KR20040074054A - 중충 연골 조직 및 그것을 조작하는 방법 - Google Patents

중충 연골 조직 및 그것을 조작하는 방법 Download PDF

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바바라 슈메이처
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러쉬 유니버시티 메디컬 센터
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Abstract

본 발명은 두 개 이상의 연골층으로 구성된 조직공학적으로 조작된 부착성 연골 구조물을 포함하며, 그 각각의 연골층은 천연 연골의 표면-접평면 부위, 천연 연골의 중간-전이부위, 천연 연골의 깊은-방사상 부위; 또는 천연 연골의 석회화 연골에 존재하는 연골세포에 해당하는 연골세포 표현형을 갖는 연골세포를 포함하는 배양된 중층 연골조직에 관한 것이다.

Description

중충 연골 조직 및 그것을 조작하는 방법{Stratified cartilage tissue and methods to engineer same}
연골은 몇몇 별개의 층 또는 부위인, 표면 부위, 중간 부위, 깊은 부위, 및 석회화 부위로 조직화되어 있으며, 각각의 부위는 세포외 매트릭스로 둘러싸여 있는 연골세포로 구성되어 있는 복잡한 무혈관성 조직이다. 세포외 매트릭스의 조성은 부위마다 다르지만, 주로 콜라겐 타입 Ⅱ, Ⅸ, ⅩⅠ, 프로테오글리칸, 및 물로 구성된다. 비록 연골세포가 성인 연골 부피의 5% 미만을 구성한다고 하더라도, 연골세포는 세포외 매트릭스를 생산하고 유지하는 역할을 하므로 적절한 관절 기능을 책임지고 있다. 연골 매트릭스로 혈액의 공급이 없다면, 연골은 일단 손상되면 치유될 수 있는 능력이 제한되어, 퇴행성 병리학적 변화를 격게 된다. 연골 손상 기전과 자연적 히스토리 및 손상된 연골의 치유와 재생성에 대한 완전한 이해가 부족하기 때문에, 효과적으로 연골의 손상을 치료하는 것이 또한 복잡하다.
미국에서 매해 수백만의 사람이 연골이 손상되기 때문에, 이러한 지식의 부족으로 인해 많은 인간적 손실 및 경제적 손실이 발생한다. 수십만의 사람들의 경우에는 주로 스포츠 부상에 의해 주요 관절에 있는 관절 연골이 손상된다. 5 천만 미국인은 통증이 있고 사람을 쇠약하게 만들며 관절의 연골을 공격하는 질병인 골관절염을 앓는 것으로 평가되었다.
연골을 복구시키려는 몇몇 시도가 있어왔다. 연골을 복구하거나 연골의 회복을 촉진시키려는 노력은 대개 몇몇 가지 이유로 성공하지 못했다.
관절 연골을 수술로 복구시키는 현재의 방법은 3 가지 카테고리: (1) 섬유연골 회복의 촉진; (2) 골연골 이식; 및 (3) 자가 연골세포 이식으로 나뉘어 진다. 몇몇 수술 기법이 연골 손상 부위에서의 섬유연골의 생성을 촉진시키기 위해 발전하여 왔다. 이러한 기법으로는 연골하 천공, 표피박탈, 및 미세골절 등이 있다. 이러한 방법의 개념은 연골하 뼈가 침투되면 골수의 콘드로프로제니터 세포(chondroprogenitor cell)가 그 손상부위로 이동하여 회복시키게 된다는 것이다. 그러나, 이러한 방법에 의해 생성된 연골은 섬유연골이며, 그 섬유연골은 상대적으로 질이 낮은 기계적 특성을 나타내며, 관절연골의 복잡한 특성을 재현하지 않는다는 문제점이 있다.
골연골 이식의 경우는, 관절 연골을 연골하 뼈층과 함께 취하여 관절의 손상 부위에 이식한다. 숙주에게 이식을 고정시키는 것은 이식된 골의 숙주의 골로의 치유를 통해서 달성된다. 이러한 기법의 주요 단점은 공여자측의 이환율(morbidity)(자가이식의 경우) 및 질병이 전염될 수 있는 위험(동종이식의 경우)이다. 또한, 동종이식의 경우 수술 결과를 위태롭게 하는 조직 거부가 일어날 수도 있다. 골연골 동종이식은 또한 연골하 골에 까지 깊이 손상된 넓은 부위일 경우에 일반적으로 행해진다.
자가 연골세포 이식은 유리된 연골세포를 이용하여 연골을 회복시키는 방법이다. 임상적으로, 이것은 연골 생검을 우선 획득하여야 하고, 그 다음에 일정 기간의ex vivo처리 후에 배양된 연골세포를 손상된 부위에 도입하는 두 단계의 치료방법이다.ex vivo처리동안, 세포외 매트릭스(ECM)를 제거하고 연골세포를 세포분열을 촉진하는 조건 하에서 배양한다. 일단 적절한 수의 세포가 생산되면, 그 세포를 관절의 손상된 부위로 이식한다. 주위를 둘러싸는 숙주 연골로 봉합되는 골막의 팻치가 오염관리시설을 제공한다. 세포는 손상된 벽에 부착되어 그곳에서 ECM을 생성한다. 이 기술로 관절 연골을 복구하는 것이 어려운 것은 세 가지, 즉 세포부착, 표현형 변환, 및 ECM 생성으로 나누어 볼 수 있다. 개별적인 세포(ECM이 없는 경우)의 이식의 성공은 손상된 부위로 부착되는 세포에 따라 매우 달라진다. 연골 ECM은 항부착 특성을 갖는 것으로 나타났으며, 이는 크고 작은 프로테오글리칸에 의한 것으로 여겨진다.in vivo연구에서는 이식된 연골세포중 8% 만이 토끼에게 이식한 후에 손상된 부위에 남아 있는 것으로 나타났다.in vitro에서 세포 집단을 부풀리는 과정동안, 연골세포는 대개 표현형 변환 또는 탈분화를 겪는다. 세포를 주입한 후, 이식 구조물은 하주을 견뎌낼 수 없으며 수주 내지 수개월 동안 무게를 가하는 것으로부터 보호되어야 하므로, 이러한 형태의 치료기법에서의 총 회복기간은 9-12 개월이다.
천연 연골을 대체하거나 복구하기위해 사용될 수 있는 관절연골을 생산하기위한 또 다른 시도가 이루어졌다. 그러한 연골 복구 방법은 각각 실질적인 한계가 있다. 그 결과, 여러 실험실에서는 연골 조직을in vitro로 생산하려는 시도가 제안되었다. 이것들은 일반적으로 배양된 세포(연골세포 또는 다능성 줄기세포 중 어느 하나)를 생물학적 또는 합성 스캐폴드(scaffold)에 접종하는 것을 포함한다. 이러한 유형의 접근법이 주요 단점은 (1) 연골세포 표현형을 획득하거나 유지하는데 있어서의 어려움; (2) 이식되는 천연 연골세포 및 그 이외의 관절 조직에 대한 스캐폴드(scaffold) 물질의 미지의 생물학적 효과; 및 (3) 조작된 조직 구조물의 손상 베드(bed)로의 제한된 부착이다. 유사하게 이러한 접근법은 연골조직으로부터 분리된 연골세포의 균질한 집단을 이용하며, 천연 연골의 층구조 또는 기능을 정확히 흉내내지는 않는다.
따라서, 천연 관절 연골을 정확하게 흉내내는 연골조직이 여전히 필요하다.
본 발명은 생명공학적으로 조작된 연골 조직에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 본 발명은 천연 연골 조직에 가깝게 복제한 조작된 중층 연골 조직 및 그것을 사용하기 위한 시스템 및 방법에 관한 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 조작된 연골조직의 생산을 도시한 도해이다.
도 2는 실시예에 나타낸 바와 같이 배양 1 주 및 2 주 후에 표면 및/또는 중간 부위 연골세포로부터 형성된 세 가지 유형의 연골 구조물의 구조적, 구성적, 및 기능적 특성을 입증한다. 습윤 중량(WW), DNA, GAG, 및 콜라겐 모두를 구조물의 단면적으로 정규화(normalization) 하였다. 데이터를 평균±(p < 0.001(◀), p < 0.01(●), p < 0.05 (◆))로 나타내었다.
도 3은 S, S/M, 및 M 연골 구조물에서 분비된 매트릭스 분자의 국소화를 나타낸다. 섹션을 마우스 IgG 대조군(a)로 처리하거나, 메틸 그린 대조염색으로 SZP(b,e,h) 또는 콜라겐 Ⅱ(c,f,i)에 대하여 면역염색 하였다. 선명함을 위해, 각각의 구조물의 꼭대기(1), 중간(2)으로부터의 선택된 부위의 더 높은 파워의 이미지를 나타내었다. GAG(d,g,j)를 알시안 블루로 조직화학적으로 검출하였다. Bar = 100 ㎛.
도 4는 12 내지 14일 된 구조 배양물로부터 수집한 소비된 배양 배지에서 간접적 ELISA에 의해 측정한 표면 부위의 단백질을 나타내고(p < 0.001(◀))(A), 배양 2 주 후에 각각의 구조물 타입에서 면역세포화학(B)에 의해 측정한 깊이 의존적 SZP 발현을 나타낸다.
발명의 요약
본 발명은 두 개 이상의 연골층으로 구성된 조직공학적으로 조작된 부착성의 연골 구조물을 포함하는 배양된 중층 연골조직을 제공한다. 각각의 연골층은
(i) 천연 연골의 표면-접평면 부위;
(ⅱ) 천연 연골의 중간-전이부위;
(ⅲ) 천연 연골의 깊은-방사상 부위; 또는
(ⅳ) 천연 연골의 석회화 연골에 존재하는 연골세포에 해당하는 연골세포 표현형을 갖는 연골생성세포를 함유한다.
몇몇 구현예에서는, 상기 연골생성세포가 연골세포 표현형에 해당하는 천연의 연골 부위로부터 획득된 연골세포이다.
몇몇 연골 구조물에서는, 부착성 연골 구조물이 표면-접평면 부위의 연골세포의 연골세포 표현형을 갖는 연골생성세포로 구성된 제 1 층과 중간-전이 부위의 연골세포의 연골세포 표현형을 갖는 연골생성세포로 구성된 제 2 층이 서로 인접해 있는 것으로 구성되어 있다. 다른 경우에는, 부착성 연골 구조물이 표면-접평면 부위의 연골세포의 연골세포 표현형을 갖는 연골생성세포로 구성된 제 1 층, 중간-전이 부위의 연골세포의 연골세포 표현형을 갖는 연골생성세포로 구성된 제 2 층, 및 깊은-방사상 부위의 연골세포의 연골세포 표현형을 갖는 연골생성세포로 구성된 제 3 층으로 구성되며, 상기 제 1 층은 제 2 층과 인접해 있고, 제 2 층은 제 3 층과 인접해 있다. 또 다른 경우에는 부착성 연골 구조물이 중간-전이 부위의 연골세포의 연골세포 표현형을 갖는 연골생성세포로 구성된 제 1 층과 깊은-방사상 부위의 연골세포의 연골세포 표현형을 갖는 연골생성세포로 구성된 제 2 층이 서로 인접해 있는 것으로 구성된다. 여기에 기재된 조작된 연골 구조물은 고체 지지체에 의해 지지될 필요가 없다. 상기 조작된 연골에서, 각각의 층은 연골세포 표현형이 결합되어 있는 연골 부위의 연골 매트릭스에 해당하는 연골생성세포-결합 매트릭스를 더 포함할 수 있다. 연골의 세포-결합 매트릭스는 미성숙한 연골 또는 성숙한 연골에 해당할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 상기 층중 하나는 표면 부위 단백질을 분비하는 표면-접평면 부위의 연골세포의 연골세포 표현형을 갖는 연골생성세포를 가질 수 있다.
본 발명은 또한 적어도 제 1 연골층의 실질적으로 모든 연골세포가 동일한 연골세포 표현형을 갖는, 연골세포를 함유하는 적어도 제 1 연골층으로 구성된 조작된 연골조직을 제공한다. 이러한 조작된 연골조직은 또한 하나 이상의 연속적인 연골층을 포함할 수 있으며, 각각의 개별적인 연속적인 연골층의 실질적으로 모든 연골세포는 동일한 연골세포 표현형을 갖는다. 제 1 연골층의 연골세포는 연속적인 연골층의 연골세포와 구별되는 연골세포 표현형을 가질 수 있다.
본 발명은 또한 두 개 이상의 연골층을 갖는 조직공학적으로 조작된 부착성 연골 구조물을 생산하기 위해, 제 1 연골세포 표현형을 갖는 제 1 그룹의 연골생성세포를 추가의 연결생성세포 표현형을 갖는 하나 이상의 추가의 그룹의 연골생성세포와 함께 배양하는 단계를 포함하는 중층 연골조직을 생산하는 방법을 제공한다. 상기 연골생성세포 표현형은 (i) 천연 연골의 표면-접평면 부위; (ⅱ) 천연 연골의 중간-전이부위; (ⅲ) 천연 연골의 깊은-방사상 부위; 또는 (ⅳ) 천연 연골의 석회화 연골 부위에 해당할 수 있다. 본 발명의 방법은 제 1 그룹의 연골생성세포를 함유하는 제 1 세포-결합 매트릭스를 생산하는 하나 이상의 제 1 그룹의 연골생성세포를 배양하는 단계; 및 하나 이상의 추가의 연골생성세포를 함유하는 하나 이상의 추가의 세포-결합 매트릭스를 생산하는 하나 이상의 추가 그룹의 연골생성세포를 배양하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 상기 하나 이상의 추가 그룹의 연골생성세포 각각은 그 그룹의 연골생성세포에 특이적인 세포-결합 매트릭스를 생산한다. 이러한 단계들은 알기네이트 배지와 같은 임의의 적절한 배지에서 수행될 수 있다. 연골생성세포는 또한 하나 이상의 성장인자 또는 두 가지 모두의 존재 하에서 반투과성막 상에서 배양될 수 있다. 일부 구현예에서, 제 1 그룹의 연골생성세포 및 하나 이상의 추가 그룹의 연골생성세포를 그들의 표현형이 결합되어 있는 천연 연골 부위로부터 분리해 낼 수 있다. 이러한 부위로는 표면-접평면 부위 연골세포, 중간-전이 부위 연골세포, 깊은-방사상 부위 연골세포, 또는 석회화 연골 부위 연골세포가 포함될 수 있다. 연골 구조물을 생산한 후에, 연골 손상의 복구에서 일어나는 것과 같이 그 연골 구조물을 관절에 이식할 수 있다.
본 발명은 또한 하나 이상의 시험 약물을, (a) 제 1 그룹의 연골생성세포; (b) 하나이상의 추가 그룹의 연골생성세포; (c) 세포-결합 매트릭스를 갖는 제 1 그룹의 연골생성세포; (d) 세포-결합 매트릭스를 갖는 하나 이상의 추가 그룹의 연골생성세포; 및 (e) 조직공학적으로 조작된 부착성 연골 구조물로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 세포 또는 조직과 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 일반적으로 이러한 방법은 하나 이상의 시험 약물이 상기 접촉된 세포 또는 조직에 미치는 효과를 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 연골조직을 생산하고 본 발명의 방법을 수행하기 위한 키트를 제공한다. 그 키트는 일반적으로 지시사항 및 하나 이상의 약물을 포함한다.
본 발명의 목적 및 이점은 다음의 상세한 설명으로부터 보다 용이하게 명백해질 것이다.
바람직한 구현예의 상세한 설명
본 발명의 한 구현예는 천연 연골, 특히 관절 연골의 물리적 구조와 유사한두 개 이상의 층으로 구성된 조작된 연골 조직을 제공한다. 이러한 구현예에서, 조작된 연골은, 조작된 연골의 각각의 층이 천연 연골 부위에 생성되는 연골세포의 표현형(즉, 특징), 즉 표면-접평면 부위 표현형, 중간-전이 부위 표현형, 깊은-방사상 부위 표현형, 또는 석회화된 연골 부위 표현형을 갖는 연골생성세포를 포함하는 부착성 조직 조각이다. 바람직하게는, 각각의 층의 연골생성세포의 표현형은 다르다. 다른 바람직한 구현예에서, 조직의 바깥층의 하나는 관절의 윤활을 제공하는 것을 돕는 표면 부위 단백질, 발달 내피세포 부위-1(Del1) 단백질, 및/또는 단백질을 분비한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구현예는 연골세포를 함유하는 하나 이상의 연골층으로 구성된 연골조직을 제공한다. 몇몇 구현예에서, 하나 이상의 연골층에 존재하는 실질적으로 모든 연골세포는 동일한 연골세포 표현형을 갖는다. 여기에서 사용된 바와 같이, 어구 "실질적으로 모든 연골세포가 동일한 표현형을 갖는다" 등은 연골층에 존재하는 연골세포가, 일반적으로 두께가 충분한 연골로부터 유래된 연골조직의 균질화된 샘플을 배양함으로써 획득될 수 있는 수준이 넘을 정도로 하나의 특정 표현형을 풍부하게 갖는다는 것을 의미한다. 당업자는 어떠한 층도 천연적으로 생성되는 연골의 부위보다 많은 부위로부터 유리된 연골세포, 즉 보다 많은 표현형을 가질 수 있다는 것을 알 것이다. 서로 다른 표현형을 갖는 연골세포의 혼합물을 사용할 경우, 연골층은 전체로서 바람직하게는 천연적으로 생성되는 연골의 층중 하나의 특징적인 우세한 표현형을 가질 것이다. 예를 들어, 표면 및 중간 부위 연골세포 혼합물이 동일한 층에 존재할 경우, 그 층은 그 층에 존재하는표면 부위 연골세포 또는 중간 부위 연골세포의 비율에 따라 연골의 중간 부위보다 연골의 표면 부위와 유사할 수 있으며, 또는 그 반대일 수도 있다. 몇몇 구현예에서는, 주어진 임의의 층의 연골세포중 50% 이상이 동일한 부위의 표현형을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 주어진 임의의 층에 존재하는 연골세포중 약 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 99% 이상이 하나의 특정 연골 부위에 대한 연골세포의 표현형을 갖는다. 따라서, 주어진 임의의 층에 존재하는 연골세포의 약 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5, 또는 1%가 그 연골층이 주로 나타내는 연골 부위의 표현형과 다른 하나 이상의 표현형을 가질 수 있다. 다른 연골층은 또한 동일한 표현형을 갖는 연골세포를 그 이외의 층에 비해 다른 백분율로 가질 수 있다.
조작된 연골 조직은 두 개, 세 개, 또는 네 개의 층과 같이 원하는 만큼의 많은 층으로 구성될 수 있다. 바람직하게는, 연골 조직은 연골의 천연 부위 구조의 복사물이다(동일하다). 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 표면-접평면 부위와 유사하고, 높은 장력이 특징인 표현형, SZP, 및/또는 Dell 분비를 갖는 하나 이상의 바깥층을 포함한다. 예를 들어, 두 개의 조작된 연골층이 존재할 경우, 한 층은 표면-접평면 표현형 연골세포를 함유하며 그 층에 인접한 제 2 층은 중간-전이 표현형 연골세포를 함유하거나, 한 층은 중간-전이 표현형 연골세포를 가지며 그 층에 인접한 층은 깊은-방사상 부위 표현형 연골세포를 가지거나, 한 층이 깊은-방사상 부위 표현형 연골세포를 포함하고 그 인접한 층은 석회화된 연골 부위 표현형 연골세포를 포함한다. 조작된 연골의 세 개의 층이 존재할 경우, 한 층은 표면-접평면 표현형 연골세포를 함유하고, 그 인접된 제 2 층은 중간-전이 표현형연골세포를 함유하며, 그 층에 인접한 제 3 층은 깊은-방사상 부위 표현형 연골세포를 함유할 수 있다. 유사하게, 한 층은 중간-전이 표현형 연골세포를 함유하고, 그 인접된 제 2 층은 깊은-방사상 부위 표현형 연골세포를 함유하며, 그 층에 인접한 제 3 층은 석회화된 연골 부위 표현형 연골세포를 함유할 수 있다. 조작된 조직에 4 개의 층이 존재할 경우, 제 1 층은 표면-접평면 표현형 연골세포를 함유하고, 제 1 층과 제 3 층 사이에 존재하는 제 2 층은 중간-전이 표현형 연골세포를 함유하고, 제 2 층과 제 4 층 사이에 존재하는 제 3 층은 깊은-방사상 부위 표현형 연골세포를 함유하며, 제 4 층은 석회화된 연골 부위 표현형 연골세포를 함유할 수 있다.
상기 예가 천연 연골의 부위의 순서를 흉내낸 조작된 조직을 나타낸다고 할 지라도, 본 발명의 조작된 조직은 그렇게 제한되는 것은 아니며, 서로 다른 연골세포 표현형을 함유하는 연골층의 모든 가능한 조합이 고안될 수 있다. 예를 들어, 표면-접평면 부위 표현형 연골세포를 함유하는 층은 깊은-방사상 부위 표현형 연골세포 또는 석회화된 연골 부위 표현형 연골세포를 함유하는 층에 인접할 수 있다. 유사하게, 본 발명의 조작된 조직은 연골층 수의 최대값을 갖는 것으로 한정되지 않는다.
또 다른 구현예에서, 각각의 연속적인 층이 또한 그 층의 연골생성세포에 특이적인 자신의 독특한 세포-결합 매트릭스를 가지도록 하기 위해, 조작된 조직 층들의 각각은 그 층의 연골세포의 표현형에 특이적인 연골생성세포와 결합된 매트릭스를 더 포함할 수 있다.
관절 연골은 골격의 성숙 후에, 액체로 채워진 세포외 매트릭스 내에 상대적으로 작은 수 및 부피(2~5%)의 세포로 구성된 수화된 결합조직이다. 세포외 매트릭스의 분자 구성성분은 조직의 기능적인 생기계적 특징에 대해 주로 책임이 있는 것 같다. 황산화된 프로테오글리칸인 아그레칸(aggrecan)은 이온화하여 팽창하여 압축 및 경화(consolidation)에 저항하는 성향을 조직에게 부여하는 설페이트 또는 카르복실 모이어티를 높은 밀도로 조직에게 제공한다. 아그레칸 모노머는 폴리음이온 글리코사미노글리칸(GAG) 체인, 콘드로이친 설페이트, 및 케라탄 설페이트가 부착되어 있는 핵단백질로 구성된다. 이러한 모노머들은 결합 단백질 및 히알루로난(HA)과의 비공유결합적 작용에 의해 안정화된다. 대조적으로, 교차결합된 콜라겐 그물은 프로테오글리칸의 팽창 특성을 방해하며, 조직의 견고성(integrity) 및 장력을 제공한다. 세가지 기능의 교차결합, 히드록시리실피리디놀린(HP)은 콜라겐의 선택된 리신 잔기의 번역후(post-translational) 히드록실화를 포함하는 연속적인 반응에 의해 형성된다.
관절 연골의 조성, 구조, 및 기능은 관절 표면으로부터 연골하 골까지의 깊이에 따라 달라지며 전형적으로 표면 부위, 중간 부위, 깊은 부위, 및 석회화 부위의 부위 순서를 갖는 것으로 기재되어 있다. 정상적인 성인 관절 연골에서는, 물의 함량 및 세포 충실성은 관절 표면으로부터의 깊이와 함께 감소하며, 반면에 황산화된 GAG 함량은 일반적으로 깊이와 함께 증가한다. GAG의 깊이-변화는 콘드로이친-4-설페이트, 콘드로이친-6-설페이트, 및 케라탄 설페이트의 상대적인 비율의 변화와 결합이 있다. 콜라겐 함량이 대략적으로 일정한 동안, 표면 부위의 세포및 콜라겐 미소섬유 모두는 관절 표면(즉, 접평면)에 평행하게 향하고 있으나, 반면에 깊은 부위의 콜라겐 미소섬유 및 세포는 표면과 수직("방사상")으로 향하고 있다. 한정된 압축율은 관절 표면에서 낮고 깊이에 따라 증가하는 반면에, 장력율 및 장력 강도는 관절 표면으로부터의 깊이에 따라 감소한다. 관절 연골의 깊이에 따라 변화하는 구조는 생기계적 기능에 매우 중요하다. 상대적으로 부드러운 연골의 표면 부위의 압축은 관절 표면간의 조화를 향상시키고 스트레스 농도를 감소시키며, 관절의 윤활을 향상시킨다. 표면 부위의 콜라겐 그물의 높은 장력과 부착하는 특성은 조직의 견고성을 유지하고 마모(wear)를 막는 것을 보조한다.
일반적으로 균질화된 관절 연골 조직이 최소 함량의 타입 I 콜라겐과 함께 주로 아그레칸, 콜라겐 타입 Ⅱ, Ⅸ, 및 ⅩⅠ, 그리고 히알루로난으로 구성된다고 하더라도, 이러한 구성분의 비율은 시험한 연골의 부위에 따라 다르다. 또한, 관절 연골의 두께는 연골에 따라 다르며 일반적으로 2-4 mm 범위이다. 본 발명의 조작된 연골은 이러한 물리적 변화 및 조성물의 변화를 가깝게 따라갈 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 조작된 연골은 또한 다음과 같은 천연의 관절 연골의 물리적 특성 중 하나 이상과 유사하다. 천연 관절 연골에서는, 표면-접평면 부위가 비록 가장 세포가 많은 부위라고 하더라도 연골 두께의 약 10 내지 20% 이다. 표현형의 측면에서는, 이 부위의 연골세포는 관절 표면과 평행하게 그 길다란 축을 따라 길게 늘어져 있다. 표면-접평면 부위의 연골세포는 또한 관절을 부드럽게 하는 것을 돕는 SZP와 Del1을 분비한다. 이 부위의 세포-결합 매트릭스는 주로 관절 표면에 평행하게 조직된 미세한 조밀하게 팩킹된 콜라겐 미소섬유로 구성되며, 다른 부위에 비해서 프로테오글리칸의 농도가 가장 낮고, 콜라겐의 농도가 가장 높다. 더 깊은 연골 부위는 표면 부위 연골보다 약 25 배 더 딱딱할 정도로 표면 부위는 또한 가장 부드러운 부위인 경향이 있다. 보다 상세하게는, 표면-접평면 부위는, 주로 작은 미소섬유의 쉬트로 구성되고 다당류가 거의 없으며 세포는 있다고 하더라도 거의 없는 투명한 필름인 미소섬유 쉬트/휘판(lamina splendens)의 보다 표면에 있는 층과 평평해진 연골세포로 구성되는 제 2의 세포층인 두 개의 서브-부위로 구성된다. 표면-접평면 부위는 골관절염의 영향이 처음으로 나타나는 부위이다. 중간-전이 부위는 전형적으로 연골 관절 두께의 약 40 내지 60%를 구성한다. 중간-전이 부위에 있는 콜라겐 미소섬유는 보다 큰 직경을 가지며 불균칙한 배열을 갖는다. 표현형에 있어서는, 중간-전이 부위의 연골세포의 모양은 구형이다. 이 부위는 또한 프로테오글리칸의 농도가 가장 높은 부위이다. 이 부위의 콜라겐 농도는 표면-접평면 부위에서보다 낮다. 연골 두께의 약 30%를 차지하는 깊은-방사상 부위에서, 프로테오글리칸 및 콜라겐 농도는 모두 중간 부위에 비해 농도가 낮다. 깊은 부위의 연골세포는 하부 연골판에 수직인 방사상으로 배열된 콜라겐 섬유 뭉치와 함께 배열된 컬럼을 형성하는 경향이 있다. 이러한 큰 섬유 뭉치는 비석회화된 즉 히알린인 연골과 석회화된 연골 간의 경계인 타이드마크(tidemark)를 가로질러 삽입되어 있어, 안전하게 연골을 뼈에 고정시킨다. 석회화된 연골 부위는 저밀도의 상대적으로 작은 세포를 함유한다. 당업자는 연골 부위에 대한 상기 설명이 제한적인 것이 아니며, 단지 연골 구조를 보다 잘 이해하기 위한 개념적 도구로서 존재한다는 것을 알 것이다. 연골의 생화학적, 조직학적, 대사적, 및 구조적 특성은 Aydelott 등, Connect Tissue Res.,; 18:223-34 (1998); Aydelotte 등, Connect Tissue Res. 18:205-22 (1998); Aydelotte 등, Am. J. Ther. 3:3-8 (1996); Flannery 등, Flannery Biochem. Biophys. Res. Commun. 254:535-41 (1999); Hauselmann 등. Arthritis Rheum. 39:478-88 (1996); Pfister 등. Biochem. Biophys. Res. Commun. 286:268-73(2001); Reid 등, J.Orthop. Res. 18:364-73 (2000); Schumacher 등. Arch. Biochem. Biophys. 311:144-52 (1994); 및 Schumacher 등, J. Orthop. Res. 17:110-20 (1999)에 보다 상세하게 논의되어 있다.
이러한 방식으로, 관절의 구조 및 조성의 특성 중 하나 이상과 물리학적으로 그리고 생물학적으로 유사하고 관절 표면으로부터의 깊이에 따라 달라지는 인공 연골 조직을 제공한다. 본 발명의 조작된 연골은 천연적으로 생성되는 관절 연골에서 발견되는 부위와 유사한 구별되지만 연속적인 층을 제공하며 천연 관절의 특성을 용이하게 복제해낼 수 있다. 예를 들어, 조작된 연골은 조직의 바깥 표면으로부터 증가하여 조직의 중간 부위에서 최대량에 이르고 다시 조직의 깊은 층으로 들어갈수록 감소되는 프로테오글리칸 농도를 가질 수 있다. 유사하게, 가장 바깥층은 연골 조직의 주요 윤활제인 Del1 및/또는 표면 부위 단백질(SZP)를 분비하는 활막세포 및/또는 표면-접평면 연골세포와 같은 세포를 함유하여 천연 연골의 기능을 흉내낼 수 있다.
본 발명은 또한 중층의 조작된 연골조직을 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명의 조작된 연골조직을 생산하는 한 가지 방법을 도 1에 나타내었다. 이 방법에 따르면, 일반적으로 골 (12)에 부착되어 있는 연골 (10)이 획득되고, 물리학적으로 두 개 이상의 표면-접평면 섹션 (14), 중간 전이 섹션 (16), 깊은-방사상 섹션 (18), 또는 석회화된 연골 섹션 (20)으로 나뉘어 진다. 연골세포 (22), (24), 또는 (26)은 각각의 연골부위로부터 획득된다. 단지 설명을 위해, 세포 (22)를 표면-접평면 섹션 (14)로부터 획득하고, 세포 (24)를 중간-전이 섹션 (16)로부터 획득하며, 세포 (26)를 깊은-방사상 섹션 (18)로부터 획득한다. 연골생성세포의 수는 증가된 연골생성세포 (28), (30), 및 (32)를 생산하기 위해 증가시킬 수 있다. 그런 다음, 연골생성세포에 특이적인 세포-결합 매트릭스를 갖는 연골생성세포인 (34), (36), 및 (38)을 생산하기 위해 증가된 연골생성세포 (28), (30), 및 (32)를 배지 중에서 또는 배지 상에서 선택적으로 증식시킨다. 여기서 알 수 있는 바와 같이, 이러한 단계들은 서로 다른 연골 부위의 세포를 혼합하지 않고 세포 (22), (24), 및 (26)에 대해서 수행한다. 세포-결합 매트릭스를 갖는 세포를 획득한 다음, 세포 및 그들의 세포-결합 매트릭스 (34), (36), 및 (38)을 함께 배양하여 일체화되고 중층 구조인 연골조직 (40)을 형성시킨다. 택일적으로는, 하나 이상의 연골생성세포 (22), (24), (26), (28), (30), 또는 (32)를 세포 매트릭스 없이 배양하여 중층 구조의 연골조직 (40)을 생산할 수 있다. 특히, 중층 연골의 표면 부위 (42)를 구성하는 세포는 세포외 매트릭스의 생산 없이 단일층으로서 배양될 수 있으며 상기한 바와 같은 그 이외의 셀 층과 함께 박층으로 이루어질 수 있다.
개별적인 연골층을 배양하는 바람직한 방법은 Masuda 등에게 허여된 발명의 명칭이 "in vitro Production of Transplantable Cartilage Tissue, CoheisveCartilage Produced Therapy, and Method for the Surgical Repair of Cartilage Damage"인 미국특허 6,197,061에 기재되어 있는 방법과 유사하게 수행될 수 있다. 일반적으로, 연골생성세포를 원하는 연골 부위로부터 분리하고, 연골생성세포-결합 매트릭스를 갖는 연골세포를 생산하기 위해 배양한다. 그런 다음, 연골세포 및 그들의 세포-결합 매트릭스를 반투과성막 상에서, 바람직하게는 하나 이상의 성장인자의 존재 하에서 배양하여 조작된 연골조직을 생산한다. 세포의 표현형을 특정 부위에 대하여 최적화하기 위해 다른 적절한 방법 및 기술을 사용할 수 있다.
연골세포/연골생성세포의 분리
본 발명의 방법에 유용한 연골생성세포를 원하는 표현형을 갖는 연골생성세포를 함유하는 본질적으로 임의의 조직으로부터 분리할 수 있다. 여기에서 사용된 바와 같이, 용어 "연골생성세포"는 적절한 자극에 노출될 경우 연골조직에 특징적인 성분을 생산하고 분비할 수 있는 세포로 분화할 수 있는 임의의 세포를 이미하는 것으로 이해된다. 연골생성세포는 이미 존재하는 연골조직, 예를 들어 히알린 연골, 탄성 연골, 또는 섬유 연골로부터 직접분리할 수 있다. 특이적으로, 연골생성세포를 관절연골(하중부하 관절 또는 비하중부하 관절), 늑연골, 코연골, 이개연골, 기관연골, 후두덮개연골, 갑상선 연골, 모뿔연골, 또는 윤상연골로부터 분리할 수 있다. 바람직하게는, 연골생성세포를 표면-접평면 섹션, 중간-전이 섹션, 깊은-방사상 섹션, 및 석회화된 연골 섹션으로 나누어지는 관절연골로부터 획득한다. 이러한 섹션들은 충분한 깊이의 관절연골을 우선 획득한 다음, 그 조직을 커팅 장치를 사용하는 것과 같이 물리학적으로 적절한 섹션으로 분리함으로써 수행될수 있다.
택일적으로는, 연골생성세포를 골수로부터 분리할 수 있다. 예를 들어, 미국특허 5,197,985 및 4,642,120과 Wakitani 등, J. Bone Joint Surg. 76:579-591 (1994) 참조. 연골생성세포는 또한 줄기세포, 활막, 슬관절반월연골(menisci), 힘줄, 인대, 또는 그 이외의 적절한 원천으로부터 유래할 수도 있다.
적절한 연골세포는 인간, 오랑우탄, 원숭이, 침팬지, 개, 고양이, 렛트, 마우스, 말, 소, 돼지 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 적절한 포유류 생물로부터 분리해 낼 수 있다. 연골세포는 정상 연골 또는 정상 연골 또는 어떤 방식으로 손상되었다고 알려져 있는 연골을 갖는 원천으로부터 분리할 수 있다.
본 발명의in vitro세포배양장치의 제조를 위해 사용되는 연골세포를 임의의 적절한 방법으로 분리할 수 있다. 다양한 출발물질 및 연골세포 분리방법이 공지되어 있다(일반적으로, Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques, 2d ed., A. R. Liss Inc., New York, pp. 137-168 (1987); Klagsburn, "Large Scale Preparation of Chondrocytes", Methods Enzymol. 58:560-564 (1979)).
출발물질이 연골세포가 본질적으로 존재하는 유일한 세포 유형인 조직, 예들 들어 관절 연골일 경우, 세포는 종래의 콜라게나제 분해 및 조직 배양 방법에 의해 직접적으로 획득될 수 있다. 택일적으로는, 세포를 출발물질에 존재하는 다른 세포 유형으로부터 분리할 수 있다. 연골세포를 분리하기 위한 공지의 방법중 하나는 플라스틱 조직 배양 용기에 대한 차별적인 부착을 포함한다. 제 2의 방법에서는, 연골세포 표면 마커에 부착하는 항체를 조직배양 플레이트에 코팅시킨 다음, 불균질의 세포 집단으로부터 연골세포를 선택적으로 결합시키는데 사용할 수 있다. 제 3의 방법에서는, 연골세포-특이적 항체를 이용한 형광 활성 세포 선별기(FACS)를 이용하여 연골세포를 분리한다. 제 4의 방법에서는, 부양성 있는 밀도에 기초하여, Ficoll 또는 Percoll과 같은 밀도 구배를 통해서 원심분리에 의해 연골세포를 분리한다.
어떤 경우에는 분화된 연골세포보다 오히려 연골세포 줄기세포를 이용하는 것이 바람직할 수 있다. 분화를 위한 줄기세포 또는 분화변환에 적절한 분화된 세포를 분리할 수 있는 조직의 예로는 태반, 탯줄, 골수, 피부, 근육, 골막, 연골막, 또는 지방조직이 있다. 체외배양 및/또는 종래의 방법을 이용하여 주위의 매트릭스를 효소분해 함으로써 이러한 조직들로부터 세포를 분리할 수 있다.
연골세포-결합 매트릭스의 생산을 위한 배지에서의 배양
분리된 연골세포/연골생성세포를 바람직하게는 약 104세포/ml 이상의 밀도로, 아가로오스와 같은 가역성 겔 또는 소듐 알기네이트 용액을 포함한 적절한 배지에 현탁시킨다. 세포 결합 매트릭스를 생산하기 위해 연골세포를 배양하는 바람직한 방법이 Hauselmann 등, "Adult Human Chondrocytes Cultured in Alginate Form A Matrix Similar to Native Human Articluar Cartilage", Am. J. Physiol. 271 (Cell Physiol. 40): C742-C752 (1996)에 개시되어 있다. 연골세포 표현형에 특이적이고 in vivo에서 발견되는 유사한 세포-결합 매트릭스를 연골세포 막 상에생산하는데 도움이 되는 표현형 형태를 유지하는데 효과적인 조건 하에서 세포를 배양한다. 바람직하게는, 연골세포를 최소 약 5 일동안 알기네이트에서 배양하여 세포-결합 매트릭스를 형성하도록 한다. 연골세포가 배양되는 배지는 우태아혈청과 같은 자극제를 함유할 수 있다.
한 구현예에서는, DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium) 및 Ham's F12 배지를 동일한 분량 함유하고, 20%의 우태아혈청(Hyclone, Logan, UT) , 약 25 ㎍/ml 아스코르베이트 및 50 ㎍/ml 겐타마이신(Gibco)과 같은 항생제을 함유하는 성장배지에 연골세포를 배양한다. 또 다른 접근에서는, 계속적인 배지의 펌핑을 가능하게 하는 밀폐된 챔버에 연골세포를 배양한다. 바람직하게는, 배지는 약 10 ng/ml 이상의 농도로 내인성 인슐린-유사 성장인자-1을 함유하는 우태아혈청을 함유한다. 이러한 사용에서, 우태아혈청은 또한 성장인자로서 여겨질 수 있다. 세포-결합 매트릭스의 형성을 최대한 촉진시키기 위해 외인성으로 배지에 부가할 수 있는 적절한 성장인자로는 골발생 단백질(OP-1), 골형태발생 단백질-2와 그 이외의 골형태발생 단백질, 변환성장인자 베타, 및 인슐린-유사 성장인자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명이 또 다른 측면에서, 연골세포 배양 배지는 외인성으로 부가된 특정 성장인자를 더 포함할 수 있다. 특정 성장인자의 부가는 매트릭스 형성의 효과적인 자극제로서 작용할 수 있다. 성장인자의 예로는 골발생 단백질-1, 골형태발생 단백질-2, 그 이외의 골형태발생 단백질, 변환성장인자 베타, 및 인슐린-유사 성장인자, 그리고 우태아혈청에 존재하지 않는 성장인자가 있다. 본 발명의 이러한측면에서, 성장인자는 바람직하게는 세포-결합 매트릭스의 형성을 최대한에 가깝게 촉진시키는 양으로 배지에 부가한다.
바람직하게는, 성장배지에서 연골세포 또는 연골생성세포의 증폭은 증폭이 단일층 배양에서 수행될 때 일어나는 연골세포 표현형의 손실을 유도하지 않는다. 일반적으로, 연골세포 표현형은 (i) 적절한 형태를 가지며, 매트릭스 내에 적절한 양의 타입 I 콜라겐을 축적시키지 않으면서 원하는 연골 부위에 해당하는 (ⅱ) 아그레칸, 및 (ⅲ) 타입 Ⅱ 콜라겐을 상당한 양만큼 합성하고, 분비하고, 및/또는 매트릭스 내에 축적시키는 능력을 갖는 세포를 말한다. 알기네이트에서 배양되는 연골세포는 그들의 표현형(연골세포에 전형적인)을 보유하며, 많은 양의 매트릭스를 유지한다. 매트릭스는 조직학적으로 히알린 연골과 유사하며 아그레칸 및 콜라겐 타입 Ⅱ가 풍부하다.
표현형이 안정한 연골세포는 또한 그 주요 거대분자를 연골-유사 매트릭스에 통합시키는 능력을 보유한다. 정상 연골세포는 번역되지 않는, 콜라겐 타입 I에 대한 적은 양의 mRNA를 발현할 수 있다. 또한, 알기네이트에서 수개월간 배양된 관절 연골은 약간의 콜라겐 타입 I 분자를 합성할 수 있지만, 그 콜라겐은 매트릭스를 형성하는데 절대 통합되지 않는다. 결과적으로, 배지에서 새롭게 합성된 소량의 콜라겐 타입 I 분자의 출현은 반드시 탈분화의 개시를 나타내지는 않는다. 또한, 히알루로난은 많은 양의 다른 세포 타입에서도 합성되기 때문에 연골세포 표현형의 마커가 아니다. 그러나, 그것은 연골 매트릭스의 중요한 구성요소이다. 표면 연골세포는 표현형적으로 표면 부위 단백질(SZP)를 분비하며, 매우 특수화되어 있어 중간 부위 또는 깊은 부위 연골세포와 현저히 다르다.
표현형적으로 안정한 세포는 바람직하게는 콜라겐보다 아그레칸을 약 10 배 이상 더 합성한다. 또한, 매트릭스에서의 아그레칸:히알루로난의 비율은 바람직하게는 약 10 이상이다. 당업자는 표현형 안정성은 배양된 세포의 표현형에 따라, 즉 표면 부위, 중간 부위, 또는 깊은 부위에 따라 달라지며, 따라서 콜라겐, 아그레칸, 히알루로난의 양은 연골세포의 타입에 의존하여 변화할 것이다.
세포-결합 매트릭스를 갖는 연골세포
알기네이트에서의 연골세포의 배양에 의해, 두 개의 부분: (i) 천연 조직의 세포주위 매트릭스 및 영역바탕질과 대사적으로 유사한 세포-결합 매트릭스 부분, 및 (ⅱ) 천연 조직의 비영역바탕질(interritorial matrix)와 대사적으로 유사한 더 제거된 매트릭스로 조직화되는 ECM이 생성된다.
중층 연골을 생산하기 위해 세포-결합 매트릭스를 갖는 연골세포를 사용한다고 할지라도, 고도로 체계화된 세포-결합 매트릭스를 각각의 연골세포 주위에 형성시키는 것이 여러 가지 이유로 바람직하다. 첫째, 세포-결합 매트릭스는 안코린(anchorin) CⅡ(콜라겐과 결합한다) 및 CD44(프로테오글리칸 응집물에서 히알루로난과 결합한다)와 같은 수용체를 경유하여 세포에 고정된다. 일단 이러한 매트릭스가 복구되면, 세포는 탈분화를 거의 하지 않게 된다. 둘째, 연골세포는 프로테오글리칸 아그레칸을 변환(turnover)시켜 이러한 매트릭스를 상대적으로 신속하게 재구성한다. 또한, 세포 결합 매트릭스는 (i) 막 결합 탄력성 PGs 및 (ⅱ) 환형 가교 콜라겐 미소섬유가 풍부하다. 그 결과, 연골세포는 세포를 변형으로부터 보호하는 자신의 방어적 껍질을 갖는다. 연골세포는 또한 추가로 제거된 매트릭스를 재구성하는데 있어 일반적으로 효과가 적다.
바람직하게는, 알기네이트에서 배양하는 동안 생산되는 ECM의 세포-결합 매트릭스 부분은 ECM을 생산하는 연골생성세포의 표현형에 적절한 아그레칸(주요 연골 프로테오글리칸), 콜라겐 타입 Ⅱ, Ⅸ, 및 ⅩⅠ, 그리고 히알루로난을 포함한다. 아그레칸 분자는 히알루로난 분자를 경유하여 연골세포막 상의 수용체(CD44 포함)에 결합된 응집물에서 주로 형성된다.
세포-결합 매트릭스의 각각의 성분의 상대적인 비율은 배양 시간의 길이에 따라 달라진다. 바람직하게는, 모든 연고층을 함께 검사한 균질화된 세포-결합 매트릭스는 아그레칸이 약 5 mg/cc3이고, 아그레칸:히알루로난(mg/mg) 비율은 10:1 내지 200:1이고, 아그레칸:콜라겐(mg/mg) 비율은 1:1 내지 약 10:1 이다. 또한, 세포-결합 매트릭스(각각의 세포 주위) 및 추가로 제거된 매트릭스(세포 사이)의 분자 조성은 배양 조건의 특정 변경에 의해 변화될 수 있다. 이러한 변경은 배양 시스템의 물리적 배열과 다양한 성장인자의 적용을 연루한다. 매트릭스 생성 및 조직화의 조작은, 연골 손상의 수술 치료를 위한in vitro관절 연골의 조작의 중심이다.
바람직하게는, 콜라겐의 함량 및 콜라겐의 피리디놀린 가교의 양은 배양 시간에 따라 증가한다. 특히 가교가 배양 2 주 후에 농도의 급격한 증가를 나타내었다. 배양 기간의 길이를 상대적으로 짧게 유지함으로써, 세포-결합 매트릭스의 콜라겐 미소섬유는 과도하게 가교되지 않는다. 기능적 특성이 좋으나 상대적으로 가교가 부족한 조직은 조작하기 더 쉽다. 더 성숙한 연골을 시뮬레이션(simulation) 하고자 할 경우에는 더 많은 양의 가교를 갖는 조직이 바람직할 수 있다.
세포-결합 매트릭스를 갖는 연골세포의 회수
바람직하게는, 세포-결합 매트릭스를 갖는 연골세포의 회수는 충분한 배양 기간 후에 알기네이트 겔을 가용화 함으로써 수행한다. 알기네이트 겔을 우선 공지의 방법을 이용하여 가용화 한다. 그리하여 생성된 세포 현탁액을 원심분리하고, 펠렛에서 세포-결합 매트릭스를 갖는 세포를 상청액의 추가로 제거된 매트릭스의의 구성성분으로부터 분리한다.
바람직하게는, 상기 단계는 함께 부착성 연골 조직을 형성하는 층을 배양하기 전에 각각의 연골생성세포 표현형에 대하여 병렬적으로(in parallel) 수행된다.
반투과성 막에서의 세포-결합 매트릭스를 갖는 연골세포의 배양
본 발명의 이러한 측면에서, 상기한 바와 같이 분리한, 세포-결합 매트릭스를 갖는 연골세포를 반투과성 막 위에서 층상으로 배양하였다. 택일적으로는, 세포-결합 매트릭스가 없는 하나 이상의 세포층을 상기 배양시 부가하여 부착성 연골조직을 생성시킬 수 있다. 바람직하게는, 세포 배양 인서트(insert)를 플라스틱 지지체 프레임 상에 놓고, 배양 배지가 세포 배양 인서트 주위를 흐르게 한다. 이러한 측면에서, 세포 배양 인서트는 반투과성 막을 포함한다. 반투과성막은 연골세포 및 세포-결합 매트릭스를 완전히 담그는 것만큼 효과적인 양으로 배지가 세포배양 인서트로 흐르도록 한다. 일 구현예에서, 반투과성막은 화학적으로, 효소적으로, 또는 생물학적으로 분해 가능하다. 또 다른 구현예에서, 부착성 중층 연골 조직은 또 다른 사용을 위해 반투과성막으로부터 제거한다.
바람직하게는, 반투과성막은 연골세포의 주위로부터 부산물의 확산은 허여하면서도 연골세포의 영양물에 대한 계속적인 접근을 허여한다. 이러한 측면에서, 상기 막은 연골세포가 공극을 통해 이동하고 막에 고정되는 것을 막는데 효과적이고 바람직하게는 약 5 미크론 미만인 공극 크기를 가져야 한다. 또한, 사용되는 막은 막이 배양 프레임으로부터 찢겨지지 않고 제거될 수 있도록 그 막이 충분한 강도를 가지며 막 상의 조직이 조작되고 원하는 크기로 잘려질 수 있도록 충분한 강도를 갖는데 효과적인 공극 밀도를 가져야 한다. 바람직하게는, 상기 막은 약 8x105공극/cm2이상의 밀도를 가져야 한다. 상기 막은 배양에 사용하기에 적절한 임의의 물질로 제조될 수 있다. 적절한 막 시스템의 예로는 (i) Falcon Cell Culture Insert 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 막[공극 크기: 0.4 내지 3 미크론, 직경: 12 내지 25 mm]; (ⅱ) Costaer Transwell Plate[폴리카보네이트막, 공극크기: 0.1 내지 5.0 미크론, 직경: 12 내지 24.5 mm]; (ⅲ)Nunc Tissue Culture Insert(폴리카보네이트막 인서트: 공극 직경- 0.4 내지 3.0 미클론, 직경- 10 mm 내지 25 mm); Millicell Culture Plate Insert(PEFE(폴리테트라플루오로에틸렌) 막, 폴리카보네이트, 공극 크기- 0.4 내지 3.0 미크론, 직경: 27 mm)이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 복구된 세포-결합 매트릭스을 갖는 세포를 중층 부착성 연골 매트릭스의 형성을 허여하는데 효과적인 시간동안 반투과성막 상에서 배지 중에서 더 배양한다. 표준 배양 조건 하에서, 배양 시간은 일반적으로 약 3 일 이상일 것이다. 이식 이전에 매트릭스 성숙의 부분적인 억제는 성숙한 연골만큼 딱딱하지 않지만 조작 동안 그 형태 및 구조를 보유할 만큼 충분한 장력 강도를 갖는 매트릭스를 제공하는데 있어 중요하다. 일 구현예에서, 그러한 조직은 외과적 복구치료 시 손상된 연골에 끼워 넣기에 충분히 적응성이 있어야 한다.
부착성 연골조직을 생산하는데 있어, 세포-결합 매트릭스를 갖거나 갖지 않는 연골세포를 서로 다른 물리적 또는 생화학적 조건 하에 놓아야 한다. 몇몇 구현예에서, 연골성 조직을 자유롭게 부푸는 조건 하에서 배양할 수 있다. 다른 구현예에서는, 연골을 유체의 흐름, 압축(정적 또는 동적), 전단력 조건, 또는 그들의 조합 하에서 배양할 수 있다. 부가적으로, 성장이 축(두께)의 방향으로만 일어나도록 하기 위해, 연골조직을 방사상으로 한정된 배열로 배양할 수 있다. 연골 매트릭스의 기계적 특성은, 연골조직이 막 상에서 배양되는 시간을 늘리거나 줄임으로써 조절할 수 있다. 배양 시간을 길게 하면 가교 밀도가 증가하게 될 것이다. 각각의 층에서의 연골세포 밀도는 복제된 연골 부위의 세포충실성을 반영하기 위해 원하는 것만큼 변화시킬 수 있다.
연골 매트릭스
바람직하게는, 반투과성막 상에 형성되는 연골 구조물은 아그레칸을 약 5 mg/cc3의 농도로 가지며, 상기 연골 매트릭스는 새롭게 합성된 분자가 프로테오글리칸 응집물에 통합되는 것을 허여하는데 효과적인 양의 히알루로난을 함유한다. 막 상에 형성된 연골 매트릭스는 응집된 아그레칸 분자를 5 mg/cc3초과의 농도로 함유하고, 아그레칸:히알루로난의 비율이 약 10:1 내지 약 200:1 이며, 아그레칸:콜라겐의 비율이 약 1:1 내지 약 10:1 이다. 본 발명의 방법에 사용된 조작된 연골은 짧은 시간 후에, 전형적으로는 약 14일 후에 천연적으로 생성되는 관절 연골과 물리화학적 특성에 있어 매우 유사하다. 또한, 반투과성막으로부터 조작된 연골을 제거하는 것이 바람직하다.
일반적으로, 조작된 연골 조직은 막에 순응하는 디스크-유사 구조를 가질 것이지만, 연골 구조물은 디스크-유사 구조를 가질 필요가 없다. 본 발명의 이러한 측면에서, 연골 구조물의 형태는 정형외과 의사가 조직(디스크 또는 쉬트 중 어느 하나)을 다루고, 손상부위에 맞춰 끼울 필요가 있는 크기로 자를 수 있을 정도로 효과적이어야 한다. 연골 구조물의 크기는 일반적으로 손상 부위의 크기보다 약간 더 크다. 본 발명의 조작된 중층 연골 조직은 원하는 손상 부위에 수술로 이식될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예는 서로 다른 시험 약물의 조작된 연골조직에 대한 효과를 시험하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에서는, 조작된 연골 조직을 하나 이상의 화합물(시험 약물)에 노출시켜서, 이러한 약물들이 연골조직의 성장, 항상성 균형, 및/또는 분해에 어떠한 영향을 미치는지를 결정한다. 본 배양 시스템 및 방법은 또한 매트릭스 항상성과 균형을 이루는 동화작용 및 이화작용을 연구하는데 유용하다. 한 방법에서는, 관절 연골의 물리학적 특성 및 화학적 및 생물학적 구성성분과 효과적으로 유사해지도록, 조작된 연골 조직을 배양한다. 조작된 연골 조직을 배양 시스템에서 사용하여, 시험 약물을 단독으로 또는 다른 약물과 함께 조작된 연골 조직의 물리적 화학적 구성성분에 대한 효과를 결정한다. 여기에서 사용된 바와 같이, 용어 "시험 약물"은 시험 화합물을 투여 시 연골 발달의 단계에서 연골조직에 대한 알려진 조정 효과가 없는 화학적 화합물로 정의된다. 따라서, 당업자는 용어 "시험 약물"이 시험 대상 약물 및 화합물이 시험되는 연골의 발달 단계를 최소로 포함하는 여러 인자에 의존한다는 것을 알 것이다. 그러므로, 동일한 화합물이 세포-결합 매트릭스를 생산하는 연골생성세포의 배양과 같은 한 연골 발달 단계에서는 시험 화합물이지만, 연골 발달의 또 다른 단계에서는 화합물이 그 연골 발달의 단계에 대한 공지의 효과를 가지기 때문에 시험 화합물이 아닐 수 있다.
배양 시스템에서, 조작된 연골을 시험 약물과 접촉시킨다. 매트릭스 메탈로프로티나제(MMPs) 및 세린 프로티나제를 포함한, 연골에 직접 작용하는 공지의 조절제; 또는 메탈로프로티나제의 조직 억제제(TIMPs), 인터류킨-1 수용체 길항제(IRAP), 및 시토킨 종양괴사인자-α(TNF-α) 또는 인터류킨-1(IL-1)과 같은 직접적으로 작용하는 이러한 화합물을 유도하거나 억제하는 조절제의 존재 또는 부재 하에서, 시험 약물을배양 시스템에 적용할 수 있다. 유사하게, 하나 이상의 부가적인 시험 약물의 존재 하에서, 시험 약물을 배양 시스템에 적용할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 시험약물은 IL-1 및 성장인자와 같은 연골조직의 공지의 조절제가 아니다. 그러므로, 시험 약물은 (i) 연골조직, (ⅱ) 연골 조직에 직접적으로 작용하는 화합물, (ⅲ) 연골 조직에 직접저긍로 작용하는 화합물의 조절잘에 직접적으로 작용하는 화합물일 수 있다.
유사하게, 시험 약물은 상기 논의한 조작된 연골 생명주기의 하나 이상의 다양한 단계에서 배양 시스템에 적용할 수 있다. 예를 들어, 시험 약물은 (i) 세포-결합 매트릭스를 생산하기 위해 성장 배지에서 연골생성세포를 배양하는 단계; (ⅱ) 연골세포 및 세포-결합 매트릭스를 회수하는 단계; (ⅲ) 중층, 부착성 조작된 연골 조직을 생산하기 위해 연골세포 및 세포-결합 매트릭스를 배양하는 단계; 또는 (ⅳ) 중충, 부착성의 조작된 연골조직을 획득하는 단계 직전, 그 중, 또는 직후 분리된 세포와 접촉시킬 수 있다. 이러한 방법으로, 시험 약물을 (i) 연골세포 생존가능성 유지; (ⅱ) 연골세포 표현형 유지; (ⅲ) 세포-결합 매트릭스의 성장의 조절; (ⅳ) 연골 매트릭스 생산 및 성장의 조절; (ⅴ) 연골 항상성의 조절; 또는 (ⅵ) 연골 분해의 조절 중 어느 것 또는 모든 것에 대한 활성에 대해 검사할 수 있다.
바람직하게는, 시험 약물의 효과가 보다 용이하게 평가될 수 있도록 비교를 위해 대조 실험을 수행한다. 전형적으로, 대조 실험은 시험 약물, 시험 약물의 하나 이상의 조합, 연골 조직에 직접 작용하는 하나 이상의 화합물, 또는 연골에 직접 작용하는 하나 이상의 조절제를 배제할 것이다.
이러한 구현예는 약물의 시험이 상대적으로 짧은 시간 후에 완료될 수 있기 때문에 그 자체에 높은 효율의 스크리닝 방법을 부여한다. 유사하게, 많은 양의조작된 연골 조직을 빨리 획득할 수 있으며, 멀티-웰 플레이트에 샘플링 하기 위해 작은 샘플을 그것으로부터 제거하여 즉각적인 스크리닝 방법을 자동화할 수 있다. 여러 조직 샘플을 동일한 조각의 조작된 조직으로부터 획득할 수 있기 때문에, 본 발명의 방법에 따라 얻어진 데이터의 인트라어세이(intraassay) 및 인터어세이(interassay) 생존성은 매우 낮다. 조작된 연골을 멀티-웰 플레이트의 동일한 웰에서 배양하고 시험할 수 있기 때문에, 조작 또는 조직의 동요을 거의 필요로 하지 않으므로, 거 현저히 본 발명은 경제적으로 이루어질 수 있다. 본 발명의 또 다른 현저한 이점은 시험이 전형적으로 방사성동위원소 라벨링을 사용함으로써 수행되는 외부 방사성 활성을 부가하지 않고 완료될 수 있다는 사실에서 기인한다.
연골 조직의 시험 약물 또는 조절제로 처리한 후에 조작된 연골 구성성분을 정량하기 위해 비-방사성 활성 기술을 이용할 경우, 조작된 연골 매트릭스를 효소로 분해시키는 것이 바람직하다. 연골 매트릭스의 효소 분해는 파파인, 키모파파인, 프로나아제, 및 프로티나제 K와 같은 하나 이상의 프로테아제를 이용하여 이룰 수 있다. 효소 분해 후, 연골의 프로테오글리칸 함량 및 DNA 함량을, DMMB 방법 및 Hoechst 33258-염료 방법과 같은 당업계에 널리 공지된 여러 방법을 이용하여 측정할 수 있다.
본 발명의 배양 시스템은 또한 물리학적 손상과 류마티스성 관절염과 같은 질병 상태를 포함한 연골 조직의 서로 다른 병리학적 상태를 흉내내기 위해 사용될 수 있다. 이러한 구현예에 따르면, 연골을 배양한 다음, 조작된 연골 조직을 물리적으로 자르거나 찢는 것과 같이 인위적으로 손상시키거나, 염증 인자 및 연골 매트릭스를 분해하는 화합물과 같은 질병의 진행을 유발한다고 알려져 있는 인자로 처리한다. 그런 다음, 병리학적 상태를 흉내낸 조작된 연골을 상기한 바와 같이 하나 이상의 시험 약물로 처리하여, 그 시험 약물이 그 병리학적 상태에 미치는 효과를 결정할 수 있다. 다른 경우와 같이 이러한 구현예에서, 유전적 손상과 같은 어떤 손상을 갖는다고 알려져 있는 연골생성세포 또는 주어진 손상을 일으키도록 유전학적으로 조작된 연골생성세포를 분리하는 것이 바람직할 수 있다.
시험 약물이 연골 생산의 상향조절, 연골 분해 억제, 또는 연골 분해 증진과 같은 원하는 특성을 갖는 것으로 확인된 후에는, 시험 약물을 확인한 다음 치료제를 생산하기 위해 시험약물을 분리하거나 화학적으로 합성할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 연골조직의in vitro또는 in vivo 치료에 유용한 의약품을 제조하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 여기에 기재된 방법을 수행하기 위한 키트를 제공한다. 일 구현예에서, 키트는 여기에 기재된 임의의 방법을 수행하기 위한 지시사항(instruction)으로 구성된다. 그 지시사항은 종이, 컴퓨터 판독 매체 등에 인쇄된 것과 같이 실재하는 매체를 통한 임의의 이해 가능한 형태로 제공될 수 있다. 본 발명의 키트는 또한 본 발명의 실행을 용이하게 촉진시키기 위해 하나 이상의 시약, 완충제, 배양 배지, 배양 배지 보충물, 조작된 연골을 분해할 수 있는 효소, 연골 조직의 특정 성분을 염색하거나 라벨링하기 위한 채색 또는 형광 염료, 조작된 연골의 특정 성분을 라벨링하기 위한 방사성 동위원소, 및/또는 멀티-웰 플레이트와 같은 일회용 실험 기구를 포함할 수 있다. 바람직한 키트의 구성요소의 예는 상기 기재 및 하기 실시예에서 찾을 수 있다.
본 발명의 방법 또는 조성물은 상기 논의된 단계 또는 조건을 모두 또는 임의로 선택하여 포함할 수 있다. 따라서, 개시된 방법의 일부에서 어떤 단계가 삭제될 수 있는지 또는 어떤 부가적인 단계가 방법의 생존성에 영향을 미치는 것 없이 수행될 수 있는지 당업자에게 매우 명백하다.
본 발명을 하기 비제한적 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다.
실시예
실험 프로토콜: 표면(0-200 ㎛) 및 중간 부위(400-1600 ㎛)로부터의 관절 연골 슬라이스를 송아지 무릎(1-3 주령, 6 마리 동물)의 페모로파텔라(femoropatellar) 그루브로부터 획득하였다. 표면 및 중간 부위 연골세포 서브집합체를 0.2% 프로나아제(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)로 1 시간동안 그리고 0.025% 콜라게나제 P(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)로 12 시간동안 순차적인 분해(Mok, 등, J.Biol. Chem. 269, 33021-7 (1994))에 의해 분리하였다. 연골세포를 4x106세포/ml로 150 mM NaCl 중이 1.2 % 알기네이트(Keltone LV, Kelco, Chicago, IL)에 현탁하고, 알기네이트를 작은 비드로서 폴리머화 하기 위해 22 게이지 바늘로부터 102 mM CaCl2용액으로 짜냈다. Hauselmann 등, Matrix 12, 116-29 (1992). 그런 다음, 알기네이트 비드를 첨가제(10% 우태아혈청, 25㎍/ml 아스코르베이트, 100 U/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신, 0.25 ㎍/ml Fungizone, 0.1 mM MEM 비필수 아미노산, 0.4 mM L-프롤린, 2 mM L-글루타민)와 함께 DMEM/F12를 함유하는 T-175 플라스크로 옮겼다. 세포 및 그 결합 매트릭스(CM)를 150 mM NaCl 중의 55 mM 소듐 시트레이트를 이용하여 분비시켰다. 10 μM CellTrackerTMOrange CMTMR(중간) 또는 Green CMFDA(표면)(Molecular Probes, Eugene, Oregon)을 함유하는 배지에서 2 시간동안 배양함으로써 선택된 세포를 라벨링 하였다. 그런 다음 0.4 ㎛ 공극 크기를 갖는 폴리에스테르 막(Corning Inc., Corning, NY)을 갖는 6.5 mm 또는 12 mm 직경의 세포 인서트에 CM을 접종하여 cm2막 면적당 5 백만 세포의 최종 밀도를 이루었다. CM을 한번에 접종함으로써 S 및 M 구조물을 형성하였으나, 반면에 S/M 구조물은 중간 CM(2.5 백만/cm2)을 접종한 다음, 표면 CM이 18 시간 후에 초기 층을 합체하도록 하여 형성시켰다. 조직 배양물을 배지 내에 잘 담기 전에 모든 그룹을 밤새 배양하였다. 구조물을 1 또는 2 주동안 매일 배지(DMEM)를 교환하면서 배양하였다. 배양이 종료될 때, 구조물을 막으로부터 제거하고, 최신의 감지 마이크로미터(sensing micrometer)로 두께 및 무게를 측정하였다. 라벨된 세포가 존재하는 부위의 1 주 동안 배양된 구조물의 형광 및 위상차 광학 현미경 사진을 획득하였으며, 세포층을 가시화 하기 위해 동일한 필드를 Adobe Photoshop(Adobe Systems, San Jose, CA)을 이용하여 덮었다.
생화학적 분석: 어떤 구조물(시간점 당 유형별로 n = 6-19 구조물)을 생화학적 분석을 위해 이용하였다. 3 mm 직경의 펀치를 프로티나제 K(Roche Diagnostics)로 가용화 하고, 디메틸메틸렌 블루 분광학적 분석방법을 이용하여 DNA(Kim 등, Anal. Biochem. 174, 168-76 (1998)), 히드록시프롤린 g당 7.25g 콜라겐에 해당한다는 가정(Pal, S. 등, Collagen Rel. Res., 1, 151-76 (1981)) 하에히드록시프롤린으로서 콜라겐(Woessner, J.F., Arch. Biochem. Biophys. 93, 440-7 (1961)), 및 황산화 GAG에 대해 분석하였다. Farndale 등, Biochem. Biophys. Acta 883, 173-7 (1986).
기계적 시험: 다른 구조물(시간점 당 유형별로 n = 6-10 구조물)을 PBS(phsophate buffered serum)를 갖는 방사상으로 한정된 챔버로 옮겨서 한정된 압축 시험을 수행하여 평형의 한정된 압축율, HA0을 결정하였다. Chen 등, J. Biomechanics 34, 1-12 (2001).
면역조직화학: O.C.T.에서 냉동된 골지체로부터 SZP의 분비를 억제하기 위해, 제 3 세트의 구조물을 0.1 μM 모네신(Sigma-Aldrich)으로 16 시간동안 처리하고(Schumacher 등, J. Orthop. Res. 17, 110-20 (1999)), 구조물 표면을 40 ㎛ 두께의 섹션으로 잘랐다. 그 섹션들을 SZP 및 콜라겐 Ⅱ에 대해서 조사하였으며, 그 조사는 항-소 SZP 모노클로날 항체(mAb), 3-A-4, 마우스 mAb 항-콜라겐 Ⅱ 항체 칵테일(Chondrex, Redmond, WA), 돈느 마우스 IgG(Vector Labs)를 대조군으로 이용하여 Vectastain ABC Elite Kit(Vector Laboratories, Burlingame, CA)을 사용하여 제조사의 지시사항에 따라 하였다. 섹션들을 메틸 그린(Vector Labs)으로 2-5 분동안 실온에서 대조염색 하고 Crystal Mount(Biomeda, Foster City, CA)에 탑재하였다. 일련의 섹션을 0.4 M MgCl2, 0.025 M 소듐 아세테이트, pH 5.6 중의 0.1% Alcian Blue로 염색하여 GAG를 염색하였다. Aydelotte 등, Connect. Tissue Res. 18, 223-34 (1998), Scott 등, Histochemie 5, 221-33 (1965). SZP 및 콜라겐 Ⅱ의 양의 반응성 및 GAG 염색을 밝은 필드 조명(brightfield illumination)을 이용하여 광학현미경으로 입증하였다. SZP양성 및 음성 세포를 Adobe Photoshop을 이용하여 표시하고, NIH Image 1.62에서 캘리브레이션된 이미지를 이용하여 자유로운 표면으로부터 출발하는 500 ㎛ 빈(bins)에서 계수하였다. 구조물이 두께가 변화하기 때문에, 막 표면으로부터 400 ㎛ 및 200 ㎛ 사이의 수를 저장하였다.
SZP ELISA: 구조 배양물의 12 내지 14 일간 모은 매질의 개개의 샘플(타입당 9-13 개의 구조물)을 96 웰 플레이트의 웰에서 0.1 M 구아니딘-HCl(Sigma-Aldrich)를 함유하는 PBS, pH 7.4 중에서 4℃에서 밤새 방치하여 웰에 부착되도록 하였다. 정제된 SZP를 사용하여 22.5 ㎍/ml의 농도로 표준화 한, 표면 부위 연골 체외배양으로부터 소비된 배지를 또한 두배 희석해서 분석하여 S 자형 대조군 곡선을 생성시켰다. 플레이트를 0.1 % Tween-20(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)(PBS-T)를 함유하는 PBS로 잘 세척하고, 1 시간동안 PBS 중의 5% 무지방 우유로 비특이적 결합을 차단하였다. 플레이트를 세척하고, 0.1 % 소혈청 알부민(Sigma-Aldrich)을 함유하는 PBS로 mAb 3-A-4를 1:1000으로 희석한 것으로 1 시간 동안 배양하고, 세척한 다음, 상기와 같이 동일한 2차 항체의 1:1000 희석액으로 한 시간 더 배양하였다. ABTS 기질(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)를 15 분동안 적용하고 반응을 SDS 1% 수용액을 부가하여 정지시켰다. OD(optical density) 측정을 MMAX 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices, Menlo Park, CA) 상에서 405 nm에서 수행하였다. 세 개의 희석액에 대하여 최소-자승 S자형 피트에 기초하여 동등한 적절한 OD를 계산하였으며, 그런 다음 그것을 대조군 곡선을 이용하여 SZP 농도로 변환하였다.
웨스턴 블랏: 12 내지 14 일간 구조물 배양한 것으로부터 모은 배지 및 정제된 SZP를 콘드로이티나제 ABC(Seikagaku America, Rockville, MD)로 샘플 완충용액(0.1 M Tris 및 0.05 M 소듐 아세테이트, pH 8.0) 내에서 37℃에서 2 시간동안 분해하였다. 샘플을 동일한 부피의 2X Laemmli 샘플 완충용액과 혼합하고 5% SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동하기 직전에 3 분동안 끓였다. 분리된 단백질을 12 mM Tris, 0.3 mM EDTA, 및 6 mM 소듐 아세테이트를 함유하는 pH 7.4의 변환 완충용액(transfer buffer) 내에서 Immunobilon-P 막(Millipore, Burlington, MA)으로 밤새 4℃에서 250 mA로 이동시켰다. 그런 다음 막을 제거하고, PBS-T 중의 5 % 무지방 건조 우유(Nestle Food Company, Glendale, CA)로 30 분동안 차단하였다. 세척한 후, 막을 PBS-T 중에 1:200으로 희석한 mAb 3-A-4와 함께 1 시간동안 배양한 후에, 양고추냉이 퍼옥시다제 접합 염소-항-마우스 IgG(Pierce, Rockfold, IL) 2차 항체(1:100)와 함께 2 시간동안 배양하였다. 단백질을 하이퍼필름-ECL(Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ)로 가시화하였다. SZP의 적절한 분자량을 무지개 분자량 표준(rainbow molecular weight standards)을 이용하여 결정하였다.
통계학적 분석: 데이터를 평균±SEM으로 표현한다. 구조물 형태 및 배양 지속의 효과를 적절한 경우 Tukey post-hoc 테스트와 함께 Systat 5.2.1(Systat Software, Inc., Richmond, CA)을 이용하여 ANOVA에 의해 평가하였다.
실험 결과
알기네이트 회수 연골세포 방법을 이용하여 송아지 연골의 표면 부위 및 중간 부위로부터 각각 분리한 연골세포로부터 부착성 연골 구조물을 제조하였다. Masuda, K. 등, International Symposium on Molecular Cell Biology of Cartilage Development and Repair 70 (1999). 세 개의 구조물 타입: 균질한 표면(S), 균질한 중간(M), 및 중간 위에 표면이 놓여져 있는 중층구조(S/M)(도 1)을 형성하였다. 구별되는 세포층을 제조하여, 형광으로 라벨링된 표면 및 중간 부위 세포의 위치측정(데이터는 나타내지 않았음)에 의해 입증된 S/M 구조물로 유지하였다. 구조물 두께는 구조물 타입에 따라 변화하였으며(p < 0.001) 배양이 오래 이루어질수록 증가하였으며(p < 0.001), 배양 1 주 및 2 주 후에는 M 구조물이 S/M 구조물보다 현저히 더 두꺼웠으며, S/M 구조물이 S 구조물 보다 더 두꺼웠다(도 2a). 구조물의 습윤 중량은 두께 데이터와 일관된 방식으로 변화하였다(도 2b). DNA 함량이 1 내지 2 주에 증가하였으나(p < 0.01) 모든 구조물에서 유사하였으므로 세포 증식 또한 확실했다(p= 0.12)(도 2c).
연골 매트릭스 분자, 콜라겐 및 GAG를 다른 속도로 다양한 타입의 구조물에 이식되었다. 콜라겐 함량은 1 내지 2 주에 3 배가 되었으며(p < 0.001), S 구조물에서보다 M에서 현저히 더 많았고(p < 0.001), S/M 구조물에서는 중간 수준이었다(S에서는 p < 0.001. M에서는 p < 0.05)(도 2e). GAG 함량은 유사한 경향을 따랐지만(도 2d), 콜라겐보다 더 풍부했고, 1 내지 2 주에는 51%로 증가하였다(p < 0.001). 평형의 한정된 압축율은 비록 현저하지는 않았지만 시간에 따라 증가하였고(p = 0.06), S 구조물(p < 0.01) 및 S/M 구조물(p < 0.05) 보다 M 구조물에서 더 컸다(도 2f).
히알린 연골의 마커로서 사용되는 콜라겐 타입 Ⅱ가 모든 타입의 구조물의 두께에 걸쳐 면역조직화학에 의해 강력하게 검출되었다(도 3c,f,i). GAG(특히 콘드로이친 설페이트 및 케라탄 설페이트)를 Alcian Blue 염료를 사용하여 구조물 섹션 상에 가시화 하였다. 콜라겐 Ⅱ와 유사하게, GAG는 모든 섹션의 두께에 걸쳐 존재하였다(도 3 d,g,j). 염색은 S/M 구조물의 앞부분에서 더 짙었다(도 3j).
매트릭스에 보유되지 않는 분비되는 분자인 SZP를 모네신으로 치리된 구조물에서 면역조직화학에 의해 세포 내에서 검출되었다. SZP가 S 및 S/M 구조물 중의 많은 비율의 연골세포 내부에서는 면역위치결정(immunolocalization) 되었으나, M 구조물 내에서는 그러한 연골세포가 거의 없었다(도 3b, e, h). S 구조물의 양쪽 표면에 가까운 세포는 내부의 세포보다 강력하게 염색되었으며, 반면에 S 구조물에서 자유로운 표면의 세포는 그 이외의 세포보다 강력하게 염색된다. S/M 구조물에서의 이러한 패턴의 SZP 발현은 천연의 송아지 연골 중의 SZP 양성 세포의 급한 모노톤의 경사와 유사하다. 배양 2 주 후에, SZP 양성세포의 백분율은 최대치 200 ㎛에서 52 ± 15% 였고, 반면에 그 다음 200 ㎛는 36 ± 8% 였으며, 조직에 남아 있는 것은 단지 13 ± 14% 였다(도 4b). 그러나, S 구조물은 표면(위 200 ㎛에서 48 ± 16%이고, 아래 200 ㎛에서는 48 ± 14%) 및 내부의 하부 수준(200-400 ㎛에서 20 ± 9% 이고, 나머지 조직에서 29 ± 21%) 모두에서 유사한 정도를 나타내었다(도 4b). M 구조물은 위 200 ㎛에서는 2 ± 2% 내지 아래 200 ㎛에서는 15 ± 0%로 범위 전체에 걸쳐 SZP 양성세포를 낮은 수준으로 갖는다.
웨스턴 블랏에 의한 분석 시, 배양 12-14일에 수거한 배지 중의 SZP는 정제된 SZP와 같은 동일한 전기영동 이동성을 가졌으며, ~345kD의 적절한 분자량을 가졌다. 각각의 수거물에서의 SZP의 양을 ELISA로 정량하였다. S 구조물은 S/M 및 M 구조물 모두에서 보다 하루에 3 내지 4 배 더 많은 SZP인 21.5 ± 4.0 ㎍/[cm2*일]을 분비하였다(도 4a).
결과에 대한 토의
상기 결과는 연골세포 서브집단이 조직공학적으로 조작된 연골의 구조, 조성, 대사, 및 기계적 기능을 결정하는데 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 나타낸다. 표면 부위 연골세포로 형성된 구조는 상대적으로 중간 부위 연골세포로 형성된 구조물보다 상대적으로 낮은 매트릭스 함량과 압축 특성을 갖는다. 또한, 표면 및 중간 부위 세포를 층을 갖는 방식으로 조합할 경우, 조직은 표면 부위의 단지 몇몇 세포층만이 가장 많은 SZP 분비를 갖는, 천연 연골과 유사한 중간 매트릭스 특성 및 SZP 국소화를 나타낸다.
중층 구조물로 행하는 이러한in vitro연구는 세포충실성이 높고, SZP 층상배열, 및 낮은 압축율을 갖는 태아-유사 연골을 반복하였다(recapitulate). 성숙한 연골과 유사한 이런 조직은 생물학적 이식에 사용하기에 바람직할 수 있다. 어린 연골이 손상될 경우에는 치유되는 경향이 있으나(Namba 등, J Bone Joint Surg. 80-A, 4-10 (1998)), 반면에 성인의 연골은 생물학적 이식 시 잘 통합되지 않는 것으로 나타났다(Hunter, W. Philos. Trans. R. Soc. London 42, 514-21 (1743) 및DiMicco 등, Osteoarthritis Cartilage (in press), (2001)). 미성숙한 기계적 특성을 갖는 조작된 연골은 보다 충분히-발달된 매트릭스 특성을 갖는 조작된 연골보다 강한 통합력을 나타내었다. 또한, 어린 연골의 보다 큰 성장 잠재력이 이상이 있는 손상부위의 더 많은 완전한 충진(filling)을 가능하게 할 수 있다.
연골세포 서브집단은in vitro에서 분화할 수 있으며, 손상 부위에 이식된 후, 조작된 조직의 각 부위에 적절한 부위의 표현형을 갖는 세포를 제공하는 것은 조직에서의 세포이동 및/또는 분화의 필요성을 감소시킴으로써 조직 성숙 시간을 감소시킬 수 있다. 이 연구에서, S 구조물에서의 SZP 발현 세포의 수는 배양 지속시간과 함께 감소하였으나, SZP의 전체적인 생산은 증가하였고, 이는 표현형의 변화 및 SZP 생산의 복잡한 조절을 나타낸다. 이러한 구조물의 표면 가까이의 세포는 배양 기간 내내 양성으로 남아있고, 반면에 내부의 SZP 양성세포의 백분율은 감소하였다. 이것은 in vivo에서 확립된 바와 같이 연골의 무혈관성 특성으로 인해 조직에서의 영양 수준 또는 경사도에 따라 표현형 의존성이 나타난다는 것을 암시한다고 할 수 있다. 택일적으로는, SZP 발현은 세포-세포 또는 보다 유사하게는 세포-매트릭스 상호작용에 의해 억제될 수 있었다. 여기에 기재된 층상 스킴(scheme)은 세포를 적절한 부위로 국소화 하였으며 표현형 발현 패턴을 유지하였다.
천연 연골과 유사한 중층의 조작된 구조물은 특히 미래의 연골 손상의 복구에 유용할 수 있다. 이식 시 기능적 표면 부위를 제공함으로써, 이식 표면 상의 마모가 보호 및 윤활 분자의 생성으로 인해 감소될 수 있다. Flannery, C.R. 등.Biochem. Biophys. Res. Commun. 254, 535-41 (1999). 또한, SZP의 윤활효과가 통합을 방해하는 효과를 나타낼 수 있어, 숙주-이식 계면 상의 관절 표면 하부에서 바람직하지 않을 수 있다. 더욱이, 중간 및 깊은 부위의 연골세포를 마무리하는 매트릭스는 하중을 견디는데 필수적인 경도 및, 연골 통합에 주요 역할자로서 여겨지는 콜라겐과 같은 매트릭스 분자를 제공할 수 있다. DiMicco 등, J. Orthop. Res. 19, 1105-12 (2001).
실험 결과에 기초하여, SZP-음성 세포의 층 위에 SZP-발현 세포를 함유하는 층을 갖는 조직을 생산하는 방법을 확립하였다.
당해 기술분야에 통상의 지식을 가진 자에게 알려져 있는 바와 같이, 임의의 모든 목적을 위해 특히 발명이 상세한 설명을 제공함에 의해, 여기에 개시한 모든 범위는 임의의 모든 가능한 서브 범위 및 그 서브 범위의 조합을 포함할 수 있다. 여기에 열거한 모든 범위는 적어도 반쪽, 1/3, 1/4, 1/5, 1/10 등으로 붕괴되는 동일한 범위를 기재하고 가능하게 한다는 것을 용이하게 알 수 있다. 비제한적 실시예로서, 여기에서 논의한 각각의 범위는 용이하게 하부 1/3, 중간 1/3, 및 상부 1/3 등으로 붕괴될 수 있다. 당업자가 알 수 있는 바와 같이, "까지", "최소", "보다 큰", "미만", "보다 많은" 등은 상기한 바와 같이 이후에 하부로 붕괴될 수 있는 범위를 언급하거나 일컬은 숫자를 포함한다. 동일한 방식으로, 여기에 개시한 모든 비율은 더 넓은 비율 내에 있는 모든 하부 비율을 포함한다.
당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 또한 마쿠쉬 그룹과 같이 구성요소가 공통된 방식으로 함께 그룹핑되는 경우에 본 발명은 열거된 그룹 전체뿐만아니라 그 그룹의 각각의 멤버가 개별적으로 그리고 모든 가능한 주요 그룹의 하부 그룹을 포함한다는 것을 용이하게 인식할 것이다. 따라서, 모든 목적을 위해, 본 발명은 주요 그룹뿐만 아니라 주요 그룹 이외의 하나 이상의 그룹 멤버를 포괄한다. 본 발명은 또한 청구하고 있는 발명의 주요 구성요소중 하나 이상을 명백히 배제할 수 있다.
여기에 개시한 모든 참고문헌은 구체적으로 참고로 여기에 통합되어 있다.
바람직한 구현예를 설명하고 기재하였다고 하더라도, 하기 청구범위에서 한정된 더 넓은 측면에서 본 발명을 벗어나지 않으면서 당해 기술분야의 통상의 기술에 따라 변화 및 수정을 가할 수 있다는 것을 이해해야 한다.

Claims (35)

  1. (A) 두 개 이상의 연골층으로 구성되며, 각각의 연골층이
    (i) 천연 연골의 표면-접평면 부위;
    (ⅱ) 천연 연골의 중간-전이부위;
    (ⅲ) 천연 연골의 깊은-방사상 부위; 또는
    (ⅳ) 천연 연골의 석회화 연골 부위에 존재하는 연골세포에 해당하는 연골세포 표현형을 갖는 연골생성세포를 포함하는, 조직공학적으로 조작된 부착성 연골 구조물을 포함하는 배양된 중충 연골조직.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 연골생성세포는 연골세포 표현형에 해당하는 천연 연골 부위로부터 획득된 연골세포인 것을 특징으로 하는 연골조직.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 부착성 연골 구조물은 표면-접평면 부위의 연골세포의 연골세포 표현형을 갖는 연골생성세포로 구성된 제 1 층과 중간-전이 부위의 연골세포의 연골세포 표현형을 갖는 연골생성세포로 구성된 제 2 층이 서로 인접해 있는 것으로 구성되는 것을 특징으로 하는 연골조직.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 부착성 연골 구조물은 표면-접평면 부위의 연골세포의 연골세포 표현형을 갖는 연골생성세포로 구성된 제 1 층, 중간-전이 부위의 연골세포의 연골세포 표현형을 갖는 연골생성세포로 구성된 제 2 층, 및 깊은-방사상 부위의 연골세포의 연골세포 표현형을 갖는 연골생성세포로 구성된 제 3 층으로 구성되며, 상기 제 1 층은 제 2 층과 인접해 있고, 제 2 층은 제 3 층과 인접해 있는 것을 특징으로 하는 연골조직.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 부착성 연골 구조물은 중간-전이 부위의 연골세포의 연골세포 표현형을 갖는 연골생성세포로 구성된 제 1 층과 깊은-방사상 부위의 연골세포의 연골세포 표현형을 갖는 연골생성세포로 구성된 제 2 층이 서로 인접해 있는 것으로 구성되는 것을 특징으로 하는 연골조직.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 부착성 연골 구조물은 고체 지지체에 의해 지지되지 않는 것을 특징으로 하는 연골조직.
  7. 제 1 항에 있어서, 각각의 층은 연골세포 표현형이 결합되어 있는 연골 부위에 존재하는 연골 매트릭스에 해당하는 연골생성세포-결합 매트릭스를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 연골조직.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 세포-결합 매트릭스는 미성숙한 연골 또는 성숙한 연골에 해당하는 것을 특징으로 하는 연골조직.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 층중 하나는 표면 부위 단백질을 분비하는 표면-접평면 부위의 연골세포의 연골세포 표현형을 갖는 연골생성세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 연골조직.
  10. (A) (i) 천연 연골의 표면-접평면 부위;
    (ⅱ) 천연 연골의 중간-전이부위;
    (ⅲ) 천연 연골의 깊은-방사상 부위; 또는
    (ⅳ) 천연 연골의 석회화 연골 부위에 해당하는 연골세포 표현형을 갖는 제 1 그룹의 연골생성세포를, (ⅰ),(ⅱ),(ⅲ) 또는 (ⅳ)에 해당하는 연골세포 표현형을 갖는 하나 이상의 추가 그룹의 연골생성세포와 함께 배양하여, 제 1 연골층은 제 1 그룹의 배양된 연골생성세포를 포함하고 하나 이상의 추가 그룹 각각의 연골생성세포가 연속적인 연골층을 포함하는, 두 개 이상의 연골층으로 구성된 조직공학적으로 조작된 부착성 연골 구조물을 생성시키는 단계를 포함하는 중층 연골조직을 생산하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    (B) 제 1 그룹의 연골생성세포를 배양하여 제 1 그룹의 연골생성세포를 함유하는 제 1 세포-결합 매트릭스를 생성시키는 단계; 및
    (C) 하나 이상의 추가 그룹의 연골생성세포를 배양하여 하나 이상의 추가 그룹의 연골생성세포를 함유하는 하나 이상의 추가 세포-결합 매트릭스를 생성시키는단계를 더 포함하며, 상기 하나 이상의 추가 그룹의 연골생성세포 각각은 그 연골세포 그룹에 특이적인 세포-결합 매트릭스를 생성하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 제 1 세포-결합 매트릭스는 제 1 연골세포 표현형이 결합된 연골 부위의 연골 매트릭스에 해당하며, 하나 이상의 추가 세포-결합 매트릭스는 하나 이상의 추가 그룹의 연골생성세포의 특정 그룹의 연골세포 표현형이 결합된 연골 부위의 연골 매트릭스에 해당하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 11 항에 있어서, 상기 (B) 및 (C)는 알기네이트 배지에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 10 항에 있어서, 상기 제 1 그룹의 연골생성세포 및 하나 이상의 추가 그룹의 연골생성세포를 반투과성 배지 상에서 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 10 항에 있어서, 상기 제 1 그룹의 연골생성세포 및 하나 이상의 추가 그룹의 연골생성세포를 성장인자의 존재 하에서 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 10 항에 있어서, 상기 제 1 그룹의 연골생성세포 및 하나 이상의 추가 그룹의 연골생성세포를 그들의 표현형이 결합된 천연 연골 부위로부터 분리하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 10 항에 있어서, 상기 제 1 그룹의 세포는 표면-접평면 부위 연골세포에 대한 표현형을 가지고, 제 1 추가 그룹의 세포는 중간-전이 부위 연골세포에 대한 표현형을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 10 항에 있어서, 상기 제 1 그룹의 세포는 중간-전이 부위 연골세포에 대한 표현형을 가지고, 제 1 추가 그룹의 세포는 깊은-방사상 부위 연골세포에 대한 표현형을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 10 항에 있어서, 상기 제 1 그룹의 세포는 표면-접평면 부위 연골세포에 대한 표현형을 가지고, 제 1 추가 그룹의 세포는 중간-전이 부위 연골세포에 대한 표현형을 가지며, 제 2 추가 그룹의 세포는 깊은-방사상 부위 연골세포에 대한 표현형을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 10 항에 있어서, 조직공학적으로 조작된 부착성 연골 구조물을 관절에 외과적으로 이식하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 12 항에 있어서,
    (D) 하나 이상의 시험 약물을 (a) 제 1 그룹의 연골생성세포; (b) 하나이상의 추가 그룹의 연골생성세포; (c) 세포-결합 매트릭스를 갖는 제 1 그룹의 연골생성세포; (d) 세포-결합 매트릭스를 갖는 하나 이상의 추가 그룹의 연골생성세포; 및 (e) 조직공학적으로 조작된 부착성 연골 구조물로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 세포 또는 조직과 접촉시키는 단계; 및
    (E) 하나 이상의 시험 약물이 상기 접촉된 세포 또는 조직에 미치는 효과를 측정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 21 항에 있어서,
    (F) 원하는 특성을 갖는 하나 이상의 시험 약물을 동정하는 단계; 및
    (G) 하나 이상의 시험 약물을 치료약물로서 생산하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 21 항에 있어서, 상기 시험 약물을 연골조직의 공지의 조절제(modulator)의 존재 하에서 세포 또는 조직과 접촉시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 10 항의 방법을 수행하기 위한 지시사항을 포함하는, 중층 연골 조직 생산용 키트.
  25. 제 24 항에 있어서, 하나 이상의 염료, 배양 배지, 배양 배지 보충제, 또는 일회용 실험실 장비를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  26. 제 10 항의 방법으로 생산된, 조직공학적으로 조작된 부착성 연골 구조물.
  27. 적어도 제 1 연골층의 실질적으로 모든 연골세포가 동일한 연골세포 표현형을 갖는 연골세포를 함유하는 적어도 제 1 연골층으로 구성된 조작된 연골조직을 포함하는 배양된 연골조직.
  28. 제 27 항에 있어서, 제 2 연골층의 실질적으로 모든 연골세포가 동일한 연골세포 표현형을 갖는 연골세포를 함유하는 제 2 연골층을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 배양된 연골조직.
  29. 제 28 항에 있어서, 제 1 연골층의 연골세포가 제 2 연골층의 연골세포 다른 연골세포 표현형을 갖는 것을 특징으로 하는 배양된 연골조직.
  30. 제 28 항에 있어서, 상기 제 1 연골층의 연골세포의 연골세포 표현형과 제 2 연골층의 연골세포의 연골세포 표현형은 각각 독립적으로 천연 관절 연골의 표면-접평면 부위, 천연 관절 연골의 중간-전이 부위, 천연 관절 연골의 깊은-방사상 부위, 또는 천연 관절 연골의 석회화된 연골 부위에 존재하는 연골세포의 특징적인 표현형으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 배양된 연골조직.
  31. 제 27 항에 있어서, 연골세포를 둘러싸는 세포-결합 매트릭스를 더 포함하는것을 특징으로 하는 배양된 연골조직.
  32. 제 27 항에 있어서, 제 1 연골층의 연골세포 중 약 75% 이상이 동일한 연골세포 표현형을 갖는 것을 특징으로 하는 배양된 연골조직.
  33. 제 27 항에 있어서, 제 1 연골층의 연골세포 중 약 90% 이상이 동일한 연골세포 표현형을 갖는 것을 특징으로 하는 배양된 연골조직.
  34. 제 30 항에 있어서, 제 1 연골층의 연골세포 중 약 75% 이상이 동일한 연골세포 표현형을 가지며 제 2 연골층의 연골세포 중 약 75% 이상이 동일한 연골세포 표현형을 갖는 것을 특징으로 하는 배양된 연골조직.
  35. 제 30 항에 있어서, 제 1 연골층의 연골세포 중 약 90% 이상이 동일한 연골세포 표현형을 가지며 제 2 연골층의 연골세포 중 약 90% 이상이 동일한 연골세포 표현형을 갖는 것을 특징으로 하는 배양된 연골조직.
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