CN113229274A - 一种诱导多能干细胞冻存液及冻存方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种诱导多能干细胞冻存液，包括基础培养基和添加剂，添加剂的成分包括：覆盆子醇、氯沙坦钾、肝素钠、毛喉素、金丝桃苷、维生素E、胰岛素、亚硒酸钠。本发明的冻存液添加覆盆子醇和氯沙坦钾代替DMSO，一方面，减少在降温至冰点时诱导多能干细胞内形成的冰晶；另一方面，稳定细胞膜，调整诱导多能干细胞冻存过程中的渗透压，避免细胞过度失水而失去活性。添加肝素钠避免诱导多能干细胞聚集成团影响冻存细胞的活性。添加毛喉素可使经液氮冻存后的诱导多能干细胞快速恢复活性。添加金丝桃苷和维生素E，避免冻存过程中形成自由基对细胞造成伤害。本发明还提供了一种诱导多能干细胞的冻存方法，方法简便，易于操作，具有较好的应用前景。

Description

一种诱导多能干细胞冻存液及冻存方法

技术领域

本发明涉及一种冻存液，尤其涉及一种诱导多能干细胞冻存液及冻存方法。

背景技术

诱导多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cell，iPSCs)是通过重编程技术使成体细胞去分化，具有与胚胎干细胞相似的自我更新及三胚层分化潜能的细胞，因为它能避免免疫移植物对宿主引起的免疫性疾病，而且规避了伦理问题，具有广阔的应用前景。

在诱导多能干细胞的应用过程中，经常需要将细胞冻存，冻存液是诱导多能干细胞冻存必须使用的一种复合缓冲液，其主要作用包括保护诱导多能干细胞在低温冷冻过程中受到破坏和伤害，保持诱导多能干细胞冻存复苏后仍具有较高的活力、增殖性和功能等。

冻存液中的一个关键成分是冷冻保护剂。二甲基亚砜(DMSO)是一种被广泛使用的渗透性冷冻保护剂，其主要作用是防止冻存过程中细胞内冰晶形成、避免高浓度冻存剂的毒性和使细胞在耐受度内脱水。不过有研究发现如果DMSO使用浓度过低，可能无法实现其冷冻保护的作用，但是浓度过高则可能影响细胞活力甚至产生细胞毒性。

另一个关键成分是动物血清。但是对于临床使用的诱导多能干细胞而言，动物血清的存在并不一定合适。首先，动物血清存在携带传播病原体及其他致病因素的风险；其次，由于血清的组分非常复杂、来源和生产批次存在差异可能会造成不良或不一致的影响；第三，血清中富含各种细胞因子、激素和其他活性成分，容易对诱导多能干细胞的生物特性产生干扰和影响。因此，近年来对无血清、无DMSO的诱导多能干细胞冻存液的开发和探索越来越受到重视。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种诱导多能干细胞冻存液，不添加血清和DMSO，同时能保证诱导多能干细胞长时间冻存经复苏后的存活率。

本发明的目的之二在于提供一种诱导多能干细胞的冻存方法。

本发明的目的之一采用如下技术方案实现：

一种诱导多能干细胞冻存液，包括基础培养基和添加剂，所述添加剂的成分包括：覆盆子醇、氯沙坦钾、肝素钠、毛喉素、金丝桃苷、维生素E、胰岛素、亚硒酸钠。

进一步地，以终浓度计，所述添加剂中各组分的浓度为：覆盆子醇9.8-12.5μg/mL、氯沙坦钾8.5-11.2μg/mL、肝素钠15.5-18.5ng/mL、毛喉素10.8-14.5ng/mL、金丝桃苷6.5-8.5μg/mL、维生素E 5.0-9.5μg/mL、胰岛素4.0-10.0ng/mL、亚硒酸钠8.5-10.5ng/mL。

进一步地，以终浓度计，所述添加剂中各组分的浓度为：覆盆子醇10.5μg/mL、氯沙坦钾9.8μg/mL、肝素钠17.0ng/mL、毛喉素13.2ng/mL、金丝桃苷7.5μg/mL、维生素E 8.0μg/mL、胰岛素5.5ng/mL、亚硒酸钠9.0ng/mL。

进一步地，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。

本发明的目的之二采用如下技术方案实现：

一种诱导多能干细胞的冻存方法，采用上述的冻存液进行冻存。

进一步地，所述诱导多能干细胞的冻存方法包括以下步骤：

（1）向上述的冻存液中加入待冻存的诱导多能干细胞，得到含有诱导多能干细胞的悬液；

（2）将上述步骤（1）的悬液在-80℃冷冻5-9h后转移至液氮中进行保存。

进一步地，所述悬液中诱导多能干细胞的浓度为1×10⁶-1×10⁷个/mL。

进一步地，所述待冻存的诱导多能干细胞可以为常规传代培养得到的诱导多能干细胞，或者其他需要冻存的诱导多能干细胞。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

