CN116426470B - 间充质干细胞无血清培养基及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种间充质干细胞无血清培养基,具体地,该无血清培养基包括基础培养基、血小板裂解物和其他培养用组分例如但不限于L‑谷氨酰胺、氢化可的松和生长因子等。本发明的干细胞无血清培养基在适用于间充质干细胞二维培养的同时还特别地适用于间充质干细胞的三维培养,具有干细胞扩增质量高、数量大、安全性高等优点。
Description
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域,具体涉及一种包含血小板裂解物的间充质干细胞无血清培养基,及其制备方法和应用。
背景技术
间充质干细胞 (Mesenchymal stem cells,MSCs),又称多潜能基质细胞,是属于中胚层的一类多能干细胞,主要存在于结缔组织和器官间质中,包括骨髓、脐带、脂肪、粘膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等组织以及羊水、羊膜、胎盘等。在适宜条件下可分化为脂肪、骨、软骨等多种组织细胞。1976年,Freidenstein首次发现骨髓间充质干细胞 (Bonemarrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs),后研究发现间充质干细胞具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点,受到人们广泛的关注,间充质干细胞被认为是最接近临床应用的干细胞产品。由于从脐带组织中分离提取间充质干细胞不会造成任何损伤,且脐带中的间充质干细胞数量多、质量高,细胞纯净,已成为目前最具有临床应用价值和保存价值的干细胞。
目前干细胞培养主要以传统二维培养为主,相当于仅在一个平面上支持干细胞生长,增殖效率和空间利用率都很低,无法满足临床干细胞日益增长的大剂量应用的需求。与二维平面细胞培养技术相比,三维培养将三维结构的基质与细胞在体外进行共培养,形成立体细胞聚集体,使细胞在体外进行立体式生长、分化和迁移,更真实地模拟机体内生存环境,更有利于细胞的增殖、存活以及本身特性的保持。细胞在不同的培养状态下营养需求存在差异,因此,适用于三维培养技术需要有适合的三维培养基以达到最优的大规模生产工艺。
间充质干细胞体外培养所使用的培养基大都需要补充血清,这就使得在细胞培养过程中存在污染外源病毒和致病因子的风险。而且,由于血清中未知成分较多,不同批次血清间的生物活性因子不一致,导致产品和实验结果的重现性差,残留的血清也易引起接种者对血清的过敏反应,给临床研究带来巨大挑战。为了克服血清带来的种种弊端,在细胞培养过程中采用无血清培养基,是非常必要的。
血小板裂解物 (HPLs) 是一种来源于人血小板的无异种源、无动物血清的细胞培养基添加物,HPLs可以从血库收集,那里有不适合病人输血的过期的血小板。HPLs中含有大量的细胞因子、生长因子和蛋白质等物质,可促进MSCs生长,同时保持其分化潜能和免疫调节特性。目前,已上市的间充质干细胞无血清培养基绝大部分是针对二维培养,三维大规模培养时效果不佳,本发明旨在寻找一种基于血小板裂解物同时适合于二维与三维培养的无血清培养基,达到细胞扩增质量和数量好、安全性高。
发明内容
本发明的目的是提供新型的间充质干细胞无血清培养基,该培养基无血清和无动物源成分,可显著提高间充质干细胞在二维培养或三维培养中的活率、增殖及细胞质量,从而解决了现有技术中已有的间充质干细胞无血清培养基在用于三维大规模培养时效果不佳的技术难题。
在一方面,本发明提供了一种间充质干细胞无血清培养基,其包括以下组分且含量如下所示:
在一些实施方案中,所述间充质干细胞无血清培养基还包括选自以下组的一种或多种组分,其含量如下所示:
在一些实施方案中,所述基础培养基选自由α-MEM培养基、D/F12培养基和DMEM培养基组成的组,优选为所述基础培养基是α-MEM培养基。
在一些实施方案中,所述血小板裂解物的含量为5% (v/v)。
在一些实施方案中,所述L-谷氨酰胺的含量为4mM。
在一些实施方案中,所述氢化可的松的含量为500μg/L。
在另一方面,本发明提供了一种间充质干细胞无血清培养基的制备方法,包括:
1) 将除了血小板裂解物外的其他组分按比例加入到基础培养基中;和
2) 过滤后,按比例加入血小板裂解物。
在一些替代性的实施方案中,本发明提供了一种间充质干细胞无血清培养基的制备方法,包括:
1) 将除了基础培养基外的其他组分按比例混合,制得营养添加组剂;和
2) 将步骤1) 制得的营养添加组剂加入到基础培养基组剂中。
再一方面,本发明提供了一种间充质干细胞的培养方法,其中使用本发明的间充质干细胞无血清培养基进行培养。
在一些实施方案中,所述培养方法是二维培养方法,包括以下步骤,
1) 将包含细胞的细胞悬液与间充质干细胞完全培养基混合均匀;
