CN111789104A

CN111789104A - 一种冷冻保存液在干细胞冻存中的应用

Info

Publication number: CN111789104A
Application number: CN202010171835.9A
Authority: CN
Inventors: 乔杰; 严杰; 闫丽盈; 李蓉; 王健君; 金晟琳
Original assignee: Institute of Chemistry CAS; Peking University Third Hospital Peking University Third Clinical Medical College
Current assignee: Beijing Dai Na Mi Ke Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-04-09
Filing date: 2020-03-12
Publication date: 2020-10-20
Anticipated expiration: 2040-03-12
Also published as: CN111789104B; CN111789106A; CN111789106B; CN111789108A; CN111789108B

Abstract

本发明公开了一种冷冻保存液在干细胞冷冻保存中应用。所述冷冻保存液含有PVA，乙二醇和蔗糖。所述冷冻保存液以PVA为主要低温保护剂成分，DMSO含量低，毒性小，用于细胞或组织尤其是卵母细胞的冷冻保存时，能达到与商业化冷冻保存液(含有DMSO 15％)同等甚至更高的细胞存活率和功能表达稳定性，具有较高的保存效率。本发明的冷冻保存液组成简单，且原料来源方便，成本低廉，可广泛应用于各类细胞、组织以及器官的冷冻保存。

Description

一种冷冻保存液在干细胞冻存中的应用

本申请要求2019年4月9日向中国国家知识产权局提交的专利申请号为201910282416.X，发明名称为“一种基于PVA的冷冻保存液及其制备方法”的在先申请的优先权。该在先申请的全文通过引用的方式结合于本申请中。

技术领域

本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种冷冻保存液在干细胞冻存中的应用。

背景技术

冷冻保存是指将细胞、组织或器官保存于超低温状态下，使细胞新陈代谢和分裂速度减慢或者停止，一旦恢复正常生理温度又能继续发育。该技术自问世以来，成为自然科学领域不可缺少的研究方法之一，已被广泛采用。近年来，随着生活压力的增加，人类生育力呈逐年下降的趋势，生育力保存越来越受到人们的重视，人类生殖细胞(精子、卵母细胞)、性腺组织等的冷冻保存就成为保存生育力的重要手段。另外，随着世界人口老龄化加剧，对捐赠的可用于再生医学和器官移植的人源性细胞、组织或器官的冷冻保存的需求也极速增加。因此，如何高效的冷冻保存珍贵的细胞、组织以及器官资源以备不时之需成为亟待解决的科学技术问题。

目前最常用的冷冻保存方法为玻璃化冷冻。玻璃化冷冻技术虽然在快速冷冻过程中可使细胞内外的液体直接成为玻璃态而避免了冷冻过程中因冰晶形成而导致的损伤。但是，在复温过程中，现有的冷冻保存试剂不能有效的控制冰晶的生长，从而损害细胞。目前玻璃化冷冻方法所使用的高浓度(≥15％)的有机溶剂，如：DMSO，导致冷冻保存试剂对细胞的毒副作用，严重影响冷冻保存对象复苏后的存活率甚至(子代)安全性以及功能表达。综上，目前采用的冷冻保存试剂不具备复温过程中有效控制冰晶生长的能力，同时存在试剂毒性大的问题。

发明内容

为改善现有技术的上述缺陷，本发明提供一种基于PVA的冷冻保存液，并且提供所述冷冻保存液在干细胞冻存中的应用。

本发明提供如下技术方案:

一种冷冻保存液，以每100mL体积计，含有PVA 0.01-6.0g，多元醇5.0-45mL，水溶性糖0.1-1.0mol L^-1，DMSO 0-15mL，血清0-30mL，和缓冲液余量。

根据本发明，所述PVA选自无规PVA，例如所述PVA的间同规整度为45％-65％、50％-55％。

根据本发明，所述PVA可选自分子量为10-500kDa或者更高分子量的PVA，例如分子量为10-30kDa、30-50kDa、80-90kDa、200-500kDa。

