WO2025018249A1 - 移植方法、培養キャリア基材、包装体、細胞シート付き培養キャリア基材、細胞シート付き培養キャリア基材の製造方法、凍結保存方法、および細胞シート付き培養キャリア基材の凍結物 - Google Patents

移植方法、培養キャリア基材、包装体、細胞シート付き培養キャリア基材、細胞シート付き培養キャリア基材の製造方法、凍結保存方法、および細胞シート付き培養キャリア基材の凍結物 Download PDF

Info

Publication number
WO2025018249A1
WO2025018249A1 PCT/JP2024/024961 JP2024024961W WO2025018249A1 WO 2025018249 A1 WO2025018249 A1 WO 2025018249A1 JP 2024024961 W JP2024024961 W JP 2024024961W WO 2025018249 A1 WO2025018249 A1 WO 2025018249A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
carrier substrate
culture
cell sheet
culture carrier
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/JP2024/024961
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
亘 河合
佳汰 吉田
由貴 中西
公一 濱野
耕司 上野
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Central Glass Co Ltd
Yamaguchi University NUC
Original Assignee
Central Glass Co Ltd
Yamaguchi University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Central Glass Co Ltd, Yamaguchi University NUC filed Critical Central Glass Co Ltd
Priority to CN202480046934.0A priority Critical patent/CN121548437A/zh
Priority to JP2025534005A priority patent/JPWO2025018249A1/ja
Priority to AU2024296215A priority patent/AU2024296215A1/en
Priority to KR1020267004208A priority patent/KR20260042204A/ko
Publication of WO2025018249A1 publication Critical patent/WO2025018249A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the present invention relates to a transplantation method, a culture carrier substrate, a package, a culture carrier substrate with a cell sheet, a method for producing a culture carrier substrate with a cell sheet, a cryopreservation method, and a frozen culture carrier substrate with a cell sheet.
  • Patent Document 1 Various developments have been made so far regarding the "cultivation” and “transportation” of cell sheets, which constitute the technical elements of transplantation technology.
  • the technology described in Patent Document 1 is known as this type of technology.
  • the background art of Patent Document 1 describes that in order to transplant a cell sheet to the desired affected area, a series of operations are required, such as detaching a cell sheet cultured on a temperature-responsive material by changing the temperature, covering the obtained cell sheet with a separately prepared sheet, removing the cell sheet with the cell sheet attached to the sheet from the container, transporting it to the affected area, and transplanting (affixing) it to the affected area.
  • Patent Document 1 describe a technique for transporting a cell sheet cultured in a cell culture vessel having a temperature-responsive polymer layer, in which the bottom of the cell culture vessel is peeled off with the cell sheet still attached, and the peeled off bottom and the cell sheet attached to the bottom are transported together.
  • transplantation method culture carrier substrate, package, culture carrier substrate with a cell sheet, method for manufacturing a culture carrier substrate with a cell sheet, cryopreservation method, and frozen culture carrier substrate with a cell sheet.
  • a culture step of culturing a cell sheet on the culture surface of a culture carrier base material A transplantation method comprising: a transplantation step of attaching the cell sheet formed on the culture surface of the culture carrier substrate to a transplantation site, and then peeling off the culture carrier substrate from the cell sheet.
  • the transplantation method according to 1. The substrate thickness of the culture carrier substrate is 5 ⁇ m or more and 250 ⁇ m or less,
  • the culture carrier substrate is a polyether ether ketone film or a polyethylene terephthalate film, A transplantation method, wherein the culture surface of the culture carrier base material has been subjected to a hydrophilization treatment. 3.
  • the transplantation method according to 1. or 2. A transplantation method, wherein the culture carrier substrate has a substrate thickness of more than 10 ⁇ m, and in the culture step, the culture carrier substrate functions as a free-standing membrane without being fixed to the inside of a culture vessel. 4.
  • the transplantation method according to any one of 1. to 3. The transplantation method, wherein the time from application to removal is 10 minutes or less in the transplantation step. 5.
  • a transplantation method wherein the area of the cell sheet obtained by the culture step is 0.3 cm2 or more.
  • a culture carrier base material used for transporting a cell sheet cultured on a culture surface comprising: The culture carrier substrate has a substrate thickness of 5 ⁇ m or more and 250 ⁇ m or less. 7. The culture carrier substrate according to 6., The culture carrier substrate has a substrate thickness of more than 10 ⁇ m, and functions as a self-supporting membrane without being fixed to the inside of a culture vessel during the culture of the cell sheet. 8. The culture carrier substrate according to 6. or 7., A culture carrier base material, the culture surface of which has been subjected to a hydrophilization treatment. 9.
  • the culture carrier substrate according to 8., The hydrophilization treatment is a plasma treatment of the culture carrier substrate.
  • the culture carrier substrate according to any one of 6. to 9. The culture carrier substrate is a polyether ether ketone film or a polyethylene terephthalate film.
  • the culture carrier base according to any one of 6. to 10. A culture carrier substrate, wherein the culture surface does not contain a temperature responsive polymer.
  • a package comprising the culture carrier substrate according to any one of 6. to 11. packaged in a packaging material.
  • the cell sheet-attached culture carrier substrate according to 13. A culture carrier substrate with a cell sheet, wherein the area of the cell sheet is 0.3 cm2 or more.
  • a method for producing a culture carrier substrate with a cell sheet according to 15. comprising the steps of: A method for producing a culture carrier substrate with a cell sheet, wherein in the culture step, the cell sheet is cultured without fixing the culture carrier substrate to the inside of a culture vessel. 17.
  • a method for producing a culture carrier substrate with a cell sheet according to 15. or 16. comprising the steps of: A method for producing a culture carrier substrate with a cell sheet, wherein the removal step does not require an operation of separating the culture carrier substrate from the culture vessel by physical means. 18.
  • a cryopreservation method comprising a cooling step of cooling a culture carrier substrate with a cell sheet, the culture carrier substrate comprising a culture carrier substrate and a cell sheet formed on a surface of the culture carrier substrate, in a cryopreservation solution. 19.
  • the cryopreservation method according to 18. A cryopreservation method, wherein in the cooling step, the culture carrier substrate with the cell sheet is cooled in a cryopreservation solution using a non-flow-through cooling device. 20.
  • the cryopreservation method according to 18. or 19., The method for cryopreservation, wherein in the cooling step, the cooling rate at 0 to -5°C is 0.1°C/min or more and 15°C/min or less.
  • 21. The cryopreservation method according to any one of 18. to 20., The cryopreservation method includes a cryopreservation step of preserving the cell sheet-attached culture carrier substrate at ⁇ 196 to ⁇ 60° C. after the cooling step.
  • the present invention provides a transplantation method that allows both cell sheet cultivation and transportation, a culture carrier substrate, a package, a culture carrier substrate with a cell sheet, a method for manufacturing a culture carrier substrate with a cell sheet, a cryopreservation method, and a frozen culture carrier substrate with a cell sheet.
  • FIG. 1 is a cross-sectional view showing a schematic example of the configuration of a carrier substrate with a cell sheet of the present embodiment.
  • FIG. 1A to 1C are cross-sectional process diagrams illustrating a modified example of the freezing method of the present embodiment.
  • the transplantation method of this embodiment includes a culture step of culturing a cell sheet on the culture surface of a culture carrier substrate, and a transplantation step of attaching the cell sheet formed on the culture surface of the culture carrier substrate to the transplantation site, and then peeling off the culture carrier substrate from the cell sheet.
  • the transplantation site may be at least a part of the body of a recipient, such as a mammal, bird, amphibian, fish, insect, plant, or microorganism.
  • a mammal such as a mammal, bird, amphibian, fish, insect, plant, or microorganism.
  • mammals and birds include humans, monkeys, chimpanzees, cows, horses, pigs, sheep, goats, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, mice, rats, and chickens.
  • the transplantation site may exclude the inside and outside of the human body.
  • transplantation sites other than the recipient include other cell sheets, devices such as medical devices, and tissues or organs isolated from the recipient.
  • tissues or organs alone include skin, oral tissue, esophagus, trachea, bronchi, lungs, lung lobes, stomach, duodenum, pancreas, spleen, small intestine, large intestine, muscle tissue, and bone (excluding tissues that are returned to the same person for treatment as the tissue taken from the recipient).
  • FIG. Fig. 1 is a cross-sectional view showing a schematic example of the steps of a transplantation method.
  • Fig. 1 shows the processes of cell seeding
  • (b) shows cell culture
  • (c) shows cryopreservation and thawing
  • (d) shows removal
  • (e) shows attachment.
  • the cryopreservation and thawing process in (c) is an optional process.
  • a transplantation method that does not include (c) is described, and the details of (c) are described in ⁇ Cryopreservation method> below.
  • the culture step may include a cell seeding step shown in Fig. 1(a) and a cell culture step shown in Fig. 1(b).
  • Fig. 2 shows a schematic cross-sectional view of an example of a culture carrier base material 50 with a cell sheet obtained in the culture step.
  • a culture solution 30 containing cells is brought into contact with a culture carrier substrate 10 placed in a culture vessel 20.
  • the cells may be suspended in the culture solution 30 in advance, or a cell suspension containing the cells may be added to the culture solution 30.
  • the culture carrier substrate 10 may be partially or entirely immersed in the culture solution 30 during the culture step.
  • the culture solution 30 may be dripped onto a part of the surface of the culture carrier substrate 10, or the culture carrier substrate 10 may be immersed in the culture solution 30 so that at least a part of each of the culture surface 12 and the side surface of the culture carrier substrate 10 is in contact with the culture solution 30.
  • the latter immersion method makes it possible to stably maintain the culture environment during the next cell culture step and/or to increase the area of the culture surface 12 of the culture carrier substrate 10, compared to the former dripping method.
  • culture is performed under appropriate culture conditions to form a cell sheet 40 on the culture surface 12 of the culture carrier substrate 10.
  • a lid (not shown) may be placed over the culture.
  • the cell sheet 40 can be cultured without fixing the culture carrier substrate 10 to the inside of the culture vessel 20.
  • the culture carrier substrate 10 functions as a self-supporting membrane during cell culture. Since the culture carrier substrate 10 is not fixed, the culture carrier substrate 50 with the cell sheet can be easily removed from the culture vessel 20 in the removal step. In addition, damage to the cell sheet 40 during removal can be suppressed.
  • fixation refers to a state in which the cell sheet is in close contact to such an extent that a peeling operation by physical means is required during removal. Fixation means that hold down the cell sheet with a load other than its own weight to prevent it from moving are not included in the "fixation" means used here.
  • examples of physical means include a method of peeling off the film while holding it, or a method of scratching it with a knife or the like and peeling it off.
  • a method for immersing the culture carrier substrate 10 in the culture solution 30 without fixing it one or more of the following may be adopted: a method for making the specific gravity of the culture carrier substrate 10 greater than that of the culture solution 30; a method for fixing a load to a part of the culture surface 12 of the culture carrier substrate 10 by a weight; or a method for fixing the position of the culture carrier substrate 10 by a tool. That is, during the cell culture process, cells can be cultured in a state where the culture carrier substrate 10 is immersed in the culture solution 30 by fixing the load and/or the position.
  • the transplantation step may include a step of removing the culture carrier substrate 50 with a cell sheet as shown in FIG. 1(d) and a step of attaching the cell sheet 40 as shown in FIG. 1(e).
  • the culture carrier substrate 50 with the cell sheet attached thereto is removed from the culture vessel 20 and transported to a desired location, such as a transplantation site.
  • the removal method is not particularly limited, but examples include a method of pinching and removing the culture carrier substrate 10 that constitutes the culture carrier substrate 50 with a cell sheet, a method of bringing the culture carrier substrate 10 into contact with a suction nozzle and lifting it while suctioning, and a method of threading the culture carrier substrate 10 and pulling it up.
  • the cell sheet 40 of the cell sheet-attached culture carrier substrate 50 is attached to the transplantation site 70, and then the culture carrier substrate 10 is peeled off from the cell sheet 40.
  • the time from attachment to removal in the attachment process can be shortened.
  • the substrate film is not exposed to the substrate as a foreign body for a long time, reducing the risk of an immune rejection reaction to the substrate film, reducing the possibility of cells dying, and simplifying the operation.
  • the method can also be used in surgeries in which a cell sheet is attached to the body through an open chest.
  • the time from application to removal is preferably 10 minutes or less, more preferably 5 minutes or less, even more preferably 3 minutes or less, and even more preferably 1 minute or less.
  • the cell sheet 40 can be prevented from remaining on the culture carrier substrate 10 after peeling.
  • the remaining rate of the cell sheet 40 on the culture carrier substrate 10 after peeling is preferably 50% or less, more preferably 30% or less, and even more preferably 10% or less, in terms of area ratio.
  • Cell transplantation therapy is intended to suppress and prevent the onset and recurrence of symptoms associated with the loss, dysfunction, and insufficiency of cells, tissues, and organs.
  • diseases that can be treated with cell transplantation therapy include spinal cord injury, knee joint cartilage injury, ischemic heart disease, age-related macular degeneration, corneal epithelial stem cell exhaustion, aplastic anemia, severe limb ischemia, intractable skin ulcers, prevention of postoperative complications (e.g., suture failure in various organs, bronchial stump fistula, pancreatic fistula, bile leakage), and burns.
  • the cells used in the cell transplantation therapy may be autologous cells, allogeneic non-autologous cells, or xenogeneic cells.
  • Preferred cells are autologous cells from the viewpoints of clinical application and safety, and non-autologous cells from the viewpoints of clinical application and productivity.
  • the culture vessel 20 is a vessel for culturing cells in a culture medium, and is not particularly limited as long as it is suitable for the type and application of cells to be cultured.
  • Examples of the culture vessel 20 include dishes, Petri dishes, tissue culture dishes, multi-dishes, flasks, tissue culture flasks, microplates, microwell plates, multi-plates, multi-well plates, chamber slides, petri dishes, tubes, trays, culture bags, roller bottles, and the like.
  • the culture vessel 20 may be a culture vessel that has been surface-treated to provide cell adhesion (for adherent cells) or a culture vessel that has not been surface-treated (for suspension cells). The presence or absence of surface treatment of the culture vessel 20 does not affect the culture carrier base 10.
  • either type may be used.
  • the material of the culture vessel 20 is not particularly limited as long as it is impermeable to the culture fluid 30, but examples include polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyvinyl alcohol, polyethylene terephthalate, polyacetal, polyvinyl chloride, acrylic resin, polycarbonate, polyether ether ketone, polyether sulfone, polytetrafluoroethylene, polyimide, polyamide, cellulose, silicone, nylon 6,6, glass, and metals such as stainless steel and aluminum.
  • the area of the culture vessel 20 is not particularly limited, but the area of a commercially available culture vessel can be used for culture without any problems.
  • the area is 0.3 cm2 or more and 1000 cm2 or less.
  • the lower limit is more preferably 0.35 cm2 or more, even more preferably 1.0 cm2 or more, and particularly preferably 1.9 cm2 or more.
  • the upper limit is more preferably 900 cm2 or less, even more preferably 800 cm2 or less, and particularly preferably 500 cm2 or less.
  • the cells are not particularly limited as long as they are clinically useful cells for treating or preventing symptoms associated with loss, dysfunction, or dysfunction of cells, tissues, or organs, or culturable cells for use in non-clinical trials, and are cells isolated from a living body.
