶液,0mins-1:99，20mins-1:4)。将纯化后的溶液冻干，既得到成品L-Thr-L-Arg(TR)。产率约为80％。质谱鉴定276.2为[M+H]+。
对比例2：
冷冻保存液3#：每1mL中含有10％(v/v)的DMSO，15％(v/v)的胎牛血清，余量为a-MEM培养基(USA，Invitrogen，C12571500BT)。
采用上述冷冻保存液按表3中的方案分别进行人脐带间充质干细胞的冷冻保存。所用人脐带干细胞冷冻保存方法具体为微滴法：将培养皿上的人脐带间充质干细胞用25％胰酶消化2分钟后，放入等体积培养液(10％FBS+a-MEM培养基)，轻柔吹打至干细胞全部脱落，加入1.5ml离心管，1000rmp离心5分钟，弃上清，将细胞与培养基分离，将10uL冷冻液加入离心管底部，轻柔吹打使干细胞团分散，将此10uL带有干细胞的冷冻液置于冷冻载片上，置于液氮(-196摄氏度)冻存。解冻时，将带有细胞及冷冻液的冷冻载杆直接放入37℃的a-MEM培养基中进行解冻。解冻后，台盼蓝染色察看其存活率，并使用仪器JIMBIO-FIL计数细胞数量，存活率＝活细胞数/细胞总数(参见表3)。
表3人脐带间充质干细胞冷冻保存存活率
编号 冷冻保存液 冷冻保存方法 存活率
应用实例9 冷冻保存液E 微滴法 92.4％
应用实例10 冷冻保存液F 微滴法 71.0％
应用实例11 冷冻保存液G 微滴法 72.2％
应用实例12 冷冻保存液H 微滴法 75.1％
应用实例13 冷冻保存液I 微滴法 77.1％
对比实例5 冷冻保存液3# 微滴法 76.6％
对比实例6 冷冻保存液1# 微滴法 63.9％
本发明的冷冻保存液进行人脐带间充质干细胞冷冻保存时，即使冷冻保存液中不加入DMSO，干细胞存活率仍可达92.4％(应用实例9)，甚至在完全不添加DMSO和血清时，存活率可达到77.1％，表明该冷冻用试剂不仅能达到常规冷冻液冷冻干细胞的有效性，甚至远高于目前普遍使用的含有10％的DMSO和培养基的冷冻保存液(对比实例5)的冷冻保存复苏率，基于PVA的冷冻保存效果显著优于不添加PVA的对比实例6。
实施例3：完整卵巢器官和卵巢组织切片的冷冻保存
冷冻保存液J：总体积100mL，含有乙二醇10mL、蔗糖17g(0.5mol L-1)、PVA 2.0g、DPBS余量。
冷冻保存液K:总体积100mL，含有乙二醇10mL、血清20mL、蔗糖17g(0.5mol L-1)、PVA 1.0g、DPBS余量。
冷冻保存液L：总体积100mL，含有乙二醇10mL、血清20mL、蔗糖17g(0.5mol L-1)、聚L-精氨酸(聚合度为8)4.0g、PVA 1.0g、DPBS余量。
冷冻平衡液a：将2.0g的PVA在80℃水浴中加热并磁力搅拌溶于50mL的DPBS中，待PVA全部溶解，调节pH为7.0，加入7.5mL乙二醇，混匀，调节pH值并定容补齐余量至100mL，备用。
冷冻平衡液b：7.5mL的乙二醇加入72.5mL的DPBS中，混匀，使用时加入20m L的血清；
对比例3：
冷冻平衡液1#：每1mL中含有7.5％(v/v)的DMSO,7.5％(v/v)的乙二醇，20％(v/v)的胎牛血清，余量为DPBS；
冷冻保存液1#：每1mL中含有15％(v/v)的DMSO,15％(v/v)的乙二醇，20％(v/v)的胎牛血清，0.5mol L-1蔗糖，余量为DPBS。
解冻液1#：解冻液Ⅰ(含有1.0mol L-1蔗糖，20％的血清，余量为DPBS)；解冻液Ⅱ(含有0.5mol L-1蔗糖，20％的血清，余量为DPBS)；解冻液Ⅲ(含有0.25mol L-1蔗糖，20％的血清，余量为DPBS)；解冻液Ⅳ(20％的血清，余量为DPBS)。
解冻液2#：解冻液Ⅰ(含有1.0mol L-1的蔗糖，20mg mL-1的PVA，余量为DPBS)；解冻液Ⅱ(含有0.5mol L-1蔗糖，20mg mL-1的PVA，余量为DPBS)；解冻液Ⅲ(含有0.25mol L-1蔗糖，20mg mL-1的PVA，余量为DPBS)；解冻液Ⅳ(20mg mL-1的PVA，余量为DPBS)。
采用上述冷冻保存液及对比例的冷冻平衡液以及冷冻保存液按表4、表5中的方案分别对新生3天内的小鼠完整卵巢器官和性成熟小鼠的卵巢组织切片进行冷冻保存。
整个卵巢器官或者卵巢组织切片先置于冷冻平衡液室温平衡25分钟，然后置于所制备的冷冻保存液中15分钟，之后将完整卵巢器官或卵巢组织切片放置于冷冻载杆上，投入液氮中保存。解冻后，完整卵巢器官或卵巢组织切片放入培养液(10％FBS+a-MEM)后置于37℃、5％CO2培养箱中复苏2小时后使用4％多聚甲醛固定、石蜡包埋、HE染色观察形态，结果如图1-10所示，图1为新鲜未冷冻的完整卵巢器官切片照片，图6为新鲜未冷冻的卵巢组织的切片照片。
表4完整卵巢器官冷冻保存方案
编号 平衡液 冷冻保存液 解冻液 形态
应用实例14 a J 解冻液2# 图3
应用实例15 b K 解冻液1# 图4
应用实例16 b L 解冻液1# 图5
对比实例7 平衡液1# 冷冻液1# 解冻液1# 图2
表5卵巢组织冷冻保存方案
编号 平衡液 冷冻保存液 解冻液 形态
应用实例17 a J 解冻液2# 图8
应用实例18 b K 解冻液1# 图9
应用实例19 b L 解冻液1# 图10
对比实例8 平衡液1# 冷冻液1# 解冻液1# 图7
根据图1-5可知，与使用不添加氨基酸类或PVA等仿生控冰材料的对比实例7以及新鲜未冷冻的卵巢器官相比，应用实例14-16中原始卵泡结构相对完整，间质结构相对完整，细胞胞浆均质、淡染相对较多，胞核皱缩、深染相对较少；血管管壁结构完整，管腔塌陷较少，内皮细胞胞浆均质、淡染相对较多，胞核皱缩、深染相对较少。可见，应用实例14-16组相比于对比实例7，对于卵巢器官的冻存效果更好。
