TWI698528B - 血管平滑肌細胞的培養方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種血管平滑肌細胞的培養方法，其係包含：在含有可使細胞或組織懸浮而培養的構造體之培養基組成物中，將血管平滑肌細胞進行懸浮培養。又，本發明提供一種血管平滑肌細胞的細胞增殖的抑制方法，其係包含：在該培養基組成物中，將血管平滑肌細胞進行懸浮培養。再者，本發明提供一種血管平滑肌細胞的保存方法，其係包含：在該培養基組成物中，使血管平滑肌細胞懸浮。該構造體係例如含有脫醯化結冷膠。

Description

血管平滑肌細胞的培養方法
本發明是關於血管平滑肌細胞的培養技術。
構成血管的血管內皮細胞及血管平滑肌細胞(以下亦稱為血管細胞)係多以作為初代培養細胞而用於體外(in vitro)試驗，幾乎沒有樹立細胞株。初代培養血管細胞係與樹立細胞不同，有報告指出其留下深厚的生體內的血管細胞的本來的性質，但相反地是若進行繼代或冷凍保存則容易引起形質改變的性質。尤其是血管平滑肌細胞若進行使用通常的平盤(plate)的培養(單層培養：2維培養)時，會發生增殖、收縮能力降低等，形質會變化。為了要迴避這種形質變化，而開發了以下的3種方法。(1)在第I型膠原蛋白凝膠上的培養。可在使血管平滑肌細胞停止增殖的狀態下培養(非專利文獻1)。(2)使用以第I型膠原蛋白為主成分的3維基質的培養(非專利文獻2)。在這種情況時，細胞增殖停止，恢復血管平滑肌細胞本來的收縮能力。(3)血管內皮細胞的培養通常是以明膠被覆(gelatin coat)進 行實施。
但是，各培養方法各有其問題點。(1)的方法是以不適於長期培養為問題點。因此，在培養第3至第5日時必須將膠原蛋白凝膠溶解並單離血管平滑肌細胞。如不單離而繼續培養，則會開始細胞增殖而變成與通常的2維培養同等。因此，無法維持接近於生體的性質。(2)的使用第I型膠原蛋白3維基質的培養，是以要使血管平滑肌細胞具有接近於生體的性質需耗時約1週左右為問題點。再者，因不能在培養的狀態下保存，故難以應用於臨床。(3)的使用明膠被覆的培養則是與通常的2維培養法並無大幅差異。
就上述現行的血管細胞的培養技術而言，因無法迴避細胞的形質改變(2維培養法)、長期培養的困難性及繁雜性(3維培養法)，故對於使用血管細胞的評估法的開發、血管細胞運送法、血管細胞的生體移植等給予很大的限制。再者，即使將培養容器表面以抑制細胞黏附的材料被覆、或施加特殊的加工等而抑制細胞黏附以培養血管平滑肌細胞時，其存活率也是會迅速降低。因此，期望開發出一種培養方法，其係將培養基材對血管細胞的刺激抑制於最低限度，並實現能簡便地評估藥劑等的培養環境、用以進行簡便的細胞回收及細胞運送而不容易引起細胞形質改變的非冷凍環境。
本發明人等成功地開發出實質上不提高液體培養基中的黏度，且在維持懸浮狀態下，可培養細胞及 組織的培養基組成物(專利文獻1及2)。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]WO2014/017513 A1
[專利文獻2]US2014/0106348 A1
【非專利文獻】
[非專利文獻1]Koyama et al., Cell 1996; 87: 1069-78
[非專利文獻2]Ishii et al., Atherosclerosis 2001; 158: 377-84
本發明的目的是提供使血管平滑肌細胞不增殖並迴避形質變化且長期間培養的技術。
本發明人等發現，若實質上不提高液體培養基中的黏度，並在維持懸浮狀態下，於可培養細胞及組織的培養基組成物中進行懸浮培養癌細胞等時，則相較於在平盤上進行黏附培養時，較會促進細胞增殖(專利文獻1)，但若將血管平滑肌細胞在維持懸浮狀態下，於可培養細胞及組織的培養基組成物中進行懸浮培養時，則意外地反而會在維持良好的生存性下而使細胞週期停止，並使細胞增殖受到抑制，迴避形質變化的風險且能維持長期間。
基於此等知識再加以檢討，而完成本發明。
亦即，本發明係如下述：
[1]一種血管平滑肌細胞的培養方法，其係包含：在含有可使細胞或組織懸浮而培養的構造體之培養基組成物中，將血管平滑肌細胞進行懸浮培養。
[2]如[1]所述的方法，其中，將在停止細胞增殖的狀態的血管平滑肌細胞進行懸浮培養。
[3]一種血管平滑肌細胞的細胞增殖的抑制方法，其係包含：在含有可使細胞或組織懸浮而培養的構造體之培養基組成物中，將血管平滑肌細胞進行懸浮培養。
[4]一種血管平滑肌細胞的保存方法，其係包含：在含有可使細胞或組織懸浮而培養的構造體之培養基組成物中，使血管平滑肌細胞懸浮。
[5]如[1]至[4]中任一項所述的方法，其中，前述構造體含有脫醯化結冷膠(deacylated gellan gum)。
[6]如[5]所述的方法，其中，培養基組成物中的脫醯化結冷膠濃度是0.005至0.3%(w/v)。
[7]一種血管平滑肌細胞的培養方法，其係包含：在含有0.005至0.3%(w/v)的濃度的脫醯化結冷膠且可使細胞或組織懸浮而培養之培養基組成物中，將血管平滑肌細胞進行懸浮培養。
[8]一種血管平滑肌細胞的保存方法，其係包含：在含有0.005至0.3%(w/v)的濃度的脫醯化結冷膠且可使細胞或組織懸浮而培養之培養基組成物中，使血管平滑肌細胞懸浮。
藉由本發明，對於血管平滑肌細胞，在抑制細胞增殖的狀態下，可長期間維持在體外。藉由本發明，可在沒有冷凍操作的條件下運送血管平滑肌細胞，並且可期待將在冷凍或黏附時可見的細胞的形質變化保持於最小限度。本發明係有所貢獻於使用血管平滑肌細胞的再生醫療的發展。
第1圖係以西方墨點轉漬法解析血管平滑肌細胞中的細胞週期關連蛋白質的表現。
第2圖係以西方墨點轉漬法解析血管平滑肌細胞中的細胞週期關連蛋白質的表現。
第3圖係以西方墨點轉漬法解析NIH3T3細胞中的細胞週期關連蛋白質的表現。
第4圖係以西方墨點轉漬法解析血管平滑肌細胞中的細胞週期關連蛋白質的表現。
第5圖係以西方墨點轉漬法解析NIH3T3細胞中的細胞週期關連蛋白質的表現。
第6圖係血管平滑肌細胞的增殖及存活率的經時變化。A：總細胞數，B：存活率。白心圓圈：將在平盤上黏附培養的細胞播種在平盤上，更進一步進行黏附培養。黑心圓圈：將在含有脫醯化結冷膠的培養基中懸浮培養的細 胞播種在平盤上，進行黏附培養。
(1)本發明所用的培養基組成物
本發明所用的培養基組成物，係含有可使細胞或組織懸浮而培養的構造體之培養基組成物。該培養基組成物，可在維持懸浮狀態下，將培養對象的細胞(亦即，血管平滑肌細胞)及含有該細胞的組織加以培養。該培養基組成物是可依照WO2014/017513 A1及US2014/0106348 A1之記載而調製。以下，有時將該培養基組成物稱為培養基組成物I。
細胞係指構成動物的最基本的單元，在細胞膜的內部具有細胞質及各種的胞器(organelle)作為其要素。
本發明中的細胞及/或組織的懸浮，係指細胞及/或組織不黏附於培養容器的狀態(非黏附)。再者，在本發明中，在使細胞及/或組織增殖、分化或維持時，不伴隨有外界對液體培養基組成物的壓力或振盪或是該組成物中的振盪、旋轉操作等，而使細胞及/或組織在該液體培養基組成物中均勻分散且成為懸浮狀態的狀態係稱為「懸浮靜置」，在該狀態下培養細胞及/或組織則稱為「懸浮靜置培養」。又，在「懸浮靜置」中可懸浮的期間係包含5分鐘以上、1小時以上、24小時以上、48小時以上、7日以上等，但只要能保持懸浮狀態，則不限定於此等期間。
本發明所用的培養基組成物，係在可維持 或培養細胞或組織的溫度範圍(例如0至40℃)內的至少1點，可進行細胞及/或組織的懸浮靜置。本發明所用的培養基組成物較佳是在25至37℃的溫度範圍的至少1點，最佳是在37℃，可進行細胞及/或組織的懸浮靜置。
關於是否可懸浮靜置，例如，係可藉由將培養對象的細胞以2×104cells/ml的濃度均勻分散在評估對象的培養基組成物中，並在15ml錐形管(conical tube)中注入10ml，於37℃靜置至少5分鐘以上(例如1小時以上、24小時以上、48小時以上、7日以上)，觀察是否維持該細胞的懸浮狀態，而予以評估之。全細胞中的70%以上為懸浮狀態時，可下結論判斷為維持懸浮狀態。亦可以聚苯乙烯珠(尺寸為500至600μm，Polysciences Inc.製)代替細胞來評估。
本發明所用的培養基組成物，係含有可使細胞或組織懸浮而培養(較佳是可懸浮靜置培養)的構造體及培養基之組成物。
本發明所用的培養基組成物，較佳是在培養時的培養基組成物的更換處理及培養終了後，可由培養基組成物回收細胞或組織的組成物，更佳是在由培養基組成物回收細胞或組織時，不需要溫度變化、化學處理、酵素處理、剪斷力的任一者的組成物。