  • the cells include biological tissue cells, mesenchymal stem cells capable of differentiating into cells belonging to mesenchymal tissues, pluripotent stem cells capable of differentiating into various biological tissues, stem cells and precursor cells that are induced to differentiate, etc.
  • the cells may be either adherent cells or floating cells.
  • biological tissue cells include fibroblasts, myofibroblasts, corneal epithelial cells, retinal cells, nerve cells, muscle cells, cardiac muscle cells, myoblasts, bone cells, osteoblasts, chondrocytes, adipocytes, hepatic cells, pancreatic cells, kidney cells, gingival cells, periosteal cells, skin cells, and endothelial cells.
  • mesenchymal stem cells include adipose tissue-derived mesenchymal stem cells, bone marrow-derived mesenchymal stem cells, umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells, and umbilical cord-derived mesenchymal stem cells.
  • pluripotent stem cells include induced pluripotent stem cells, embryonic stem cells, nuclear transfer embryonic stem cells, embryonic tumor cells, and embryonic germ cells. These cells may be cultured alone or in combination of two or more kinds. The cells may be appropriately selected from known ones depending on the purpose of the cells.
  • the origin of the cells is not particularly limited, but examples include mammals, birds, amphibians, fish, insects, plants, and microorganisms. Specific examples of mammals and birds include humans, monkeys, chimpanzees, cows, horses, pigs, sheep, goats, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, mice, rats, and chickens.
  • the cell culture is not particularly limited, and conventional means used in technical fields such as medicine, pharmaceuticals, quasi-drugs, cosmetics, food, and veterinary medicine, as well as basic technical fields such as regenerative medicine and bioengineering, can be used.
  • the culture conditions are not particularly limited as long as the cultured cells can be brought into a desired state.
  • Typical culture conditions include, for example, a 37° C., 5% CO 2 environment using a prepared basal culture medium.
  • the period of cell culture is not particularly limited as long as the cultured cells reach the desired state.
  • the period of cell culture is, for example, within 28 days, within 21 days, within 14 days, within 7 days, within 5 days, or within 3 days.
  • the medium may be replaced.
  • the frequency and method of medium replacement are not particularly limited. In general, it is preferable to replace the medium every 1 to 7 days. Particularly preferably, it is every 1 to 5 days. At this time, the entire amount of the medium may be replaced, or a part of the medium may be left and new medium may be added.
  • the density of the cells to be cultured is not particularly limited as long as it is suitable for the cells to be cultured, the culture vessel, and the use of the cultured cells, but is, for example, 5 x 102 cells/cm2 or more and 1 x 109 cells/cm2 or less .
  • the lower limit of the cell density is more preferably 1 x 103 cells/cm2 or more , even more preferably 5 x 103 cells/ cm2 or more, and particularly preferably 5 x 104 cells/cm2 or more .
  • the upper limit of the cell density is more preferably 1 x 108 cells/cm2 or less, even more preferably 5 x 107 cells/cm2 or less, and particularly preferably 1 x 107 cells/cm2 or less .
  • the density of the cells to be cultured is, for example, 5 ⁇ 10 2 cells/cm 2 to 1 ⁇ 10 9 cells/cm 2 , 5 ⁇ 10 2 cells/cm 2 to 1 ⁇ 10 8 cells/cm 2 , 5 ⁇ 10 2 cells/cm 2 to 5 ⁇ 10 7 cells/cm 2 , 5 ⁇ 10 2 cells/cm 2 to 1 ⁇ 10 7 cells/cm 2 , 1 ⁇ 10 3 cells /cm 2 to 1 ⁇ 10 9 cells/cm 2 , 1 ⁇ 10 3 cells/cm 2 to 1 ⁇ 10 8 cells/cm 2 , 1 ⁇ 10 3 cells/cm 2 to 5 ⁇ 10 7 cells/cm 2 , 1 ⁇ 10 3 cells/cm 2 to 1 ⁇ 10 7 cells/cm 2 , 5 ⁇ 10 3 cells/cm 2 to 1 ⁇ 10 9 ...5 ⁇ 10 7 cells/cm 2 , 1 ⁇ 10 3 cells/cm 2 to 1 ⁇ 10 7 cells/cm 2 , 5 ⁇ 10 3 cells/cm 2 to 1 ⁇ 10 9 cells/cm 2 , 5 ⁇
  • culture medium 30 There are no particular limitations on the culture medium 30 as long as it is suitable for the cells to be cultured.
  • Examples of culture medium components include sugars, amino acids, vitamins, inorganic salts, trace metals, and additives. These culture medium components may be blended alone or in combination of two or more. These culture medium components may be appropriately selected from known ones depending on the cells to be cultured, etc.
  • sugars include monosaccharides such as glucose, fructose, mannose, and galactose; disaccharides such as sucrose, sucralose, trehalose, maltose, and lactose; trisaccharides such as glucosylsucrose, lactosucrose, and raffinose; tetrasaccharides such as acarbose and maltotetraose; cyclodextrins; and oligosaccharides.
  • monosaccharides such as glucose, fructose, mannose, and galactose
  • disaccharides such as sucrose, sucralose, trehalose, maltose, and lactose
  • trisaccharides such as glucosylsucrose, lactosucrose, and raffinose
  • tetrasaccharides such as acarbose and maltotetraose
  • amino acids include L-glutamic acid, L-glutamine, L-arginine, L-cystine, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L-methionine, L-phenylalanine, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-valine, L-alanine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-cysteine, and L-hydroxyproline.
  • vitamins include L-sodium ascorbate, L-ascorbic acid diphosphate, choline, folic acid, niacin, biotin, pantothenic acid, pyridoxine, riboflavin, thiamine, thymidine, and vitamin B12.
  • inorganic salts include sodium chloride, sodium hydroxide, sodium sulfate, sodium phosphate, disodium hydrogen phosphate, sodium carbonate, sodium bicarbonate, potassium chloride, potassium hydroxide, potassium sulfate, potassium phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, potassium carbonate, potassium bicarbonate, calcium chloride, calcium sulfate, calcium nitrate, calcium phosphate, calcium carbonate, magnesium chloride, magnesium sulfate, magnesium nitrate, magnesium phosphate, magnesium carbonate, and the like.
  • trace metals include iron sulfate, iron nitrate, copper sulfate, copper nitrate, and zinc sulfate.
  • additives include sera such as bovine serum, horse serum, and human serum; growth factors such as FGF2, EGF, HGF, VEGF, and PDGF; proteins such as albumin; antioxidants such as glutathione, ascorbic acid, and ascorbic acid derivatives; antibiotics such as penicillin and streptomycin; pH adjusters such as HEPES; organic acids such as lactic acid and propionic acid; lipids such as cholesterol; fatty acids such as linoleic acid; amines such as ethanolamine and putrescine; reducing agents such as mercaptoethanol and 3-mercapto-1,2-propanediol; thickeners such as sodium alginate, polyvinylpyrrolidone, carboxymethylcellulose, and pullulan; and pH indicators such as phenol red.
  • growth factors such as FGF2, EGF, HGF, VEGF, and PDGF
  • proteins such as albumin
  • antioxidants such as glutathione, ascorbic acid, and ascorbic acid derivatives
  • Examples of the culture medium 30 containing the above culture medium components include AIM V medium, HFDM-1 Medium, equilibrium buffers such as Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) and Hank's balanced salt solution (HBSS), DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), EMEM (Eagle's Minimum Essential Medium), ⁇ -MEM (Minimum Essential Medium alpha Modification), IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), GMEM (Glasgow's MEM), Ham's F-10 medium, Ham's F-12 medium, Ham's F-12K medium, RPMI medium 1640, M-199 medium, L-15 medium, McCoy's 5A Medium, MCDB105 medium, MCDB107 medium, MCDB131 medium, MCDB153 medium, MCDB201 medium, NCTC109 medium, NCTC135 medium, Waymouth's MB752/1 medium, CMRL-1066 Examples of the basal culture
  • basal culture solutions may be used alone or in combination of two or more. Furthermore, the basal culture solution may be added, removed, increased, or decreased in volume depending on the type and condition of the cells. These basal culture solutions may be appropriately selected from known ones depending on the cells to be cultured.
  • the cell sheet 40 has a sheet structure in which cells are physically and functionally connected to each other via adhesion molecules, extracellular matrix, and the like.
  • the cell sheet 40 may have a single-layer structure consisting of one cell layer, or may have a laminated structure consisting of two or more cell layers.
  • the laminated structure is not particularly limited, but examples thereof include multi-layer structures such as two layers, three layers, four layers, and five layers.
  • a multi-layer structure may be obtained when it is cultured on the culture carrier substrate 10, or it may be obtained by stacking cell sheets having a single-layer structure.
  • a cell sheet having a multi-layer structure can be obtained by preparing multiple culture carrier substrates 50 with cell sheets of the present invention, superimposing one cell sheet on another, and peeling off the culture carrier substrate from the other cell sheet.
  • the thickness of the cell sheet 40 is not particularly limited, but is, for example, 0.001 mm or more and 2.0 mm or less.
  • the lower limit of the thickness of the cell sheet 40 is more preferably 0.01 mm or more, even more preferably 0.03 mm or more, and particularly preferably 0.05 mm or more.
  • the upper limit of the thickness of the cell sheet 40 is more preferably 1.5 mm or less, even more preferably 1.2 mm or less, and particularly preferably 1.0 mm or less.
  • the thickness of the cell sheet 40 is, for example, 0.001 mm to 2.0 mm, 0.001 mm to 1.5 mm, 0.001 mm to 1.2 mm, 0.001 mm to 1.0 mm, 0.01 mm to 2.0 mm, 0.01 mm to 1.5 mm, 0.01 mm to 1.2 mm, 0.01 mm to 1.0 mm, 0.03 mm to 2.0 mm, 0.03 mm to 1.2 mm, 0.03 mm to 1.0 mm, 0.05 mm to 2.0 mm, 0.05 mm to 1.5 mm, 0.05 mm to 1.2 mm, or 0.05 mm to 1.0 mm.
  • the area of the cell sheet 40 is not particularly limited, and may be, for example, 0.3 cm2 or more and 1000 cm2 or less.
  • the lower limit of the area of the cell sheet 40 is more preferably 0.6 cm2 or more, even more preferably 1.6 cm2 or more, particularly preferably 8 cm2 or more, and may be 3 cm2 or more, 6 cm2 or more, or 10 cm2 or more.
  • the upper limit of the area of the cell sheet 40 is more preferably 900 cm2 or less, even more preferably 800 cm2 or less, particularly preferably 500 cm2 or less, and may be 100 cm2 or less, 50 cm2 or less, or 20 cm2 or less.
  • the area of the cell sheet 40 is 0.6 cm2 or more and 900 cm2 or less, 1.6 cm2 or more and 800 cm2 or less, 3 cm2 or more and 500 cm2 or less, 6 cm2 or more and 100 cm2 or less , 8 cm2 or more and 50 cm2 or less, or 10 cm2 or more and 20 cm2 or less.
  • the strength of the cell sheet is low, so that in the case of a large area, there is a high possibility of the cell sheet being damaged during transportation.
  • the cell sheet 40 since the cell sheet 40 is supported by the culture carrier base material, the cell sheet can be prevented from being torn during transplantation, so that the size of the cell sheet 40 can be increased to 8 cm2 or more.
  • a large cell sheet can be prepared and appropriately adjusted to the size of the affected area for use.
  • the shape of the culture carrier substrate is shown as a circle in FIG. 1, it may be any suitable shape other than a circle, for example, a regular polygon such as a square, a regular pentagon, a regular hexagon, or a regular octagon, an oval, a rectangle, etc.
  • the culture carrier substrate 10 of this embodiment is used both as a cell sheet scaffold for culturing cells to form a cell sheet 40, and as a cell sheet support for transporting the cultured cell sheet 40, and is a substrate that is peeled off from the cell sheet after being affixed to the site to which the cell sheet is to be transplanted.
  • the area of the culture carrier substrate 10 is not particularly limited, but is preferably smaller than the culture vessel and equal to or larger than the cell sheet. For example, it is 0.3 cm2 or more and 1000 cm2 or less.
  • the lower limit of the area of the culture carrier substrate 10 is more preferably 0.6 cm2 or more, even more preferably 1.6 cm2 or more, particularly preferably 8 cm2 or more, and may be 3 cm2 or more, 6 cm2 or more, or 10 cm2 or more.
  • the upper limit of the area of the culture carrier substrate 10 is more preferably 900 cm2 or less, even more preferably 800 cm2 or less, particularly preferably 500 cm2 or less, and may be 100 cm2 or less, 50 cm2 or less, or 20 cm2 or less .
  • the area of the culture carrier substrate 10 is 0.6 cm 2 to 900 cm 2 , 1.6 cm 2 to 800 cm 2 , 3 cm 2 to 500 cm 2 , 6 cm 2 to 100 cm 2 , 8 cm 2 to 50 cm 2 , or 10 cm 2 to 20 cm 2 .
  • the substrate thickness of the culture carrier substrate 10 is not particularly limited, but is preferably 5 ⁇ m or more and 250 ⁇ m or less.
  • the lower limit of the substrate thickness is more preferably 6 ⁇ m or more, even more preferably 8 ⁇ m or more, 10 ⁇ m or more, or 12 ⁇ m or more.
  • the upper limit of the substrate thickness is more preferably 50 ⁇ m or less, 30 ⁇ m or less, 25 ⁇ m or less, and even more preferably 20 ⁇ m or less.
  • the substrate thickness of the culture carrier substrate 10 is 6 ⁇ m or more and 50 ⁇ m or less, 8 ⁇ m or more and 30 ⁇ m or less, or 10 ⁇ m or more and 20 ⁇ m or less.
  • the culture carrier substrate 10 can be prevented from breaking or curling during transportation, improving the ease of handling.
  • the thickness By setting the thickness to the above upper limit or less, the conformability to the affected area during transplantation can be improved.
  • the substrate thickness is set to 20 ⁇ m or less, the conformability to the affected area with a higher curvature can be improved, and the substrate can be applied to, for example, a site where an internal organ has been sutured during surgery.
  • the lower limit of the substrate thickness of the culture carrier substrate 10 is preferably more than 10 ⁇ m, more preferably 11 ⁇ m or more, and even more preferably 12 ⁇ m or more.
  • the self-supporting membrane is preferably a membrane that maintains the planar state of the culture surface 12 of the culture carrier substrate 10 even in the culture solution 30, and more preferably maintains the planar state even after the cell sheet 40 is formed on the culture surface 12.
  • the non-curling culture carrier substrate 10 can enhance the cell culture characteristics in the culture solution 30 without adhering.
  • the self-supporting membrane may be capable of retaining a sheet shape to a certain extent when one end is pinched and lifted with tweezers.
  • the area of the culture carrier substrate 10 is preferably 1.6 cm2 or more.
  • the culture surface 12 of the culture carrier substrate 10 is preferably subjected to a hydrophilic treatment, which can improve cell adhesion.
  • a hydrophilic treatment include UV ozone treatment and plasma treatment.
  • the hydrophilized surface means a surface having a water droplet contact angle ⁇ of 70° or less as measured by the ⁇ /2 method.
  • the lower limit of the water droplet contact angle ⁇ of the hydrophilized surface is preferably 3° or more, but is not limited thereto.