根据本发明，所述PVA可选自水解度为大于80％的PVA，例如水解度为80％-99％、82-87％、87％-89％、89％-99％、98％-99％。

根据本发明，所述多元醇可以为碳原子数2-5的多元醇，优选碳原子数2-3的二元醇、三元醇，例如乙二醇，丙二醇，丙三醇中的任一种。

根据本发明，所述水溶性糖可以为非还原性双糖、水溶性多糖、糖酐中的至少一种，例如选自蔗糖、海藻糖、水溶性纤维素、聚蔗糖；优选蔗糖、羟丙基甲基纤维素等。所述水溶性糖可以起到保护细胞膜和避免细胞沉降的作用。

根据本发明，所述血清针对人源性冷冻保存对象可选人血清白蛋白或替代物，例如十二烷基磺酸钠SDS，针对非人源性冷冻保存对象可选胎牛血清或牛血清白蛋白。

根据本发明，所述缓冲液可以为DPBS、hepes-buffered HTF缓冲液、其他已知的细胞培养缓冲液中的至少一种。

根据本发明的冷冻保存液，所述PVA含量为0.1-5.5g、0.5-5.0g，例如1.0g、2.0g、3.0g、4.0g。

根据本发明的冷冻保存液，所述多元醇含量为6.0-40mL，例如7.0-20mL，10-15mL。

根据本发明的冷冻保存液，所述DMSO含量为0.1-15mL，例如1.0-10mL，优选1.5-7.5mL；作为本发明的另一实施方案，所述DMSO含量为0。

根据本发明的冷冻保存液，所述血清含量为0.1-30mL，例如5.0-20mL，10-15mL；作为本发明的另一实施方案，所述血清含量为0。

根据本发明的冷冻保存液，所述水溶性糖含量为0.1-1.0mol L^-1，例如0.1-0.8molL^-1，0.2-0.6mol L^-1；具体地，例如0.25mol L^-1，0.5mol L^-1，1.0mol L^-1。

根据本发明的冷冻保存液，其pH为6.5-7.6，例如为6.9-7.2。

作为本发明的一个实施方案，所述冷冻保存液以每100mL体积计，包括如下组分：

优选，所述冷冻保存液以每100mL体积计，包括如下组分：

优选：所述冷冻保存液以每100mL体积计，包括如下组分：

作为本发明的一个实施方案，所述冷冻保存液以每100mL体积计，由如下组分组成：

优选：所述冷冻保存液以每100mL体积计，由如下组分组成：

根据本发明，所述冷冻保存液以每100mL体积计，还可以包括0-9.0g的聚氨基酸(聚合度≥2,如聚合度为6、8、15、20等)，例如包括1.0-6.0g、2.0-5.0g、3.0g、或4.0g聚氨基酸。优选所述聚氨基酸的聚合度为6～25。

根据本发明，所述聚氨基酸可选自赖氨酸、精氨酸、脯氨酸、苏氨酸等中至少一种或两种以上氨基酸的聚合物。

根据本发明，所述冷冻保存液以每100mL体积计，还可以包括0-50g的氨基酸，例如包括1.0-25g、4.0-20g、或8.0-10g的赖氨酸、精氨酸、脯氨酸、苏氨酸组氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、甘氨酸等中的至少一种或两种以上氨基酸的组合。

