CN101432419A - 保持、改善和恢复软骨细胞的软骨表型的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及能够恢复、保持或改善经扩增和传代的软骨细胞的稳定软骨表型的调节细胞。该调节细胞还能引导前体细胞和干细胞进入成软骨系。富集的调节细胞群可通过在PO软骨细胞单层培养的培养基中收获非粘附性细胞得到。

Description

保持、改善和恢复软骨细胞的软骨表型的方法
技术领域
本发明涉及软骨细胞扩充和软骨修复领域。本发明还涉及软骨的可控性细胞群可用于保持、改善或恢复诸如软骨细胞或软骨母细胞的成软骨细胞的软骨表型。
发明背景
关节软骨和半月软骨均在正常关节运动机制中起重要作用。关节软骨覆盖膝关节诸骨的末端。它由稀疏分布的包围在细胞外基质中的细胞(软骨细胞)组成，软骨基质由胶原、多种蛋白质/糖蛋白和携带称为粘多糖的负电荷多聚糖的高保水性的蛋白聚糖组成。半月软骨是以细胞出现在基质中成行和成束的胶原纤维中排列的陷窝中为特征的纤维软骨。关节软骨和/或半月软骨的损伤是影像数百万人的常见病患。该损伤由于成人关节软骨的弱的再生性和损伤带来的运动障碍和疼痛而变得复杂。近年来已提出几种软骨修复的模式。其中一种模式，“自体软骨细胞迁移”技术(ACT)，从健康逛街软骨收集细胞，进行培养扩增以得到足够的细胞数，并再植入关节或半月软骨缺损[Brittberg等(1994)N Engl.JMed.331，889-895]。细胞扩充必须从小的活检软骨获取以修复软骨缺损。ACT技术有例如软骨细胞在单细胞层培养中扩增具有与增加的传代数量去分化倾向的限制。这种去分化将导致基质的合成物与原始组织中的合成物具有不同的生物化学和生物机械特性。需要优化细胞培养条件和限制传代数量以保持软骨细胞的表型性质，包括在体内形成稳定的玻璃样软骨的能力，抵抗血管侵蚀和软骨内成骨。所有目前采用的ACT技术使用由取自原始活检通过细胞培养方法的扩充的软骨细胞群组成的细胞疗法。不可否认，这些细胞群包含不同数量的保持其表型稳定性的和不能稳定地朝形成关节软骨细胞分化的去分化细胞。这种情况在组织修复质量的临床研究中表现为从纤维软骨上玻璃样软骨到未显示修复的高度变异性中得到验证[Peterson等(2000)Clin Orthop Res.374，212-234]。这提示软骨细胞扩增的数量不足以达到实现成功移植的程度。
已采用多种努力以改进软骨细胞的质量或使用软骨细胞的替代来源。(WO0124833)描述了使用分子标记物作为软骨细胞扩增或传代的质量控制。这些标记物的使用能够确定一个软骨细胞群的传代数量是否能在移植后不明显损失软骨形成能力。已使用不同方法通过对软骨细胞增加不同基质组分(例如基底膜蛋白聚糖)以增加ACT的结果[French等(1999)J.Cell.Biol.145，1103-1115]。
也有报道环境基质对软骨细胞再生能力的影像。Graff等[2003，Biotechnol.Bioeing.82，457-464]描述了取自软骨的以存在原生细胞外基质(“软骨质”)为特征的一种细胞群，并记载了这些细胞相对于已在体外重建其细胞外膜的软骨细胞具有增强的软骨形成特性。
已描述软骨活检包括：除了典型的软骨细胞，还有具有不同形态和行为的小部分细胞。Kamil等[2004，Tissue Eng.10，139-144]描述了在扩增方案中为了获得更高的产量从软骨活检去除通常称为“泡沫细胞”的细胞群，并描述了这些细胞如何能够仍然被扩增。该报道建议除了经典的粘附软骨细胞部分软骨活检的其它部分也可用作成软骨细胞的来源。
尽管有多种方法扩增软骨细胞并验证其质量，仍不能在限定的传代数量中获得足够数量的表型稳定的软骨细胞，以改进低质量软骨细胞的特性或恢复不当处理后(例如，过度孵化或扩增)细胞特性的恢复。对于在ACT中对产生稳定数量高质量细胞的方法的需求，需要能够保证在活检中软骨细胞质量和数量的一致性、独立性的方法。
发明概述
本发明涉及可获自软骨的细胞群，当与有成软骨能力的细胞群组合时其具有调节效应，从而增加、诱导或恢复软骨细胞表型稳定性。该调节细胞群自然状态下表现为新鲜分离的软骨活检的一部分，但可基于其物理和/或生理属性富集和/或分离。已证实该细胞群冷冻时保持其调节能力，使存储调节细胞群(以富集形式或非富集形式)成为可能，例如在此期间须将成熟软骨细胞扩增至移植所需的足够大的数量。一旦获得足够数量的软骨细胞，该软骨细胞群与调节细胞群组合，组合后的细胞群准备供移植。
并且已发现该调节细胞群可在一定时间内通过采集从软骨活检的软骨细胞分离，如在接种后约2到5天和/或当粘附细胞达到培养容器的细胞非粘附部分的至少30％汇合时。
一方面，本发明提供富集本发明调节细胞群的方法。更具体地，本发明提供从分离的软骨样本富集调节细胞群的方法，所述方法包括以下步骤：(a)机械和/或酶处理分离的软骨样本以获取独立的细胞；(b)将所得独立细胞转移至细胞培养容器使软骨细胞以单层扩增；(c)将细胞培养容器置于合适的细胞培养条件中，从而获得粘附细胞群和包含非粘附细胞群的上清液；(d)至少2天后和/或当粘附细胞达到至少约30％汇合时从细胞培养容器收集包含非粘附细胞群的上清液；(e)从上清液收集相当于本发明调节细胞群的非粘附细胞群。
根据一实施方式，用于本发明富集方法的软骨样本是关节软骨或半月软骨的样本。
本发明富集方法通常始于用胶原酶A酶处理的软骨样本。
在另一方面，本发明提供富集的调节细胞群，该细胞群是用本文所述富集方法获得的非粘附性、非传代调节细胞群。
在又一方面，本发明提供本发明富集调节细胞群的不同应用。
根据第一实施方式，用本发明方法获得的富集调节细胞群被作为药物使用。
更具体地，本发明提供治疗软骨病患的方法包括：给软骨疾患患者输注本发明的富集调节细胞群。因此，本发明提供包含本发明富集调节细胞群的药物组合物。