  • the water droplet contact angle ⁇ is measured by placing 2 ⁇ l of pure water on the substrate in a 25° C.
  • the lower limit of the surface roughness Ra of the hydrophilically treated culture surface is 0.3 nm or more, preferably 0.5 nm or more, and the upper limit is 100 nm or less, preferably 10 nm or less, more preferably 2 nm or less.
  • the surface roughness Ra herein refers to the arithmetic mean roughness in a square region with one side being 100 nm, using surface shape data measured with an atomic force microscope (AFM).
  • Examples of materials that can be used to form the culture carrier substrate 10 include resin materials such as polyether ether ketone (PEEK), polyethylene terephthalate (PET), polybutylene terephthalate (PBT), polystyrene (PS), polycarbonate (PC), modified polyphenylene ether (mPPE), polyphenylene sulfide (PPS), polysulfone (PSU), polyarylate (PAR), liquid crystal polymer (LCP), polyethylene (PE), and polypropylene (PP).
  • resin materials such as polyether ether ketone (PEEK), polyethylene terephthalate (PET), polybutylene terephthalate (PBT), polystyrene (PS), polycarbonate (PC), modified polyphenylene ether (mPPE), polyphenylene sulfide (PPS), polysulfone (PSU), polyarylate (PAR), liquid crystal polymer (LCP), polyethylene (PE), and polypropylene (PP).
  • the resin layer does not need to include a layer formed by chemical vapor deposition such as parylene or a wet coating layer.
  • the inorganic layer in the laminate substrate preferably does not include a glass layer, and may include a metal foil.
  • the culture carrier substrate 10 preferably does not include a nonwoven fabric or a fiber substrate on the culture surface 12 side. Considering overall the low linear expansion coefficient, solvent resistance, and heat resistance, a culture carrier substrate 10 containing PEEK is more preferable than one containing PET.
  • the culture carrier substrate 10 is preferably made of a material having a higher specific gravity than the culture solution 30 .
  • the culture carrier substrate When the culture surface 12 of the culture carrier substrate 10 is measured with a laser microscope, the culture carrier substrate has three or less holes with a diameter of 1 ⁇ m to 100 ⁇ m and a depth of 0.5 ⁇ m to 100 ⁇ m within a 100 ⁇ m square area.
  • the diameter of the hole is, for example, 1 ⁇ m to 100 ⁇ m, preferably 2 ⁇ m to 50 ⁇ m, more preferably 3 ⁇ m to 30 ⁇ m.
  • the depth of the hole is, for example, 0.5 ⁇ m to 100 ⁇ m, preferably 1 ⁇ m to 50 ⁇ m, more preferably 2 ⁇ m to 20 ⁇ m.
  • Combinations of the ranges of hole diameter and hole depth are, for example, hole diameter of 1 ⁇ m to 100 ⁇ m and hole depth of 0.5 ⁇ m to 100 ⁇ m, hole diameter of 1 ⁇ m to 100 ⁇ m and hole depth of 1 ⁇ m to 50 ⁇ m, hole diameter of 1 ⁇ m to 100 ⁇ m and hole depth of 2 ⁇ m to 20 ⁇ m, hole diameter of 2 ⁇ m to 50 ⁇ m and hole depth of 0.5 ⁇ m to 100 ⁇ m, hole diameter the hole diameter is 2 ⁇ m or more and 50 ⁇ m or less and the hole depth is 1 ⁇ m or more and 50 ⁇ m or less, the hole diameter is 2 ⁇ m or more and 50 ⁇ m or less and the hole depth is 2 ⁇ m or more and 20 ⁇ m or less, the hole diameter is 3 ⁇ m or more and 30 ⁇ m or less and the hole depth is 0.5 ⁇ m or more and 100 ⁇ m or less, the hole diameter is 3 ⁇ m or more and 30 ⁇ m or less and the hole
  • the upper limit of the porosity of the culture carrier substrate 10 is, for example, 15% or less, preferably 10% or less, and more preferably 5% or less.
  • the lower limit of the porosity of the culture carrier substrate 10 is not particularly limited, but may be 0% or more.
  • the adhesion to the cell sheet 40 can be made appropriate.
  • the presence or absence of holes may be measured on the surface of the resin layer formed on the culture surface 12 side of the culture carrier substrate 10 .
  • the porosity is calculated from the theoretical density and the actually measured density.
  • the culture surface 12 of the culture carrier substrate 10 may be configured not to contain a temperature-responsive polymer, which can prevent the adhesion between the cell sheet 40 and the culture carrier substrate 10 from decreasing in a low-temperature environment such as a cryopreservation process.
  • the temperature-responsive polymer is a material that exhibits cell adhesiveness at the temperature at which cells are cultured, and exhibits cell non-adhesiveness by changing the temperature from that point, making it possible to easily peel off the cell sheet. If the temperature range in which the temperature-responsive polymer exhibits cell adhesiveness is 10°C to 45°C, and particularly 33°C to 40°C, this is preferable because cells can be stably cultured. In addition, if the temperature range in which the temperature-responsive polymer exhibits cell non-adhesiveness is within the range of 1°C to 36°C, and particularly 4°C to 32°C, this is preferable because this reduces damage to the peeling of the cell sheet.
  • temperature-responsive polymers such as poly-N-isopropylacrylamide (PNIPAAm), poly-N-n-propylacrylamide, poly-N-n-propylmethacrylamide, poly-N-ethoxyethylacrylamide, poly-N-tetrahydrofurfuryl acrylamide, poly-N-tetrahydrofurfuryl methacrylamide, and poly-N,N-diethylacrylamide, with PNIPAAm, poly-N-n-propylmethacrylamide, and poly-N,N-diethylacrylamide being particularly preferred.
  • PNIPAAm poly-N-isopropylacrylamide
  • PNIPAAm poly-N-n-propylacrylamide
  • poly-N-n-propylmethacrylamide poly-N-ethoxyethylacrylamide
  • PNIPAAm poly-N-tetrahydrofurfuryl acrylamide
  • poly-N-tetrahydrofurfuryl methacrylamide and poly
  • the culture carrier substrate 10 before being used for culturing the cell sheet can be packaged in a packaging material. By making it into a sealed package, it can be stored and distributed without soiling the culture surface. This package may also be sterilized. Sterilization methods include electron beam sterilization, gamma ray sterilization, EOG sterilization, high-pressure steam sterilization, etc.
  • packaging materials include aluminum, polyethylene terephthalate, ionomer, polyethylene, polyvinyl chloride, polyvinylidene chloride, polyvinyl alcohol, polypropylene, polyester, polycarbonate, polystyrene, polyacrylonitrile, ethylene-vinyl acetate copolymer, ethylene-vinyl alcohol copolymer, ethylene-methacrylic acid copolymer, perfluoroalkoxy fluororesin, nylon, cellophane, and paper. These may be used alone or in combination of two or more. When sterilization requiring gas permeability is performed, such as EOG sterilization or high-pressure steam sterilization, packaging materials combining paper and the above materials are preferably used.
  • the packaging material may be multi-packaged, and further packaging may be added after sterilization, and it is preferable that the outermost part of the package is a resin film-like packaging material.
  • a cell sheet-attached culture carrier substrate 50 including a laminate of the cell sheet 40 and the culture carrier substrate 10 is obtained.
  • the cell sheet 40 covers, for example, 50% to 100% of the surface area on the culture surface 12 side where cells can be deposited.
  • the area where cells can be deposited is an area where the weight, instrument, etc. are not in contact and cells can be deposited.
  • the area where cells can be deposited is an area that has been subjected to the hydrophilic treatment.
  • the lower limit of the coverage area of the cell sheet 40 is preferably 70% or more, more preferably 90% or more.
  • the upper limit of the coverage area of the cell sheet 40 may be 100% or less, 99% or less, or 98% or less.
  • the coverage area of the cell sheet 40 is, for example, 50% to 100%, 50% to 99%, 50% to 98%, 70% to 100%, 70% to 99%, 70% to 98%, 90% to 100%, 90% to 99%, and 90% to 98%.
  • the area of the culture carrier substrate 10 is preferably equal to or larger than the area of the region of the cell sheet 40 where cells can be deposited. By setting the coverage area to be equal to or larger than the lower limit, the healing effect can be improved.
  • the possibility of the cell sheet tearing when being removed from the culture vessel or cryopreservation vessel is reduced, making it easier to remove.
  • the cell sheet After attaching the cell sheet to the transplantation site, the cell sheet can be easily peeled off from the culture carrier substrate. As the cell sheet is easier to handle, it becomes possible to produce large-sized cell sheets.
  • An example of a manufacturing method for the culture carrier substrate 50 with a cell sheet of this embodiment may include, for example, a culture process in which a plurality of cells, a culture medium (culture solution 30), and a culture carrier substrate 10 are introduced into the inside of a culture container 20, and a cell sheet 40 is cultured on the culture surface 12 of the culture carrier substrate 10, and a removal process in which the culture carrier substrate 50 with the cell sheet is removed from the culture solution 30.
  • the cell sheet 40 of this embodiment is peeled off from the cell sheet-attached culture carrier substrate 50, and can be used for treatment, prevention, etc., such as cell transplantation therapy.
  • the peeling method is not particularly limited, and may be any of the usual means used in the technical fields of medicine, pharmaceuticals, quasi-drugs, cosmetics, food, veterinary medicine, etc., and in the basic technical fields of regenerative medicine, bioengineering, etc. Examples of the peeling method include physical treatment.
  • an example of the cryopreservation method of the present embodiment includes a cooling step of cooling a culture carrier substrate 50 with a cell sheet, which includes a culture carrier substrate 10 inside a culture vessel 20 and a cell sheet 40 formed on the surface (culture surface 12) of the culture carrier substrate 10, in a cryopreservation liquid 60.
  • the culture vessel may be frozen with a lid (not shown) for culture or a lid (not shown) for preventing liquid leakage and microbial contamination.
  • the culture carrier substrate 50 with a cell sheet is cryopreserved inside the culture vessel 20, but the culture carrier substrate 50 with a cell sheet may be transferred to a cryopreservation container other than the culture vessel 20 and cryopreserved.
  • the cryopreservation container is not particularly limited, and may be, for example, the one exemplified for the culture vessel 20.
  • the culture carrier substrate 50 with the cell sheet can adopt various forms.
  • the culture carrier substrate 50 with the cell sheet may have a structure in which the culture carrier substrate 10 is formed on one side of the cell sheet 40, or as shown in Fig. 3(c), the culture carrier substrate 10 may be sandwiched between two culture carrier substrates 10a and 10b on both sides of the cell sheet 40.
  • the culture carrier substrate 10 is placed facing the bottom surface of the culture vessel 20.
  • the cell sheet 40 is placed facing the bottom surface of the culture vessel 20.
  • the culture carrier substrates 10a and 10b may be made of the same material or may be made of different materials.
  • both the culture carrier substrates 10a and 10b may be culture carrier substrates containing PEEK, or one may be a culture carrier substrate containing PEEK and the other may be a culture carrier substrate not containing PEEK.
  • the cryopreservation solution 60 is a solution for reducing damage to cells due to cryopreservation.
  • the cryopreservation solution 60 may contain culture solution components contained in culture solution, a cryoprotectant, and the like.
  • the culture medium components such as sugars, amino acids, vitamins, inorganic salts, trace metals, and additives, may be any that satisfy the description in the section (Culture Medium) above.
  • the freezing and preservation medium preferably has a solidification initiation temperature in the range of -15°C or higher and -5°C or lower.
  • Cryoprotectants are substances used to reduce damage to cells caused by freezing and thawing during cryopreservation.
  • cryoprotectants include cell-non-permeable cryoprotectants and cell-permeable cryoprotectants.
  • Specific examples of cell-impermeable cryoprotectants include, for example, albumin, sucrose, trehalose, dextran, polyethylene glycol, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, polylysine, and the like.
  • Specific examples of cell-permeable cryoprotectants include, for example, dimethylsulfoxide (DMSO), glycerol, ethylene glycol, propylene glycol, propanediol, and the like. These cryoprotectants may be used alone or in combination of two or more. These cryoprotectants may be appropriately selected from known ones depending on the type of cells, the composition of the cryopreservation solution, etc.
  • cryopreservation solutions that do not contain DMSO include, for example, Stem Cell Banker (registered trademark) DMSO-free GMP grade (Nihon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.), Bambanker (registered trademark) DMSO-free (CG Lymphotec Co., Ltd.), CryoScarless (registered trademark) DMSO-free (BioVerde Co., Ltd.), Stem Cell Keep (BioVerde Co., Ltd.), CryoNovo (registered trademark) X12 (Akron BioProducts LCC Co., Ltd.), and CryoNovo (registered trademark) P24.
  • Stem Cell Banker registered trademark
  • Bambanker registered trademark
  • DMSO-free CG Lymphotec Co., Ltd.
  • CryoScarless registered trademark
  • DMSO-free BioVerde Co., Ltd.
  • Stem Cell Keep BioVerde Co., Ltd.
  • CryoNovo registered trademark
  • cryopreservation solutions containing DMSO examples include Stem Cell Banker (registered trademark) GMP grade (Nihon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.), Stem Cell Banker (registered trademark) EX GMP grade (Nihon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.), Bambanker (registered trademark) hRM (CG Lymphotec Co., Ltd.), Bambanker (registered trademark) (CG Lymphotec Co., Ltd.), iStock (CG Lymphotec), CryoStor CS5 (Charles River Laboratories Cell Solutions, Inc.), and CryoStor CS10 (Charles River Laboratories Cell Solutions, Inc.).
  • the cooling step it is preferable to cool the culture carrier substrate 50 with the cell sheet in a cryopreservation solution using a non-throughflow cooling device.
  • the cell sheet 40 on the appropriate culture carrier substrate 10 can be cooled at a uniform temperature by the non-throughflow cooling device, which causes less damage to the cells and suppresses a decrease in the cell activity rate.
  • the cooling rate at 0 to ⁇ 5° C. is, for example, 0.1° C./min to 15° C./min, preferably 0.25° C./min to 12.5° C./min, and more preferably 0.5° C./min to 10° C./min.
  • the temperature of the freezing process is not particularly limited, so long as it is possible to freeze the cultured cells and the cryopreservation solution.
  • the freezing process temperature is, for example, -196°C or higher and -25°C or lower.
  • the lower limit is more preferably -180°C or higher, even more preferably -160°C or higher, and particularly preferably -150°C or higher.
  • the upper limit is more preferably -25°C or lower, even more preferably -30°C or lower, and particularly preferably -35°C or lower.
  • the freezing temperature is, for example, -196°C or higher and -25°C or lower, -196°C or higher and -30°C or lower, -196°C or higher and -35°C or lower, -180°C or higher and -25°C or lower, -180°C or higher and -30°C or lower, -180°C or higher and -35°C or lower, -160°C or higher and -25°C or lower, -160°C or higher and -30°C or lower, -160°C or higher and -35°C or lower, -150°C or higher and -25°C or lower, -150°C or higher and -30°C or lower, or -150°C or higher and -35°C or lower.
  • the cooling device used in the freezing process is not particularly limited, and examples include quick freezing devices and cryogenic refrigeration devices.