本发明还提供所述冷冻保存液的制备方法，包括如下步骤：

(1)将PVA溶解于一部分缓冲液中，冷却到室温后调节pH，得到溶液1；

(2)任选地，将聚氨基酸或氨基酸溶解于一部分缓冲液，冷却到室温后调节pH形成溶液2；

(3)将水溶性糖溶解于另一部分缓冲液中，待水溶性糖全部溶解后加入其他组分，制得溶液3；

(4)待溶液1、任选地溶液2、和溶液3冷却至室温后混合，再次确认或调节pH并补齐余量缓冲液至预定体积，得到所述冷冻保存液。

根据本发明的制备方法，当所述冷冻保存液含有血清时，所述血清在所述冷冻保存液使用时添加。

根据本发明的制备方法，所述步骤(1)中，PVA温浴加热溶解，例如水浴或者油浴；例如温浴温度为60-95℃，优选80℃。所述步骤(1)中，所述溶解包括搅拌步骤。

根据本发明的制备方法，所述步骤(2)中，所述溶解为超声辅助溶解。

一种冷冻平衡液，以每100mL体积计，含有PVA 0-5.0g，多元醇5.0-45mL，缓冲液余量。

根据本发明的冷冻平衡液，还任选地包括DMSO 0-15mL，血清0-30mL。

根据本发明的冷冻平衡液，所述PVA含量为0.1-5.0g，例如0.1g、0.5g、1.0g、2.0g。

根据本发明的冷冻平衡液，所述多元醇含量为6.0-28mL，例如7.0-20mL，10-15mL。

根据本发明的冷冻平衡液，所述DMSO含量为0.1-15mL，例如1-10mL，1.5-7.5mL；作为本发明的一个实施方案，所述DMSO的含量为0。

根据本发明的冷冻平衡液，所述血清含量为0.1-30mL，例如5.0-20mL，10-15mL；作为本发明的一个实施方案，所述血清的含量为0。

作为本发明的一个实施方案，所述冷冻平衡液以每100mL体积计，含有多元醇5.0-7.5mL，DMSO 5.0-7.5mL，血清10-20mL，缓冲液余量。

作为本发明的一个实施方案，所述冷冻平衡液以每100mL体积计，多元醇7.5-15mL，血清10-20mL，缓冲液余量。

作为本发明的一个实施方案，所述冷冻平衡液以每100mL体积计，含有PVA1.0-5.0g，多元醇7.5-15mL，缓冲液余量。

冷冻平衡液中PVA、多元醇、血清和缓冲液具有和冷冻保存液中相同的含义。

本发明还提供上述冷冻平衡液的制备方法，包括将各组分溶解于缓冲液中，血清单独存放，在使用时添加。

一种基于PVA的冷冻保存用试剂，包括上述冷冻平衡液和上述冷冻保存液，所述冷冻平衡液和冷冻保存液彼此独立存在。

作为本发明的一个实施方案，所述冷冻保存用试剂中，所述冷冻保存液的DMSO含量为0，所述冷冻平衡液以每100mL体积计，含有PVA 0-5.0g，多元醇7.5-15mL，血清10-20mL，缓冲液余量。当所述冷冻保存液的DMSO和血清含量均为0时，所述冷冻平衡液以每100mL体积计，含有PVA 1.0-5.0g，多元醇7.5-15mL，缓冲液余量。

根据本发明的冷冻保存用试剂，所述冷冻平衡液以每100mL体积计，包括如下组分：

所述冷冻保存液以每100mL体积计，包括如下组分:

本发明还提供上述冷冻保存液或冷冻平衡液或冷冻保存试剂的应用，用于细胞、组织或器官的冷冻保存；例如用于卵母细胞、精子或干细胞、卵巢组织、胚胎或卵巢器官的冷冻保存。

进一步地，本发明提供上述冷冻保存液在干细胞冷冻保存中的应用。

根据本发明的实施方案，所述干细胞为本领域已知的具有分化功能的各种干细胞，例如全能干细胞、多能干细胞或者专能干细胞，包括但不限于胚胎干细胞、各类间充质干细胞(例如脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞等)、造血干细胞等。

根据本发明的实施方案，干细胞冷冻保存采用微滴法，例如所述干细胞冷冻保存的应用包括如下步骤：将冷冻保存液加入干细胞中，吹打分散，制成干细胞悬液，将干细胞悬液置于冷冻载片上，液氮(-196℃)冷冻保存。

根据本发明的实施方案，冷冻保存的干细胞的解冻包括将置有干细胞的冷冻载片置于a-MEM培养基中，37℃解冻。

本发明中“冻存”和“冷冻保存”具有相同含义，可互换使用，指通过低温对某种物质或者细胞、组织、器官进行保存，使其保持其本来的理化和/或生物活性、生理生化功能。

有益效果

(1)本发明提供的冷冻保存液以PVA为主要成分，DMSO含量低，毒性小，安全性好。

(2)本发明选用特定结构的无规PVA作为主要控冰材料，由于其在冰水界面具有更加优异的铺展性能，能有效抑制冰晶生长，减小冰晶对细胞的损害，用于冷冻保存液时，较少用量的PVA即可实现良好的冷冻保存效果。

(3)本发明的冷冻保存液以特殊的PVA和其他特定比例的渗透性保护剂、非渗透保护剂共同作用，用于细胞或组织尤其是卵母细胞和胚胎的冷冻保存时，能达到与商业化冷冻保存液(含有DMSO 15％)同等甚至更高的细胞存活率和功能表达稳定性，具有较高的保存效率。

