KR20140016841A - 태아연골조직유래 줄기세포원 및 이를 포함하는 세포치료제 - Google Patents

태아연골조직유래 줄기세포원 및 이를 포함하는 세포치료제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 태아연골조직 유래 줄기세포원 및 이를 포함하는 세포치료제에 관한 것으로서, 기존에 알려진 배아줄기세포보다 윤리적 제한이 적고 분화조절이 용이하며, 성체줄기세포 보다는 증식력이나 분화능이 뛰어난 태아조직유래의 세포를 이용한 줄기세포원의 개발에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 태아연골조직에서 분리된 세포는 SSEA-4와 같은 배아줄기세포 특이 표면항원과, Oct4와 같은 배아줄기세포 특이 전사인자를 발현하며 동시에 Stro-1, CD29, CD90 및 CD105와 같은 중간엽줄기세포의 표면항원도 발현하는 특성을 지니고 있다. 태아연골조직 유래 세포는 증식 능력과 다양한 세포조직으로의 분화 능력이 성체줄기세포에 비해 월등하여 손상된 조직을 재생하기 위한 새로운 줄기세포원으로 이용될 수 있다. 특히, 태아연골조직 유래 세포는 면역억제 생쥐 (nude mice)의 피하에 이식 시 종양을 형성하지 않음을 확인하여 인체 이식 시 안전성도 매우 높은 특성을 가지고 있다.

Description

태아연골조직유래 줄기세포원 및 이를 포함하는 세포치료제{A novel stem cell source derived from fetal cartilage tissue and cellular therapeutic agent}
본 발명은 손상된 조직을 재생하기 위한 새로운 줄기세포원 및 이를 포함하는 세포치료제에 관한 것으로, 배아줄기세포 보다 윤리적 제한이 적고 분화조절이 용이하며, 성체줄기세포 보다는 증식력이나 분화능이 뛰어난 태아연골조직 유래의 세포를 이용한 줄기세포원 및 이를 포함하는 세포치료제의 개발에 관한 것이다.
연골을 비롯한 많은 인체 조직은 자가재생 능력이 높지 않기 때문에 손상 후 재생치료가 용이하지 않다. 이러한 난치성 조직 손상에 대한 치료 방법으로서 최근 줄기세포 및 조직공학을 이용한 이식치료법이 활발히 개발되고 있다. 하지만, 이러한 이식치료 기법은 치료에 사용가능한 안정한 세포원의 확보가 어렵다는 문제가 있다. 그 동안 배아줄기세포와 여러 가지 성체 줄기세포를 개발하고자 하는 시도들이 많이 이루어져 왔으나, 각기 갖는 한계점으로 인해 부분적인 성공만을 거두고 있는 상황이다.
성체줄기세포의 경우 골수로부터 유래한 중간엽줄기세포와 지방유래 줄기세포가 가장 많이 연구되고 있다. 이들 줄기세포는 지방, 연골, 골, 근육세포 등으로 분화가 가능한 줄기세포로 기내(in vitro)에서 증식이 잘 되는 세포로 알려져 있으며, 연골 외에도 다양한 조직의 재생을 위한 세포원으로 임상적 효용가치가 높은 세포이다. 그러나 중간엽줄기세포는 체내에서 골세포로 분화하는 등의 완전한 연골세포로는 분화하기 힘든 세포로 아직까지 이러한 중간엽 줄기세포의 분화능을 조절하기 위한 연구가 진행 중이다. 한편, 배아줄기세포의 경우 분화 및 증식 능력은 좋으나 안정적인 세포주 확보 및 분화능력의 조절이 어렵다는 문제점이 있다. 또한, 종양 형성과 면역거부 반응과 같은 부작용에 대해서도 아직 충분한 기술 개발이 이루어져 있지 않아 실제 상용화되기까지 많은 시간이 소요될 것으로 판단된다. 전술한 성체줄기세포 및 배아줄기세포에 대한 연구 외에 제대혈, 태아의 조직 등으로부터 새로운 줄기세포원을 개발하기 위한 방법들 또한 제시되고 있다.