本發明中的構造體，係指由特定化合物所形成且會顯示使細胞及/或組織均勻懸浮的效果者。更詳細而言，係包含由高分子化合物經由離子而聚集者、或由高分子化合物 形成三維網絡者等。又，由多糖類經由金屬離子而形成微凝膠是公知的(例如日本特開2004-129596號公報)，本發明的構造體也包含該微凝膠作為一態樣。又，由高分子化合物經由離子而聚集者，係可列舉如膜狀的構造體作為其一態樣。
本發明中的構造體的大小，較佳是在以過濾器過濾時會通過孔徑為0.2μm至200μm的過濾器者。就該孔徑的下限而言，較佳是超過1μm，若考慮到使細胞或組織安定懸浮，則更佳是超過5μm。就該孔徑的上限而言，較佳是100μm以下，若考慮到細胞或組織的大小，則更佳是70μm以下。
本發明中的特定化合物，係在將特定化合物與液體培養基混合時形成不定形的構造體，且該構造體在該液體中均勻分散，並且實質上不提高該液體的黏度而實質上保持細胞及/或組織，有防止其沈降的效果者。「實質上不提高液體的黏度」係指液體的黏度不超過8mPa‧s。此時的該液體的黏度(亦即，本發明所用的培養基組成物的黏度)是在37℃時為8mPa‧s以下，較佳是4mPa‧s以下，更佳是2mPa‧s以下。再者，只要是顯示在液體培養基中會形成該構造體，且實質上不提高該液體的黏度並且使細胞及/或組織均勻懸浮(較佳是懸浮靜置)的效果者，則對於該特定化合物的化學構造、分子量、物性等並無任何限制。
含有構造體的液體的黏度，係例如可藉由後述的實施例所記載的方法來測定。具體而言，可在37℃條件下使用 E型黏度計(東機產業股份有限公司製，TV-22型黏度計，機種：TVE-22L，圓錐形轉子(cone rotor)：標準轉子1°34′×R24，旋轉數100rpm)而測定。
關於本發明所用的特定化合物的例子，雖無特別限制，但可列舉如高分子化合物，較佳是可列舉如具有陰離子性官能基的高分子化合物。
陰離子性官能基可列舉如羧基、磺酸基、磷酸基及該等的鹽，以羧基或其鹽為較佳。
本發明所用的高分子化合物係可使用具有由前述陰離子性官能基的群中選出之1種或2種以上的官能基者。
本發明所用的高分子化合物的較佳具體例，雖無特別限制，但可列舉如由10個以上的單糖類(例如三碳醣、四碳醣、五碳醣、六碳醣、七碳醣等)所聚合成的多糖類，較佳是可列舉如具有陰離子性官能基的酸性多糖類。在此的所謂酸性多糖類，只要是在其構造中具有陰離子性官能基者則無特別限制，但可為例如具有醣醛酸(例如葡萄醣醛酸、艾杜糖醛酸(iduronic acid)、半乳醣醛酸、甘露醣醛酸)的多糖類、在構造中的一部分具有硫酸基或磷酸基的多糖類、或具有其雙方的構造的多糖類，並且不只是由天然獲得的多糖類，也包含由微生物所產生的多糖類、由基因工學技術所產生的多糖類、或使用酵素而人工合成的多糖類。更具體而言，可例示如由玻尿酸、結冷膠、脫醯化結冷膠(以下，有時亦稱為DAG)、鼠李糖膠(Rhamsan gum)、迪特膠(Diutan gum)、三仙膠、鹿角菜苷(carrageenan)、黃 原膠、己醣醛酸、褐藻醣膠(fucoidan)、果膠、果膠酸、果凍酸(pectinic acid)、硫酸乙醯肝素(heparan sulfate)、肝素、硫酸類肝素(heparitin sulfate)、硫酸角質素(keratan sulfate)、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸鼠李聚糖(rhamnan sulfate)及該等的鹽所成的群中選出之1種或2種以上所構成者。多糖類較佳是玻尿酸、DAG、迪特膠、三仙膠、鹿角菜苷或該等的鹽，若考慮到可使用低濃度來使細胞或組織懸浮並且考慮到細胞或組織的回收容易度，則以DAG為最佳。
在此所謂的鹽，係例如可列舉如鋰、鈉、鉀等鹼金屬的鹽，鈣、鋇、鎂等鹼土類金屬的鹽，或鋁、鋅、銅、鐵、銨、有機鹼及胺基酸等的鹽。
該等高分子化合物(多糖類等)的重量平均分子量，較佳是10,000至50,000,000，更佳是100,000至20,000,000，又更佳是1,000,000至10,000,000。例如，該分子量是可藉由凝膠滲透層析法(GPC)的聚三葡萄糖(pullulan)換算而測定。
再者，DAG也可使用經磷酸化者。該磷酸化是藉由公知的手法實施。
在本發明中，可將上述多糖類組合複數種(較佳是2種)而使用。關於多糖類的組合的種類，只要是在液體培養基中形成上述構造體，且實質上不提高該液體培養基的黏度並且使細胞及/或組織均勻懸浮(較佳是懸浮靜置)者，則無特別限定，但較佳是該組合中至少含有DAG 或其鹽。亦即，合適的多糖類的組合是包括DAG或其鹽、以及DAG或其鹽以外的多糖類(例如三仙膠、海藻酸、鹿角菜苷、迪特膠、甲基纖維素、刺槐豆膠或該等的鹽)。具體的多糖類的組合，可列舉如DAG與鼠李糖膠、DAG與迪特膠、DAG與三仙膠、DAG與鹿角菜苷、DAG與黃原膠、DAG與刺槐豆膠、DAG與κ-鹿角菜苷、DAG與海藻酸鈉、DAG與甲基纖維素等，但不限定於該等。
本發明所用的特定化合物的更佳具體例，可列舉如玻尿酸、脫醯化結冷膠、迪特膠、鹿角菜苷及三仙膠、以及該等的鹽，考慮到可使培養基組成物的黏度變低之觀點及細胞或組織的回收容易度之觀點，則最佳例可列舉如脫醯化結冷膠或其鹽。
本發明中的脫醯化結冷膠是以1-3鍵結的葡萄糖、1-4鍵結的葡萄醣醛酸、1-4鍵結的葡萄糖及1-4鍵結的鼠李糖的4分子的糖作為構成單元的直鏈狀的高分子多糖類，並且是在以下的通式(I)中之R1、R2皆為氫原子且n為2以上的整數時所表示的多糖類。惟，雖然R1可含有甘油基且R2可含有乙醯基，但乙醯基及甘油基的含有量較佳是10%以下，更佳是1%以下。
本發明中的構造體是依據特定化合物而成為各種形態，但以脫醯化結冷膠的情況說明時，脫醯化結冷膠是在與液體培養基混合時，取入液體培養基中的金屬離子(例如鈣離子)而形成經由該金屬離子所成的不定形的構造體，而使細胞及/或組織懸浮。由脫醯化結冷膠調製的本發明所用 的培養基組成物的黏度是8mPa‧s以下，較佳是4mPa‧s以下，考慮到細胞或組織的回收容易度之觀點，則更佳是2mPa‧s以下。
Figure 105102833-A0202-12-0012-1
本發明中的特定化合物亦可藉由化學合成法獲得，但該化合物為天然物時，則較佳是由含有該化合物的各種植物、各種動物、各種微生物並使用慣用技術進行萃取及分離精製而獲得。在其萃取時，若使用水或超臨界氣體，則可將該化合物有效率地萃取。例如，就結冷膠的製造方法而言，是以發酵培養基來培養生產微生物，並將在菌體外生產的黏膜物以通常的精製方法回收，在乾燥、粉碎等的步驟後，製成粉末狀即可。又，若為脫醯化結冷膠的情況，則是在回收黏膜物時施行鹼處理，將在1-3鍵結的葡萄糖殘基鍵結的甘油基及乙醯基進行脫醯化，然後回收即可。就精製方法而言，例如將液-液萃取、分級沈澱、結晶化、各種離子交換層析法、使用sephadex LH-20等的凝膠過濾層析法、由活性碳、矽膠(silica gel)等而進行的吸附層析法或薄層層析法的活性物質的吸脫附處理、或使用逆相管柱的高速液體層析法等，單獨使用或以任意的順序組合、或反覆使用，而可除去雜質並進行精製。結冷膠的生產微生物的例子可列舉如鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas elodea)及將該微生物的基因改變後的微生物，但並不限定於此。
然後，若為脫醯化結冷膠的情況時，則可使用市販品，例如三晶股份有限公司製「KELCOGEL(CP Kelco公司的註冊商標)CG-LA」、三榮源F.F.I.股份有限公司製「KELCOGEL(CP Kelco公司的註冊商標)」等。又，天然(native)型結冷膠係可使用三榮源F.F.I.股份有限公司製「KELCOGEL(CP Kelco公司的註冊商標)HT」等。
關於培養基中的特定化合物的濃度，係隨著特定化合物的種類而定，在可使特定化合物於液體培養基中形成上述構造體且實質上不提高該液體培養基的黏度並且使細胞及/或組織均勻懸浮(較佳是懸浮靜置)的範圍內，可適當設定之，但通常是0.0005%至1.0%(w/v)，較佳是0.001%至0.4%(w/v)，更佳是0.005%至0.1%(w/v)，又更佳是0.005%至0.05%(w/v)即可。例如，在為脫醯化結冷膠的情況時，係在培養基中添加0.001%至1.0%(w/v)，較佳是0.003%至0.5%(w/v)，更佳是0.005%至0.3%(w/v)，又更佳是0.01%至0.05%(w/v)，最佳是0.01%至0.03%(w/v)即可。在為三仙膠的情況時，則是在培養基中添加0.001%至5.0%(w/v)，較佳是0.01%至1.0%(w/v)，更佳是0.05%至0.5%(w/v)，最佳是0.1%至0.2%(w/v)即可。在為κ-鹿角菜苷及刺槐豆膠混合系的情況時，是在培養基中添加0.001%至5.0%(w/v)，較佳是0.005%至1.0%(w/v)，更佳是0.01%至0.1%(w/v)，最佳是0.03%至0.05%(w/v)即可。在為 天然型結冷膠的情況時，是在培養基中添加0.05%至1.0%(w/v)，較佳是0.05%至0.1%(w/v)即可。