(4)本发明的冷冻保存液组成简单，且原料来源方便，成本低廉，可广泛应用于各类细胞(卵母细胞、胚胎、干细胞等)、组织以及器官冷冻保存。

附图说明

图1为新鲜卵巢器官切片染色图片；

图2为对比实例8冻存的完整卵巢器官解冻后切片染色图片；

图3-5依次为应用实例13-15冻存的完整卵巢器官解冻后切片染色图片；

图6为新鲜卵巢组织切片染色图片；

图7为对比实例9冻存的卵巢组织解冻后切片染色图片；

图8-10依次为应用实例16-18冻存的卵巢组织解冻后切片染色图片。

具体实施方式

下文将结合具体实施例对本发明的制备方法做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明实施例中采用的PVA为间同规整度为50％-55％，分子量为13-23kDa，水解度98％。

本发明实施例中冷冻保存液中采用聚-L-脯氨酸聚合度为8或15，分子量分别为795或1475；聚L-精氨酸聚合度为8，分子量为1267。解冻液中聚-L-脯氨酸聚合度为8，分子量为795。

本实施例中存活率为每组3-12次重复实验存活率的平均值。

实施例1：卵母细胞和胚胎冻存

1.制备冷冻保存液：按以下配方配制冷冻保存液

冷冻保存液A:

每100mL中含有如下组分：

物质	含量
		PVA(g)	2.0
乙二醇(mL)	10
		DMSO(mL)	10
蔗糖(mol L<sup>-1</sup>)	0.5
		胎牛血清(mL)	20
DPBS(mL)	余量

将2.0g的PVA在80℃水浴中加热并磁力搅拌溶于25mL的DPBS中，待PVA全部溶解并冷却到室温后调节pH为7.0，为溶液1；17g(0.05mol)的蔗糖(蔗糖在冷冻保存液中终浓度为0.5mol L^-1)超声溶解于25mL的DPBS中，待蔗糖全部溶解后加入10mL的乙二醇、10mL的DMSO，为溶液2，待溶液1及溶液2恢复至室温，再将两种溶液混均，调节pH值并定容补齐余量至总体积的80％，20mL血清单独存放待保存液使用时添加。

冷冻保存液B：

每100ml中含有如下组分：

物质	含量
		L-Arg(g)	8.0
L-Thr(g)	4.0
		PVA(g)	2.0
乙二醇(mL)	10
		蔗糖(mol L<sup>-1</sup>)	0.5
胎牛血清(mL)	20
		DPBS(mL)	余量

冷冻保存液配液步骤：将2.0g的PVA在80℃水浴中加热并磁力搅拌溶于20mL的DPBS中，调节pH为7.1，为溶液1；将8.0g的L-Arg和4.0g的L-Thr溶于20mL的DPBS中，调节pH为7.1，为溶液2；17g(0.05mol)的蔗糖(蔗糖在冷冻保存液中终浓度为0.5mol L^-1)超声溶解于20mL的DPBS中，待蔗糖全部溶解后加入10mL的乙二醇，为溶液3；待溶液1、溶液2及溶液3恢复至室温，再将三种溶液混均，调节pH值并定容补齐余量至总体积的80％，使用时加入20mL的血清。

冷冻保存液C:

每100ml中含有以下组分：

将2.0g的PVA在80℃水浴中加热并磁力搅拌溶于25mL的DPBS中，调节pH为6.9，为溶液1；17g(0.05mol)的蔗糖(蔗糖在冷冻保存液中终浓度为0.5mol L^-1)超声溶解于25mL的DPBS中，待蔗糖全部溶解后加入10mL的乙二醇，为溶液2，待溶液1及溶液2恢复至室温，再将两种溶液混均，调节pH值并定容补齐余量至总体积的80％，20mL血清单独存放待保存液使用时添加。

冷冻保存液D：

每100ml中含有以下组分：

物质	用量
		PVA(g)	2.0
乙二醇(mL)	10
		蔗糖(mol L<sup>-1</sup>)	0.5
DPBS(mL)	余量

将2.0g的PVA在80℃水浴中加热并磁力搅拌溶于30mL的DPBS中，调节pH为7.0，为溶液1；17g(0.05mol)的蔗糖(蔗糖在冷冻保存液中终浓度为0.5mol L^-1)超声溶解于25mL的DPBS中，待蔗糖全部溶解后加入10mL的乙二醇，为溶液2，待溶液1及溶液2恢复至室温，再将两种溶液混均，调节pH值并定容补齐余量至总体积100mL，备用。

