CN109789246A - 软骨再生用组合物及其制造方法 - Google Patents

软骨再生用组合物及其制造方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109789246A
CN109789246A CN201780061241.9A CN201780061241A CN109789246A CN 109789246 A CN109789246 A CN 109789246A CN 201780061241 A CN201780061241 A CN 201780061241A CN 109789246 A CN109789246 A CN 109789246A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cartilage
composition
regenerating bone
cell
bone
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201780061241.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109789246B (zh
Inventor
闵炳显
朴素拉
崔炳炫
金永稷
吴贤珠
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ATEX CORP
Original Assignee
ATEX CORP
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ATEX CORP filed Critical ATEX CORP
Publication of CN109789246A publication Critical patent/CN109789246A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109789246B publication Critical patent/CN109789246B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A61L27/3817—Cartilage-forming cells, e.g. pre-chondrocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/32—Bones; Osteocytes; Osteoblasts; Tendons; Tenocytes; Teeth; Odontoblasts; Cartilage; Chondrocytes; Synovial membrane
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/48—Reproductive organs
    • A61K35/54—Ovaries; Ova; Ovules; Embryos; Foetal cells; Germ cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
    • A61L27/3633—Extracellular matrix [ECM]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3641—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the site of application in the body
    • A61L27/3645—Connective tissue
    • A61L27/3654—Cartilage, e.g. meniscus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3683—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment
    • A61L27/3691—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment characterised by physical conditions of the treatment, e.g. applying a compressive force to the composition, pressure cycles, ultrasonic/sonication or microwave treatment, lyophilisation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3839—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by the site of application in the body
    • A61L27/3843—Connective tissue
    • A61L27/3852—Cartilage, e.g. meniscus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3895—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells using specific culture conditions, e.g. stimulating differentiation of stem cells, pulsatile flow conditions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0655—Chondrocytes; Cartilage
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/06—Materials or treatment for tissue regeneration for cartilage reconstruction, e.g. meniscus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/12—Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/33—Insulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/39—Steroid hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)

Abstract

本发明涉及包含胚胎软骨组织源性细胞及胚胎软骨组织源性细胞外基质的软骨再生用组合物及其制造方法。根据本发明的软骨再生用组合物无需人工支架可制作用于软骨的适当大小的三维组织，且组合物可由胶形态注入并具有高的涂抹性和粘附性，因此，与注入部位的软骨缺损的大小及模样无关可便于移植，并且呈现与宿主的较高的结合力同时具有成熟的软骨组织的表型，从而具有良好的软骨再生功效的效果。

Description

软骨再生用组合物及其制造方法
技术领域
本发明涉及软骨再生用组合物及其制造方法。
背景技术
软骨是仅由单一细胞的软骨和细胞外基质形成的组织。软骨组织的缺点为没有血管和神经，因此受到损伤则难以治愈。此外，软骨细胞由坚固的细胞外基质所环绕，因此，存在一旦受到损伤或退化则难以再生的问题。
为治疗受损的软骨组织，可使用药物治疗剂(镇痛剂、类固醇、非类固醇抗炎药等)、软骨保护剂(透明质酸、氨基葡萄糖、软骨素等)或进行手术处理(关节镜手术、胫骨高位截骨术、关节置换术、全膝关节置换术、骨髓刺激术、骨、软骨组织移植术等)。但是，使用药物治疗剂时，只起到非特异性缓解痛症或炎症反应本身的效果，而软骨保护剂只起到为软骨细胞提供营养或缓解冲击，从而暂时性地保护关节的作用。此外，在整形外科中实施多种临床学手术方法，其代表性的方法是骨髓刺激术(Bone marrow stimulation)和骨软骨组织移植术(Osteochondral graft)。骨髓刺激术是露出受损的软骨下骨(subchondralbone)，并使用包括从骨髓诱导的干细胞的血凝块(blood clot)来填充软骨受损部位的方法，其具有手术较为简便的优点，但是，存在术后再生的并非透明软骨而是纤维软骨的缺点。骨-软骨组织移植术是从患者自身的软骨组织中，提取受体重影响较少部位的骨-软骨结合组织后，将其移植到软骨受损部位的方法，但是，存在受损部位较大时无法实施的缺点。