更具体地，本发明提供涉及在关节软骨缺陷处形成微小裂口的治疗方法。病患处形成的微裂口使下方骨干细胞能进入关节软骨缺陷。然后，通过施加细胞性治疗形成体内软骨重建，根据本发明该治疗包括具调节功能的细胞群。在此重建过程中本发明调节细胞群引导间叶干细胞进入成软骨细胞系。
根据又一实施方式，富集的调节细胞群用于在体外改善、保持或恢复扩增或传代软骨细胞群的软骨细胞表型稳定性。
根据再一本发明实施方式，使用富集调节细胞群使间叶干细胞体外分化成成软骨细胞系。
在另一方面，本发明提供包含一种或多种不同细胞群的调节细胞群(富集形式或如本文的新鲜分离的软骨细胞)的组合物。
更具体地，本发明提供包含两种或多种不同细胞群的组合的组合物，所述细胞群包含：
—包含调节细胞的细胞群，其为(i)获自软骨活检的新鲜分离的软骨细胞群，或(ii)通过收集取自软骨活检新鲜分离的软骨细胞P0培养上清液的非粘附细胞的富集调节细胞群；和
—选自下组的一种或多种细胞群：传代的软骨细胞细胞群，间叶干细胞群，和软骨母细胞群。
更具体地，本发明提供包含两种或多种不同细胞群的组合的组合物，所述细胞群包括：富集的调节细胞群，富集的调节细胞的相对量范围通常是组合的组合物细胞总数的1到75％。
根据具体实施方式，出现在本发明的组合的组合物中的包含调节细胞的细胞群取自关节软骨或半月软骨。
本发明还提供调节细胞群(富集形式或如本文的新鲜分离的软骨细胞)与不同细胞群的联和的不同应用。
更具体地包含本发明调节细胞的细胞群的组合细胞群被作为一种药物。因此本发明提供包含本文所述组合细胞群的药物组合物。该组合细胞群也可用于支撑物供治疗用。
本发明提供了本发明调节细胞群(任选富集的)和第二细胞群的组合在制备治疗软骨病患的细胞治疗剂中的应用。因此提供治疗软骨病患的方法，包括给予软骨病患患者包含本发明调节细胞群和一种或多种其它细胞群的组合物
调节细胞群与其它细胞群组合可使用如较高传代数的软骨细胞供移植。并且，本发明方法使通过反复传代生成大量软骨细胞成为可能。过度传代后软骨细胞表型的最终减低可通过加入本发明调节细胞群得到恢复。
因此由于可获得具有稳定表型的大量软骨细胞，本发明细胞群的使用能够进行较大缺陷的细胞性治疗。或者，不依赖可用软骨细胞的数量，可使用本发明调节细胞群改进其质量。
本发明调节细胞群的使用改进了通常使用的ACT方法。
更具体地，本发明提供制备用于ACT移植的细胞群的方法，该方法包括以下步骤：
a)机械和/或酶处理分离的软骨样本以获取个体细胞，
b)将所获个体细胞转入细胞培养容器以使软骨细胞单层扩增，
c)保持培养容器在合适的细胞培养条件，获得粘附细胞群和包含非粘附细胞群的上清液，
d)在至少2天后或一旦至少培养容器中约30％粘附细胞汇合，从培养容器收集包含非粘附细胞群的上清液，
e)从所述上清液收集所述非粘附细胞，
f)将所获非粘附细胞群与成软骨细胞群(其并非富集的调节细胞群)组合。
根据制备用于ACT移植的细胞群的方法的实施方式，成软骨细胞群是取自相同或不同的分离的软骨样本的成熟软骨细胞群。更具体地，该方法还包括以下步骤：
g)扩增或传代步骤(c)中所得粘附细胞群，
h)收集扩增和传代的粘附细胞群，
i)步骤(f)中，将步骤(e)所得非粘附细胞群与步骤(h)所得粘附细胞群扩增和传代后的群组合。
通常，在本发明方法中，步骤(a)中的酶处理使用胶原酶A。
在本发明方法的具体实施方式中分离的软骨样本是半月软骨样本。任选地，成软骨源细胞群来自半月软骨活检。或者，成软骨细胞群是间叶干细胞群。
本发明用于制备ACT移植细胞群方法的其它实施方式还包括将步骤(f)或(i)所得组合细胞群接种到支撑物上的步骤。
因此本发明涉及通过施加包含本发明自体或异体调节软骨细胞群和具有成纤维细胞形态的扩增的自体甚或异体软骨细胞的混合物或组合物的细胞治疗剂改善体内软骨重建的方法。
本发明还涉及通过施加包含本发明调节细胞群和间叶干细胞的混合物的细胞治疗剂改善体内软骨重建的方法。
包含本发明细胞群和软骨细胞组合的组合物能够在体外加快软骨形成。因此，构想本发明软骨细胞和调节细胞群的组合植入导致软骨重建增强，当注入体内时引导更快的再生过程和高质量的软骨形成。
并且观察到，在颗粒培养中本发明细胞群生成的软骨即使与较高传代的去分化软骨细胞组合时仍显示快速地形成机械稳定的颗粒。这不仅使涉及可供移植的软骨细胞群更具灵活，而且预示对局部成软骨细胞发挥作用。诱导部分去分化细胞稳定的软骨细胞表型的能力显示本发明调节细胞可应用于诱导软骨形成，例如在骨关节炎情况下，关节内局部软骨细胞已受到分解过程影响时。
发明详述
定义：
术语“成软骨”在用于细胞或细胞群时指该细胞或细胞群在适当情况下固有的产生软骨或刺激软骨生长的能力。成软骨细胞包括软骨细胞和本身分化成软骨细胞的细胞，例如属于骨软骨系的前体细胞。
本文中“成软骨因子”指促进软骨分化的化合物，例如某些生长因子如TGF-β。
术语“软骨细胞表型稳定性”在用于细胞群时，指该细胞群在体内产生软骨的能力。此能力可通过在诸如免疫缺陷小鼠的哺乳动物(体内)注射部分细胞群(至少约1-20×106个细胞)进行测试，确定(时间跨度约3星期)软骨植入物的进展而无血管侵蚀或软骨内成骨征象。表型稳定的软骨细胞群，及其以表型稳定性标志物的出现为特征，如WO124833所述。经传代后在成熟软骨细胞逐渐失去软骨细胞表型稳定性。
术语“新鲜分离细胞”(FI)指取自组织消化后活检的细胞群。术语“新鲜分离软骨细胞”在本文则是指直接从含软骨细胞组织，例如软骨经消化未传代获得的细胞群。在本发明范围里新鲜分离细胞群或直接使用(即分离后48-120小时内)或冷冻供以后使用。或者，新鲜分离细胞群的特征可在某种培养条件下长期保持，如以高密度在培养箱的超低接触板中未传代培养较长时间段。
术语“调节”当用于细胞或细胞群时指该细胞或细胞群当接触另一细胞群时影响该细胞群的成软骨性，和/或启动软骨细胞扩增，和/或影响其它细胞群的软骨细胞表型稳定性的能力。
术语“富集”用于本发明调节细胞群时涉及以下情况：从获自软骨活检的新鲜分离细胞，去除发展为成熟软骨细胞的细胞，从而得到相对于新鲜分离细胞总体中调节细胞百分比较高的调节细胞。根据本发明一种富集调节细胞群的具体方法是基于其非粘附特性。