冷冻保存液E:

每100ml中含有以下组分：

配液步骤：将2.0g的PVA在80℃水浴中加热并磁力搅拌溶于25mL的DPBS中，调节pH为7.0，为溶液1；将1.5g的聚-L-脯氨酸(聚合度15)超声溶于另外20mL的DPBS中，调节pH为7.0，为溶液2；17g(0.05mol)的蔗糖(蔗糖在冷冻保存液中终浓度为0.5mol L^-1)超声溶于25mL的DPBS中，待蔗糖全部溶解后依次加入10mL乙二醇，为溶液3，待溶液1、溶液2及溶液3恢复至室温，再将3种溶液混均，调节pH值并定容补齐余量至总体积100mL，备用。

2.制备冷冻平衡液：按以下配方配制冷冻平衡液

冷冻平衡液a：将7.5mL的乙二醇、7.5mL的DMSO加入65mL的DPBS中，混匀，使用时加入20m L的血清。

冷冻平衡液b：将7.5mL的乙二醇溶于72.5mL的DPBS中，混匀，使用时加20mL的血清。

冷冻平衡液c:将2.0g的PVA在80℃水浴中加热并磁力搅拌溶于50mL的DPBS中，待PVA全部溶解，调节pH为7.0，加入7.5mL乙二醇，混匀，调节pH值并定容补齐余量至100mL，备用。

对比例1：

冷冻平衡液a：每1mL中含有7.5％(v/v)的DMSO,7.5％(v/v)的乙二醇，20％(v/v)的胎牛血清，余量为DPBS；

冷冻保存液1#：每1mL中含有15％(v/v)的DMSO,15％(v/v)的乙二醇，20％(v/v)的胎牛血清，0.5M蔗糖，余量为DPBS。

冷冻平衡液2#：每1mL中含有7.5％(v/v)的乙二醇，20％(v/v)的胎牛血清，余量为DPBS；

冷冻保存液2#：每1mL中含有10％(v/v)的乙二醇，20％(v/v)的胎牛血清，0.5M蔗糖，余量为DPBS。

实施例1和对比例1采用的解冻液配方有如下三种：

解冻液1#：解冻液Ⅰ(含有1.0mol L^-1蔗糖，20％的血清，余量为DPBS)；解冻液Ⅱ(含有0.5mol L^-1蔗糖，20％的血清，余量为DPBS)；解冻液Ⅲ(含有0.25mol L^-1蔗糖，20％的血清，余量为DPBS)；解冻液Ⅳ(20％的血清，余量为DPBS)。

解冻液2#：解冻液Ⅰ(含有1.0mol L^-1的蔗糖，20mg mL^-1的PVA，余量为DPBS)；解冻液Ⅱ(含有0.5mol L^-1蔗糖，20mg mL^-1的PVA，余量为DPBS)；解冻液Ⅲ(含有0.25mol L^-1蔗糖，20mg mL^-1的PVA，余量为DPBS)；解冻液Ⅳ(20mg mL^-1的PVA，余量为DPBS)。

解冻液3#：解冻液Ⅰ(含有1.0mol L^-1的蔗糖，20mg mL^-1的PVA，10mg mL^-1的聚脯氨酸，余量为DPBS)；解冻液Ⅱ(含有0.5mol L^-1蔗糖，20mg mL^-1的PVA，5.0mg mL^-1的聚脯氨酸，余量为DPBS)；解冻液Ⅲ(含有0.25mol L^-1蔗糖，20mg mL^-1的PVA，2.5mg mL^-1的聚脯氨酸，余量为DPBS)；解冻液Ⅳ(20mg mL^-1的PVA，余量为DPBS)。

应用例1：

采用上述实施例及对比例的冷冻平衡液以及冷冻保存液按表1和表2中的方案分别进行卵母细胞和胚胎冷冻保存。

1.卵母细胞冷冻保存

小鼠卵母细胞先置于冷冻平衡液中平衡5分钟；然后置于所制备冷冻保存液中1分钟，将已在冷冻保存液中平衡后的卵母细胞放置于冷冻载杆上，然后快速投入液氮中(-196℃)中，并封闭载杆后继续保存；解冻时，将冻存的卵母细胞置于37℃的解冻液Ⅰ中平衡5分钟，再依次在解冻液Ⅱ-Ⅳ中各平衡3分钟；将解冻完毕的卵母细胞培养2小时后观察存活细胞数量，计算存活率(参见表1)。