1、本发明提供一种诱导多能干细胞冻存液，添加覆盆子醇和氯沙坦钾代替DMSO，一方面，保证诱导多能干细胞内水分的动态平衡，减少在降温至冰点时诱导多能干细胞内形成的冰晶，避免因冰晶损伤细胞内部结构造成细胞死亡；另一方面，稳定细胞膜，调整诱导多能干细胞冻存过程中的渗透压，避免细胞过度失水而失去活性。

2、本发明的冻存液添加肝素钠避免诱导多能干细胞聚集成团影响冻存细胞的活性。添加毛喉素可使经液氮冻存后的诱导多能干细胞快速恢复活性，提高细胞复苏的存活率。

3、本发明的冻存液中添加金丝桃苷和维生素E，避免冻存过程中形成自由基对细胞造成伤害，具有较好的抗氧化效果。

4、本发明还提供了一种诱导多能干细胞的冻存方法，该方法简便，易于操作，同时冻存的诱导多能干细胞经复苏后存活率高，具有较好的应用前景。

具体实施方式

下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。

实施例1

一种诱导多能干细胞冻存液，包括基础培养基DMEM/F12和添加剂，以终浓度计，添加剂中各组分的浓度为：覆盆子醇10.5μg/mL、氯沙坦钾9.8μg/mL、肝素钠17.0ng/mL、毛喉素13.2ng/mL、金丝桃苷7.5μg/mL、维生素E 8.0μg/mL、胰岛素5.5ng/mL、亚硒酸钠9.0ng/mL。

一种诱导多能干细胞的冻存方法，包括以下步骤：

（1）将传代培养的P3代诱导多能干细胞加入上述冻存液中，诱导多能干细胞的浓度为5×10⁶个/mL，得到含有诱导多能干细胞的悬液，将上述悬液分装于2mL的冻存管中，每管装1.5mL；

（2）将分装好的冻存管密封后在-80℃冷冻7h，然后转移至液氮中进行保存。

实施例2

一种诱导多能干细胞冻存液，包括基础培养基DMEM/F12和添加剂，以终浓度计，添加剂中各组分的浓度为：覆盆子醇9.8μg/mL、氯沙坦钾8.5μg/mL、肝素钠15.5ng/mL、毛喉素10.8ng/mL、金丝桃苷6.5μg/mL、维生素E 5.0μg/mL、胰岛素4.0ng/mL、亚硒酸钠8.5ng/mL。

一种诱导多能干细胞的冻存方法，包括以下步骤：

（1）将传代培养的P4代诱导多能干细胞加入上述冻存液中，诱导多能干细胞的浓度为1×10⁶ /mL，得到含有诱导多能干细胞的悬液，将上述悬液分装于2mL的冻存管中，每管装1.5mL；

（2）将分装好的冻存管密封后在-80℃冷冻5h，然后转移至液氮中进行保存。

实施例3

一种诱导多能干细胞冻存液，包括基础培养基DMEM/F12和添加剂，以终浓度计，添加剂中各组分的浓度为：覆盆子醇12.5μg/mL、氯沙坦钾11.2μg/mL、肝素钠18.5ng/mL、毛喉素14.5ng/mL、金丝桃苷8.5μg/mL、维生素E 9.5μg/mL、胰岛素10.0ng/mL、亚硒酸钠10.5ng/mL。

一种诱导多能干细胞的冻存方法，包括以下步骤：

（1）将传代培养的P5代诱导多能干细胞加入上述冻存液中，诱导多能干细胞的浓度为1×10⁷个/mL，得到含有诱导多能干细胞的悬液，将上述悬液分装于2mL的冻存管中，每管装1.5mL；

（2）将分装好的冻存管密封后在-80℃冷冻9h，然后转移至液氮中进行保存。

对比例1

对比例1提供一种诱导多能干细胞冻存液，和实施例1的区别为：省去覆盆子醇，其余均和实施例1相同。

对比例2

对比例2提供一种诱导多能干细胞冻存液，和实施例1的区别为：省去氯沙坦钾，其余均和实施例1相同。

对比例3

对比例3提供一种诱导多能干细胞冻存液，和实施例1的区别为：省去氯沙坦钾，将覆盆子醇的用量调整为：20.3μg/mL其余均和实施例1相同。

对比例4

对比例4提供一种诱导多能干细胞冻存液，和实施例1的区别为：省去肝素钠，其余均和实施例1相同。

对比例5

对比例5提供一种诱导多能干细胞冻存液，和实施例1的区别为：省去毛喉素，其余均和实施例1相同。

对比例6

对比例6提供一种诱导多能干细胞冻存液，和实施例1的区别为：省去金丝桃苷，将维生素E的用量调整为15.5μg/mL，其余均和实施例1相同。

实施例1至3，对比例1至6冻存的诱导多能干细胞分别在冻存1个月、3个月、6个月时，每次取出三个冻存管在40℃快速复苏，离心后收集细胞，用PBS制成悬液，采用台盼蓝染色法统计诱导多能干细胞存活率，每组数据均取三个冻存管检测结果的平均值，结果如表1所示。

