CN118028415A - 一种细胞黏附物的培育方法及其细胞检测方法、装置 - Google Patents

一种细胞黏附物的培育方法及其细胞检测方法、装置 Download PDF

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Abstract

本申请涉及一种细胞黏附物的培育方法,其包括:准备黏附载体;拉出黏附检测装置的推注杆,放入所述黏附载体;制备细胞悬液;利用所述黏附检测装置吸取所述细胞悬液,经倒置、轻微震荡、排除气泡步骤,黏附细胞与所述黏附载体接触,所述黏附细胞黏附在所述黏附载体表面,初步形成细胞黏附物,等待所述细胞黏附物下沉;绑定多组所述黏附检测装置,将推注杆朝向细胞培养瓶底部放入所述细胞培养瓶中,而后将所述细胞培养瓶垂直放入细胞培养箱孵育1~24小时。以及一种细胞检测方法、装置。本申请用于评价材料的生物相容性和生物活性,为进一步的临床应用提供了重要的预测信息。

Description

一种细胞黏附物的培育方法及其细胞检测方法、装置
技术领域
本发明涉及一种细胞黏附物及其培育方法,以及一种细胞检测方法、装置。
背景技术
生物材料的设计和应用在组织工程和再生医学中扮演着至关重要的角色。它们不仅为细胞提供了一个模拟自然生理环境的平台,以促进细胞的生长和黏附,还通过其表面特性和生物活性分子来维持细胞的活力和功能,从而支持受损组织的重建和修复。因此,评价细胞在生物材料表面的黏附铺展情况,包括细胞的数量、分布、形态以及黏附的速度,是体外评价生物材料生物相容性和功能性的一个重要环节。这些评价指标不仅反映了材料的生物相容性和生物活性,也为进一步的临床应用提供了重要的预测信息。
现有技术中存在由于载体形状不规则,难操作,载体在孔板中面积大,容易散开等问题。还存在,洗涤时载体容易被吸走。细胞更容易黏附在孔板上等问题。故载体难以全部转移到新的检测孔板上,这会直接导致检测结果不准。
发明内容
为解决上述技术问题,本发明提供一种细胞黏附物的培育方法及其细胞检测方法、装置,能够满足细胞黏附物培养、细胞检测的条件,提供更高效、更精准的细胞黏附检测。
为实现上述技术目的,采用如下技术方案:
一种细胞黏附物的培育方法,其包括:
S1:准备黏附载体0.1~0.5ml;
S2:拉出黏附检测装置的推注杆,放入所述黏附载体;
S3:制备细胞悬液,所述细胞悬液包括黏附细胞及培养基;
S4:利用所述黏附检测装置取0.1ml所述细胞悬液,经倒置、轻微震荡、排除气泡步骤,黏附细胞与所述黏附载体接触,所述黏附细胞黏附在所述黏附载体表面,初步形成细胞黏附物,等待所述细胞黏附物下沉;
S5:绑定多组所述黏附检测装置,将推注杆朝向细胞培养瓶底部放入细胞培养瓶中,而后将所述细胞培养瓶垂直放入细胞培养箱孵育1~24小时。
根据[1]所述的细胞黏附物的培育方法,其中,
所述黏附载体为多孔物质。
根据[2]所述的细胞黏附物的培育方法,其中,
所述黏附载体为骨粉颗粒。
一种细胞检测方法,用以检测[1]所述的细胞黏附物,其包括:
将置于黏附检测装置中的培养完成的所述细胞黏附物,推动所述推注杆,排除含有细胞悬浮液的培养基;
重新吸取不含细胞的培养基进行润洗涤,重复3次;
将所述细胞黏附物从黏附检测装置中取出,在孔板中收获培养完成的所述细胞黏附物:
经过培养基润洗涤后,进行1mg/ml MTT孵育2小时,按照MTT实验方法洗脱,收获上清液测量OD570,以反映细胞黏附数量。
根据[4]所述的细胞检测方法,其中,
所述润洗涤包括改性处理。
根据[4]所述的细胞检测方法,其中,
所述细胞黏附物取出方式为,拔出所述推注杆,从所述黏附检测装置下方取出。
根据[4]所述的细胞检测方法,其中,
