CN112586495A

CN112586495A - 一种肿瘤组织保存液及应用

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Publication number: CN112586495A
Application number: CN202011641294.8A
Authority: CN
Inventors: 万勇; 徐中华; 李明
Original assignee: Guangzhou Darui Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Darui Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-12-31
Filing date: 2020-12-31
Publication date: 2021-04-02
Anticipated expiration: 2040-12-31
Also published as: CN112586495B

Abstract

本发明公开了一种肿瘤组织保存液及应用，本发明所述的原代肿瘤组织保存液不含血清，成分明确，批间差异小。BSA、海藻糖、γ‑多聚谷氨酸、亚油酸等组分联合使用，协同增效，可有效克服长时间运输保存条件下所带来的细胞酸中毒、水肿以及外部物理应力，从而减少细胞损伤，维持组织形态结构和细胞活力，随着保存时间的延长，癌组织的细胞活力下降减缓，保存后的细胞胶滴包埋培养成功率高，能够满足肿瘤组织更长时间保存运输的需求。

Description

一种肿瘤组织保存液及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种肿瘤组织保存液及应用。

背景技术

随着再生医学以及干细胞研究的发展，活体肿瘤组织的科研和临床应用价值日益凸显。临床新鲜肿瘤组织标本离体后的采集和保存对于标本的质量至关重要，直接影响后期研究的可靠性。在组织样本的采集、运输过程中，选择合适的保存介质可维持组织结构形态及细胞的活性，反之，保存不当则可能导致组织细胞凋亡。

通常，在2～8℃低温条件下将肿瘤组织保存在适当的保存液中进行运输，以降低细胞内的酶活性，从而降低细胞新陈代谢速率，延缓组织自溶速度，延长组织内细胞离体后的存活时间。一般情况下，人们大多常采用含血清的完全培养基作为肿瘤组织体外保存液，用于组织的短时间保存。不过，由于完全培养基是特定的培养条件和温度下使用，更适用于细胞的生长和增殖，而这与组织保存的目的并不完全相同。特别是在临床上需要长时间保存运输样本时，细胞完全培养基无法满足要求，而且血清成分复杂，存在不同品牌、批次之间的差异，血清中的未知生长因子可能对干细胞产生不可预知的诱导分化，这些可能对后续临床应用研究产生不可估计的影响。因此，临床上需要从离体组织保存运输的实际需要出发，开发一种适用于密闭条件下的长时间低温保存运输用保存液。

理想的组织保存液应满足以下几点：(1)具有不依赖CO₂条件的、稳定的酸碱缓冲系统，防止细胞酸中毒引发细胞凋亡。长时间密闭保存容易造成离体组织中细胞缺氧，将促进组织进行无氧条件下糖酵解，乳酸浓度增加，组织酸化引发溶酶体的不稳定，致使细胞发生程序性凋亡。(2)提供必要的营养物质，满足组织细胞基本新陈代谢需要，以达到长时间维持细胞活性的目的。(3)防止低温条件下的细胞水肿对组织细胞造成的不可逆损伤。低温条件下，组织中活细胞代谢速度降低，能量生成不足，可能导致维持细胞渗透压的Na⁺-K⁺泵运转失灵，细胞内渗透压增高，引起细胞水肿。(4)能够缓冲运输过程中的物理应力，减轻其对组织细胞产生的机械损伤。样本在运输过程中的物理应力，如剪切力、沉降、机械冲击、振动等，易对组织细胞产生机械损伤，保持保存液一定的黏度，可有助于缓冲机械应力，降低细胞受到机械应力损伤的风险。(5)成分明确，成本可控，能够避免动物血清带来的不利影响。