2) 收集细胞,用间充质干细胞完全培养基重悬细胞;
3) 将细胞接种到细胞培养容器中,加入间充质干细胞完全培养基,置于培养箱中培养;和
4) 收获细胞。
所述间充质干细胞完全培养基是本发明的间充质干细胞无血清培养基,其组成如以上所述。
在一些实施方案中,所述培养方法是三维培养方法,包括以下步骤,
1) 准备微载体:将微载体置于培养容器中,加入间充质干细胞完全培养基,使微载体均匀分散;
2) 细胞接种及培养:将细胞悬液加入培养容器中,置于培养箱中培养;和
3) 收获细胞。
所述间充质干细胞完全培养基是本发明的间充质干细胞无血清培养基,其组成如以上所述。
再一方面,本发明提供了间充质干细胞无血清培养基在培养间充质干细胞中的用途。在一些实施方案中,所述培养是二维培养。在一些实施方案中,所述培养是三维培养。
本发明的有益效果为:
1. 本发明的培养基中不包含来源于血清的组分,避免了血清带来的污染外源病毒和致病因子的风险、产品和实验结果的重现性差、易引起过敏反应等弊端;
2. 在适用于间充质干细胞二维培养的同时,本发明的培养基还特别地适用于间充质干细胞的三维培养,实现了间充质干细胞的大规模高质量扩增,且具有安全性高的优点。
附图说明
图1显示了实施例5中细胞连续培养活率大小。
图2显示了实施例5中细胞连续培养增殖倍数。
图3显示了实施例5中细胞连续培养的细胞直径大小。
图4显示了实施例5中细胞连续培养镜下图。
图5显示了实施例7三维培养P7时第1日与第4日细胞染色结果。
图6显示了实施例8三维培养第1日与第4日细胞染色结果。
具体实施方式
除非另有说明,本发明所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术员通常所理解的含义。
在本文中使用时,术语“包括”旨在指定所阐述的特征、整数、组件或步骤的存在,但它们不排除一个或更多个其他特征、整数、组件、步骤或其组的存在或添加。
间充质干细胞无血清培养基
一方面,本发明提供了一种间充质干细胞无血清培养基,其可用于间充质干细胞的二维培养和三维培养。
在本文中使用时,术语“干细胞”是指一类具有自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下,干细胞可以分化成多种功能细胞。术语“间充质干细胞”是指干细胞家族中的一项重要成员,其来源于发育早期的中胚层,属于多能干细胞,最初在骨髓中发现,具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点。间充质干细胞包括骨髓间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、滑膜间充质干细胞、骨骼间充质干细胞、肌肉间充质干细胞、肺间充质干细胞、肝间充质干细胞、胰腺间充质干细胞、羊水间充质干细胞、脐带间充质干细胞等。术语“脐带间充质干细胞”是指来源于脐带的间充质干细胞。术语“脂肪间充质干细胞”是指来源于脂肪的间充质干细胞。
在本文中使用时,术语“无血清培养基”是指未补充有血清蛋白如胎牛血清的细胞培养基。无血清培养基是本领域公知的。
本发明的间充质干细胞无血清培养基包括基础培养基,约88-99% (v/v);血小板裂解物,约1-12% (v/v);L-谷氨酰胺,约2-4mM;和氢化可的松,约0.05-5000μg/L。
在本文中使用时,术语“基础培养基”是指将细胞加入其中开始培养的起始培养基。基础培养基是包含滋养生长的细胞的营养素的溶液。通常,基础培养基提供细胞对于最小限度的生长和/或存活所需要的必需和非必需的氨基酸、维生素、能量来源、脂质和痕量元素。在一些实施方案中,基础培养基是商业上可以获得的培养基或本领域已知能够维持哺乳动物细胞的生长或增殖的培养基。基础培养基的非限定性实例包括但不限于DMEM、F12、MEM、α-MEM、MEGM、RPMI-1640及其组合。在一些实施方案中,所述基础培养基包括D/F12(例如1:1混合比例)、α-MEM+DMEM (例如1:1混合比例)和α-MEM。在优选实施方案中,所述基础培养基是α-MEM。在一些实施方案中,本发明的间充质干细胞无血清培养基中,以体积比计,基础培养基占约88-99% (v/v),例如约88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%,或由上述任意数值为端点的范围内的任意值。在一些实施方案中,本发明的间充质干细胞无血清培养基中,以间充质干细胞无血清培养基总体积为基准计算体积比计,基础培养基占约88-97% (v/v),例如约88-95% (v/v)、约88-93% (v/v)、约88-92% (v/v)、约88-91% (v/v)、约89-91% (v/v)、约90% (v/v)等。