將上述多糖類組合複數種(理想是2種)而使用時，關於該多糖類的濃度，在可使該多糖類的組合在液體培養基中形成上述構造體且實質上不提高該液體培養基的黏度並且使細胞及/或組織均勻懸浮(較佳是懸浮靜置)的範圍內，可適當設定之。例如，使用DAG或其鹽、與DAG或其鹽以外的多糖類的組合時，DAG或其鹽的濃度係可例示如0.005至0.02%(w/v)，較佳是0.01至0.02%(w/v)，DAG或其鹽以外的多糖類的濃度係可例示如0.0001至0.4%(w/v)，較佳是0.005至0.4%(w/v)，更佳是0.1至0.4%(w/v)。具體的濃度範圍的組合而言係例示如下。
DAG或其鹽：0.005至0.02%(較佳是0.01至0.02%)(w/v)DAG以外的多糖類
三仙膠：0.1至0.4%(w/v)
海藻酸鈉：0.0001至0.4%(w/v)(較佳是0.1至0.4%(w/v))
天然型結冷膠：0.0001至0.4%(w/v)
刺槐豆膠：0.1至0.4%(w/v)
甲基纖維素：0.1至0.4%(w/v)(較佳是0.2至0.4%(w/v))
鹿角菜苷：0.05至0.1%(w/v)
迪特膠：0.05至0.1%(w/v)
又，該濃度可依據以下的式算出。
濃度[%(w/v)]=特定化合物的重量(g)/培養基組成物的容量(ml)×100
前述化合物也可依據化學合成法而改變成別的衍生物，如此所得的該衍生物也可在本發明中有效使用。具體而言，在為脫醯化結冷膠的情況時，將其通式(I)所示化合物中相當於R1及/或R2的羥基置換成C1-3烷氧基、C1-3烷磺醯基、葡萄糖或果糖等單糖殘基，蔗糖、乳糖等寡糖殘基，甘胺酸、精胺酸等胺基酸殘基等的衍生物，係也可在本發明中使用。又，也可使用1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺(EDC)等交聯劑將該化合物加以交聯。
本發明所使用的特定化合物或其鹽，是依據製造條件而可作為任意的結晶形而存在，並可作為任意的水合物而存在，該等結晶形及水合物及該等的混合物也包含在本發明的範圍。又，也有作為含有丙酮、乙醇、四氫呋喃等有機溶媒的溶媒合物而存在的情況，該等形態也都包含在本發明的範圍。
本發明所使用的特定化合物，亦可作為因環內或環外異構化所生成的互變異構物、幾何異構物、互變異構物或幾何異構物的混合物、或該等的混合物的形態而存在。本發明的化合物不論是否會因異構化而產生，當具有不對稱中心時，係可作為被分割的光學異構物或以任意比率含有該等的混合物的形態而存在。
本發明所用的培養基組成物中，可存在有金屬離子，例如2價的金屬離子(鈣離子、鎂離子、鋅離子、鐵離子及銅離子等)存在，較佳是含有鈣離子。該金屬離子是可組合2種類以上而使用，例如鈣離子與鎂離子、鈣離 子與鋅離子、鈣離子與鐵離子、鈣離子與銅離子等。本發明所屬技術領域中具有通常知識者可適當決定其組合。在一態樣中，是藉由在培養基組成物含有金屬離子(例如鈣離子)，以使高分子化合物經由該金屬離子而聚集，並且藉由高分子化合物形成三維網格(例如，藉由於使多糖類經由金屬離子(例如鈣離子)而形成微凝膠)，而形成本發明的構造體。關於金屬離子的濃度，在可使特定化合物在液體培養基中形成上述構造體且實質上不提高該液體培養基的黏度並且使細胞及/或組織均勻懸浮(較佳是懸浮靜置)的範圍內，可適當設定之。金屬離子濃度是在0.1mM至300mM，較佳是0.5mM至100mM，但不限定於該等。該金屬離子可為與培養基混合，或亦可為將鹽溶液另外調製好再添加於培養基。又，在本發明所用的培養基組成物中，亦可含有後述的細胞外基質、黏附分子等。
由本發明所使用的特定化合物所構成的構造體，係在將細胞及/或組織在生體外培養時，會顯示使該細胞及/或組織在含有該特定化合物的構造體之液體中懸浮的效果(較佳是懸浮靜置之效果)者。由於該懸浮效果，故在相較於單層培養時，可更加增加每一定體積中的細胞數及/或組織數而進行培養。又，在以往的懸浮培養方法中，在伴隨著旋轉或振盪操作時，因對細胞及/或組織有剪斷力作用，故細胞及/或組織的增殖率及回收率低、或是細胞的機能會有受損的情況，但若使用含有本發明的特定化合物的構造體之培養基組成物，即可不進行振盪等操作而 可使細胞及/或組織均勻分散，故使作為目的之細胞及/或組織可在不損失細胞機能下容易且大量地取得。又，在含有以往的凝膠基材之培養基中，將細胞及/或組織進行懸浮培養時，細胞及/或組織的觀察或回收有困難、或在回收時有損失其機能的情況，但若使用含有本發明的特定化合物的構造體之培養基組成物，則可將細胞及/或組織懸浮培養，並可不損失其機能而觀察、回收。又，含有以往的凝膠基材的培養基係黏度高而有難以更換培養基的情況，但含有本發明的特定化合物的構造體之培養基組成物則由於低黏度，故可使用吸量管(pipette)或幫浦等輕易地更換培養基。
使用本發明的特定化合物培養細胞及/或組織時，可在培養細胞及/或組織時將所用的培養基與特定化合物混合而調製培養基組成物。依據培養基的組成而分類時，可列舉如天然培養基、半合成培養基、合成培養基，又，依據形狀而分類時，可列舉如半固體培養基、液體培養基、粉末培養基(以下，有時也稱為粉培養基)等。細胞及/或組織是源自於動物時，只要是動物細胞的培養所用的培養基都可以使用。如此之培養基係例如可列舉如：Dulbecco改變的Eagles培養基(Dulbecco's Modified Eagles's Medium，亦即DMEM)、Ham的F12培養基(Ham's Nutrient Mixture F12)、DMEM/F12培養基、McCoy的5A培養基(McCoy's 5A medium)、Eagles的MEM培養基(Eagles's Minimum Essential Medium，亦即EMEM)、α MEM培養基 (alpha Modified Eagles's Minimum Essential Medium，亦即α MEM)、MEM培養基(Minimum Essential Medium)、RPMI1640培養基、Iscove改變的Dulbecco培養基(Iscove's Modified Dulbecco's Medium，亦即IMDM)、MCDB131培養基、威廉培養基E、IPL41培養基、Fischer's培養基、StemPro34(Invitrogen公司製)、X-VIVO 10(Cambrex公司製)、X-VIVO 15(Cambrex公司製)、HPGM(Cambrex公司製)、StemSpan H3000(Stem Cell Technologies公司製)、StemSpanSFEM(Stem Cell Technologies公司製)、StemlineII(Sigma Aldrich公司製)、QBSF-60(Quality Biological公司製)、StemProhESCSFM(Invitrogen公司製)、Essential 8(註冊商標)培養基(Gibco公司製)、mTeSR1或2培養基(Stem Cell Technologies公司製)、ReproFF或ReproFF2(Reprocell公司製)、PSGro hESC/iPSC培養基(System Biosciences公司製)、NutriStem(註冊商標)培養基(Biological Industries公司製)、CSTI-7培養基(細胞科學研究所公司製)、MesenPRO RS培養基(Gibco公司製)、MF-Medium(註冊商標)間葉系幹細胞增殖培養基(東洋紡股份有限公司製)、Sf-900 II(Invitrogen公司製)、Opti-Pro(Invitrogen公司製)等。
血管平滑肌細胞的培養所用的培養基，係可在上述培養基中含有細胞黏附因子。就其例而言，可列舉如：基質膠(Matrigel)、膠原蛋白凝膠、明膠、聚-L-離胺酸、聚-D-離胺酸、海帶胺酸(laminine)、纖網蛋白(fibronectin)。該等細胞黏附因子亦可組合2種類以上而添 加。再者，對於血管平滑肌細胞的培養所用的培養基，可更進一步混合瓜爾膠、羅望子膠(tamarind gum)、海藻酸丙二醇酯、刺槐豆膠、阿拉伯樹膠、刺梧桐膠(tara gum)、甲基纖維素等增黏劑。
在上述培養基中，本發明所屬技術領域中具有通常知識者可視目的而自由添加鈉、鉀、鈣、鎂、磷、氯、各種胺基酸、各種維生素、抗生物質、血清、脂肪酸、糖等。源自動物的細胞及/或組織在培養時，本發明所屬技術領域中具有通常知識者可視目的而與其他化學成分或生體成分的一種類以上組合而添加。
在源自動物的細胞及/或組織的培養基中所添加的成分，可列舉如：牛胎兒血清、人類血清、馬血清、胰島素、運鐵蛋白(transferrin)、乳鐵蛋白(lactoferrin)、膽固醇、乙醇胺、亞硒酸鈉、單硫甘油、2-巰基乙醇、牛血清白蛋白，丙酮酸鈉、聚乙二醇、各種維生素、各種胺基酸、洋菜、洋菜醣、膠原蛋白、甲基纖維素、各種細胞介素、各種激素、各種增殖因子、各種細胞外基質及各種細胞黏附分子等。
在培養基中所添加的抗生物質的例子，可列舉如：磺胺製劑、盤尼西林、非奈西林(phenethicillin)、二甲苯青黴素(methicillin)、苯唑西林(oxacillin)、氯唑西林(cloxacillin)、雙氯青霉素(dicloxacillin)、氟氯西林(flucloxacillin)、萘夫西林(nafcillin)、氨苄青黴素(ampicillin)、安莫西林(amoxicillin)、環青霉素(ciclacillin)、 羧芐基青霉素(carbenicillin)、替卡西林(ticarcillin)、哌拉西林(piperacillin)、阿洛西林(azlocillin)、美洛西林(mezlocillin)、甲亞胺青霉素(mecillinam)、阿德諾西林(amdinocillin)、頭孢菌素(cephalosporin)及其衍生物、歐索林酸(oxolinic acid)、氨氟沙星(amifloxacin)、替馬沙星(temafloxacin)、萘啶酮酸(nalidixic acid)、排諾密德酸(piromidic acid)、環丙沙星(ciprofloxacin)、西諾沙星(cinoxacin)、諾氟沙星(norfloxacin)、培氟沙星(perfloxacin)、羅索沙星(rosaxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、依諾沙星(enoxacin)、吡哌酸(pipemidic acid)、舒巴克坦(sulbactam)、克拉維酸(clavulanic acid)、β-溴青霉烷酸(β-bromopenicillanic acid)、β-氯青霉烷酸(β-chloropenicillanic acid)、6-乙醯基亞甲基青霉烷酸(6-acetylmethylene-penicillanic acid)、頭孢噁唑(cefoxazole)、舒他西林(sultampicillin)、氨卓西林(adinocillin)及舒巴克坦(sulbactam)的甲醛/食物警示酯(formaldehyde Food alert ester)、三唑巴坦(tazobactam)、氨曲南(aztreonam)、磺酰胺菌素(sulfazethin)、異磺酰胺菌素(isosulfazethin)、諾卡菌素(nocardicin)、間羧基酚(m-carboxyphenol)、苯基乙醯胺基膦酸甲酯、氯四環素、氧四環素、四環素、去甲基氯四環素(demeclocycline)、去氧羥四環素(doxycycline)、美她環素(methacycline)、以及米諾四環素(minocycline)。
將本發明的特定化合物添加於上述培養基 時，首先以合適的溶媒將該特定化合物在使用時溶解或分散(將其作為培養基添加劑)。之後，關於培養基中的特定化合物濃度，如上所詳述，是以可實質上不提高該液體培養基之黏度且使細胞及/或組織均勻懸浮(較佳是懸浮靜置)的濃度，例如0.0005%至1.0%(w/v)，較佳是0.001%至0.4%(w/v)，更佳是0.005%至0.1%(w/v)，又更佳是0.005%至0.05%(w/v)，將該培養基添加劑添加於培養基中即可。例如，在為脫醯化結冷膠的情況時，是在培養基中添加0.001%至1.0%(w/v)，較佳是0.003%至0.5%(w/v)，更佳是0.005%至0.3%(w/v)，最佳是0.01%至0.05%(w/v)即可。在為三仙膠的情況時，是在培養基中添加0.001%至5.0%(w/v)，較佳是0.01%至1.0%(w/v)，更佳是0.05%至0.5%(w/v)，最佳是0.1%至0.2%(w/v)即可。在為κ-鹿角菜苷及刺槐豆膠混合系的情況時，在培養基中添加使兩化合物的總和成為0.001%至5.0%(w/v)，較佳是0.005%至1.0%(w/v)，更佳是0.01%至0.1%，最佳是0.03%至0.05%(w/v)即可。在為脫醯化結冷膠與迪特膠的混合系的情況時，是在培養基中添加使兩化合物的總和成為0.001%至1.0%(w/v)，最佳是0.005%至0.01%(w/v)即可。在為脫醯化結冷膠及甲基纖維素的混合系的情況時，是在培養基中添加使兩化合物的總和成為0.001%至1.0%(w/v)，最佳是0.005%至0.2%(w/v)即可。在為脫醯化結冷膠及刺槐豆膠的混合系的情況時，是在培養基中添加使兩化合物的總和成為0.001%至1.0%(w/v)，最佳是0.01%至0.1%(w/v)即可。在為脫醯化結冷膠 及海藻酸鈉的混合系的情況時，是在培養基中添加使兩化合物的總和成為0.001%至1.0%(w/v)，最佳是0.01%至0.1%(w/v)即可。在為脫醯化結冷膠及三仙膠的混合系的情況時，是在培養基中添加使兩化合物的總和成為0.001%至1.0%(w/v)，最佳是0.01%至0.1%(w/v)即可。在為脫醯化結冷膠及κ-鹿角菜苷的混合系的情況時，是在培養基中添加使兩化合物的總和成為0.001%至1.0%(w/v)，最佳是0.01%至0.1%(w/v)即可。又，該濃度係可依照以下的式算出。
濃度[%(w/v)]=特定化合物的重量(g)/培養基組成物的容量(ml)×100
在此，培養基添加劑所用的合適的溶媒的例子，可列舉如水、二甲基亞碸(DMSO)、甲醇、乙醇、丁醇、丙醇、甘油、丙二醇、丁二醇等各種醇等水性溶媒，但並不限定於該等。此時，期望將特定化合物濃度設定為0.001%至5.0%(w/v)，較佳是0.01%至1.0%(w/v)，更佳是0.1%至0.6%(w/v)。此時，也可再添加可提高該特定化合物的效果或可降低使用時的濃度等的添加物。關於如此之添加劑的例子，可添加一種以上的瓜爾膠、海藻酸丙二醇酯、刺槐豆膠、阿拉伯樹膠、刺梧桐膠、羅望子膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素、洋菜醣、羅望子種膠、聚三葡萄糖等多糖類。又，也可將該特定化合物在培養時固定化在載體表面上或承載在載體內部而使用。該特定化合物在提供時或保存時可為任意的形狀。該特定化合物可為錠劑、丸劑、 膠囊劑、顆粒劑等經製劑化的固體，經合適的溶媒及溶解劑所溶解的溶液或懸液等液體，或是結合於基板或載體的狀態。就製劑化時的添加物而言，可列舉如：對羥基苯甲酸酯類等防腐劑；乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇等賦形劑；硬脂酸鎂、滑石等潤滑劑；聚乙烯醇、羥丙基纖維素、明膠等黏結劑；脂肪酸酯等界面活性劑；甘油等可塑劑等。該等添加物並不限定於上述的化合物，只要是本發明所屬技術領域中具有通常知識者可利用的化合物，則可自由選擇。又，本發明的特定化合物可視需要而施行滅菌處理。滅菌方法並無特別限制，例如可列舉如放射線滅菌、環氧乙烷氣體滅菌、高壓釜滅菌、過濾器滅菌等。進行過濾器滅菌(以下，有時亦稱為過濾滅菌)時的過濾器部分的材質並無特別限制，例如可列舉如玻璃纖維、尼龍、聚醚碸(polycthersulfone，亦即PES)、親水性聚二氟亞乙烯(polyvinylidene fluoride，亦即PVDF)、纖維素混合酯、乙酸纖維素、聚四氟乙烯等。過濾器的細孔的大小並無特別限制，較佳是0.1μm至10μm，更佳是0.1μm至1μm，最佳是0.1μm至0.5μm。該等滅菌處理時，特定化合物可為固體或溶液的狀態。
藉由上述調製而將特定化合物的溶液或分散液添加到液體培養基中，在液體培養基中形成上述構造體，而可得到本發明所用的培養基組成物。在培養基中，通常含有充分濃度的金屬離子(例如鈣離子等2價金屬離子)而足以使高分子化合物經由離子而聚集、或使高分子化 合物形成三維網格，故只要將本發明的特定化合物的溶液或分散液添加到液體培養基中，即可得到本發明所用的培養基組成物。或者是亦可在培養基添加劑(特定化合物的溶液或分散液)中添加培養基。再者，本發明所用的培養基組成物也可為將特定化合物及培養基成分在水性溶媒(例如包括離子交換水及超純水等水)中混合而調製。混合的態樣可列舉如：(1)將液體培養基及培養基添加劑(溶液)混合，(2)在液體培養基中混合上述高分子化合物(粉末等固體)，(3)在培養基添加劑(溶液)中混合粉末培養基，(4)將粉末培養基及上述高分子化合物(粉末等固體)與水性溶媒混合等，但不限定於該等。為了防止本發明所用的培養基組成物中的特定化合物的分布不均勻，而以(1)或(4)、或是(1)或(3)的態樣為較佳。
將特定化合物溶解於溶媒(例如水、液體培養基等水性溶媒)，或將特定化合物及粉末培養基溶解於溶媒時，為了促進溶解，以將該混合液加熱為較佳。加熱的溫度係例如可列舉如80℃至130℃，較佳是加熱滅菌的100℃至125℃(例如121℃)。加熱後，將所得的特定化合物的溶液冷卻至室溫。由於在該溶液中添加上述金屬離子(例如鈣離子等2價金屬離子)(例如將該溶液添加到液體培養基中)，而形成由該特定化合物構成的上述構造體。或者是，在將特定化合物溶解於含有上述金屬離子(例如鈣離子等2價金屬離子)的溶媒(例如水、液體培養基等水性溶媒)時，進行加熱(例如80℃至130℃，較佳是100℃至125℃(例如121 ℃))，即使將所得的溶液冷却至室溫，也可形成由該特定化合物構成的上述構造體。
以下例示本發明所用的培養基組成物的調製方法，但本發明不受此所限定。將特定化合物添加到離子交換水或超純水。然後，在可使該特定化合物溶解的溫度(例如60℃以上、80℃以上、90℃以上)攪拌而溶解直到成為透明的狀態為止。溶解後，一邊攪拌一邊放冷，進行滅菌(例如在121℃進行高壓釜滅菌20分鐘)。恢復到室溫後，一邊將用於靜置培養的任意培養基予以攪拌(例如均勻混合器(homomixer)等)，一邊在該培養基中添加前述滅菌後的水溶液，進行混合直到與該培養基成為均勻為止。本水溶液與培養基的混合方法並無特別限制，例如可列舉如：以吸量管吸取等的手動的混合，使用磁力攪拌機及機械式攪拌機、均勻混合器、均質器(homogenizer)等機器的混合。又，在混合後，亦可將本發明所用的培養基組成物以過濾器過濾。在進行過濾處理時所用的過濾器的細孔的大小是5μm至100μm，較佳是5μm至70μm，更佳是10μm至70μm。
或者是，將粉末培養基及上述高分子化合物(粉末等固體)與水性溶媒混合，在上述溫度下加熱而調製本發明所用的培養基組成物。
例如，在調製脫醯化結冷膠時，是在離子交換水或超純水中添加脫醯化結冷膠而使其成為0.1%至1%(w/v)，較佳是0.2%至0.5%(w/v)，更佳是0.3%至 0.4%(w/v)。又，另一種情形，則是在調製脫醯化結冷膠時，在離子交換水或超純水中添加脫醯化結冷膠而使其成為0.1%至1%(w/v)，較佳是0.2%至0.8%(w/v)，更佳是0.3%至0.6%(w/v)。
然後，如果是能溶解前述脫醯化結冷膠的溫度即可，例如藉由在60℃以上，較佳是在80℃以上，更佳是在90℃以上(例如80至130℃)攪拌，而使其溶解直到成為透明的狀態為止。溶解後，一邊攪拌一邊放冷，例如在121℃進行高壓釜滅菌20分鐘。恢復至室溫後，例如，一邊將DMEM/F12培養基以均勻混合器等進行攪拌，一邊在該培養基中添加本水溶液直到成為所希望的最終濃度(例如終濃度為0.015%時，則0.3%水溶液：培養基的比率是1：19)為止，混合均勻。本水溶液與培養基的混合方法並無特別限制，例如可列舉如：以吸量管吸取等的手動的混合，使用磁力攪拌機或機械式攪拌機、或均勻混合器、均質器等機器的混合。又，在混合後亦可將本發明所用的培養基組成物以過濾器過濾。進行過濾處理時所用的過濾器的細孔的大小是5μm至100μm，較佳是5μm至70μm，更佳是10μm至70μm。
以下加以說明本發明所用的培養基組成物及其製造方法的適宜態樣。
本發明所用的培養基組成物較佳是可使細胞或組織懸浮而培養的培養基組成物，前述培養基組成物的黏度是8mPa‧s以下(37℃條件下)，並且以含有脫醯化結冷膠或其 鹽為特徴。在一態樣中，培養基組成物中的脫醯化結冷膠或其鹽的濃度是0.005至0.3%(w/v)(較佳是0.01至0.05%(w/v))。在一態樣中，該培養基組成物更含有脫醯化結冷膠或其鹽以外的多糖類。在一態樣中，該培養基組成物中含有2價金屬離子(例如鈣離子)，其濃度足以使脫醯化結冷膠形成可使細胞或組織懸浮而培養的構造體。該濃度是例如0.1mM至300mM，較佳是0.5mM至100mM。
該培養基組成物係可藉由將脫醯化結冷膠或其鹽與培養基混合而製造。在一態樣中，該培養基是液體培養基。在一態樣中，該液體培養基含有2價金屬離子(例如鈣離子)，其濃度足以使脫醯化結冷膠形成可使細胞或組織懸浮而培養的構造體。該濃度是例如0.1mM至300mM，較佳是0.5mM至100mM。在一態樣中，將溶媒中溶解或分散的脫醯化結冷膠或其鹽與培養基混合。在一態樣中，在溶媒中溶解或分散的脫醯化結冷膠或其鹽是經滅菌過的狀態。在一態樣中，滅菌是藉由高壓釜滅菌而實施。在另一態樣中，滅菌是藉由過濾滅菌而實施。在一態樣中，過濾滅菌是藉由使其通過0.1至0.5μm的過濾器而實施。
(2)血管平滑肌細胞的培養
本發明提供一種血管平滑肌細胞的體外培養方法，其包含在培養基組成物I中將血管平滑肌細胞進行懸浮培養。藉由將血管平滑肌細胞在培養基組成物I中進行懸浮培養，而可在維持良好的生存性下停止細胞週期，使細胞 增殖受到抑制，並可在迴避形質變化的風險下維持長期間。本發明也包括此種血管平滑肌細胞的細胞增殖的抑制方法、血管平滑肌細胞的形質變化的抑制方法、以及在細胞增殖停止狀態的血管平滑肌細胞的生存性的維持方法(抑制存活率降低的方法)。
本發明所用的血管平滑肌細胞是哺乳動物的血管平滑肌細胞。就哺乳動物而言，例如可列舉如：小鼠、大鼠、倉鼠、天竺鼠等囓齒類，兔等兔目，豬、牛、山羊、馬、綿羊等有蹄目，狗、貓等貓目，人類、猴、紅毛猴、食蟹猴、狨(Marmoset)、猩猩、黑猩猩等靈長類等。哺乳動物較佳是囓齒類(小鼠等)、兔目或靈長類(人類等)，更佳是人類。
本發明所用的血管平滑肌細胞較佳是經單離者。「單離」係指進行除去目的成分或細胞以外的因子的操作，使其脫離天然存在的狀態。「經單離的血管平滑肌細胞」的純度(全細胞中所佔的血管平滑肌細胞的細胞數的百分率)通常是在70%以上，較佳是80%以上，更佳是90%以上，又更佳是99%以上，最佳是100%。在一態樣中，本發明的培養方法的培養物中所含的全細胞中所佔的血管平滑肌細胞的細胞數的百分率通常是在70%以上，較佳是80%以上，更佳是90%以上，又更佳是99%以上，最佳是100%。
血管平滑肌細胞係例如藉由從大動脈只將中膜剝離以貼在平盤底面並培養1至2週，或將血管中膜以膠原蛋白酶或彈性蛋白酶進行處理，而可從生體單離。 血管平滑肌細胞的單離方法是如論文(May-Jun et al，1984；Arteriosclerosis，4(3)：183-188，Orekhov et al，Med Biol.1984；62(4)：255-259.)所記載，在該技術領域是周知的。亦可使用市售的血管平滑肌細胞。
在一態樣中，本發明所用的血管平滑肌細胞是初代培養細胞。初代培養細胞係指在從生體分離並進行繼代操作前的細胞。使用本發明的培養方法時，可在維持良好的生存性下停止血管平滑肌細胞的細胞週期，並使細胞增殖受到抑制，且可在迴避形質變化的風險下維持長期間，所以，可將初代培養的血管平滑肌細胞在維持生體內的形質下進行長期間培養。
將血管平滑肌細胞進行懸浮培養時，可使用細胞的培養一般所用的平皿(schale)、燒瓶、塑膠袋、鐵氟龍(註冊商標)袋、皿、培養皿(petri dish)、組織培養用皿、多皿(multidish)、微盤(microplate)、微孔盤(microwellplate)、多盤(multiplate)、多孔盤(multiwell plate)、腔室玻片(chamber slide)、細胞培養燒瓶、旋轉燒瓶、試管(tube)、盤(tray)、培養袋、滾瓶(roller bottle)等培養容器而培養。為了減少供於培養的血管平滑肌細胞的一部分黏附於培養容器並增殖而產生形質變化的風險，在一態樣中，本發明的培養方法所用的培養容器是細胞非黏附性的。就細胞非黏附性的培養容器而言，可使用：對培養容器的表面未進行用以提升與細胞的黏附性之人工處理(例如細胞外基質等的被覆處理)者；或是對培養容器的表 面已進行用以減低與細胞的黏附性之人工處理者。
培養的血管平滑肌細胞的形態及狀態是可由本發明所屬技術領域中具有通常知識者任意選擇。其較佳具體例並無特別限制，但可列舉如：血管平滑肌細胞以單一細胞的狀態分散於培養基組成物I中的狀態；血管平滑肌細胞黏附在載體表面上的狀態；血管平滑肌細胞包埋在載體內部的狀態；複數個血管平滑肌細胞聚集而形成細胞塊(sphere，亦即球)的狀態等。為了減低因黏附於固相而導致細胞增殖及形質變化的風險，血管平滑肌細胞較佳是以單一細胞的狀態分散於培養基組成物I中的狀態、或複數個細胞聚集而形成細胞塊(球)的狀態，並在培養基組成物I中懸浮培養(較佳是懸浮靜置培養)。亦即，較佳是不使用用以將血管平滑肌細胞黏附或包埋的載體。該等狀態中，由於形成細胞塊(球)的狀態是再構成接近於生體內環境的細胞-細胞間相互作用及細胞構造體，並可在長期維持細胞機能下進行培養，且細胞的回收為較容易，故為理想。