不难看出，含有动物血清的完全细胞培养基难以满足离体组织长时间保存运输的需要，而开发成分明确、性能可靠且稳定的无血清保存液无疑是更好的选择。中国专利CN201810901395.0公开了一种肿瘤组织高活性储存运输液及其制备方法，该保存液以DMEM培养基为基础，成分明确，能够保持肿瘤组织的活性，延长肿瘤组织在体外的保存时间，运输48h后，乳腺癌、肺癌组织原代培养的成活率可达90％。但在更长时间保存运输条件下可能存在一定的不足：(1)该保存液中采用碳酸氢钠缓冲体系，常规条件下，CO₂浓度较低，难以发挥较好的缓冲作用；(2)DMEM培养基营养成分有限，缺少某些脂类物质和金属离子的载体蛋白，无法满足肿瘤组织更长时间保存运输的需求；(3)缺少防止细胞水肿可能给细胞带来损伤的防范措施。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种无血清组织保存液，成分明确、性能稳定，适用于离体肿瘤组织低温条件下长时间密闭保存运输，更好的满足临床新鲜肿瘤组织的保存运输需求。

本发明的第一个目的是提供一种肿瘤组织保存液。

本发明的第二个目的是提供任一所述肿瘤组织保存液在保存实体瘤组织中的应用。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

本发明要求保护一种肿瘤组织保存液，所述肿瘤组织保存液为含有血清白蛋白、重组人胰岛素、转铁蛋白、亚油酸、Trace Elements A、自由基清除剂、细胞保护剂的无血清基础培养基。

优选地，所述无血清基础培养基为Leibovitz’s L-15、DMEM/F12、RPMI 1640、DMEM、或F-12的一种。

更优选地，所述基础培养基为Leibovitz’s L-15。

优选地，所述血清白蛋白(SA)为牛血清白蛋白(BSA)或人血清白蛋白(HSA)中的一种或两种的混合物。

更优选地，所述血清白蛋白(SA)为牛血清白蛋白(BSA)。

进一步优选地，所述肿瘤组织保存液中牛血清白蛋白(BSA)的浓度为0.5％～5％(w/v)。

进一步更优选地，所述肿瘤组织保存液中牛血清白蛋白(BSA)浓度为2％(w/v)。

优选地，所述肿瘤组织保存液中重组人胰岛素的量为1～30μg/ml。

更优选地，所述肿瘤组织保存液中重组人胰岛素的量为10μg/ml。

优选地，所述肿瘤组织保存液中转铁蛋白的量为1～20μg/ml

更优选地，所述肿瘤组织保存液中铁蛋白的量为5μg/ml。

优选地，所述肿瘤组织保存液中亚油酸的量为1～20μg/ml。

更优选地，所述肿瘤组织保存液中亚油酸的量为5μg/ml。

优选地，所述肿瘤组织保存液中Trace Elements A的用量为1×，即在所述保存液中Trace Elements A(1000×)的浓度为0.1％(v/v)。

优选地，所述自由基清除剂为谷胱甘肽、Glutamax、L-抗环血酸、巯基乙醇、二硫苏糖醇、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶中的一种或几种的混合物。

更优选地，所述自由基清除剂为Glutamax。

进一步优选地，所述肿瘤组织保存液中Glutamax的用量为1×，即在所述培养基中Glutamax(100×)的浓度为1％(v/v)。

优选地，所述细胞保护剂为多羟基化合物、糖类、氨基酸、聚合物、蛋白质中的一种或多种的混合物。

更优选地，所述细胞保护剂为海藻糖和γ-多聚谷氨酸。

进一步优选地，所述肿瘤组织保存液中海藻糖的浓度为1～10mg/ml；γ-多聚谷氨酸(500kDa)的浓度为0.01～0.1％(w/v)。

进一步更优选地，所述肿瘤组织保存液中海藻糖的浓度为2mg/ml；γ-多聚谷氨酸(500kDa)的浓度为0.075％(w/v)。

优选地，还含有抗生素。

更优选地，所述抗生素为Primocin、Antibiotic-Antimycotic、两性霉素B、氨苄青霉素、青霉素-G、卡那霉素、庆大霉素、红霉素、MRA、新霉素、制霉菌素、多黏霉素B、硫酸链霉素、四环素、泰乐霉素等的一种或几种。

更优选地，所述抗生素为Primocin。

进一步优选地，所述原代肿瘤组织保存液中Primocin的浓度为100μg/ml。

优选地，一种肿瘤组织保存液，所述肿瘤组织保存液为含有0.5～5％(w/v)的牛血清白蛋白、1～30μg/ml的重组人胰岛素、1～20μg/ml的转铁蛋白、1～20μg/ml亚油酸、0.1～10×的Trace Elements A、0.1～10×的Glutamax、1～10mg/ml的海藻糖、和0.1％～0.01％(w/v)的γ-多聚谷氨酸(500kDa)的基础培养基Leibovitz’s L-15。