为了克服这种手术治疗技术的缺点，从外部提供治疗细胞的细胞治疗剂的研究被广泛地展开。最先产品化的技术为自体软骨细胞移植术(Autologous ChondrocytesImplantation，ACI)，是从患者自身的软骨组织中受体重影响较小部位，提取一点健康的软骨并从中将软骨细胞进行分离，且在在体外进行培养之后再注入到受损部位的技术。但是，其具有因两次手术引发的不便及给健康部位的软骨带来损伤的缺点，而且更何况提取的软骨细胞的数量较少，需要培养一定时间，且在培养期间发生失去软骨细胞特性的脱分化现象，且注入的软骨细胞为非均质且因重力导致集中在特定部位，因此存在分布不均匀的缺点。
为克服这一缺点，移植干细胞的研究进展较为活跃，而最近培养同种类脐带血源性间充质干细胞，并移植到软骨部位的移植治疗术已被产品化。除脐带血以外，也积极地研究从骨髓或脂肪组织中分离培养间充质干细胞，治疗软骨损伤的技术，但对于注入的间充质干细胞生存的依据不足，且移植后在活体内的软骨细胞的分化及软骨组织形成效率未被证明，因此，目前的情况是难以期待作为普遍的治疗方法。总而言之，将软骨细胞或干细胞注入软骨损伤部位的细胞治疗剂对细胞的生存、分化、分布的依据不足，且细胞的作用机制也未得以证实，而且细胞治疗剂相互之间的相对有效性并未得到研究，因此，被认定为临床推荐治疗剂的可能性很小。
由于前面所述各种问题，目前为克服细胞治疗剂的活体内分布及分化的缺点，正在使用将多种形态的生物材料(biomaterials)作为支架(scaffolds)传达细胞的技术，进一步地，正在开发在在体外(in vitro)制造三维结构的人工软骨组织(tissue engineeredcartilage)的技术。
为将细胞传达到移植部位，目前使用的支架具有海绵、胶状物、纤维及微球(microbead)等多种形态，主要使用天然或合成生物材料进行制造。使用支架时，对移植术本身显示高的效率且具有可均匀地分布在移植部位的优点，但是，在支架内增值细胞或分泌细胞外基质时，支架反而具有空间局限性的缺点。尤其，水凝胶(hydrogel)形态的支架无法顺畅地进行氧气与营养的供给，具有细胞的生存率和软骨分化降低的缺点，且薄膜(membrane)形态的支架无法形成三维软骨组织，并且使用三维海绵(sponge)或网眼(mesh)形态的支架时，存在制造的人工软骨与原有组织(host tissue)的粘合力差，因而软骨不易再生的缺点。此外，所有的支架均会进行分解，但对于分解速度较快的天然生物材料的情况，存在细胞有可能与分解一起流失的可能性较高的缺点。最终，使用支架的细胞治疗剂依旧未被证实其与现有的细胞治疗剂的相当有效性，因此无法推荐为优先选择。
与所述技术不同，目前正在进行将细胞接种在生物材料之后，与活性因子(bioactive factors)一同在生物反应器(bioreactor)内进行培养，制造具有与软骨类似的化学结构的人工软骨材料的研究，此外，不使用支架制造人工软骨组织的技术也在研究中。例如，具有将细胞以高浓度在培养盘进行接种之后，施加外部刺激(bioreactor)来制造人工软骨的方法、将胎牛血清及成长因子添加到培养基中，提高细胞的增殖和分行能力制造的方法，以及利用圆心分离将多个细胞制造为团块(pellet)形态的方法等。但这些技术大部分只可制造厚度为几十微米(micrometer，mm)左右的薄膜(membrane)形态或直径为1mm左右的小的团块形态的组织，从而作为软骨实际使用起来存在大小较小且无法显现出充分地再生效果的缺陷。
综上所述，可替代软骨组织的软骨再生材料方面的研究开发一直在持续着，并且为了作为适合于人体的软骨再生用材料使用，尤其，其目的为解决如下问题。
第一，应拥有可固定移植软骨的大小和体积。
第二，关节软骨的损伤大部分以非典型形式产生，因此，人工软骨可适用于这些非典型损伤形状。
第三，在体外培养软骨在组织学方面无法与自然软骨类似，因此，与其说组织在在体外全部完成，而应在移植之后能够在体内环境中发生分化及再形成(remodeling)，且在再形成过程中应与周围的组织较好地相互融合(integration)。
但是，目前的技术在制造大软骨时，发生中心组织的坏死等情况，且在制造骨软骨复合体的方法上具有困难，从而较难以解决。此外，例如使用三维支架制造的人工软骨组织在在体外发生僵硬(rigid)现象，从而移植到损伤的软骨组织时，存在与周围组织难以结合(integration)的缺点。再有，在在体外培养的软骨在人体内产生排异反应或与组织的融合方面难以确保充分地安全性。
因此，本发明人为解决所述三个问题，研究开发适合人体的软骨再生用组合物并完成了本项发明。
发明内容
(要解决的课题)
本发明目的在于提供包括胚胎软骨组织源性细胞及胚胎软骨组织源性细胞外基质的软骨再生用组合物。
本发明的目的还在于提供制造所述软骨再生用组合物的方法。
本发明的目的还在于提供包括所述软骨再生用组合物作为有效成分的软骨缺陷疾病治疗用药剂学组合物。
本发明的目的还在于提供将所述软骨再生用组合物按药剂学有效量注入给患者来治疗软骨缺陷疾病的方法。
本发明目的还在于提供在用于软骨缺陷疾病治疗的药剂制造中的所述软骨再生用组合物的用途。
本发明目的还在于提供用于软骨缺陷疾病治疗的所述软骨再生用组合物。
(解决课题的方法)
本发明中的用语“胚胎软骨组织源性细胞”是从胚胎软骨组织分离的细胞的总称，优选为利用胶原酶等完全消化软骨组织之后分离的软骨细胞(chondrocytes)。
本发明中的用语“胚胎软骨组织源性细胞外基质(Extracellular Matrix)”作为从胚胎软骨组织源性细胞由细胞合成而在细胞外分泌及积累的分子构成的生物高分子聚物，包括胶原质及弹力素等纤维性蛋白质、糖胺聚糖等复合蛋白质、纤维连接蛋白和层粘连蛋白等细胞粘附性蛋白质等。
本发明中的用语“软骨”包括但不特别限定于透明软骨(hyaline cartilage)、纤维软骨(fibrocartilage)或弹性软骨(elastic cartilage)。无限定地包括在关节软骨(articular Cartilage)、耳软骨、鼻软骨、胳膊肘软骨、半月软骨(meniscus)、膝软骨、肋软骨、脚腕软骨、气管软骨、咽喉软骨及脊椎软骨等软骨部位。
本发明中的用语“再生”指的是一般在生体的身体一部分或失去其功能时，重新制作该部分的组织或器官恢复为原来状态或者恢复期功能的作用。这些再生能力在体系简单且系统性进化程度越低则越强。
本发明中的用语“软骨再生用组合物”是移植到软骨缺陷或受损部分时，发挥软骨再生能力对软骨损伤显示改善及治疗效果的组合物。
本发明中的用语“凝胶(gel)”作为与胶状物类似的物质具有柔软且具有从较弱的范围至较强范围的物性，并意味着在正常状态下不显示流向的固体(solid)，且凝胶的大部分重量因液体(liquid)或三维网络结构从整体上与固体一同行动。
本发明中的用语“软骨缺陷疾病”指的是软骨、软骨组织和/或关节组织(滑膜、关节囊、软骨下骨等)因机械性刺激或炎症反应被受损的软骨缺陷、损伤及缺损引发的疾病。这些软骨缺陷疾病包括退行性关节炎、风湿性关节炎、骨折、肌肉组织的损伤、足底筋膜炎、网球肘病、钙化性肌腱炎、骨折愈合不良或因外伤导致的关节损伤，但并不限于此。
本发明中的用语“物理强度”指的是对物理性刺激的承受强度，优选为压缩强度，且指的是以垂直应力压缩断面时，将压缩荷重除以试料横截面的值。本发明中的压缩强度指的是，将试料按1mm/min速度按下之后，测量形态变形率(strain)在10-16％之间显示的杨氏模量(Young’s modulus)的值。
本发明中的用语“涂抹性(散开性)”指的是在物性中散开的性质，并且指的是涂抹在患部等时，不会结块而柔滑地全面散开的性质。本发明中的散开性指的是，将试料按1mm/min速度在1秒钟内将5N的力垂直地给予试料时，按试料单位重量散开的程度。
本发明中的用语“粘附性”指的是在物质粘附其他物质的性质，并且指的是涂抹在患部等时，物质不会掉落而粘附其上的性质。本发明中的粘附性指的是，将物质接触在直径5mm的夹具和患部进行粘附之后，以1.3mm/min的速度拉动直至夹具和患部上粘附的物质脱离为止的抗力。
本发明中的用语“软骨分化培养基”指的是支持在试验管内成长及生存并可由软骨再生用组合物制造的供给营养成分的培养基，且也包括培养时间从细胞分泌的基质等和在细胞培养中消耗之后剩下的营养成分等。
本发明的用语“移植(transplantation)”一般指的是将提供者的细胞、组织或脏器等转移到受益者受损组织或脏器中的过程，且在本发明中指的是适用于软骨再生用组合物的软骨缺陷、损伤、缺损部位。移植可按业界公认的方法实施。例如，有可能通过外科手术来进行，也可以直接注射到患部。
本发明中的用语“药剂学上有效的量”指的是，以可适用于医学性治疗的合理性受益/危险比例治疗疾病时的充分的量，且有效容量水平可根据包括的个体种类及重症度、年龄、性别、疾病的种类、治疗时间及同时使用的药物等因素及其他医学领域众所周知的因素所决定。
本发明中的用语“患者”指的是包括患有软骨缺陷疾病的人类的所有动物，是注入本发明的软骨再生用组合物获得软骨再生的改善及治疗效果的群组。