예를 들어, 일본공개특허공보 제2009-65879호에서는 양막이 붙어있는 융모막을 디쉬에서 배양한 후 융모막을 제거하고 디쉬에 부착된 세포만을 배양하여 태아유래 중간엽줄기세포를 분리 및 수득하는 방법을 개시하고 있다. 또한, 국제특허공개공보 WO 2005/017117 A2호에서는 임산부의 양수에서 태아 줄기세포를 분리, 배양 및 분화시키는 방법을 소개하고 있고, 유럽특허공보 제1 613 743 B1호는 자궁경부 샘플에서 태아 줄기세포를 분리 및 증식하는 방법을 개시하고 있으며, 미국공개특허공보 US 2008/0131410 A1호는 태반 줄기세포나 제대혈 줄기세포를 배양하여 신경세포 등으로 분화시키는 기술을 개시하고 있다. 또한, 태아의 혈액(blood), 골수(bone marrow), 뇌(brain), 간(liver), 비장(kidney) 등의 특정 조직으로부터 유래한 세포는 다양한 세포로 분화할 수 있으며 중간엽 줄기세포보다 분화능이나 증식능이 뛰어난 것으로 연구된 바 있다. 특히 태아의 장골(lone bone)에서 유래한 세포는 배양 시 중간엽 줄기세포에 비해 연골, 지방, 골 세포로의 분화능이 뛰어나고 누드마우스를 이용한 체내 배양 시 골조직 형성이 매우 뛰어난 것으로 보고된 바가 있다. 이러한 연구들을 바탕으로 특정 태아조직유래의 세포에 조직공학적 기법을 응용하여 손상된 조직을 재생하기 위한 연구가 현재 진행되고 있고, 얻어진 세포의 특성을 분석하고 분화를 조절하기 위한 연구 또한 진행 중에 있다.
본 발명의 목적은 태아연골조직에서 연골세포를 분리 배양하여 중간엽줄기세포와 배아줄기세포의 표면항원 단백질을 동시에 발현하고, 증식능 및 다분화 능력을 가진 태아연골조직유래 줄기세포원을 수득하는 방법을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 다른 목적은 성인의 골수유래 중간엽줄기세포 특이 표면항원인 CD29, CD44, CD90 및 CD105을 발현하면서도, 배아줄기세포 특이 표면항원인 SSEA-4와 Oct4를 발현하는 태아연골조직유래 줄기세포원을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 태아연골조직유래 줄기세포원을 유효성분으로 포함하는 세포치료제를 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자는 태아연골조직으로부터 세포의 분리, 배양 및 유지 방법을 확립하고 분리된 세포의 줄기세포 특성을 분석한 후, 연골조직을 비롯한 여러 조직의 재생치료 효과를 검증함으로써 연골을 비롯한 여러 조직의 재생치료에 대한 적용 가능성을 확인하고, 임상적으로 활용 가능한 줄기세포원 및 이를 포함하는 세포치료제를 개발하기에 이르렀다.
본 발명은 (a) 태아연골조직에서 연골세포를 분리하여 배양하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 분리 배양된 세포에서 중간엽줄기세포와 배아줄기세포의 표면항원 단백질을 동시에 발현하는 세포를 분리하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 분리된 세포의 증식능 및 다분화 능력을 검증하여 태아연골조직유래 줄기세포원을 수득하는 단계를 포함하는 태아연골조직유래 줄기세포원을 수득하는 방법을 제공한다.