形成細胞凝集塊(球)的方法並無特別限制，可由本發明所屬技術領域中具有通常知識者適當選擇。其例可列舉如：使用具有細胞非黏附表面的培養容器的方法、懸滴法(hanging drop method)、旋轉培養法、3維支架法(3 dimensional scaffold method)、離心法、使用電場或磁場所致的凝集的方法等。
也可使用培養組成物I而形成球。例如，球係藉由在培養組成物I中使解離成單一細胞狀態之目的之 血管平滑肌細胞分散均勻，並靜置3日至10日且懸浮培養，而調製之。在此所調製的球係可藉由進行離心或過濾處理而回收。
在一態樣中，將停止細胞增殖的血管平滑肌細胞供於培養。使用本發明的培養方法時，可在維持良好的生存性下，以細胞增殖停止的狀態，長期間維持血管平滑肌細胞。「細胞增殖停止的狀態」係指細胞的比增殖速度(div/day)在0.1以下，較佳是0.001以下，更佳是0以下。細胞增殖停止的血管平滑肌細胞通常其細胞週期係停止在G0或G1期。在一態樣中，供於培養的血管平滑肌細胞的70%以上，較佳是80%以上，更佳是90%以上，又更佳是95%以上，再又更佳是99%以上係細胞週期停止在G0或G1期。停止在G0或G1期的細胞的比率係可藉由以4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚將細胞染色並以流動式細胞測量術(flow cytometry)來解析細胞內DNA量而決定(Cell,vol.87,pages1069-1078,1996)。
在一態樣中，將增殖中的血管平滑肌細胞供於培養。若藉由本發明的培養方法將增殖中的血管平滑肌細胞進行培養，即可在維持良好的生存性下，使其增殖受到抑制，並停止細胞增殖。本發明也提供此種血管平滑肌細胞的細胞增殖的抑制方法。「增殖中的狀態」係指細胞的比增殖速度(div/day)超過0.1。
培養血管平滑肌細胞時，只要對培養組成物I添加另外調製的血管平滑肌細胞，並混合至均勻分散 即可。此時的混合方法並無特別限制，例如可列舉如：以吸量管吸取等的手動的混合，使用攪拌機、渦漩混合器(vortex mixer)、微盤混合器、振盪機等機器的混合。混合後，可將所得的血管平滑肌細胞懸液靜置培養，亦可視需要而將培養液旋轉、振盪或攪拌。其旋轉數及頻度可配合本發明所屬技術領域中具有通常知識者的目的而適當設定。又，在靜置培養的期間有必要更換培養基組成物時，只要在藉由進行離心或過濾處理而將血管平滑肌細胞與培養基組成物分離後，對細胞添加新鮮的培養基組成物I即可。或者是，亦可在藉由實施離心或過濾處理而適當濃縮血管平滑肌細胞後，將新鮮的上述培養基組成物I添加到該濃縮液中即可。
在一態樣中，將從生體分離的初代血管平滑肌細胞、或另外在體外培養的血管平滑肌細胞(例如經黏附培養的血管平滑肌細胞)，分散成單一細胞或接近於其之狀態。血管平滑肌細胞的分散是使用合適的細胞解離液而進行。細胞解離液係例如可將EDTA；胰蛋白酶、膠原蛋白酶IV、金屬蛋白酶等蛋白分解酶等單獨或適當組合而使用。將經分散過的血管平滑肌細胞懸浮於培養基組成物I中，並將其懸浮培養(較佳是懸浮靜置培養)。培養物中，血管平滑肌細胞是以單一細胞的狀態或球的狀態而懸浮在培養基組成物I中。
培養物中的血管平滑肌細胞的濃度，只要是能以細胞增殖受到抑制的狀態來維持血管平滑肌細胞者 則無特別限定，通常是3.0×104至3.0×106cells/ml，較佳是1.0×105至1.0×106cells/ml，更佳是3.0×105至5.0×105cells/ml。
培養基組成物I中的血管平滑肌細胞的培養期間，只要是能以細胞增殖受到抑制的狀態來維持血管平滑肌細胞者則無特別限定，例如可為12小時以上、24小時以上、48小時以上、70小時以上的培養。就理論而言，培養期間並無上限值，但由於若以細胞增殖受到抑制的狀態而過度長期間培養血管平滑肌細胞時會有招致存活率的降低之虞，故期望培養期間是例如止於30日以下，較佳是14日以下，更佳是211小時以下左右。若使用本發明的方法，即可以細胞增殖受到抑制的狀態將血管平滑肌細胞如此長期間地維持在體外。
在一態樣中，將增殖中的血管平滑肌細胞在培養基組成物I中懸浮培養(較佳是靜置懸浮培養)至該細胞的細胞增殖停止為止。增殖中的血管平滑肌細胞，其到停止細胞增殖為止所需的時間通常是3小時以上，較佳是12小時以上，更佳是24小時以上。
培養血管平滑肌細胞時的溫度通常是25至39℃，較佳是37℃。CO2濃度通常在培養的環境中是4至10體積%，較佳是5體積%。氧氣濃度在培養的環境中是15至50體積%，較佳是20體積%。
藉由如此之培養操作，可將血管平滑肌細胞以細胞增殖受到抑制的狀態長期間維持在體外。
(3)血管平滑肌細胞的保存或運送方法
本發明提供使用上述培養基組成物I的血管平滑肌細胞的保存方法及運送方法。本發明的保存或運送方法是以在上述培養基組成物I中使血管平滑肌細胞懸浮為特徴。在本發明的保存或運送方法中，係藉由使用培養基組成物I，而可將細胞或組織在非冷凍條件下以懸浮狀態(較佳是懸浮靜置狀態)保存或運送。
保存或運送所用的培養基組成物I中，除了上述(1)所述的組成之外，在將細胞以非冷凍狀態保存時，也可含有具有細胞延命效果的各種成分。該成分可列舉如：糖類(惟排除多糖類)(例如單糖類、二糖類)、抗氧化劑(例如SOD、維生素E或麩胱甘肽(glutathione))、親水性聚合物(例如聚乙烯吡咯酮)、螯合劑(例如EDTA)、糖醇(例如甘露糖醇、山梨糖醇)、甘油等。
血管平滑肌細胞較佳是經單離者。在一態樣中，將初代培養的血管平滑肌細胞供於保存‧運送。在一態樣中，將停止細胞增殖的血管平滑肌細胞供於保存‧運送。在一態樣中，供於保存‧運送的血管平滑肌細胞的70%以上，較佳是80%以上，更佳是90%以上，又更佳是95%以上，再又更佳是99%以上，細胞週期係停止在G0或G1期。在一態樣中，將增殖中的血管平滑肌細胞供於保存‧運送。使用本發明的方法時，由於可在非冷凍條件下，維持高生存性，且使血管平滑肌細胞的細胞增殖受到抑 制，並維持細胞增殖停止的狀態，所以，可迴避因冷凍或細胞增殖而導致形質變化的風險，並可將血管平滑肌細胞長期間保存或運送。
在本發明的保存或運送方法中，將血管平滑肌細胞分散於培養基組成物I中後，裝入可密封的容器中。該容器可列舉如燒瓶、塑膠袋、鐵氟龍(註冊商標)袋、試管、培養袋等，但不限定於該等。在保存或運送中，為了迴避內容物的漏出及來自外界的細菌等的汙染，裝有血管平滑肌細胞的培養基組成物I中的分散物之容器較佳係經密封。
保存或運送中的溫度，只要是能維持血管平滑肌細胞的生存者則無特別限定，通常是37℃以下。溫度較低時，可迴避保存或運送中的血管平滑肌細胞的生存性降低，但通常是以超過培養基組成物I的融點的溫度來保存或運送，以避免血管平滑肌細胞凍結。因此，保存或運送中的溫度通常是維持在-5至42℃，較佳是1至37℃，更佳是4至32℃，又更佳是18至30℃。
為了能將懸浮靜置狀態的血管平滑肌細胞加以保存或運送，保存或運送中的溫度較佳是能使培養基組成物I懸浮靜置血管平滑肌細胞的溫度。
保存或運送的期間，只要是在可於培養基組成物I中使血管平滑肌細胞維持生存狀態的範圍內則無特別限定，通常是12小時以上、10日以內，較佳是1至8日，更佳是1至3日。保存或運送期間中，細胞或組織較 佳是在培養基組成物I中維持懸浮靜置狀態。
使用本發明的保存或運送方法時，在沒有冷凍操作的條件下可運送血管平滑肌細胞，並且可期待將在冷凍或增殖所見的血管平滑肌細胞的形質變化抑制於最小限度。
在(3)項中的各用語的定義，在沒有特別註明時，係與上述(1)及(2)中所述相同。
在此所述的包括專利及申請專利說明書的全部刊行物所述的內容，係因引用於此，而以與其全部明示者為同樣的程度編入於本說明書。
[實施例]
以下，將本發明所用的培養基組成物的分析例、試驗例作為實施例而具體闡述，藉此而將本發明更詳細說明，但本發明並不受該等所限定。
[試驗例1] 血管平滑肌細胞及NIH3T3細胞的生存維持試驗