表1

样品	1个月	3个月	6个月
				实施例1	99.67%	97.42%	94.59%
实施例2	98.41%	96.12%	93.02%
				实施例3	99.11%	96.85%	93.37%
对比例1	86.79%	81.42%	75.91%
				对比例2	87.46%	82.94%	77.41%
对比例3	88.31%	84.54%	80.20%
				对比例4	90.15%	86.64%	81.39%
对比例5	91.49%	86.86%	79.67%
				对比例6	93.60%	88.02%	82.19%

由表1可以看出实施例1至3冻存液中的诱导多能干细胞在液氮中保存6个月后，经复苏细胞的存活率高于93%。对比例1至6中调整了冻存液的成分，诱导多能干细胞在冻存6个月经复苏的存活率均有不同程度的下降。

对比例1至3中分别省去覆盆子醇和氯沙坦钾或者省去氯沙坦钾后增加覆盆子醇的用量，得到的冻存液保存诱导多能干细胞，随着冻存时间的延长，复苏后细胞的存活率下降明显，在保存6个月后诱导多能干细胞经复苏后的存活率分别为75.91%、77.41%和80.20%，说明本发明的冻存液通过添加添加覆盆子醇和氯沙坦钾代替DMSO，一方面，保证诱导多能干细胞内水分的动态平衡，减少在降温至冰点时诱导多能干细胞内形成的冰晶，避免因冰晶损伤细胞内部结构造成细胞死亡；另一方面，稳定细胞膜，调整诱导多能干细胞冻存过程中的渗透压，避免细胞过度失水而失去活性，进而提高诱导多能干细胞经长时间冻存后的复苏存活率。

对比例4至5中分别省去肝素钠和毛喉素，冻存液中诱导多能干细胞在保存6个月后经复苏检测细胞的平均成活率分别为81.39%和79.67%，远远低于实施例1至3中的诱导多能干细胞的存活率，说明本发明通过添加肝素钠避免诱导多能干细胞聚集成团影响冻存细胞的活性。添加毛喉素可使经液氮冻存后的诱导多能干细胞快速恢复活性，提高细胞复苏的存活率。

对比例6中省去了金丝桃苷，即使调整维生素E的用量诱导多能干细胞的存活率也有一定程度的下降，说明本发明的冻存液中通过添加金丝桃和维生素E协同作用，避免冻存过程中形成自由基对细胞造成伤害，提高诱导多能干细胞的存活率。

综上，本发明提供的冻存液通过覆盆子醇、氯沙坦钾、肝素钠、毛喉素、金丝桃苷、维生素E等成分的协同作用，在不添加动物血清和DMSO的情况下，还能有效保证冻存后诱导多能干细胞的活性，有利于诱导多能干细胞的长期保存。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种诱导多能干细胞冻存液，其特征在于，包括基础培养基和添加剂，所述添加剂的成分包括：覆盆子醇、氯沙坦钾、肝素钠、毛喉素、金丝桃苷、维生素E、胰岛素、亚硒酸钠。

2. 根据权利要求1所述诱导多能干细胞冻存液，其特征在于，以终浓度计，所述添加剂中各组分的浓度为：覆盆子醇9.8-12.5μg/mL、氯沙坦钾8.5-11.2μg/mL、肝素钠15.5-18.5ng/mL、毛喉素10.8-14.5ng/mL、金丝桃苷6.5-8.5μg/mL、维生素E 5.0-9.5μg/mL、胰岛素4.0-10.0ng/mL、亚硒酸钠8.5-10.5ng/mL。

3. 根据权利要求1所述诱导多能干细胞冻存液，其特征在于，以终浓度计，所述添加剂中各组分的浓度为：覆盆子醇10.5μg/mL、氯沙坦钾9.8μg/mL、肝素钠17.0ng/mL、毛喉素13.2ng/mL、金丝桃苷7.5μg/mL、维生素E 8.0μg/mL、胰岛素5.5ng/mL、亚硒酸钠9.0ng/mL。

4.根据权利要求1所述诱导多能干细胞冻存液，其特征在于，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。

5.一种诱导多能干细胞的冻存方法，其特征在于，采用权利要求1至4任一项所述的冻存液进行冻存。

6.根据权利要求5所述诱导多能干细胞的冻存方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）向权利要求1至4任一项所述的冻存液中加入待冻存的诱导多能干细胞，得到含有诱导多能干细胞的悬液；

（2）将上述步骤（1）的悬液在-80℃冷冻5-9h后转移至液氮中进行保存。

7.根据权利要求5所述诱导多能干细胞的冻存方法，其特征在于，所述悬液中诱导多能干细胞的浓度为1×10⁶-1×10⁷个/mL。