本发明提供包括胚胎软骨组织源性细胞及胚胎软骨组织源性细胞外基质的软骨再生用组合物。
根据本发明的软骨再生用组合物可无需人工支架而制作大小适合软骨使用的三维组织，且组合物可由胶状物进行注入并且具有高的涂抹性和粘附性，因此与注入部位的软骨缺损大小及形状无关可容易地进行移植，且呈现与宿主的较高的结合能力具有成熟的软骨组织的表型，因此，显示软骨再生功效很好的效果。特别地，在人在体外部相比成熟的实际软骨其强度较低，但其具有胶状形态且有着涂抹性和粘附性，从而具有较容易适用于患部的优点。同时，通过向体内(in vivo)患部移植时的成熟(maturation)和再成形，具有与实际软骨类似的强度。
包括胚胎软骨组织源性细胞及胚胎软骨组织源性细胞外基质的软骨再生用组合物可根据以下步骤制造。
(a)从胚胎软骨组织中分离软骨前驱细胞进行培养；
(b)获得包括所述培养的软骨前驱细胞及其细胞外基质的细胞膜；
(c)将所述获得的细胞膜进行圆心分离，获得细胞团块(cell pellet)；以及
(d)将所述细胞团块在软骨分化培养基进行培养。
根据所述步骤制造的包括胚胎软骨组织源性细胞及胚胎软骨组织源性细胞外基质的软骨再生用组合物具有如下物性：
形状：凝胶型(gel type)
压缩强度：制造之后在在体外(in vitro)状态中以1mm/min速度按压使得组织的变形率(strain)变为10～16％之间时，所施加的杨氏模量(Young’s modulus)为20kPa以下，优选为0.2至20kPa，更优选为4.1至18.9kPa；
涂抹性：制造之后在在体外(in vitro)状态下以1mm/min速度在1秒钟内将5N的力垂直地给予试料时，每一个单位重量(1mg)散开的面积为0.1至2.0mm2/mg，优选为0.2至1.7mm2/mg，更优选为0.4至1.2mm2/mg的涂抹性；
粘附性：制造之后在in vitro状态下，将直径为5mm的夹具和患部接触物质粘附后，以1.3mm/min的速度拉动，使夹具和患部粘附的物质分离时的力的大小为0.5至5.0kPa，优选为0.9至4.5kPa，更优选为1.0至2.8kPa的粘附性。
根据本发明的软骨再生用组合物具有凝胶形态，从而可在患部以注射方式移植，也可通过涂抹方式进行。根据本发明的软骨再生用组合物在体内(in vivo)适用前，invitro状态或制造后具有如所述的良好的涂抹性，从而适用于患部时，可较容易地涂抹软骨再生用组合物。根据本发明的软骨再生用组合物在in vivo适用前，in vitro状态或制造之后具有如所述的良好的粘附性，从而适用于患部时，组合物从患部不掉落可由软骨组织再生。
根据本发明的软骨再生用组合物的凝胶形态，可在25至37℃条件下保持24小时以上，更优选地维持24小时以上1年以下。所述软骨再生用组合物在将细胞球在软骨分化培养基培养的步骤中，根据培养时间可调整其大小，其直径为1mm至15mm，高为1mm至15mm。此外，在将细胞球在软骨分化培养基培养的步骤中，根据培养时间可调整压缩强度、涂抹性及粘附性，来维持对软骨再生的最适当状态。
所述软骨再生用组合物适用在活体条件，优选为人体内后，随着时间的推移糖蛋白和第2胶原质的表达增加呈现出成熟软骨的特性。
本发明还提供包括所述胚胎软骨组织源性细胞及胚胎软骨组织源性细胞外基质的软骨再生用组合物制造方法。
根据本发明的制造软骨再生用组合物的方法，可提供细胞球的形成和自此根据培养的凝胶形状的物质，调整根据培养时间的调整而生成的软骨再生用组合物的物性，提供适合人体的软骨再生用组合物。
包括所述胚胎软骨组织源性细胞及胚胎软骨组织源性细胞外基质的制造软骨再生用组合物的方法包括如下几个步骤：
(a)从胚胎软骨组织中分离软骨前驱细胞进行培养；
(b)获得包括所述培养的软骨前驱细胞及其细胞外基质的细胞膜；
(c)将所述获得的细胞膜进行圆心分离，获得细胞团块；以及
(d)将所述细胞团块在软骨分化培养基进行培养。
制造所述软骨再生用组合物的方法包括(a)从胚胎软骨组织中分离软骨前驱细胞进行培养的步骤。
所述胚胎软骨组织可从胚胎的关节部位(例如，膝关节)被分离。分离的胚胎软骨组织由胶原酶、胃蛋白酶等蛋白酶处理，分解软骨组织之后，统筹获得放出的细胞。分离的软骨前驱细胞在通常使用的培养培养基(例如细胞培养基(dulbecco's modified eaglemedium，DMEM)条件下他添加FBS及抗生素的培养基)培养，并生成细胞外基质而成长。
制造所述软骨再生用组合物的方法包括(b)获得包括所述培养的软骨前驱细胞及其细胞外基质的细胞膜的步骤。
与一般的细胞获得方法不同，根据本发明的获取方法是获得包括经培养的软骨前驱细胞及其细胞外基质的细胞膜。即，从培养盘分离细胞时，没有将细胞分离为单一细胞的过程，将培养盘内的软骨前驱细胞及其细胞外基质全部包括在内一起获得。这种获取可以是去除培养基并处理胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA)等，从而获得包括粘附在底部的细胞及细胞外基质的所有膜。
所述软骨再生用组合物的制造方法包括(c)将所述获得的细胞膜进行圆心分离，获得细胞团块的步骤。
在所述(b)步骤获取的细胞膜可通过圆心分离形成凝聚体(即，球形态)。对于这种球形态的形成优选为在100g至500g条件下，圆心分离5分钟至30分钟进行制造，更为优选地可在包括软骨分化因子的软骨分化培养基进行。
所述软骨分化培养基优选为包括从胰岛素(insulin)、人转铁蛋白(humantransferrin)、亚硒酸钠(sodium selenite)、抗坏血酸(Ascorbic acid)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin；BSA)、地塞米松(dexamethasone)、脯氨酸(proline)和转化生长因子-β(TGF-β)构成的群中选择的一个以上成分的培养基，优选为包括所述所有成分。
根据本发明的实施例，是包括1％抗生素-抗真菌剂(antibiotic-antimycotic)、1.0mg/mL胰岛素(insulin)、0.55mg/mL人转铁蛋白(human transferrin)、0.5mg/mL亚硒酸钠(sodium selenite)、50μg/mL抗坏血酸(Ascorbic acid)、1.25mg/mL牛血清白蛋白(bovine serum albumin；BSA)、100nM地塞米松(dexamethasone)、40μg/mL脯氨酸(proline)及10ng/ml转化生长因子-β的杜尔贝科改良伊格尔中高葡萄糖(Dulbecco'sModified Egle Medium-High Glucose；DMEM-HG)。
制造所述软骨再生用组合物的方法包括(d)将所述细胞团块在软骨分化培养基进行培养的步骤。
软骨分化培养基的细胞球培养随着培养时间，压缩强度、粘附性和涂抹性会发生变化，为了在患部提供适当的软骨再生用组合物可设置培养期间。优选为，培养可由三维培养形成，培养期间为4周以内，优选为1天至21天，更优选为进行3周。
本发明还可提供包括所述胚胎软骨组织源性细胞及胚胎软骨组织源性细胞外基质的软骨再生用组合物为有效成分的软骨缺陷疾病治疗用药剂学组合物。
所述包括胚胎软骨组织源性细胞及胚胎软骨组织源性细胞外基质的软骨再生用组合物如上所述。
软骨缺陷疾病如上所述，“软骨缺陷疾病”指的是软骨、软骨组织和/或关节组织(滑膜、关节囊和软骨下骨等)因机械性刺激或炎症反应而受到损害的软骨缺陷、损伤及缺损引发的疾病。这种软骨缺陷疾病为退行性关节炎、风湿性关节炎、骨折、肌肉组织损伤、足底筋膜炎、网球肘、钙化性肌腱炎、骨折愈合不良或由外伤导致的关节损伤，但并不限于此。
根据本发明的治疗用药剂学组合物不仅包括作为有效成分的所述软骨再生用组合物，还附加地包括药剂学上许可的载体。
包括在本发明的药剂学组合物的药剂学所许可的载体作为制剂时通常利用的，包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、洋槐树胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、细微结晶性纤维素、纤维素、聚乙烯吡络烷酮、纤维素、水、糖稀、甲基乙基纤维素、甲基-羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油等，但不限于此。本发明的药剂学组合物除所述成分以外，还可包括润滑剂、湿润剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂和保存剂等。适当的药剂学方面许可的载体和制剂在雷明登氏药学全书(Remington's PharmaceuticalSciences)(19th ed.,1995)有详细的记载。
本发明的药剂学组合物可由肠外注入，在肠外注入时，优选为可直接投在软骨缺损、损伤或缺陷部位。