所述细胞黏附物取出方式为,分离所述黏附检测装置上部,推动所述推注杆,从所述黏附检测装置上方取出。
一种细胞黏附检测装置,应用于[1][7]所述的任一种方法,其包括,
空管,所述空管上部具有乳头结构;
推注杆,所述推注杆底部设有推注柄,所述推注杆设于空管内部;
胶塞,所述胶塞与所述推注杆连接,并于空管接触,使空管内部形成密闭结构。
根据[8]所述的细胞黏附检测装置,其中,
所述空管具有分离式结构。
一种细胞组合物,其含有黏附细胞。
发明效果:
根据本公开,能够提供更高效、更精准的细胞黏附检测装置,并能提供细胞黏附物培养方法、细胞检测方法、细胞黏附物以适用。
应当理解的是,以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的,并不能限制本说明书。
附图说明
图1为本发明黏附检测装置结构示意图;
图2为本发明黏附检测装置置培养瓶中培养图示;
图3为本发明细胞黏附示意图;
图4为本发明细胞黏附物显微镜图。
具体实施方式
本说明书中,使用“~”表示的数值范围表示包含“~”前后记载的数值分别作为最小值和最大值的范围。在本说明书中阶段性地记载的数值范围中,某阶段性数值范围的上限值或下限值可以与其他阶段性数值范围的上限值或下限值任意组合。在本说明书所记载的数值范围中,该数值范围的上限值或下限值可以置换为实施例所示的值。本说明书中,在组合物中存在多种相当于各成分的物质的情况下,只要没有特别说明,则组合物中的各成分的含量是指存在于组合物中的该多种物质的合计量。在本说明书中,“步骤”这一术语不仅包含独立的步骤,即使在无法与其他步骤明确区别的情况下,只要能够实现该步骤的所期望的作用,则也包含在本术语中。只要没有特别说明,要素表示单个或多个要素。
以下,对本公开的实施方式进行说明。本发明并不限定于以下的实施方式中的例示。以下说明中的术语及表述并不受后述的实施例的具体例限定。
细胞黏附物的培育方法,
本公开的实施方式的培养物的制造方法可以包括:
S1:准备黏附载体0.1~0.5ml;
S2:拉出黏附检测装置的推注杆,放入黏附载体;
S3:制备细胞悬液,细胞悬液包括黏附细胞及培养基;
S4:利用黏附检测装置取0.1ml细胞悬液,经倒置、轻微震荡、排除气泡步骤,黏附细胞与黏附载体接触,黏附细胞黏附在黏附载体表面,初步形成细胞黏附物,等待细胞黏附物下沉;
S5:绑定多组黏附检测装置,将推注杆朝向细胞培养底部放入细胞培养瓶中,而后将细胞培养瓶垂直放入细胞培养箱孵育1~24小时。
该培养方法运用黏附检测装置,便于吸取培养基,便于定量,能够最大程度上减少杂质混入,运用该培养方法培养的细胞黏附物,更便于后续细胞检测处理。
在以下说明中,细胞黏附物是指含有黏附细胞和黏附载体,且黏附细胞黏附于黏附载体表面的材料。细胞悬液是指含有黏附细胞的液体。
黏附细胞可以是能够黏附在黏附载体表面,且在黏附载体表面状态下能够促进细胞生长的细胞,黏附细胞可以与与水性介质一起构成细胞悬液,作为构成细胞悬液的水性介质,可以为培养基、生理盐水、磷酸缓冲液等。
细胞优选为源自动物的细胞,更优选为源自哺乳动物的细胞。作为哺乳动物,可列举例如:人、猴子、黑猩猩、牛、猪、马、绵羊、山羊、兔、大鼠、小鼠、豚鼠、狗、猫等。细胞来源的组织没有特别限定,例如可以是皮肤、肝脏、肾脏、肌肉、骨、血管、血液、神经组织等。细胞可以是原代培养细胞、培养细胞株、重组培养细胞株等。
作为干细胞,例如可举出间充质干细胞、造血干细胞、神经干细胞、骨髓干细胞、生殖干细胞、牙髓干细胞等成体干细胞等,优选为间充质干细胞。间充质干细胞广义上是指存在于个体的各种组织中,能够分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等间充质细胞中的全部或几种的成体干细胞。作为间充质干细胞,可列举源自骨髓的间充质干细胞、源自脐带的间充质干细胞、源自脂肪组织的间充质干细胞等。
