KR20180092506A - 이종 동물 혈청이 첨가된 배지 없이 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 배양 및 분화시키는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지를 이용하여 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 배양하는 방법, 및 상기 배양된 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 분화배지를 이용하여 연골세포, 골세포, 또는 지방세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명자들은 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지를 이용하여 배양하였으며, 상기 배양된 중간엽 줄기세포는 원래 중간엽 줄기세포의 특성 및 세포 증식능이 유지되며, 각각 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 연골세포, 골세포, 또는 지방세포로 분화시켰을 때 높은 분화능을 나타내며, 특히 기존의 방법으로 배양하여 이종 항원이 포함된 각 분화배지를 이용해 분화시킨 경우와 비교하여 골세포 및 지방세포로의 분화능이 우수함을 확인하였는바, 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지를 이용하여 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 배양 및 분화시켜 실제 임상에 용이하게 적용하여 연골세포, 골세포, 또는 지방세포 결손 및 기능 부전에 의해 유발되는 다양한 질환의 치료 용도에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

이종 동물 혈청이 첨가된 배지 없이 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 배양 및 분화시키는 방법 {Process for differentiation and cultivation of human nasal inferior turbinate derived mesenchymal stem cell with serum free media}
본 발명은 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지를 이용하여 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 배양하는 방법, 및 상기 배양된 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 분화배지를 이용하여 연골세포, 골세포, 또는 지방세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다.
줄기세포에 대한 연구는 1981년 Evans 등이 처음으로 쥐의 배아 줄기세포주를 확립하는데 성공한 이후, 줄기세포의 무한한 자가재생능과 모든 세포로 분화가 가능한 전능성에 대한 연구가 본격적으로 진행되었다. 이러한 줄기세포는 얻는 과정에 따라 발생초기의 배반포(blstocyst)에서 얻어지는 배아 줄기세포 및 발생과정이 끝난 성인 또는 태반에서 얻어지는 성체 줄기세포로 분류할 수 있다. 배아 줄기세포의 경우는 미분화 상태의 자가 재생능이 뛰어나 증식이 용이한 반면, 사용 및 연구에 있어서 윤리적인 문제를 항상 내포하고 있으며 생체 내에 세포치료를 위해 이식한 경우 미분화 상태의 세포가 증식하는 암(teratoma) 발생 가능성 등이 있어 임상적인 상용화에는 어려움이 있다. 성체 줄기세포인 중간엽 줄기세포(mesenchymal stromal cell)는 생체 외 배양 조건에서 분화가 용이한 반면에 증식이 어려운 단점이 있으나, 성체조직인 골수, 흡입된 지방조직 등 전신 대부분의 조직에서 얻을 수 있으며 생체 내에 이식된 후 장기의 특성에 맞게 분화하는 장기 특이적 분화(site-specific differentiation)와 본래의 세포 특성과 다른 종류의 기관 세포로 교차분화(trans-differentiation) 할 수 있는 다형성 능력(plasticity of stem cells)을 가지고 있는 것으로 밝혀지면서 조직공학과 재생의학의 영역에서 많은 연구가 이루어지고 있다. 최근 보고서에 의하면 줄기세포를 이용한 세포치료제가 개발될 경우 대상 환자의 수는 약 1억 2천만 명에 달할 것으로 추정되고 있으며, 이들의 시장 규모는 최소 연간 3,000억 달러를 넘어설 것으로 예상하고 있다.
이러한 줄기세포를 세포치료제로 활용하기 위해서는 충분한 양으로 증식시키기 위한 배양과정이 필요하며, 이때 상당히 많은 양의 배양액이 사용된다. 현재 소태아 혈청(fetal bovine serum; FBS)은 세포배양 배지에서 세포의 부착, 성장, 및 증식에 필요한 요소들이 대부분 칵테일 형태로 섞여 있어서 대부분의 인간유래 세포의 배양에 일반적으로 필수적인 첨가물로 상용되고 있다. 하지만 세포배양에 있어서 이종 동물의 혈청을 사용하는 것은 향후 세포치료제로의 사용 시에 여러 가지 문제점을 야기할 수 있다. 이론적 그리고 생물학적인 측면에서 혈청 조성은 알부민(albumin), 트랜스페린(transferrin) 등과 같이 주요 성분과 함께 잘 알려져 있지만, 밝혀지지 않은 미지의 성분이 미량 포함되어 있으며 이들이 세포 성장에 상당한 영향을 미칠 수 있으므로 재현성 있는 실험을 진행하기 위해서는 이러한 미지의 미량 성분을 배제할 필요가 있다. 또한, 혈청은 채취 시기와 채취 장소에 따라 성분의 변화가 있을 수 있고 같은 로트(lot)의 혈청을 대량으로 준비하더라도 보관 기관 중에 성분변화가 야기될 수 있다. 같은 로트의 혈청을 미리 준비하지 못한다면 다른 로트의 혈청을 실험에 사용하기 전에 광범위한 검사를 시행하여 이전의 혈청과 비교해야 한다. 이외에도 혈청은 동물에서 채취하므로 동물의 병원성 또는 기타요인에 오염이 될 수 있어서 실험결과에 영향을 미칠 수 있고, 경제적인 측면에서는 매우 고가이며 공급보다 수요가 많아지면 공급 또한 원활하지 못할 수 있다. 더욱이 혈청은 매우 복잡한 산물이므로 세포 배양 후 배양 산물을 이용하고자 할 때 혈청 성분을 제거하기 어려우며 다음 공정 과정이 제한되는 경우가 많다.
상기와 같은 문제점들 때문에 지난 삼십년 전부터 소태아 혈청을 대체하기 위해서 성분이 정확히 알려져 있는 대체 첨가물을 사용하는 이종 항원 및 단백질이 없는 배지 (serum and protein free media)를 이용한 사람 세포의 배양에 대한 연구들이 진행되어 왔고, 최근에는 상품화된 배지를 이용한 연구들이 발표되고 있다(한국 등록특허10-1156745). 이종 항원 및 단백질이 없는 배지를 사용하게 되면 상기와 같은 번거로운 과정을 피할 수 있고 배지 성분이 완전히 밝혀져 있기 때문에 재현성 있는 실험이 가능하며, 배양 후 공정과정에 이용할 때 용이하다. 따라서 이종 항원 및 단백질이 없는 배지를 배양에 사용하게 되면 위와 같은 이종 동물 혈청 사용에 따른 단점을 보완할 수 있다.
상기와 같은 종래의 문제점을 극복하기 위하여, 본 발명자들은 많은 수술 과정 중에 제거되어 폐기되는 사람의 코 안에 존재하는 하비갑개 조직에서 분리한 중간엽 줄기세포를 향후 실제 임상적용의 용이성을 위해 이종 항원 및 단백질이 첨가되지 않은 배지를 이용하여 배양하였으며, 상기 배양된 중간엽 줄기세포는 원래 세포의 특성 및 각각 연골세포, 골세포, 또는 지방세포로의 분화능이 유지 및 향상되는 것을 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 배양방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 연골세포, 골세포, 또는 지방세포로의 분화방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 배양방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지에서 배양하는 단계; 및
(b) 상기 배양된 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 연골 분화배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 연골세포로의 분화방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지에서 배양하는 단계; 및
(b) 상기 배양된 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 골 분화배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 골세포로의 분화방법을 제공한다.