2.胚胎冷冻保存

小鼠胚胎先置于冷冻平衡液平衡5分钟，然后置于上述实施例或对比例中的配方所制备冷冻保存液中50秒，将已在冷冻保存液中平衡的胚胎放置于冷冻载杆上，然后快速投入液氮(-196℃)中，并封闭载杆后继续保存；解冻时，将胚胎置于37℃的解冻液Ⅰ中平衡3分钟，再依次在解冻液Ⅱ-Ⅳ中各平衡3分钟；将解冻完毕胚胎培养2小时，观察存活胚胎数量，计算存活率(参见表2)。

表1小鼠卵母细胞冷冻保存存活率

编号	平衡液	冷冻保存液	解冻液	冻卵总数	2小时后存活率<sup>*</sup>
						应用实例1	a	A	解冻液1#	67	100.0％
应用实例2	b	B	解冻液1#	109	94.8％
						应用实例3	b	C	解冻液1#	90	97.7％
应用实例4	c	D	解冻液1#	50	93.4％
						应用实例5	c	D	解冻液2#	53	96.5％
应用实例6	c	E	解冻液1#	39	89.7％
						应用实例7	c	E	解冻液3#	60	98.6％
对比实例1	a	冷冻液1#	解冻液1#	146	95.0％
						对比实例2	平衡液2#	冷冻液2#	解冻液1#	96	81.9％
对比实例3	平衡液2#	冷冻液2#	解冻液2#	44	94.7％

表2小鼠胚胎冷冻保存存活率

以上数据表明该冷冻保存液可以达到90％以上甚至100％的存活率，能达到或远远超过目前临床普遍使用的含有15％DMSO的商业化冷冻保存液的冷冻保存复苏率，应用实例1(含有10％的DMSO)和对比实例1，即商业化的卵母细胞冻存液(含有15％的DMSO)的对比可以看出，PVA的加入显著提高了卵母细胞的存活率；应用实例2-3也表明，本发明添加PVA的完全不含有DMSO的冷冻保存液，也能达到较高的卵母细胞或胚胎存活率，解决了目前临床普遍使用的商业化冷冻保存液DMSO浓度高、对细胞损害大的问题；并且，应用实例5、7-9表明，在冷冻液，平衡液以及解冻液中均不添加DMSO和血清的情况下，也可实现较高的卵母细胞或胚胎存活率。解决了目前临床普遍使用的商业化冷冻保存液因含有血清而造成的保质期短、带入寄生性生物污染物质等问题。

实施例2：干细胞冻存

冷冻保存液C1：

每100ml中含有以下组分：

物质	用量
		PVA(g)	1.0
乙二醇(mL)	10
		蔗糖(mol L<sup>-1</sup>)	0.5
胎牛血清(mL)	20
		DPBS(ml)	余量

冷冻保存液D：

每100ml中含有以下组分：

冷冻保存液F:

每100ml中含有以下组分：

物质	用量
		聚-L-精氨酸(g,聚合度为8)	4.0
PVA(g)	1.0
		乙二醇(ml)	10
蔗糖(mol L<sup>-1</sup>)	0.5
		血清(ml)	20
DPBS(ml)	余量

冷冻保存液制备方法与实施例1相同。

2.对比例2：

冷冻保存液1#：每1mL中含有15％(v/v)的DMSO,15％(v/v)的乙二醇，20％(v/v)的胎牛血清，0.5mol L^-1蔗糖，余量为DPBS。

冷冻保存液3#：每1mL中含有10％(v/v)的DMSO，15％(v/v)的胎牛血清，余量为培养基a-MEM(USA,Invitrogen,C12571500BT)。