术语“非粘附”，“漂浮”，或“非接触”当用于指示软骨衍生细胞或细胞群时指以下情况：当细胞或细胞群引入培养容器(例如培养瓶)时，保持悬浮不粘附于容器表面。更具体地，本发明非粘附细胞群(NAC)是在至少两天或当粘附细胞已获至少30％汇合后，出现在新鲜分离软骨细胞的软骨细胞单层的上清液中(即在标准培养条件下第一次扩增期间)。
在本发明中用到的“成熟软骨细胞”，是指软骨组织的成熟细胞，其源于成软骨细胞且能够生成软骨。成熟软骨细胞从软骨的新鲜分离细胞群经培养获得。当可接触基质或支撑物(例如在单层培养)时，新鲜分离细胞变平并获得多角型或成纤维细胞形态，失去其细胞外基质而成为成熟软骨细胞。因此“成熟软骨细胞群”用在本文是指通过软骨细胞单层培养得到的细胞群，例如在培养瓶中，成熟软骨细胞粘附于培养瓶表面并经传代一次或多次。
术语“扩增”，当用于得自诸如软骨组织的细胞群时，指示该细胞群已置于一定条件下，其细胞数已通过增殖得以增加。简单地看，扩增是通过使细胞群在具有适当培养基的培养容器中实现，任选地直到汇合。
分离自组织的细胞群的“第一次扩增”是指该细胞群在第一次传代前的培养。在此第一次扩增中，一部分新鲜分离细胞将粘附于瓶表面并成为成熟软骨细胞(P0成熟软骨细胞)，而一部分新鲜分离细胞仍保持为上清液中的非粘附细胞(非粘附细胞群)。通常第一次扩增约为15天，取决于接种细胞的密度。一旦传代，去除经培养细胞的上清液，并使粘附细胞从培养容器脱离，分份并再次转至含新鲜培养基(此阶段相对于P1)的培养容器。P1细胞再次粘附于培养瓶可进一步传代。P1细胞或更高传代数的细胞在本文中一般称为“传代细胞”。
术语“软骨缺陷”在本文中指任何由于软骨缺失或损伤导致的情况。最常见的发生于关节，例如但不限于膝关节，肘关节，踝关节，因此通常被称为关节软骨缺陷。软骨缺陷也常以附近的骨命名，例如股骨髁缺陷，肱骨缺陷等。半月板的纤维软骨缺失/撕裂也称为半月板缺陷。
本发明基于以下观察：取自软骨活检的新鲜分离细胞，除了包含将分化为成熟软骨细胞的细胞群，当引入培养瓶时粘附于瓶表面并可扩增的细胞群；以及非粘附细胞群，其不仅表型稳定，还可作为调节细胞群。该细胞群的调节活性由以下情况显示：其能够保持软骨细胞群的软骨细胞表型稳定性并恢复去分化细胞群的软骨细胞表型稳定性。因此，出现在取自软骨的新鲜分离细胞中的该细胞群对软骨产生和修复具有特殊意义。因此，本申请提供新鲜分离软骨细胞的新型应用，利用了其中调节细胞亚群的特征。并且，该调节细胞群的非粘附特征提供了本发明调节细胞群富集的方法。因此，尽管传统上取自软骨细胞培养的第一次扩增的非粘附细胞被弃用，本发明提供了该非粘附细胞的使用，不仅作为成软骨细胞群还作为能够显著影响其它细胞群软骨细胞表型稳定性的调节细胞群。
已观察到本发明调节细胞群包含具有细胞外基质的细胞。软骨细胞出现在软骨组织中时具有园型或半园型表现。软骨组织的消化破坏了出现在细胞周围的天然细胞外基质。在最初48小时培养中，细胞再次得到(尽管不同的)细胞外基质。当接触基质或支撑物，例如单层培养时，大多数新鲜分离细胞变平并形成多角型或成纤维细胞形态，再次失去其细胞外基质。本发明调节细胞群以具有园型的细胞形状为特征，其周围保留着这种重获得的细胞外基质。
根据本发明，本发明调节细胞群出现在得自各种软骨活检的新鲜分离细胞中。因此本发明提供涉及使用该调节细胞群的方法，既可出现在新鲜分离细胞中，也可是富集细胞群，在体外或体内的软骨生成中。本发明还提供富集具有调节功能的细胞群的方法。
本发明调节细胞群或是新鲜分离细胞群的一部分，或是富集的调节细胞群，通常得自分离的软骨样本。根据本发明，该分离的软骨是得自人体或动物体任何部位的纤维软骨和/或关节软骨。更具体地是选择体内易于到达以获取软骨活检的部位。如调节细胞群的分离是用于实现本文供ACT的细胞，理想的软骨活检来自与其它骨接触少的非承重部位，例如股骨髁间切迹。或者，用于本发明方法的软骨样本是脱出的椎间盘软骨或半月软骨(纤维软骨)。
在本发明中用于生成细胞的软骨活检可得自幼年或老年个体、健康或病患软骨(如骨关节炎软骨)。
本发明第一方面涉及富集本发明调节细胞群的方法。以最通常的形式，该方法包括以下步骤：
—机械和/或酶处理分离的软骨样本以获取单个细胞群，
—将所获单个细胞群转至细胞培养容器使软骨细胞以单层扩增，
—保持培养容器在合适细胞培养条件下，以及
—从细胞培养容器收集包含非粘附细胞群的上清液，非粘附细胞群相当于本发明调节细胞群。
根据本发明，来自软骨组织新鲜分离细胞的培养为物理分离细胞为包括必须的软骨细胞的“粘附”细胞群，以及具有调节特征的非粘附细胞群提供了方法。
根据本发明富集过程的第一步骤中，处理分离的软骨以获取个体细胞群(“新鲜分离软骨细胞”)。根据具体实施方式，该处理包括酶处理。适于消化软骨活检的酶包括但不限于：胶原酶NB4，胶原酶A或分散酶/胶原酶II。在本发明具体实施方式中用胶原酶A处理软骨活检。其它适于分解软骨的蛋白酶包括选自下组的酶(单独使用或与胰岛素组合)：天冬氨酸酶例如组织蛋白酶D，半胱氨酸酶例如组织蛋白酶B、L、S、K和钙激活中性蛋白酶I和II，丝氨酸蛋白酶例如嗜中性粒细胞弹性蛋白酶，组织蛋白酶G和蛋白酶3和金属蛋白酶例如MMP 1-20。本发明的“处理”包括分离的组织与一定量的酶接触足够的时间段使组织消化为单个细胞。示例性的酶浓度和消化时间段在本文实施例部分描述，本领域熟练技术人员可简单地决定其它处理方法。在本发明具体实施方式中使用0.1到0.3％的胶原酶A持续8到16小时，更具体是12小时。
或者，可使用机械方法处理软骨活检以获得单个细胞群，例如使用低速机械均质化，如Poole等(1998)J.Orthop.Res 6，408-419所述。