最优选地，所述肿瘤组织保存液为含有2％(w/v)的牛血清白蛋白、10μg/ml的重组人胰岛素、5μg/ml的转铁蛋白、5μg/ml亚油酸、1×的Trace Elements A、1×的Glutamax、2mg/ml的海藻糖、和0.075％(w/v)的γ-多聚谷氨酸(500kDa)的基础培养基Leibovitz’sL-15。

本发明还要求保护任一所述肿瘤组织保存液在保存实体瘤组织中的应用。

优选地，所述实体瘤包括但不限于胃癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明所述的原代肿瘤组织保存液不含血清，成分明确，批间差异小。BSA、海藻糖、γ-多聚谷氨酸、亚油酸等组分联合使用，协同增效，可有效克服长时间运输保存条件下所带来的细胞酸中毒、水肿以及外部物理应力，从而减少细胞损伤，维持组织形态结构和细胞活力，随着保存时间的延长，癌组织的细胞活力下降减缓，保存后细胞胶滴包埋培养成功率高，能够满足肿瘤组织更长时间保存运输的需求。

附图说明

图1为新鲜肿瘤组织、以及在实施例1保存液和常规保存液中保存72h的肿瘤组织，经中性红染色后的细胞图片。

图2为采用实施例1保存液和常规保存液保存胃癌组织，于0h、24h、72h、120h，采用MTT法进行细胞活力测定结果。

图3为采用实施例1保存液和常规保存液保存结直肠癌组织，于0h、24h、72h、120h，采用MTT法进行细胞活力测定结果。

图4为采用实施例1保存液和常规保存液保存乳腺癌组织，于0h、24h、72h、120h，采用MTT法进行细胞活力测定结果。

图5为采用实施例2、实施例3保存液保存肿瘤组织，于72h采用MTT法进行细胞活力测定结果。

图6为采用实施例4、实施例5保存液保存肿瘤组织，于72h采用MTT法进行细胞活力测定结果。

图7为采用实施例6、实施例7保存液保存肿瘤组织，于72h采用MTT法进行细胞活力测定结果。

图8为将新鲜肿瘤组织以及在实施例1保存液和常规保存液中保存72h的肿瘤组织进行胶滴包埋培养，培养结束后的胶原凝胶滴扫描图片。

图9为将新鲜肿瘤组织以及在实施例1保存液和常规保存液中保存72h的肿瘤组织进行胶滴包埋培养，培养结束后进行扫描分析得到的细胞增殖情况。

图10为在对照例1～5和实施例1肿瘤组织保存液中分别保存72h的肿瘤组织经中性红染色后的细胞图片。

图11为分别采用对照例1～5和实施例1的肿瘤组织保存液保存肿瘤组织，于72h采用MTT法进行细胞活力测定结果。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

常规保存液：添加10％胎牛血清和1％Antibiotic-Antimycotic的DMEM/F12培养基。

重组胰岛素：品牌：ProSpec，货号：CYT-270，规格：25mg。

实施例1一种肿瘤组织保存液

组成：基础培养基Leibovitz’s L-15；BSA，2％(w/v)；重组人胰岛素，10μg/ml；转铁蛋白，5μg/ml；亚油酸，5μg/ml；Trace Elements A(1000×)，0.1％(v/v)；Glutamax(100×)，1％(v/v)；海藻糖，2mg/ml；γ-多聚谷氨酸(500kDa)，0.075％(w/v)；Primocin，100μg/ml。

实施例2一种肿瘤组织保存液

组成：基础培养基Leibovitz’s L-15；BSA，2％(w/v)；重组人胰岛素，1μg/ml；转铁蛋白，5μg/ml；亚油酸，5μg/ml；Trace Elements A(1000×)，0.1％(v/v)；Glutamax(100×)，1％(v/v)；海藻糖，2mg/ml；γ-多聚谷氨酸(500kDa)，0.075％(w/v)；Primocin，100μg/ml。

