KR102292132B1 - 무혈청 배지 조성물 - Google Patents

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Abstract

세포 배양용 무혈청 배지 조성물 및 상기 조성물에서 세포를 배양하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 세포 배양용 무혈청 배지 조성물을 이용하는 경우, 혈청을 포함하는 고가의 세포 배양용 배지를 대체하여 경제적이면서도, 기존의 혈청을 포함할 때 발생할 수 있는 감염 등의 부작용을 감소시킬 수 있고, 기존의 혈청을 포함하는 세포 배양용 배지와 유사한 세포 증식율을 나타낸다.

Description

무혈청 배지 조성물{Serum-free medium composition}
세포 배양용 무혈청 배지 조성물 및 이를 이용하여 세포를 배양하는 방법에 관한 것이다.
줄기세포를 이용한 임상시험은 전 세계적으로 600개 이상이 clinicaltrial.gov의 임상시험 (clinical trial)에 등록되어 있고, 주입 부위에 따라 차이는 있지만 임상적으로 적용되는 치료적 효능을 보이는 세포의 수는 약 1 내지 5 억 개로, 반복적인 계대를 통해 생산되고 있다. 이러한 대량의 세포를 확보하기 위해, 배양 시 사용되고 있는 동물 유래 혈청, 예를 들면, 우태아혈청 (Fetal bovine serum: FBS)은 박테리아, 바이러스, 마이코플라즈마와 같은 미생물학적 감염성의 위험에 노출되고, 이러한 물질이 세포 내 잔류하는 경우, 확인되지 않은 감염 물질로서 작용하여 임상으로 적용할 경우에 문제를 일으킬 가능성이 높다. 동물 유래 혈청은 세포의 부착 및 생장에 중요한 역할을 하나, 세포 분리 단계에서 이종개체군 (heterogenous population)을 함께 증식시켜 줄기세포의 순도 (purity)를 낮추며, 랏 간의 편차 (lot-to-lot variation)를 증가시키고, 증식능을 저하시키며, 분화능을 감소시킨다. 또한, 항원 반응 (antigenic response)을 높임으로써 세포의 생존능 (viability), 안전성 (safety) 및 치료적 효능 (therapeutic efficacy)에 영향을 준다.
따라서 동물 유래 혈청을 배제한 무혈청 배지를 개발함으로써 배양 안전성을 확보하는 것이 중요하다고 할 수 있다.
일 양상은 세포 배양용 무혈청 배지 조성물을 제공한다.
다른 양상은 상기 배지 조성물에서 세포를 배양하는 방법을 제공한다.
일 양상은 세포 배양용 무혈청 배지 조성물을 제공한다.
용어 "세포 배양 (cell culture)"이란 조절된 조건 하에서 인공적으로 체외에서 살아있는 세포를 키우는 과정을 의미한다. 또한, 개체 조직의 일부분을 무균적으로 떼어내 효소로 세포간 연결 물질을 분해하여 유리시킨 현탁액을 병이나 페트리 접시와 같은 배양 접시의 편평한 밑부분에 도말하여 세포를 성장 및 증식시키는 것일 수 있다.
용어 "배지 (culture media)"는 인 비트로 (in vitro)에서 줄기세포를 비롯한 세포의 성장 및 생존을 지지할 수 있게 하는 물질을 의미한다.
상기 조성물은 인슐린 (Insulin), 트랜스페린 (Transferrin), 셀레늄 (Selenium), 혈소판 유래 증식 인자-AB (Platelet-derived growth factor-AB subunit : PDGF-AB), 인간 혈청 알부민 (human serum albumin: HAS), 지질, 섬유아세포 성장 인자 (Fibroblast Growth Factor: FGF), 표피세포 성장 인자 (Epidermal Growth Factor: EGF), 전환 성장 인자 베타-1 (Transforming growth factor beta-1: TGFbeta-1), 헤파린 (heparin), 리소포스파티드산 (Lysophosphatidic acid), 인간 과립구 매크로파지 콜로니 자극 인자 (human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor: hGM-CSF), 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 12 (chemokine (C-X-C motif) ligand 12: CXCL12) 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다.
상기 인슐린 (Insulin)은 당과 아미노산의 세포 내로의 섭취를 촉진하여 세포를 증식시키는 역할을 하는 호르몬이며, 소마토메딘C (somatomedin C)와 연계하여 세포 증식을 촉진시킬 수 있다. 상기 트랜스페린 (Transferrin)은 세포로 철을 이동시키는 역할을 하는 단백질이며, 배지에 있는 유리산소 (Oxygen radical)와 과산화물 (peroxides)을 해독시킬 수 있다. 상기 셀레늄 (Selenium)은 셀레늄 의존적인 효소들이 지방의 과산화를 감소시키도록 하는 물질로서 세포막을 보호해주는 역할을 가진다. 상기 셀레늄은 셀레늄 자체 또는 셀레늄 염의 형태, 예를 들면 유기 및 무기 형태인 것일 수 있다. 상기 셀레늄 염의 유기 형태는 아미노산 L(+)-셀레노메티오닌, L(+)-메틸셀레노시스테인 또는 L(+)-셀레노시스테인 것일 수 있다. 상기 셀레늄 염의 무기 형태는 소듐 셀레나이트, 칼슘 셀레나이트, 또는 칼륨 셀레나이트인 것일 수 있다. 상기 인슐린, 트랜스페린 및 셀레늄은 배지 중에 약 0.05% 내지 약 20%, 또는 약 0.1% 내지 약 10%로 포함되는 것일 수 있다. 여기서, %는 v/v%를 의미한다.