根据图6-10可知，实施例17-19的方案和对比实例8以及新鲜未冷冻的成年小鼠卵巢组织相比，生长期卵泡及窦卵泡结构相对完整，可见本发明的冻存液用于冻存卵巢组织也比现有技术具有更好的效果。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (24)

1.一种无DMSO的冷冻保存液在制备干细胞冷冻保存液中的应用，其特征在于，以每100mL体积计，含有仿生控冰材料0.01-50g，多元醇5.0-45mL，水溶性糖 0.1-1.0 mol L-1，血清0-30mL，余量为缓冲液，所述仿生控冰材料为PVA，或PVA和氨基酸类仿生控冰材料；
所述PVA为无规PVA，所述PVA的间同规整度为15%-60%，所述PVA选自分子量为10-500kDa的PVA；所述PVA选自水解度大于80%的PVA；
所述氨基酸类仿生控冰材料选自聚合度≥2的聚氨基酸、氨基酸、肽类化合物中的一种或两种以上；
所述肽类化合物为多肽，所述多肽选自L-Thr-L-Arg,L-Thr-L-Pro,L-Arg-L-Thr,L-Pro-L-Thr，L-Thr-L-Arg-L-Thr,L-Thr-L-Pro-L-Thr,L-Ala-L-Ala-L-Thr中的一种或两种以上。
2.根据权利要求1所述的冷冻保存液在干细胞冷冻保存中的应用，所述仿生控冰材料为PVA，所述PVA含量为0.1-6.0 g。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多元醇可以为C2-5的多元醇。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述多元醇为乙二醇，丙二醇，丙三醇中的任一种。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述水溶性糖为非还原性双糖、水溶性多糖、糖酐中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述水溶性糖选自蔗糖、海藻糖、羟丙基甲基纤维素、聚蔗糖中至少一种。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述缓冲液为DPBS、hepes-buffered HTF缓冲液、或其他细胞培养缓冲液中的至少一种。
8.根据权利要求1-7任一项所述的应用，其特征在于，所述仿生控冰材料为PVA与氨基酸和/或聚氨基酸的组合。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述仿生控冰材料由0.1-5.0g的PVA和8.0-35g的氨基酸和/或1.0-9.0g聚氨基酸组成。
10.根据权利要求1-7任一项所述的应用，其特征在于，所述PVA的间同规整度为45%-60%。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述PVA的间同规整度为50%-60%。
12.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述聚氨基酸为聚-L-脯氨酸、聚-L-精氨酸中的一种或两种的组合。
13.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述聚氨基酸的聚合度为2-40。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述聚氨基酸的聚合度为2-20。
15.根据权利要求1-7任一项所述的应用，其特征在于，所述多元醇含量为6.0-28 mL。
16.根据权利要求1-7任一项所述的应用，其特征在于，所述血清含量为0。
17.根据权利要求1-7任一项所述的应用，其特征在于，所述水溶性糖含量为0.2-0.5mol L-1。
18.根据权利要求1-7任一项所述的应用，其特征在于，所述冷冻保存液pH为6.5-7.6。
19.根据权利要求1-7任一项所述的应用，所述冷冻保存液由如下方法制备得到：将仿生控冰材料溶解于缓冲液中，冷却到室温后调节pH，将其他组分溶解于剩下的缓冲液中，冷却后混合。
20.如权利要求19所述的应用，其特征在于，所述冷冻保存液采用如下方法制备，包括如下步骤：
（1）将PVA溶解于一部分缓冲液中，冷却到室温后调节pH，得到溶液1；
（2）任选地，将聚氨基酸或氨基酸溶解于一部分缓冲液，冷却到室温后调节pH，形成溶液2；
（3）将水溶性糖溶解于一部分缓冲液中，待水溶性糖全部溶解后加入除血清外的其他组分，制得溶液3；
（4）待溶液1、任选地溶液2、和溶液3冷却至室温后混合，调节pH并采用缓冲液定容至预定体积，得到所述冷冻保存液；
任选地，当所述冷冻保存液含有血清时，所述血清在所述冷冻保存液使用时添加。
21.根据权利要求1-7任一项所述的应用，所述干细胞全能干细胞、多能干细胞或者专能干细胞。
22.如权利要求21所述的应用，其特征在于，所述干细胞为胚胎干细胞、各类间充质干细胞、造血干细胞。
23.如权利要求22所述的应用，其特征在于，所述各类间充质干细胞为脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞。
24.根据权利要求1-7任一项所述的应用，所述干细胞冷冻保存采用微滴法，包括如下步骤：将冷冻保存液加入干细胞中，吹打分散，制成干细胞悬液，将干细胞悬液置于冷冻载片上，-196℃液氮冷冻保存。
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