作为干细胞,例如可以使用人工多能干细胞(iPS细胞)、胚胎干细胞(ES细胞)、胚胎生殖干细胞(EG细胞)、多能生殖干细胞(mGS细胞)、胚胎癌细胞(EC细胞)、Muse细胞等多能干细胞。
作为细胞,例如可以是内皮细胞、表皮细胞、上皮细胞、心肌细胞、成肌细胞、神经细胞、骨细胞、成骨细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、肝细胞、肾细胞、胰细胞、肾上腺细胞、牙周膜细胞、牙龈细胞、骨膜细胞、皮肤细胞、树突状细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等分化后的细胞;处于从干细胞向这些分化后的细胞的前阶段的前体细胞等。
上述细胞可以单独使用1种或组合使用2种以上。
黏附载体主要起黏附、支撑作用,黏附载体能够在表面黏附细胞,能够形成黏附细胞和黏附载体的组合,优选为多孔结构,更优选为骨粉颗粒。
用于培养黏附细胞的培养基优选含有无机盐、氨基酸、糖和水。培养基可以进一步含有血清、维生素、激素、抗生素、生长因子、黏附因子等任意成分。作为培养基,可以使用作为细胞培养用的基础培养基而已知的培养基。即,作为培养基,只要是已知用于培养所选择的细胞的培养基,就可以没有特别限制地使用。
作为培养基,并不限定于此,例如可举出DMEM(Dulbecco’s改良Eagle培养基)、MEM(Eagle最小必需培养基)、αMEM培养基(Eagle最小必需培养基α改良型)、GMEM(Glasgow最小必需培养基)、IMDM(Iscove's改良Dulbecco’s培养基)、Ham’s F12(营养混合物F-12ham)、RPMI-1640(RPMI-1640培养基)、McCoy’s 5A(McCoy’s 5A培养基)、MSC生长培养基2型(Promocell公司)、Prime XV XSFM(Irvine Scientific公司)等。它们可以单独使用或组合2种以上使用。
培养基中可以根据需要添加添加剂。作为添加剂,可列举例如:维生素A、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、维生素C、维生素D等维生素;叶酸等辅酶;甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、异亮氨酸、亮氨酸等氨基酸;乳酸等作为碳源的糖或有机酸;EGF、FGF、PFGF、TGF-β等生长因子;IL-1、IL-6等白细胞介素;TNF-α、TNF-β、瘦素等细胞因子;转铁蛋白等金属转运蛋白;铁离子、硒离子、锌离子等金属离子;β-巯基乙醇、谷胱甘肽等SH试剂;白蛋白等蛋白质等。
细胞培养方法没有特别限定,使用适合于各细胞的方法即可。细胞培养的温度为细胞悬液的温度,例如可以为20~45℃、或30~40℃的范围内,优选为36~37℃。细胞培养的pH为细胞悬液的pH,例如可以在6.2~7.7的范围内,优选为7.4。细胞培养的CO2浓度为细胞悬液的CO2浓度,例如可以为1~20体积%的范围内、4~10体积%、优选为5~7体积%,在培养哺乳动物来源细胞的情况下,通常使用37℃的温度、5%(v/v)的二氧化碳浓度。
细胞检测方法,
用以检测权利要求1的细胞黏附物,本公开的实施方式的细胞检测方法可以包括:
推动推注杆,将置于黏附检测装置中的培养完成的细胞黏附物排除含有细胞悬浮液的培养基;
重新吸取不含细胞的培养基进行润洗涤,重复3次;
将细胞黏附物从黏附检测装置中取出,置于孔板中收获培养完成的细胞黏附物;