상기 혈소판 유래 증식 인자-AB (Platelet-derived growth factor-AB subunit : PDGF-AB)는 세포 성장 및 분열을 조절하는 성장 인자이며, 배지 중에 약 0.5ng/ml 내지 약 200ng/㎖ 또는 약 1ng/㎖ 내지 약 100ng/㎖로 포함되는 것일 수 있다. 상기 인간 혈청 알부민 (Human serum albumin: HAS)은 인간 혈장에 다량으로 존재하고, 호르몬, 지방산 등의 화합물을 운반하고, pH 및 삼투압을 조절하는 단백질이며, 배지 중에 약 0.0125% 내지 약 5.0% 또는 약 0.025% 내지 약 2.5%로 포함되는 것일 수 있다. 여기서, %는 v/v%를 의미한다. 상기 지질 (lipid)은 세포의 성장과 유지에 있어 조절하는 역할을 하며, 포화지방산, 불포화지방산 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다. 상기 지질은 배지 중에 약 0.005% 내지 약 2% 또는 약 0.01% 내지 약 1%로 포함되는 것일 수 있다. 여기서, %는 v/v%를 의미한다. 상기 섬유아세포 성장 인자 (Fibroblast Growth Factor: FGF)는 세포가 성장하고 증식하기 위한 신호를 제공하여, 증식을 위한 신호전달 (signal transduction) 과정을 유도한다. 상기 섬유아세포 성장 인자는 섬유아세포 성장 인자-4 (Fibroblast Growth Factor-4: FGF-4), 섬유아세포 성장 인자-2 (Fibroblast Growth Factor-2: FGF-2), 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다.
상기 섬유아세포 성장 인자-4 (Fibroblast Growth Factor-4: FGF-4)는 배지 중에 약 0.25 ng/㎖ 내지 약 100ng/㎖ 또는 약 0.5 ng/ml 내지 약 50ng/ml로 포함되는 것일 수 있다. 상기 섬유아세포 성장 인자-2 (Fibroblast Growth Factor-2: FGF-2)는 배지 중에 약 0.25 ng/㎖ 내지 약 100ng/㎖ 또는 약 0.5 ng/㎖ 내지 약 50ng/㎖로 포함되는 것일 수 있다. 상기 표피세포 성장 인자 (Epidermal Growth Factor: EGF)는 수용체인 EGFR에 결합하여 증식 및 분화를 자극하며, 배지 중에 약 0.5ng/㎖ 내지 약 200ng/㎖ 또는 약 1ng/㎖ 내지 약 100ng/㎖로 포함되는 것일 수 있다. 상기 전환 성장 인자 베타-1 (Transforming growth factor beta-1: TGFbeta-1)는 세포 성장, 세포 증식, 세포 분화 및 세포 사멸을 조절하며, 배지 중에 약 0.25 ng/㎖ 내지 약 100ng/㎖ 또는 약 0.5 ng/㎖ 내지 약 50ng/㎖로 포함되는 것일 수 있다.
상기 헤파린 (heparin)은 섬유아세포 성장 인자가 결합하여 세포증식을 돕는 역할을 하며, 배지 중에 약 0.05㎍/㎖ 내지 20㎍/㎖ 또는 약 0.1㎍/㎖ 내지 10㎍/㎖로 포함되는 것일 수 있다.
상기 리소포스파티드산 (Lysophosphatidic acid)은 신호 분자로 작용하는 포스포리피드 유도체의 일종이며, 미토겐 (mitogen)으로 작용할 수 있고, 배지 중에 약 0.1ng/㎖ 내지 40ng/㎖ 또는 약 0.2ng/㎖ 내지 20ng/㎖로 포함되는 것일 수 있다. 상기 인간 과립구 매크로파지 콜로니 자극 인자 (human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor: hGM-CSF)는 대식세포, T 세포, 비만 세포, 자연 살해 세포 등에서 분비되는 사이토카인으로 전구세포의 분화성숙을 촉진하는 역할을 하며 배지 중에 약 0.05 ng/㎖ 내지 약 20ng/㎖ 또는 약 0.1 ng/㎖ 내지 약 10ng/㎖로 포함되는 것일 수 있다. 상기 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 12 (chemokine (C-X-C motif) ligand 12: CXCL12)은, 스트로마 세포 유래 인자 (stromal cell-derived factor 1: SDF1)와 혼용되며, B 전구세포의 증식을 촉진하는 케모카인이고, 배지 중에 약 1ng/㎖ 내지 약 400ng/㎖ 또는 약 2ng/㎖ 내지 약 200ng/㎖로 포함되는 것일 수 있다.
상기 성분을 포함하는 경우, 세포 배양시에 안전성을 확보하면서도, 증식능 및 순도가 높으므로, 동물 유래 혈청을 대체할 수 있다. 상기 동물 유래 혈청은 인간은 제외한 개체 유래의 혈청을 의미한다.
상기 배지 조성물은 세포 배양에 이용될 수 있는 것이라면, 특별히 제한되는 것은 아니며, 예를 들면, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM/F12, α-MEM (α-Minimal Essential Medium), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A 배지, AmnioMax complete 배지, AminoMax ±complete 배지, EBM (Endothelial Basal Medium) 배지, Chang's Medium, MesenCult-XF, DMEM/HG (Dulbecco's Modified Eagle's Medium high glucose)배지, 및 MCDB+DMEM/LG (MCDB +Dulbecco's Modified Eagle's Medium low glucose) 배지로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
상기 세포는 미분화 세포, 분화 중인 세포, 또는 분화가 완료된 세포인 것일 수 있다. 상기 세포는 줄기세포인 것일 수 있다.
용어 "줄기세포"는 분화능 (potency) 및 자기재생 (self-renewal)능을 갖는 세포를 의미한다. 줄기세포는 분화 능력에 따라 전분화능 (pluripotency), 다분화능 (multipotency) 또는 단일분화능 (unipotency)로 나누어진다. 상기 줄기세포는 배아줄기세포 (embryonic stem cell: ESC) (착상 전 배아의 내세포), 성체줄기세포 (adult stem cell) (각 조직 및 장기에 존재하는 미분화된 세포) 및 역분화 줄기세포 (induced pluripotent stem cell: iPSC) (체세포에 유전자 및/또는 단백질을 삽입하여 역분화가 유도된 세포, 또는 유도만능 줄기세포)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것일 수 있다.