实施例3一种肿瘤组织保存液

组成：基础培养基Leibovitz’s L-15；BSA，2％(w/v)；重组人胰岛素，30μg/ml；转铁蛋白，5μg/ml；亚油酸，5μg/ml；Trace Elements A(1000×)，0.1％(v/v)；Glutamax(100×)，1％(v/v)；海藻糖，2mg/ml；γ-多聚谷氨酸(500kDa)，0.075％(w/v)；Primocin，100μg/ml。

实施例4一种肿瘤组织保存液

组成：基础培养基Leibovitz’s L-15；BSA，0.5％(w/v)；重组人胰岛素，10μg/ml；转铁蛋白，5μg/ml；亚油酸，5μg/ml；Trace Elements A(1000×)，0.1％(v/v)；Glutamax(100×)，1％(v/v)；海藻糖，2mg/ml；γ-多聚谷氨酸(500kDa)，0.075％(w/v)；Primocin，100μg/ml。

实施例5一种肿瘤组织保存液

组成：基础培养基Leibovitz’s L-15；BSA，5％(w/v)；重组人胰岛素，10μg/ml；转铁蛋白，5μg/ml；亚油酸，5μg/ml；Trace Elements A(1000×)，0.1％(v/v)；Glutamax(100×)，1％(v/v)；海藻糖，2mg/ml；γ-多聚谷氨酸(500kDa)，0.075％(w/v)；Primocin，100μg/ml。

实施例6一种肿瘤组织保存液

组成：基础培养基Leibovitz’s L-15；BSA，2％(w/v)；重组人胰岛素，10μg/ml；转铁蛋白，5μg/ml；亚油酸，5μg/ml；Trace Elements A(1000×)，0.1％(v/v)；Glutamax(100×)，1％(v/v)；海藻糖，1mg/ml；γ-多聚谷氨酸(500kDa)，0.075％(w/v)；Primocin，100μg/ml。

实施例7一种肿瘤组织保存液

组成：基础培养基Leibovitz’s L-15；BSA，2％(w/v)；重组人胰岛素，10μg/ml；转铁蛋白，5μg/ml；亚油酸，5μg/ml；Trace Elements A(1000×)，0.1％(v/v)；Glutamax(100×)，1％(v/v)；海藻糖，10mg/ml；γ-多聚谷氨酸(500kDa)，0.075％(w/v)；Primocin，100μg/ml。

实施例8一种肿瘤组织保存液

组成：基础培养基Leibovitz’s L-15；BSA，0.5％(w/v)；重组人胰岛素，1μg/ml；转铁蛋白，1μg/ml；亚油酸，1μg/ml；Trace Elements A(1000×)，0.01％(v/v)；Glutamax(100×)，0.1％(v/v)；海藻糖，1mg/ml；γ-多聚谷氨酸(500kDa)，0.01％(w/v)；Primocin，100μg/ml。

实施例9一种肿瘤组织保存液

组成：基础培养基Leibovitz’s L-15；BSA，5％(w/v)；重组人胰岛素，30μg/ml；转铁蛋白，20μg/ml；亚油酸，20μg/ml；Trace Elements A(1000×)，1％(v/v)；Glutamax(100×)，10％(v/v)；海藻糖，10mg/ml；γ-多聚谷氨酸(500kDa)，0.1％(w/v)；Primocin，100μg/ml。

实施例10胃癌、结直肠癌、和乳腺癌组织的保存及细胞活力测定

一、实验方法

(1)取新鲜肿瘤(胃癌、结直肠癌、和乳腺癌)组织，分别采用1％Antibiotic-Antimycotic的无菌生理盐水清洗5次，剔除坏死区域及非肿瘤组织。

(2)用无菌手术刀片、手术剪和手术镊将肿瘤组织分割为直径小于1mm的小碎块。

(3)将切碎的肿瘤组织等分分别转移至装有10ml常规保存液和实施例1到9的肿瘤组织保存液的的10ml离心管中。

(4)4℃，60rpm震荡保存24h、72h、和120h。

(5)保存72h后采用中性红染色并拍照。由于中性红染色为活细胞染色，其着色度与细胞的活性呈正相关，着色越深，细胞活性越好。

(6)于0h(肿瘤组织切碎之后，尚未用保存液进行保存，此时记为0h)、24h、72h、和120h，采用MTT法进行细胞活力测定。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，在一定细胞数量范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