本发明的药剂学组合物的适当注入量(优选为，移植量)根据制剂化方法、注入方式、患者年龄、体重、性别、病情及反应感应性等因素，可采取多种处方。另外，本发明的药剂学组合物的注入量(优选为，移植量)可根据患部的大小及种类有所不同，优选为患部的每cm3可注入(移植)2至5个软骨再生用组合物，更优选为3至4个软骨再生用组合物。
本发明的药剂学组合物优选为提供在患部直接可注入的包括软骨再生用组合物的药剂学组合物。根据本发明的一个实施例，可在患部直接注入的软骨再生用组合物有可能是注射剂形态。
将包括本发明的软骨再生用组合物作为有效成分，在患部直接注入的药剂学组合物可由在患部直接注入的形态定型，优选为注入方式及制剂中一个是注射剂。注射剂可使用生理盐水、汉克(Hank)溶液或灭菌水溶液等的水性溶剂、橄榄油等的植物油、油酸乙酯等高级脂肪酸酯及乙醇、苄醇、丙二醇、聚乙二醇或丙三醇等非水溶性剂等制造，为穿透黏膜壁垒可使用本业界公认的非浸透性制剂，还可包括作为防止变质的稳定剂使用的抗坏血酸、亚硫酸氢钠、叔丁基对羟基茴香醚(butylated hydroxyanisole，BHA)、生育酚、EDTA等以及乳化剂、用于调节pH的缓冲剂、硝酸苯汞、硫汞撒、杀藻胺、苯酚、甲酚和苄醇等阻止微生物发育的保存剂等药剂学许可的载体。
本发明还可提供将包括胚胎软骨组织源性细胞及胚胎软骨组织源性细胞外基质的软骨再生用组合物的药剂学有效的量注入给(优选为，移植)患者来治疗软骨缺陷疾病的方法。例如，所述注入无限定的使用体内移植时使用的方法，从而可移植到体内。
本发明还在制造用于治疗软骨缺陷疾病的药剂中，提供包括所述胚胎软骨组织源性细胞及胚胎软骨组织源性细胞外基质的软骨再生用组合物的用途。
本发明还提供用于软骨缺陷疾病治疗的包括所述胚胎软骨组织源性细胞及胚胎软骨组织源性细胞外基质的软骨再生用组合物。
在本发明的用途、组合物、治疗方法中所提及的事项在不自相矛盾的情况下同样地适用。
(发明效果)
根据本发明的软骨再生用组合物，可在无人工支架情况下制作适用于软骨的适当大小的三维组织，组合物不仅可按胶状体注入，也具有高的涂抹性和粘附性，因此，与注入部位的软骨缺损的大小及形状无关，可方便地进行移植。此外，可呈现与宿主的高结合亲和力，且具有成熟的软骨组织的表型，从而具有良好的软骨再生功效。
附图说明
图1是示出本发明的软骨再生用组合物制造方法的模式图。
图2是示出根据本发明的一个实施例，培养1周、2周或3周而制造的胶形态的软骨再生用组合物的外观照片及组织的体积。
图3是示出根据本发明的一个实施例，对培养1周、2周或3周而制造的胶形态的软骨再生用组合物进行番红O(Safranin-O)染色及苏木精-伊红(Hematoxylin&Eosin)染色的照片。
图4是示出根据本发明的一个实施例，培养1周、2周或3周而制造的软骨再生用组合物的水分含量、DNA含量、糖胺聚糖及羟基脯氨酸含量。
图5是示出根据本发明的一个实施例注入在制造的软骨再生用组合物及来自体外(ex vivo)的软骨再生用组合物的物理性强度(杨氏模量(young’s modulus)，kPa)的确认结果。
图6是示出根据本发明的一个实施例，用肉眼确认制造的软骨再生用组合物和由婴儿软骨细胞制造的软骨再生用组合物的蛋白糖的量，而进行组织学染色(Safranin O)的确认结果。
图7是示出根据本发明的一个实施例，培养1周、2周或3周而制造的胶形态的软骨再生用组合物的涂抹性(散开程度)确认结果。
图8是示出根据本发明的一个实施例，培养1周、2周或3周而制造的胶形态的软骨再生用组合物的粘附性确认结果。
图9是示出根据培养基构成，确认软骨再生用组合物的形成程度的结果。
图10是示出根据本发明的一个实施例制造的软骨再生用组合物移植到人类软骨块(human cartilage block)后，在裸鼠皮下培养之后进行组织学染色及免疫染色的结果。
图11是示出根据标注荧光表达因子PKH-26的本发明的一个实施例制造的软骨再生用组合物的荧光散发的确认结果。
图12是示出根据标注荧光表达因子PKH-26的本发明的一个实施例制造的软骨再生用组合物移植到受损软骨部位并确认软骨损伤部位的粘附结果。
图13是示出根据本发明的一个实施例制造的软骨再生用组合物移植到兔子膝盖软骨损伤模型，并通过组织学分析移植后确认软骨损伤再生的结果。
图14是示出根据本发明的一个实施例制造的软骨再生用组合物移植到猴子膝盖软骨损伤模型，并通过核磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging，MRI)确认软骨损伤再生的结果。
图15是示出根据本发明的一个实施例制造的软骨再生用组合物移植到猴子膝盖软骨损伤模型，并通过组织染色学确认软骨损伤再生的结果。
具体实施方式
以下，通过实施例可更详细地就本发明进行说明。这些实施例仅为本发明的范例，但本发明的范围并非因这些实施例而被解释为受局限。
<实施例1>软骨再生用组合物的制造
用于制造软骨再生用组合物的制造步骤的模式图在图1示出，且制造方法如下。
为了制造包括胚胎软骨组织源性细胞及胚胎软骨组织源性细胞外基质的软骨再生用组合物，从10～15周的胚胎(出处：亚洲大学医院伦理委员会批准的IRB NO.AJIRB-MED-SMP-10-268)的膝关节分离软骨前驱细胞。
具体地，将从膝关节分离的软骨组织用PBS(phosphated buffered saline，磷酸盐缓冲液)洗涤之后，在37℃、5％CO2的保育箱以包括0.2％(w/v)胶原酶(collagenase,Worthington Biochemical Corp.,Lakewood,NJ)的DMEM(Dulbecco's Modified EgleMedium,Gibco,Grand Island,NY)培养4个小时。将软骨组织完全被消化且被放出的软骨细胞在1700rpm进行10分钟的圆心分离之后，将沉淀的软骨前驱细胞接种到组织培养盘(在每个培养盘1×106cells密度的150mm(dia.)×20mm(h))。
将所述软骨前驱细胞(chondrocytes)在添加10％的FBS(fetal bovine serum，牛胎儿血清)、50units/mL青霉素及50μg/mL链霉素的DMEM以2×105cells进行稀释之后，单层培养15～18天。培养之后去除培养基，添加0.05％胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Gibco)获得与细胞外基质结合的细胞膜。细胞及细胞外基质结合的细胞膜的获得在0.05％的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Gibco)进行处理之后，不用吸液管分离细胞，一次性获得包括细胞及细胞外基质的细胞膜全部。
将获得的包括细胞及细胞外基质的细胞膜注入到包括软骨分化培养基(1％抗生素-抗真菌剂(antibiotic-antimycotic)，1.0mg/mL胰岛素(insulin)，0.55mg/mL人转铁蛋白(human transferrin)，0.5mg/mL亚硒酸钠(sodium selenite)，50μg/mL抗坏血酸(Ascorbic acid)，1.25mg/mL牛血清白蛋白(bovine serum albumin；BSA)，100nM地塞米松(dexamethasone)，40μg/mL脯氨酸(proline)及包括10ng/ml TGF-β的Dulbecco'sModified Egle Medium-High Glucose；DMEM-HG)的50ml管中，在250xg进行20分钟的圆心分离制造出球形态的结构体。
将制造的细胞球放在带有与所述构成相同的软骨分化培养基的培养盘中，并在37℃的含有5％二氧化碳的保育箱培养1周、2周及3周来制造软骨再生用组合物。
根据所述制造方法制造的软骨再生用组合物的照片及组织体积在图2示出。图2的A示出组织的肉眼图片(每个刻度1mm)，图2的B示出组织的体积。如在图2所确认，根据软骨再生用组合物的制造，制造了胶状组合物，且确认了其大小及体积根据培养时间增加。这是从细胞球根据培养以球形增殖细胞及细胞外基质而被制造，属于胶状且被确认为容易形成模样变形。
<实施例2>软骨再生用组合物的组织学分析
从所述实施例1的细胞球到软骨再生用组合物的制造过程中，每过1周就用4％甲醛水进行固定之后，嵌入石蜡并以4μm厚度切割之后，为了检测出积累的硫酸化的蛋白聚糖，在横断面进行番红O(Sarfanin-O)染色和苏木精-伊红(H&E)染色。
其结果在图3示出。
如图3所确认，随着从1周到3周的时间推移，确认了在苏木精-伊红(H&E)中，细胞间距变宽且细胞模样与软骨细胞变得类似。此外，番红O(Sarfanin-O)染色作为染色蛋白糖的方法，确认了在2周、3周蛋白糖的表达增加且形成了可在软骨发现的腔隙(lacuna)。
<实施例3>软骨再生用组合物的总糖胺聚糖(GAG)含量及组合物构成分析
在所述实施例1中，测量了进行1周、2周及3周培养的软骨再生用组合物的水分含量、DNA量、糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)和羟脯氨酸含量。