在本文中使用时,术语“血小板裂解物”是指可从血小板获得的制品。血小板可从供体,优选人供体获得,可从多个采集单位的全血分离并汇集,或通过血小板单采采集:从供体获取血液,并使血液通过去除血小板的装置。在分离后,血小板典型地例如通过一个或多个冷冻/解冻循环进行裂解。本发明中使用的血小板裂解物可以是能商业购买获得的市售血小板裂解物产品,例如EliteCell Biomedical Corp购买获得的血小板裂解物产品EliteGro-adv。在一些实施方案中,本发明的间充质干细胞无血清培养基中,以体积比计,血小板裂解物占约1-12% (v/v),例如约1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、9%、10%、11%、12%,或由上述任意数值为端点的范围内的任意值。在一些实施方案中,本发明的间充质干细胞无血清培养基中,以体积比计,血小板裂解物占约2-10% (v/v),例如约2.5-10% (v/v)、约2.5-7.5% (v/v)、约3.5-6.5% (v/v)、约4.5-5.5%(v/v)、约5% (v/v)等。在优选实施方案中,本发明的间充质干细胞无血清培养基中,以间充质干细胞无血清培养基总体积为基准计算体积比计,血小板裂解物占约5% (v/v)。
在细胞培养时,绝大部分细胞对谷氨酰胺有较高的要求,因为谷氨酰胺是作为能源及碳源物质同时被细胞利用,是是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸,在缺少谷氨酰胺时,细胞生长不良而死亡。细胞所能利用的谷氨酰胺是L型同分异构体,D型谷氨酰胺不能被利用。在一些实施方案中,本发明的间充质干细胞无血清培养基中,L-谷氨酰胺的含量为约2-4mM,例如约2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM,或由上述任意数值为端点的范围内的任意值。在优选实施方案中,本发明的间充质干细胞无血清培养基中,L-谷氨酰胺的含量为约4mM。
在本文中使用时,术语“氢化可的松”也被称为可的松,是指具有糖皮质激素作用的肾上腺皮质激素剂。在间充质干细胞培养中,氢化可的松是一种常用的添加剂,可以影响细胞的信号传递途径,从而影响细胞的功能。还可以抑制细胞的免疫反应和炎症反应,从而减少细胞在培养中受到的应激,提高干细胞的存活率和生长速度。在一些实施方案中,本发明的间充质干细胞无血清培养基中,氢化可的松的含量为约0.05-5000μg/L,例如约0.05μg/L、0.5μg/L、5μg/L、50μg/L、500μg/L、1000μg/L、2000μg/L、3000μg/L、4000μg/L、5000μg/L,或由上述任意数值为端点的范围内的任意值。在一些实施方案中,本发明的间充质干细胞无血清培养基中,氢化可的松的含量为约5-5000μg/L,例如约100-1000μg/L,例如约100μg/L、200μg/L、300μg/L、400μg/L、500μg/L、600μg/L、700μg/L、800μg/L、900μg/L、1000μg/L。在优选实施方案中,本发明的间充质干细胞无血清培养基中,氢化可的松的含量为约500μg/L。
本发明的间充质干细胞无血清培养基还可以包括生长因子。生长因子是维持细胞体外培养生存、增殖和分化所必需的补充因子。生长因子是有效的促有丝分裂原,能缩短细胞群体倍增时间。按化学性质可分为多肽类生长因子和甾类生长因子。能加入到本发明的间充质干细胞无血清培养基的生长因子包括但不限于多肽类生长因子和甾类生长因子,例如天然生长因子或者通过基因重组手段获得相应的重组生长因子。在一些实施方案中,本发明的间充质干细胞无血清培养基包括选自由表皮生长因子 (EGF);成纤维细胞生长因子(FGF),例如碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF);和神经生长因子 (NGF) 等组成的组一种或多种生长因子。在一些实施方案中,本发明的间充质干细胞无血清培养基包括表皮生长因子 (EGF) 和碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)。在一些实施方案中,在本发明的间充质干细胞无血清培养基中,EGF的含量为约5-20ng/ml,例如约5ng/ml、6ng/ml、7ng/ml、8ng/ml、9ng/ml、10ng/ml、11ng/ml、12ng/ml、13ng/ml、14ng/ml、15ng/ml、16ng/ml、17ng/ml、18ng/ml、19ng/ml、20ng/ml,或由上述任意数值为端点的范围内的任意值。在优选实施方案中,本发明的间充质干细胞无血清培养基中,EGF的含量为约20ng/ml。在一些实施方案中,在本发明的间充质干细胞无血清培养基中,bFGF的含量为约5-20ng/ml,例如约5ng/ml、6ng/ml、7ng/ml、8ng/ml、9ng/ml、10ng/ml、11ng/ml、12ng/ml、13ng/ml、14ng/ml、15ng/ml、16ng/ml、17ng/ml、18ng/ml、19ng/ml、20ng/ml,或由上述任意数值为端点的范围内的任意值。在优选实施方案中,本发明的间充质干细胞无血清培养基中,bFGF的含量为约20ng/ml。