在本发明富集过程中，从软骨活检(“新鲜分离软骨细胞”)得到的单个细胞被引入“培养容器”，以使“粘附”和“非粘附”细胞群在其中出现分离。用于本发明的合适培养容器是用于基质依赖细胞培养的标准培养瓶(例如，但不限于，得自BD公司(Becton Dickinson)的FalconTM瓶，得自特科诺塑料制品公司(Techno Plastic Products)的TPP瓶，经Greiner组织培养处理的瓶等)。通常，这些培养瓶包含已施加表面处理的内表面或瓶底。可使用不同形状或尺寸的培养瓶，且这些方面在本发明文本中未严格要求。唯一的限制是瓶子是关闭的，即可以使粘附细胞群上方的培养基保留成熟软骨细胞群粘附于底面所需的时间段，从而使粘附和非粘附细胞物理分离和从培养基中回收非粘附细胞。根据具体实施方式，用于本发明富集方法的该步骤的培养基和条件是标准的软骨细胞培养基。用于软骨细胞扩增工艺中的培养基通常包含DMEM，HAMS/F12或其它任选的细胞培养基添加5到15％血清。或者可使用适于软骨细胞培养的无血清培养基。这些培养基可包含混合维生素，生长因子，激素，糖，等。根据具体实施方式，使用含血清和抗生素的DMEM培养基。该细胞培养标准化地置于37℃含5％CO2，但希望这些条件地轻微变化不会显著影响细胞群粘附到本发明培养容器的表面。根据本发明地具体实施方式，包含非粘附细胞群的培养瓶的上清液将保留在培养瓶中一段时间，如接种后2到5天或直到粘附细胞得到至少约20％，更具体地约30％汇合后进行收集。这将视瓶的尺寸和初始引入其中的细胞数而定。在第一次扩增中为使粘附细胞在培养瓶中的培养在约两周内达到汇合，通常在175cm2的瓶中引入5,000-20,000新鲜分离软骨细胞。对于熟练技术人员软骨细胞的培养技术是众所周知的。
本发明调节细胞群的特征是它是非粘附性的，即在用得自软骨活检的细胞接种培养瓶2到5天后或当来自软骨细胞的粘附细胞达到约30％汇合时，它不粘附于培养瓶表面。根据本发明，可通过在新鲜分离软骨细胞群的第一次扩增中分离粘附和非粘附细胞而获取调节细胞群。典型的出现在来自软骨活检的细胞群的成熟软骨细胞无天然的细胞外膜，在1星期时间段内粘附于(预处理的)培养容器表面。这种细胞接触过程是富集调节细胞群的方法的基础，该细胞群的特征是其在较长时间内耐受去分化和接触过程。应理解本发明富集过程中调节细胞群的收集时间可以是接种后少于2天或多于5天，但由于上清液将包含较高比例的或仍未粘附或不再粘附于培养容器表面的成熟软骨细胞，这会影响富集过程的效果。
在本发明富集过程中，非粘附细胞群以物理方法从粘附细胞群去除。根据本发明实施方式，非粘附细胞群随上清液从培养容器一起收集。更具体地，从非粘附细胞群从培养容器的收集包含施加轻柔机械力的步骤(如轻微拍打瓶子)使粘附较弱的细胞脱离并收集培养上清液。从上清液回收细胞使用标准技术，例如，但不限于离心(如1500rpm持续10分钟)。其它方法包括包括其它分离法例如过滤。
通常，本发明富集过程导致出现在细胞群中调节细胞的百分比相对于新鲜分离活检中的调节细胞出现百分比增加至少10％，更特殊地至少20％，最特殊地至少30％。通常发现软骨细胞活检包含5-20％的调节细胞。因为在刚从活检回收后细胞的性质难于确定，也可在成熟软骨细胞已开始粘附于培养瓶表面后确定。根据具体实施方式，本发明富集的调节细胞群包含至少30％，更特殊的至少40％，最特殊的介于50％到95％的调节非粘附细胞。
根据另一实施方式，粘附和非粘附细胞群基于形态学和/或生理学特征进行分离。因此，本发明调节细胞群以园型细胞形态和细胞外基质为特征，与Graff等(2003，如上)所述“软骨质”的细胞外基质不同，不是天然的细胞外基质，而是细胞在培养中再次获得的。本发明调节细胞群还以II型胶原和软骨聚集蛋白聚糖的表达为特征。因此本发明其它隔离调节细胞的方法包括以下方法：如上所述为得到单个细胞对软骨活检的处理，然后使用分离技术分离普通软骨细胞和调节细胞群，如使用FACS分析或其它细胞分离技术。
由于本发明提供从上述活检获取富集调节细胞群的方法，也应注意从这些活检获得的新鲜分离细胞包含本发明调节细胞群并可如此使用。因此，本发明构想新鲜分离细胞的使用既作为供富集的调节细胞的来源，也可如下文所述直接用于本发明调节细胞的不同应用。
因此，根据本发明一个实施方式，新鲜分离细胞群中的调节细胞群用于本文所述的不同应用。新鲜分离细胞群可直接使用，即在标准培养条件下从软骨组织分离24小时内。已进一步明确出现在新鲜分离细胞群中的调节细胞群的调节特性在某种培养条件下可在体外保持较长时间，例如以高密度将细胞保存在培养箱超低接触板中(得自如康宁公司(Corning))。或者新鲜分离细胞群在分离24小时内冷冻供以后使用。在本领域中细胞群冷冻和解冻的方法是众所周知的。
根据一个实施方式，得自软骨活检的新鲜分离细胞分为两部分，其中之一进一步扩增以增加细胞数(使用经典软骨细胞扩增技术)，另一部分被冷冻直到第一部分的扩增完成，之后新鲜分离细胞的解冻部分与软骨细胞的扩增和传代后的部分组合，建立组合细胞群，可用作具有本发明增加表型稳定性作用的细胞治疗剂。
根据本发明另一实施方式，调节细胞群以通过本文所述方法获得的富集的调节细胞群的形式，用于本文所述不同应用中。再次，该富集调节细胞群可或直接使用或冷冻供以后使用。
本发明的其它方面提供了本发明调节细胞群的不同应用。
本发明的一方面提供了a)本发明的调节细胞群(“富集”或非富集的，即出现在新鲜分离软骨细胞群的形式)和b)成熟，祖代和/或去分化软骨细胞群的组合用于细胞性治疗策略。
根据本发明具体实施方式，用于本发明的组合细胞群的调节细胞群和成软骨细胞群从同一软骨样本获得。根据第一实施方式，从该活检样本获得的一部分新鲜分离细胞是冷冻的，或直接或第一次扩增的24小时内，而第二部分是扩增后的以获得扩增的软骨细胞群(成熟软骨细胞群)。或者，调节细胞群和软骨细胞群均来源于新鲜分离软骨细胞样本的同一第一次扩增，其中调节细胞相当于取自软骨细胞第一次扩增期间的非粘附细胞部分的细胞群，成熟软骨细胞相当于同一软骨细胞第一次扩增的粘附细胞群的一个或多个软骨细胞传代。或者，构想调节细胞群和软骨细胞群或成软骨细胞群的组合源自不同软骨活检或来自已被分为第一和第二部分的软骨样本，则调节细胞群优选从第一部分分离而软骨细胞群优选从第二部分分离。