또한, (a) 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지에서 배양하는 단계; 및
(b) 상기 배양된 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 지방 분화배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 지방세포로의 분화방법을 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지에서 배양하는 단계 이전에 인간 유래 성분으로 이루어진 기질로 코팅된 배양플레이트에 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 올리고 슬라이드 글라스로 덮어 부착시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지는 재조합된 PDGF-BB(human platelet-derived growth factor-BB), bFGF(basic fibroblast growth factor), 및 TGF-β1(transforming growth factor-β1)을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 인간 유래 성분으로 이루어진 기질은 CELLstart CTS Attachment substrate 또는 인간 혈장 피브로넥틴(human plasma fibronectin)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 단계 (a) 또는 (b)에서 배양은 1 내지 3주 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 연골 분화배지는 DMEM 배지에 인슐린 성장인자(insulin growth factor-1; IGF-1), 덱사메타손(dexamethasone), 아스코르브산-2 인산(ascorbate-2 phosphate), 인슐린-트랜스페린 아셀렌산나트륨(Insulin-transferrin sodium selenite), 피루브산나트륨(sodium pyrubate), 프롤린(proline), L-글루타민(L-glutaime), 재조합된 PDGF-BB(human platelet-derived growth factor-BB), bFGF(basic fibroblast growth factor), 및 TGF-β1(transforming growth factor-β1)가 포함된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 골 분화배지는 DMEM 배지에 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin), 덱사메타손(dexamethasone), 아스코르브산-2 인산(ascorbate-2 phosphate), 베타-글리세로포스페이트(β-glycerophosphate), 재조합된 PDGF-BB(human platelet-derived growth factor-BB), bFGF(basic fibroblast growth factor), 및 TGF-β1(transforming growth factor-β1)가 포함된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 지방 분화배지는 DMEM 배지에 인슐린(insulin), 인도메타신(indomethacin), 덱사메타손(dexamethasone), 3-이소부틸-1-메틸잔틴(3-isobutyl-1-methylxanthine), 재조합된 PDGF-BB(human platelet-derived growth factor-BB), bFGF(basic fibroblast growth factor), 및 TGF-β1(transforming growth factor-β1)이 포함된 것일 수 있다.
본 발명자들은 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지를 이용하여 배양하였으며, 상기 배양된 중간엽 줄기세포는 원래 중간엽 줄기세포의 형태 및 세포증식능이 유지되고, 각각 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 분화배지를 이용하여 연골세포, 골세포, 또는 지방세포로 분화시켰을 때 높은 분화능을 나타내며, 특히 기존의 방법으로 배양하여 이종 항원이 포함된 각 분화배지를 이용해 분화시킨 경우와 비교하여 골세포 및 지방세포로의 분화능이 우수함을 확인하였는바, 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지를 이용하여 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 배양 및 분화시켜 실제 임상에 용이하게 적용하여 연골세포, 골세포, 또는 지방세포 결손 및 기능 부전에 의해 유발되는 다양한 질환의 치료 용도에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지(serum free cultivation) 또는 기존의 이종 동물 혈청이 포함된 배지(serum containing cultivation)를 이용하여 배양한 후 현미경으로 세포의 형태를 관찰한 결과이다.
도 2는 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지(serum free cultivation) 또는 기존의 이종 동물 혈청이 포함된 배지(serum containing cultivation)를 이용하여 배양한 후 유세포 분석을 통해 세포 표면 표지자(CD14, CD19, CD29, CD34, CD73, CD90 및 HLA-DR)들의 발현수준을 분석한 결과이다.
도 3은 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지(Serum free culture) 또는 기존의 이종 동물 혈청이 포함된 배지(Conventional culture)를 이용하여 7일 동안 배양하면서 세포증식능을 측정하여 비교한 결과이다.
도 4a 및 도 4b는 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지에서 배양한 후 역시 이종 동물 혈청이 없는 연골 분화배지에서 분화시킨 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포(serum free cultivation) 및 기존의 방법으로 배양한 후 이종 항원이 포함된 연골 분화배지에서 분화시킨 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포(serum containing cultivation)를 Toluidine blue-O 염색을 통한 연골 특이적 기질 생성(도 4a) 및 real-time PCR을 통한 연골 분화 관련 유전자(COLI 및 ACAN)의 mRNA 발현수준(도 4b)을 분석하여 연골세포로의 분화능을 비교분석한 결과이다.
도 5a 및 도 5b는 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지에서 배양한 후 역시 이종 동물 혈청이 없는 골 분화배지에서 분화시킨 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포(serum free cultivation) 및 기존의 방법으로 배양한 후 이종 항원이 포함된 골 분화배지에서 분화시킨 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포(serum containing cultivation)를 알칼리성 인산가수분해효소(Akaline phosphatase) 염색을 통한 골 특이적 기질 생성(도 5a) 및 real-time PCR을 통한 골 분화 관련 유전자(OC, Runx2, 및 COLI)의 mRNA 발현수준(도 5b)을 분석하여 골세포로의 분화능을 비교분석한 결과이다.
도 6a 및 도 6b는 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지에서 배양한 후 역시 이종 동물 혈청이 없는 지방 분화배지에서 분화시킨 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포(serum free cultivation) 및 기존의 방법으로 배양한 후 이종 항원이 포함된 지방 분화배지에서 분화시킨 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포(serum containing cultivation)를 Oil-red O 염색을 통한 지방 특이적 소체의 생성(도 6a) 및 real-time PCR을 통한 지방 분화 관련 유전자(PPARG 및 ACSS2)의 mRNA 발현수준(도 6b)을 분석하여 지방세포로의 분화능을 비교분석한 결과이다.