为此，所述软骨再生用组合物的水分含量将测量培养后重量并冻结烘干之后与烘干重量进行比较时的水分含量以％进行标注。DNA量利用皮科格林试剂盒(PicoGreen Kit)对1mg烘干重量中的DNA量进行了测量。糖胺聚糖(glycosaminoglycan)的含量在60℃木瓜蛋白酶溶液(5mM L-半胱酸铵，100mM Na2HPO4，5mM EDTA，木瓜蛋白酶型Ⅲ125μg/mL，pH7.5)分解16小时之后，12,000×g、10分钟进行圆心分离，由圆心分离的上层液和DMB(dimethylmethylene-blue，二甲基亚甲基蓝)比色测定法(colorimetric assay,Heide,T.R.and Gernot,J.,Histochem.Cell Biol.,112：271,1999)使用ELISAReader(酶标仪)(BIO-TEK,Instruments,INC.,美国)测量在550nm波长的吸光度。总胶原质含量融化在4NHCl溶液并在121℃进行10分钟处理之后，12,000×g、10分钟进行圆心分离并将圆心分离的上层液和chloramine T,dimethylamino-benzaldehyde(氯胺T，二甲氨基苯甲醛)进行混合，且使用ELISA Reader测量在480nm波长的吸光度。对照群使用了正常软骨。
其结果在图4示出。
如图4所确认，水分含量平均为95％，DNA量分别为1周6.88±1.01μg/㎎，2周5.74±0.40μg/㎎，3周5.05±0.77μg/㎎且随着时间的推移，可确认DNA量减少，但相比其大小变大可确认DNA量并无变化。以生化学方法分析的总GAG内容物分别为1周16.76±2.8μg/㎎(烘干重量)，2周35.87±5.1μg/㎎(烘干重量)及3周48.98±8.0μg/㎎(烘干重量)且随着培养期间的变长其含量呈现增长。特别地，考虑到天然软骨组织的GAG量约为62.8±5.1μg/㎎(烘干重量)，随着培养期间的变长呈现出软骨再生用组合物的总GAG含量接近天然软骨组织。羟脯氨酸的量分别以1周7.78±1.89μg/㎎，2周40±11.74μg/㎎，3周87.2±3.57μg/㎎随着培养期间的变长其含量呈现增长。
<实施例4>软骨再生用组合物的物理强度测量
使用Universal Testing Machine(万能试验机)(Model H5K-T,H.T.E,英国)确认了软骨再生用组合物的压缩强度。
在所述实施例1中，以培养1周、2周及3周制造的软骨再生用组合物为对象，首先在in vitro条件下测量了压缩强度，然后将在in vitro培养2周的软骨再生用组合物在exvivo模型下培养2周、4周、8周之后测量压缩强度并比较了由生体内培养的压缩强度变化。Ex vivo模型由如下的方法被制作。首先，回收对骨关节炎患者的膝软骨置换术后销毁的软骨组织(亚洲大学医院IRB NO.AJIRB-MED-SMP-11-205)，制造与实际软骨损伤类似模样的缺损之后，将所述软骨再生用组合物插入到缺损部位，并将此移植到白鼠皮下培养2周、4周、8周。
为了测量压缩强度，首先将各个试料(n＝6)拍成照片之后，利用图像J(image J)软件计算出断面积和高度。将各个试料以1mm/min速度一直按压到组织变形率(strain)达到20％为止之后，测量变形率(strain)在10～16％区间的Young’s modulus的值，且在图5示出in vitro结果和ex vivo结果。
如图5所确认，软骨再生用组合物在in vitro显示1周5.21kPa、2周10.62kPa、3周15.83kPa维持胶形状。但是，在ex vivo状态下以2周50.81kPa、4周155.58kPa、8周602.04kPa在体内环境中，随着时间的推移强度增加到与正常软骨组织类似的水准。
从上述结果，确认根据本发明的软骨再生用组合物注入到人体时，可具有与软骨组织类似的压缩强度。
<实施例5>根据细胞源差异确认软骨再生用组合物生成与否
使用不同的细胞源来确认了根据本发明的包括胚胎软骨组织源性细胞及胚胎软骨组织源性细胞外基质的软骨再生用组合物作为软骨材料的使用可能性。
为了与根据本发明实施例1的软骨再生用组合物进行对比，与实施例1的方法相同的进行制造，并将细胞源作为人类婴儿软骨细胞制造了软骨再生用组合物。
以上两种软骨再生用组合物均使用了为期3周在软骨培养基培养的组合物。将所述软骨再生用组合物以4％甲醛溶液进行固定之后，嵌入石蜡并以4μm厚度切割之后，在横断面进行番红O(Sarfanin-O)染色。
其结果在图6示出。
如图6所确认，人类婴儿软骨细胞人工软骨组织的情况，只在组织外部发现蛋白糖(proteoglycan)，但是，人类胚胎软骨前驱细胞人工软骨组织的情况，确认蛋白糖在组织整体均匀地分布，并确认了根据本发明的软骨再生用组合物的良好的效果。即，确认了以细胞源只使用胚胎软骨前驱细胞和其细胞外基质，才可制造本发明的软骨再生用组合物。
<实施例6>软骨再生用组合物涂抹性分析
使用Universal Testing Machine(Model H5K-T,H.T.E,英国)测量了在所述实施例1制造的软骨再生用组合物的涂抹性(散开的程度)。
考虑到软骨再生用组合物物理特性设置了对涂抹性测量的实验方法。测量软骨再生用组合物(n＝6)的重量且平放在底面之后，利用夹具以1mm/min的速度在1秒钟内将5N的力垂直地添加到试料。拍摄试料的照片之后，由图像J(image J)软件分析影像并计算试料散开在底部的面积。
其结果在图7示出。
图7的A示出肉眼确认涂抹性的结果，图7的B示出将其数值化的结果。如图7所确认，分析根据培养时间的试料涂抹性的结果显示为1周1.09±0.062mm2mg、2周0.77±0.001mm2/mg、3周0.48±0.004mm2/mg，因此确认了随着时间的推移单位重量的涂抹性减少。这显示出与在所述实施例4中根据培养时间的经过，软骨再生用组合物的强度变高且组织变得坚硬的结果具有关联性。
一般公知的软骨再生用材料只将着重点放在承受荷载的强度方面进行了技术开发，但是，存在着软骨再生用材料不能适当地涂抹在软骨损伤部位的问题。
也就是说，确认了根据本发明的软骨再生用组合物与现有的软骨再生用材料不同，将其插入到软骨损伤部位时，显示出按损伤部位的形状散开并涂抹的特征。
<实施例7>软骨再生用组合物的粘附性分析
使用Universal Testing Machine(Model H5K-T,H.T.E,英国)测量了在所述实施例1制造的软骨再生用组合物的粘附性。
将人工关节手术后销毁的患者的软骨组织与同意书一同得到了捐赠。在患者的软骨组织表面使用6mm biopsy punch(活检穿孔器)制作软骨损伤模型，并插入了制造的软骨再生用组合物。此后，接触在插入直径为5mm夹具的软骨再生用组合物并粘附之后，测量了以1.3mm/min的速度拉动直至夹具与软骨再生用组合物分离为止时的抵抗力。将胶形态的生体材料的藻酸盐(alginate)相同地插入软骨损伤模型，比较了粘附性。
其结果在图8示出。
图8的A是以上述实验模型利用成人软骨组织制作全层软骨损伤(chondraldefect)进行测试粘附性结果的图片，图8的B示出确认根据培养时间的软骨再生用组合物的粘附性变化的结果。
如图8的B所确认，分析根据培养时间的试料粘附性结果，以1周2.624±0.154kPa、2周1.799±0.146kPa、3周1.058±0.067kPa随着时间的推移软骨再生用组合物和患者软骨组织的粘附力一点点的减少，但是，确认了相比用于对照群的藻酸盐(0.094±0.014kPa)具有明显高的粘附力。
从上述结果确认了，根据本发明的软骨再生用组合物相比现有的胶形态的试料，具有非常高的粘附力并且根据培养时间可将粘附力调整为适当的水准。
<实施例8>根据培养基组成的软骨再生用组合物生成与否的确认
为了确认根据培养基组成变化的软骨再生用组合物的生成变化，在变更培养基组成的情况下与实施例1的方法相同地制造了软骨再生用组合物。
在所述实施例1，以培养3周制造的软骨再生用组合物和包括牛血清的分化培养基(培养基组成：包括1％抗生素-抗真菌剂(antibiotic-antimycotic)，1.0mg/mL胰岛素(insulin)，0.55mg/mL人转铁蛋白(human transferrin)，0.5mg/mL亚硒酸钠(sodiumselenite)，50μg/mL抗坏血酸(Ascorbic acid)，100nM地塞米松(dexamethasone)，40μg/mL脯氨酸(proline)及10ng/ml TGF-β的Dulbecco's Modified Egle Medium-High Glucose；DMEM-HG)作为培养基，并通过番红O(Sarfanin-O)染色分析培养3周制造的组合物。将上述各个组合物以4％甲醛溶液进行固定之后，嵌入石蜡并由4μm厚度切割之后，在横断面进行了番红O(Sarfanin-O)染色。