根据本发明，在新鲜分离细胞群中出现的或在新鲜分离软骨细胞第一阶段扩增期间获得的非粘附细胞群具有调节属性，其在体外和体内均对软骨生成均有特殊影响。因此本发明的其它方面涉及经识别的调节细胞群在软骨生成和软骨修复各方面的使用。
本发明的调节细胞群的不同应用基于当与第二细胞群混合时其调整该第二细胞群软骨细胞表型稳定性的能力。细胞群的软骨细胞表型稳定性可通过将细胞群植入如WO0124833所述的裸鼠模型来测定。通常约5×106个早期传代成软骨细胞的细胞群能够在2-3周内产生成熟软骨株。如WO0124833所述，可使用分子标志物预测该移植的结果，因此这些分子标志物可指示细胞群的软骨细胞表型稳定性。通常，一种或多种阳性标志物(例如BMP-2和/或FGFR-3)的出现可一种或多种阴性标志物(例如ALK-1)的空缺可用于识别软骨细胞表型稳定的群。
根据一方面，本发明提供保持、改善和/或恢复成软骨细胞群的软骨细胞表型稳定性的方法。在本发明的方法中，调节细胞群与成软骨细胞群组合或混合。本发明文本中构想的成软骨细胞群可以是选自下组的细胞群的一种或混合物：新鲜分离软骨细胞，经扩增传代的软骨细胞，间叶干细胞(MSC)，或属于骨软骨系的前体细胞。在本发明方法中，调节细胞群中的细胞与成软骨细胞群组合，其中调节细胞的相对数量通常介于1到75％，更特殊的在混合物细胞总数的10到50％。根据本发明，调节细胞群可与成软骨细胞群组合，或以混合物的形式(轻柔混合细胞悬液以保证两细胞群的完全混合)或以所谓软骨球的形式，软骨球代表成簇的软骨形成细胞。
因此，本发明提供了改善、恢复和保持新鲜分离软骨细胞，经扩增传代的软骨细胞，间叶干细胞或属于骨软骨系的前体细胞的软骨细胞表型稳定性的方法。更具体地，本发明提供改善、恢复和保持经培养的软骨细胞的软骨细胞表型稳定性的方法，其中的培养可包括6到10次或更多次随后的传代。
因此本发明的方法使调节细胞群(新鲜分离细胞群或是富集细胞群)和成软骨细胞群任选地组合在一个组合物中。通常，当所得组合细胞群将用于移植时，两细胞群都是自体的。或者，例如使用异种软骨细胞或异种MSC与自体甚或同种异体调节细胞群组合也是可以考虑的。
本发明一个具体方面涉及从软骨活检获得具有改善的软骨细胞表型稳定性的细胞群的方法。本发明的方法设想的改善可以是不同的途径，但在体外或体内对软骨生成和/或软骨缺陷的重建有效。已证实接触从具有本发明调节细胞群的标准单层培养获得的软骨细胞群，导致所得细胞群的软骨细胞表型稳定性显著改善，效果超过两细胞群的加法效应。这种对软骨细胞表型稳定性的正效应不仅已在第一或第二次传代的软骨细胞群观察到，并且对已进行高次数传代的显示去分化征象的细胞也有效。因此，根据本发明的这方面，提供了获取改良的成软骨细胞群的方法，例如用于ACT。这些方法基于两个细胞群的组合，第一细胞群是用标准培养方法从软骨活检获得的成熟软骨细胞群，第二细胞群是调节细胞群，可如上文所述获得。两个细胞群可独立地处理并在任何阶段组合。调节细胞群对软骨细胞群的调节效应使成熟软骨细胞群的显著增殖而不影响最终细胞治疗剂的软骨细胞表型稳定性成为可能。
本发明另一具体实施方式涉及使用调节细胞群(如本发明的新鲜分离的软骨细胞群或是富集的调节细胞群)恢复具有较低或减少的软骨细胞表型稳定性的细胞群的软骨细胞表型稳定性。虽然直接从外植组织(如软骨活检)衍生的初始细胞保持产生和分泌天然软骨特征性的细胞外组分，具体是II型胶原和硫酸蛋白聚糖，已知在体外单层扩增期间，成熟软骨细胞去分化并失去其在体内形成透明软骨的能力。本发明调节细胞群能够改善或恢复那些已失去其稳定表型向前进一步传代的细胞的软骨细胞表型稳定性。此外或或者本发明调节细胞群能够改善或恢复，由于疾病(如骨关节炎软骨)或其它状况所致不具有或软骨细胞表型稳定性减低的软骨细胞的软骨细胞表型稳定性。一旦这样的细胞群与本发明调节细胞群组合，所得细胞群的软骨细胞表型稳定性得到恢复。例如用于移植目的时，由于对可用作细胞源供自体修复策略如ACT，或同种异体修复策略的组织设置较少限制，这是有益的。
本发明的又一具体实施方式涉及使用调节细胞群引导软骨细胞的前体细胞朝形成软骨的软骨细胞发展更具体地，在本发明文本中，考虑诸如间叶干细胞(MSC)的前体细胞或诸如WO0125402所述的CDMP-1正性前体细胞的软骨细胞前体细胞。事实上，本发明证实，与本发明调节细胞群组合的干细胞，更具体是MSCs或骨软骨系前体细胞被朝向产生软骨的表型引导。间叶干细胞(MSCs)能够分化成不同的间叶系，包括脂肪和结缔组织，骨，和软骨。MSCs已在人出生后骨髓(BM)，外周血，骨膜，肌肉，脂肪组织和成人结缔组织中检出。也已证实许多胎儿组织包含MSCs，例如人妊娠首三月胎儿BM(骨髓)，肝脏，血液，以及第二三月期的BM，肝，肺，脾，胰，和肾。目前对于临床，成人BM是最常用的MSC来源。本发明调节细胞群使多能性MSC分化成软骨细胞系的能力，更具体是诱导软骨样表达模式的能力使MSC可用于软骨的有效产生和/或再生成。并且，间叶干细胞具有重要优点，即它们是调节免疫系统并减轻人类异体排斥程度的自更新细胞群。因此，由于间叶干细胞使利用HLA-非匹配(同种异体)细胞修复或替换受损组织成为可能，其在再生性医疗领域具有重要潜力。因此本发明提供了修复细胞群的方法，该方法包括使本发明调节细胞群与自体或同种异体MSC组合。
应理解上述改善、诱导或恢复软骨细胞群或软骨细胞前体细胞群的软骨细胞表型稳定性的方法可以不同途径实现。在具体实施方式中本发明调节细胞群与其它细胞群在对患者给药前接触。在一个实施方式中，给药前1-30分钟内多个细胞群接触，但也需考虑接触时间是达到1小时还是更多。任选地，细胞群可以是细胞悬液的形式接触。或者被一起置于供移植的基质上。
本发明的另一方面涉及使用本发明调节细胞群任选地与一个或多个成软骨细胞群组合的软骨的体外生产。