상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포인 것일 수 있다. 용어 "중간엽 줄기세포 (Mesenchymal sterm cell: MSC)"는 성체 줄기세포로서, 다분화능과 자기재생능을 갖고, 증식능이 우수하고 유전적으로 안정화되어 있다. 상기 중간엽 줄기세포는 지방, 연골, 뼈, 골수간질, 근육, 신경 등을 만드는데 원조가 되는 세포이며, 다양한 세포 예를 들면, 지방세포, 연골세포, 피부세포 및 골세포 등으로 분화할 수 있다.
상기 줄기세포는 분화능과 자기재생능을 갖는 것이라면, 그 종류 및 유래가 제한되지 아니한다. 상기 줄기세포는, 예를 들면, 포유동물, 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 마우스 또는 토끼 등으로부터 유래한 것일 수 있다. 상기 줄기세포는 분리된 탯줄, 태반, 지방, 골수, 제대혈 또는 양수로부터 유래한 것일 수 있다. 용어 "분리된"은 자연적으로 발생하는 세포 또는 조직의 환경과는 다른 환경에 존재하는 것을 의미한다. 탯줄, 태반, 지방, 골수, 제대혈 또는 양수를 분리하는 것 및 이로부터 줄기세포를 수득하는 것은 통상의 해부학적 방법 및 공지된 방법으로 수행되는 것 일수 있다.
상기 배양은 성장 및 증식인 것일 수 있다.
용어 "성장 (growth) 및 증식 (proliferation)"이란, 세포 수의 증가를 의미한다. 상기 배양은 미분화 증식인 것일 수 있다. 상기 미분화 증식 (undifferentiated proliferation)은 줄기세포가 특정 세포로 분화되지 않은 채 원래의 세포와 동일한 성질을 가지는 즉, 분화능 (potency) 및 자기재생 (self-renewal)능을 가지는 세포로 증식하는 것을 의미한다. 용어 "분화 (differentiation)"는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화되는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 의미한다. 특정 세포 유형으로의 분화 정도를 측정 또는 판단하는 것은 당해 분야에 익히 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 또한, 상기 분화는, 유세포 분석 또는 면역세포화학과 같은 기법을 사용하여 세포 표면 표지 (예를 들면, 조직-특이적 또는 세포-표지 특이적 항체로 세포를 염색함) 및 세포 형태의 변화 (예를 들면, 핵 비율/세포질 비율)를 측정하면서, 광학 현미경 또는 공초점 현미경을 사용하여 세포 형태를 조사함으로써, 또는 중합효소 연쇄 반응 (polymerase chain reaction: PCR) 및 유전자-발현 프로파일과 같은 당해 분야에 익히 공지된 기법을 사용하여 유전자 발현상의 변화를 측정함으로써 확인될 수 있다.
다른 양상은 상기 배지 조성물에서 세포를 배양하는 방법을 제공한다.
상기 배양은 성장 및 증식인 것일 수 있다.
상기 배양하는 방법은 계대 배양을 포함하는 것일 수 있다.
용어, "계대 배양"이란, 세포 증식 방법의 하나로, 세포를 보존하고 세포의 대를 이어가기 위해 수일마다 주기적으로 새로운 배지에 이식시키는 것을 의미한다. "계대 (passage)"는 배양 용기에서 초기 종배양부터 동일한 배양 용기에 세포가 왕성하게 자라는 시기 (confluence)까지의 줄기세포의 성장 및 증식인 것일 수 있다. 세포를 배양하는 방법 및 계대 배양 방법은 통상의 배양 방법 및 공지된 방법으로 수행되는 것 일수 있다.
상기 세포는 줄기세포인 것일 수 있다. 상기 줄기세포는 배아줄기세포, 중간엽 줄기세포, 또는 역분화 줄기세포인 것일 수 있다. 배양할 수 있는 세포에 대하여는 전술한 바와 동일한다.
상기 배지 조성물을 이용하여 세포를 배양하는 방법에 따르면, 동물 유래 혈청을 포함하는 배지를 사용하지 않는 경우에도, 줄기세포 고유의 특성을 유지하는 줄기세포를 대량으로 증식 및 성장시켜 수득할 수 있다.
본 발명의 세포 배양용 무혈청 배지 조성물을 이용하는 경우, 혈청을 포함하는 고가의 세포 배양용 배지를 대체하여 경제적이면서도, 기존의 혈청을 포함할 때 발생할 수 있는 감염 등의 부작용을 감소시킬 수 있다. 뿐만 아니라, 기존의 혈청을 포함하는 세포 배양용 배지와 유사한 세포 증식율 및 유전자 발현율을 나타낸다.
도 1은 기본 배지에 따른 줄기세포의 증식율을 나타낸다. 즉, 6종의 기본 배지를 포함하는 세포 배양용 배지에서 줄기세포의 증식율을 측정한 결과를 나타낸다.
도 2는 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지 및 본 발명의 배지에서 줄기세포를 배양한 후, 줄기세포의 형상 및 증식된 정도를 나타낸다.
도 3은 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지 및 본 발명의 배지에서 줄기세포를 배양한 후, 줄기세포의 크기를 나타낸다.
도 4는 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지, 통상의 무혈청 배지 및 본 발명의 배지에서 줄기세포를 배양한 후, 줄기세포의 증식율을 나타낸다.
도 5는 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지, 및 본 발명의 배지에서 줄기세포를 배양한 후, 줄기세포의 표면 항원 특성을 나타낸 결과이다.