상세하게는 상기 태아연골조직에서 분리된 연골세포는 12-15주의 유산된 태아로부터 채취하여 콜라게나아제(Collagenase)를 사용하거나 마쇄(trituration)를 통해 수득되는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 태아연골조직유래 줄기세포원은 중간엽줄기세포 특이 표면항원인 CD29, CD44, CD90 및 CD105을 발현하면서도, 배아줄기세포 특이 표면항원인 SSEA-4 및 Oct4를 동시에 발현하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 태아연골조직유래 줄기세포원은 중간엽줄기세포의 표면항원과 배아줄기세포의 표면항원의 동시 발현을 유세포분석(fluorescent-assisted cell sorting; FACS) 및 자기활성세포선별(magnetic-activated cell sorting; MACS) 방법을 포함하는 면역화학적 분리 방법으로 분석한 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 태아연골조직유래 줄기세포원은 연골, 골, 근육, 피부 및 지방 세포를 포함하는 근골격계 조직세포; 신경세포; 간세포; 췌장세포; 심근세포; 및 혈관세포 중 어느 하나로 분화하는 다분화 능력을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 있어서, "줄기세포"란 여러 종류의 신체 조직으로 분화할 수 있는 능력을 가진 세포, 즉 미분화세포이다. 이 줄기세포에는 사람의 배아를 이용해 만들 수 있는 '배아줄기세포(전분화능줄기세포; pluripotent stem cells)'와 혈구세포를 끊임없이 만드는 골수세포와 같은 '성체줄기세포(다분화능줄기세포; multipotent stem cells)'가 있다.
본 발명에서 있어서, "배아줄기세포(embryonic stem cell)"란 수정한지 14일이 안된 배아기의 세포로서, 장차 인체를 이루는 모든 세포와 조직으로 분화할 수 있기 때문에 '전능세포' 혹은 '만능세포'로 불린다. 수정란은 세포분열을 통해 배반포를 형성하는데 그 안쪽에 내세포괴라는 세포덩어리가 있어 이것이 배아를 형성한다. 이 내세포괴의 세포를 배반포로부터 분리하여 배양하면, 분화는 일어나지 않지만 분화 능력은 여전히 가지는 배아줄기세포가 된다.
본 발명에서 있어서, "성체줄기세포(adult stem cell)"란 제대혈(탯줄혈액)이나 다 자란 성인의 골수와 혈액 등에서 추출해낸 것으로, 뼈와 간, 혈액 등 구체적 장기의 세포로 분화되기 직전의 원시세포다. 여기에는 조혈모세포(hematopoietic stem cell)와 재생의학의 재료로 각광받고 있는 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell), 신경줄기세포(neural stem cell) 등이 있다. 이밖에 간이나 표피, 췌장 등에도 줄기세포가 있다. 상기 성체 줄기세포는 증식이 어렵고 쉽게 분화되는 경향이 강한 대신에 여러 종류의 성체 줄기세포를 사용하여 실제 의학에서 필요로 하는 장기 재생을 할 수 있을 뿐 아니라 이식된 후 각 장기의 특성에 맞게 분화할 수 있는 특성을 지니고 있다.
본 발명에 있어서, "중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)"는 뼈(bone), 연골(cartilage), 지방(fat), 힘줄(건), 신경 조직(nerve tissue), 섬유아세포(fibroblast) 및 근육 세포(muscle cell) 등 구체적인 장기의 세포로 분화되기 전의 다분화 전구 세포 (multipotent progenitor)를 말한다.
또한, 본 발명은 성인의 골수유래 중간엽줄기세포 특이 표면항원인 CD29, CD44, CD90 및 CD105을 발현하면서도, 배아줄기세포 특이 표면항원인 SSEA-4와 Oct4를 발현하는 태아연골조직유래 줄기세포원을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 태아연골조직유래 줄기세포원을 유효성분으로 포함하는 세포치료제를 제공한다.
본 발명에서 있어서, "세포치료제"는 사람으로부터 분리, 배양 및 특수한 저작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식, 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 지칭한다. 세포치료제는 세포의 분화정도에 따라 크게 체세포치료제, 줄기세포치료제로 분류되며 본 발명은 특히 줄기세포치료제에 관한 것이다.