经过培养基润洗涤后,进行1mg/ml MTT孵育2小时,按照MTT实验方法洗脱,收获上清液测量OD570,以反映细胞黏附数量。
根据该细胞检测方法,能够将黏附于黏附载体的表面的黏附细胞高效地从黏附载体分离,防止现有技术运用孔板方法,颗粒在孔板中被吸走,或细胞黏附在孔板上,本公开细胞检测方法便于后续检测处理,以增加检测准确性。
本公开的细胞检测方法可以包括改性处理步骤。
本公开的润洗涤处理可以使用PBS缓冲液清洗。
本公开的一个实施方式的细胞黏附物取出方式为,拔出推注杆,从黏附检测装置下方取出。
本公开的另一实施方式的细胞黏附物取出方式为,分离黏附检测装置上部,推动推注杆,从黏附检测装置上方取出。
更优选的实施方式是分离黏附检测装置上部,推动推注杆,从黏附检测装置上方取出,该方式不会对黏附细胞施加额外的力,能够保证细胞的存活率。
细胞黏附检测装置,
如图1所示,本公开的实施方式的细胞黏附检测装置可以包括:
空管,空管上部具有乳头结构;
推注杆,推注杆底部设有推注柄,推注杆设于空管内部;
胶塞,胶塞与推注杆连接,并与空管接触,使空管内部形成密闭结构。
本公开的细胞黏附检测装置方便液体吸排,方便定量,且能有效隔绝杂菌污染,应用该黏附检测装置可以实现细胞检测、细胞黏附物的培育。
本公开的细胞黏附检测装置的一个实施方式为,空管具有分离式结构,便于上方提取。
细胞组合物,
本公开的实施方式的细胞组合物含有黏附细胞。
在此,细胞组合物只要是将黏附细胞与黏附载体一起培养后与黏附载体分离而得到的组合物即可。
实施例
(1)细胞黏附物培育
准备骨粉0.1ml;拉出黏附检测装置的推注杆,放入骨粉;
制备细胞悬液,采用MC3T3-E1小鼠前成骨细胞和aMEM培养基;
如图3所示,利用黏附检测装置取0.1ml上述制备的细胞悬液,经倒置、轻微震荡、排除气泡步骤,使MC3T3-E1小鼠前成骨细胞与骨粉充分接触,MC3T3-E1小鼠前成骨细胞黏附在骨粉表面,初步形成MC3T3-E1小鼠前成骨细胞细胞黏附物,等待上述细胞黏附物下沉;
如图2所示,绑定多组上述黏附检测装置,将推注杆朝向细胞培养瓶底部放入细胞培养瓶中,而后将上述细胞培养瓶垂直放入细胞培养箱孵育24小时。
(2)细胞检测
将置于黏附检测装置中的培养完成的上述细胞黏附物,推动推注杆,排除含有细胞悬浮液的培养基;
重新吸取不含细胞的aMEM培养基进行润洗涤,重复3次;
分离黏附检测装置上部,推动推注杆,从黏附检测装置上方将上述细胞黏附物从黏附检测装置中取出,在孔板中收获培养完成的细胞黏附物:
经过培养基润洗涤后,进行1mg/ml MTT孵育2小时,按照MTT实验方法洗脱,收获上清液测量OD570,以反映细胞黏附数量。
比较例1
(1)细胞黏附物培育
直接培养:称量取0.1ml骨粉于孔板中,直接加入上述细胞悬液培养,经震荡、排除气泡步骤,放入细胞培养箱孵育24小时。
(2)细胞检测
吸取含有细胞悬浮液的培养基;
重新吸取不含细胞的aMEM培养基进行润洗涤,重复3次;
将细胞黏附物转移到新的孔板;
经过培养基润洗涤后,进行1mg/ml MTT孵育2小时,按照MTT实验方法洗脱,收获上清液测量OD570,以反映细胞黏附数量。
MTT方法:
先将细胞黏附物转移到48孔板中,再用无血清培养基润洗非黏附的细胞。吸弃上清液,加入1mg/ml MTT应用液,300ul/孔。孵育两小时,去除MTT孵育液,加入300ul异丙醇,洗脱摇匀30min。取100ul于96孔板在酶标仪中检测波长:OD570。
比较例2
将骨粉颗粒不加入上述细胞,与实施例1同等实验条件,进行MTT实验。
[表1]
通过上述数据可知,通过比较例1即现有培养方法对于细胞检测,由于细胞更容易黏附在孔板上等问题,极大的影响了检测结果,导致检测结果OD值过高,采用本申请的实施方式才能准确显示细胞结果。