  • a freezing device that does not come into contact with the heat transfer means and blows cold air onto the culture vessel from multiple directions, preferably all directions, rather than contacting the culture vessel with a heat transfer means to freeze the culture vessel and cells, is preferable from the viewpoint of freezing cells at a uniform temperature and increasing the survival rate of the cells after thawing.
  • Specific examples of freezing devices that blow cold air onto the culture vessel include cooling devices that cool the object to be cooled by circulating cold air with a cooling fan, such as the non-through-flow type cooling device with a cooling fan disclosed in JP 2005-127666 A.
  • the above "non-through-flow type” refers to a type in which most of the through-flow air from the object to be cooled does not pass through (through) the cooler.
  • the cryopreservation method preferably includes a cryopreservation step of storing the cell sheet-attached culture carrier substrate 50 after the cooling step, for example, at ⁇ 196 to ⁇ 60° C., preferably ⁇ 180 to ⁇ 65° C., more preferably ⁇ 150 to ⁇ 80° C. This allows the cell sheet to be stably maintained for a long period of time.
  • the temperature in the cooling step may be the set temperature of the cooling device.
  • cryopreservation is not particularly limited as long as the cells can be stably cryopreserved.
  • Methods of cryopreservation include, for example, contact with the liquid or gas phase of a cooling agent, use of an ultra-low temperature freezer, etc.
  • a preferred method of cryopreservation is contact with the liquid or gas phase of a cooling agent from the viewpoint of temperature.
  • Coolants include, for example, liquid nitrogen, liquid ethane, liquid propane, liquid helium, dry ice, and the like.
  • the temperature for cryopreservation is not particularly limited as long as the cells can be stably cryopreserved, and may be, for example, within any range of ⁇ 196° C. to ⁇ 60° C., ⁇ 196° C. to ⁇ 134° C., or ⁇ 134° C. to ⁇ 60° C.
  • the temperature for cryopreservation may be the surface temperature of the cell sheet 40 to be frozen.
  • the surface temperature can be measured using, for example, a K thermocouple.
  • the frozen culture carrier substrate 50 with a cell sheet includes a culture carrier substrate 10 and a cell sheet 40 formed on the surface (culture surface 12) of the culture carrier substrate 10.
  • the culture carrier substrate 10 and the cell sheet 40 are in a frozen state.
  • the culture carrier substrate 10 and the cell sheet 40 are frozen at the above-mentioned cryopreservation temperature, specifically, preferably at or below -60°C, more preferably at or below -135°C.
  • the frozen material may also be frozen in the range of -134°C or higher and -60°C or lower.
  • the frozen material is frozen at or above -196°C.
  • the frozen product of the culture carrier substrate with a cell sheet frozen inside a culture vessel or a cryopreservation vessel can be packaged in a packaging material while it is frozen in the culture vessel or the cryopreservation vessel, or after it has been removed from the vessel.
  • a package of the frozen product can be obtained by packaging the culture carrier substrate with a cell sheet and a vessel containing a cryopreservation solution in a film-like packaging material and freezing it in a sealed state.
  • the packaging material aluminum, polyethylene terephthalate, ionomer, polyethylene, polyvinylidene chloride, polyvinyl alcohol, polypropylene, polyester, polycarbonate, polyacrylonitrile, ethylene-vinyl acetate copolymer, ethylene-vinyl alcohol copolymer, ethylene-methacrylic acid copolymer, polyimide, fluororesins such as perfluoroalkoxy fluororesin and tetrafluoroethylene-hexafluoropropylene copolymer (FEP), and nylon. These may be used alone or in combination of two or more of these.
  • FEP tetrafluoroethylene-hexafluoropropylene copolymer
  • the cryopreservation method further includes a thawing step of thawing the culture carrier substrate 50 with the cell sheet attached.
  • the thawing method is not particularly limited, and any conventional means used in technical fields such as medicine, pharmaceuticals, quasi-drugs, cosmetics, food, and veterinary medicine, as well as basic technical fields such as regenerative medicine and bioengineering, can be used.
  • Methods for thawing include, for example, using a water bath, incubator, hot plate, defroster, etc., immersing in a melting liquid at a temperature higher than the freezing point, or leaving in an environment at a temperature higher than the freezing point.
  • the environmental temperature in contact with the frozen material during thawing is not particularly limited as long as it is higher than the freezing temperature and lower than 50° C.
  • the upper limit of the environmental temperature is, for example, 49° C. or lower, preferably 45° C.
  • the lower limit of the environmental temperature is, for example, 0° C. or higher, preferably 5° C. or higher, more preferably 10° C., and even more preferably 15° C. or higher.
  • the range of environmental temperatures in contact with the frozen material when thawing is, for example, 0°C or higher and 49°C or lower, 0°C or higher and 45°C or lower, 0°C or higher and 40°C or lower, 5°C or higher and 49°C or lower, 5°C or higher and 45°C or lower, 5°C or higher and 40°C or lower, 10°C or higher and 49°C or lower, 10°C or higher and 45°C or lower, 10°C or higher and 40°C or lower, 15°C or higher and 49°C or lower, 15°C or higher and 45°C or lower, and 15°C or higher and 40°C or lower.
  • a thawing temperature of 50° C.
  • the frozen material may be temporarily stored in a temperature environment below the freezing point during thawing.
  • a frozen material stored at ⁇ 80° C. can be exposed to an environmental temperature of ⁇ 30° C. and then thawed at an environmental temperature above the freezing point.
  • the time required for thawing a frozen material is not particularly limited as long as the cells are not damaged by freezing. Usually, thawing can be performed without problems if it is more than 10 seconds and less than 60 minutes.
  • the lower limit of the time required for thawing a frozen material is more than 10 seconds, preferably 20 seconds or more, more preferably 30 seconds or more, and even more preferably 1 minute or more.
  • the upper limit is 60 minutes or less, preferably 50 minutes or less, more preferably 40 minutes or less, and even more preferably 30 minutes or less.
  • the time required for thawing is more than 10 seconds but less than 60 minutes, more than 10 seconds but less than 50 minutes, more than 10 seconds but less than 40 minutes, more than 10 seconds but less than 30 minutes, 20 seconds or more but less than 60 minutes, 20 seconds or more but less than 50 minutes, 20 seconds or more but less than 40 minutes, 20 seconds or more but less than 30 minutes, 30 seconds or more but less than 60 minutes, 30 seconds or more but less than 50 minutes, 30 seconds or more but less than 40 minutes, 30 seconds or more but less than 30 minutes, 1 minute or more but less than 60 minutes, 1 minute or more but less than 50 minutes, 1 minute or more but less than 40 minutes, or 1 minute or more but less than 30 minutes.
  • the thermal shock caused by the temperature difference may cause cracks in the frozen material, damaging the cell sheet, whereas if thawing is performed too slowly, water molecules may recrystallize in sub-freezing conditions, causing the ice crystals to grow larger and causing serious damage to the cells, which is undesirable.
  • the environmental temperature may be set to be constant, or may be set to fluctuate, such as increasing stepwise.
  • melting liquid there are no particular limitations on the melting liquid, so long as it does not damage the cultured cells.
  • components contained in the melting liquid include sucrose, glucose, maltose, trehalose, and fructose.
  • the melting liquid may also contain the components described in the above section (Culture liquid).
  • the temperature of the melting liquid is not particularly limited as long as it is higher than the freezing temperature.
  • the temperature of the melting liquid is, for example, 0°C or higher and 45°C or lower.
  • the lower limit is more preferably 4°C or higher, even more preferably 25°C or higher, and particularly preferably 28°C or higher.
  • the upper limit is more preferably 40°C or lower, even more preferably 39°C or lower, and particularly preferably 38°C or lower.
  • the temperature of the melting liquid is, for example, 0°C or higher and 45°C or lower, 0°C or higher and 40°C or lower, 0°C or higher and 39°C or lower, 0°C or higher and 38°C or lower, 4°C or higher and 45°C or lower, 4°C or higher and 40°C or lower, 4°C or higher and 39°C or lower, 4°C or higher and 38°C or lower, 25°C or higher and 45°C or lower, 25°C or higher and 40°C or lower, 25°C or higher and 39°C or lower, 25°C or higher and 38°C or lower, 28°C or higher and 45°C or lower, 28°C or higher and 40°C or lower, 28°C or higher and 39°C or lower, and 28°C or higher and 38°C or lower.
  • the thawed cell sheet 40 and culture carrier substrate 10 may be washed with a cell washing solution immediately after the thawing process, if necessary.
  • the cell washing solution is not particularly limited, and may contain the components described in the above section (Culture Solution).
  • the temperature of the cell washing solution is not particularly limited.
  • the temperature of the cell washing solution is, for example, 0° C. or higher and 45° C. or lower.
  • the lower limit is more preferably 4° C. or higher, even more preferably 25° C. or higher, and particularly preferably 28° C. or higher.
  • the upper limit is more preferably 40° C. or lower, even more preferably 39° C. or lower, and particularly preferably 38° C. or lower.
  • the number of times the cultured cells are washed is not particularly limited, and may be one or more times (for example, two, three, four, five, etc.).
  • the culture surface 12 does not contain a temperature-responsive polymer, it is possible to prevent the cell sheet 40 from peeling off from the culture carrier substrate 10 in a low-temperature environment such as a cryopreservation process, and it is possible to obtain a culture carrier substrate 50 with a cell sheet that maintains the adhesiveness between the cell sheet and the film even after the cryopreservation process and the thawing process.
  • Examples of reference forms A to J are given below.
  • Examples of reference forms A to J are given below.
  • Examples of reference form A of the culture carrier base material include the following 1. to 13. 1.
  • a culture carrier base used for transporting a cultured cell sheet on a culture surface, The culture carrier substrate has a substrate thickness of 5 ⁇ m or more and 250 ⁇ m or less. 2.
  • the culture carrier substrate according to 1. The culture carrier substrate has a substrate thickness of more than 10 ⁇ m, and functions as a self-supporting membrane without being fixed to the inside of a culture vessel during the culture of the cell sheet. 3.
  • the culture carrier substrate according to 1. or 2. A culture carrier base material, the culture surface of which has been subjected to a hydrophilization treatment.
  • the culture carrier substrate according to 3. The hydrophilization treatment is a UV ozone treatment or a plasma treatment. 5.
  • the culture carrier substrate according to any one of 1 to 4 The culture carrier substrate is a polyether ether ketone film or a polyethylene terephthalate film. 6.
  • the culture carrier substrate according to any one of 1 to 5 A culture carrier substrate, wherein the culture surface does not contain a temperature responsive polymer. 7.
  • a culture carrier base material wherein the culture surface has a water contact angle of 70° or less. 12.
  • the culture carrier substrate according to any one of 1. to 11., A culture carrier base material used for cryopreserving the cell sheet formed on the culture surface.
  • the culture carrier base according to any one of 1. to 12., A culture carrier base material used for attaching the cell sheet formed on the culture surface to a transplantation site.
  • Examples of reference form B of the culture carrier base material with a cell sheet include the following 1. to 21. 1.
  • the present invention has a laminate of a culture carrier base material and a cell sheet, A culture carrier substrate with a cell sheet, in which the cell sheet covers at least 50% of the surface on the culture side of the culture carrier substrate. 2.
  • the cell sheet-attached culture carrier substrate according to 1. A culture carrier substrate with a cell sheet, the thickness of the culture carrier substrate being 5 ⁇ m or more and 250 ⁇ m or less. 3.
  • the cell sheet-attached culture carrier substrate according to 1 or 2 A culture carrier substrate with a cell sheet, the culture surface of which has been subjected to a hydrophilization treatment.
  • the cell sheet-attached culture carrier substrate according to 3. The hydrophilic treatment is a UV ozone treatment or a plasma treatment. 5.
  • a cell sheet-attached culture carrier substrate according to any one of 1 to 5 A culture carrier substrate with a cell sheet, wherein the culture surface does not contain a temperature-responsive polymer. 7. A cell sheet-attached culture carrier substrate according to any one of 1 to 6, A culture carrier substrate with a cell sheet, the culture carrier substrate having an area of 0.3 cm2 or more and 1000 cm2 or less. 8. A cell sheet-attached culture carrier substrate according to any one of 1 to 7, The culture carrier base material having a cell sheet thereon, the culture carrier base material including one or more resin layers made of a resin material. 9.
  • a cell sheet-attached culture carrier substrate according to any one of 1 to 8
  • a culture carrier substrate with a cell sheet in which, when the culture surface is measured with a laser microscope, there are three or less holes with a diameter of 1 ⁇ m to 100 ⁇ m and a depth of 0.5 ⁇ m to 100 ⁇ m in at least one observation area of 100 ⁇ m square.
  • a culture carrier substrate with a cell sheet according to any one of 1. to 9. A culture carrier substrate with a cell sheet, the porosity of which is 15% or less.
  • a culture carrier substrate with a cell sheet according to any one of 1. to 10. A culture carrier substrate with a cell sheet, wherein the water contact angle on the culture surface is 70° or less. 12.
  • a cell sheet-attached culture carrier substrate according to any one of 1. to 11., A culture carrier substrate with a cell sheet, which is used to transport a cell sheet cultured on a culture surface. 13. A cell sheet-attached culture carrier substrate according to any one of 1 to 12, A culture carrier substrate with a cell sheet, which is used for cryopreserving the cell sheet formed on the culture surface. 14. A cell sheet-attached culture carrier substrate according to any one of 1. to 13., A culture carrier substrate with a cell sheet, which is used to attach the cell sheet formed on the culture surface to a transplantation site. 15. A cell sheet-attached culture carrier substrate according to any one of 1. to 14., A culture carrier substrate with a cell sheet used in cell transplantation therapy. 16.
  • a cell sheet-attached culture carrier substrate according to any one of 1 to 15, A culture carrier substrate with a cell sheet, in which the cell transplantation therapy includes at least one of suppressing and preventing the onset and recurrence of symptoms associated with loss, functional disorder, and dysfunction of cells, tissues, and organs. 17.
  • a cell sheet-attached culture carrier substrate according to any one of 1 to 16
  • a cell sheet-attached culture carrier substrate according to any one of 1 to 17, A culture carrier substrate with a cell sheet for use in a transplantation method, comprising at least one of the steps of culturing the cell sheet, freezing and storing the cell sheet, thawing the frozen cell sheet, and attaching the cell sheet to a site to be transplanted. 19.
  • a transplant material comprising the cell sheet-attached culture carrier substrate according to any one of 1. to 18.
  • 20. The transplant material according to 19., A transplant material used to attach cell sheets to diseased areas. 21.
  • the above-mentioned culture carrier base material with a cell sheet may include any one of the culture carrier base materials 1. to 13. of Reference Form A.
  • Examples of reference forms C of the frozen product of the culture carrier substrate with a cell sheet include the following 1. to 8. 1.
  • the frozen product according to 1. Frozen items stored frozen at -196°C to -60°C. 3.
  • the frozen product according to 1. Frozen items stored frozen at -196°C to -135°C. 4.
  • the frozen product according to 1. A frozen product that is stored frozen at -134°C to -60°C. 5.
  • the frozen product according to 5. A frozen product, wherein the cryopreservation solution contains at least one of a culture solution component and a cryoprotectant. 7.
  • the preservation solution does not contain DMSO. 8.
  • the frozen product according to any one of 1. to 4., A frozen product, in which the culture carrier base material and the cell sheet are entirely covered with a cryopreservation solution and are in a frozen storage state.