본 발명의 태아연골조직에서 분리된 세포는 SSEA-4와 같은 배아줄기세포 특이 표면항원과 OCT-4와 같은 배아줄기세포 특이 전사인자를 발현하며 동시에 CD29, CD44, CD90 및 CD105와 같은 중간엽줄기세포의 표면항원도 발현하는 특성을 지니고 있고, 증식 능력과 다양한 세포조직으로의 분화 능력이 성체줄기세포에 비해 월등하여 손상된 조직을 재생하기 위한 새로운 줄기세포원으로 이용될 수 있다. 특히, 본 발명의 태아연골조직유래 세포는 면역억제 생쥐(nude mice)의 피하에 이식 시 종양을 형성하지 않음을 확인하여 인체 이식 시 안전성도 매우 높은 특성을 가지고 있다.
즉, 본 발명의 태아연골조직유래 세포는 손상된 연골을 포함하여 다양한 조직의 재생을 위한 새로운 세포원으로서 적용가능하며, 특히 연골세포의 특성 뿐만 아니라 줄기세포의 특성 또한 지니고 있어 연골을 포함하는 근골격계의 재생에 있어서 탁월할 효과를 나타낼 수 있다. 또한, 본 발명의 태아연골조직유래 세포는 근골격계 조직 외에 신경, 간, 췌장, 심장 등 여러 조직으로 분화가 가능하며 증식능이 뛰어난 반면, 인체 이식 시 종양 형성과 같은 부작용이 없으므로 기존의 줄기세포의 한계점을 극복할 수 있는 획기적인 줄기세포원이 될 것이다.
도 1은 태아연골조직으로부터 세포를 분리한 후 1일째 모양과 계대배양 2번째의 모양이다.
도 2는 태아연골유래줄기세포를 체외에서 13번째까지 계대배양하면서 얻은 세포수와 doubling time을 표시한 그래프이다.
도 3은 태아연골유래줄기세포에서의 유전자 발현 양상을 나타낸 그림이다.
도 4는 태아연골유래줄기세포에서의 중간엽줄기세포의 특성을 나타내는 인자를 유세포 분석기를 이용하여 분석한 그림이다.
도 5는 태아연골유래줄기세포에서의 배아줄기세포의 특성을 나타내는 인자를 유세포 분석기를 이용하여 분석한 그림이다.
도 6은 배아줄기세포 특이 표면항원인자인 SSEA-4에 대한 항체를 이용하여 태아연골유래줄기세포에서 유세포분석기를 이용하여 SSEA-4를 발현하는 세포를 분리하고, 체외에서 19번째까지 계대배양하면서 얻은 총 세포수를 표시한 그래프이다.
도 7은 SSEA-4를 발현하는 태아연골유래줄기세포를 체외에서 배양하면서 배아줄기세포 특이 전사인자인 Oct4의 유전자의 단백질의 발현양상을 나타낸 그림이다.
도 8은 SSEA-4를 발현하는 태아연골유래줄기세포를 체외에서 골세포로 분화유도한 후, 골세포 특이염색인 알리자린 레드 S(Alizarin Red S) 염색을 시행한 것이다.
도 9는 SSEA-4를 발현하는 태아연골유래줄기세포를 체외에서 지방세포로 분화유도한 후, 지방세포 특이염색인 오일 레드 O(Oil Red O) 염색을 시행한 것이다.
도 10은 SSEA-4를 발현하는 태아연골유래줄기세포를 체외에서 연골세포로 분화유도한 후, 연골세포 특이염색인 사프라닌 O(Safranin O) 염색을 시행한 것이다.
이하, 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1 > 태아연골줄기세포의 분리 및 배양
태아연골유래세포의 분리 및 배양을 위해 인하대학교 병원의 윤리위원회(IRB) 승인을 획득하였으며, 연골세포는 인하대병원의 산모로부터 수술 시 동의서를 받은 후 태아의 연골을 채취하였다. 채취된 조직은 인산완충염식염수 (PBS)로 수차례 세척 후 잘게 잘라 0.1% 콜라게나아제(collagenase), 1% 소혈정 (fetal bovine serum, FBS)가 함유된 배양배지(DMEM)를 처리하여 37℃, 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 12시간 방치하여 세포를 분리하였다. 콜라게나아제에 의해 분리된 세포는 10% FBS가 함유된 배양배지로 세척하였으며 그 방법은 다음과 같다. 배양배지에 부유된 세포를 1700 rpm에서 10분간 원심분리 후 상층액을 제거하고 모아진 세포를 획득한 후 배양배지에 다시 부유시켰다. 이때 일부 세포를 트립판 블루(trypan Blue)로 염색 후 광학 현미경 하에서 혈구계수판을 이용하여 세포수를 측정하였다. 배양배지에 부유된 세포를 배양용기에 8×104/cm2 의 농도로 분주한 후 37℃, 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 배양하였다. 계대배양은 세포가 배양용기의 80~90% 정도를 채웠을 때 이루어졌다.