도 6a는 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지 및 본 발명의 배지에서 줄기세포를 배양한 후, 줄기세포의 유전자의 발현 특성을 플롯 시그널로 나타낸 결과이다.
도 6b는 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지 및 본 발명의 배지에서 줄기세포를 배양한 후, 줄기세포의 유전자의 발현 특성을 막대 그래프로 나타낸 결과이다.
도 7은 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지 및 본 발명의 배지에서 줄기세포를 배양한 후, 줄기세포의 계대별 유전자 발현을 분석하여 Identity-by-state (IBS) 값으로 나타낸 결과이다.
도 8은 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지 및 본 발명의 배지에서 줄기세포를 배양한 후, 줄기세포에서 분비된 분비 단백질을 비교한 결과이다.
도 9는 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지 및 본 발명의 배지에서 줄기세포를 배양한 후, 줄기세포에서 분비된 칼슘염을 Alizarin Red S로 염색한 결과이다.
도 10은 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지 및 본 발명의 배지에서 줄기세포를 배양한 후, 줄기세포를 Oil Red O로 염색한 결과이다.
도 11은 Oil Red O로 염색된 줄기세포를 이소프로필 알코올로 탈색한 후, 지방분화율을 정량적으로 평가한 그래프이다.
도 12는 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지 및 본 발명의 배지에서 줄기세포를 배양한 후, 줄기세포를 Alcian blue로 염색한 결과이다.
도 13a는 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지 및 본 발명의 배지에서 배양한 줄기세포를 배양한 후, 줄기세포에서 TNFAIP6 유전자의 발현 양상을 확인한 그래프이다.
도 13b는 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지 및 본 발명의 배지에서 배양한 줄기세포를 배양한 후, 줄기세포에서 PTGS2 유전자의 발현 양상을 확인한 그래프이다.
도 13c는 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지 및 본 발명의 배지에서 배양한 줄기세포를 배양한 후, 줄기세포에서 IDO1 유전자의 발현 양상을 확인한 그래프이다.
도 13d는 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지 및 본 발명의 배지에서 배양한 줄기세포를 배양한 후, 마우스에 주입하여 TNF-a의 발현 양상을 확인한 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 무혈청 세포 배양 배지 조성물 제조 및 상기 배지 조성물에서 배양된 줄기세포의 형상, 크기, 증식, 표현 항원 특성 확인
1. 탯줄 유래 줄기세포 분리 및 배양
정상적으로 분만한 건강한 산모로부터 사전에 충분한 설명에 근거한 동의(informed consent)를 받고, 정상 태반 분만시에 수집된 태반으로부터 탯줄을 분리하였다. 분리된 탯줄 각각을 Ca/Mg를 함유하지 않는 (free) 둘베코스 인산염 완충 식염수 (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline: DPBS)로 2 내지 5회 세척하여 혈액을 제거하였다. 이후, 탯줄에서 동맥과 정맥을 제거한 뒤 1 내지 5 mm 정도 크기로 탯줄을 잘라내었다. 이후, 상기 탯줄을 배양 용기에 부착하여 10 내지 15일 배양을 하였고, 상기 배양된 조직에서 세포가 뻗어나오는 것을 확인한 후, 5 내지 6시간 동안 200 U/㎖의 콜라게나아제 I을 가하여 탯줄 유래 줄기세포를 각각 분리하였다. 분리된 탯줄 유래 줄기세포는 37
Figure 112021040757718-pat00001
, 95%의 공기 및 5%의 CO2의 조건의 배양기에서 배양하였다.
2. 무혈청 세포 배양 배지 조성물 제조
(2.1) 혈청 대체 물질 선정
줄기세포의 증식, 생존, 기능 등에 영향을 미칠 것으로 예상되는 인자를 발굴하고, 다양한 조성 및 조성비를 갖는 세포 배양 배지 조성물을 제작하였다. 이에 따라, 다양한 세포 배양 배지 조성물에 Lot 번호를 부여하고 (CHA-SFM-000), 그 중에서 기본 배지, 인슐린 (Insulin), 트랜스페린 (Transferrin), 셀레늄 (Selenium), 혈소판 유래 증식 인자-AB (Platelet-derived growth factor-AB subunit : PDGF-AB), 인간 혈청 알부민 (human serum albumin: HAS), 지질, 섬유아세포 성장 인자 4 (Fibroblast Growth Factor 4: FGF4), 섬유아세포 성장 인자 2 (Fibroblast Growth Factor 2: FGF2), 표피세포 성장 인자 (Epidermal Growth Factor: EGF), 전환 성장 인자 베타-1 (Transforming growth factor beta-1: TGFbeta-1), 헤파린 (heparin), 리소포스파티드산 (Lysophosphatidic acid), 인간 과립구 매크로파지 콜로니 자극 인자 (human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor: hGM-CSF), 및 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 12 (chemokine (C-X-C motif) ligand 12: CXCL12)를 포함하는 CHA-SFM-035 Lot을 선정하였다.
(2.2) 기본 배지 선정
기본 배지 (Basal media)를 선정하기 위해, 총 6종의 배지 (MCDB+DMEM/LG, EBM, DMEM/F12, IMDM, DMEM/HG, 및 MEM alpha)를 이용하여, 최적화된 배지를 선정하였다.
상기 (2.1)의 CHA-SFM-035 Lot에서 기본 배지로, 6종의 기본 배지 각각 첨가하여, 6종의 세포 배양용 배지를 제작하였다. 상기 6종의 세포 배양용 배지에서 1에 배양된 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 약 72 시간 배양한 후, 세포 계수 키트(Cell Counting Kit-8: CCK-8) 분석으로 줄기세포의 세포 증식율을 측정하였다.