  • the frozen product of the above-mentioned culture carrier substrate with a cell sheet may include any one of the culture carrier substrates 1. to 13. of Reference Form A, or any one of the culture carrier substrates 1. to 21. of Reference Form B.
  • D. Packaging Examples of reference form D of the package include the following 1. to 8. 1. A package comprising a culture carrier base material and a packaging material for packaging the culture carrier base material. 2.
  • a culture carrier substrate with a cell sheet the culture carrier substrate including a culture carrier substrate and a cell sheet formed on the culture surface of the carrier substrate;
  • a packaging body comprising: a packaging material for packaging the culture carrier base material with the cell sheet. 3.
  • a frozen culture carrier substrate with a cell sheet the frozen culture carrier substrate including a culture carrier substrate and a cell sheet formed on the culture surface of the carrier substrate;
  • a packaging body comprising: a packaging material for packaging the frozen product. 4.
  • the package according to any one of 1 to 3 A package comprising a culture container and/or a cryopreservation container inside the packaging material. 5.
  • the package according to any one of 1 to 4 A package in which the interior of the packaging material is sealed. 6.
  • the above-mentioned package may include any one of the culture carrier substrates 1. to 13. in Reference Form A, any one of the culture carrier substrates 1. to 21. in Reference Form B with a cell sheet, or any one of the frozen culture carrier substrates 1. to 8. in Reference Form C.
  • Reference Form A any one of the culture carrier substrates 1. to 13.
  • Reference Form B any one of the culture carrier substrates 1. to 21.
  • Reference Form B with a cell sheet
  • Reference Form C ⁇ E. Freezing and thawing method>
  • Examples of the reference form E of the cryopreservation method or the thawing method include the following 1. to 10. 1.
  • a cryopreservation method comprising a cooling step of cooling a culture carrier substrate with a cell sheet, the culture carrier substrate comprising a culture carrier substrate and a cell sheet formed on the surface of the culture carrier substrate, in a cryopreservation solution. 2.
  • the cryopreservation method according to 1. A cryopreservation method, wherein in the cooling step, the culture carrier substrate with the cell sheet is cooled in a cryopreservation solution using a non-flow-through cooling device. 3.
  • the cryopreservation method according to 1. or 2. The method for cryopreservation, wherein in the cooling step, the cooling rate at 0 to -5°C is 0.1°C/min or more and 15°C/min or less.
  • the cryopreservation method according to any one of 1. to 3., The cryopreservation method includes a cryopreservation step of preserving the cell sheet-attached culture carrier substrate at ⁇ 196 to ⁇ 60° C. after the cooling step. 5.
  • a cryopreservation method comprising obtaining a frozen product comprising the culture carrier substrate and the cell sheet by the cooling step. 6.
  • a thawing method comprising a thawing step of thawing the frozen product obtained by the cryopreservation method according to 5.
  • the defrosting method according to any one of 6. to 8.
  • the thawing method wherein in the thawing step, the environmental temperature during thawing is 0°C or higher and lower than 50°C.
  • the thawing method according to any one of 6. to 9.
  • the thawing method, wherein the thawing time in the thawing step is more than 10 seconds and not more than 60 minutes.
  • the above-mentioned cryopreservation method or freezing method may include any one of the culture carrier substrates 1. to 13. of Reference Form A, or any one of the culture carrier substrates 1. to 21.
  • the frozen product obtained by the cryopreservation method may include a frozen product of any one of the cell sheet-attached culture carrier substrates 1. to 8. of Reference Form C. Furthermore, the frozen material obtained by the cryopreservation method and/or the thawed material obtained by the thawing method can be used in the transplantation method described below.
  • a method for producing a culture carrier substrate with a cell sheet according to 1. comprising the steps of: A method for producing a culture carrier substrate with a cell sheet, wherein in the culture step, the cell sheet is cultured without fixing the culture carrier substrate to the inside of a culture vessel. 3.
  • the method for producing the culture carrier substrate with a cell sheet may include any one of the culture carrier substrates 1. to 13. of Reference Form A.
  • G. Transplantation Method The following 1. to 25. are examples of the reference form G of the transplantation method. 1.
  • a transplantation method comprising: a transplantation step of attaching a cell sheet to a transplantation site using a culture carrier substrate comprising a culture carrier substrate and a cell sheet formed on a culture surface of the culture carrier substrate, and then peeling off the culture carrier substrate from the cell sheet. 2.
  • the transplantation method according to 1. A transplantation method using the cell sheet-attached culture carrier substrate in the transplantation step, the culture carrier substrate having a laminate of the culture carrier substrate and the cell sheet, the cell sheet covering at least 50% of the surface on the culture side of the culture carrier substrate. 3.
  • the transplantation method according to 1. or 2. A transplantation method in which, in the transplantation step, the culture carrier substrate with the cell sheet is removed from the package and used, or the frozen culture carrier substrate with the cell sheet is removed from the package and the frozen substrate is thawed before use. 4.
  • the transplantation method according to any one of 1. to 3. A transplantation method comprising a culture step of culturing the cell sheet on the culture surface of the culture carrier substrate to obtain the culture carrier substrate with the cell sheet. 5.
  • the transplantation method according to 4. A transplantation method, wherein in the culturing step, the cell sheet is cultured in a state in which at least a portion of each of the culture surface and the side surface of the culture carrier base material is in contact with a culture medium. 6. The transplantation method according to 4. or 5., A transplantation method, wherein in the culturing step, the cell sheet is cultured in a state in which the culture carrier base is loaded and fixed by a weight and/or the culture carrier base is fixed in position by an instrument. 7. The transplantation method according to any one of 4.
  • a transplantation method wherein in the culturing step, the density of the cells to be cultured is 5 x 102 cells/cm2 or more and 1 x 109 cells/cm2 or less.
  • the transplantation method according to any one of 4. to 7. A transplantation method, wherein the culture carrier substrate has a substrate thickness of more than 10 ⁇ m, and in the culture step, the culture carrier substrate functions as a free-standing membrane without being fixed to the inside of a culture vessel.
  • the transplantation method according to any one of 1. to 8., The transplantation method includes a cooling and preservation step of cooling the culture carrier substrate with the cell sheet in a freezing storage solution to obtain a frozen product of the culture carrier substrate with the cell sheet. 10.
  • a transplantation method comprising a thawing step of thawing the frozen culture carrier substrate with the cell sheet.
  • the transplantation method according to any one of 1. to 10. The substrate thickness of the culture carrier substrate is 5 ⁇ m or more and 250 ⁇ m or less, The culture carrier substrate is a polyether ether ketone film or a polyethylene terephthalate film, A transplantation method, wherein the culture surface of the culture carrier base material has been subjected to a hydrophilization treatment.
  • the transplantation method according to any one of 1. to 11. The transplantation method, wherein the time from application to removal is 10 minutes or less in the transplantation step.
  • a transplantation method wherein the area of the cell sheet is 0.3 cm2 or more.
  • a transplantation method wherein after the transplantation step, a remaining rate of the cell sheet on the culture carrier base material after the detachment is 50% or less in terms of area ratio.
  • the transplantation method according to any one of 1. to 14. A transplantation method, wherein the thickness of the cell sheet is 0.001 mm or more and 2.0 mm or less.
  • the transplantation method wherein the culture carrier base material comprises one or more resin layers made of a resin material.
  • the transplantation method according to any one of 1. to 17. A transplantation method using the culture carrier base material, in which, when the culture surface is measured with a laser microscope, at least one observation area of 100 ⁇ m square has three or less holes with a diameter of 1 ⁇ m to 100 ⁇ m and a depth of 0.5 ⁇ m to 100 ⁇ m. 19.
  • 20. The transplantation method according to any one of 1. to 19. A transplantation method, wherein the culture surface of the culture carrier base has a water contact angle of 70° or less.
  • the transplantation method according to any one of 1. to 24., The transplantation method, wherein the disease includes at least one of spinal cord injury, knee joint cartilage damage, ischemic heart disease, age-related macular degeneration, corneal epithelial stem cell deficiency, aplastic anemia, severe limb ischemia, intractable skin ulcer, prevention of postoperative complications, and burns.
  • the present invention may comprise any one of the culture carrier substrates 1. to 13. in Reference Form A, any one of the culture carrier substrates 1. to 21. in Reference Form B with a cell sheet, or any one of the frozen culture carrier substrates 1. to 8. in Reference Form C.
  • the above transplantation method may include any one of the methods for producing a culture carrier substrate with a cell sheet described in 1. to 3.
  • Reference Form H includes a treatment method including at least one of suppressing and preventing the onset and recurrence of symptoms associated with loss, functional disorder, and dysfunction of cells, tissues, and organs, using at least one of a culture carrier substrate of any one of 1. to 13. in Reference Form A, a culture carrier substrate with a cell sheet of any one of 1. to 21 in Reference Form B, and a frozen product of a culture carrier substrate with a cell sheet of any one of 1. to 8. in Reference Form C.
  • This treatment method may include at least one of the diseases described above as such associated symptoms.
  • Reference Form I also includes use of at least one of the culture carrier substrates 1.
  • Reference Form A the culture carrier substrates with a cell sheet 1. to 21 of Reference Form B, and the frozen culture carrier substrates with a cell sheet 1. to 8.
  • Reference Form C for treatment including at least one of suppression and prevention of onset and recurrence of symptoms associated with loss, functional disorder, and dysfunction of cells, tissues, and organs. This use may include at least one of the diseases mentioned above as such associated symptoms.
  • Reference Form J includes use of at least one of the culture carrier substrates 1. to 13. of Reference Form A, the culture carrier substrates with a cell sheet 1. to 21 of Reference Form B, and the frozen culture carrier substrates with a cell sheet 1. to 8.
  • Reference Form C in the manufacture of a therapeutic agent for treating, including at least one of suppressing and preventing, the onset and recurrence of symptoms associated with loss, functional disorder, and dysfunction of cells, tissues, and organs.
  • This use may include at least one of the diseases mentioned above as such associated symptoms.
  • Example 1 ⁇ Production of culture carrier substrate> Plasma treatment was performed on the culture surface (surface) of a PEEK film (Shin-Etsu Polymer Co., Ltd., polyether ether ketone film, Shin-Etsu Sepla Film (registered trademark) low crystal type, 12 ⁇ m thick). The surface roughness after plasma treatment was rougher than before plasma treatment, and the Ra was 0.6 nm. The Ra was measured as follows. An AFM (Shimadzu Corporation SPM-9700) was used, and a silicon single crystal probe with a small tip diameter (radius of curvature of about 10 nm) was used as the probe. The surface was observed in a range of 1 ⁇ m x 1 ⁇ m.
  • AFM Shiadzu Corporation SPM-9700
  • the Ra was calculated using analysis software attached to the device, and after smoothing treatment in the X and Y directions, surface roughness analysis was performed in a range of 100 nm x 100 nm avoiding foreign matter and surface scratches.
  • the arithmetic mean roughness Ra is the average value of the distance from the reference line within the reference length.
  • the PEEK film had a porosity of 5% or less, and when the culture surface was measured with a laser microscope, it was a solid film with no holes with a diameter of 1 ⁇ m to 100 ⁇ m and a depth of 0.5 ⁇ m to 100 ⁇ m within a 100 ⁇ m square area.
  • the porosity was calculated from " ⁇ 1 - (actual density / theoretical density) ⁇ x 100". Thereafter, the obtained surface-treated film was cut into a size of ⁇ 33.5 mm to obtain a disk-shaped culture carrier base material.
  • the culture carrier substrates prepared in the above ⁇ Preparation of culture carrier substrate> were washed with 70% ethanol, phosphate buffer, and culture medium in that order, and then placed on the flat bottoms of the holes of a multi-well cell culture plate (6 holes). At this time, the culture surface of the culture carrier substrate was placed facing the opening of the well plate, that is, the back surface of the culture carrier substrate was placed in contact with the flat bottoms of the holes of the well plate. However, the culture carrier substrate was not fixed to the inside of the well plate (culture vessel). Cryopreserved human fibroblasts (derived from human oral tissue) were thawed at 37°C and washed with medium.
  • 5x105 cells were suspended in 5% serum-containing medium, seeded at 2.5x105 cells per dish (60.1 cm2 ), and cultured for 3 days.
  • the cultured cells were collected, suspended in 5% serum-containing medium, seeded at 2.5x105 cells per flask (225 cm2 ), passaged, and cultured for 4 days.
  • the cultured cells were collected, suspended in a 2% serum-containing medium, and seeded at a seeding density of 55.8 x 104 cells/ cm2 into each well of a cell culture multi-well plate in which a culture carrier substrate had already been installed.
  • the cells were then incubated at 37°C and 5% CO2 for 1 day to produce a cell sheet on the culture surface of the culture carrier substrate.
  • the culture carrier substrate with the cell sheet was removed from the multi-plate.
  • the removed culture carrier substrate with the cell sheet was transported onto a piece of pork (a transplantation site) that imitated a cell tissue, which was prepared in a separate location. After the surface of the cell sheet was attached to the surface of the pork piece, the culture carrier substrate was peeled off from the cell sheet. Since the substrate was not cooled in particular between application and removal, the substrate temperature was maintained at 30° C. or higher.
  • Example 2 In the above ⁇ Production of culture carrier substrate>, ⁇ Production of cell sheet> and ⁇ Transplantation> were carried out in the same manner as in Example 1, except that a 25 ⁇ m thick PET film (polyethylene terephthalate film, Lumirror (registered trademark), manufactured by Toray Industries, Inc.) was used instead of the polyether ether ketone film.
  • PET film polyethylene terephthalate film, Lumirror (registered trademark), manufactured by Toray Industries, Inc.
  • Example 3 In the above ⁇ Production of culture carrier substrate>, the cutting size of the surface-treated film was changed from ⁇ 33.5 mm to ⁇ 14.0 mm, and in the above ⁇ Production of cell sheet>, a 24-hole flat-bottom cell culture multiwell plate was used for seeding, and the seeding density was changed to 27.9 ⁇ 104 cells/cm. Except for this, ⁇ Production of cell sheet> and ⁇ Transplantation> were carried out in the same manner as in Example 1.
  • Example 1 ⁇ Production of cell sheet> and ⁇ Transplantation> were carried out in the same manner as in Example 1, except that the culture carrier substrate produced in the above ⁇ Production of culture carrier substrate> was not used, and in ⁇ Production of cell sheet>, a cell sheet was produced on the flat bottom inside the holes of a multi-well plate for adherent cells, and in ⁇ Transplantation>, the cell sheet was peeled off from the flat bottom and attached to the surface of a piece of pork.
  • a culture carrier substrate with a cell sheet was obtained in which the cell sheet covered 100% or more of the substrate culture surface.
  • the culture carrier substrate with the cell sheet was easily removed because it was not fixed to the multi-plate. Note that, in the case of the PET film of Example 2, the substrate was peeled off by slightly pressing the cell sheet with tweezers, but in the case of the PEEK films of Examples 1 and 3, the substrate was slid without pressing the cell sheet, and it was found that the films were easy to handle.
  • the culture carrier substrate was easily removed from the cell sheet.
  • the cell sheet and pork meat quickly adhered to each other, so the process from attachment to removal took less than one minute. In other words, the operation during transplantation was simplified, making it possible to shorten the operation time. Furthermore, after the ⁇ transplantation> step, it was not necessary to culture the cell sheet on the pork meat.