应用例2：

采用上述实施例及对比例的冷冻保存液按表3中的方案分别进行人脐带间充质干细胞的冷冻保存。

1.微滴法冷冻保存人脐带间充质干细胞

本发明所用人脐带干细胞冷冻保存方法具体为：将培养皿上的人脐带间充质干细胞用25％胰酶消化2分钟后，放入等体积培养液(10％FBS+a-MEM培养基)，轻柔吹打至干细胞全部脱落，加入1.5ml离心管，1000rmp离心5分钟，弃上清(将细胞与培养基分离)，将10uL冷冻液加入离心管底部，轻柔吹打使干细胞团分散，将此10uL带有干细胞的冷冻液置于冷冻载片上，置于液氮(-196摄氏度)冻存。解冻时，将带有细胞及冷冻液的冷冻载杆直接放入37℃培养基中进行解冻。解冻后，台盼蓝染色察看其存活率，并使用仪器JIMBIO-FIL计数细胞数量，存活率＝活细胞数/细胞总数(参见表3)。

表3人脐带间充质干细胞冷冻保存存活率

编号	冷冻保存液	冷冻保存方法	存活率
				应用实例10	C1	微滴法	72.2％
应用实例11	D	微滴法	77.1％
				应用实例12	F	微滴法	92.4％
对比实例6	冷冻保存液1#	微滴法	63.9％
				对比实例7	冷冻保存液3#	微滴法	76.6％

本发明的冷冻保存液进行人脐带间充质干细胞冷冻保存时，即使不使用DMSO干细胞存活率也可达92.4％和72.2％(应用实例12和10)，甚至在完全不添加DMSO和血清时，存活率也可达到77.1％，达到现有冷冻试剂的存活率水平，表明该冷冻用试剂不仅能达到常规冷冻液冷冻干细胞的有效性，甚至达到或远高于目前普遍使用的含有10％的DMSO的冷冻保存液(对比实例7)的冷冻保存复苏率，基于PVA的冷冻保存效果显著优于不添加PVA的对比实例6。

实施例3：完整卵巢器官与卵巢组织切片冻存1.配制冷冻保存液冷冻保存液D：

每100ml中含有以下组分：

冷冻保存液C1:每100ml中含有以下组分：

冷冻保存液F:

每100ml中含有以下组分：

冷冻保存液制备方法与实施例1相同。

制备冷冻平衡液：按以下配方配制冷冻平衡液

2.对比例：

3.解冻液：

应用例3:

采用上述实施例及对比例的冷冻平衡液以及冷冻保存液按表4、表5中的方案分别对新生3天内的小鼠卵巢器官和性成熟小鼠的卵巢组织切片进行冷冻保存。

整个卵巢器官或者卵巢组织切片先置于冷冻平衡液室温平衡25分钟，然后置于所制备的冷冻保存液中15分钟，之后将完整卵巢器官或卵巢组织切片放置于冷冻载杆上，投入液氮中保存。解冻后，完整卵巢器官或卵巢组织切片放入培养液(10％FBS+a-MEM)后置于37℃、5％CO₂培养箱中复苏培养2小时后使用4％多聚甲醛固定、石蜡包埋、HE染色观察形态，结果如图1-10所示，其中图1为新鲜未冷冻的卵巢器官切片照片，图6为新鲜未冷冻的卵巢组织切片照片。

表4卵巢器官冷冻保存方案

编号	平衡液	冷冻保存液	解冻液	形态
					应用实例13	c	D	解冻液2#	图3
应用实例14	b	C1	解冻液1#	图4
					应用实例15	b	F	解冻液1#	图5
对比实例8	a	冷冻液1#	解冻液1#	图2

表5卵巢组织切片冷冻保存方案

根据图1-图5可知，与使用不添加聚乙烯醇的对比实例8以及新鲜未冷冻的卵巢器官相比，应用实例13-15中原始卵泡结构相对完整，间质结构相对完整，细胞胞浆均质、淡染相对较多，胞核皱缩、深染相对较少；血管管壁结构完整，管腔塌陷较少，内皮细胞胞浆均质、淡染相对较多，胞核皱缩、深染相对较少。可见，应用实例13-15组对于卵巢器官的冻存效果更好。

根据图6-图10可知，应用实例16-18的方案和对比实例9以及新鲜未冷冻的成年小鼠卵巢组织相比，生长期卵泡及窦卵泡结构相对完整，可见本发明的冻存液用于冻存卵巢组织也比现有技术具有更好的效果。

由此可见，本发明以PVA类仿生控冰材料为主要成分制备的冷冻保存液具有良好的抑制冰晶生长的效果，可以减少保存体系中DMSO的用量，甚至不加DMSO，可保持良好的生物相容性，并且可以同时适用于卵母细胞、胚胎、干细胞、生殖器官和组织的冷冻保存，均可达到良好的细胞存活率和生物活性。