도 1은 기본 배지에 따른 줄기세포의 증식율을 나타낸다. 즉, 6종의 기본 배지를 포함하는 세포 배양용 배지에서 줄기세포의 증식율을 측정한 결과를 나타낸다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 줄기세포를, DMEM/F12를 포함하는 세포 배양용 배지에서 배양하는 경우, 다른 기본 배지를 포함하는 세포 배양용 배지에서 배양하는 경우에 비하여, 증식율이 약 25% 내지 약 400% 증가하였다. 따라서, (2.1)의 기본 배지로 DMEM/F12를 선정하였다.
3. 1의 배지 조성물에서 배양된 줄기세포의 형상, 크기, 증식, 표현 항원 특성 확인
(3.1) 1의 배지 조성물에서 배양한 후, 줄기세포의 형상 (morphology) 및 증식된 정도 (cell density) 분석
실험군은 (2.1)에서 기본 배지로 DMEM/F12를 포함하는 세포 배양용 배지 (CHA-SFM-035)에서, 1에서 수득한 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 4 내지 7 계대까지 배양한 것을 사용하였다. 양성 대조군은 10%의 우태아혈청 (Fetal Bovine Serum: FBS)과 25 ng/ml의 FGF4, 2 ug/ml의 헤파린(heparin)이 함유된 α-MEM배지 (이하, CCM)에서, 1에서 수득한 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 4 내지 7 계대까지 배양한 것을 사용하였다. 이 때, 배양은 줄기세포를 피브로넥틴이 코팅된 플레이트에 분주하고, 성장 및 증식시킨 후, 트립신을 가하여 세포 부유액을 회수하여 수행하였다. 계대 배양 후, 실험군 및 양성 대조군에서, 줄기세포의 형상 및 증식된 정도를 확인하였다.
도 2는 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지 및 본 발명의 배지에서 줄기세포를 배양한 후, 줄기세포의 형상 및 증식된 정도를 나타낸다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 실험군에서 줄기세포의 형상은 방추사 (spindle) 형상을 유지하였고, 이는 동물 유래 혈청을 포함하는 세포 배양용 배지(CCM)에서 배양된 줄기세포와 동일 또는 유사한 형상이었다. 또한, 증식된 정도는 실험군 및 양성 대조군이 유사하였다. 본 발명의 세포 배양용 배지는 동물 유래 혈청을 포함하는 세포 배양용 배지와 유사한 정도의 세포 증식력을 갖는 것임을 알 수 있다.
(3.2) 1의 배지 조성물에서 배양한 후, 줄기세포의 크기 (size) 분석
실험군은 CHA-SFM-035에서, 1에서 수득한 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 4 내지 7 계대까지 배양한 것을 사용하였다. 양성 대조군은 CCM에서, 1에서 수득한 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 4 내지 7 계대까지 배양한 것을 사용하였다. 실험군 및 양성 대조군에서, 수득한 세포의 크기를 LUNA 분석으로 확인하였다.
도 3은 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지 및 본 발명의 배지에서 줄기세포를 배양한 후, 줄기세포의 크기를 나타낸다. 도 3에서 나타낸 바와 같이, 배양된 줄기세포의 크기는 약 15 내지 17㎛로, 실험군 및 양성 대조군에서 줄기세포의 크기는 유사하였다. 본 발명의 세포 배양용 배지 조건에서 세포를 배양한 경우, 세포의 크기가 유의하게 줄어들거나 커지지 않고 유지되는 것을 알 수 있다.
(3.3) 1의 배지 조성물에서 배양한 후, 줄기세포의 증식능 분석
실험군은 CHA-SFM-035에서, 1에서 수득한 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 약 72시간 동안 배양한 것을 사용하였다. 양성 대조군은 CCM에서, 1에서 수득한 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 약 72시간 동안 배양한 것을 사용하였다. 음성 대조군은 시판용 무혈청 배지(통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지)에서, 1에서 수득한 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 약 72시간 동안 배양한 것을 사용하였다. 배양, 약 24시간, 약 48시간, 및 약 72시간 후에, 세포 계수 키트(Cell Counting Kit-8: CCK-8) 분석으로 줄기세포의 세포 증식율을 측정하였다.
도 4는 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지, 통상의 무혈청 배지 및 본 발명의 배지에서 줄기세포를 배양한 후, 줄기세포의 증식율을 나타낸다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 시판용 무혈청 배지에서 줄기세포를 배양한 경우, CCM에서 줄기세포를 배양한 경우에 비하여, 63%의 증식율을 나타내었다. 또한, 본 발명의 배지인 CHA-SFM-035에서 줄기세포를 배양한 경우, 시판용 무혈청 배지에서 줄기세포를 배양한 경우에 비하여 약 27% 향상된 증식율을 나타내었으며, 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지에서 배양한 경우에 비하여 약 90%의 증식율을 나타내었다. 본 발명의 세포 배양용 배지는 혈청을 함유하는 배지와 유사한 수준의 증식력을 갖는 것을 알 수 있다.
(3.4) 1의 배지 조성물에서 배양한 후, 줄기세포의 표면 항원 특성 분석
배지가 (2.1)의 조성을 포함함에 따라, CHA-SFM-035에서 배양한 후 줄기세포의 특성이 변화하는지 확인하기 위해 유세포 분석을 수행하였다. 세포를 둘베코스 인산염 완충 식염수 (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline: DPBS)를 사용하여 세척하고, 2%의 FBS가 함유된 DPBS에 담아 CD44, CD73, CD105, CD45, CD34, CD31, CD29, CD49 및 CD90 항체와 약 20분간 반응시켰다. 이후, 유세포 분석기 (FACS Calibur, Becton Bickinson)를 통해 표면 항원 특성을 분석하였다.