本发明的间充质干细胞无血清培养基还可以包括其他补充因子。例如,可以加入到本发明的间充质干细胞无血清培养基的补充因子包括但不限于激素、结合蛋白、贴壁因子和其他添加因子等。
在一些实施方案中,本发明的间充质干细胞无血清培养基包括激素,如胰岛素、生长激素、胰高糖素等。几乎所有的细胞系都需要胰岛素,它是一种多肽,能与细胞上的胰岛素受体结合形成复合物,促进RNA、蛋白质和脂肪酸的合成,一致细胞凋亡,是重要的细胞存活因子。
在一些实施方案中,本发明的间充质干细胞无血清培养基包括结合蛋白,例如转铁蛋白和白蛋白。大多数哺乳动物细胞上存在特定的转铁蛋白受体,受体与转铁蛋白与铁离子的复合物结合是细胞获取必需的微量元素铁的主要来源,此外转铁蛋白还具有生长因子的性质并能与其他微量元素如钒等结合。不同细胞对转铁蛋白的需要量也不同。白蛋白也是无血清培养基中常用的添加因子。它通过与维生素、脂类、激素、金属离子和生长因子的结合而稳定和调节上述物质在无血清培养基中活性的作用,此外还有结合毒素和减轻蛋白酶对细胞影响的作用。在一些实施方案中,在本发明的间充质干细胞无血清培养基中,白蛋白的含量为约0.5-1.0g/L,例如约0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L、1.0g/L,或由上述任意数值为端点的范围内的任意值。
在一些实施方案中,当在本发明的间充质干细胞无血清培养基中添加组分时,可以添加组分复合物,例如包含激素例如胰岛素和结合蛋白例如转铁蛋白的复合物。在一些具体实施方案中,组分复合物是ITS,例如包括但不限于ITS-X、ITS-G和ITS-E等。在一些实施方案中,在本发明的间充质干细胞无血清培养基中包含ITS-X。能添加到本发明的间充质干细胞无血清培养基的ITS-X可以是能商业购买获得的市售ITS-X产品。在一些实施方案中,在本发明的间充质干细胞无血清培养基中,以间充质干细胞无血清培养基总体积为基准计算体积比计,ITS-X的含量为约0.8-1.2% (v/v),例如约0.8% (v/v)、0.9% (v/v)、1.0%(v/v)、1.1% (v/v)、1.2% (v/v),或由上述任意数值为端点的范围内的任意值。
在一些实施方案中,本发明的间充质干细胞无血清培养基还包括其他添加因子,例如氨基酸、维生素、葡萄糖和盐包括无机盐和有机盐等。
氨基酸是合成蛋白质的基本单位,本发明的间充质干细胞无血清培养基可以包括细胞自身不能合成和能合成的必需氨基酸和非必需氨基酸,以供细胞生长的需要。本领域技术人员熟知在细胞培养中使用的非必需氨基酸的相关知识。能添加到本发明的间充质干细胞无血清培养基的非必需氨基酸可以是能商业购买获得的市售非必需氨基酸产品,例如可由Sigma公司提供的非必需氨基酸产品 (货号:M7145)。在一些实施方案中,在本发明的间充质干细胞无血清培养基中,非必需氨基酸的含量为约0.1-1.0mM,例如约0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM,或由上述任意数值为端点的范围内的任意值。
维生素是维持细胞生长的一类生物活性物质,对细胞代谢有重大作用。它们在细胞中大多形成酶的辅基或辅酶,没有维生素,酶便没有活性,代谢活动将无法进行。能添加到本发明的间充质干细胞无血清培养基的维生素可以是复合维生素,例如能商业购买获得的市售复合维生素产品,例如可由上海源培生物科技股份有限公司提供的MEM 维生素溶液产品 (货号:S420JV)。在一些实施方案中,在本发明的间充质干细胞无血清培养基中,以间充质干细胞无血清培养基总体积为基准计算体积比计,维生素的含量为约0.8-1.2% (v/v),例如约0.8% (v/v)、0.9% (v/v)、1.0% (v/v)、1.1% (v/v)、1.2% (v/v),或由上述任意数值为端点的范围内的任意值。
葡萄糖为间充质干细胞在培养基中生长提供能量来源。在一些实施方案中,在本发明的间充质干细胞无血清培养基中,葡萄糖的含量为约11-27mM,例如约11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、21mM、22mM、23mM、24mM、25mM、26mM、27mM,或由上述任意数值为端点的范围内的任意值。
盐例如无机盐或有机盐能够维持培养基渗透压平衡,参与细胞的代谢活动。主要有Na+、K+、Ca2+、Mg2+等。Na+是细胞外液中最主要的阳离子,对维持渗透压的恒定有决定性的作用。K+主要分布在细胞内液,细胞内K+对于激活某些酶是必需的,并在调节细胞内环境的酸碱平衡上也有极重要意义。Ca2+在细胞外液中的作用是将组织内部细胞之间相互粘着,在细胞内参与许多重要的细胞生理活动,如传导、参与肌肉细胞收缩等。Mg2+是构成细胞间质的重要成分,对于细胞间相互稳定结合有很重要的意义。磷的化合物对细胞物质代谢和生理功能调控有重要作用。
在一些实施方案中,在本发明的间充质干细胞无血清培养基中包含丙酮酸钠。在一些实施方案中,在本发明的间充质干细胞无血清培养基中,丙酮酸钠的含量为约1-2mM,例如约1mM、2mM,或由上述任意数值为端点的范围内的任意值。
在一些实施方案中,在本发明的间充质干细胞无血清培养基中包含Hepes。在一些实施方案中,在本发明的间充质干细胞无血清培养基中,Hepes的含量为约10-25mM,例如约10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、21mM、22mM、23mM、24mM、25mM,或由上述任意数值为端点的范围内的任意值。
在一些实施方案中,本发明的间充质干细胞无血清培养基还包括选自以下组的一种或多种组分:丙酮酸钠,1-2mM;EGF,5-20ng/ml;bFGF,5-20ng/ml;ITS-X,0.8-1.2% (v/v);葡萄糖,11-27mM;白蛋白,0.5-1.0g/L;维生素,0.8-1.2% (v/v);非必需氨基酸,0.1-1.0mM;和Hepes,10-25mM。
在一些实施方案中,本发明的间充质干细胞无血清培养基还任选地包括余量的水。本领域技术人员应当理解的是,在无血清培养基的配制过程中,由于液体之间的混合互溶以及固体组分在液体组分中的溶解等因素,使得配制后得到的体积可能小于各组分体积之和,在这样的情况下,可以通过补充余量的水来得到具有预期总体积的间充质干细胞无血清培养基。
本领域技术人员应当理解的是,本发明的间充质干细胞无血清培养基中所包含的组分可以是能商业购买获得的市售产品。
在一些实施方案中,本发明的间充质干细胞无血清培养基具有以下组成:
在一些实施方案中,本发明的间充质干细胞无血清培养基具有以下组成:
在一些实施方案中,本发明的间充质干细胞无血清培养基是双组剂配方。该双组剂在储存时分开各自保存,在使用前再混合均匀,即配即用。在一些实施方案中,本发明的间充质干细胞无血清培养基是双组剂配方,其中第一组剂是基础培养基组剂,包括基础培养基;第二组剂是营养添加组剂,包括除基础培养基以外的其他组分。各组剂中组分含量如本文中所限定。
在一些实施方案中,该双组剂在储存时分开各自保存,其中基础培养基组剂在2-8℃的温度条件下保存,营养添加组剂在-18至-22℃,例如-20℃的温度条件下保存。
间充质干细胞无血清培养基的制备
另一方面,本发明提供了间充质干细胞无血清培养基的制备方法,包括以下步骤:
1) 将除了血小板裂解物外的其他组分按比例加入到基础培养基中;和
2) 按比例加入血小板裂解物。
在一些替代性的实施方案中,本发明提供了一种间充质干细胞无血清培养基的制备方法,包括:
1) 将除了基础培养基外的其他组分按比例混合,制得营养添加组剂;和
2) 将步骤1) 制得的营养添加组剂加入到基础培养基组剂中。
在一些实施方案中,在添加前,可以将组分溶解于水或有机溶剂中,有机溶剂例如DMSO。在一些实施方案中,在添加前,用细胞培养用水溶解EGF、bFGF、葡萄糖、白蛋白等。在一些实施方案中,在添加前,用DMSO溶解氢化可的松。
在一些实施方案中,上述方法的各个步骤中,在组分添加过程中任选地进行搅拌或本领域中熟知的手段来促使各组分混合均匀。
在一些实施方案中,上述方法的各个步骤中,在组分混合后任选地可以使用本领域中已知的过滤方法进行过滤,例如使用滤膜进行过滤。在一些实施方案中,使用孔径不大于0.22μm的滤膜进行过滤。在一些实施方案中,使用孔径为0.22μm的滤膜进行过滤。
本发明的间充质干细胞无血清培养基可以在制备后立即使用,替代性地,也可以在低温环境下保存供随后使用。在一些实施方案中,本发明的间充质干细胞无血清培养基的双组剂在储存时分开各自保存,其中基础培养基组剂在2-8℃的温度条件下保存,营养添加组剂在-18至-22℃,例如-20℃的温度条件下保存。
间充质干细胞的培养方法
再一方面,本发明提供了间充质干细胞的培养方法,其中使用本发明的间充质干细胞无血清培养基进行培养。
本发明的的间充质干细胞无血清培养基不仅适用于间充质干细胞的二维培养,而且能应用于间充质干细胞的三维培养,尤其是大规模三维培养。
在本文中使用时,术语“二维培养”是指其中细胞暴露于与细胞生长相容并允许细胞在单层中生长的条件的培养。适合这种生长的装置被称为“二维培养装置”。这种装置通常具有平坦的生长表面。用于二维培养的装置的非限制性实例是细胞培养皿和细胞培养板。
在本文中使用时,术语“三维培养”是指将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养,使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长,构成三维的细胞-载体复合物,改变或减少细胞在培养的过程贴壁的特性,使细胞在空间上获得更多的生存空间,减少细胞接触抑制。
在本发明中,待培养的细胞是干细胞,例如是间充质干细胞,包括但不限于骨髓间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、滑膜间充质干细胞、骨骼间充质干细胞、肌肉间充质干细胞、肺间充质干细胞、肝间充质干细胞、胰腺间充质干细胞、羊水间充质干细胞、脐带间充质干细胞等。
二维培养方法包括以下步骤,
1) 将包含细胞的细胞悬液与间充质干细胞完全培养基混合均匀;
2) 收集细胞,用间充质干细胞完全培养基重悬细胞;
3) 将细胞接种到细胞培养容器中,加入间充质干细胞完全培养基,置于培养箱中培养;和
4) 收获细胞。
所述间充质干细胞完全培养基是本发明的间充质干细胞无血清培养基,其组成如以上方面所描述。
在一些实施方案中,待培养的细胞可以是冷冻保存的细胞。在培养前,按照本领域技术人员熟知的程序解冻细胞,例如将冻存的细胞置入37℃水浴锅中摇晃解冻,例如肉眼观察细胞悬液内冰晶即将完全消失时取出,从而得到可继续进行细胞培养的包含细胞的细胞悬液。
在一些实施方案中,间充质干细胞完全培养基在室温下制备后立即使用。在一些实施方案中,间充质干细胞完全培养基在低温下保存后已恢复至室温待使用。
在一些实施方案中,间充质干细胞完全培养基是通过逐滴加入的方式加入并与细胞悬液相混合均匀。
在一些实施方案中,采用离心的方式收集细胞,例如在200×g的转速下离心5min。
在一些实施方案中,在使用间充质干细胞完全培养基重悬细胞后,精确计数。
在一些实施方案中,接种密度可以为6000-10000/cm2,例如6000/cm2、7000/cm2、8000/cm2、9000/cm2、10000/cm2,或由上述任意数值为端点的范围内的任意值。在优选实施方案中,接种密度为8000/cm2。
在一些实施方案中,采用本领域常规温育条件进行培养,例如置于37℃,5% CO2浓度,饱和湿度的培养箱中。
在一些实施方案中,连续培养时间随细胞汇合度达到合适标准,例如75-90%或80-85%所需的时间而变化,例如可以是连续培养2天、3天、4天等,在细胞汇合度达到合适标准,例如75-90%或80-85%以后按照本领域常规方法收获细胞,或者可以进行选择传代等后续步骤。
在具体实施方案中,本发明的间充质干细胞的二维培养方法包括如下步骤。
吸取细胞悬液至离心管中,加入恢复至室温的间充质干细胞完全培养基,轻柔混匀。离心收集细胞,随后吸去上清,加入间充质干细胞完全培养基重悬细胞。然后将细胞接种到细胞培养容器中,加入适量恢复至室温的新鲜间充质干细胞完全培养基,置于培养箱中培养。连续培养至合适细胞汇合度可选择传代。
三维培养方法包括以下步骤,
1) 准备微载体:将微载体置于培养容器中,加入间充质干细胞完全培养基,使微载体均匀分散;
2) 细胞接种及培养:将细胞悬液加入培养容器中,置于培养箱中培养;和
3) 收获细胞。
所述间充质干细胞完全培养基是本发明的间充质干细胞无血清培养基,其组成如以上所述。
在一些实施方案中,待培养的细胞可以是冷冻保存的细胞。在培养前,按照本领域技术人员熟知的程序解冻细胞,例如将冻存的细胞置入37℃水浴锅中摇晃解冻,例如肉眼观察细胞悬液内冰晶即将完全消失时取出,从而得到可继续进行细胞培养的包含细胞的细胞悬液。
在一些实施方案中,间充质干细胞完全培养基在室温下制备后立即使用。在一些实施方案中,间充质干细胞完全培养基在低温下保存后已恢复至室温待使用。
在一些实施方案中,使用本领域中常规反应器,按照三维培养常规条件进行培养。在一些实施方案中,反应器的参数设定为变速培养和恒速培养相结合,例如40rpm,5min,1rpm,2h,持续1天。在任选地补充间充质干细胞完全培养基之后,反应器调为恒速40rpm,继续培养数天,例如1天、2天、3天、4天,根据细胞取样检测结果判定停止培养的时间。
在一些实施方案中中,可以采用本领域常规步骤进行细胞取样检测。例如,具体地,使用无菌移液管吸取少量微载体悬液置于微孔板例如96孔板中,通过荧光标记染色的方法进行细胞观察。
在一些实施方案中,可以采用本领域常规步骤进行细胞收获。在一些具体实施方案中,采用的微载体是可以用裂解液裂解的微载体,在微载体全部降解后,收集细胞悬液,离心,弃上清以收获细胞。也可用PBS重悬细胞,再离心,弃上清,任选地重复多次后收获细胞。在收获细胞以后,可以重悬至适合密度备用。
在一些实施方案中,任选地包括细胞计数,检测活细胞数、细胞活率、细胞直径等相关参数。在具体实施方案中,取少量裂解后重悬一次的细胞悬液,置于细胞计数仪进行计数,最后检测活细胞数、细胞活率、细胞直径等相关参数。
在具体实施方案中,本发明的间充质干细胞的三维培养方法包括如下步骤:
1. 微载片及细胞准备:取微载片投入培养瓶中,加入间充质干细胞完全培养基,晃动培养瓶使微载片均匀分散;
2. 细胞接种及培养:将细胞悬液加入培养瓶中,补加间充质干细胞完全培养基,置于培养箱中培养,期间任选地补充间充质干细胞完全培养基;
3. 任选地细胞取样观察:使用无菌移液管吸取少量微载体悬液置于微孔板中,通过荧光标记染色的方法进行细胞观察;
4. 细胞收获:停止搅拌生物反应器,待微载体沉降后弃上清,加入裂解液裂解消化,待微载体全部降解,收集细胞悬液,任选地进行离心、弃上清、PBS重悬细胞、再离心,和弃上清等步骤,任选地根据需求,将细胞重悬至适合密度,备用;
5. 任选地细胞计数:取少量裂解后重悬一次的细胞悬液,置于细胞计数仪进行计数,最后检测活细胞数、细胞活率、细胞直径等相关参数。
相比细胞二维培养,细胞三维培养具有诸多优势:1、更接近体内环境,细胞在三维结构中可以形成更复杂的组织结构,更接近人体内部环境,这使得三维培养的细胞更具有生物学意义和临床价值。2、更好的细胞-细胞和细胞-基质相互作用:三维培养可以使细胞更好地进行细胞-细胞和细胞-基质相互作用,从而更好地模拟体内生物环境,增加细胞之间通讯,有利于生长和分化的可塑性。3、更好的药物筛选,三维培养可以更好地模拟体内生物环境,因此更适合用于药物筛选。这种方法可以帮助更好地预测新药物的疗效和安全性,从而更好地提高药物的研发效率。4、更好的组织工程和再生医学应用,三维培养可以为组织工程和再生医学提供更好的模型和方法。通过三维培养,可以将多种细胞类型组合成复杂的组织结构,这对于研究细胞间相互作用和细胞分化有很大的帮助。此外,三维培养还可以为组织修复和再生提供更好的方法,例如利用干细胞和多能细胞进行组织工程。
进行细胞三维培养时可以采用包含微载体的三维培养系统。在本文中使用时,术语“微载体”是指允许贴壁细胞例如间充质干细胞在生物反应器中生长的支持基质颗粒。在本发明中,微载体可以是球体、圆柱体或扁平载体。微载体可以是实心的或多孔的。微载体大小可为10-1000微米的多孔微球,其中有若干相互连通的大于10微米直径的小孔构成的多孔通透结构包裹细胞,如同蜂巢与蜜蜂的关系,微载体的多孔结构为细胞提供了巢穴保护其受到外界不利因素的影响。
微载体可以由多种不同的材料制成。在一些实施方案中,微载体由不可生物降解的材料制成,例如但不限于纤维素、DEAE-葡聚糖、羟基化甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、塑料、玻璃、陶瓷和硅酮。在一些实施方案中,微载体由可生物降解的材料制成,例如但不限于胶原蛋白、藻酸盐、葡聚糖、结冷胶和明胶。这些微载体材料以及不同的表面化学性质可以影响细胞行为,包括形态和增殖。
可用于细胞三维培养的微载体可通过市售从制造商处购买获得,例如GlobalCell Solutions、GE Healthcare、Cultispher Percell、SoloHill Engineering、思拓凡(Cytiva),和北京华龛等。在一些实施方案中,三维培养中使用的微载体是三维多孔微载体,优选地,所述三维多孔微载体具有80-400μm粒径和30-50μm孔径。本发明的间充质干细胞无血清培养基可以适用于使用各种市售三维培养用微载体进行的间充质干细胞的三维培养。
应当理解的是,使用本发明的间充质干细胞无血清培养基来培养间充质干细胞的方法不应局限于以上描述的实施方案。其中使用了本发明的的间充质干细胞无血清培养基的间充质干细胞培养方法均应落在本发明的范围内。
间充质干细胞无血清培养基在培养间充质干细胞中的用途
再一方面,本发明提供了间充质干细胞无血清培养基在培养间充质干细胞中的用途。在一些实施方案中,所述培养是二维培养。在一些实施方案中,所述培养是三维培养。
实施例
下面通过实施例,并结合附图,对本发明作进一步详细描述。除非另有说明,下文描述的实施例的方法和材料均为可以通过市场购买获得的常规产品。本发明所属领域技术员将会理解,下文描述的方法和材料,仅是示例性的,而不应视为限定本发明的范围。
以下实施例中使用的血小板裂解物是购自EliteCell Biomedical Corp的EliteGro-adv。
实施例1. 不同基础培养基对MSCs二维培养的影响
培养基A、B、C、D组分与浓度如下:
人脐带间充质干细胞P5复苏、接种 (接种量2×105个) 于T25培养瓶,培养3天,检测细胞数、增殖倍数、细胞活率及细胞直径大小。实验结果显示组别D使用α-MEM细胞增殖14.3倍,明显优于其它各组 (见表1),但B和C组增殖倍数均在10倍以上,因此可选择D/F12、α-MEM+DMEM (1:1)和α-MEM做为基础培养基,优选基础培养基α-MEM。
表1 实施例1二维培养第3日时细胞培养情况
实施例2. 不同浓度谷氨酰胺对MSCs二维培养的影响
培养基E、F组分与浓度如下:
人脐带间充质干细胞P5复苏、接种 (接种量2×105个) 于T25培养瓶,培养3天,检测细胞数、增殖倍数及细胞活率大小。实验结果显示组别F使用L-谷氨酰胺4 mM时细胞增殖效果明显优于组别E (见表2),但E、F组细胞增殖均达到10倍以上,因此可选择L-谷氨酰胺2-4 mM,优选L-谷氨酰胺4 mM。