其结果在图9示出。
如图9所确认，在软骨分化培养基(培养基1)制造的软骨再生用组合物经过整个细胞确认了GAG，但是，在包括牛血清的分化培养基(培养基2)制造的组合物被确认为只在表面留有软骨的GAG，而中心部的细胞被消灭。
从所述结果确认了根据本发明的软骨再生用组合物的制造中，软骨培养基属于适合的培养基构成。
<实施例9>软骨再生用组合物的组织学及免疫学特性的确认
将根据实施例1在软骨培养基培养2周制造的软骨再生用组合物，以与软骨损伤模型同样的模样制作块并移植之后，在裸鼠皮下培养2、4、8、12周(w)，并将一般用于临床的自体骨软骨移植术(Osteochondral Autologous Transplantation,OAT)作为对照群进行了使用。提取相应组织并将各个block(块)以4％甲醛溶液进行固定之后，嵌入石蜡并以4μm厚度进行切割之后，为了肉眼确认在横断面的番红O(Safranin-O)染色和胶原质的量，进行了免疫组织化学性染色。免疫染色确认了第1胶原质和第2胶原质。
其结果在图10示出。
如图10所确认，确认了移植软骨再生用组合物之后，随着时间的推移显示出与正常软骨类似的形态。具体地说，确认了可确认蛋白糖量的番红O(Safranin-O)在移植2周之后几乎没有表达，但是，确认了随着时间的推移与正常软骨类似。软骨被脱分化时，第1胶原质的量会增加，但是，被分化为软骨并由正常透明软骨分化时，第2胶原质的量会增加。在exvivo下，在2周内第1、2胶原质没被染色，但随着4周、8周的时间推移，显示出第2胶原质的表达增加。在12周之后，第2胶原质的量呈现出与正常软骨类似的结果。特别地，确认了软骨中最多的胶原蛋白的II型胶原(type II collagen)的表达，在第12周达到了与正常软骨类似的水准。
<实施例10>标注荧光表达因子PKH-26的软骨再生用组合物的体内粘附的确认
根据所述实施例1，在软骨培养基培养标注为在细胞表面标注的荧光表达因子PKH-26的细胞，制造软骨再生用组合物，并在培养第1天和第7天确认了PKH-26表达与否。
其结果在图11示出。如图11所示，确认了在in vitro中软骨再生用组合物的荧光因子的表达较好地形成。
此后，将制作的软骨再生用组合物移植到了白鼠的部分软骨损伤模型。
具体地，切开达到8周的白鼠膝盖并由12号刮勺来刮大腿骨(femur)软骨部分造成损伤之后，移植了粘附PKH-26荧光标注因子的软骨再生用组合物。
移植后第3天和第7天后，将移植部位的膝盖分离并利用冷冻切片机由4μm厚度切割后制作了片。使用光学显微镜和荧光显微镜确认部分软骨损伤部位的组织和荧光表达，调查移植的软骨再生用组合物是否有残留。其结果在图12示出。
如图12所确认，涂抹软骨再生用组合物的3天之后及7天之后，确认了软骨再生用组合物都粘附在软骨损伤部位。
从上述结果确认了在in vivo根据本发明的软骨再生用组合物可涂抹并粘附在患部。
<实施例11>从兔子的部分软骨损伤模型确认软骨再生用组合物移植带来的软骨再生效果
根据本发明实施例1，在in vitro下将在软骨培养基培养2周的软骨再生用组合物，移植到如实施例9制作的兔子的部分层软骨损伤模型。
移植后6周、12周之后，通过肉眼确认了软骨组织的再生，并由组织学染色的番红O(Saranin-O)染色方法确认了损伤部位的恢复。
其结果在图13示出。
在图13中，ACI显示自体软骨细胞移植群，Defect(缺损)显示无处理群及在invitro 2周(w)显示利用在软骨分化培养基培养2周的软骨再生用组合物的实验结果。
如图13所确认，经过根据本发明的软骨再生用组合物移植后6周及12周时，确认了软骨组织恢复与正常组织类似几乎无法确认软骨损伤部位，且确认了这种效果是与阳性对照群的自体软骨细胞移植群几乎相同的水准。
<实施例12>从猴子膝盖软骨损伤模型确认软骨再生用组合物移植带来的软骨再生效果
在猴子膝盖大腿骨(femur)medial condyle(内侧踝)部分利用3mm biopsy punch制作了软骨损伤模型。在损伤的软骨缺损部位移植在in vitro培养2周的软骨再生用组合物，并在8周、16周、24周期间拍摄MRI确认了软骨再生程度。对照群使用了未进行任何处理的群。
所述动物模型的软骨再生效果通过MRI、番红O(Safranin-O)染色及苏木精-伊红(Hematoxylin&Eosin)染色被确认。
图14示出通过MRI分析的实验结果。如图14所确认，在24周期间的MRI结果中可确认随着时间的推移，在移植软骨再生用组合物的群形成软骨，且24周后牺牲动物并通过肉眼观察时也确认了再生为正常软骨以至于看不到移植的部位。
此外，在图15中确认了通过番红O(Safranin-O)染色及苏木精-伊红(Hematoxylin&Eosin)染色结果未进行任何处理的对照群(Control)的软骨坍塌且蛋白糖的量减少，但是，移植软骨再生用组合物的实验群(Artipaste)的软骨受损部位恢复为正常。此外，不只是在移植部位的大腿骨(femur)部分，对照群为trochlea(滑车)部分和lateral condyle(外侧踝)部分也发生损伤并软骨坍塌，但是，移植软骨再生用组合物的群中可知移植的部位形成了软骨，而且对周围组织不带来影响。

Claims (14)

1.一种软骨再生用组合物，其特征在于，包括胚胎软骨组织源性细胞及胚胎软骨组织源性细胞外基质，
其中，所述组合物为胶状，且在在体外状态下具有如下物质性质：
以1mm/min速度按压时，杨氏模量为20kPa以下的压缩强度；
以1mm/min速度在1秒钟内将5N的力垂直地给予试料时，散开的程度为0.1至2.0mm2/mg的涂抹性；以及
在直径5mm的夹具和患部接触物质并进行粘附之后，以1.3mm/min的速度拉动直至分离时的力的大小为0.5至5.0kPa的粘附强度。
2.根据权利要求1所述的软骨再生用组合物，其特征在于，所述软骨再生用组合物具有如下物质性质：
以1mm/min速度按压时，杨氏模量为0.2至20kPa的压缩强度；
以1mm/min速度在1秒钟内将5N的力垂直地给予试料时，散开的程度为0.2至1.7mm2/mg的涂抹性：以及
在直径5mm的夹具和患部接触物质并进行粘附之后，以1.3mm/min的速度拉动直至分离时的力的大小为0.9至4.5kPa的粘附强度。
3.根据权利要求1所述的软骨再生用组合物，其特征在于，所述软骨再生用组合物在生体条件下，糖蛋白和第2胶原质的表达增加而呈现成熟软骨的特性。
4.一种制造软骨再生用组合物的方法，其特征在于，所述软骨再生用组合物包括胚胎软骨组织圆形细胞及胚胎软骨组织源性细胞外基质，制造方法的步骤包括：
(a)从胚胎软骨组织中分离软骨前驱细胞进行培养；
(b)获得包括所述培养的软骨前驱细胞及其细胞外基质的细胞膜；
(c)将所述获得的细胞膜进行圆心分离，获得细胞团块；以及
(d)将所述细胞团块在软骨分化培养基进行培养。
5.根据权利要求4所述的制造软骨再生用组合物的方法，其特征在于，所述(b)步骤的细胞膜的获得是无需细胞的分离步骤，与粘附在底面的细胞一起，将细胞外基质全部包括在内进行获得。
6.根据权利要求4所述的制造软骨再生用组合物的方法，其特征在于，所述(d)步骤的软骨分化培养基包括从胰岛素、人转铁蛋白、亚硒酸钠、抗坏血酸、牛血清白蛋白、地塞米松、脯氨酸和转化生长因子-β构成的群中选择的一个以上成分。
7.根据权利要求4所述的制造软骨再生用组合物的方法，其特征在于，所述(d)步骤的培养期间为4周之内。
8.根据权利要求4所述的制造软骨再生用组合物的方法，其特征在于，根据所述培养期间调整软骨再生用组合物的压缩强度、粘附性和涂抹性。
9.一种软骨再生用组合物，根据权利要求4至8中任意一项所述的制造软骨再生用组合物的方法进行制造。
10.一种软骨缺陷疾病治疗用药剂学组合物，其有效成分包括权利要求1至3中任意一项所述的软骨再生用组合物。
11.根据权利要求10所述的软骨缺陷疾病治疗用药剂学组合物，其特征在于，所述软骨缺陷疾病是从退行性关节炎、风湿性关节炎、骨折、肌肉组织的损伤、足底筋膜炎、网球肘、钙化性肌腱炎、骨折愈合不良及由外伤导致的关节损伤中选择的任何一个。
12.一种治疗软骨缺陷疾病的方法，其将根据权利要求1至3中任意一项所述的软骨再生用组合物的药剂学有效量注入给患者。
13.一种根据权利要求1至3中任意一项所述的软骨再生用组合物的用途，用于软骨缺陷疾病治疗的药剂制造。
14.一种根据权利要求1至3中任意一项所述的软骨再生用组合物，用于软骨缺陷疾病的治疗。
CN201780061241.9A 2016-08-02 2017-08-02 软骨再生用组合物及其制造方法 Active CN109789246B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2016-0098658 2016-08-02
KR1020160098658A KR101836475B1 (ko) 2016-08-02 2016-08-02 연골 재생용 조성물 및 이의 제조방법