도 5는 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지, 및 본 발명의 배지에서 줄기세포를 배양한 후, 줄기세포의 표면 항원 특성을 나타낸 결과이다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 배지인 CHA-SFM-035에서 줄기세포를 배양한 경우와 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양한 경우는 모두 세포에서 CD44, CD73, CD105, CD29, CD49 및 CD90의 발현 수준이 높고 (양성, positive), CD45, CD34, CD31 및 HLA-DR의 발현 수준이 낮았으며 (음성, negative), 발현 수준 또한 유사하였다. 본 발명의 세포 배양용 배지는 줄기세포의 표면 항원 특성을 변화시키지 않는 것을 알 수 있다.
4. 1의 배지 조성물에서 배양된 줄기세포의 유전자, 사이토카인 발현 확인
(4.1) 1의 배지 조성물에서 배양한 후, 줄기세포의 유전자 발현 특성 확인
실험군은 (2.1)에서 기본 배지로 DMEM/F12를 포함하는 세포 배양용 배지(CHA-SFM-035)에서, 1에서 수득한 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 4 내지 7 계대까지 배양한 것을 사용하였다. 양성 대조군은 혈청포함배지(CCM)에서 배양한 세포를 사용하였다. 실험군 및 양성 대조군에서, 동등한 유전자를 발현하는지 평가하기 위해 Affymetrix Human Gene 2.0 ST Array 시험법을 통해 다수의 유전자의 발현양상을 동시에 확인하였다. 실험군 및 양성 대조군의 계대 7인 세포에서 총 RNA를 추출해 cDNA로 합성하여 발현 차이의 여부를 확인하였다.
도 6은 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지 및 본 발명의 배지에서 배양한 줄기세포에서 유전자의 발현 동등성을 비교한 결과이다. 도 6a에 나타난 바와 같이, 실험군과 양성 대조군의 유전자 발현 수준의 플롯 시그널(plot signal)이 1에 가까운 것을 확인하였다. 또한, 6b에 나타난 바와 같이, 실험군과 양성 대조군의 플롯 시그널이 유사하게 나온 것을 확인하였다. 즉, 본 발명의 세포 배양용 배지는 혈청 배지와 동등한 세포 유전자 발현 수준을 나타냄을 알 수 있다.
(4.2) 1의 배지 조성물에서 배양한 후, 줄기세포의 계대별 유전자 발현 특성 확인
배지가 (2.1)의 조성을 포함함에 따라, CHA-SFM-035에서 배양한 줄기세포의 계대별 변이가 발생하지 않고 DNA가 동일하게 유지되는지 여부를 약 70만개의 SNP를 포함하고 있는 Infinium　Global Screening Array-24 v1.0 시험법을 통해 확인하였다. 실험군은 (2.1)에서 기본 배지로 DMEM/F12를 포함하는 세포 배양용 배지(CHA-SFM-035)에서, 1에서 수득한 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 4 내지 7 계대까지 배양한 것을 사용하였다. 양성 대조군은 혈청포함배지(CCM)에서 배양한 세포를 사용하였다.
도 7은 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지 및 본 발명의 배지에서 배양한 줄기세포의 계대별 유전자 발현을 분석하여 Identity-by-state (IBS) 값으로 나타낸 결과이다. 실험군 및 양성 대조군의 DNA를 추출하여 비교 분석한 결과, 총 70만 여개의 SNP 중 50여 개에서만 유전자의 차이를 보였다. 즉, 양성 대조군 대비 실험군의 DNA가 약 0.007%의 비율로 변이가 발생하며, 계대 시 양성 대조군 대비 실험군의 DNA는 변이가 거의 발생되지 않는 것을 확인하였다. 또한, 실험군 및 양성 대조군의 Identity-by-state (IBS) 값을 계산하여 나타낸 플롯(plot)으로 유사성을 확인하였다. 즉, 본 발명의 세포 배양용 배지는 줄기세포의 계대 시 혈청 배지와 동등한 세포 안정성을 나타냄을 알 수 있다.
(4.3) 1의 배지 조성물에서 배양한 후, 줄기세포의 사이토카인 발현 확인
실험군은 (2.1)에서 기본 배지로 DMEM/F12를 포함하는 세포 배양용 배지(CHA-SFM-035)에서, 1에서 수득한 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 4 내지 7 계대까지 배양한 것을 사용하였다. 양성 대조군은 혈청포함배지(CCM)에서 배양한 세포를 사용하였다. 실험군 및 양성 대조군에서, 동등한 사이토카인을 분비하는지 평가하기 위해, Human L-507 array 시험법을 통해 조건배지(conditioned media) 내 다수의 사이토카인의 양상을 동시에 확인하였다. 실험군 및 양성 대조군의 계대 7인 세포의 조건 배지에서 507개의 사이토카인의 차이 여부를 확인하였다.
도 8은 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지 및 본 발명의 배지에서 배양한 줄기세포에서 분비된 분비단백질을 비교한 결과이다. 도 8에 나타난 바와 같이, 실험군 및 양성 대조군에서 사이토카인의 scatter plot이 1에 가까운 것을 확인하였다. 또한, 이미지 분석에서도 실험군 및 양성 대조군의 사이토카인 발현 양상이 유사한 것을 확인하였다. 즉, 본 발명의 세포 배양용 배지는 혈청 배지와 동등한 사이토카인 발현 수준을 나타냄을 알 수 있다.
5. 1의 배지 조성물에서 배양된 줄기세포의 다분화능 특성 확인
(5.1) 1의 배지 조성물에서 배양한 후, 줄기세포의 골분화능 확인
배지가 (2.1)의 조성을 포함함에 따라, CHA-SFM-035에서 계대 배양한 줄기세포의 골분화 잠재력의 변화 여부를 확인하였다. (2.1)에서 기본 배지로 DMEM/F12를 포함하는 세포 배양용 배지(CHA-SFM-035)에서, 1에서 수득한 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 계대 4 내지 6까지 배양하였다. 이후, 계대 6의 세포를 시판용 골분화유도배지로 옮겨 추가로 3주 동안 배양한 세포를 실험군으로 사용하였다. 대조군은 혈청포함배지(CCM)에서 배양한 계대 6 세포를 시판용 골분화유도배지로 옮겨 추가로 3주 동안 배양한 것을 사용하였다.다.