  • the results of Examples 1 to 3 confirmed that by using a plasma-treated PEEK film or a plasma-treated PET film as a culture carrier substrate, both cell sheet culture and transplantation can be performed.
  • the amount of the cell sheet remaining on the culture surface of the culture carrier substrate was 1% or less in terms of area ratio. This makes it possible to reduce the amount of cell sheet remaining during the transplantation process. In addition, when detaching the culture carrier substrate from the cell sheet, it was not necessary to apply dispase treatment to the culture surface before culture.
  • Comparative Example 1 in ⁇ Production of cell sheet>, a cell sheet could be produced in a multi-well plate for adherent cells.
  • ⁇ Transplantation> when removing the cell sheet from the multi-well plate for adherent cells, it was difficult to peel the cell sheet off from the flat bottom of the multi-well plate for adherent cells so as not to damage the cell sheet with tweezers or the like. Even if the cell sheet could be peeled off, it was difficult to grasp the cell sheet and therefore difficult to attach the cell sheet.
  • Comparative Examples 2 and 3 a cell sheet could not be produced, and therefore the transplantation procedure was not carried out.
  • Example 4 ⁇ Production of cell sheets> A culture carrier substrate obtained in ⁇ Production of culture carrier substrate> of Example 1 was used, in which the cutting size of the surface-treated film was changed from ⁇ 33.5 mm to ⁇ 14.0 mm, and a cell sheet (cell sheet with culture carrier substrate) was produced on the culture surface of the culture carrier substrate in the same manner as in ⁇ Production of cell sheet> of Example 1, except that a 24 -hole flat- bottom cell culture multiwell plate was used during seeding, and the seeding density was changed to 27.9 x 104 cells/cm2.
  • the cell activity rate before freezing was measured according to the following procedure.
  • the cell culture multiwell plate was placed on ice, and the cell sheet with the culture carrier substrate was washed with phosphate buffer, and then a cryoprotectant (STEMCELL-BANKER GMP grade, manufactured by Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.) was added to the plate at 0.3 mL/well. Thereafter, the cell culture multiwell plate was packed in a zippered plastic bag, and the package was placed in a non-throughflow cooling device (3D Freezer (registered trademark), KSS-40BLW-2400V, manufactured by Kogasan Co., Ltd.) cooled to -35°C, and held for 30 minutes.
  • a non-throughflow cooling device (3D Freezer (registered trademark), KSS-40BLW-2400V, manufactured by Kogasan Co., Ltd.
  • the cooling rate from 0 to -5°C was 3.4°C/min. Thereafter, the cooled package was quickly placed in a freezer (RDE50086FD ultra-low temperature freezer, manufactured by Thermoscientific Corporation) at -80°C and held there for 1 hour.
  • the temperature of the cell sheet (cell sheet with culture carrier substrate) stored in a freezer at 80°C was measured using a K thermocouple and found to be -70°C.
  • the cell activity before freezing was C0 and the cell activity after freezing was C1
  • the "variation rate of cell activity before and after freezing" calculated by (C1/C0) x 100 was 89%.
  • the culture supernatant was collected, and the vascular endothelial growth factor (VEGF) and hepatocyte growth factor (HGF) were measured on the day after the supernatant was frozen at -80°C. It was found that the VEGF in the supernatant was 1451 pg and the HGF was 4608 pg.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • HGF hepatocyte growth factor
  • the thawing time was the time required to thaw a frozen product that had been cryoprotectant added and stored, and was measured from the time it was exposed to the thawing environment until the frozen product became completely liquid.
  • Cell activity was measured using a viable cell count measuring reagent (Cell Count Reagent SF, manufactured by Nacalai Tesque) and a plate reader (iMark, manufactured by BIO-RAD).
  • the supernatant of each well of the cell culture multi-well plate containing the cultured cell sheet was aspirated, and the test solution was added at 0.5 mL/well, and incubated for 1 hour in an environment of 37 ° C and 5% CO 2.
  • Cell activity [Abs.] ⁇ absorbance of measurement sample [absorbance (450 nm) - absorbance of measurement sample (630 nm)] ⁇ - ⁇ absorbance of blank [absorbance (450 nm) - absorbance of blank (630 nm)] ⁇ The test solution was used as a blank.
  • VEGF and HGF were measured as cytokines involved in angiogenesis. These cytokines were measured using VEGF, Human, ELISA Kit, Quantikine (96 well) (R&D Systems, DVE00), HGF, Human, ELISA Kit, Quantikine (96 well) (R&D Systems, DHG00B) and a plate reader (iMark, BIO-RAD). The kits were used according to the instructions for use. The test samples were thawed and cultured for 24 hours, and the supernatant was collected and frozen for storage. The test samples were thawed at the time of measurement on the day after freezing.
  • test samples were also diluted 2 to 4 times with the diluent provided with the kit and measured.
  • the calibration curve was made using the standard provided with each kit.
  • the absorbance of each sample and the standard for the calibration curve was calculated from the following formula, and the obtained absorbance was applied to the calibration curve to calculate the concentrations of VEGF and HGF.
  • Absorbance of sample and calibration standard [Abs.] absorbance (450 nm) - absorbance (570 nm)
  • Example 5 to 11 Except for changing the freezing period in the above ⁇ Cryopreservation of cell sheet> to the value shown in Table 2, ⁇ Production of cell sheet>, ⁇ Cryopreservation of cell sheet>, ⁇ Thawing of cell sheet>, and ⁇ Transplantation after thawing> were carried out in the same manner as in Example 4.
  • Comparative Example 4 ⁇ Production of cell sheets> was carried out in the same manner as in Example 4, except that no culture carrier substrate was used and the cell culture multi-well plate was changed to a petri dish (UpCell (registered trademark), manufactured by CellSeed Inc.).
  • UpCell registered trademark
  • Comparative Example 5 In Comparative Example 5, the ⁇ Production of cell sheets>, ⁇ Cryopreservation of cell sheets>, and ⁇ Thawing of cell sheets> were carried out in the same manner as in Example 4, except that no culture carrier substrate was used and the cell culture multiwell plate was changed to a multiwell plate for adherent cells (24 wells).
  • Comparative Example 4 the cell sheet could not be cryopreserved because it detached from the petri dish when the petri dish was cooled, and therefore the measurement of the cell activity rate after freezing and the transplantation operation after thawing were not performed.
  • Comparative Example 5 the cell sheet could be cryopreserved in a state of being in close contact with the multiwell plate, but the results showed that the rate of change in cell activity rate before and after freezing decreased.
  • the cell sheet could be frozen while still attached to the culture carrier substrate, and the change in cell activity rate before and after freezing and at least one of VEGF and HGF were higher than in Comparative Example 5. Furthermore, even when transplanted after thawing, the culture carrier substrate could be easily peeled off from the cell sheet. Since the cell sheet and pork immediately adhered to each other, the process from attachment to peeling was performed within 1 minute, and there was no need to culture the cell sheet on the pork.
  • Examples 4 to 11 confirmed that by using a plasma-treated PEEK film as a culture carrier substrate, it is possible to freeze a cell sheet and transplant it after thawing, and that the thawed cell sheet can maintain a high cell activity rate even if it is frozen for a long period of time.
  • Example 12 to 23 ⁇ Production of cell sheet>, ⁇ Cryopreservation of cell sheet>, ⁇ Thawing of cell sheet>, and ⁇ Transplantation after thawing> were carried out in the same manner as in Example 4, except that the freezing period in the above ⁇ Cryopreservation of cell sheet> was changed to the value shown in Table 3, Bambanker (registered trademark) hRM (CG Lymphotec) was used as the cryoprotectant, and a freezer at -150°C was used. The thawing time in this case was 18 minutes. After thawing, the appearance of the cell sheet was good.
  • Bambanker registered trademark
  • hRM CG Lymphotec
  • the temperature of the cell sheet (cell sheet with culture carrier substrate) stored in a freezer at -150°C was measured using a K thermocouple and found to be -140°C. For each example, evaluation was performed regarding cryopreservation and transplantation after thawing. The results are shown in Table 3.
  • the cell sheet could be frozen while still attached to the culture carrier substrate, and the change in cell activity rate before and after freezing, as well as VEGF and HGF, were all higher than in Comparative Example 5. Furthermore, even when transplanted after thawing, the culture carrier substrate could be easily peeled off from the cell sheet. Furthermore, since the cell sheet and pork immediately adhered to each other, the process from attachment to peeling was completed within one minute, and there was no need to culture the cell sheet on the pork.
  • Examples 24 to 26 Except for changing the freezing period in the above ⁇ Cryopreservation of cell sheet> to the value shown in Table 4, ⁇ Production of cell sheet>, ⁇ Cryopreservation of cell sheet>, ⁇ Thawing of cell sheet>, and ⁇ Transplantation after thawing> were carried out in the same manner as in Example 12. However, the frozen state of each example was configured as shown in FIG. 3(a) to FIG. 3(c). In Figure 3(a), the culture carrier substrate 10 is positioned so that it faces the bottom of the culture vessel 20, in Figure 3(b), the cell sheet 40 is positioned so that it faces the bottom of the culture vessel 20, and in Figure 3(c), the cell sheet 40 is sandwiched between two culture carrier substrates 10. In this state, ⁇ freezing and preserving the cell sheet> and ⁇ thawing the cell sheet> were performed. For each example, cryopreservation and transplantation after thawing were evaluated. The results are shown in Table 4.
  • the cell sheet could be frozen while still attached to the culture carrier substrate, and the change in cell activity rate before and after freezing was higher than in Comparative Example 5. Furthermore, even when transplanted after thawing, the cell sheet could be easily peeled off from the culture carrier substrate. Since the cell sheet and pork meat quickly adhered to each other, the process from attachment to peeling was completed within one minute, and there was no need to culture the cell sheet on the pork meat. Furthermore, since the PEEK film has low linear expansion properties, it was found that it can be used as a culture carrier base material that is also useful for freezing treatment.
  • Example 27 In the method shown in ⁇ Thawing of cell sheet> of Example 12, ⁇ Production of cell sheet>, ⁇ Cryopreservation of cell sheet>, ⁇ Thawing of cell sheet>, and ⁇ Transplantation after thawing> were carried out in the same manner as in Example 12, except that thawing at room temperature in a safety cabinet was performed by placing the cell culture multiwell plate on the heat sink of a defroster (manufactured by DEC). The set temperature of the defroster indicates the temperature of the heat sink, and was set to 37°C for thawing. The thawing time in this case was 3 minutes.
  • Example 29 Except for setting the defroster temperature in Example 27 to 4° C., the same procedures as in Example 26 were carried out for ⁇ Production of cell sheet>, ⁇ Cryopreservation of cell sheet>, ⁇ Thawing of cell sheet>, and ⁇ Transplantation after thawing>.
  • the thawing time was 8 minutes. After thawing, the appearance of the cell sheet was good.
  • Example 30 In the method shown in ⁇ Thawing of cell sheet> of Example 12, ⁇ Production of cell sheet>, ⁇ Cryopreservation of cell sheet>, ⁇ Thawing of cell sheet>, and ⁇ Transplantation after thawing> were carried out in the same manner as in Example 26, except that thawing at room temperature in a safety cabinet was changed to thawing in a refrigerator set at 4° C. In this case, the thawing time was 37 minutes. After thawing, the appearance of the cell sheet was good. The appearance of the cell sheets, measurement of cell activity rate, and transplantation after thawing were evaluated for Examples 27 to 30. The results are shown in Table 5. For reference, Table 5 also shows the results of Examples 4 and 12.