< 실시예 2 > 태아연골유래 세포와 성인연골세포에서의 유전자발현 확인
태아연골유래 세포와 성인 연골세포를 배양한 다음 계대배양이 진행되는 동안 연골세포 특이 유전자의 발현 양상을 RT-PCR 기법을 이용하여 분석하였다. 계대배양이 진행될수록 탈분화되어 제2형 콜라겐(collagen type 2)과 SOX9 유전자의 발현은 감소하는 반면, 제1형 콜라겐(collagen type 1) 유전자의 발현은 증가하는 것을 확인함으로써 태아 연골유래세포의 유전자 발현 특성을 성인연골세포의 유전자 발현 특성과 비교하였다. 각 유전자의 PCR 증폭을 위한 프라이머(primer)는 하기 표 1과 같다.
프라이머 명칭 염기서열 PCR 증폭
산물 크기
GADPH S: 5'-GGTCATGAGTCCTTCCACGAT-3'(서열번호 1)
A: 5'-GGTGAAGGTCGGAGTCAACGG-3'(서열번호 2)		 520bp
SOX9 S: 5'-CACACAGCTCACTCGACCTTG-3'(서열번호 3)
A: 5'-TTCGGTTATTTTTAGGATCATCTCG-3'(서열번호 4)		 76bp
Collagen 2 S: 5'-CTCCTGGAGCATCTGGAGAC-3'(서열번호 5)
A: 5'-ACCACGATCACCCTTGACTC(서열번호 6)		 152bp
Collagen 1 S: 5'-CTTCTGGCCCTGCTGGAAAAGATG-3'(서열번호 7)
A: 5'-CCCGGATACAGGTTTCGCCAGTAG-3'(서열번호 8)		 344bp
연골세포는 계대배양을 진행할수록 그 특성을 잃어버리는 탈분화의 특성을 가지고 있으며, 그 대표적인 예로서 연골세포의 특이 인자인 제2형 콜라겐(collagen type 2)의 발현이 감소하게 된다. 태아연골에서 분리된 세포는 계대배양이 진행될수록 성인연골과 마찬가지로 제2형 콜라겐(collagen type 2)의 발현이 감소한 것을 확인하였다(도 3).
또한, 탈분화될수록 증가하는 제1형 콜라겐(collagen type 1)은 성인연골과 동일한 패턴으로 태아연골에서 분리된 세포에서 증가하는 것으로 확인되었다. 그러나 제2형 콜라겐(collagen type 2)의 전사인자로 알려진 SOX9 유전자의 경우 성인연골은 감소하는 반면, 태아연골유래세포의 경우 계대배양이 진행되어도 그 발현을 유지하는 것으로 나타났다(도 3). 이는 태아연골유래세포가 연골세포의 특성을 잃어버리기는 하나 일부분 유지하는 연골생성 전구세포(chondrogenic progenitor)의 특성을 지닌 것으로 판단되었다.
< 실시예 3 > 태아연골유래세포 세포표면인자 확인
태아연골유래세포의 줄기세포 특성을 확인하기 위하여 중간엽줄기세포에서 발현하는 것으로 알려진 세포표면인자(cell surface marker)를 유세포분석기 (FACScantoⅡ)를 이용하여 분석하였다. 2번의 계대배양 후, 태아연골유래 세포를 0.25% 트립신-EDTA로 떼어내어 2% FBS가 함유된 PBS로 2회 세척한 후, 1×106의 세포당 0.5㎍의 1차 항체를 처리하여 4℃의 암실에서 40분간 반응시켰다. 항체의 부착 후 각각의 세포는 다시 2% FBS가 함유된 PBS로 2회 세척한 후, 유세포분석기를 이용하여 중간엽줄기세포와의 발현차이를 비교분석하였다. 또한, 태아연골유래 세포에서 SSEA-1, SSEA-4와 같은 배아줄기세포 표면항원과 Oct4, SOX2와 같은 배아줄기세포 특이 전사인자의 발현 변화도 조사하였다.