事实上，在软骨修复中在体外形成软骨材料，随后植入软骨缺损，可能是有益的。这样合成软骨材料的优点是软骨的生产可通过形态学、生物化学和分子特征，在植入前进行监控。本发明调节细胞群既可单独使用，或与成软骨细胞群(选自新鲜分离软骨细胞，经扩增的和任选的经传代的软骨细胞，MSC)组合用于在锚基依赖或非锚基依赖的培养系统中成软骨细胞的扩增。对于后者，任选地与诸如软骨细胞组合的调节细胞群的细胞可在琼脂凝胶中克隆培养。或者，在另一锚基非依赖型方法中，任选地与诸如软骨细胞组合的调节细胞群可在悬浮液培养基中克隆培养。在锚基依赖方法中，本发明调节细胞群与例如分离自原始组织并单层生长的成软骨细胞群在二维或三维基质中组合以产生形成软骨的结节。
在其它方面，本发明提供了用作药物的调节细胞群，以及包括该调节细胞群给予需要的患者的治疗方法。更具体地说，认为通过调节细胞直接给药至需要软骨生成的缺陷处，该调节细胞群对骨软骨缺陷的治疗具有治疗价值。通常本发明调节细胞将给药到包含软骨细胞的区域，最常见的是作为疾病或机械性缺损结果的不再能够产生足够量的透明软骨的软骨细胞。根据本发明的这方面，在植入软骨缺损后，本发明调节细胞群对细胞群的软骨细胞表型稳定性的改善或恢复发生在原位。再次，本发明的细胞可作为细胞悬液给药或施于诸如基质的固体支撑物上。
根据另一方面，本发明提供了组合物，即一个或多个调节细胞群(新鲜分离细胞群或是“富集后的形式”)和一个或多个选自下组的成软骨细胞群的混合物或组合：新鲜分离软骨细胞，经传代的成熟软骨细胞，间叶干细胞或属于骨软骨细胞系的祖代细胞。如上文所示，与本发明调节细胞组合使用的成软骨细胞或以稳定的软骨细胞表表型或以不稳定的表型为特征。这些混合物或组合物可用作药物。本发明还提供包含本发明混合物和组合物的药物组合物。
因此，本发明通过给予本发明组合物或混合物为软骨缺陷的治疗提供了方法，以及本发明组合物或混合物在生产治疗软骨缺陷药物中的对应的用途。
涉及本发明调节细胞或单独或与其它细胞群组合或混合给药的治疗方法包括但不限于：关节(例如膝关节)的关节软骨和半月软骨的治疗方法，体内其它部位的弹性软骨、纤维软骨或关节软骨的其它治疗(如椎间盘的修复，骨关节炎或风湿性关节炎的治疗)。通常，在用于治疗关节缺陷时，本发明的细胞群或组合物是注射在骨膜瓣下方，骨膜瓣被缝合以覆盖软骨缺陷。或者，本发明的细胞群或组合物用于浸透合成的载体基质，或接种到天然生物聚合物上然后植入软骨缺陷。至今已使用多种生物聚合物，包括三维胶原凝胶(如美国专利号4,846,835)，重建的纤维蛋白-凝血酶凝胶(如美国专利号4,642,120；5,053,050和4,904,259)，合成聚合物基质包括聚酐，聚原酸酯，聚羟基乙酸和它们的共聚物(美国专利号5,041,138)，和透明质酸基聚合物。
除了一个或多个细胞群，本发明文本所述药物组合物常包括至少一种制药学可接受的载体，该载体对本领域技术人员是众所周知的，例如选自蛋白质如胶原和凝胶，碳水化合物如淀粉、多聚糖、糖(右旋糖，葡萄糖和蔗糖)，纤维素衍生物如羟甲基纤维素钠盐或钙盐、羟丙基纤维素或羟丙甲基纤维素，预糊化淀粉，果胶琼脂，角藻胶，黏土，亲水树胶(阿拉伯树胶、瓜尔胶、阿拉伯胶和黄原胶)，褐藻酸，褐藻盐，聚羟基乙酸和聚乳酸，右旋糖苷，果胶，合成聚合物例如水溶性丙烯酸聚合物或聚乙烯吡咯烷酮，蛋白聚糖，硫酸钙等。
此外或或者，药物组合物包括调节细胞群或还包括例如趋药性因子或分化因子等因子的本发明组合细胞群。
附图简述
以下实施例并非试图使本发明限制于所述具体实施方式，可组合所附示图进行理解，其内容包括于此作参考，其中：
图1显示不同个体活检的新鲜分离软骨细胞(FI)、经扩增的单层软骨细胞(P0)和本发明调节细胞群(NAC)的标志物图表(QS评分)。QS评分通过RT-PCR检测的特有基因的表达水平的量化评估定义。高的评分与软骨细胞表型稳定性增加相关。
图2显示与新鲜分离软骨细胞比较，不同个体活检的单层扩增的软骨细胞(P0)和本发明非粘附调节细胞群(NAC)中的一些标志物表达的变化。所述标志物是II型胶原(图A)，聚集蛋白聚糖(图B)和BMP-2(图C)。
图3显示体外调节细胞群的软骨形成。
图4显示软骨细胞与不同数量本发明调节细胞群混合的混合细胞团培养物的体外软骨形成(图A)。图A显示包含10，20或30％(富集)非粘附细胞群(NAC)的去分化软骨细胞样本的细胞团形成，证实随着本发明调节细胞数量的增加细胞团形成的尺寸和机械稳定性显著增加。图B通过番红O染色阳性证实，包含P4软骨细胞的TGFβ-刺激的细胞团与50％本发明的调节软骨细胞混合能有效形成细胞外基质。
图5显示II型胶原(图A)和聚集蛋白聚糖(图B)的表达特征，分别为与30％调节细胞群(NAC)混合的P6软骨细胞的TGFβ-刺激的细胞团培养物(左)以及与30％P0软骨细胞混合的P6软骨细胞的TGFβ-刺激的细胞团培养物(右)，对照为相同组合物未经刺激的细胞团培养物。
图6显示P4软骨细胞(左)、P4软骨细胞与30％(中)或50％调节细胞群(NAC)(右)的经TGFβ-刺激的细胞团培养物的II/I型胶原比例。
图7显示一60岁供体的去分化P6软骨细胞与10％调节细胞群混合的异位软骨形成。
图8显示包含人滑膜(HSM)衍生的间叶干细胞(MSC)以及间叶干细胞与不同浓度调节细胞的细胞团培养物在TGFβ-刺激和非刺激条件下的II/I型胶原比例(每个样本的数字指示MSC在MSC和调节细胞群混合物中的百分比)。
图9显示根据本发明实施方式的从半月软骨获得的新鲜分离细胞群、P0的粘附性成熟软骨细胞和调节细胞群(NAC)的I型胶原和II型胶原表达的比较图。
图10显示从半月软骨获得的调节细胞(NAC)经TGFβ-处理后的细胞团培养物中的纤维形成，与根据本发明实施方式的滑膜衍生干细胞(HSM)的比较。A：包含100％滑膜衍生干细胞的细胞团；B：包含100％半月软骨调节细胞群(NAC)的细胞团；C：包含70％半月软骨调节细胞群(NAC)和30％滑膜衍生干细胞的细胞团；D：包含50％半月软骨调节细胞群(NAC)和50％间叶干细胞(HSM)的细胞团。
实施例