  • Examples 4, 12, and 27-30 there were no problems with the appearance of the cell sheets. Furthermore, Examples 4, 12, and 27-30 showed a higher "rate of change in cell activity before and after freezing” than Comparative Example 5. In other words, it can be said that a high cell survival rate was maintained after freezing. Among these, it was found that Examples 4, 12, and 27-29 showed a higher "rate of change in cell activity before and after freezing” than Example 30, which had a relatively long freezing time. Furthermore, the thawed products of all Examples were able to be transplanted well after thawing.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)

Abstract

本発明の移植方法は、培養キャリア基材の培養面に細胞シートを培養する、培養工程と、培養キャリア基材の培養面に形成された細胞シートを被移植部位に貼り付けた後、細胞シートから培養キャリア基材を剥離する、移植工程と、を含むものである。

Description

移植方法、培養キャリア基材、包装体、細胞シート付き培養キャリア基材、細胞シート付き培養キャリア基材の製造方法、凍結保存方法、および細胞シート付き培養キャリア基材の凍結物
　本発明は、移植方法、培養キャリア基材、包装体、細胞シート付き培養キャリア基材、細胞シート付き培養キャリア基材の製造方法、凍結保存方法、および細胞シート付き培養キャリア基材の凍結物に関する。
　これまで移植技術の技術要素を構成する、細胞シートの「培養」と「搬送」について様々な開発がなされてきた。この種の技術として、例えば、特許文献１に記載の技術が知られている。
　特許文献１の背景技術には、細胞シートを、目的とする患部に移植するには、温度応答性材料の上で培養した細胞シートを温度変化により剥離させ、得られた細胞シートに別途用意したシートを被せて該シートに細胞シートを付着させた状態で容器から取り出し、患部まで搬送し、その患部に移植（貼付）するといった一連の操作が必要になることが記載されている。
　これに対して、特許文献１の請求項１や段落０００７等には、温度応答性高分子層を有する細胞培養容器で培養した細胞シートを搬送させる方法として、細胞培養容器の底部を、細胞シートが付着した状態のまま剥離して、剥離した底部と共に底部に付着した細胞シートを搬送させる技術が記載されている。
特開２０１６－０１３１１１号公報
　しかしながら、本発明者が検討した結果、特許文献１の技術を活用した移植方法において、温度応答性高分子層から細胞シートを剥離する際に細胞シートと基材との密着状態を低温処理により解除する必要があること、または、低温処理により基材と細胞シートとの密着性が低下することから、温度応答性高分子層を有する細胞培養容器で培養した細胞シートを、温度応答性高分子層を有する細胞培養容器に接着させた状態での凍結保存が難しいこと等が判明した。
　本発明者は、鋭意検討した結果、個別に検討されてきた細胞シートの「培養」と「搬送」とを統合した新しいコンセプトに着想して、移植方法および培養キャリア基材等を具体化し、本発明を完成するに至った。
　本発明の一態様によれば、以下の移植方法、培養キャリア基材、包装体、細胞シート付き培養キャリア基材、細胞シート付き培養キャリア基材の製造方法、凍結保存方法、および細胞シート付き培養キャリア基材の凍結物が提供される。
１．　培養キャリア基材の培養面に細胞シートを培養する、培養工程と、
　前記培養キャリア基材の前記培養面に形成された前記細胞シートを被移植部位に貼り付けた後、前記細胞シートから前記培養キャリア基材を剥離する、移植工程と、を含む、移植方法。
２．　１．に記載の移植方法であって、
　前記培養キャリア基材の基材厚みが５μｍ以上２５０μｍ以下であり、
　前記培養キャリア基材がポリエーテルエーテルケトンフィルムまたはポリエチレンテレフタレートフィルムであり、
　前記培養キャリア基材の前記培養面は親水化処理がなされている、移植方法。
３．　１．または２．に記載の移植方法であって、
　前記培養キャリア基材の基材厚みが１０μｍ超であり、前記培養工程において、前記培養キャリア基材が培養容器の内部に固着されずに自立膜として機能する、移植方法。
４．　１．～３．のいずれか一つに記載の移植方法であって、
　前記移植工程において、貼り付けた後から剥離するまでの時間が、１０分以下である、移植方法。
５．　１．～４．のいずれか一つに記載の移植方法であって、
　前記培養工程により得られた前記細胞シートの面積が、０．３ｃｍ２以上である、移植方法。
６．　培養面に培養された細胞シートを搬送するために用いられる、培養キャリア基材であって、
　当該培養キャリア基材の基材厚みが５μｍ以上２５０μｍ以下である、培養キャリア基材。
７．　６．に記載の培養キャリア基材であって、
　前記培養キャリア基材の基材厚みが１０μｍ超であり、前記細胞シートの培養中に培養容器の内部に固着されずに自立膜として機能する、培養キャリア基材。
８．　６．または７．に記載の培養キャリア基材であって、
　前記培養面が、親水化処理がなされている、培養キャリア基材。
９．　８．に記載の培養キャリア基材であって、
　前記親水化処理は、プラズマ処理された、培養キャリア基材。
１０．　６．～９．のいずれか一つに記載の培養キャリア基材であって、
　当該培養キャリア基材がポリエーテルエーテルケトンフィルムまたはポリエチレンテレフタレートフィルムである、培養キャリア基材。
１１．　６．～１０．のいずれか一つに記載の培養キャリア基材であって、
　前記培養面が、温度応答性ポリマーを含まない、培養キャリア基材。
１２．　６．～１１．のいずれか一つに記載の培養キャリア基材を包装材料で包装した包装体。
１３．　６．～１１．のいずれか一つに記載の培養キャリア基材と、細胞シートとの積層体を有しており、
　前記細胞シートが、前記培養キャリア基材の前記培養面側における表面の少なくとも５０％を被覆した状態である、細胞シート付き培養キャリア基材。
１４．　１３．に記載の細胞シート付き培養キャリア基材であって、
　前記細胞シートの面積が、０．３ｃｍ２以上である、細胞シート付き培養キャリア基材。
１５．　培養容器の内部に、複数の細胞、培地、および６．～１１．のいずれか一つに記載の培養キャリア基材を導入して、前記培養キャリア基材の培養面に細胞シートを培養する、培養工程と、
　前記培養容器から、前記細胞シート付きの前記培養キャリア基材を取り出す、取出工程と、を含む、細胞シート付き培養キャリア基材の製造方法。
１６．　１５．に記載の細胞シート付き培養キャリア基材の製造方法であって、
　前記培養工程において、前記培養キャリア基材を培養容器の内部に固着せずに、前記細胞シートを培養する、細胞シート付き培養キャリア基材の製造方法。
１７．　１５．または１６．に記載の細胞シート付き培養キャリア基材の製造方法であって、
　前記取出工程において、前記培養容器から前記培養キャリア基材を物理的手段により分離する操作が不要である、細胞シート付き培養キャリア基材の製造方法。
１８．　培養キャリア基材と前記培養キャリア基材の表面に形成された細胞シートとを含む細胞シート付き培養キャリア基材を、凍結保存液中で冷却する冷却工程を含む、凍結保存方法。
１９．　１８．に記載の凍結保存方法であって、
　前記冷却工程において、前記細胞シート付き培養キャリア基材を、凍結保存液中で非貫流式の冷却装置を用いて冷却する、凍結保存方法。
２０．　１８．または１９．に記載の凍結保存方法であって、
　前記冷却工程において、０～－５℃における冷却速度が、０．１℃／分以上１５℃／分以下である、凍結保存方法。
２１．　１８．～２０．のいずれか一つに記載の凍結保存方法であって、
　前記冷却工程の後、－１９６～－６０℃にて前記細胞シート付き培養キャリア基材を保存する、凍結保存工程を含む、凍結保存方法。
２２．　培養キャリア基材と、
　前記培養キャリア基材の表面に形成された細胞シート、を含み
　前記培養キャリア基材および前記細胞シートが凍結保存状態である、細胞シート付き培養キャリア基材の凍結物。
２３．　２２．に記載の細胞シート付き培養キャリア基材の凍結物であって、
　－１９６℃～－６０℃で凍結保存状態である、細胞シート付き培養キャリア基材の凍結物。
２４．　２２．に記載の細胞シート付き培養キャリア基材の凍結物であって、
　－１９６℃～－１３５℃で凍結保存状態である、細胞シート付き培養キャリア基材の凍結物。
２５．　２２．に記載の細胞シート付き培養キャリア基材の凍結物であって、
　－１３４℃～－６０℃で凍結保存状態である、細胞シート付き培養キャリア基材の凍結物。
２６．　２２．～２５．のいずれか一つに記載の凍結物を包装材料で包装した包装体。
　本発明によれば、細胞シートの培養と搬送との両方が可能な移植方法、培養キャリア基材、包装体、細胞シート付き培養キャリア基材、細胞シート付き培養キャリア基材の製造方法、凍結保存方法、および細胞シート付き培養キャリア基材の凍結物が提供される。
本実施形態の移植方法の工程の一例を模式的に示す工程断面図である。 本実施形態の細胞シート付きキャリア基材の構成の一例を模式的に示す断面図である。 本実施形態の凍結方法の変形例を模式的に示す工程断面図である。
　以下、本発明の実施の形態について、図面を用いて説明する。なお、すべての図面において、同様な構成要素には同様の符号を付し、適宜説明を省略する。また、図は概略図であり、実際の寸法比率とは一致していない。
＜移植方法＞
　本実施形態の移植方法は、培養キャリア基材の培養面に細胞シートを培養する、培養工程と、培養キャリア基材の培養面に形成された細胞シートを被移植部位に貼り付けた後、細胞シートから培養キャリア基材を剥離する、移植工程と、を含む。
　被移植部位は、例えば、哺乳類、鳥類、両生類、魚類、昆虫、植物、微生物などの移植対象者における体の少なくとも一部が挙げられる。哺乳類及び鳥類の具体例としては、例えば、ヒト、サル、チンパンジー、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラット、ニワトリなどが挙げられる。ただし、被移植部位は、ヒトの身体の内部および外部を除外してもよい。移植対象者以外の被移植部位として、例えば、他の細胞シート、医療器具などの器具、移植対象者から分離された状態の組織単独または器官単独などが挙げられる。組織単独または器官単独の例としては、皮膚、口腔内組織、食道、気管、気管支、肺、肺葉、胃、十二指腸、すい臓、脾臓、小腸、大腸、筋組織、骨等が挙げられる（ただし、移植対象者から採取したものと同一人に治療のために戻すものを除く）。
　本実施形態の移植方法について、図１を用いて具体的に説明する。
　図１は、移植方法の工程の一例を模式的に示す工程断面図である。図１中、（ａ）は細胞播種、（ｂ）は細胞培養、（ｃ）は凍結保存・解凍、（ｄ）は取出、（ｅ）は貼付、の各プロセスを示す。（ｃ）の凍結保存・解凍は任意のプロセスである。ここでは（ｃ）を実施しない移植方法を説明し、（ｃ）の詳細は後述の＜凍結保存方法＞で説明する。
　培養工程は、図１（ａ）に示される細胞播種工程、および図１（ｂ）に示される細胞培養工程を含んでもよい。図２には、培養工程で得られた細胞シート付き培養キャリア基材５０の一例の断面模式図を示す。
　図１（ａ）の細胞播種工程では、培養容器２０中に設置した培養キャリア基材１０に、細胞を含む培養液３０を接触させる。細胞は、培養液３０に予め懸濁しておいてもよいが、細胞を含む細胞懸濁液を培養液３０に加えてもよい。
　培養キャリア基材１０は、培養工程中、その一部または全体が培養液３０中に浸漬した状態としてもよい。具体的には、細胞播種工程では、培養キャリア基材１０の表面の一部に培養液３０を滴下してもよいが、培養キャリア基材１０の培養面１２および側面のそれぞれの少なくとも一部が培養液３０に接触した状態となるように、培養キャリア基材１０を培養液３０中に浸漬してもよい。後者の浸漬方法の方が、前者の滴下方法と比べて、次の細胞培養工程中の培養環境を安定的に維持することが可能になる、および／または、培養キャリア基材１０の培養面１２の大面積化を図ることが可能になる。
　図１（ｂ）の細胞培養工程では、適当な培養条件下で培養を行い、培養キャリア基材１０の培養面１２上に細胞シート４０を形成する。培養時には蓋（図示せず）をして培養してもよい。
　細胞培養工程において、培養キャリア基材１０を培養容器２０の内部に固着せずに、細胞シート４０を培養することができる。このとき、培養キャリア基材１０は、細胞培養時に自立膜として機能する。培養キャリア基材１０が固着されていないため、取出工程において、培養容器２０からの細胞シート付き培養キャリア基材５０を簡便に取り出すことが可能になる。また、取出時における細胞シート４０の破損も抑制できる。ここで、固着とは、取出時に物理的手段によって引き剥がし操作が必要な程度に密着した状態を言う。自重以外の荷重で押さえつけて動かないようにする固定手段は、ここでいう「固着」手段には含まれない。
　本明細書において、物理的手段とは、例えば、フィルムを把持しながら引き剥がす方法やナイフ等で傷つけて剥がす方法等が挙げられる。
　なお、培養キャリア基材１０を固着せずに、培養液３０中に浸漬する方法の一つとして、培養キャリア基材１０の比重を培養液３０よりも大きくする方法、培養キャリア基材１０の培養面１２の一部に対して重りにより荷重固定する方法、あるいは、培養キャリア基材１０を器具により位置固定する方法等の一つ又は二つ以上を採用してもよい。すなわち、上記細胞培養工程中、荷重固定および／または位置固定により、培養キャリア基材１０を培養液３０中に浸漬した状態で細胞培養することができる。
　移植工程は、図１（ｄ）に示される細胞シート付き培養キャリア基材５０の取出工程、および図１（ｅ）に示される細胞シート４０の貼付工程を含んでもよい。
　図１（ｄ）の取出工程では、培養容器２０から、細胞シート付き培養キャリア基材５０を取り出し、例えば、被移植部位等の所望の場所まで搬送させる。
　本実施形態の取出工程では、取出方法はとくに限定されないが、例えば、細胞シート付き培養キャリア基材５０を構成する培養キャリア基材１０をつまんで取り出す方法、培養キャリア基材１０を吸引ノズルに接触させて吸引しながら持ち上げる方法、培養キャリア基材１０を糸掛けして引き上げる方法等が挙げられる。
　図１（ｅ）の貼り付け工程では、細胞シート付き培養キャリア基材５０の細胞シート４０を被移植部位７０に貼り付けた後、細胞シート４０から培養キャリア基材１０を剥離する。
　本実施形態では、貼り付け工程において、貼り付けから剥離までの時間を短時間化することが可能である。短時間化することで、異物として、長時間さらされないので、基材フィルムに対して免疫的に拒絶反応が起こるリスク低減、細胞が死ぬ可能性低減、操作が簡便になる。開胸して体内に細胞シートを貼り付けるような手術にも使用できる。
　貼り付けから剥離までの時間は、好ましくは１０分以下、より好ましくは５分以下、さらに好ましくは３分以下、一層好ましくは１分以下である。
　詳細なメカニズムは定かではないが、培養キャリア基材１０の培養面１２と細胞シート４０の表面との密着が適度な強さであるため、細胞シート４０が被移植部位７０に対して生物的に結合する前でも、細胞シート４０から培養キャリア基材１０を剥離可能であると推察される。
　また、本実施形態では、剥離後、培養キャリア基材１０の上に細胞シート４０が残存することを抑制できる。剥離後の培養キャリア基材１０上の細胞シート４０の残存率は、面積比換算で、好ましくは５０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは１０％以下である。
　細胞移植療法は、細胞、組織、臓器の欠損及び機能障害、機能不全に関連する症状の発症及び再発を抑制、防止するものである。細胞移植療法の対象疾患としては、例えば、脊髄損傷、膝関節軟骨損傷、虚血性心疾患、加齢黄斑変性、角膜上皮幹細胞疲弊症、再生不良性貧血、重症下肢虚血、難治性皮膚潰瘍、術後合併症予防（例えば、各種臓器の縫合不全、気管支断端瘻、膵液瘻、胆汁漏）、熱傷などが挙げられる。
　また、細胞移植療法に用いる細胞は、自己由来細胞、同種非自己由来細胞、異種由来細胞であってもよい。好ましい細胞としては、臨床応用及び安全性の観点から自己由来細胞であり、臨床応用及び生産性の観点から、非自己由来細胞である。
　以下、移植方法の各工程における要素を説明する。
（培養容器）
　培養容器２０は、培養液中で細胞を培養するための容器であり、培養する細胞の種類及び用途に適したものであれば、特に制限されるものではない。
　培養容器２０としては、例えば、ディッシュ、ペトリディッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、フラスコ、組織培養用フラスコ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトルなどが挙げられる。