본 발명자들은 사람 하비갑개 조직에서 분리한 중간엽 줄기세포를 향후 실제 임상적용의 용이성을 위해 이종 항원 및 단백질이 첨가되지 않은 배지를 이용하여 배양하였으며, 상기 배양된 중간엽 줄기세포는 원래 세포의 특성 및 각각 연골세포, 골세포, 또는 지방세포로의 분화능이 유지 및 향상되는 것을 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 배양방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "줄기세포(stem cell)"란, 개체를 구성하는 세포나 조직의 근간이 되는 세포로서 그 특징은 반복 분열하여 자가 재생(self-renewal)할 수 있고, 환경에 따라 특정한 기능을 지닌 세포로 분화할 수 있는 다분화 능력을 갖는 세포를 의미한다. 태아의 발생과정 중 모든 조직에서 생겨나며, 성인이 되어서도 골수, 상피조직 등 세포가 활발히 교체되는 일부 조직에서 발견된다. 줄기세포는 분화 가능한 세포의 종류에 따라 수정란이 첫 분열을 시작할 때 형성되는 전능성 줄기세포(totipotent stem cells)와, 이 세포들이 계속 분열해 만들어진 포배 내막에 있는 만능성 줄기세포(pluripotent stem cells), 그리고 성숙한 조직과 기관 속에 존재하는 다능성 줄기세포(multipotent stem cells)로 분류된다. 이때, 다능성 줄기세포는, 이 세포가 포함되어 있는 조직 및 기관에 특이적인 세포로만 분화할 수 있는 세포로써 태아기, 신생아기 및 성체기의 각 조직 및 장기의 성장과 발달은 물론 성체조직의 항상성 유지와 조직 손상 시 재생을 유도하는 기능에 관여하고 있다. 이러한 조직 특이적 다능성 세포들을 총칭하여 성체 줄기세포라고도 한다.
성체 줄기세포로 분류되는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)는 재생의학의 재료로 각광받고 있는 세포로, 골수, 제대혈, 지방조직, 탯줄 등의 조직에서 채취될 수 있으며, 혈액 줄기세포와 달리 지방세포, 골세포, 연골세포, 신경세포, 심근세포 등 다양한 인체 조직을 구성하는 세포로의 분화능을 가진다. 본 발명에서는 사람 하비갑개 조직으로부터 분리한 중간엽 줄기세포를 이용하였다.
본 발명에 있어서, 이종 동물 혈청이란 세포의 배양 및 분화에 이용될 수 있는 인간을 제외한 동물에서 유래한 혈청을 의미하며, 보다 바람직하게는 널리 사용되는 소태아 혈청(fetal bovine serum; FBS) 또는 송아지 태아 혈청(fetal calf serum; FCS)을 포함하나, 보다 넓은 의미로 인간을 제외한 동물 유래 항원 또는 단백질이 포함된 물질을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지는 재조합된 PDGF-BB(human platelet-derived growth factor-BB), bFGF(basic fibroblast growth factor), 및 TGF-β1(transforming growth factor-β1)를 주요 구성성분으로 포함하며, StemPro SFM XenoFree을 이용할 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
상기 배양은 1주 내지 3주 동안 수행될 수 있고, 보다 바람직하게는 2주 내지 3주 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지에서 배양하는 단계 이전에, 인간 유래 성분으로 이루어진 기질로 코팅된 배양플레이트에 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 올리고 슬라이드 글라스로 덮어 부착시키는 단계를 더 포함할 수 있으며, 상기 기질은 CELLstart CTS Attachment substrate 또는 인간 혈장 피브로넥틴(human plasma fibronectin)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 실시예에서는 상기와 같은 본 발명의 배양방법에 따라 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 배양하고, 기존의 방법인 이종 동물 혈청을 첨가한 배지로 배양한 세포와 그 특성을 비교분석하였다.
본 발명의 일실시예에서는, 본 발명에 따른 배양방법에 따라 배양한 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포 및 기존의 방법으로 배양한 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 각각 현미경으로 관찰한 결과 세포가 동일하게 방추형의 섬유모세포의 형태를 갖는 것을 확인하였다(실시예 1 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 두 가지 방법에 따라 배양한 중간엽 줄기세포에 대하여 유세포 분석을 통해 세포 표면의 표지자(CD14, CD19, CD29, CD34, CD73, CD90 및 HLA-DR)의 발현수준을 분석한 결과, 동일하게 조혈모세포 표지자인 CD14, CD19, 및 CD34는 100% 음성을 나타내었고, 중간엽 줄기세포의 표지자인 CD29, CD73, 및 CD90은 거의 100% 양성임을 확인함으로써 본 발명에 따른 배양방법으로 배양한 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포는 원래 세포의 특성이 유지되는 것을 알 수 있었으며, 조직적합성 항원인 HLA에 대해 100% 음성임을 관찰함으로써 인체 적합성에 면역학적 문제점이 없음을 확인하였다(실시예 2 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 상기 두 가지 방법에 따라 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 7일 동안 배양하면서 세포증식능을 측정한 결과 배양 초기에는 증식능이 다소 떨어지나 배양 후기에는 상기 두 가지 방법으로 배양한 세포의 증식능이 유사하게 나타나는 것을 확인하였다(실시예 3 참조).
상기 실시예 결과들을 통해 본 발명에 따른 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지로 배양한 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포는 원래 세포의 특성 및 세포증식능이 유지되는 것을 확인하였으며, 이를 통해 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지를 이용한 배양방법이 이용 가능함을 알 수 있었다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 (a) 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지에서 배양하는 단계; 및
(b) 상기 배양된 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 연골 분화배지에서 배양하는 단계를 포함하는 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 연골세포로의 분화방법을 제공한다.
상기 연골 분화배지는 DMEM 배지에 인슐린 성장인자(insulin growth factor-1; IGF-1), 덱사메타손(dexamethasone), 아스코르브산-2 인산(ascorbate-2 phosphate), 인슐린-트랜스페린 아셀렌산나트륨(Insulin-transferrin sodium selenite), 피루브산나트륨(sodium pyrubate), 프롤린(proline), L-글루타민(L-glutaime), 재조합된 PDGF-BB(human platelet-derived growth factor-BB), bFGF(basic fibroblast growth factor), 및 TGF-β1(transforming growth factor-β1)가 포함된 것일 수 있고, 바람직하게는 StemPro® chondrogenesis Differentiation Kit일 수 있으나, 본 발명에 따른 배양방법으로 배양한 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시킬 수 있는 이종 항원이 포함되지 않은 배지라면 그 종류가 제한되지 않는다.
상기 연골 분화배지는 DMEM 배지에 인슐린 성장인자(insulin growth factor-1; IGF-1), 덱사메타손(dexamethasone), 아스코르브산-2 인산(ascorbate-2 phosphate), 인슐린-트랜스페린 아셀렌산나트륨(Insulin-transferrin sodium selenite), 피루브산나트륨(sodium pyrubate), 프롤린(proline), L-글루타민(L-glutaime), 재조합된 PDGF-BB(human platelet-derived growth factor-BB), bFGF(basic fibroblast growth factor), 및 TGF-β1(transforming growth factor-β1)가 포함된 것일 수 있고, 바람직하게는 StemPro® chondrogenesis Differentiation Kit일 수 있으나, 본 발명에 따른 배양방법으로 배양한 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시킬 수 있는 이종 항원이 포함되지 않은 배지라면 그 종류가 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 (a) 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지에서 배양하는 단계; 및
(b) 상기 배양된 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 골 분화배지에서 배양하는 단계를 포함하는 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 골세포로의 분화방법을 제공한다.