实施例1：调节细胞的分离和特征描述
关节/半月活检在无血清DMEM培养基和抗生素中切碎。随后在组织中加入含0.1％胶原酶A的无血清DMEM培养基和抗生素溶液。酶反应在37℃培养箱转动体中的试管中进行约12小时，以释放来自活检的单个细胞或细胞簇。通过离心收集细胞，随后移至含血清和抗生素的DMEM培养基中。细胞培养在37℃含5％CO2下进行。
开始细胞培养4天后，如下更换培养基：收获培养上清液，在粘附性软骨细胞部分加入新鲜培养基。通过在1500rpm离心10分钟从细胞上清液收集松散粘附的和非粘附的细胞。然后将这些表型稳定的细胞冷冻或保存在培养瓶或经特殊处理的平板中，或直接在各种实验程序/临床应用(如下所述)中使用。
在人体中发现这种圆型调节细胞群在不同组织来源的经消化的软骨活检中出现，包括关节软骨和半月软骨，不论年龄或疾病。在关节软骨消化物中发现具有调节细胞的软骨细胞亚群的存在浓度为接种细胞量的8-20％(表1)。在半月软骨活检中，发现非粘附细胞群约占细胞总数的约5-20％。
表1：从软骨消化物获得的非粘附细胞占总细胞群的百分比。
 
关节软骨细胞活检 年龄 性别 细胞活力 ％非粘附
CS228 81 男 85％ 14％
CC0039 25 未注明 91％ 20％
CC0009 23 男 86％ 8.5％
CC0044 89％ 14％
经免疫组化分析非粘附细胞群证实，至少一部分非粘附细胞具有包含VI的细胞外基质。流式细胞计分析显示了CD29、CD49e、CD51、CD54和CD56的表达。
调节细胞群证实与软骨表型稳定性相关的标志物的异常表达曲线。
通常，当关节软骨细胞单层培养时它们失去其特征性的表型。伴随着朝多边形甚至成纤维细胞形态转变的是软骨特异性细胞外基质基因表达的戏剧性降低。在第一次扩增期间非粘附调节细胞群不仅保持其圆形形态，并且与粘附的P0成熟软骨细胞比较，这些细胞表型稳定软骨的标志物的表达曲线改善(在第一次扩增末期分析)(图1)。由于新鲜分离软骨细胞(FI)中调节细胞的出现保证表型稳定软骨细胞标志物的表达曲线得到改善优于粘附性P0成熟软骨细胞，这些标志物的表达低于经富集的调节细胞群(图1)。
所有分析证实，不论用来获取软骨的患者的年龄，本发明所述调节细胞群与P0软骨细胞甚或新鲜分离(FI)软骨细胞比较，显示更高的QC评分。
除了一个样本(供体81岁，患严重OA)外的所有样本，II型胶原表达率高于新鲜分离细胞(数据未示出)且明显超过P0粘附性成熟软骨细胞(图2A)。聚集蛋白聚糖的表达率显著超过P0粘附性成熟软骨细胞(图2B)和新鲜分离的软骨细胞(数据未示出)。BMP-2表达率较P0粘附性成熟软骨细胞高(图2C)但低于新鲜分离的软骨细胞(数据未示出)。
实施例2：本发明调节细胞的软骨形成能力
约200,000个细胞的非粘附性调节细胞群(活检CS225)在15ml圆锥型试管中以1500rpm离心并在软骨生成诱导条件下成团培养。该培养基的配方如下：含1:100抗生素的DMEM，1:100丙酮酸钠，1:100ITS+[BD生物科技公司(BD Biosciences)]，10-7M的塞米松和1:100037.5mg/ml抗坏血酸。然后将试管盖轻轻旋松，细胞培养在含5％CO2的37℃条件下进行。细胞培养周期为2周，每2-3天更换培养基。在一些细胞团中还加入TGF-β。2周后，将细胞团用于组织学分析或提取RNA进行实时定量PCR。
TGFβ刺激导致机械稳定的异常质地的成软骨组织，通过石蜡包埋软骨切片的细胞外基质的甲苯胺蓝和番红O异染性染色可得以证实(图3)。
这些数据证实本发明调节细胞群是本身表型稳定的软骨细胞群，能够产生高质量的软骨。
实施例3：调节细胞群能够改善成熟软骨细胞的软骨细胞表型稳定 性
混合细胞团的培养类似于上文实施例2所述的过程，但使用调节细胞和成熟软骨细胞的组合。
反复传代的软骨细胞和不同数量(10％，20％，30％)的本发明调节细胞群(NAC)的TGFβ刺激的混合细胞团培养物两周后进行观察，显示较单一去分化软骨细胞更强的软骨形成能力，细胞团尺寸的增加(图4A)和番红O异染性染色(图4B)可以证实。
本发明调节细胞群和70％P6软骨细胞的组合诱导高质量的细胞外基质。包含调节软骨细胞的混合细胞团培养物与使用P0软骨细胞和P6软骨细胞组合体的混合细胞团培养物比较可观察到II型胶原和聚集蛋白聚糖表达显著增加(图5)。
II型胶原：I型胶原比率的显著增加也反映了软骨形成能力改善(图6)。在II型胶原表达率增加之后观察到I型胶原表达减少(图6，中、右栏)。相反，纯粹去分化的P4软骨细胞的细胞团培养物不形成机械稳定的软骨，在3D培养中只显示受限的II型胶原重新表达率(图6，左)。
实施例4：裸鼠肌肉组织中表型稳定软骨的生成
本发明调节细胞群的重分化能力通过在裸鼠肌肉内注射后的异位软骨形成证实。在该方法中将约3到4百万细胞与HBSS培养基混合并以50微升容积注射入裸鼠股部。2-3周后处死动物，其股部肌肉用福尔马林固定，包埋在蜡中并切片供组织学研究。
当注射4百万个由90％P6软骨细胞和10％P0成熟粘附性软骨细胞的组合构成的细胞后，未检测到软骨植入。然而，当注射相同数量的P6软骨细胞与10％调节非粘附细胞(CS225-调节细胞/CS216P6)的组合后形成巨大软骨植入物。
甲苯胺蓝及番红O异染性染色证实该透明软骨样植入物质量优良(图7)。
实施例5：间叶干细胞朝成软骨系的分化
间叶干细胞与数量不等的调节细胞组合，置于如上文所述TGFβ刺激的混合细胞团培养物，或用于如上文所述裸鼠体内检验。通过培养70％间叶干细胞和30％调节软骨细胞的混合物，戏剧性地促进了分化为成软骨系。通过测量II型胶原与I型胶原的表达评估软骨细胞团的数量(图8B)。结果显示调节细胞通过增强II型胶原表达至相当高的水平，在促进分化成软骨上优于最常使用的单一TGFβ分化剂。
实施例6：用自体或同种异体非造血干细胞和自体或同种异体表型 稳定软骨细胞组成的组合细胞产品治疗OA关节