表2 实施例2二维培养第3日时细胞培养情况
实施例3. 不同浓度氢化可的松对MSCs二维培养的影响
培养基G、H、I、J、K组分与浓度如下:
人脐带间充质干细胞P5复苏、接种 (接种量2×105个) 于T25培养瓶,培养3天,检测细胞数、增殖倍数及细胞直径大小。实验结果显示氢化可的松500 μg/L时细胞增殖倍数达到最高点,再继续增加浓度细胞增殖并不升高 (见表3),氢化可的松5-5000 μg/L时细胞增殖均可达到10倍以上,因此可选择氢化可的松5-5000μg/L,优选氢化可的松500 μg/L。
表3 实施例3二维培养第3日时细胞培养情况
实施例4. 不同浓度血小板裂解物对MSCs二维培养的影响
培养基L、M组分与浓度如下:
人脐带间充质干细胞P5复苏、接种 (接种量2×105个) 于T25培养瓶,培养3天,检测细胞数、增殖倍数、细胞活率及细胞直径大小。实验结果显示血小板裂解物浓度在5%时细胞增殖达到10倍以上 (见表4),优选血小板裂解物 5%。
表4 实施例4二维培养第3日时细胞培养情况
实施例5. MSCs的二维培养连续传代效果
实验方法:人脐带间充质干细胞P5复苏、接种 (接种量2×105个) 于含有培养基L的T25培养瓶,培养3天后,传代于T25培养瓶中,继续培养3天,再次传代,如此连续培养至P10,每代均检测细胞活率、增殖倍数及细胞直径大小。实验结果见图1-4,细胞从P6传代到P10,增殖倍数较稳定,均在10倍以上,细胞活率较高,细胞直径随着传代增加略有上升。说明该培养基L可二维稳定培养MSC细胞。
实施例6. MSCs的二维培养与三维培养效果比较
实验方法:人脐带间充质干细胞P4复苏,培养3天后,消化、计数,继续二维与三维培养。二维培养:2×105万细胞接种于含有培养基L、N的T25培养瓶中,培养3天。三维培养:2.5×106细胞接种于125ml转瓶中,微载体100mg,培养基体积50ml,间速培养 (40rpm,5min;1rpm,2h)。1天后 (第1日) 补充培养基25ml,转速调为恒速40rpm,继续培养3天。其中培养基N为Biological Industries商业培养基 (货号:05-200-1A+PLTGOLD010R)。实验结果见表5,培养基L在二维与三维培养中均有较好的效果,但培养基N只在二维培养中效果尚可,在三维培养中效果较差。
表5 实施例6 MSCs二维与三维培养效果比较
实施例7. MSCs的三维连续传代效果
人脐带间充质干细胞P3复苏、接种 (接种量6×105个) 于含有培养基L的T75培养瓶,培养3天后,接种于125ml转瓶中,细胞接种量2.5×106个,微载体100mg,培养基N体积50ml,间速培养 (40rpm,5min;1rpm,2h)。1天后 (第1日) 补充培养基25ml,取样计数、染色,转速调为恒速40rpm,再培养3天后染色、计数,连续传代至P7。实验结果显示使用L培养基,连传3代后,增殖倍数仍达到10倍以上,细胞活性较高,细胞维持较好的状态 (见表6与图5)。
表6 实施例7三维培养P7时第1日与第4日时细胞培养情况
实施例8. 不同来源MSCs的培养效果
实验方法:复苏P4代的人脐带间充质干细胞UCMSC、人脂肪间充质干细胞ADMSC及人牙髓间充质干细胞DPMSC,培养3天后,消化、计数,继续二维与三维培养。二维培养:2×105万不同来源MSCs接种于含有培养基L的T25培养瓶中,培养3天。三维培养:2.5×106不同来源MSCs接种于125ml转瓶中,微载体100mg,培养基体积50ml,间速培养 (40rpm,5min;1rpm,2h)。1天后 (第1日) 补充培养基25ml,转速调为恒速40rpm,继续培养3天。实验结果见表7与图6,各细胞在二维与三维中均有较好的培养效果,因此培养基L适合进行UCMSC、ADMSC、DPMSC的二维及三维培养。
表7 不同来源MSCs的二维与三维培养情况
本发明的实施方案并不限于上述实施例所述,在不偏离本发明的精神和范围的情况下,本领域普通技术人员可以在形式和细节上对本发明做出各种改变和改进,而这些均被认为落入了本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种间充质干细胞无血清培养基在三维培养间充质干细胞中的用途,其中,所述间充质干细胞无血清培养基由以下组分构成且含量如下所示:以该间充质干细胞三维培养无血清培养基总体积计,
2.根据权利要求1所述的用途,其中所述血小板裂解物的含量为5% (v/v)。
3.根据权利要求1所述的用途,其中所述L-谷氨酰胺的含量为4mM。
4.根据权利要求1所述的用途,其中所述氢化可的松的含量为500μg/L。
5.根据权利要求1所述的用途,其中,所述间充质干细胞无血清培养基由以下组分构成且含量如下所示:以该间充质干细胞三维培养无血清培养基总体积计,
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