또한, 골수유래 중간엽 줄기세포의 세포표면인자로 널리 알려진CD29(integrin β1 chain), CD44(HA receptor), CD 90(thy-1), CD105(endoglin)를분석한 결과, 태아연골유래세포에서도 높은 수준으로 발현하는 것으로 나타났다(도 4). 특히, 배아유래 줄기세포의 특이 마커인 SSEA-4와 Oct4의 경우 골수유래 중간엽 줄기세포에서는 발현하지 않으나 태아연골유래세포의 경우 일부 발현하는 것으로 분석되어, 확보된 태아연골유래세포가 배아유래 줄기세포의 특성을 일부 지니고 있음을 확인할 수 있었다(도 5).
< 실시예 4 > SSEA -4를 발현하는 태아연골유래줄기세포분리
유세포분석기를 이용하여 태아연골유래줄기세포에서 배아줄기세포 특이 표면항원인 SSEA-4를 발현하는 세포를 분리하였고 계대배양은 실시예1와 동일하게 이루어졌다(도 6).
SSEA-4를 발현하는 태아연골유래줄기세포를 체외에서 배양하면서 배아줄기세포 특이 전사인자인 Oct4의 유전자와 단백질의 발현을 확인할 수 있었다(도 7). Oct4 유전자의 PCR 증폭을 위한 프라이머(primer)는 하기 표 2과 같다.
프라이머명칭 염기서열 PCR 증폭산물 크기
Oct4 S:5’-CGACCATCTGCCGCTTTGAG-3’(서열번호9)
S:5’-CCCCCTGTCCCCCATTCCTA-3’(서열번호10)		 573 bp
< 실시예 5 > SSEA -4를 발현하는 태아 연골유래세포의 다분화능 확인
태아연골유래세포의 줄기세포 특성을 확인하기 위하여, 중간엽 줄기세포의 특징인 다분화능 (multipotency)을 확인하기 위한 분화 실험을 시행하였다. 태아연골유래세포를 두 번의 계대배양 후 골분화유도(osteogenesis), 지방분화유도(adipogenesis), 연골분화유도(chondrogenesis)를 진행하였으며, 성인의 연골세포 혹은 골수유래 중간엽 줄기세포의 분화능력과 비교하였다.
골분화유도는 지름 35mm 배양기에 5×104의 세포를 분주한 후, 10% FBS가 함유된 α-MEM에 50㎍/ml 아스코베이트-2 포스페이트(ascorvate-2 phosphate), 0.1μM 덱사메타손 및 10mM β-글리세로포스페이트(β-glycerophosphate)를 첨가한 후 3 주 동안 배양하여 수행하였다(도 8).
지방분화유도는 상기와 동일한 배양용기에 1×105의 세포를 10% FBS가 함유된 α-MEM에 0.5mM IBMX, 10㎍/ml 인슐린, 0.1mM 인도메타신(indomethacin) 및 1μM 덱사메타손을 첨가한 후 역시 3주 동안 배양하여 수행하였다(도 9).
연골분화유도는 3×105의 세포를 500g에서 10분간 원심분리하여 펠릿(pellet)으로 만든 후, DMEM에 100 nM 덱사메타손, 50 ㎍/ml 아스코베이트-2 포스페이트, ITS supplement, 40 ㎍/ml 프롤린(proline), 1.25 mg/ml BSA(bovine serum albumin), 100 ㎍/ml 소디움 피루베이트(sodium pyruvate) 및 10 ng/ml TGF-β3를 첨가한 후 3주간 펠릿(pellet)으로 배양하여 수행하였다(도 10).