按实施例1收获的自体或同种异体非粘附性细胞与经扩增的成熟软骨细胞、人滑膜衍生的干细胞、或其它来源的非造血干细胞组合。非粘附性调节细胞与软骨细胞前体细胞的组合形成具有组合治疗活性的细胞产品，其中调节细胞引导干细胞形成成软骨系，而干细胞可调节炎症反应。此组合细胞产品，能够生成软骨和调节炎症，在治疗风湿性关节炎软骨缺陷中具有特殊意义。
实施例7：半月软骨调节细胞群的分离和表征
通过如实施例1所述收集非粘附部分从半月软骨样本富集调节细胞群。测定调节细胞群的表达曲线。得自半月软骨的调节细胞群以II型胶原表达率显著高于对应的得自半月软骨样本的粘附性P0软骨细胞群为特征(图9)。发现新鲜分离半月软骨细胞的II型胶原低表达。相反，得自半月软骨的经富集调节细胞群中I型胶原表达率降低。
实施例8：得自半月软骨的调节细胞群的纤维形成能力
如实施例2所述使用得自半月软骨的富集调节细胞群获得细胞团培养物。发现半月软骨调节细胞群的TGFβ刺激细胞团培养物形成胶原纤维，提示该细胞群能够整合入周围组织(图10，右上栏)。制备半月软骨衍生的调节细胞群和滑膜衍生的干细胞的混合细胞团培养物并用TGFβ刺激。观察到半月软骨调节细胞具有相对数量不等的胶原纤维出现(图10，下栏)，而单一滑膜衍生干细胞的细胞团培养物不形成胶原纤维(图10，左上栏)。半月软骨调节细胞的该特性在修复半月软骨内部撕裂中尤其有益，对该疾病目前无治疗方法(见下文)。
实施例9：使用半月软骨衍生的调节细胞群治疗半月软骨缺陷
使用实施例1所述过程从半月软骨样本富集调节细胞群，并计细胞数。然后将半月软骨衍生调节细胞群与经扩增的人滑膜衍生干细胞混合，任选地置于支撑物中，用于治疗半月软骨缺陷，甚至用于半月板的无血管区域。

Claims (24)

1.从分离的软骨样本富集调节细胞群的方法，所述方法包括以下步骤：
a)机械和/或酶处理分离的软骨样本以获取独立的细胞，
b)将所述按步骤a)所获独立的细胞转移至细胞培养容器使软骨细胞以单层扩增，
c)将所述容器置于合适的细胞培养条件中，从而获得粘附细胞群和包含非粘附细胞群的上清液，
d)至少2天后和/或当至少约30％汇合时从所述容器收集包含所述非粘附细胞群的所述上清液，
e)从所述上清液收集相当于所述调节细胞群的所述非粘附细胞群。
2.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述软骨样本是关节软骨样本。
3.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述软骨样本是半月软骨样本。
4.如权利要求1-3中任一项所述方法，其特征在于，步骤(a)包括用胶原酶A处理分离的软骨样本。
5.一种包含两种或多种不同细胞群组合的组合物，该组合物包含：
a)一种包含调节细胞的细胞群，其为(i)得自软骨活检的新鲜分离的软骨细胞群，或(ii)通过从得自软骨活检的新鲜分离的软骨细胞的P0培养上清液收集非粘附细胞获得的富集的调节细胞群
b)选自下组的一种或多种细胞群：经传代软骨细胞群，间叶干细胞群，软骨细胞前体细胞群。
6.如权利要求5所述组合物，其包含富集的调节细胞群，其中所述富集的调节细胞占组合物细胞总数中的相对量介于1-75％。
7.如权利要求5或6所述组合物，其特征在于，所述细胞群包含从关节软骨获得的调节细胞。
8.如权利要求5或6所述组合物，其特征在于，所述细胞群包含从半月软骨获得的调节细胞。
9.一种药物组合物，其包含权利要求5到8中任一的组合。
10.一种包含权利要求5到8中任一细胞组合的支撑物。
11.权利要求5到8中任一组合在制备用于治疗软骨缺陷的细胞治疗剂中的应用。
12.一种治疗软骨缺陷的方法，所述方法包括给予具有所述软骨缺陷的患者权利要求5到8中的任一组合。
13.一种可通过权利要求1到4中任一方法获得的非粘附性、非传代调节细胞群，其作为药物使用。
14.一种治疗软骨缺陷的方法，所述方法包括给予具有所述软骨缺陷的患者通过权利要求1到4中任一方法获得的调节细胞群。
15.一种药物组合物，其包含通过权利要求1到4中任一方法得到的非粘附性、非传代调节细胞群。
16.一种非粘附性、非传代调节细胞群在体外改善、保持或恢复经扩增或传代的软骨细胞群的软骨细胞表型稳定性中的应用。
17.一种非粘附调节细胞群在使间叶干细胞体外分化为成软骨系细胞中的应用。
18.一种制备供ACT移植的细胞群的方法，所述方法包括以下步骤：
a)机械和/或酶处理分离的软骨样本以获取独立的细胞，
b)将所述按步骤a)所获独立的细胞转移至细胞培养容器使软骨细胞以单层扩增，
c)将所述容器置于合适的细胞培养条件中，从而获得粘附细胞群和包含非粘附细胞群的上清液，
d)至少2天后和/或当所述容器中达到至少约30％汇合时从所述容器收集包含所述非粘附细胞群的所述上清液，
e)从所述上清液收集所述非粘附细胞。
f)将步骤(e)所获所述非粘附细胞群与成软骨细胞群组合，所述成软骨细胞群不是富集的调节细胞群。
19.如权利要求18所述方法，其特征在于，所述成软骨细胞群是从所述分离的软骨样本得到的成熟软骨细胞群，其中所述方法还包括以下步骤：
g)将所述步骤(c)所得粘附细胞群扩增和传代，
h)收集所述经扩增和传代的粘附性细胞群，
i)在步骤(f)中，将步骤(e)所获所述非粘附细胞群与步骤(h)所获所述经扩增和传代的粘附性细胞群组合。
20.如权利要求18或19所述方法，其特征在于，步骤(a)中所述酶处理用胶原酶A实现。
21.如权利要求18到20中任一所述方法，其特征在于，所述分离的软骨样本是半月软骨样本。
22.如权利要求18到21中任一所述方法，其特征在于，所述成软骨细胞群源于半月软骨活检。
23.如权利要求18到21中任一所述方法，其特征在于，所述成软骨细胞群是间叶干细胞群。
24.如权利要求18或19所述方法，还包括以下步骤：
j)将步骤(f)或(i)所得所述组合的细胞群接种到支撑物上。
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