상기 골 분화배지는 DMEM 배지에 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin), 덱사메타손(dexamethasone), 아스코르브산-2 인산(ascorbate-2 phosphate), 베타-글리세로포스페이트(β-glycerophosphate), 재조합된 PDGF-BB(human platelet-derived growth factor-BB), bFGF(basic fibroblast growth factor), 및 TGF-β1(transforming growth factor-β1)가 포함된 것일 수 있고, 바람직하게는 StemPro® osteogenesis Differentiation Kit일 수 있 수 있으나, 본 발명에 따른 배양방법으로 배양한 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 골세포로 분화시킬 수 있는 이종 항원이 포함되지 않은 배지라면 그 종류가 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 (a) 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지에서 배양하는 단계; 및
(b) 상기 배양된 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 지방 분화배지에서 배양하는 단계를 포함하는 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 지방세포로의 분화방법을 제공한다.
상기 지방 분화배지는 DMEM 배지에 인슐린(insulin), 인도메타신(indomethacin), 덱사메타손(dexamethasone), 3-이소부틸-1-메틸잔틴(3-isobutyl-1-methylxanthine), 재조합된 PDGF-BB(human platelet-derived growth factor-BB), bFGF(basic fibroblast growth factor), 및 TGF-β1(transforming growth factor-β1)이 포함된 것일 수 있고, 바람직하게는 StemPro® adipogenesis Differentiation Kit일 수 있으나, 본 발명에 따른 배양방법으로 배양한 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 지방세포로 분화시킬 수 있는 이종 항원이 포함되지 않은 배지라면 그 종류가 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 단계 (a) 이전에 인간 유래 성분으로 이루어진 기질로 코팅된 배양플레이트에 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 올리고 슬라이드 글라스로 덮어 부착시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 단계 (a) 또는 (b)에서 배양은 1 내지 3주 동안 수행될 수 있으며, 보다 바람직하게는 2 내지 3주 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, "분화(differentiation)"란 초기 단계의 상기 줄기세포가 각 조직으로서의 특성을 갖게 되는 과정을 일컫는 것으로서, 본 발명의 목적상 연골세포, 골세포, 또는 지방세포로서의 특성을 지니게 되는 것을 의미한다.
본 발명의 실시예에서는, 본 발명에 따른 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지 또는 기존의 이종 동물 혈청이 첨가된 배지로 배양한 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 대상으로 각각의 연골세포, 골세포, 또는 지방세포로의 분화능을 비교분석하였다.
본 발명의 일실시예에서는, 본 발명에 따른 방법으로 배양한 상기 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 연골 분화배지를 이용하여 분화시키거나, 기존의 방법으로 배양한 상기 중간엽 줄기세포를 이종 항원이 포함된 연골 분화배지를 이용하여 분화시킨 후 Toluidine blue-O 염색을 통해 연골 특이적 기질 생성 정도 및 연골 분화관련 유전자인 type I collagen(COLI)과 aggrecan(ACAN)의 mRNA 발현수준을 비교분석하였다. 그 결과, 기질 생성 정도는 유사하였으며, 상기 유전자들의 발현수준은 본 발명에 따른 방법으로 분화시킨 경우 낮게 측정되었으나 시간 경과에 따른 발현량 증가는 유사하게 나타나 연골 분화가 진행되는 것을 확인하였다(실시예 4 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 연골 분화능 분석과 유사한 방법으로 실험을 진행하는 대신 골 분화를 위해 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 골 분화배지를 이용하여 분화시키거나, 이종 항원이 포함된 골 분화배지를 이용하여 분화시킨 후 알칼리성 인산가수분해효소 염색을 통해 골 특이적 기질 생성 정도 및 골 분화관련 유전자인 osteocalcin(OC), Runt-related transcription factor 2(Runx2), 및 type I collagen(COLI)의 mRNA 발현수준을 비교분석하였다. 그 결과, 골 특이적 기질 생성 정도는 유사한 반면에 본 발명에 따른 방법으로 분화시킨 중간엽 줄기세포의 경우 골 분화관련 유전자들의 발현수준이 유의하게 높게 측정되었으며, 시간 경과에 따른 발현량 증가를 통해 골 분화가 진행되는 것을 확인하였다(실시예 5 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 상기 연골 분화능 분석과 유사한 방법으로 실험을 진행하는 대신 지방 분화를 위해 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 지방 분화배지를 이용하여 분화시키거나, 이종 항원이 포함된 지방 분화배지를 이용하여 분화시킨 후 Oil red O 염색을 통해 지방 특이적 소체 생성 정도 및 지방 분화관련 유전자인 peroxisome proliferator activated receptor r(PPARG) 와 AcylCoA synthetase(ACSS2) mRNA의 발현수준을 비교분석하였다. 그 결과, 지방 특이적 소체의 생성 정도는 유사하게 나타난 반면 본 발명에 따른 방법으로 분화시킨 중간엽 줄기세포의 경우 지방 분화관련 유전자들의 발현수준이 유의하게 높게 측정되었으며, 시간 경과에 따른 발현량 증가를 통해 지방 분화가 진행되는 것을 확인하였다(실시예 6 참조).
상기 실시예 결과들을 통해, 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지에서 배양한 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포는 연골세포, 골세포, 또는 지방세포로의 분화능이 그대로 유지되며, 이종 동물 혈청이 없는 각각의 분화배지를 이용하여 분화시키는 경우 특히 골세포 또는 지방세포로의 분화능이 향상되는 것을 확인하였다.
이에, 본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 본 발명에 따른 방법으로 분화된 연골세포 및 상기 연골세포를 유효성분으로 포함하는 연골 손상질환 치료용 조성물을 제공한다.
상기 연골 손상질환은 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 또는 외상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 방법으로 분화된 골세포 및 상기 골세포를 유효성분으로 포함하는 골 손상질환 또는 골대사성 질환 치료용 조성물을 제공한다.
상기 골 손상질환 또는 골대사성 질환은 골의 파괴 흡수가 과대하여 생리적 병리상태를 초래하는 질환을 의미하며, 바람직하게는 골다공증, 유방암 또는 전립선암 등 종양이 뼈로 전이된 뼈전이암 병소(bone metastatic lesion), 원발성으로 뼈에 생성된 종양, 치주질환, 염증성 치조골 흡수 질환, 염증성 뼈 흡수 질환, 또는 파게트 질병(Paget’s disease)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 방법으로 분화된 지방세포 및 상기 지방세포를 포함하는 피부조직 재생을 위한 지방세포 이식용 조성물을 제공한다.
상기 지방세포 이식은 나이로 인하여 노화된 피부의 주름 개선을 비롯하여, 입술선, 턱선, 이마선의 교정, 코 성형 등에 사용되고 있으며, 화상이나 상처로 인하여 함목된 피부, 암 절제 수술로 상실된 부분 등에도 이식함으로써 결함 부위를 교정하는 수술로 이용되고 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 분리 및 배양
본 연구에 이용한 하비갑개 조직은 하비갑개절제술 시행과정에서 얻어진 것으로써 수술 전 환자의 동의하에 이용하였다. 하비갑개 조직을 채취한 직후 젠타마이신(gentamicin)(국제약품공업, 성남, 대한민국)이 포함된 생리식염수로 3-5회 세척한 후 상기 조직으로부터 섬유모세포를 분리하였다.
사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 분리를 위해 수술과정에서 제거된 하비갑개 조직을 4℃에서 냉장 보관하였고, 상기 조직을 실온에서 항생-항진균 용액(Gibco, Gaithersberg, MD)으로 3회 세척하였다. 이를 다시 중성의 인산완충용액(phosphate buffered saline; PBS)으로 2회 세척한 후 작은 수술용 가위를 이용하여 1 ㎜3 크기로 잘게 절단하였다. 이후 절단한 조직의 배양을 위해, 먼저 100 ㎜ 배양용 접시에 인간 유래 성분만 함유한 기질로써 중간엽 줄기세포의 부착을 도와주는 CELLstart CTS Attachment Substrate(Cat.no. A1014201, Invitrogen) 또는 5 ㎍/cm2의 인간 혈장 피브로넥틴(human plasma fibronectin)을 얇게 씌우고(coating), 상기 방법으로 잘게 절단한 하비갑개 조직을 배양용 접시 위에 놓고 소독된 슬라이드 글라스로 덮어 배양용 접시에 유착시킨 후 재조합된 PDGF-BB(human platelet-derived growth factor-BB), bFGF(basic fibroblast growth factor), 및 TGF-β1(transforming growth factor-β1)를 주요 구성성분으로 포함하는 StemPro SFM XenoFree 배양액(Cat.no. A10675, Invitrogen)에 200 mM L-글루타민(Cat.no. 25030, Invitrogen)을 첨가한 배지를 넣어 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하였다. 2-3주 동안 배양한 후, 슬라이드 글라스를 제거하고 배양액에 부유하는 세포를 세척하여 버린 다음 배양용 접시 바닥에 부착된 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포를 얻었다. 계대배양 시에는 접시에 붙은 세포를 떼어 내기 위해 일반적으로 사용하는 돼지혈청 유래 트립신(trypsin) 대신 동물 유래 성분이 없는 TryplE Select 10X(Gibco, cat.no. A12177-01)을 사용하였고, 3대까지 계대배양하여 본 실험에 이용하였다.
또한, 상기 이종 동물 혈청을 첨가하지 않은 무혈청 배양방법(serum free cultivation)과 더불어 기존의 중간엽 줄기세포의 배양방법인 혈청을 첨가하여 배양하는 방법(serum containing cultivation)도 동시에 진행을 하여 비교분석하였다. 보다 구체적으로, 사람 하비갑개 조직을 상기와 동일한 방법으로 잘게 절단한 후에 100 ㎜ 배양용 접시에 놓고 소독된 슬라이드 글라스로 덮어 배양용 접시에 유착시킨 후 10% 소태아 혈청(fetal bovine serum; FBS)이 포함된 DMEM 배지를 넣어 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하였다. 2-3주간의 배양 후 슬라이드 글라스를 제거하고 배양액에 부유하는 세포를 세척하여 버린 다음, 배양용 접시 바닥에 부착된 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포는 트립신을 사용해서 바닥으로부터 떼어내어 3대까지 계대배양한 세포를 사용하였다. 상기 두 가지 배양 방법을 통해서 얻어진 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포들을 현미경으로 관찰한 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 모두 방추형의 섬유모세포 형태인 것을 확인하였다.
실시예 2. 이종 동물 혈청이 첨가된 배지 없이 배양된 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기 세포의 특성 분석
상기 실시예 1의 이종 동물 혈청이 포함된 배지를 이용하지 않고 분리 및 배양한 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 특성을 분석하기 위하여, 상기 방법으로 3대까지 계대배양한 중간엽 줄기세포를 계수하여 1ⅹ105 cells/㎖로 시험관에 분주하고, 중성의 PBS로 3회 세척하였다. 다음으로 FITC(Fluorescein Isothiocyanate)와 PE(Phycoerythrin)가 접합되어 있는 CD14, CD19, CD29, CD34, CD73, CD90 및 HLA-DR에 대한 1차 항체를 상기 세포에 처리하고 1시간 동안 반응시킨 후, PBS로 다시 3회 세척한 다음 유세포 분석(FACS Caliber, Becton Dickson, San Diego, CA)을 실시하였다.
상기 방법으로 이종 동물 혈청이 첨가된 배지 없이 배양한 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포가 원래의 중간엽 줄기세포의 특성을 갖는지 확인한 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 조혈모세포의 표지자인 CD14, CD19, 및 CD34는 발현되지 않아 거의 100% 음성임을 확인하였고, 중간엽 줄기세포의 표면 표지자인 CD29, CD73, 및 CD90은 거의 100% 양성임을 관찰함으로써 상기 방법으로 배양한 중간엽 줄기세포가 원래의 특성을 갖는 것을 알 수 있었다. 또한, 조직적합성 항원인 HLA(Human leukocyte antigen) 표면 표지자에 대하여 100% 음성을 나타냄을 확인함으로써 인체 적합성에 면역학적 문제점이 없음을 중명할 수 있었다.
또한, 상기와 같은 결과는 기존의 이종 동물 혈청이 첨가된 배지를 이용하여 배양한 중간엽 줄기세포에서의 표지자 발현 분석 결과와 동일한 것임을 확인하였다.
실시예 3. 이종 동물 혈청이 첨가된 배지 없이 배양된 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 세포 증식능 평가
세포를 활용하기 위해서는 배양을 통하여 충분한 양으로 증식되는 것이 중요하며 이와 관련해서 배지의 변화 시에 증식능의 증감을 분석하는 것은 중요하다. 따라서 상기 실시예 1의 방법으로 이종 동물 혈청이 첨가된 배지 없이 배양한 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 성장 곡선을 확인하고자 하였다. 이를 위해, 96-웰 플레이트에 상기 중간엽 줄기세포를 1500 cells/㎖씩 분주하고, 2-3일 간격으로 배양배지를 교환해 주었으며, 세포 증식능 분석을 위해 cell counting kit(CCK)-8(Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan)을 이용하였다. 세포의 배양배지를 제거하고 10 ㎕의 CCK-8 용액을 포함하는 100 ㎕의 배지를 각 웰에 첨가한 후 37℃에서 4시간 동안 배양하였으며, 세포의 생존율은 450 nm에서의 흡광도(optical density values)를 측정하였고, 7일 동안 측정하여 분석하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 초기 배양(4일 이내) 동안에는 이종 동물 혈청이 첨가된 배지 없이 배양한 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 증식능이 기존의 배양 방법하의 세포와 비교하여 유의하게 적었으나, 후기 배양(5일 이후)부터는 통계학적 차이가 없이 유사한 정도의 증식능을 보이는 것을 확인하였다.
실시예 4. 이종 동물 혈청이 첨가된 배지 없이 배양된 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 연골 분화 유도능 분석
상기 실시예 1의 이종 동물 혈청이 첨가된 배지 없이 배양된 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화능을 분석하고자 하였다. 일반적으로 이용되는 연골세포로의 분화용 배지의 제조에는 이종 동물 혈청인 10% FBS가 포함되기 때문에 상기와 같은 혈청이 첨가된 배지를 사용하지 않고 배양한 중간엽 줄기세포의 연골 분화를 위해, 중간엽 줄기세포의 연골형성 경로에 기여하여 연골세포를 생성하도록 하는데 필요한 성분이 있으면서 이종 동물 혈청이 없는 StemPro® chondrogenesis Differentiation Kit(Gibco, cat.no. A1007101)를 사용하여 연골 분화배지를 제조하였다. 상기 연골 분화배지는 10-7 M 덱사메타손(dexamethasone), 50 ㎍/㎖ 아스코르브산(ascorbate), 50 ㎎/㎖ 인슐린-트랜스페린 아셀렌산나트륨(Insulin-transferrin sodium selenite), 100 ㎍/㎖ 피루브산나트륨(sodium pyrubate), 40 ㎍/㎖ 프롤린(proline), 2 mM L-글루타민(L-glutaime)이 포함된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Media, Gibco) 배지에 10% FBS 대신 재조합된 PDGF-BB(human platelet-derived growth factor-BB), bFGF(basic fibroblast growth factor), 및 TGF-β1(transforming growth factor-β1)가 포함된 것을 구성으로 한다.
보다 구체적으로, 12-웰 플레이트에 상기 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 2×104 cells/웰씩 분주하고, 상기 연골 분화배지를 2-3일 간격으로 교체해주었으며, 연골 분화정도를 확인하기 위해 Toluidine blue-O 염색을 통한 조직학적 분석 및 real-time PCR을 실시하였다.
또한, 본 발명에 따른 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화능과 비교분석하기 위하여, 기존의 방법으로 배양한 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화능을 함께 분석하였다. 이를 위해, 10% FBS가 포함된 DMEM 배지에 10-7 M 덱사메타손(dexamethasone), 50 ㎍/㎖ 아스코르브산(ascorbate), 50 ㎎/㎖ 인슐린-트랜스페린 아셀렌산나트륨(Insulin-transferrin sodium selenite), 100 ㎍/㎖ 피루브산나트륨(sodium pyrubate), 40 ㎍/㎖ 프롤린(proline), 2 mM L-글루타민(L-glutaime)을 첨가하여 연골 분화배지를 제조하였고, 상기 방법과 동일하게 12-웰 플레이트에 기존의 방법으로 배양한 중간엽 줄기세포를 2×104 cells/웰 씩 분주한 후 상기 연골 분화배지를 2-3일 간격으로 교체하였으며, 이때 TGF-β1(10ng/㎖, Sigma) 및 IGF-I(10ng/㎖, Sigma)을 첨가해 주었다. 배양 2주 후 동일한 방법으로 연골 분화정도를 분석하였다.
4-1. Toluidine blue-O 염색
상기 두 가지 방법으로 각각 배양 및 분화시킨 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 배양 2주째에 통상적인 조직학적 방법에 따라 10% 포르말린(formalin)으로 고정한 후 파라핀에 포매하였고, 조직을 5㎛ 두께의 절편으로 제작한 다음 Toluidine blue-O 염색을 실시하여 조직샘플을 현미경으로 관찰하였으며, Spot software(Polaroid Digital Microscope Camera Ie v1.25, Polaroid, Waltham, MA)를 사용하여 디지털 영상을 촬영하였다.
그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이, 푸르게 염색된 부분을 통해 연골세포로의 분화 배양을 통해 연골 특이적 기질이 생성된 것을 확인할 수 있는데, 본 발명에 따른 방법으로 배양한 후 역시 이종 동물 혈청이 없는 연골 분화배지에서 분화시킨 중간엽 줄기세포의 경우(serum free cultivation)와 기존의 방법으로 배양한 후 이종 항원이 포함된 연골 분화배지에서 분화시킨 중간엽 줄기세포의 경우(serum containing cultivation) 연골 특이적 기질이 유사한 정도로 생성된 것을 관찰하였다.
4-2. Real-time PCR 분석
상기 두 가지 방법으로 각각 배양 및 분화시킨 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포에 대하여 각각 배양 0일, 7일, 및 14일(2주)째에 RNeasy 미니 키트(QIAGEN, Valencia, CA, USA)를 사용해서 총 RNA를 추출하였고, deoxyribonuclease 1(QIAGEN)을 처리하여 게놈 DNA를 제거한 다음 1 ㎎의 정제 된 RNA는 게놈 DNA를 제거하는 단계(QIAGEN)를 포함하는 iScript reverse transcription kit(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 통해서 첫 번째 가닥과 상보적인 DNA로 역전사되도록 하였다. 상기 방법으로 추출한 RNA를 이용하여 cDNA를 합성한 후 연골 분화정도를 확인할 수 있는 type I collagen(COLI) 과 aggrecan(ACAN) 유전자의 mRNA 발현수준을 배양 0일, 7일, 및 14일째에 TaqMan 유전자 발현 분석법을 이용해 lightcycler 480 PCR system(Roche, Mannheim, Germany)으로 분석하였다. 모든 분석은 유사한 증폭 효율을 보였고 델타 사이클을 사용한 임계 실험 디자인을 상대적으로 정량을 위해서 사용하였다. 반응은 TaqMan probe Master Mix(Roche)를 사용하여 20 ㎖의 부피로 3회 반복수행 하였고, 10 ng의 보완 DNA를 각각의 반응에 이용하였다. GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 유전자의 발현수준을 함께 측정하여 내인성 대조군으로 사용하였으며, 결과는 lightcycler 480 instrument software 1.2(Roche)를 이용하여 분석 하였다.
그 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 방법으로 배양한 후 역시 이종 동물 혈청이 없는 연골 분화배지에서 분화시킨 중간엽 줄기세포의 경우(serum free) 시간이 지남에 따라 연골 분화정도가 증가되는 양상을 보이는 것을 확인하였다. 비록 기존의 방법으로 배양한 후 이종 항원이 포함된 연골 분화배지에서 분화시킨 중간엽 줄기세포의 경우(Conventional)와 비교할 때 통계적으로 상기 유전자들의 mRNA 발현수준이 유의하게 적게 나타났으나, 시간 경과에 따라 증가되는 양상은 유사한 것을 알 수 있었다.
실시예 5. 이종 동물 혈청이 첨가된 배지 없이 배양된 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 골 분화 유도능 분석
상기 실시예 1의 이종 동물 혈청이 첨가된 배지 없이 배양된 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 골세포로의 분화능을 분석하기 위해, 상기 실시예 4와 유사하게 중간엽 줄기세포의 골 형성 경로에 기여하여 골세포를 생성하도록 하는데 필요한 성분이 있으면서 이종 동물 혈청이 없는 StemPro® osteogenesis Differentiation Kit(Gibco, cat.no. A1007201)를 사용하여 골 분화배지를 제조하였다. 상기 골 분화배지는 보다 상세하게 DMEM 배지에 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin), 덱사메타손(dexamethasone), 아스코르브산-2 인산(ascorbate-2 phosphate), 베타-글리세로포스페이트(β-glycerophosphate), 재조합된 PDGF-BB(human platelet-derived growth factor-BB), bFGF(basic fibroblast growth factor), 및 TGF-β1(transforming growth factor-β1)가 포함된 것을 구성으로 하고, 2주 동안의 배양기간 동안 2-3일 간격으로 교체해 주었으며, 배양 후 골 분화정도를 확인하기 위해 알칼리성 인산가수분해효소(Alkaline phosphatase) 염색 및 real-time PCR을 실시하였다.
또한, 본 발명에 따른 중간엽 줄기세포의 골세포로의 분화능과 비교분석하기 위하여, 기존의 방법으로 배양한 중간엽 줄기세포의 골세포로의 분화능을 함께 분석하였다. 이를 위해, FBS가 포함되지 않은 DMEM 배지에 100 U/㎖ 페니실린(penicillin), 100 μg/㎖ 스트렙토마이신(streptomycin), 10-8 M 덱사메타손, 5 mM 베타-글리세포포스페이트(β-glycerophosphate), 및 50 ㎍/㎖ ascorbate-2-phosphate를 첨가하여 골 분화배지를 제조하였다. 이후 기존의 방법으로 배양한 중간엽 줄기세포를 이용해 상기와 동일한 방법으로 골 분화를 유도하고, 상기 골 분화배지를 2-3일 간격으로 교체하였으며 배양 2주 후 골 분화정도를 분석하였다.
5-1. 알칼리성 인산가수분해효소(Akaline phosphatase) 염색
4웰 챔버 슬라이드에 각 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 1×104 ㎖씩 분주하고 2주 동안 각각의 골 분화배지를 이용해 분화를 유도하였다. 배양 2주째에 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 멸균 3차 증류수로 3회 세척한 후 구연산-아세톤-포름알데하이드(citrate-acetone-formaldehyde) 고정액으로 15분 동안 세포를 고정시켰다. 이후 멸균 3차 증류수로 3회 세척하고, alkaline dye 혼합액(Nitrite, FRV-alkaline, Naphthol AS-BI alkaline siolution, Sigma)으로 빛을 차단한 상태에서 상온에서 15분간 염색하고, 멸균 3차 증류수로 다시 3회 세척한 후 도립현미경(inverted microscope)하에서 관찰하였다.
그 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이, 상기 염색법을 통해 골 특이적 기질의 생성여부를 관찰할 수 있는데, 본 발명에 따른 방법으로 배양한 후 역시 이종 동물 혈청이 없는 골 분화배지에서 분화시킨 중간엽 줄기세포의 경우(serum free cultivation)와 기존의 방법으로 배양한 후 이종 항원이 포함된 골 분화배지에서 분화시킨 중간엽 줄기세포의 경우(serum containing cultivation) 골 특이적 기질이 유사한 정도로 생성된 것을 관찰하였다.
5-2. Real-time PCR 분석
12-웰 플레이트에 각 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 2×104 ㎖씩 분주하고 2주 동안 각 골 분화배지를 이용해 분화를 유도하였다. 상기 두 가지 방법에 따라 배양한 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 골 분화 정도를 분석하기 위해, 배양된 세포들을 PBS로 수세하고 Ambion RNAqueous kit를 이용하여 Tri-ZolTMreagent 1 ㎖를 넣어 제조사의 방법에 따라 RNA를 추출하고, 상기 실시예 4-2와 동일한 방법으로 real-time PCR 분석을 실시하여 골 분화와 관련된 osteocalcin(OC), Runt-related transcription factor 2(Runx2), 및 type I collagen(COLI) mRNA의 발현수준을 각각 배양 0일, 7일, 및 14일째에 분석하였다.
그 결과, 도 5b에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 방법으로 배양한 후 역시 이종 동물 혈청이 없는 연골 분화배지에서 분화시킨 중간엽 줄기세포의 경우(serum free) 시간이 지남에 따라 상기 3가지 유전자의 발현이 모두 증가하는 양상을 나타내는 것을 통해 상기 중간엽 줄기세포의 골 분화가 진행되는 것을 확인하였다. 또한, 기존의 방법으로 배양한 후 이종 항원이 포함된 골 분화배지에서 분화시킨 중간엽 줄기세포의 경우(Conventional)에 비하여 시간 경과에 따른 유전자 발현의 증가 양상이 매우 높게 나타났으며, 통계적으로도 유의하게 높게 발현되는 것을 확인하였다.
실시예 6. 이종 동물 혈청이 첨가된 배지 없이 배양된 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 지방 분화 유도능 분석
상기 실시예 1의 이종 동물 혈청이 첨가된 배지 없이 배양된 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 지방세포로의 분화능을 분석하기 위해, 상기 실시예 4와 유사하게 중간엽 줄기세포의 지방형성 경로에 기여하여 지방세포를 생성하도록 하는데 필요한 성분이 있으면서 이종 동물 혈청이 없는 StemPro® adipogenesis Differentiation Kit(Gibco, cat. no. A1007001)를 사용하여 지방 분화배지를 제조하였다. 상기 지방 분화배지는 보다 상세하게 DMEM 배지에 인슐린(insulin), 인도메타신(indomethacin), 덱사메타손(dexamethasone), 3-이소부틸-1-메틸잔틴(3-isobutyl-1-methylxanthine), 재조합된 PDGF-BB(human platelet-derived growth factor-BB), bFGF(basic fibroblast growth factor), 및 TGF-β1(transforming growth factor-β1)이 포함된 구성이며, 2주 동안의 배양기간 동안 2-3일 간격으로 교체해 주었으며, 지방 분화정도를 확인하기 위해 Oil red O 염색 및 real-time PCR을 실시하였다.
또한, 본 발명에 따른 중간엽 줄기세포의 지방세포로의 분화능을 분석하기 위하여, 기존의 방법으로 배양한 중간엽 줄기세포의 골세포로의 분화능을 비교분석하였다. 이를 위해, FBS를 포함하는 α-MEM 배지에 10 ㎍/㎖ 인슐린, 200 μM 인도메타신(indomethacin), 0.1 μM 덱사메타손, 0.5 μM 3-이소부틸-1-메틸잔틴(3-isobutyl-1-methylxanthine)을 첨가하여 지방 분화배지를 제조하였다. 이후 상기와 동일한 방법으로 지방 분화를 유도하고, 상기 지방 분화배지를 2-3일 간격으로 교체하였으며 배양 2주 후 상기와 동일한 방법으로 지방 분화정도를 분석하였다.