분화유도를 위한 배지는 각각 3일에 한번 교환되었으며, 배양 3주째에 세포학검사를 위해 세포를 고정하였다. 세포학적 검사는 다음의 방법으로 염색을 통하여 확인하였다. 골세포, 지방세포로의 분화를 확인하기 위하여 분화 3주째에 40mM 알리자린 레드 S(Alizarin Red S), 0.18% 오일 레드 O(Oil Red O) 용액으로 각각 염색하였으며, 정량분석을 위해 세포에 염색된 시약을 녹여내어 500nm, 405nm에서 각각 흡광도를 측정하였다. 연골세포로의 분화를 확인하기 위하여 분화 3주째에 조직을 고정하여 조직학적 분석을 진행하였다. 연골조직에서 다량 함유되어 있는 당백당(glycosaminoglycans)을 확인하기 위해 사프라닌 O(Safranin O) 염색을 통해 각 조직은 분석되었다.
<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> A novel stem cell source derived from fetal cartilage tissue and cellular therapeutic agent <130> ADP-2013-0353 <150> KR 10-2012-0083260 <151> 2012-07-30 <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ggtcatgagt ccttccacga t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ggtgaaggtc ggagtcaacg g 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cacacagctc actcgacctt g 21 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ttcggttatt tttaggatca tctcg 25 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ctcctggagc atctggagac 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 accacgatca cccttgactc 20 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 cttctggccc tgctggaaaa gatg 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 cccggataca ggtttcgcca gtag 24 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 cgaccatctg ccgctttgag 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 ccccctgtcc cccattccta 20

Claims (7)

  1. (a) 태아연골조직에서 연골세포를 분리하여 배양하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 분리 배양된 세포에서 중간엽줄기세포와 배아줄기세포의 표면항원 단백질을 동시에 발현하는 세포를 분리하는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계에서 분리된 세포의 증식능 및 다분화 능력을 검증하여 태아연골조직유래 줄기세포원을 수득하는 단계를 포함하는 태아연골조직유래 줄기세포원을 수득하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 태아연골조직에서 분리된 연골세포는 12-15주의 유산된 태아로부터 채취하여 콜라게나아제(Collagenase)를 사용하거나 마쇄(trituration)를 통해 수득되는 것을 특징으로 하는 태아연골조직유래 줄기세포원을 수득하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 태아연골조직유래 줄기세포원은 중간엽줄기세포 특이 표면항원인 CD29, CD44, CD90 및 CD105을 발현하면서도, 배아줄기세포 특이 표면항원인 SSEA-4 및 Oct4를 동시에 발현하는 것을 특징으로 하는 태아연골조직유래 줄기세포원을 수득하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 태아연골조직유래 줄기세포원은 중간엽줄기세포의 표면항원과 배아줄기세포의 표면항원의 동시발현을 유세포분석(Fluorescent-Assisted Cell Sorting; FACS) 방법을 포함하는 면역 화학적 분리 방법으로 분석하는 것을 특징으로 하는 태아연골조직유래 줄기세포원을 수득하는 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 태아연골조직유래 줄기세포원은 연골, 골, 근육, 피부 및 지방 세포를 포함하는 근골격계 조직세포; 신경세포; 간세포; 췌장세포; 심근세포; 및 혈관세포 중 어느 하나로 분화하는 다분화 능력을 갖는 것을 특징으로 하는 태아연골조직유래 줄기세포원을 수득하는 방법.
  6. 성인의 골수유래 중간엽줄기세포 특이 표면항원인 CD29, CD44, CD90 및 CD105을 발현하면서도, 배아줄기세포 특이 표면항원인 SSEA-4와 Oct4를 발현하는 태아연골조직유래 줄기세포원.
  7. 제6항에 따른 태아연골조직유래 줄기세포원을 유효성분으로 포함하는 세포치료제.

KR1020130090233A 2012-07-30 2013-07-30 태아연골조직유래 줄기세포원 및 이를 포함하는 세포치료제 KR20140016841A (ko)

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