依照WO2014/017513 A1所記載的製造方法，調製用於細胞的懸浮培養的培養基組成物。亦即，將脫醯化結冷膠(KELCOGEL CG-LA，三晶股份有限公司製)懸浮於超純水(Milli-Q水)成為0.3%(w/v)後，在90℃加熱下攪拌而溶解，將所得的脫醯化結冷膠水溶液以121℃高壓釜滅菌20分鐘。使用本溶液，製作含有終濃度0.015%(w/v)的脫醯化結冷膠的DMEM/F12(Kohjin-Bio公司製)，再添加10%(v/v)胎 兒牛血清而得到培養基組成物。繼而，將兔血管平滑肌細胞(在千葉大學藥學研究院醫院藥學研究室調製)及小鼠纖維芽細胞株NIH3T3(ATCC製)在上述培養基組成物中調製成為1.0×105cells/ml後，在15ml試管播種5mL。此外，以使兔血管平滑肌細胞或NIH3T3細胞懸浮於不含脫醯化結冷膠的DMEM者作為陰性對照，予以分注。繼而，將本試管靜置在CO2保溫箱(37℃，5%CO2)內，而將細胞在靜置狀態下懸浮培養最長211小時。對於培養12小時、24小時、36小時、48小時、70小時、115小時及211小時後的培養物，添加台盼藍(trypan blue)試劑(Life Technologies公司製)，在顯微鏡下計測活細胞數及總細胞數。由總細胞數及活細胞數算出存活率。
其結果，陰性對照的各細胞的存活率，兔血管平滑肌細胞是在12小時未達50%，NIH3T3細胞是在36小時未達50%。另一方面，在含有脫醯化結冷膠的培養基時，兩細胞的存活率在到115小時為止是表現50%以上的值。將兔血管平滑肌細胞的活細胞數及存活率表示於第1表及第2表，將NIH3T3細胞的活細胞數及存活率表示於第3表及第4表。
Figure 105102833-A0202-12-0038-2
Figure 105102833-A0202-12-0038-3
Figure 105102833-A0202-12-0039-4
Figure 105102833-A0202-12-0039-5
[試驗例2] 血管平滑肌細胞的細胞週期解析
依照WO2014/017513 A1所記載的製造方法，調製用於細胞的懸浮培養的培養基組成物。亦即，將脫醯化結冷膠(KELCOGEL CG-LA，三晶股份有限公司製)懸浮於超純水(Milli-Q水)成為0.3%(w/v)後，在90℃加熱下攪拌而溶解，將所得的脫醯化結冷膠水溶液以121℃高壓釜滅菌20分鐘。使用本溶液，調製含有終濃度0.015%(w/v)的脫醯化結冷膠的DMEM/F12(Kohjin-Bio公司製)，再添加10%(v/v)胎兒牛血清而得到培養基組成物。繼而，將兔血管平滑肌細胞(在千葉大學藥學研究院醫院藥學研究室調製)在上述培養基組成物中調製成為4×105cells/ml後，在15ml試管播種9mL。繼而，將本試管靜置在CO2保溫箱(37℃，5%CO2)內，而將細胞以靜置狀態懸浮培養最長5日。此外，以使兔血管平滑肌細胞懸浮於不含脫醯化結冷膠的DMEM(和光純藥公司製)並在一般的單層培養用的平皿上培養者作為對照。
使用細胞溶解液(IP buffer)從各細胞回收蛋白質，並使用BCA法(Thermo Scientific)實施蛋白的定量。使用20μg的蛋白質而實施西方墨點轉漬法分析。就一次抗體(Santa Cruz Biotechnology公司製)而言，係將多株(polyclonal)抗p27抗體(C-19)、多株抗p21抗體(M-19)、多株抗CDK2抗體(M-2)、及多株抗β-actin抗體(I-19)稀釋200倍而使用。又，就二次抗體而言，係將抗兔IgG-HRP抗體(Amersham Bioscience)稀釋10,000倍而使用。檢測是使用ECL西方墨點轉漬法檢測試劑(Amersham Bioscience)或Immobilon Western(Millipore)，以LAS4000(FUJIFILM)實施。
在含有脫醯化結冷膠的培養基中的懸浮培養、以及在不含脫醯化結冷膠的培養基中的單層培養之間，比較兔血管平滑肌細胞的細胞週期因子的表現。在含有脫醯化結冷膠的培養基中培養兔血管平滑肌細胞時，促進細胞週期的G1/S期轉移的cdk2的表現及抑制G1/S轉移的p21及p27的表現係皆降低(第1圖)。在單層培養的兔血管平滑肌細胞未見到此現象。由G1/S期的促進因子及抑制因子皆降低的結果看來，暗示在含有脫醯化結冷膠的培養基中的懸浮培養是將兔血管平滑肌細胞的細胞週期停止於G0期。
[試驗例3] 血管平滑肌細胞的細胞週期解析
依照WO2014/017513 A1所記載的製造方法，調製用於細胞的懸浮培養的培養基組成物。亦即，將脫醯化結冷膠(KELCOGEL CG-LA，三晶股份有限公司製)懸浮於超純水(Milli-Q水)成為0.3%(w/v)後，在90℃加熱下攪拌而溶解，將本水溶液以121℃高壓釜滅菌20分鐘。使用本溶液，製作含有終濃度0.015%(w/v)的脫醯化結冷膠的DMEM/F12(Kohjin-Bio公司製)，再添加10%(v/v)胎兒牛血清而調製培養基組成物。繼而，將兔血管平滑肌細胞(在千葉大學藥學研究院醫院藥學研究室調製)在上述培養基組成物中調製成為3×105cells/ml(兔血管平滑肌細胞)後，在15ml試管播種5mL。繼而，將本試管靜置在CO2保溫箱(37℃，5%CO2)內，而將細胞以靜置狀態懸浮培養最長3日。此外，使用使兔血管平滑肌細胞懸浮於不含脫醯化結冷膠的DMEM(和光純藥公司製)並在一般的單層培養用的平皿培養的細胞作為對照。
使用細胞溶解液(IP buffer)從各細胞回收蛋白質，並使用BCA法(Thermo Scientific)實施蛋白的定量。使用10至15μg的蛋白質而實施西方墨點轉漬法分析。就一次抗體而言，係將Santa Cruz Biotechnology公司製的多株抗cyclin E1抗體(M-20)、多株抗CDK2抗體(M-2)、多株抗p27抗體(C-19)、多株抗p21抗體(M-19)、多株抗β-actin抗體(I-19)稀釋200倍，將單株抗cyclin D1抗體(HD11)稀釋250倍，將BD Biosciences公司製的單株抗cyclin D3抗體稀釋1000倍，將單株抗CDK4抗體稀釋250倍而使用。又，就二次抗體而言，係將抗小鼠IgG-HRP抗體(GE Healthcare)稀釋50,000倍，將抗兔IgG-HRP抗體(Cell Signaling Technology)稀釋10,000倍而使用。檢測是使用ECL西方墨點轉漬法檢測試劑(GE Healthcare)或Immobilon Western(Millipore)，以LAS4000(FUJIFILM)實施。
針對含有脫醯化結冷膠的培養基及在單層培養的兔血管平滑肌細胞的細胞週期因子，進行比較。在含有脫醯化結冷膠的培養基中培養兔血管平滑肌細胞時，促進細胞週期的G1/S期轉移的cdk2的表現及抑制G1/S轉移的p21的表現係皆降低，確認到有再現性(第2圖)。在單層培養的兔血管平滑肌細胞未見到此現象。由G1/S期的促進因子及抑制因子皆降低的結果看來，暗示含有脫醯化結冷膠的培養基係使兔血管平滑肌細胞往G0期轉移。
[試驗例4] NIH3T3細胞的細胞週期解析
依照WO2014/017513 A1所記載的製造方法，調製用於細胞的懸浮培養的培養基組成物。亦即，將脫醯化結冷膠(KELCOGEL CG-LA，三晶股份有限公司製)懸浮於超純水(Milli-Q水)成為0.3%(w/v)後，在90℃加熱下攪拌而溶解，將本水溶液以121℃高壓釜滅菌20分鐘。使用本溶液，製作含有終濃度0.015%(w/v)的脫醯化結冷膠的DMEM/F12(Kohjin-Bio公司製)，再添加10%(v/v)胎兒牛血清而調製培養基組成物。繼而，將小鼠纖維芽細胞株NIH3T3(ATCC公司製)在上述培養基組成物中調製成為3×105cells/mL後，在15ml試管播種5mL。繼而，將本試管在CO2保溫箱(37℃，5%CO2)內使細胞以靜置狀態懸浮培養最長5日。此外，使用使NIH3T3細胞懸浮於不含脫醯化結冷膠的DMEM(和光純藥公司製)並在一般的單層培養用的平皿上培養的細胞作為對照。
使用細胞溶解液(IP buffer)從各細胞回收蛋白質，並使用BCA法(Thermo Scientific)實施蛋白的定量。使用10至15μg的蛋白質而實施西方墨點轉漬法分析。就一次抗體 而言，係將Santa CruzBiotechnology公司製的多株抗cyclin E1抗體(M-20)、多株抗CDK2抗體(M-2)、多株抗p27抗體(C-19)、多株抗p21抗體(M-19)、多株抗β-actin抗體(I-19)稀釋200倍，將單株抗cycin D1抗體(HD11)稀釋250倍，將BD Biosciences公司製的單株抗cyclin D3抗體稀釋1000倍，將單株抗CDK4抗體稀釋250倍而使用。又，就二次抗體而言，係將抗小鼠IgG-HRP抗體(GE Healthcare)稀釋50,000倍，將抗兔IgG-HRP抗體(Cell Signaling Technology)稀釋10,000倍而使用。檢測是使用ECL西方墨點轉漬法檢測試劑(GE Healthcare)或Immobilon Western(Millipore)，以LAS4000(FUJIFILM)實施。