PCT/KR2017/008353 WO2018026198A1 (ko) 2016-08-02 2017-08-02 연골 재생용 조성물 및 이의 제조방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109789246A true CN109789246A (zh) 2019-05-21
CN109789246B CN109789246B (zh) 2022-06-17

Family

ID=61073874

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780061241.9A Active CN109789246B (zh) 2016-08-02 2017-08-02 软骨再生用组合物及其制造方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US11801331B2 (zh)
EP (1) EP3517144B1 (zh)
JP (1) JP6980004B2 (zh)
KR (1) KR101836475B1 (zh)
CN (1) CN109789246B (zh)
WO (1) WO2018026198A1 (zh)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102586164B1 (ko) * 2019-03-28 2023-10-10 아주대학교산학협력단 조직 접착 및 분화 특성을 갖는 조직 유합용 조성물 및 이의 제조방법
JP2022528378A (ja) * 2019-03-28 2022-06-10 アジュ ユニバーシティー インダストリー－アカデミック コーオペレイション ファウンデーション 組織接着及び分化特性を有する組織癒合用組成物及びその製造方法
KR102334886B1 (ko) * 2019-07-17 2021-12-06 아주대학교산학협력단 성장판 재생용 조성물
KR20210009634A (ko) * 2019-07-17 2021-01-27 아주대학교산학협력단 척추 수핵 재생용 조성물
KR102553921B1 (ko) * 2020-10-18 2023-07-07 에이템즈 주식회사 연골조직 유래 세포외 기질을 유효성분으로 함유하는 관절염 예방 또는 치료용 약학조성물
AU2021388342A1 (en) * 2020-11-27 2023-07-13 Kangstem Biotech Co., Ltd. Method for preparing injectable injection composition derived from animal cartilage, and use thereof
CN114848915A (zh) * 2021-01-20 2022-08-05 上海软馨生物科技有限公司 一种耳软骨组织工程复合物及其用途
CN114848914A (zh) * 2021-01-20 2022-08-05 上海软馨生物科技有限公司 一种软骨组织工程复合物及其用途
CN114796612A (zh) * 2021-01-22 2022-07-29 上海软馨生物科技有限公司 一种基于大孔径的组织工程支架及其用途
CN115944781A (zh) * 2021-10-09 2023-04-11 上海软馨生物科技有限公司 一种基于3d打印的软骨组织工程复合物及其用途

Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050074477A1 (en) * 2002-11-07 2005-04-07 Olivera Josimovic-Alasevic Method for the treatment of diseased, degenerated, or damaged tissue using three dimensional tissue produced in vitro in combination with tissue cells and/or exogenic factors
US20070184550A1 (en) * 2005-08-02 2007-08-09 Satoshi Miyauchi Artificial cartilage tissue and production method thereof
US20080159994A1 (en) * 2005-01-28 2008-07-03 Sakis Mantalaris Methods for embryonic stem cell culture
CN101248172A (zh) * 2005-01-28 2008-08-20 诺瓦塞拉有限公司 胚胎干细胞培养方法
CN101563450A (zh) * 2006-09-21 2009-10-21 利真普膜股份有限公司 细胞衍生细胞外基质膜的制备方法
US20100119577A1 (en) * 2007-05-06 2010-05-13 Byoung-Hyun Min Therapeutic composite for cartilage disorder using extracellular matrix (ecm) scaffold
CN102526806A (zh) * 2012-01-20 2012-07-04 陕西博鸿生物科技有限公司 一种组织工程软骨及其制备方法
WO2013008174A1 (en) * 2011-07-11 2013-01-17 Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (Chuv) Preparation of parental cell bank from foetal tissue
KR20140016841A (ko) * 2012-07-30 2014-02-10 아주대학교산학협력단 태아연골조직유래 줄기세포원 및 이를 포함하는 세포치료제
CN104204191A (zh) * 2012-02-29 2014-12-10 蒂斯由斯股份有限公司 3d体外双相软骨-骨构建物
KR20150067518A (ko) * 2013-12-10 2015-06-18 인제대학교 산학협력단 연골세포 유래 세포외 기질막을 유효성분으로 함유하여 수술 후 유착 방지용 조성물
CN105039247A (zh) * 2015-07-13 2015-11-11 暨南大学 一种用于诱导干细胞向成软骨分化的制剂及制备方法与应用
JP2016067311A (ja) * 2014-09-30 2016-05-09 株式会社ジーシー 軟骨分化培養液、及び軟骨組織
CN105754937A (zh) * 2016-03-31 2016-07-13 北京大学第三医院 一种促进软骨分化的细胞共培养体系及其制备方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007052935A1 (en) 2005-10-31 2007-05-10 Modern Cell & Tissue Technologies Inc. Artificial cartilage containing chondrocytes obtained from costal cartilage and preparation process thereof
KR101340458B1 (ko) 2010-11-02 2013-12-11 서울대학교산학협력단 하이드로겔을 포함하는 연골 이식용 조성물
KR20160095677A (ko) * 2015-02-03 2016-08-12 아주대학교산학협력단 연골결손 치료용 조성물 및 인공연골 제조방법
KR101718669B1 (ko) * 2016-12-16 2017-03-21 아주대학교산학협력단 연골결손 치료용 조성물 및 인공연골 제조방법

Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050074477A1 (en) * 2002-11-07 2005-04-07 Olivera Josimovic-Alasevic Method for the treatment of diseased, degenerated, or damaged tissue using three dimensional tissue produced in vitro in combination with tissue cells and/or exogenic factors