二、实验结果

结果如图1到图7所示。

图1为新鲜肿瘤组织、以及在实施例1的肿瘤组织保存液和常规保存液中保存72h的肿瘤组织，经中性红染色后的细胞图片。由图中可以看出，保存72h后，在实施例1的肿瘤组织保存液中的胃癌、结直肠癌、乳腺癌组织着色程度均深于在常规保存液中保存的肿瘤组织。因此可初步判断，胃癌、肠癌、乳腺癌组织在实施例1保存液中保存72h后，其细胞活性高于在常规保存液中保存的肿瘤组织。

图2为采用实施例1的肿瘤组织保存液和常规保存液保存胃癌组织，于0h、24h、72h、120h，采用MTT法进行细胞活力测定结果。由图中可以看出，随着保存时间的延长，胃癌组织的细胞活力逐渐下降，而在实施例1保存液中保存的胃癌组织细胞活力下降速度比在常规保存液中保存的胃癌组织慢。采用实施例1保存液和常规保存液保存胃癌组织，72h后细胞活力分别为90％和76％，120h后细胞活力分别为60％和35％。与常规保存液相比，实施例1保存液更有利于胃癌组织的长时间保存。

图3为采用实施例1的肿瘤组织保存液和常规保存液保存结直肠癌组织，于0h、24h、72h、120h，采用MTT法进行细胞活力测定结果。由图中可以看出，随着保存时间的延长，结直肠癌组织的细胞活力逐渐下降，而在实施例1保存液中保存的结直肠癌组织细胞活力下降速度比在常规保存液中保存的结直肠癌组织慢。采用实施例1保存液和常规保存液保存结直肠癌组织，72h后细胞活力分别为90％和72％，120h后细胞活力分别为67％和37％。与常规保存液相比，实施例1保存液更有利于结直肠癌组织的长时间保存。

图4为采用实施例1的肿瘤组织保存液和常规保存液保存乳腺癌组织，于0h、24h、72h、120h，采用MTT法进行细胞活力测定结果。由图中可以看出，随着保存时间的延长，乳腺癌组织的细胞活力逐渐下降，而在实施例1保存液中保存的乳腺癌组织细胞活力下降速度比在常规保存液中保存的乳腺癌组织慢。采用实施例1保存液和常规保存液保存乳腺癌组织，72h后细胞活力分别为89％和76％，120h后细胞活力分别为64％和38％。与常规保存液相比，实施例1保存液更有利于乳腺癌组织的长时间保存。

图5～7为采用实施例2～7的肿瘤组织保存液保存胃癌、结直肠癌、乳腺癌组织，于72h采用MTT法进行细胞活力测定结果。由图5可以看出，实施例1、实施例2、实施例3保存液在添加不同浓度重组胰岛素条件下，其保存效果均较好，且实施例1优于实施例2保存液和实施例3保存液。由图6可以看出，实施例1、实施例4、实施例5保存液在添加不同浓度BSA条件下，其保存效果均较好，且实施例1优于实施例4保存液和实施例5保存液。由图7可以看出，实施例1、实施例6、实施例7保存液在添加不同浓度海藻糖条件下，其保存效果均较好，且实施例1优于实施例6保存液和实施例7保存液。

采用实施例8和实施例9的肿瘤组织保存液保存胃癌、结直肠癌、乳腺癌组织细胞活力也优于常规保存液。

实施例11胃癌、结直肠癌、和乳腺癌组织的增殖率测定

一、实验方法

(1)收集在肿瘤组织保存液中保存72h的肿瘤组织，1,200rpm离心3min。离心后弃上清，沉淀细胞中加入4.5mL DMEM/F12和0.5mL细胞分散酶溶液，置于37℃振荡器上低速振荡消化2h，所述细胞分散酶溶液为浓度200u/ml的Collagenase,Type I(GibcoTM17100017)。

(2)终止消化的肿瘤细胞簇通过孔径125μm尼龙滤膜过滤，1200rpm离心3min。

(3)将胶原凝胶溶液加入重悬后的细胞沉淀中，充分混匀，得到细胞-胶原混合液。

(4)将30μL细胞-胶原混合液滴到6孔培养板上制成胶原凝胶滴，放入37℃培养箱中孵育1h。

(5)加入3mL PCM-2，于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

(6)0-time组于培养第1天进行染色固定，实验组于培养第7天进行染色固定。中性红染色2h，4ml PBS清洗细胞2次，每次15min，中性福尔马林固定45min，于蒸馏水浸泡20min，通风干燥。

(7)采用广州达瑞生物技术股份有限公司的培养细胞分析系统DR6690或Primage图像分析系统对胶原凝胶滴进行扫描分析，计算细胞增殖率。细胞增殖率(GR)＝实验组平均OD值/0-time组平均OD值。GR≥0.8时，判定为肿瘤细胞存活。细胞培养成功率＝样本存活总数/样本总数×100％。

二、实验结果

图8到图9分别为将新鲜肿瘤组织以及在实施例1肿瘤组织保存液和常规保存液中保存72h的肿瘤组织进行胶滴包埋培养，培养结束后的胶原凝胶滴扫描图片以及细胞增殖情况。结果表明，采用本发明提供的实施例1肿瘤组织保存液保存胃癌、结直肠癌、乳腺癌组织，保存72h后，可以实现胃癌、结直肠癌、乳腺癌细胞增殖，增殖效果优于在常规保存液中保存的肿瘤细胞。

表1到表3分别为将20例胃癌、结直肠癌、乳腺癌组织样本在实施例1肿瘤组织保存液与常规保存液中保存72h后进行胶滴包埋培养的情况。20例胃癌、结直肠癌、乳腺癌组织样本在实施例1保存液中保存72h，胶滴包埋培养成功率均为100％，均优于常规保存液。

表1将20例胃癌组织样本在实施例1的肿瘤组织保存液与常规保存液中保存72h后进行胶滴包埋培养的情况：

	实施例1保存液	常规保存液
			样本总数	20	20
存活总数	20	17
			成功率	100％	85％

表2将20例结直肠癌组织样本在实施例1的肿瘤组织保存液与常规保存液中保存72h后进行胶滴包埋培养的情况：

	实施例1保存液	常规保存液
			样本总数	20	20
存活总数	20	19
			成功率	100％	95％

表3将20例乳腺癌组织样本在实施例1的肿瘤组织保存液与常规保存液中保存72h后进行胶滴包埋培养的情况：

采用实施例2到实施例9的肿瘤组织保存液保存胃癌、结直肠癌、乳腺癌组织，胶滴包埋培养的成功率也优于常规保存液。

对照例1一种肿瘤组织保存液

组成：基础培养基Leibovitz’s L-15；重组人胰岛素，10μg/ml；转铁蛋白，5μg/ml；亚油酸，5μg/ml；Trace Elements A(1000×)，0.1％(v/v)；Glutamax(100×)，1％(v/v)；海藻糖，2mg/ml；γ-多聚谷氨酸(500kDa)，0.075％(w/v)；Primocin，100μg/ml。

对照例2一种肿瘤组织保存液

组成：基础培养基Leibovitz’s L-15；BSA，2％(w/v)；重组人胰岛素，10μg/ml；转铁蛋白，5μg/ml；亚油酸，5μg/ml；Trace Elements A(1000×)，0.1％(v/v)；Glutamax(100×)，1％(v/v)；Primocin，100μg/ml。

对照例3一种肿瘤组织保存液

组成：基础培养基Leibovitz’s L-15；BSA，2％(w/v)；重组人胰岛素，10μg/ml；转铁蛋白，5μg/ml；亚油酸，5μg/ml；Trace Elements A(1000×)，0.1％(v/v)；Glutamax(100×)，1％(v/v)；γ-多聚谷氨酸(500kDa)，0.075％(w/v)；Primocin，100μg/ml。

对照例4一种肿瘤组织保存液

组成：基础培养基Leibovitz’s L-15；BSA，2％(w/v)；重组人胰岛素，10μg/ml；转铁蛋白，5μg/ml；亚油酸，5μg/ml；Trace Elements A(1000×)，0.1％(v/v)；Glutamax(100×)，1％(v/v)；海藻糖，2mg/ml；Primocin，100μg/ml。