針對含有脫醯化結冷膠的培養基及在單層培養的NIH3T3細胞的細胞週期因子，進行比較。以含有脫醯化結冷膠的培養基培養NIH3T3細胞時，促進細胞週期的G1/S期轉移的cdk2的表現係降低，與兔血管平滑肌細胞的結果相同。但是，抑制G1/S轉移的p21的表現則未見到降低，與兔血管平滑肌細胞的結果不同(第3圖)。由此可明白，以含有脫醯化結冷膠的培養基培養兔血管平滑肌細胞及NIH3T3細胞時，會表現不同的細胞週期模式。
[試驗例5] 血管平滑肌細胞的磷酸化Erk及磷酸化FAK的蛋白解析
依照WO2014/017513 A1所記載的製造方法，調製用於細胞的懸浮培養的培養基組成物。亦即，將脫醯化結冷膠(KELCOGEL CG-LA，三晶股份有限公司製)懸浮於超純水(Milli-Q水)成為0.3%(w/v)後，在90℃加熱下攪拌而溶解，將本水溶液以121℃高壓釜滅菌20分鐘。使用本溶液，製作含有終濃度0.015%(w/v)的脫醯化結冷膠的DMEM/F12(Kohjin-Bio公司製)，再添加10%(v/v)胎兒牛血清而調製培養基組成物。繼而，將兔血管平滑肌細胞(在千葉大學藥學研究院醫院藥學研究室調製)在上述培養基組成物中調製成為3×105cells/mL後，在15ml試管播種5mL。此外，使用使兔血管平滑肌細胞懸浮於不含脫醯化結冷膠的DMEM(和光純藥公司製)並在一般的單層培養用的平皿培養的細胞作為對照。繼而，將本試管在CO2保溫箱(37℃，5%CO2)內使細胞以靜置狀態懸浮培養最長3日。
使用細胞溶解液(IP buffer)從各細胞回收蛋白質，並使用BCA法(Thermo Scientific)實施蛋白的定量。使用10至15μg的蛋白質而實施西方墨點轉漬法分析。就一次抗體而言，係將Upstate Biotechnology公司製的單株抗磷酸化FAK(p125)抗體稀釋100倍，將BD Biosciences公司製的單株抗FAK抗體稀釋200倍，將Cell Signaling公司製的多株抗磷酸化p44/42 MAPK(Erk1/2)抗體(Thr202/Tyr204)稀釋500倍，將ZYMED公司製的單株抗MAP kinase(ERK1+ERK2)抗體稀釋500倍而使用。又，就二次抗體而言，係將抗小鼠IgG-HRP抗體(GE Healthcare)稀釋50,000倍，將抗兔IgG-HRP抗體(Cell Signaling Technology)稀釋10,000倍而使用。檢測是使用ECL西方墨點轉漬法檢測試劑(GE Healthcare)或Immobilon Western(Millipore)，以LAS4000(FUJIFILM)實施。
針對含有脫醯化結冷膠的培養基及在單層培養的兔血管平滑肌細胞的信號傳遞因子(Erk及FAK)，進行比較。在單層培養中，培養開始1小時後磷酸化Erk的表現量是無法檢測出的水準。以含有脫醯化結冷膠的培養基培養兔血管平滑肌細胞時，磷酸化Erk量係顯示與單層培養一樣的表現量。另一方面，關於磷酸化FAK量，則顯示相較於單層培養而為表現量較低的傾向(第4圖)。
[試驗例6] NIH3T3細胞的磷酸化Erk及磷酸化FAK的蛋白解析
依照WO2014/017513 A1所記載的製造方法，調製用於細胞的懸浮培養的培養基組成物。亦即，將脫醯化結冷膠(KELCOGEL CG-LA，三晶股份有限公司製)懸浮於超純水(Milli-Q水)成為0.3%(w/v)後，在90℃加熱下攪拌而溶解，將本水溶液以121℃高壓釜滅菌20分鐘。使用本水溶液，製作含有終濃度0.015%(w/v)的脫醯化結冷膠的DMEM/F12(Kohjin-Bio公司製)，再添加10%(v/v)胎兒牛血清而調製培養基組成物。繼而，將小鼠纖維芽細胞株NIH3T3(ATCC公司製)在上述培養基組成物中調製成為3×105cells/mL後，在15ml試管播種5mL。此外，使用使NIH3T3細胞懸浮於不含脫醯化結冷膠的DMEM(和光純藥公司製)並在一般的單層培養用的平皿培養的細胞作為對照。繼而，將本試管在CO2保溫箱(37 ℃，5%CO2)內使細胞以靜置狀態懸浮培養最長5日。
使用細胞溶解液(IP buffer)從各細胞回收蛋白質，並使用BCA法(Thermo Scientific)實施蛋白的定量。使用10至15μg的蛋白質而實施西方墨點轉漬法分析。就一次抗體而言，係將Upstate Biotechnology公司製的單株抗磷酸化FAK(p125)抗體稀釋100倍，將BD Biosciences公司製的單株抗FAK抗體稀釋200倍，將Cell Signaling公司製的多株抗磷酸化p44/42 MAPK(Erk1/2)抗體(Thr202/Tyr204)稀釋500倍，將ZYMED公司製的單株抗MAP kinase(ERK1+ERK2)抗體稀釋500倍而使用。又，就二次抗體而言，係將抗小鼠IgG-HRP抗體(GE Healthcare)稀釋50,000倍，將抗兔IgG-HRP抗體(Cell Signaling Technology)稀釋10,000倍而使用。檢測是使用ECL西方墨點轉漬法檢測試劑(GE Healthcare)或Immobilon Western(Millipore)，以LAS4000(FUJIFILM)實施。
針對含有脫醯化結冷膠的培養基及在單層培養的NIH3T3細胞的信號傳遞因子(Erk及FAK)，進行比較。在單層培養中，磷酸化Erk的表現量是無法檢測出的水準。使用含有脫醯化結冷膠的培養基培養時，磷酸化Erk的表現係相較於單層培養而顯示較高的表現量。另一方面，關於磷酸化FAK量，則顯示相較於單層培養而為表現量較低的傾向(第5圖)。由於兔血管平滑肌細胞與NIH3T3細胞的Erk及FAK的磷酸化模式不同，故暗示兩細胞間的信號傳遞不相同。
[試驗例7]
將脫醯化結冷膠(KELCOGEL CG-LA，三晶股份有限公司製)懸浮於超純水(Milli-Q水)成為0.3%(w/v)後，在90℃加熱下攪拌而溶解，將本水溶液以121℃高壓釜滅菌20分鐘。使用本水溶液，製作含有終濃度0.015%(w/v)的脫醯化結冷膠的DMEM/F12(Kohjin-Bio公司製)，再添加10%(v/v)胎兒牛血清而調製培養基組成物。繼而，將兔血管平滑肌細胞(在千葉大學藥學研究院醫院藥學研究室調製)在上述培養基組成物中調製成為1×105cells/mL後，在15ml試管播種。繼而，將本試管在CO2保溫箱(37℃，5%CO2)內以靜置狀態培養2日。之後，將經胰蛋白酶處理的細胞使用DMEM(和光純藥工業製)在平皿播種9×104cells/cm3，繼續培養。在培養3日、5日及7日後更換培養基。在培養1日、3日、5日、7日及10日後回收細胞，添加台盼藍試劑(Life Technologies公司製)而懸浮，在顯微鏡下計測活細胞數、總細胞數。由總細胞數及活細胞數算出存活率。
將血管平滑肌細胞在維持懸浮狀態下於含有脫醯化結冷膠的培養基中懸浮培養時，是在維持良好的生存性下使細胞增殖受到抑制。將血管平滑肌細胞從懸浮培養繼代到平盤上的黏附培養後，雖能維持該形質一定期間，但之後，血管平滑肌細胞就會增殖(第6圖)。
[產業上的利用可能性]
藉由本發明，使血管平滑肌細胞在細胞增 殖受到抑制的狀態下，可在體外維持長期間。藉由本發明，可在沒有冷凍操作的條件下運送血管平滑肌細胞，並且可期待使在冷凍或黏附所看到的細胞的形質變化限於最小限度。本發明是有所貢獻於使用血管平滑肌細胞的再生醫療的發展。
在此所述的包括專利、申請專利說明書、科學文獻的全部刊行物所述的內容，係因引用於此，而以與其全部明示者為同樣的程度編入於本說明書。
本申請案是以在日本提出申請的特願2015-017839(申請日：2015年1月30日)、特願2015-065007(申請日：2015年3月26日)及特願2015-183940(申請日：2015年9月17日)為基礎，其內容全部包含在本說明書中。
本案之第1圖至第6圖皆為實施例中培養細胞之分析結果圖，並非用以表示本案申請專利範圍所請發明的圖，故本案無指定代表圖。

Claims (3)

  1. 一種血管平滑肌細胞的培養方法，其係包含：在含有0.005至0.3%(w/v)的濃度的脫醯化結冷膠且可使細胞或組織懸浮而培養之培養基組成物中，將在細胞增殖停止的狀態之血管平滑肌細胞進行懸浮培養。
  2. 一種血管平滑肌細胞的細胞增殖的抑制方法，其係包含：在含有0.005至0.3%(w/v)的濃度的脫醯化結冷膠且可使細胞或組織懸浮而培養之培養基組成物中，將在細胞增殖停止的狀態之血管平滑肌細胞進行懸浮培養。
  3. 一種血管平滑肌細胞的保存方法，其係包含：在含有0.005至0.3%(w/v)的濃度的脫醯化結冷膠且可使細胞或組織懸浮而培養之培養基組成物中，使在細胞增殖停止的狀態之血管平滑肌細胞懸浮。
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