US20080159994A1 (en) * 2005-01-28 2008-07-03 Sakis Mantalaris Methods for embryonic stem cell culture
CN101248172A (zh) * 2005-01-28 2008-08-20 诺瓦塞拉有限公司 胚胎干细胞培养方法
US20070184550A1 (en) * 2005-08-02 2007-08-09 Satoshi Miyauchi Artificial cartilage tissue and production method thereof
CN101563450A (zh) * 2006-09-21 2009-10-21 利真普膜股份有限公司 细胞衍生细胞外基质膜的制备方法
US20100119577A1 (en) * 2007-05-06 2010-05-13 Byoung-Hyun Min Therapeutic composite for cartilage disorder using extracellular matrix (ecm) scaffold
WO2013008174A1 (en) * 2011-07-11 2013-01-17 Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (Chuv) Preparation of parental cell bank from foetal tissue
CN102526806A (zh) * 2012-01-20 2012-07-04 陕西博鸿生物科技有限公司 一种组织工程软骨及其制备方法
CN104204191A (zh) * 2012-02-29 2014-12-10 蒂斯由斯股份有限公司 3d体外双相软骨-骨构建物
KR20140016841A (ko) * 2012-07-30 2014-02-10 아주대학교산학협력단 태아연골조직유래 줄기세포원 및 이를 포함하는 세포치료제
KR20150067518A (ko) * 2013-12-10 2015-06-18 인제대학교 산학협력단 연골세포 유래 세포외 기질막을 유효성분으로 함유하여 수술 후 유착 방지용 조성물
JP2016067311A (ja) * 2014-09-30 2016-05-09 株式会社ジーシー 軟骨分化培養液、及び軟骨組織
CN105039247A (zh) * 2015-07-13 2015-11-11 暨南大学 一种用于诱导干细胞向成软骨分化的制剂及制备方法与应用
CN105754937A (zh) * 2016-03-31 2016-07-13 北京大学第三医院 一种促进软骨分化的细胞共培养体系及其制备方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BRIAN J.HUANG等: "Effects of passage number and post-expansion aggregate culture on tissue engineered, self-assembled neocartilage", 《ACTA BIOMATERIALIA》 *
CHOI ET AL.: "Establishment of stem cell lines from human fetal cartilage for organ engineering", 《MEDICAL-HIGH TECH CONVERGENCE TECHNOLOGY DEVELOPMENT》 *
CHOI等: "Fetal Cartilage-Derived Cells Have Stem Cell Properties and Are a Highly Potent Cell Source for Cartilage Regeneration", 《CELL TRANSPLANTATION》 *
JIN等: "Scaffold-Free Cartilage Fabrication System Using Passaged Porcine Chondrocytes and Basic Fibroblast Growth Factor", 《TISSUE ENGINEERING PART A》 *
PARK等: "Scaffold-free, engineered porcine cartilage construct for cartilage defect repair-In vitro and in vivo study", 《ARTIFICIAL ORGANS》 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2019523289A (ja) 2019-08-22
EP3517144A4 (en) 2020-07-22
US20190184061A1 (en) 2019-06-20
KR101836475B1 (ko) 2018-03-08
CN109789246B (zh) 2022-06-17
EP3517144B1 (en) 2024-05-01
WO2018026198A1 (ko) 2018-02-08
EP3517144A1 (en) 2019-07-31
JP6980004B2 (ja) 2021-12-15
US11801331B2 (en) 2023-10-31
KR20180015041A (ko) 2018-02-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109789246A (zh) 软骨再生用组合物及其制造方法
JP6676022B2 (ja) インビボバイオリアクターを使用する軟骨の修復のための方法および組成物
CN101589139B (zh) 包含获得自肋软骨的软骨细胞的人工软骨及其制备方法
CN102145195B (zh) 修复软骨损伤之外科移植物
US20070104692A1 (en) Breast tissue regeneration
Barnewitz et al. Treatment of articular cartilage defects in horses with polymer-based cartilage tissue engineering grafts
González-Fernández et al. Assessment of regeneration in meniscal lesions by use of mesenchymal stem cells derived from equine bone marrow and adipose tissue
CN101035890B (zh) 经物理/物理化学刺激处理的无定形细胞递送载体
KR101718669B1 (ko) 연골결손 치료용 조성물 및 인공연골 제조방법
CN109152864A (zh) 一种用于制备三维软骨类器官块的方法
US20220105243A1 (en) Engineering mechanically functional human cartilage and method of making same
CN105452447A (zh) 用于软骨细胞应用的脂肪细胞
CN101432419A (zh) 保持、改善和恢复软骨细胞的软骨表型的方法
KR20160095677A (ko) 연골결손 치료용 조성물 및 인공연골 제조방법
CN108865986A (zh) 用于修复关节软骨损伤/缺损的间充质干细胞制剂及其制备方法和应用
CN104667348A (zh) 一种含有海藻酸钠的药用组合物及其制备方法
CN102971019B (zh) 用于复杂组织工程化的方法
JP2005000143A (ja) 移植用軟骨細胞の製法
CN107693844A (zh) 一种组合物凝胶与应用
CN111514374A (zh) 一种基于共培养系统构建的组织工程软骨促进软骨修复的方法
KR20110032433A (ko) 세포이식술을 위한 혼합세포복합체인 세포스페로이드의 제조방법 및 이의 이용방법
Hoshi et al. Production of three-dimensional tissue-engineered cartilage through mutual fusion of chondrocyte pellets
KR20130102506A (ko) 성숙 낭성 기형종 유래 세포 및 조직의 용도
JP2017221438A (ja) 軟骨組織修復方法
Lee et al. Human iNSC-derived brain organoids of Niemann-Pick disease type C with cholesterol pathology

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant