ES2693609T3

ES2693609T3 - Lámina de células cultivadas, método para su producción y método para su aplicación

Info

Publication number: ES2693609T3
Application number: ES06714889.0T
Authority: ES
Inventors: Masato Sato; Hideaki Sakai
Original assignee: Cellseed Inc; Tokai University Educational System
Current assignee: Cellseed Inc; Tokai University Educational System
Priority date: 2005-02-28
Filing date: 2006-02-28
Publication date: 2018-12-12
Anticipated expiration: 2026-02-28
Also published as: WO2006093151A1; JP2011224398A; EP1857126B1; JP4921353B2; JP5989705B2; EP1857126A4; DK1857126T3; US10533158B2; EP1857126A1; US20080226692A1; JPWO2006093151A1; JP2014155494A; JP5562303B2

Abstract

Una lámina de células cultivadas en íntimo contacto con un vehículo para su uso en un método para el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en artritis, una lesión cartilaginosa, una lesión osteocondral, una lesión del menisco, una degeneración de disco intervertebral, donde la lámina de células cultivadas expresa fenotipo de tejido condroide y tiene una adherencia superior al tejido cartilaginoso u óseo, donde la célula en la lámina cultivada es un tipo cualquiera o una combinación de dos o más tipos de células seleccionadas del grupo que consiste en: condrocitos, células condroprogenitoras, células derivadas de tejido sinovial, células madre derivadas de tejido sinovial, osteoblastos, células madre mesenquimales, células derivadas de tejido adiposo y células madre derivadas de tejido adiposo; y en donde no se incluye ningún andamio distinto al producido por las células cultivadas en la lámina de células cultivadas.

Description

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DESCRIPCION

Lamina de celulas cultivadas, metodo para su produccion y metodo para su aplicacion Campo tecnico

La presente invencion se refiere a una lamina de celulas cultivadas, un metodo de produccion y un metodo de tratamiento de la misma para su uso en campos como el medico y tejidos oseos biologicos y tejidos cartilaginosos.

Tecnica anterior

Japon esta convirtiendose en una sociedad envejecida que tiene la esperanza de vida mas alta del mundo como promedio. La gente esta empezando a poner un mayor enfasis en vivir mejor, es decir en la “calidad de vida” (QOL), que en el mero hecho de prolongar la vida. Un area que sigue suscitando atencion es la disfuncion motora. La artritis incluye una amplia variedad de enfermedades que llevan a una disfuncion motora; y en los Estados Unidos, mas de 70 millones de los pacientes que acudieron al hospital en 2002 se quejaron de tener smtomas de algun tipo de artritis o artropatfa cronica. Actualmente, uno de cada tres adultos presenta esta enfermedad. Por otra parte, se preve que este numero se duplique para el ano 2020. Como problema medico ocupa el segundo lugar despues de las enfermedades cardfacas y supone un coste de 86.200 millones de dolares en gastos medicos al ano. Entre los pacientes atendidos, mas de 20 millones de personas de mas de 45 anos de edad tienen osteoartritis, que es una de las formas mas comun de la artritis. En Japon, un gran numero de personas padece principio de osteoartritis, con un mdice de prevalencia de 30 % para personas con edades comprendidas entre 45 y 65 anos, y de 63 % a 85 % para personas mayores de 65 anos. Un millon de pacientes en Japon padecen osteoartritis y se preve que el numero de nuevos pacientes aumente 900.000 cada ano. Las enfermedades del sistema motor, como la osteoartritis y similares, difieren de las enfermedades de los organos en que rara vez son mortales. Sin embargo, estas enfermedades pueden limitar el movimiento de las extremidades y por lo tanto disminuyen notablemente la calidad de vida de la persona. Se preve que dichas enfermedades del sistema motor aumenten de forma espectacular en el futuro debido al creciente envejecimiento de la poblacion, y los problemas personales y sociales derivados de estos trastornos continuaran siendo una cuestion enormemente importante.

La mayona de estos tipos de enfermedades del sistema motor son el resultado de inflamacion o de una lesion del tejido cartilaginoso o el tejido oseo. Actualmente, en los casos de una enfermedad grave, se emplean como tratamiento articulaciones artificiales que contienen metales y un polietileno de peso molecular ultra alto. Sin embargo, las articulaciones artificiales se desgastan al cabo de aproximadamente diez anos tras su implante; y es posible que se produzcan varias reacciones biologicas no deseadas con los polvos abrasivos. Aunque se estan llevando a cabo investigaciones para mejorar la resistencia abrasiva para resolver estos problemas, se preven limitaciones en la resistencia abrasiva. Por otra parte, estan siendo objeto de atencion los tratamientos del tejido cartilaginoso u oseo en los que se utiliza una tecnica de ingeniena regenerativa del tejido como nuevas soluciones. Dicho metodo de tratamiento incluye un metodo en el que se trasplantan condrocitos u osteocitos cultivados y el tejido cartilaginoso u oseo producido de los mismos en el area afectada del paciente.

En 1994, Brittberg, et al., notifico un metodo de tratamiento segun el cual se extrafa tejido del cartflago articular de una porcion sin sobrecarga de una articulacion y se cultivaban las celulas de tejido cartilaginoso aisladas y se trasplantaban en el defecto del espesor total del cartflago danado (Brittberg, et al., New England Journal of Medicine, 331(14), 889 (1994)). Desde que la FDA aprobo este metodo de tratamiento en 1997, se ha comercializado y realizado en mas de 20.000 casos en todo el mundo. Un estudio de 219 casos durante un penodo de 2 a 10 anos confirma que el rendimiento del metodo de tratamiento a medio y largo plazo fue excelente presentando una mejora funcional en 89 % de los casos (Peterson L., 6a Encuentro Anual, American Academic Orthopedic Surgery (1998)). Por otra parte, en 2002, se notificaron casos de mortalidad debido a una infeccion bacteriana tras el trasplante y una investigacion del CDC descubrio 41 casos de infeccion postoperatoria, tambien en Japon. La informacion concerniente a dichos casos fue facilitada por el Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar, Oficina del Servicio Sanitario, a la Asociacion Ortopedica de Japon, que senalo que dicho problema debfa de confirmarse y adoptarse precauciones en el procesamiento. Por otra parte, este metodo no puede utilizarse en el tratamiento de osteoartritis asociada a una amplia gama de tejidos cartilaginosos u oseos parcialmente defectuosos y degenerativos y, por tanto, es necesaria una mejora.

En Japon, tambien se reconstruye el tejido cartilaginoso por ingeniena de tejidos utilizando condrocitos aislados de cartflago articular de una porcion sin sobrecarga o celulas madre mesenquimales derivadas de la medula osea y se han comenzado aplicaciones clmicas dirigidas a completar defectos de espesor osteocondral. Sin embargo, los ejemplos de las aplicaciones clmicas mencionadas se refieren a lesiones osteocondrales traumaticas y osteocondritis desecante y este tratamiento se aplica de forma limitada unicamente en los casos en los que esta presente un area de defecto del cartflago muy reducida (Solicitud de patente japonesa No. 2001-384446, Solicitud de patente japonesa No. 2002-216561, Solicitud de patente japonesa No. 2003-358118). Actualmente, dado que el rendimiento del tratamiento en la tecnica de reemplazamiento de articulaciones artificiales es estable, parece ser que no se avanza en el tratamiento de osteoartritis asociada a una amplia gama de degeneraciones o defectos del tejido del cartflago u oseo. Asimismo, dado que estas tecnicas requieren un andamio hecho de una protema, azucar o

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poKmero artificial, etc., distinto al producido de las celulas cultivadas, los efectos biologicos de dichos andamios crean tambien nuevos problemas. Por lo tanto, existe una definitiva necesidad de desarrollar una tecnica que no emplee este tipo de andamios.

Por otra parte, Hunziker et al. han abordado exhaustivamente una investigacion fundamental sobre el tratamiento de osteoartritis centrandose en la patologfa de osteoartritis en defectos que no se extienden a la degeneracion del carfflago y los huesos subcondrales y han llevado a cabo una investigacion fundamental empleando un modelo para defectos de cartflago articular parcial. En su investigacion, han descubierto que la reparacion y regeneracion del cartflago era la funcion central de celulas sinoviales y no los condrocitos (Hunziker et al., The Journal of Bone and Joint Surgery, 78-A, 721 (1996)). Sin embargo, dado que esta tecnica no es necesariamente practica y tiene un limitado abanico de posibles tratamientos, la explicacion de Hunziker et al. no esta dirigida a proporcionar directamente un tratamiento de osteoartritis. Por lo tanto, existe una gran necesidad de establecer cuanto antes esta tecnica para el tratamiento de defectos osteocondrales.

Convencionalmente, se lleva a cabo el cultivo celular en una superficie de vidrio o en la superficie de un compuesto polfmero sintetico junto con diversos procesos superficiales. Para conseguirlo, por ejemplo, se suelen utilizar como vasos para el cultivo celular diversos tipos de vasos hechos de poliestireno sometidos a un procesamiento superficial, como por ejemplo revestimiento con silicona, irradiacion gamma, etc. Las celulas cultivadas y desarrolladas en estos tipos de vasos de cultivos celulares se desprenden y se recogen de la superficie del vaso por tratamiento con un agente qmmico o por tratamiento con una proteinasa como tripsina. Sin embargo, en los casos en los que se recogen las celulas a traves del tratamiento con el agente qmmico tal como se ha mencionado, se han senalado ciertos inconvenientes: el metodo de tratamiento es farragoso y complicado; el potencial de contaminacion por impurezas es mayor y hay ejemplos de defectos en los que las celulas se danan o se degeneran a traves del tratamiento qmmico y pierden su funcion original.

Siendo asf, para resolver los inconvenientes mencionados, los autores de la presente invencion han propuesto una serie de tecnicas. Especialmente, en la solicitud de patente japonesa No. 2001-226141, un metodo para producir una lamina de celulas cultivadas que comprende las etapas de revestir la superficie de un soporte de cultivo de celulas con un polfmero sensible a la temperatura que tiene una temperatura de solucion critica inferior o superior comprendida entre 0 °C y 80 °C en agua, habiendose multi-estratificado las capas de celulas cultivadas a traves de un metodo convencional, segun sea necesario, y desprender la lamina de celulas cultivadas unicamente cambiando la temperatura del soporte de cultivo. Como resultado de la aplicacion de este metodo, se puede producir una lamina de celulas cultivadas que tiene una resistencia suficiente sin un andamio, que no sea el producido de las celulas cultivadas. Asimismo, la lamina de celulas cultivadas asf obtenida retiene las protemas de tipo membrana basal y tambien tiene una mejor capacidad de adherencia al tejido, en comparacion con una lamina de celulas recogida empleando el tratamiento con dispasa descrito. Por otra parte, la publicacion internacional PCT No. WO 02/08387 divulga un metodo para producir una lamina de celulas miocardiales cultivada, que comprende las etapas de cultivar las celulas del tejido miocardial sobre un soporte de cultivo de celulas que tiene una superficie de soporte revestida o recubierta con un polfmero sensible a la temperatura, preparar una lamina de celulas de tipo miocardio y, a continuacion, ajustar la temperatura del medio de cultivo a una temperatura superior a la temperatura critica superior de la solucion o por debajo de la temperatura critica inferior de la solucion, poner en mtimo contacto la lamina de celulas cultivadas estratificada con una membrana de poKmero, desprender la lamina de celulas intacta cultivada con la membrana de polimero y estructurar tridimensionalmente a traves de un metodo determinado previamente. Como resultado de la aplicacion de este metodo, se descubrio la construccion de una lamina de celulas de tipo miocardio y una estructura tridimensional in vitro con menos defectos estructurales y con ciertas funciones del tejido de miocardio. La patente europea EP 0 739 631se refiere a un metodo para desarrollar condrocitos mediante el uso de un sustrato de soporte para su uso en el reemplazamiento de carrilago perdido o defectuoso. El sustrato de soporte es un hueso desmineralizado en el que se cultiva una monocapa de condrocitos. A continuacion, se implanta la lamina de celulas en contacto con el sustrato.

Sin embargo, ninguno de estos metodos ha sido investigado en lo que respecta a la aplicacion en una tecnologfa dirigida a la terapia de regeneracion de carrilago y tejido oseo.

Divulgacion de la invencion

Problemas que se resuelven

La presente invencion tiene como objetivo resolver los problemas de la tecnologfa convencional que se han mencionado. Concretamente, el fin de la presente invencion es proporcionar una lamina de celulas cultivadas con una excelente capacidad de adherencia al tejido oseo o el tejido del carrilago. Ademas, un fin de la presente invencion es proporcionar un metodo para fabricar una lamina de celulas cultivadas y el metodo para su aplicacion.

Medios para resolver los problemas

Los autores de la invencion han llevado a cabo un exhaustivo estudio y desarrollo a traves de la investigacion de

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varios aspectos con el fin de resolver los problemas mencionados.

Concretamente, la presente invencion proporciona una lamina de celulas cultivadas tal como se define en la reivindicacion 1.

La presente invencion proporciona un metodo para producir una lamina de celulas cultivadas de acuerdo con la reivindicacion 1 que comprende una etapa de cultivo de al menos un tipo de celula seleccionado del grupo que consiste en condrocitos, celulas condroprogenitoras, celulas derivadas del tejido sinovial, celulas madre derivadas del tejido sinovial, osteoblastos, celulas madre mesenquimales, celulas derivadas del tejido adiposo y celulas madre derivadas del tejido adiposo, en un soporte de cultivo de celulas estando una superficie del soporte revestida con un poffmero sensible a la temperatura que tiene una temperatura cntica superior o inferior de solucion comprendida entre 0 °C y 80 ° en agua, y que comprende a continuacion las etapas de:

(1) Ajustar la temperatura del medio de cultivo a una temperatura por encima de la temperatura cntica superior de solucion o por debajo de de la temperatura cntica inferior de la solucion;

(2) poner en mtimo contacto la lamina de celulas cultivadas con un vetffculo; y

(3) desprender la lamina de celulas cultivadas junto con el vetffculo.

La lamina de celulas cultivadas obtenida tal como se ha mencionado presenta una capacidad de adherencia superior a la superficie del tejido cartilaginoso u oseo y, por tanto, las laminas de celulas cultivadas con una capacidad de adherencia superior como la de la presente invencion se denominan a veces “laminas de celulas cultivadas altamente adherentes”.

Por otra parte, la presente invencion proporciona una lamina de celulas cultivadas altamente adherente para tratar areas afectadas en las que esta danada o deteriorada una porcion o todo el tejido oseo o cartilaginoso.

Efecto de la invencion

La lamina de celulas cultivadas altamente adherente de la presente invencion tiene una capacidad de adherencia enormemente alta con la superficie del tejido oseo o del cartffago. Por lo tanto, el uso de la lamina de celulas de la presente invencion permite el trasplante de celulas diana que expresan fenotipo del tejido oseo o cartilaginoso con una densidad muy alta y permite la regeneracion del tejido en una fase temprana. Por otra parte, el trasplante de una lamina de celulas estratificada que tiene polaridad tridimensional permite la reconstruccion de un organo diana de forma mas eficaz incluso y, por tanto, ampffa el ambito de posibles tratamientos de la enfermedad. En consecuencia, la presente invencion es enormemente util en los campos medico y biologico, etc., como puedan ser el de ingeniena celular e ingeniena medica.

Breve descripcion de los dibujos

[Figura 1] FIG. 1 presenta el estado de una lamina de celulas cultivadas cuando se desprende utilizando un vetffculo, 10 dfas despues del cultivo, tal como se indica en el Ejemplo 2;

[Figura 2] FIG. 2 es una fotograffa en la que se muestra el estado de una lamina de celulas cultivadas cuando se estratifica la lamina de celulas cultivadas indicada en el Ejemplo 3;

[Figura 3] FIG. 3 es una fotograffa en la que se muestran los resultados de una tincion con PKH 26 de una porcion de la lamina de celulas estratificada, indicada en el Ejemplo 3;

[Figura 4] FIG. 4 es una fotograffa en la que se muestran los resultados de la tincion con PKH 26 de la porcion de la lamina de celulas estratificada y una porcion de monocapa de la lamina de celulas, indicada en el Ejemplo 3; [Figura 5] FIG. 5 es un diagrama en el que se muestra el analisis de la produccion de colageno II medido utilizando el metodo Rt-PCR, tal como se describe en el Ejemplo 4;

[Figura 6] FIG. 6 es un diagrama en el que se muestra el estado de la lamina de celulas estratificada que se transporta a un modelo de osteoartritis, tal como se describe en el Ejemplo 5;

[Figura 7] FIG. 7 es un diagrama en el que se muestra el estado de adherencia de la lamina de celulas estratificada al tejido cartilaginoso en el sitio del trasplante, tal como se describe en el Ejemplo 5; y [Figura 8] FIG. 8 es un diagrama en el que se muestra el estado de la lamina de celulas estratificada en el momento en el que la lamina de celulas no se ha trasplantado en el tejido cartilaginoso, tal como se describe en el Ejemplo Comparativo 2.

Modo de realizacion de la invencion preferente

La presente invencion proporciona una lamina de celulas cultivadas en mtimo contacto con una membrana de soporte utilizada como vetffculo, que expresa el fenotipo de tejido condroide y que tiene una capacidad adherencia superior al tejido del cartffago y el tejido oseo. Entre las celulas adecuadas para producir la lamina de celulas cultivadas de la presente invencion se incluyen un tipo cualquiera o una combinacion de dos o mas tipos de celulas seleccionadas del grupo que consiste en condrocitos, celulas condroprogenitoras, celulas derivadas del tejido sinovial, celulas madre derivadas del tejido sinovial, osteoblastos, celulas madre mesenquimales, celulas derivadas del tejido adiposo y celulas madre derivadas del tejido adiposo. Asimismo, las celulas mencionadas pueden

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diferenciarse, por ejemplo, con un medio de induccion condrogenico. Sin embargo, el metodo de induccion de la diferenciacion de las celulas mencionadas no esta limitado de forma rigurosa. En la presente invencion, celula cultivada altamente adherente se refiere a una lamina que se prepara a traves de las etapas de cultivo de cada uno de los tipos de celulas mencionados como una unica capa sobre la superficie del soporte de cultivo y, a continuacion, el desprendimiento de la lamina de celulas desde el soporte. La lamina de celulas asf obtenida tiene una superficie lateral inferior que esta en contacto con el soporte de cultivo en el momento del cultivo, y una superficie lateral superior en la cara opuesta del mismo. Si se cultivan las celulas en el soporte de cultivo de celulas, cuya superficie se reviste con un polfmero sensible a la temperatura que tiene una temperatura cntica de solucion superior o inferior comprendida entre 0 °C y 80 °C para el agua indicado en la presente invencion, se producira una abundancia de protemas adhesivas en la cara lateral inferior de la lamina de celulas en el momento en que se cultiven las celulas.

La lamina de celulas cultivadas de la presente invencion es aquella que se forma cultivando celulas con una alta densidad. La densidad celular dentro de la lamina de celulas cultivadas indicada en la presente invencion puede variar dependiendo de las celulas que se cultiven. Sin embargo, preferentemente es una densidad no inferior a 1000 celulas/cm2, mas preferentemente una densidad no inferior a 3000 celulas/cm2, mas preferentemente aun una densidad no inferior a 5000 celulas/cm2, siendo lo mas preferente una densidad no inferior a 7000 celulas/cm2, para regenerar eficazmente el tejido cartilaginoso y el tejido oseo. Por otra parte, si la densidad celular dentro de la lamina de celulas cultivadas esta por debajo de 1000 celulas/cm2, las celulas cultivadas se aplastan en muchos casos, concretamente. En el caso de condrocitos en el que el grado de expresion fenotfpica es debil, no se puede conseguir el objeto de la tecnologfa de la presente invencion.

Una propiedad de la lamina de celulas cultivadas de la presente invencion es que la lamina de celulas cultivadas expresa fenotipo de tejido condroide. En los casos en los que la lamina de celulas expresa fenotipo de tejido condroide, expresa caractensticas hereditarias como SOX9 y HAS, o expresa caractensticas de diferenciacion como colageno II en relacion con la formacion de matriz.

La lamina de celulas cultivadas de la presente invencion no incluye un andamio distinto al producido por las celulas cultivadas por los efectos biologicos del andamio que se han mencionado y porque es difmil potenciar la densidad celular a traves de la utilizacion de un andamio.

La lamina de celulas cultivadas de la presente invencion se construye en al menos un tipo o una combinacion de dos o mas tipos de celulas seleccionadas del grupo que consiste en condrocitos, celulas condroprogenitoras, celulas derivadas del tejido sinovial, celulas madre derivadas del tejido sinovial, osteoblastos, celulas madre mesenquimales, celulas derivadas del tejido adiposo y celulas madre derivadas del tejido adiposo. Dichas celulas son celulas capaces de expresar el fenotipo de varios tipos del tejido condroide mencionado.

La lamina de celulas cultivadas altamente adherente de la presente invencion se adhiere extremadamente bien a la superficie del tejido cartilaginoso o tejido oseo vivo. Esta propiedad se consigue reduciendo la contraccion de la lamina de celulas cultivadas que se desprende de la superficie del soporte de cultivo. Por otra parte, el porcentaje de contraccion de la lamina de celulas cultivadas cuando se desprende de la superficie del soporte de cultivo es preferentemente 20% como maximo, preferentemente, 10% como maximo, siendo incluso mas preferente 5% como maximo, en cualquiera de las direcciones longitudinales de la lamina. Si el porcentaje de contraccion no es inferior a 20 %, la lamina de celulas desprendida queda flacida y no tiene la capacidad de adherirse al tejido vivo bien, incluso cuando se une al tejido vivo. En consecuencia, la lamina de celulas desprendida con una contraccion que no es inferior a 20 % presenta las caractensticas de una lamina de celulas altamente adherente de la presente invencion.

El metodo para evitar que la lamina de celulas cultivadas se contraiga no esta limitado en particular en absoluto e incluye un metodo que comprende las etapas de poner en mtimo contacto un vehnculo con forma anular con una porcion central cortada con las laminas de celulas mencionadas en el momento de desprender la lamina de celulas cultivadas del soporte de cultivo y desprender la lamina de celulas con el vehnculo mencionado.

El vehnculo utilizado para desprender la lamina de celulas cultivadas altamente adherente tiene una estructura para impedir que la lamina de celulas de la presente invencion se contraiga y se puede utilizar un vehnculo como por ejemplo uno que este fabricado de una membrana de polfmero o una estructura formada a partir de una membrana de polfmero, o un elemento metalico, etc. Por ejemplo, en los casos en los que se utiliza un polfmero como material de vehnculo, pueden utilizarse como material espedfico del vehnculo biomacromoleculas (como acido hialuronico, colageno, gelatina, fibrina, plasma rico en plaquetas, celulosa, otros polisacaridos, polfmeros de protemas bioderivadas y similares), polialcohol vimlico, polivinil pirrolidona, polietilen glicol, difluoruro de polivinilideno (PVDF), polipropileno, polietileno, celulosa y sus derivados, papeles, quitina, quitosano, uretano, etc. Concretamente, en los casos en los que la lamina de celulas cultivadas de la presente invencion se utiliza en trasplantes, al utilizar una biomacromolecula como acido hialuronico, colageno, gelatina, fibrina, plasma rico en plaquetas, etc., es posible dejar el vehnculo en el area afectada en la que ha sido trasplantado, lo cual resulta ventajoso ya que no sera necesario separar el vehnculo y la lamina de celulas en el area afectada en el momento del trasplante.

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En el caso de la presente invencion, la expresion “en mtimo contacto” se refiere en adelante a conseguir que la lamina de celulas quede en un estado en el cual no se desliza ni se resbala para impedir que la lamina de celulas no se contraiga en el ftmite entre la lamina de celulas y el vehftculo, y por tanto, puede estar en mtimo contacto uniendose ffsicamente o puede estar en mtimo contacto a traves de un fluido (por ejemplo, el medio de cultivo y otras soluciones isotonicas) que existen entre cada lamina de celulas y el vehftculo.

La forma del vehftculo no esta limitada espedficamente en absoluto. Por ejemplo, cuando se trasplanta la lamina de celulas cultivadas altamente adherente obtenida, si se utiliza una porcion cortada del vehftculo que tenga el mismo tamano o que sea mas grande que el sitio de trasplante, se obtendran resultados mas convenientes ya que la lamina de celulas se fija solamente en la porcion que rodea a la porcion cortada y solamente se puede trasplantar la lamina de celulas con una porcion cortada que encaje en el sitio de trasplante.

Dado que la lamina de celulas cultivadas altamente adherente de la presente invencion se proporciona directamente como una lamina de monocapa o que se proporciona como una lamina estratificada, estratificando varias laminas de monocapa, es posible controlar el espesor de la lamina de celulas. Concretamente, el espesor de la lamina de celulas cultivadas altamente adherente de la presente invencion se determina de acuerdo con el numero de laminas que se han estratificado.

En este punto, la lamina estratificada puede prepararse estratificando laminas que consisten unicamente en la lamina de celulas cultivadas altamente adherente o se puede preparar combinando la lamina de celulas cultivadas altamente adherente con una lamina de otras celulas. Por ejemplo, una lamina de celulas incluye, pero sin limitarse a ellas, aquella que se prepara superponiendo la lamina de celulas condrocfticas mencionada con otra lamina de celulas condrocfticas, o una lamina de celulas que se preparan superponiendo una lamina de celulas derivadas de celulas distintas a las de la lamina de celulas condrocfticas (por ejemplo, una lamina de celulas derivadas de tejido sinovial), etc., con la lamina de celulas condrocfticas. En tales casos, si se emplean al menos dos tipos de celulas diferentes, las celulas diferentes interactuan intercelularmente entre sf y, por lo tanto, se puede obtener una lamina de celulas que tiene la caractenstica de una actividad incluso mayor. Asimismo, la posicion en la que se estratifican las laminas de celulas, el orden de las laminas de celulas estratificadas y el numero de laminas de celulas estratificadas no estan limitados en particular. Sin embargo, dependiendo del tejido revestido o recubierto, la estructura de la lamina estratificada puede variar segun se emplee una lamina de celulas derivadas de tejido sinovial altamente adherente sobre la capa exterior, etc., En el caso del tejido cartilaginoso, preferentemente, la capa mas interior de la lamina de celulas es condrocitos o celulas madre mesenquimales, o una combinacion de las mismas, y la capa exterior comprende una lamina de celulas derivadas de tejido sinovial; o las capas mas interior y mas externa de la lamina de celulas estratificada son ambas una lamina de celulas derivadas de tejido sinovial. Asimismo, el numero de laminas de celulas estratificadas es preferentemente 10 como maximo, mas preferentemente 8 como maximo e incluso mas preferentemente 4 como maximo. Los condrocitos pueden ser viables incluso en un entorno en el que no se suministran completamente los nutrientes basicos. Sin embargo, una lamina de celulas que consiste en mas de 10 capas de laminas de celulas no es deseable ya que es diftcil suministrar el oxfgeno y los nutrientes a la porcion central de la lamina de celulas estratificada.

Por ejemplo, la lamina estratificada de la presente invencion puede producirse por ejemplo empleando un metodo como el que se describe a continuacion, pero sin limitarse a el:

(1) un metodo de superposicion de una lamina de celulas cultivadas altamente adherente en mtimo contacto con el vehftculo mencionado a traves de las etapas de fijacion de la primera lamina de celulas en mtimo contacto con el vehftculo con el soporte de cultivo de celulas y, a continuacion, separacion del vehftculo de la primera lamina de celulas por adicion de un medio de cultivo, y estratificacion de una segunda lamina de celulas fijando la segunda lamina de celulas en mtimo contacto con un vehftculo; y repitiendo las etapas;

(2) un metodo de superposicion de una lamina de celulas cultivadas altamente adherente en mtimo contacto con el vehftculo mencionado a traves de las etapas de invertir la primera lamina de celulas en mtimo con el vehftculo, fijar el lado del vehftculo a la primera lamina de celulas a la superficie del soporte de cultivo de celulas, fijar la segunda lamina de celulas al lado de la lamina de celulas de la primera lamina de celulas, separar el vehftculo de la primera lamina de celulas por adicion de un medio de cultivo despues y repetir las etapas al fijar otra lamina de celulas distinta;

(3) un metodo en el que se ponen en intimo contacto dos laminas de celulas, cada una de ellas en mtimo contacto con un vehftculo, cada una de ellas en cada lado de la lamina de celulas; y

(4) un metodo en el que se ajusta la lamina de celulas en mtimo contacto con el vehftculo en un area afectada de un paciente y, una vez fijada la lamina de celulas en el tejido vivo, separacion del vehftculo y superposicion de otra lamina de celulas distinta sobre el area afectada.

La lamina de celulas cultivadas altamente adherente de la presente invencion se caracteriza por que las protemas de tipo membrana basal entre la celula y el soporte formado durante el cultivo no son danadas por enzimas, como puedan ser proteinasas como dispasa, tripsina, etc. Por lo tanto, para producir una lamina de celulas cultivadas con dichas caractensticas, preferentemente se lleva a cabo el cultivo de celulas sobre una superficie del soporte de cultivo de celulas revestido con un poftmero sensible a la temperatura.

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El poUmero sensible a la temperatura que se utiliza para revestir el soporte de cultivo de celulas tiene una temperatura cntica superior e inferior de solucion que oscila entre 0 °C y 80 °C en agua y, mas preferentemente en un intervalo de 20 °C a 50 °C en agua. Una temperatura cntica superior o inferior de solucion que exceda 80 °C no es preferente, ya que las celulas mueren. Por otra parte, una temperatura cntica superior o inferior de solucion que este por debajo de 0 °C tampoco es preferente, ya que normalmente causa un extremo descenso de la velocidad de crecimiento celular o causa la muerte celular.

El polfmero sensible a la temperatura para su uso en la presente invencion puede ser o bien un homopolfmero o bien un copolfmero. Entre los ejemplos de polfmero se pueden incluir por ejemplo el polfmero divulgado en la publicacion de patente japonesa No. H2-211865 (JP 2-211865 A). Concretamente, por ejemplo, se pueden obtener por polimerizacion o copolimerizacion de los monomeros que se mencionan a continuacion. Entre los monomeros que se pueden utilizar se incluyen por ejemplo un compuesto de (met)acrilamida, un derivado de (met)acrilamida N- (o N,N-di)alquil sustituido o un derivado de eter vimlico; en el caso de un copolfmero, pueden seleccionarse y utilizarse al menos dos de estos monomeros. Por otra parte, dichos monomeros pueden copolimerizarse con otros monomeros, o pueden injertarse los polfmeros juntos o copolimerizarse o, alternativamente, pueden emplearse mezclas de polfmeros y copolfmeros. Si se desea, es posible reticular los polfmeros en un grado en que no se alteren sus propiedades.

El soporte que se cubre con el polfmero sensible a la temperatura puede seleccionarse entre vidrio, vidrio modificado, compuestos como poliestireno y poli(metacrilato de metilo) y otras sustancias que por lo general pueden moldearse, como por ejemplo compuestos de polfmero distintos a estos compuestos y ceramicas.

El metodo para revestir el soporte con el polfmero sensible a la temperatura no esta limitado en ningun modo en particular, pero pueden seguirse los metodos descritos en la patente japonesa JP 2-211865 A. Concretamente, se puede conseguir la operacion de revestimiento o bien sometiendo el soporte y los monomeros o polfmeros mencionados a exposicion de haz de electrones (EB), irradiacion de rayos y, irradiacion ultravioleta, tratamiento de plasma, tratamiento de corona o reaccion de polimerizacion organica, o bien por medios de absorcion ffsica, como por ejemplo llevados a efecto por aplicacion de soluciones de revestimiento o la etapa de amasado.

El revestimiento del polfmero sensible a la temperatura se encuentra adecuadamente en el intervalo de 0,5 a 5,0 |jg/cm2, preferentemente de 1,0 a 4,0 jg/cm2, y mas preferentemente de 1,2 a 3,5 jg/cm2. Si el recubrimiento del polfmero sensible a la temperatura es inferior a 0,5 jg/cm2, las celulas en el polfmero no se desprenderan facilmente incluso aunque se proporcione un estfmulo y la eficiencia operativa se reducira considerablemente, lo cual no es preferente. Si, por otra parte, el recubrimiento del polfmero sensible a la temperatura es superior 5,0 jg/cm2, las celulas no se adheriran facilmente al area revestida y sera diffcil conseguir una adherencia adecuada de las celulas. La forma del soporte de cultivo de la presente invencion puede incluir por ejemplo, pero sin limitarse a ellos, forma de plato, forma de varios platos, forma de matraz, forma de inserto de celula, etc., entre las que se pueden emplear.

La composicion del medio de cultivo para cultivar las celulas de la presente mencionadas no esta limitada en particular en absoluto, y se pueden emplear cualquiera de las utilizadas convencionalmente en el momento en que se cultiven las celulas mencionadas. En el caso de cultivar condrocitos, celulas condroprogenitoras, celulas derivadas del tejido sinovial, celulas madre derivadas del tejido sinovial, osteoblastos, celulas madre mesenquimales, celulas derivadas del tejido adiposo o celulas madre derivadas del tejido adiposo, puede prepararse el medio de cultivo por ejemplo suplementando un medio de cultivo a-MEM, un medio de cultivo F-12, un medio de cultivo DMEM o cualquier mezcla de los mismos con suero bovino al 10 % a 20 % u, opcionalmente, con 50 jg/ml de 2-fosfato de acido ascorbico, ademas de suero bovino.

Por otra parte, el medio de cultivo puede ser un medio de induccion de la diferenciacion de condrocitos que incluye factores para diferenciar celulas cultivadas en condrocitos, dado que las celulas asf obtenidas expresan fenotipos de condrocitos incluso en un mayor grado y, por tanto, son preferentes. El medio de induccion de la diferenciacion de condrocitos puede producirse suplementando varios factores para diferenciar celulas de cultivo en condrocitos (como, por ejemplo, pero sin limitarse a ellos TGF-p, IGF, IL, dexametasona, BMP), al medio de cultivo a-MEM mencionado, un medio de cultivo F-12, medio de cultivo DMEM o cualquier mezcla de los mismos, suplementado con suero bovino al 10 % a 20 % u, opcionalmente, con 50 jg/ml de 2-fosfato de acido ascorbico.

Por otra parte, la propiedad de la lamina de celulas cultivadas de la presente invencion de ser altamente adherente a la superficie del tejido cartilaginoso u oseo se consigue en condiciones de cultivo espedficas. Concretamente, la lamina de celulas cultivadas de la presente invencion se obtiene por cultivo, tras la siembra de las celulas que se van a cultivar sobre la superficie del soporte de cultivo. Se ha demostrado que la lamina de celulas cultivadas se prepara recogiendo la lamina de cultivo tras el cultivo de las celulas sobre el soporte de cultivo durante 14 dfas como maximo, preferentemente 12 dfas como maximo y mas preferentemente 10 dfas como maximo, a partir de la fecha en la que las celulas de cultivo confluyen en el soporte de cultivo. Si el cultivo tiene lugar durante mas de 14 dfas tras la confluencia, la lamina de celulas cultivadas desprendida inicia la diferenciacion de celulas con el resultado de una menor actividad celular y, por lo tanto, no es posible obtener la lamina de celulas cultivadas de la presente invencion que debena expresar en un grado alto el fenotipo pretendido.

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La temperature del medio de cultivo no esta limitada en particular, siempre y cuando la temperatura este por debajo de la temperatura cntica superior de solucion o por encima de la temperatura cntica inferior de solucion del poKmero con el que se va a revestir la superficie del soporte. Sin embargo, debe apreciarse que una temperatura baja, en la que no proliferan las celulas cultivadas, o una region de temperatura alta, en la que las celulas cultivadas son eliminadas, son naturalmente poco convenientes. Las condiciones de cultivo aparte de la temperatura no estan limitadas en particular y se pueden seguir los procedimientos convencionales. Por ejemplo, un medio de cultivo utilizado puede ser un medio de cultivo que se ha suplementado con suero, como por ejemplo suero bovino fetal (FCS), o un medio de cultivo sin suero, al que no se ha anadido suero.

Cuando se desprenden y se recogen las celulas cultivadas del material de soporte cultivado a traves del metodo de la presente invencion, la lamina de celulas cultivadas altamente adherente en mtimo contacto con el vetnculo puede separarse a traves de las etapas de poner en mtimo contacto la lamina de celulas cultivadas con el vetnculo, ajustar la temperatura del soporte de cultivo fijado a las celulas a una temperatura por encima de la temperatura cntica superior de solucion, o por debajo de la temperatura cntica inferior de solucion del polfmero que reviste el soporte de cultivo, aumentar la hidrofilia del polfmero que reviste la superficie del soporte y desprender la lamina de celulas cultivadas en mtimo contacto con el vehnculo desde el soporte de cultivo, gracias al debilitamiento de la union entre el soporte de cultivo y la lamina de celulas cultivada. Por otra parte, la lamina puede desprenderse o bien en el medio de cultivo que se utiliza para cultivar las celulas o bien en otra solucion isotonica, dependiendo de los fines.

Para desprender y recoger la lamina de celulas cultivadas altamente adherente en un alto rendimiento, puede utilizarse un metodo en el que el soporte de cultivo de celulas se cierra con tapon hermeticamente y se agita, o un metodo en el que se agita el medio de cultivo utilizando una pipeta, etc., ya sea en solitario o combinados. Por otra parte, segun se requiera, pueden lavarse las celulas cultivadas con solucion isotonica, antes del desprendimiento y la recogida.

La lamina de celulas cultivadas altamente adherente de la presente invencion, cuando se recoge segun se ha explicado, no es danada por proteinasas como dispasa, tripsina, etc., desde el momento del cultivo hasta el momento del desprendimiento de la lamina de celulas. Por tanto, la lamina de celulas altamente adherente que se ha desprendido del soporte retiene la estructura desmenosoma intercelular, tiene tan solo algunos defectos estructurales y presenta una alta resistencia. Por otra parte, las protemas de tipo membrana basal de la lamina de la presente invencion entre la celula y el soporte formados en el momento del cultivo no son danadas por enzimas, proporcionando asf una adherencia superior al area afectada en el momento del trasplante y permitiendo que sea posible la implantacion de un tratamiento muy eficaz. Mas concretamente, en los casos en los que se utilizan proteinasas convencionales como tripsina, no se retienen en absoluto la estructura demonosoma intercelular ni las protemas de tipo membrana basal entre la celula y el soporte, etc. y, por lo tanto, las celulas se desprenden del soporte de cultivo por separado. Si bien se sabe por lo general que entre las proteinasas, la dispasa puede permitir el desprendimiento de aproximadamente 10% a 60 a de la estructura desmonosoma intercelular, las protemas de tipo membrana basal entre la celula y el soporte, etc. se danan casi completamente y la lamina de celulas obtenida tiene solamente una resistencia baja. Sin embargo, la lamina de celulas de la presente invencion mantiene por lo menos 80 % de la estructura desmonsoma y las protemas de membrana basal intactas y por lo tanto, proporciona varios de los efectos que se han descrito.

La superficie del tejido oseo o cartilaginoso no esta limitada en particular en la presente invencion. Por ejemplo, el tejido cartilaginoso u oseo incluye generalmente cartflago articular, menisco, disco intervertebral, cartflago costal, tabique nasal, cartflago auricular, etc. La lamina de celulas cultivadas de la presente invencion puede emplearse para tratar un area afectada, en la que toda o una porcion del tejido del cartflago se ha danado o se ha deteriorado, o para tratar un area afectada en la que se ha danado o deteriorado una porcion del tejido oseo. Concretamente, la lamina de celulas cultivadas de la presente invencion es eficaz en el tratamiento de artritis, artropatfa, lesion del cartflago, lesion osteocondral, lesion del menisco, degradacion de un disco intervertebral y, particularmente, como nuevo tratamiento para osteoartritis, que es difmil de tratar a traves de la terapia convencional. La utilizacion de la lamina de celulas cultivadas altamente adherente de la presente invencion para la superficie de un tejido cartilaginoso u oseo puede incluir por ejemplo, pero sin limitarse en particular a ellos, un metodo en el que se reviste o se recubre el area afectada con la lamina de celulas cultivadas altamente adherente de la presente invencion. En tales casos, la lamina de celulas cultivadas puede cortarse para que se ajuste al tamano y la forma del area afectada. De esta forma, la lamina de celulas cultivadas altamente adherente de la presente invencion puede adherirse extremadamente bien a la superficie del tejido cartilaginoso u oseo vivo, lo cual no puede conseguirse segun la tecnica anterior.

Una aplicacion de la lamina de celulas cultivadas altamente adherente tal como se muestra en la presente invencion es eficaz por ejemplo, pero sin limitarse en particular e ellos, en tratamientos de osteoartritis, artritis, artropatfa, lesion del cartflago, lesion osteocondral, lesion del menisco o degeneracion de un disco intervertebral.

El metodo para fijar la lamina de celulas cultivadas altamente adherente al tejido vivo, tal como se demuestra con la presente invencion, no esta limitado en absoluto, y por tanto, la lamina de celulas puede suturarse al tejido vivo, puede conectarse al tejido vivo con un agente adherente que se pueda utilizar in vivo o puede fijarse al area afectada sin utilizar ninguno de estos medios, para injertar rapidamente la lamina de celulas cultivadas altamente

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adherente tal como se muestra con la presente invencion.

Un metodo para trasplantar la lamina de celulas cultivadas altamente adherente de la presente invencion puede incluir, sin limitarse en particular a ellos, por ejemplo, un metodo en el que se fija la lamina de celulas cultivadas altamente adherente por incision del area afectada, o un metodo en el que se fija la lamina de celulas a la zona afectada mediante el uso de un artroscopio. Concretamente, este ultimo metodo es preferente ya que el tratamiento es menos invasivo para el paciente.

En los casos en los que se utiliza la lamina de celulas cultivadas de la presente invencion en trasplante, se trasplanta la lamina de celulas separando la lamina de celulas del vehnculo y ajustando despues la lamina de celulas en el area afectada. El metodo para separar la lamina de celulas del vetnculo incluye, por ejemplo, pero no se limita a ellos, un metodo de separacion de la lamina de celulas del vetnculo por humedecimiento del vetnculo para debilitar la capacidad de adherencia, o un metodo de cortado de la lamina de celulas cultivadas utilizando una herramienta cortante, como un bistun, pinzas, haz de laser, onda de plasma, etc. Por ejemplo, en los casos en los que se emplea una lamina de celulas que esta en mtimo contacto con un vehnculo con una porcion central cortada, preferentemente, se corta la lamina de celulas cultivadas que se va a trasplantar con un haz de laser o similar, a lo largo del reborde del area afectada, ya que es posible evitar la union de la lamina de celulas cultivadas con el area no deseada fuera del area afectada.

La lamina de celulas cultivadas altamente adherente obtenida segun el metodo mencionado es superior en comparacion con la obtenida a traves de los metodos convencionales, ya que la lamina de celulas cultivadas no es invasiva en el momento del desprendimiento y por lo tanto, las aplicaciones clmicas del tejido cartilaginoso o tejido oseo para trasplante, etc. son muy prometedoras. Sobre todo, la lamina de celulas cultivadas altamente adherente de la presente invencion presenta una capacidad de adherencia mas alta a los tejidos vivos que las laminas de celulas de trasplante convencionales, y se injerta en los tejidos vivos con mucha rapidez. Ademas, es posible resolver los problemas antigenicos y de infeccion gracias al uso de celulas autologas.

Desde el punto de vista del trasplante celular, los investigadores se estan centrando en este momento en la investigacion para el trasplante de celulas cultivadas con andamios tras el cultivo de celulas tridimensionalmente dentro del andamio, como por ejemplo gel de colageno, asf como en la investigacion para el trasplante de celulas cultivadas con membrana bioabsorbible despues de cultivar celulas en la membrana bioabsorbible, etc. Sin embargo, la densidad celular de la lamina de celulas cultivadas de la presente invencion es inmensamente superior a la que esta hecha de celulas y andamios de la membrana bioabsorbible. Asimismo, la lamina de celulas de la presente invencion presenta tambien la ventaja de tener una capacidad de adherencia mas alta para dirigirse al tejido que la de las que estan hechas de celulas y andamios o la membrana bioabsorbible, ya que la lamina de celulas de la presente invencion excluye la membrana bioabsorbible y consiste en celulas purificadas y la matriz extracelular. Con respecto a la fijacion, dado que la lamina de celulas cultivadas de la presente invencion no se recoge de forma invasiva junto con la matriz extracelular, incluyendo las moleculas de adherencia segregadas por la lamina de celulas cultivadas que se trasplante, la lamina de celulas cultivadas presenta la ventaja de un establecimiento temprano en la superficie del tejido cartilaginoso u oseo para su trasplante cuando se trasplanta en la superficie. Por lo tanto, la presente invencion proporciona una tecnologfa extremadamente eficaz con mejoras en cuanto a la eficacia del tratamiento del area afectada y un mayor alivio de la sobrecarga para el paciente.

Ejemplos

A continuacion, se explicara la presente invencion con mayor detalle haciendo referencia a los siguientes Ejemplos con los que no se pretende limitar el alcance de la presente invencion en absoluto

Ejemplos 1 y 2

Se aplicaron sobre un plato de cultivo comercial con un diametro de 3,5 cm (Falcon 3001, fabricado por Becton Dickinson Labware), 0,07 ml de la solucion de monomero de N-isopropil acrilamida disuelto en alcohol isopropflico a una concentracion de 53 % (Ejemplo 1) o 54 % (Ejemplo 2). Se expuso el plato de cultivo a haz de electrones a una intensidad de 0,25 MGy, y se inmovilizo el polfmero de N-isopropil acrilamida (PIPAAm) sobre una superficie del plato de cultivo. Tras la irradiacion, se lavo el plato de cultivo con agua de intercambio ionico para eliminar el monomero residual y el PIPAAm que no se unio al plato de cultivo, se seco despues dentro del banco limpio y se esterilizo con gas oxido de etileno para obtener un material de soporte de cultivo de celulas revestido con un polfmero sensible a la temperatura.

Se midio la cantidad de polfmero sensible a la temperatura sobre la superficie de soporte. Como resultado, se observo que la superficie de los soportes estaba revestida con el polfmero sensible a la temperatura en una cantidad de 1,7 |jg/cm2 (Ejemplo 1) y 1,9 jg/cm2 (Ejemplo 2), respectivamente. Se extirpo cartflago articular de la rodilla de un cerdo, se trato con 0,4 % (p/v) de pronasa durante aproximadamente 1 hora y despues, con 0,025 % (p/v) de colageno durante aproximadamente 6 horas para obtener condrocitos, que se sembraron (7000 celulas/cm2) sobre la superficie de cada soporte de cultivo de celulas. Se utilizo medio de cultivo DMEM/F12 suplementado con suero bovino al 20 % como medio de cultivo. Se cultivaron las celulas a 37 °C, bajo CO2 al 5 %, con el resultado de la

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adherencia y proliferacion normal en la superficie de cada soporte de cultivo celular. Diez dfas despues del cultivo, las celulas cultivadas estaban en estado de confluencia.

Se coloco un vehnculo formado de una pelfcula difluoruro de polivinilideno (PDVF) que tema un diametro de 5 mm, con una porcion central cortada que tema un diametro de 2 mm, sobre las celulas, se aspiro suavemente el medio de cultivo y se incubo cada uno de los materiales de soporte de cultivo celular y se enfrio a 20 °C durante 30 minutos, de manera que se desprendiera el material de soporte de cultivo de celulas junto con el vehnculo superpuesto.

Las laminas de celulas obtenidas teman una resistencia suficiente como lamina unica con una contraccion no superior a 2 %.

Por otra parte, aunque el “tratamiento a baja temperatura” en cada uno de los Ejemplos expuestos se realizo por incubacion a 20 °C durante 30 minutos, el “tratamiento a baja temperatura” de la presente invencion no queda limitado espedficamente a las condiciones del tiempo y la temperatura mencionados en los Ejemplos expuestos. Las condiciones de temperatura preferentes oscilan entre 0°C y 30°C y el penodo de tratamiento preferente oscila entre 5 minutos y 1 hora para el “tratamiento a baja temperatura” de la presente invencion. En la Figura 1 se muestran las condiciones de la lamina de celulas cuando se desprende utilizando un vetnculo diez dfas despues del cultivo, en el Ejemplo 2.

Ejemplo 3

Se preparo el material de soporte de cultivo de celulas siguiendo un metodo similar al del Ejemplo 2, con la excepcion de que se aplicaron 0,07 ml de la solucion de monomero de N-isopropil acrilamida disuelto en alcohol isopropflico a una concentracion de 55 % al plato de cultivo comercial mencionado con un diametro de 3,5 cm (Falcon 3001, fabricado por Becton Dickinson Labware).

Se midio la cantidad de polfmero sensible a la temperatura sobre la superficie del soporte. Como resultado, se observo que la superficie del soporte estaba revestida con el polfmero en una cantidad de 2,0 pg/cm2. Se extirpo cartflago articular de la rodilla de un cerdo, se trato con 0,4 % (p/v) de pronasa durante aproximadamente 1 hora, y 0,025 % (p/v) de colagenasa durante aproximadamente 6 horas para obtener condrocitos, que se sembraron (5000 celulas/cm2) sobre la superficie del soporte de cultivo de celulas. Se utilizo medio de cultivo DMEM/F12 suplementado con suero bovino al 20 % como medio de cultivo. Se cultivaron las celulas a 37 °C, bajo CO2 al 5 %, con el resultado de adherencia y proliferacion normal sobre la superficie del soporte de cultivo de celulas. Diez dfas despues del cultivo, las celulas cultivadas estaban en un estado de confluencia.

Se estratifico sobre la lamina de celulas obtenidas adherida a la superficie del material de soporte de cultivo la lamina de celulas de cultivo recogida en el Ejemplo 2. A continuacion, se separo el vehnculo fijado a la lamina de celulas de cultivo y se obtuvo una lamina de celulas de cultivo estratificado. En ese momento se mantuvo la lamina estratificada tal como estaba fijada en la superficie del soporte de cultivo de celulas. A continuacion, se desprendio la lamina de celulas estratificada del soporte de cultivo de celulas. Se desprendio la lamina de celulas estratificada del soporte de cultivo de celulas a traves de un metodo similar al del Ejemplo 2.

La lamina de celulas obtenida tema una resistencia suficiente como una unica lamina con una contraccion no superior a 2 %. En la figura 2 presenta la lamina de celulas cultivadas estratificada obtenida en el Ejemplo 3. Por otra parte, en las Figuras 4 y 4 se presentan los resultados de la tincion con PKH26 de la lamina de celulas cultivadas estratificada, aplicando un metodo normal. La porcion derecha superior de la fotograffa de la Figura 4 es el area de monocapa con tan solo unas cuantas celulas tenidas. Por otra parte, dado que hay muchas celulas tenidas en la Figura 3, y en la porcion izquierda inferior de la Figura 4, se demuestra que la lamina de celulas obtenida en este ejemplo se estratifico en estas localizaciones.

Ejemplo 4 y Ejemplo comparativo 1

Se examino el nivel de expresion del fenotipo de los condrocitos utilizando el metodo Rt-PCR midiendo la cantidad de produccion de colageno II espedfico de condrocito (intensidad de banda COL II en la Figura 5). En el estudio, se utilizaron la lamina de celulas cultivadas de tipo monocapa obtenida en el Ejemplo 2, la lamina de celulas de cultivo estratificada obtenida en el Ejemplo 3, las celulas obtenidas por tratamiento con tripsina de un soporte de cultivo de celulas comercial convencional sin revestimiento con un polfmero sensible a la temperatura.

En la Figura 5 se muestran los resultados obtenidos. Las celulas obtenidas por tratamiento con tripsina expresaron un menor nivel de produccion de colageno II (el soporte de cultivo de celulas convencional, monocapa, en la Figura 5). Por otra parte, las celulas obtenidas en el Ejemplo 2 (monocapa UpCell, en la Figura 5) y el Ejemplo 3 (estratificado UpCell, en la Figura 5) expresaron una alta concentracion de la produccion de colageno II. Como resultado, se demostro que la lamina de celulas de la presente invencion tiene una alta actividad.

Ejemplo 5

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Se preparo un modelo de osteoartritis por raspado de aproximadamente 1 mm sobre la superficie del cartflago articular de una rodilla de cerdo utilizando papel de lija N° 40, en el que se trasplanto la lamina de celulas cultivadas estratificadas obtenida en el Ejemplo 3. Concretamente, el trasplante se completo cubriendo la superficie expuesta del cartflago con el lado inferior de la lamina de celulas cultivadas del Ejemplo 3, y protegiendo asf la superficie del sitio herido.

Tres dfas despues de la operacion, se obtuvo una muestra del sitio de trasplante que se trato con fijacion con formalina, descalcificacion con EDTA e incorporacion de parafina de acuerdo con un metodo normal y se tineron secciones en serie de 5 pm con safranina-O y se determino histologicamente el grado de adherencia al tejido de cartflago. En la Figura 6 se muestra el estado en el momento de su trasplante. En la Figura 7 se muestran los resultados de la tincion con safranina-O.

Se adhirio la lamina de celulas cultivadas estratificada aplicada a la superficie del cartflago de un modelo de osteoartritis de cerdo y se confirmo que se supriirna la descarga de proteoglicano desde la matriz extracelular, etc., y que presentaba una accion anti-degenerativa. Al trasplantar la lamina de celulas cultivadas de la presente invencion se concluyo que fue posible reconstruir el tejido cartilaginoso.

Ejemplo de Comparacion 2

Se preparo un modelo de osteoartritis por raspado de aproximadamente 1 mm de la superficie del cartflago articular de la rodilla de un cerdo utilizando una lija No. 40, sin trasplantar la lamina de celulas cultivadas estratificada.

Tres dfas despues de la operacion, se obtuvo una muestra del sitio raspado que fue tratado con fijacion de formalina, descalcificacion con EDTA e incorporacion de parafina de acuerdo con el metodo convencional y se tineron secciones en serie de 5 pm con safranina-O y se determino histologicamente el grado de adherencia al tejido cartilaginoso. En la Figura 8 se muestran los resultados de la tincion con safranina-O. Se confirmo que el proteoglicano se descargaba desde la matriz extracelular, etc. del sitio en degeneracion que se raspo con lija.

Aplicabilidad industrial

La lamina de celulas cultivadas altamente adherente obtenida segun la presente invencion tiene una capacidad adherente superior a la superficie del tejido oseo o cartilaginoso. Por tanto, el uso de la lamina de celulas de la presente invencion permite trasplantar celulas diana con una alta densidad y facilita la reconstruccion activa del tejido oseo y cartilaginoso. Por otra parte, al trasplantar una lamina de celulas estratificada que tiene polaridad tridimensional, se puede reconstruir el organo diana incluso de manera mas eficaz y por lo tanto, las aplicaciones clmicas para artritis, artropatfa, lesiones del cartflago, lesiones osteocondrales, lesiones del menisco, degeneracion de los discos intervertebrales, osteoartritis, etc. son muy prometedoras. En consecuencia, la presente invencion es enormemente util en los campos de la biologfa y medico, etc., como por ejemplo la ingeniena de celulas y la ingeniena medica.

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REIVINDICACIONES

1. Una lamina de celulas cultivadas en mtimo contacto con un vetnculo para su uso en un metodo para el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en artritis, una lesion cartilaginosa, una lesion osteocondral, una lesion del menisco, una degeneracion de disco intervertebral,

donde la lamina de celulas cultivadas expresa fenotipo de tejido condroide y tiene una adherencia superior al tejido cartilaginoso u oseo,

donde la celula en la lamina cultivada es un tipo cualquiera o una combinacion de dos o mas tipos de celulas seleccionadas del grupo que consiste en: condrocitos, celulas condroprogenitoras, celulas derivadas de tejido sinovial, celulas madre derivadas de tejido sinovial, osteoblastos, celulas madre mesenquimales, celulas derivadas de tejido adiposo y celulas madre derivadas de tejido adiposo; y en donde no se incluye ningun andamio distinto al producido por las celulas cultivadas en la lamina de celulas cultivadas.
2. La lamina de celulas cultivadas de acuerdo con la reivindicacion 1, donde el vetnculo es un vetnculo de tipo gel o de tipo membrana que comprende un material cualquiera o una combinacion de dos o mas tipos de materiales seleccionados del grupo que consiste en: acido hialuronico, colageno, gelatina, fibrina, plasma rico en plaquetas y poli(alcohol vimlico).
3. La lamina de celulas cultivadas de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, donde la densidad de las celulas en la lamina de celulas cultivadas es al menos 1000 celulas/cm2
4. La lamina de celulas cultivadas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde se controla el espesor de la lamina de celulas cultivadas.
5. La lamina de celulas cultivadas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde se estratifica

la lamina de celulas cultivadas superponiendo la lamina de celulas de la reivindicacion 1.
6. La lamina de celulas cultivadas de acuerdo con la reivindicacion 5, donde la capa mas interior de la lamina de celulas estratificada es una lamina de celulas de condrocitos, celulas madre mesenquimales o una mezcla de las mismas y la capa mas exterior de la lamina de celulas estratificada es una lamina de celulas derivadas del tejido sinovial.
7. La lamina de celulas cultivadas de acuerdo con la reivindicacion 5, donde las capas mas interior y mas exterior de la lamina de celulas estratificada esta hecha de una lamina de celulas derivadas de tejido sinovial.
8. La lamina de celulas cultivadas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde se cultivan las celulas sobre el soporte de cultivo de celulas que tiene una superficie revestida con un polfmero sensible a la temperatura que tiene una temperatura cntica superior o inferior de solucion en el intervalo de 0 °C a 80 °C en agua, y se desprende la lamina de celulas del soporte sin tratarse con proteinasa y despues del desprendimiento, se mantiene la contraccion de la lamina de celulas en no mas de 20 %.
9. La lamina de celulas cultivadas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde se desprende

la lamina de celulas en el curso de 14 dfas desde el comienzo del cultivo.
10. La lamina de celulas cultivadas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde la enfermedad que se trata es una osteoartritis.
11. La lamina de celulas cultivadas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde el tratamiento comprende el revestimiento o recubrimiento de la superficie de tejido cartilaginoso u oseo con la lamina de celulas cultivadas.
12. La lamina de celulas cultivadas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde antes del revestimiento o recubrimiento del area afectada, se corta la lamina de celulas cultivadas de acuerdo con el tamano y la forma del area afectada.
13. La lamina de celulas cultivadas de acuerdo con la reivindicacion 12, donde antes del revestimiento o recubrimiento de la superficie del tejido cartilaginoso u oseo, se trasporta la lamina de celulas cultivadas al area afectada utilizando un artroscopio.
14. La lamina de celulas cultivadas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 o 13, donde el area afectada que se va a tratar se selecciona del grupo que consiste en: la porcion de tejido cartilaginoso del cartflago articular, la porcion de tejido cartilaginoso de un menisco, la porcion del tejido cartilaginoso de un disco intervertebral, la porcion del tejido cartilaginoso de cartflago costal, la porcion de tejido cartilaginoso del tabique nasal y la porcion del tejido cartilaginoso del cartflago auricular.

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15. La lamina de celulas cultivadas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, donde la enfermedad que se trata es una osteoartritis.
16. Un metodo para producir la lamina de celulas cultivadas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, que comprende una etapa de cultivo de al menos un tipo de celula que se selecciona del grupo que consiste en: celulas madre derivadas del tejido adiposo, celulas derivadas del tejido adiposo, celulas madre mesenquimales, osteoblastos, celulas madre derivadas del tejido sinovial, celulas derivadas del tejido sinovial, celulas condroprogenitoras y condrocitos, en un soporte de cultivo de celulas que tiene revestida una superficie con un polfmero sensible a la temperatura que tiene una temperatura cntica superior o inferior de solucion en el intervalo de 0 °C a 80 °C en agua, y que comprende a continuacion las etapas de:

(1) ajustar la temperatura del medio de cultivo a una temperatura por encima de la temperatura cntica superior de solucion o por debajo de la temperatura cntica inferior de solucion;

(2) poner en mtimo contacto la lamina de celulas cultivadas con la membrana de soporte utilizada como el vetnculo; y

(3) desprender la lamina de celulas cultivadas junto con el vetnculo.
17. El metodo para producir la lamina de celulas cultivadas de acuerdo con la reivindicacion 16, que comprende ademas las etapas de:

(4) poner en mtimo contacto la lamina de celulas cultivadas con el vetnculo obtenido en la etapa (3), en mtimo contacto con la parte superior de una lamina de celulas por separado cultivada sobre el soporte de cultivo de celulas por separado, cuya superficie se reviste con el polfmero sensible a la temperatura que tiene una temperatura cntica superior o inferior de solucion en el intervalo de 0 °C a 80 °C en agua; y

(5) repetir las etapas (1) A (3).
18. El metodo para producir la lamina de celulas cultivadas de acuerdo con la reivindicacion 16 o 17, donde el polfmero sensible a la temperatura es poli(N-isopropil acrilamida).
19. El metodo para producir la lamina de celulas cultivadas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, donde la densidad de las celulas sembradas por area unitaria del soporte de cultivo de celulas es al menos 1000 celulas/cm2
20. El metodo para producir la lamina de celulas cultivadas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, donde se utiliza un medio de cultivo de diferenciacion de condrocitos como medio de cultivo para cultivar celulas.
21. El metodo para producir la lamina de celulas cultivadas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, donde la forma de la membrana utilizada como vetnculo es una estructura de membrana continua o una estructura de forma anular con una porcion central cortada.
22. El metodo para producir la lamina de celulas cultivadas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 21, donde la lamina de celulas cultivadas se desprende sin tratamiento con una proteinasa.