6-1. Oil red O 염색
4웰 챔버 슬라이드에 각 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 1×104 ㎖씩 분주하고 2주 동안 각 지방 분화배지를 이용해 분화를 유도하였다. 배양 2주째에 각 웰을 PBS로 1회 세척 후 4% 파라포름알데히드 고정액을 이용해 10분 동안 고정한 후 세척하고 0.16% Oil-red O 용액으로 20분간 염색하여 현미경하에서 관찰하였다.
그 결과, 도 6a에 나타낸 바와 같이, 상기 염색방법을 이용해 세포의 핵 내에서 지방 특이 소체의 생성을 확인할 수 있는데, 본 발명에 따른 방법으로 배양한 후 이종 동물 혈청이 없는 지방 분화배지에서 배양한 중간엽 줄기세포의 경우(serum free cultivation)와 기존의 방법으로 배양한 후 이종 항원이 포함된 지방 분화배지에서 배양한 중간엽 줄기세포의 경우(serum containing cultivation) 지방 특이적 소체가 유사한 정도로 생성된 것으로 관찰되었다.
6-2. Real-time PCR 분석
12-웰 플레이트에 각 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 2×104 ㎖씩 분주하고 2주 동안 각 지방 분화배지를 이용해 분화를 유도하였다. 이후 상기 두 가지 방법에 따라 배양한 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 지방 분화정도를 분석하기 위해, 배양된 세포들을 PBS로 수세하고 Ambion RNAqueous kit를 이용하여 Tri-ZolTMreagent 1 ㎖를 넣어 제조사의 방법에 따라 RNA를 추출하고, 상기 실시예 4-2와 동일한 방법으로 real-time PCR 분석을 실시하여 지방 분화와 관련된 peroxisome proliferator activated receptor r(PPARG) 와 AcylCoA synthetase(ACSS2) mRNA의 발현수준을 각각 배양 0일, 7일, 및 14일째에 분석하였다.
그 결과, 도 6b에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 방법으로 배양한 후 이종 동물 혈청이 없는 지방 분화배지에서 배양한 중간엽 줄기세포의 경우(serum free) 시간이 지남에 따라 상기 3가지 유전자의 발현 모두 증가하는 양상을 나타내는 것을 통해 상기 중간엽 줄기세포의 골 분화가 진행되는 것을 확인하였다. 또한, 기존의 방법에 따라 배양한 후 이종 항원이 포함된 분화배지에서 배양한 중간엽 줄기세포(Conventional)에 비하여 시간 경과에 따른 유전자 발현의 증가 양상이 매우 높게 나타났으며, 통계적으로도 유의하게 높게 발현되는 것을 확인하였다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (23)

  1. 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 배양방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지에서 배양하는 단계 이전에 인간 유래 성분으로 이루어진 기질로 코팅된 배양플레이트에 상기 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 올리고 슬라이드 글라스로 덮어 부착시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 배양방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지는 재조합된 PDGF-BB(human platelet-derived growth factor-BB), bFGF(basic fibroblast growth factor), 및 TGF-β1(transforming growth factor-β1)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 배양방법.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 인간 유래 성분으로 이루어진 기질은 CELLstart CTS Attachment substrate 또는 인간 혈장 피브로넥틴(human plasma fibronectin)인 것을 특징으로 하는, 배양방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 배양은 1 내지 3주 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 배양방법.
  6. (a) 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지에서 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 배양된 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 연골 분화배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 연골세포로의 분화방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 단계 (a) 이전에 인간 유래 성분으로 이루어진 기질로 코팅된 배양플레이트에 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 올리고 슬라이드 글라스로 덮어 부착시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 분화방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지는 재조합된 PDGF-BB(human platelet-derived growth factor-BB), bFGF(basic fibroblast growth factor), 및 TGF-β1(transforming growth factor-β1)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 분화방법.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 단계 (b)의 연골 분화배지는 재조합된 PDGF-BB(human platelet-derived growth factor-BB), bFGF(basic fibroblast growth factor), 및 TGF-β1(transforming growth factor-β1)이 포함된 것을 특징으로 하는, 분화방법.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 인간 유래 성분으로 이루어진 기질은 CELLstart CTS Attachment substrate 또는 인간 혈장 피브로넥틴(human plasma fibronectin)인 것을 특징으로 하는, 분화방법.
  11. 제6항에 있어서,
    상기 단계 (a) 또는 (b)에서 배양은 1 내지 3주 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 분화방법.
  12. (a) 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지에서 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 배양된 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 골 분화배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 골세포로의 분화방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 단계 (a) 이전에 인간 유래 성분으로 이루어진 기질로 코팅된 배양플레이트에 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 올리고 슬라이드 글라스로 덮어 부착시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 분화방법.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지는 재조합된 PDGF-BB(human platelet-derived growth factor-BB), bFGF(basic fibroblast growth factor), 및 TGF-β1(transforming growth factor-β1)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 분화방법.
  15. 제12항에 있어서,
    상기 단계 (b)의 골 분화배지는 재조합된 PDGF-BB(human platelet-derived growth factor-BB), bFGF(basic fibroblast growth factor), 및 TGF-β1(transforming growth factor-β1)이 포함된 것을 특징으로 하는, 분화방법.
  16. 제13항에 있어서,
    상기 인간 유래 성분으로 이루어진 기질은 CELLstart CTS Attachment substrate 또는 인간 혈장 피브로넥틴(human plasma fibronectin)인 것을 특징으로 하는, 분화방법.
  17. 제12항에 있어서,
    상기 단계 (a) 또는 (b)에서 배양은 1 내지 3주 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 분화방법.
  18. (a) 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지에서 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 배양된 중간엽 줄기세포를 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 지방 분화배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 지방세포로의 분화방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 단계 (a) 이전에 인간 유래 성분으로 이루어진 기질로 코팅된 배양플레이트에 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 올리고 슬라이드 글라스로 덮어 부착시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 분화방법.
  20. 제18항에 있어서,
    상기 이종 동물 혈청이 첨가되지 않은 배지는 재조합된 PDGF-BB(human platelet-derived growth factor-BB), bFGF(basic fibroblast growth factor), 및 TGF-β1(transforming growth factor-β1)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 분화방법.
  21. 제18항에 있어서,
    상기 단계 (b)의 지방 분화배지는 재조합된 PDGF-BB(human platelet-derived growth factor-BB), bFGF(basic fibroblast growth factor), 및 TGF-β1(transforming growth factor-β1)이 포함된 것을 특징으로 하는, 분화방법.
  22. 제19항에 있어서,
    상기 인간 유래 성분으로 이루어진 기질은 CELLstart CTS Attachment substrate 또는 인간 혈장 피브로넥틴(human plasma fibronectin)인 것을 특징으로 하는, 분화방법.
  23. 제18항에 있어서,
    상기 단계 (a) 또는 (b)에서 배양은 1 내지 3주 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 분화방법.
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