对照例5一种肿瘤组织保存液

组成：基础培养基Leibovitz’s L-15；BSA，2％(w/v)；重组人胰岛素，10μg/ml；转铁蛋白，5μg/ml；Trace Elements A(1000×)，0.1％(v/v)；Glutamax(100×)，1％(v/v)；海藻糖，2mg/ml；γ-多聚谷氨酸(500kDa)，0.075％(w/v)；Primocin，100μg/ml。

对照例6胃癌、结直肠癌、和乳腺癌组织的保存

一、实验方法

使用对照例1～5的肿瘤组织保存液按照实施例8的方法分别保存胃癌组织、肠癌组织、乳腺癌组织，并进行细胞活力检测。与使用实施例1的肿瘤组织保存液保存肿瘤组织效果作比较。

二、实验结果

结果如图10～11所示。图10为在对照例1～5和实施例1的肿瘤组织保存液中分别保存72h的胃癌、结直肠癌、乳腺癌组织经中性红染色后的细胞图片。

由图中可以看出，在对照例1～5的肿瘤组织保中保存72h的胃癌组织、肠癌组织、乳腺癌组织着色程度比在实施例1的肿瘤组织保存液中保存72h的肿瘤组织浅。因此可初步判断，胃癌、肠癌、乳腺癌组织在对照例1～5保存液中保存72h后，其细胞活性低于在实施例1的肿瘤组织保中保存72h的肿瘤组织。

图11为分别采用对照例1～5和实施例1的肿瘤组织保存液保存胃癌组织、结直肠癌组织、乳腺癌组织，于72h采用MTT法进行细胞活力测定结果。在对照例1～5的保存液中保存72h，胃癌组织细胞活力维持在73％～80％，结直肠癌组织细胞活力维持在68％～78％，乳腺癌组织细胞活力维持在73％～82％。而在实施例1保存液中，胃癌、结直肠癌、乳腺癌组织保存72h后的细胞活力可达89％以上。因此可进一步得出结论，BSA、海藻糖、γ-多聚谷氨酸、亚油酸组分的添加对于胃癌、肠癌、乳腺癌组织细胞活力的保持具有协同增效的作用。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims

1.一种肿瘤组织保存液，其特征在于，所述肿瘤组织保存液为含有血清白蛋白、重组人胰岛素、转铁蛋白、亚油酸、Trace Elements A、自由基清除剂、细胞保护剂的无血清基础培养基。

2.根据权利要求1所述肿瘤组织保存液，其特征在于，所述无血清基础培养基为Leibovitz’s L-15、DMEM/F12、RPMI 1640、DMEM、或F-12的一种。

3.根据权利要求1所述肿瘤组织保存液，其特征在于，所述血清白蛋白(SA)为牛血清白蛋白或人血清白蛋白中的一种或两种的混合物，其中，所述血清白蛋白的含量为0.5％～5％(w/v)。

4.根据权利要求1所述肿瘤组织保存液，其特征在于，所述肿瘤组织保存液中重组人胰岛素的量为1～30μg/ml。

5.根据权利要求1所述肿瘤组织保存液，其特征在于，所述肿瘤组织保存液中转铁蛋白的量为1～20μg/ml。

6.根据权利要求1所述肿瘤组织保存液，其特征在于，所述肿瘤组织保存液中亚油酸的量为1～20μg/ml。

7.根据权利要求1所述肿瘤组织保存液，其特征在于，所述自由基清除剂为谷胱甘肽、Glutamax、L-抗环血酸、巯基乙醇、二硫苏糖醇、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶中的一种或几种的混合物。

8.根据权利要求1所述肿瘤组织保存液，其特征在于，所述细胞保护剂为多羟基化合物、糖类、氨基酸、聚合物、蛋白质中的一种或多种的混合物。

9.根据权利要求8所述肿瘤组织保存液，其特征在于，所述细胞保护剂为海藻糖和γ-多聚谷氨酸。其中，所述海藻糖的浓度为1～10mg/ml，500kDaγ-多聚谷氨酸的浓度为0.01～0.1％(w/v)。

10.权利要求1到9任一所述肿瘤组织保存液在保存实体瘤组织中的应用。