도 9는 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지 및 본 발명의 배지에서 배양한 줄기세포에서 분비된 칼슘염을 Alizarin Red S로 염색한 결과이다. 도 9에 나타난 바와 같이, 세포 배양용 배지(CHA-SFM-035) 및 혈청포함배지(CCM)에서 배양한 세포는 염색이 되지 않았으나, 실험군 및 대조군에서는 세포의 골분화시 생성되는 칼슘염과 반응하여 적색으로 염색이 됨을 확인하였다. 즉, 본 발명의 세포 배양용 배지는 줄기세포의 계대 배양 시 혈청 배지와 동일한 골분화능을 가짐을 알 수 있다.
(5.2) 1의 배지 조성물에서 배양한 후, 줄기세포의 지방분화능 확인
배지가 (2.1)의 조성을 포함함에 따라, CHA-SFM-035에서 계대 배양한 줄기세포의 지방분화 잠재력의 변화 여부를 확인하였다. (2.1)에서 기본 배지로 DMEM/F12를 포함하는 세포 배양용 배지(CHA-SFM-035)에서, 에서, 1에서 수득한 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 계대 4 내지 6까지 배양하였다. 이후, 계대 6의 세포를 시판용 지방분화유도배지로 옮겨 추가로 3주 동안 배양한 세포를 실험군으로 사용하였다. 대조군은 CCM에서 배양한 계대 6 세포를 시판용 지방분화유도배지로 옮겨 추가로 3주 동안 배양한 것을 사용하였다.
도 10은 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지 및 본 발명의 배지에서 배양한 줄기세포를 Oil Red O로 염색한 결과이다. 도 10에 나타난 바와 같이, 세포 배양용 배지(CHA-SFM-035) 및 혈청포함배지(CCM)에서 배양한 세포는 염색이 되지 않았으나, 실험군 및 대조군에서는 세포의 지방분화시 생성되는 중성지방, 지방산 및 콜레스테롤에스테르가 적색으로 염색되는 것을 확인하였다. 또한, 인지질 및 세레브로시드(cerebroside)는 연한분홍색으로 염색되는 것을 확인하였다. 도 11은 Oil Red O로 염색된 줄기세포를 이소프로필 알코올로 탈색한 후, 지방분화율을 정량적으로 평가한 그래프이다. 도 11에 나타난 바와 같이, 세포 배양용 배지(CHA-SFM-035) 및 혈청포함배지(CCM)에서 배양한 세포와 비교하여 실험군 및 대조군에서 Fold change 각 1.71과 1.78로 유사한 수치를 나타냄을 확인할 수 있다. 즉, 본 발명의 세포 배양용 배지는 줄기세포의 계대 배양 시 혈청 배지와 동일한 지방분화능을 가짐을 알 수 있다.
(5.3) 1의 배지 조성물에서 배양한 후, 줄기세포의 연골분화능 확인
배지가 (2.1)의 조성을 포함함에 따라, CHA-SFM-035에서 계대 배양한 줄기세포의 연골분화 잠재력의 변화 여부를 확인하였다. (2.1)에서 기본 배지로 DMEM/F12를 포함하는 세포 배양용 배지(CHA-SFM-035)에서, 1에서 수득한 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 계대 4 내지 6까지 배양하였다. 이후, 계대 6의 세포를 시판용 연골분화유도배지로 옮겨 추가로 3주 동안 배양한 세포를 실험군으로 사용하였다. 대조군은 혈청포함배지(CCM)에서 배양한 계대 6 세포를 시판용 골분화유도배지로 옮겨 추가로 3주 동안 배양한 것을 사용하였다. 도 12는 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지 및 본 발명의 배지에서 배양한 줄기세포를 Alcian blue로 염색한 결과이다. 도 12에 나타난 바와 같이, 전체적으로 유사한 양상을 나타냈으나 배양용 배지(CHA-SFM-035) 및 혈청포함배지(CCM)에서 배양한 세포와 비교하여 실험군 및 대조군의 세포크기가 큰 것을 확인하였다. 또한, 핵(Red 염색)의 모양이 길어지고 얇아지는 것을 확인할 수 있었다. 이는, 배양용 배지(CHA-SFM-035) 및 혈청포함배지(CCM)에서 배양한 세포와 비교하여 실험군 및 대조군에서 연골 분화가 더 이루어지는 것을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 세포 배양용 배지는 줄기세포의 계대 배양 시 혈청 배지와 동일한 연골분화능을 가짐을 알 수 있다.
실시예 6. 면역자극 조건에서의 염증 인자 발현율 확인
(6.1) in vitro 분석
배지가 (2.1)의 조성을 포함함에 따라, CHA-SFM-035에서 계대 배양한 줄기세포의 염증 인자인 TNFAIP6, PTGS2, IDO1의 유전자 발현 여부를 확인하였다. 실험군은 (2.1)에서 기본 배지로 DMEM/F12를 포함하는 세포 배양용 배지(CHA-SFM-035)에서, 1에서 수득한 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 4 내지 7 계대까지 배양한 것을 사용하였다. 양성 대조군은 혈청포함배지(CCM)에서 배양한 세포를 사용하였다. 먼저, TNF-a를 이용해 세포의 계대 별로 면역조절(Immunomodulation)을 시킨 후 정량적 중합효소연쇄반응(quantitative Polymerase Chain Reaction, qPCR)을 수행하였다.