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种冷冻保存液在干细胞冷冻保存中应用，其特征在于，以所述冷冻保存液的每100mL体积计，含有PVA 0.01-6.0g，多元醇5.0-45mL，水溶性糖0.1-1.0molL^-1，DMSO 0-15mL，血清0-30mL，缓冲液余量。

2.根据权利要求1所述的冷冻保存液在干细胞冷冻保存中应用，其特征在于，所述DMSO含量为0.5-10mL；

优选地，所述血清含量为10-20mL。

3.根据权利要求1所述的冷冻保存液在干细胞冷冻保存中应用，其特征在于，所述DMSO和/或血清含量为0。

4.根据权利要求1-3任一项所述的冷冻保存液在干细胞冷冻保存中应用，其特征在于，所述多元醇为C2-5的多元醇，例如乙二醇，丙二醇，丙三醇中的任一种；

优选，所述血清针对人源性冷冻保存对象可选人血清白蛋白或替代物，如：十二烷基磺酸钠SDS，针对非人源性冷冻保存对象可选胎牛血清或牛血清白蛋白；

优选，所述水溶性糖为非还原性双糖、水溶性多糖、糖酐中的至少一种，例如选自蔗糖、海藻糖、水溶性纤维素、聚蔗糖；

优选地，所述缓冲液为DPBS、hepes-buffered HTF缓冲液或其他细胞培养缓冲液中的至少一种。

优选地，所述PVA含量为0.1-5.5g，优选地，所述冷冻保存液pH为6.5-7.6。

5.根据权利要求2或4所述的冷冻保存液在干细胞冷冻保存中应用，其特征在于，所述冷冻保存液以每100mL体积计，由如下组分组成：

PVA 0.01-6.0g

多元醇 5.0-45mL

血清 0.1-30mL

水溶性糖 0.1-1.0mol L^-1

缓冲液余量；

优选，所述冷冻保存液以每100mL体积计，由如下组分组成：

PVA 1.0-5.0g

多元醇5.0-20mL

DMSO 0.1-10mL

血清 0.1-20mL

水溶性糖 0.2-0.8mol L^-1

缓冲液余量；

优选，所述冷冻保存液以每100mL体积计，由如下组分组成：

PVA 0.1-6.0g

多元醇 10-45mL

水溶性糖 0.2-1.0mol L^-1

缓冲液余量。

6.根据权利要求1-5任一项所述的冷冻保存液在干细胞冷冻保存中应用，其特征在于，所述PVA为无规PVA，例如所述PVA的间同规整度为45％-60％；

优选，所述PVA选自分子量为10-500kDa或者更高分子量的PVA；

优选，所述PVA选自水解度为大于80％的PVA。

7.根据权利要求1-6任一项所述的冷冻保存液在干细胞冷冻保存中应用，其特征在于，所述冷冻保存液以每100mL体积计，还包括0-9.0g的聚合度≥2的聚氨基酸；优选所述聚氨基酸的聚合度为2～40；

优选，所述冷冻保存液以每100mL体积计，还包括0-50g的氨基酸。

8.根据权利要求1-7任一项所述的冷冻保存液在干细胞冷冻保存中应用，所述冷冻保存液采用如下步骤制备：

(3)将水溶性糖溶解于剩余一部分缓冲液中，待全部溶解后加入其他组分，制得溶液3；

(4)待溶液1、任选地溶液2、和溶液3冷却至室温后混合，得到所述冷冻保存液；

任选地，当所述冷冻保存液含有血清时，所述血清在所述冷冻保存液使用时添加。

9.根据权利要求1-8任一项所述的冷冻保存液在干细胞冷冻保存中应用，所述干细胞选自全能干细胞、多能干细胞或者专能干细胞中的至少一种，例如胚胎干细胞、间充质干细胞(例如脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞等)、造血干细胞。

10.根据权利要求1-9任一项所述的冷冻保存液在干细胞冷冻保存中应用，干细胞冷冻保存采用微滴法，包括如下步骤：将冷冻保存液加入干细胞中，吹打分散，制成干细胞悬液，将干细胞悬液置于冷冻载片上，液氮(-196℃)冷冻保存。