如图4所示,采用MC3T3-E1小鼠前成骨细胞为黏附细胞模型,分别采用传统方法(直接培养:称量取0.1ml骨粉于孔板中,直接加入细胞悬液)和本实施例方法进行实验,采用MTT指示剂显示细胞活力(数量)。
实施例:从图4-A中可以看出细胞(蓝色即为活细胞)均匀地黏附在颗粒上;
比较例1:比较例1采用传统培养方法,图4-B颗粒显示不均匀斑点,为孔板底部细胞在润洗涤过程中浮起来导致;图4-D为40X下细胞和颗粒状态,大部分细胞黏附在孔板中。
比较例2:图4-C为颗粒上没有细胞,但是也同样孵育了MTT检测试剂,结果表明,没有活细胞颗粒不会显示颜色。
本实施例中的颗粒上附着有活细胞。传统方法颗粒上也有细胞,但是大部分细胞在孔板上。本实施例实验采用MTT试剂显示细胞活性,具有组间可比性和良好的操作性。采用本发明专利提供的方法只显示被测颗粒上黏附的细胞活性,彻底杜绝孔板中非特异性黏附的细胞干扰,并且可操作性好,方便得到黏附有细胞的颗粒物。
以上所述,仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到其各种变化或替换,这些都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此,本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种细胞黏附物的培育方法,其包括:
S1:准备黏附载体0.1~0.5ml;
S2:拉出黏附检测装置的推注杆,放入所述黏附载体;
S3:制备细胞悬液,所述细胞悬液包括黏附细胞及培养基;
S4:利用所述黏附检测装置取0.1ml所述细胞悬液,经倒置、轻微震荡、排除气泡步骤,所述黏附细胞与所述黏附载体接触,所述黏附细胞黏附在所述黏附载体表面,初步形成细胞黏附物,等待所述细胞黏附物下沉;
S5:绑定多组所述黏附检测装置,将推注杆朝向细胞培养瓶盖部放入细胞培养瓶中,而后将所述细胞培养瓶放入细胞培养箱孵育1~24小时。
2.根据权利要求1所述的细胞黏附物的培育方法,其中,
所述黏附载体为多孔物质。
3.根据权利要求2所述的细胞黏附物的培育方法,其中,
所述黏附载体为骨粉颗粒。
4.一种细胞检测方法,用以检测权利要求1所述的细胞黏附物,其包括:
推动所述推注杆,将置于所述黏附检测装置中的培养完成的所述细胞黏附物排除含有细胞悬浮液的培养基;
重新吸取不含细胞的培养基进行润洗涤,重复3次;
将所述细胞黏附物从所述黏附检测装置中取出,置于孔板中收获培养完成的所述细胞黏附物;
经过培养基润洗涤后,进行1mg/ml MTT孵育2小时,按照MTT实验方法洗脱,收获上清液测量OD570,以反映细胞黏附数量。
5.根据权利要求4所述的细胞检测方法,其中,
所述润洗涤步骤包括改性处理。
6.根据权利要求4所述的细胞检测方法,其中,
所述细胞黏附物取出方式为,拔出所述推注杆,从所述黏附检测装置下方取出。
7.根据权利要求4所述的细胞检测方法,其中,
所述细胞黏附物取出方式为,分离所述黏附检测装置上部,推动所述推注杆,从所述黏附检测装置上方取出。
8.一种细胞黏附检测装置,应用于权利要求1~7所述的任一种方法,其包括,
空管,所述空管上部具有乳头结构;
推注杆,所述推注杆底部设有推注柄,所述推注杆设于空管内部;
胶塞,所述胶塞与所述推注杆连接,并与所述空管接触,使所述空管内部形成密闭结构。
9.根据权利要求8所述的细胞黏附检测装置,其中,
所述空管具有分离式结构。
10.一种细胞组合物,其含有黏附细胞。
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