도 13a~13c는 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지 및 본 발명의 배지에서 배양한 줄기세포에서 염증 인자의 발현 양상을 확인한 그래프이다. 도 13a 내지 13c에 나타난 바와 같이, 양성 대조군과 비교하여 실험군에서 TNFAIP6, PTGS2, IDO1 유전자의 발현이 비슷하거나 유의하게 상승하는 것을 확인하였다. 특히, 계대 5에서 현저하게 상승하는 것을 확인할 수 있다. 즉, 본 발명의 세포 배양용 배지는 줄기세포의 계대 배양 시 유전자가 동등함을 알 수 있다.
(6.2) in vivo 분석
배지가 (2.1)의 조성을 포함함에 따라, CHA-SFM-035에서 계대 배양한 줄기세포의 In vivo 상에서의 면역조절을 확인하였다. 실험군은 (2.1)에서 기본 배지로 DMEM/F12를 포함하는 세포 배양용 배지(CHA-SFM-035)에서, 1에서 수득한 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 4 내지 7 계대까지 배양한 것을 사용하였다. 음성 대조군은 PBS, 양성 대조군은 혈청포함배지(CCM)에서 배양한 세포를 사용하였다. 먼저, 복막염 마우스 모델(zymosan induced peritonitis mouse model)을 이용하여 자이모산(zymosan)으로 복강내 염증을 유발하였다. 이후, 실험군, 음성대조군 및 양성대조군 세포를 주입하였다. 4시간 후 복막 삼출액(peritoneal exudates)을 추출하여 ELISA 시험을 진행하였다.
도 13d는 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지 및 본 발명의 배지에서 배양한 줄기세포를 배양한 후, 마우스에 주입하여 TNF-a의 발현 양상을 확인한 그래프이다. 도 13d에 나타난 바와 같이, 실험군을 주입한 마우스의 경우 mTNF-a 의 발현이 감소하는 것을 확인하였다. 즉, 본 발명의 세포 배양용 배지에서 계대 배양한 세포는 혈청포함배지와 비교하여 동등하거나 향상된 mTNF-a의 발현을 나타내는 바 세포 유전자의 항-염증 효과가 있음을 알 수 있다.

Claims (6)

  1. 인슐린 (Insulin), 트랜스페린 (Transferrin), 셀레늄 (Selenium), 혈소판 유래 증식 인자-AB (Platelet-derived growth factor-AB subunit : PDGF-AB), 인간 혈청 알부민 (human serum albumin: HAS), 지질, 섬유아세포 성장 인자 (Fibroblast Growth Factor: FGF), 표피세포 성장 인자 (Epidermal Growth Factor: EGF), 전환 성장 인자 베타-1 (Transforming growth factor beta-1: TGFbeta-1), 헤파린 (heparin), 리소포스파티드산 (Lysophosphatidic acid), 인간 과립구 매크로파지 콜로니 자극 인자 (human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor: hGM-CSF), 및 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 12 (chemokine (C-X-C motif) ligand 12: CXCL12); 및 DMEM/F12을 포함하는 중간엽줄기세포 배양용 무혈청 배지 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 섬유아세포 성장 인자는 섬유아세포 성장 인자-4 (Fibroblast Growth Factor-4: FGF-4), 섬유아세포 성장 인자-2 (Fibroblast Growth Factor-2: FGF-2), 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 배양은 성장 및 증식인 것인 조성물.
  4. 인슐린 (Insulin), 트랜스페린 (Transferrin), 셀레늄 (Selenium), 혈소판 유래 증식 인자-AB (Platelet-derived growth factor-AB subunit : PDGF-AB), 인간 혈청 알부민 (human serum albumin: HAS), 지질, 섬유아세포 성장 인자 (Fibroblast Growth Factor: FGF), 표피세포 성장 인자 (Epidermal Growth Factor: EGF), 전환 성장 인자 베타-1 (Transforming growth factor beta-1: TGFbeta-1), 헤파린 (heparin), 리소포스파티드산 (Lysophosphatidic acid), 인간 과립구 매크로파지 콜로니 자극 인자 (human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor: hGM-CSF), 및 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 12 (chemokine (C-X-C motif) ligand 12: CXCL12); 및 DMEM/F12을 포함하는 무혈청 배지 조성물에서 탯줄 유래 중간엽줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 중간엽줄기세포의 배양 방법.
  5. 인슐린 (Insulin), 트랜스페린 (Transferrin), 셀레늄 (Selenium), 혈소판 유래 증식 인자-AB (Platelet-derived growth factor-AB subunit : PDGF-AB), 인간 혈청 알부민 (human serum albumin: HAS), 지질, 섬유아세포 성장 인자 4 (Fibroblast Growth Factor 4: FGF4), 섬유아세포 성장 인자 2 (Fibroblast Growth Factor 2: FGF2), 표피세포 성장 인자 (Epidermal Growth Factor: EGF), 전환 성장 인자 베타-1 (Transforming growth factor beta-1: TGFbeta-1), 헤파린 (heparin), 리소포스파티드산 (Lysophosphatidic acid), 인간 과립구 매크로파지 콜로니 자극 인자 (human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor: hGM-CSF), 및 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 12 (chemokine (C-X-C motif) ligand 12: CXCL12); 및,
    MCDB+DMEM/LG, EBM, DMEM/F12, IMDM, DMEM/HG, 및 MEM alpha로부터 선택된 기본 배지에 중간엽줄기세포를 배양하는 단계;
    상기 배지에서 배양된 중간엽줄기세포의 세포 증식율을 측정하는 단계; 및
    배양된 탯줄 유래 중간엽줄기세포의 세포 증식율이 대조군에 비해 증가한 경우 무혈청 배지 조성물에 적합한 기본 배지인 것으로 선택하는 단계를 포함하는 중간엽줄기세포 배양용 무혈청 배지 조성물에 적합한 기본 배지를 선택하는 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 중간엽줄기세포는 탯줄 유래인 것인 방법.
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