　また培養容器２０は、表面処理された細胞接着性を付与された培養容器（接着細胞用）でも、表面処理されていない培養容器（浮遊細胞用）でもよい。培養容器２０の表面処理の有無は、培養キャリア基材１０には影響しない。以降、特に明記しない場合は、どちらでも使用ができる。
　培養容器２０の素材としては、培養液３０を透過させないものであれば、特に制限されるものではないが、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンテレフタレート、ポリアセタール、ポリ塩化ビニル、アクリル樹脂、ポリカーボネート、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエーテルスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリイミド、ポリアミド、セルロース、シリコ－ン、ナイロン６，６、ガラス、ステンレスやアルミニウムなどの金属などが挙げられる。
　培養容器２０の面積は、特に制限されるものではないが、市販されている培養容器の面積であれば問題なく培養を行える。例えば、０．３ｃｍ２以上１０００ｃｍ２以下である。下限値としては、より好ましくは０．３５ｃｍ２以上、更に好ましくは１．０ｃｍ２以上、特に好ましくは１．９ｃｍ２以上である。一方、上限値としては、より好ましくは９００ｃｍ２以下、更に好ましくは８００ｃｍ２以下、特に好ましくは５００ｃｍ２以下である。
（細胞）
　細胞は、細胞、組織、臓器の欠損及び機能障害、機能不全に関連する症状を治療又は予防するための臨床上有用な細胞、非臨床試験などで使用する培養可能な細胞であって、生体から分離された細胞あれば、特に制限されるものではない。
　細胞としては、例えば、生体組織細胞、間葉系組織に属する細胞に分化する能力を有する間葉系幹細胞、様々な生体組織に分化する能力を有する多能性幹細胞、分化誘導される幹細胞や前駆細胞などが挙げられる。なお、細胞は、接着細胞であっても浮遊細胞であってもよい。
　生体組織細胞の具体例としては、例えば、線維芽細胞、筋線維芽細胞、角膜上皮細胞、網膜細胞、神経細胞、筋細胞、心筋細胞、筋芽細胞、骨細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肝細胞、膵細胞、腎細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞、内皮細胞などが挙げられる。
　間葉系幹細胞の具体例としては、例えば、脂肪組織由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、臍帯血由来間葉系幹細胞、臍帯由来間葉系幹細胞などが挙げられる。
　多能性幹細胞の具体例としては、例えば、誘導多能性幹細胞、胚性幹細胞、核移植胚性幹細胞、胚性腫瘍細胞、胚性生殖細胞などが挙げられる。
　また、これらの細胞は、単独で培養してもよいし、二種以上を組み合わせて培養してもよい。これらの細胞については、細胞の用途などに応じて公知のものから適宜設定すればよい。
　なお、細胞の由来は、特に制限されるものではないが、例えば、哺乳類、鳥類、両生類、魚類、昆虫、植物、微生物などが挙げられる。哺乳類及び鳥類の具体例としては、例えば、ヒト、サル、チンパンジー、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラット、ニワトリなどが挙げられる。
（培養条件）
　細胞培養は、特に制限されるものではなく、医療、医薬品、医薬部外品、化粧品、食品、動物用薬品などの技術分野、及び再生医療、生物工学などの基礎技術分野において使用されている通常の手段を用いることができる。
　培養条件は、培養細胞を目的とする状態にできるのであれば、特に制限されるものではない。一般的な培養条件としては、例えば、調製した基礎培養液を用いた３７℃、５％ＣＯ２の環境下である。
　細胞培養の期間は、培養細胞が目的とする状態になるのであれば、特に制限されるものではない。細胞培養の期間としては、例えば、２８日以内、２１日以内、１４日以内、７日以内、５日以内、３日以内である。長期間培養する際は、培地交換しても良い。培地交換の頻度と方法は特に制限されるものではない。一般的には１日～７日毎に交換することが好ましい。特に好ましくは、１日～５日である。この時、全量培地を交換しても良く、一部培地を残し、新しい培地を加えても良い。
　培養する細胞の密度は、培養する細胞、培養容器、培養細胞の用途に適したものであれば、特に制限されるものではないが、例えば、５×１０２細胞／ｃｍ２以上１×１０９細胞／ｃｍ２以下である。細胞密度の下限値としては、より好ましくは１×１０３細胞／ｃｍ２以上、更に好ましくは５×１０３細胞／ｃｍ２以上、特に好ましくは５×１０４細胞／ｃｍ２以上である。一方、細胞密度の上限値としては、より好ましくは１×１０８細胞／ｃｍ２以下、更に好ましくは５×１０７細胞／ｃｍ２以下、特に好ましくは１×１０７細胞／ｃｍ２以下である。
　培養する細胞の密度は例えば、５×１０２細胞／ｃｍ２以上１×１０９細胞／ｃｍ２以下、５×１０２細胞／ｃｍ２以上１×１０８細胞／ｃｍ２以下、５×１０２細胞／ｃｍ２以上５×１０７細胞／ｃｍ２以下、５×１０２細胞／ｃｍ２以上１×１０７細胞／ｃｍ２以下、１×１０３細胞／ｃｍ２以上１×１０９細胞／ｃｍ２以下、１×１０３細胞／ｃｍ２以上１×１０８細胞／ｃｍ２以下、１×１０３細胞／ｃｍ２以上５×１０７細胞／ｃｍ２以下、１×１０３細胞／ｃｍ２以上１×１０７細胞／ｃｍ２以下、５×１０３細胞／ｃｍ２以上１×１０９細胞／ｃｍ２以下、５×１０３細胞／ｃｍ２以上１×１０８細胞／ｃｍ２以下、５×１０３細胞／ｃｍ２以上５×１０７細胞／ｃｍ２以下、５×１０３細胞／ｃｍ２以上１×１０７細胞／ｃｍ２以下、５×１０４細胞／ｃｍ２以上１×１０９細胞／ｃｍ２以下、５×１０４細胞／ｃｍ２以上１×１０８細胞／ｃｍ２以下、５×１０４細胞／ｃｍ２以上５×１０７細胞／ｃｍ２以下、５×１０４細胞／ｃｍ２以上１×１０７細胞／ｃｍ２以下である。
（培養液）
　培養液３０は、培養する細胞に適したものであれば、特に制限されるものではない。培養液成分としては、例えば、糖類、アミノ酸、ビタミン類、無機塩、微量金属、添加物などが挙げられる。
　また、これらの培養液成分は、単独で配合してもよいし、二種以上を組み合わせて配合してもよい。これらの培養液成分については、培養する細胞などに応じて公知のものから適宜設定すればよい。
　糖類の具体例としては、例えば、グルコースやフルクトース、マンノース、ガラクトースなどの単糖類、スクロースやスクラロース、トレハロース、マルトース、ラクトースなどの二糖類、グルコシルスクロースやラクトスクロース、ラフィノースなどの三糖類、アカルボースやマルトテトラオースなどの四糖類、シクロデキストリン、オリゴ糖などが挙げられる。
　アミノ酸の具体例としては、例えば、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－シスチン、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－システイン、Ｌ－ヒドロキシプロリンなどが挙げられる。
　ビタミン類の具体例としては、例えば、Ｌ－アスコルビン酸ナトリウム、Ｌ－アスコルビン酸－二リン酸、コリン、葉酸、ナイアシン、ビオチン、パントテン酸、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、チミジン、ビタミンＢ１２などが挙げられる。
　無機塩の具体例としては、例えば、塩化ナトリウム、水酸化ナトリウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化カリウム、水酸化カリウム、硫酸カリウム、リン酸カリウム、リン酸水素二カリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、塩化カルシウム、硫酸カルシウム、硝酸カルシウム、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、リン酸マグネシウム、炭酸マグネシウムなどが挙げられる。
　微量金属の具体例としては、例えば、硫酸鉄、硝酸鉄、硫酸銅、硝酸銅、硫酸亜鉛などが挙げられる。
　添加物の具体例としては、例えば、ウシ血清やウマ血清、ヒト血清などの血清、ＦＧＦ２やＥＧＦ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦなどの増殖因子、アルブミンなどのタンパク質、グルタチオンやアスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体などの抗酸化剤、ペニシリンやストレプトマイシンなどの抗生物質、ＨＥＰＥＳなどのｐＨ調整剤、乳酸やプロピオン酸などの有機酸、コレステロールなどの脂質、リノレン酸などの脂肪酸、エタノールアミンやプトレシンなどのアミン類、メルカプトエタノールや３－メルカプト－１，２－プロパンジオールなどの還元剤、アルギン酸ナトリウムやポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、プルランなどの増粘剤、フェノールレッドなどのｐＨ指示薬などが挙げられる。
　上記の培養液成分を含有する培養液３０としては、例えば、ＡＩＭ　Ｖ　ｍｅｄｉｕｍ、ＨＦＤＭ－１　Ｍｅｄｉｕｍ、ダルベッコリン酸緩衝食塩液（Ｄ－ＰＢＳ）やハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）などの平衡緩衝液、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ）やＥＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ）、α－ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ　ａｌｐｈａ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ）、ＧＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ　ＭＥＭ）、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１０　ｍｅｄｉｕｍ、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１２　ｍｅｄｉｕｍ、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１２Ｋ　ｍｅｄｉｕｍ、ＲＰＭＩ　ｍｅｄｉｕｍ　１６４０、Ｍ－１９９　ｍｅｄｉｕｍ、Ｌ－１５　ｍｅｄｉｕｍ、ＭｃＣｏｙ’ｓ　５Ａ　Ｍｅｄｉｕｍ、ＭＣＤＢ１０５　ｍｅｄｉｕｍ、ＭＣＤＢ１０７　ｍｅｄｉｕｍ、ＭＣＤＢ１３１　ｍｅｄｉｕｍ、ＭＣＤＢ１５３　ｍｅｄｉｕｍ、ＭＣＤＢ２０１　ｍｅｄｉｕｍ、ＮＣＴＣ１０９　ｍｅｄｉｕｍ、ＮＣＴＣ１３５　ｍｅｄｉｕｍ、Ｗａｙｍｏｕｔｈ’ｓ　ＭＢ７５２／１　ｍｅｄｉｕｍ、ＣＭＲＬ－１０６６　ｍｅｄｉｕｍ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’ｍｅｄｉｕｍ　Ｅ、Ｂｒｉｎｓｔｅｒ’ｓ　ＢＭＯＣ－３　Ｍｅｄｉｕｍ、Ｅ８　ｍｅｄｉｕｍなどの基礎培養液などが挙げられる。
　また、これらの基礎培養液は、単独で用いてもよいし、二種以上を組み合わせて用いてもよい。さらに、基礎培養液は、細胞の種類や状態に応じて、培養液成分を追加、除去、増量、減量してもよい。これらの基礎培養液については、培養する細胞などに応じて公知のものから適宜設定すればよい。
（細胞シート）
　細胞シート４０は、細胞同士が接着分子、細胞外マトリックスなどを介して物理的、機能的に連結してシート構造を有するものである。
　細胞シート４０は、１の細胞層から構成される単層構造であってもよいし、２以上の細胞層から構成される積層構造でもよい。積層構造としては、特に制限されるものではないが、２層、３層、４層、５層などの多層構造が挙げられる。
　細胞シート４０が多層構造を持つ場合、培養キャリア基材１０で培養した際に多層構造が得られることもあるし、単層構造を持つ細胞シートを積層して得ることもできる。特に、本発明の細胞シート付き培養キャリア基材５０を複数用意し、ある細胞シートの上に別の細胞シートを重ね合わせ、別の細胞シートから培養キャリア基材を剥がすことで、多層構造を持つ細胞シートを得ることができる。
　細胞シート４０の厚みは、特に制限されるものではないが、例えば、０．００１ｍｍ以上２．０ｍｍ以下である。細胞シート４０の厚みの下限値としては、より好ましくは０．０１ｍｍ以上、更に好ましくは０．０３ｍｍ以上、特に好ましくは０．０５ｍｍ以上である。一方、細胞シート４０の厚みの上限値としては、より好ましくは１．５ｍｍ以下、更に好ましくは１．２ｍｍ以下、特に好ましくは１．０ｍｍ以下である。細胞シート４０の厚みは例えば、０．００１ｍｍ以上２．０ｍｍ以下、０．００１ｍｍ以上１．５ｍｍ以下、０．００１ｍｍ以上１．２ｍｍ以下、０．００１ｍｍ以上１．０ｍｍ以下、０．０１ｍｍ以上２．０ｍｍ以下、０．０１ｍｍ以上１．５ｍｍ以下、０．０１ｍｍ以上１．２ｍｍ以下、０．０１ｍｍ以上１．０ｍｍ以下、０．０３ｍｍ以上２．０ｍｍ以下、０．０３ｍｍ以上１．２ｍｍ以下、０．０３ｍｍ以上１．０ｍｍ以下、０．０５ｍｍ以上２．０ｍｍ以下、０．０５ｍｍ以上１．５ｍｍ以下、０．０５ｍｍ以上１．２ｍｍ以下、０．０５ｍｍ以上１．０ｍｍ以下である。細胞シート４０の厚みを上記範囲とすることにより、細胞シート４０内での高い細胞活性率、及び細胞移植に有利な優れた形状維持能を発揮することができる。
　細胞シート４０の面積は、特に制限されるものではないが、例えば、０．３ｃｍ２以上１０００ｃｍ２以下である。細胞シート４０の面積の下限値としては、より好ましくは０．６ｃｍ２以上、更に好ましくは１．６ｃｍ２以上、特に好ましくは８ｃｍ２以上であり、３ｃｍ２以上、６ｃｍ２以上又は１０ｃｍ２以上であってもよい。一方、細胞シート４０の面積の上限値としては、より好ましくは９００ｃｍ２以下、更に好ましくは８００ｃｍ２以下、特に好ましくは５００ｃｍ２以下であり、１００ｃｍ２以下、５０ｃｍ２以下又は２０ｃｍ２以下であってもよい。例えば、細胞シート４０の面積は、０．６ｃｍ２以上９００ｃｍ２以下、１．６ｃｍ２以上８００ｃｍ２以下、３ｃｍ２以上５００ｃｍ２以下、６ｃｍ２以上１００ｃｍ２以下、８ｃｍ２以上５０ｃｍ２以下又は１０ｃｍ２以上２０ｃｍ２以下である。従来、細胞シート単独での移植の際は、細胞シートの強度は低いため、大面積の場合は搬送時に破損する可能性が高かったが、本開示においては、細胞シート４０が培養キャリア基材に支持されているため、移植時に細胞シートが破れることを防ぐことができるため、細胞シート４０の大きさを８ｃｍ２以上に大きくできる。また、大きく細胞シートを作製し、適宜患部のサイズに調製して使用することもできる。
　なお、培養キャリア基材の形状は、図１において円形が示されているが、円形以外の適宜の形状であってもよく、例えば正方形、正五角形、正六角形、正八角形等の正多角形や、長円形、矩形等であってもよい。
＜培養キャリア基材＞
　本実施形態の培養キャリア基材１０は、細胞を培養して細胞シート４０を形成するための細胞シート足場材と、培養された細胞シート４０を運搬する細胞シート支持体との両方に用いられ、細胞シートの被移植部位への貼付後に前記細胞シートから剥離される基材である。
　培養キャリア基材１０の面積は、特に制限されるものではないが、培養容器より小さく、細胞シートと同じもしくは大きいことが望まれる。例えば、０．３ｃｍ２以上１０００ｃｍ２以下である。培養キャリア基材１０の面積の下限値としては、より好ましくは０．６ｃｍ２以上、更に好ましくは１．６ｃｍ２以上、特に好ましくは８ｃｍ２以上であり、３ｃｍ２以上、６ｃｍ２以上又は１０ｃｍ２以上であってもよい。一方、培養キャリア基材１０の面積の上限値としては、より好ましくは９００ｃｍ２以下、更に好ましくは８００ｃｍ２以下、特に好ましくは５００ｃｍ２以下であり、１００ｃｍ２以下、５０ｃｍ２以下又は２０ｃｍ２以下であってもよい。培養容器より大きい場合は、細胞シートが得られない可能性がある。例えば、培養キャリア基材１０の面積は、０．６ｃｍ２以上９００ｃｍ２以下、１．６ｃｍ２以上８００ｃｍ２以下、３ｃｍ２以上５００ｃｍ２以下、６ｃｍ２以上１００ｃｍ２以下、８ｃｍ２以上５０ｃｍ２以下又は１０ｃｍ２以上２０ｃｍ２以下である。
　培養キャリア基材１０の基材厚みは、とくに限定されないが、好ましくは５μｍ以上２５０μｍ以下である。基材厚みの下限値としては、より好ましくは６μｍ以上、さらに好ましくは８μｍ以上、１０μｍ以上、１２μｍ以上である。一方、基材厚みの上限値としては、より好ましくは５０μｍ以下、３０μｍ以下、２５μｍ以下、さらに好ましくは２０μｍ以下である。例えば、培養キャリア基材１０の基材厚みは、６μｍ以上５０μｍ以下、８μｍ以上３０μｍ以下、又は１０μｍ以上２０μｍ以下である。
　上記下限値以上とすることにより、培養キャリア基材１０が搬送時に破れたり丸まってしまったりすることを防げ、取り扱い性を向上できる。上記上限値以下とすることにより、移植時に患部への追従性を向上できる。特に基材厚みを２０μｍ以下とすると、より曲率の高い患部への追従性を高めることができ、例えば、手術により体内の器官を縫合した箇所などにも適用できる。
　また、培養時における自立膜として機能する観点から、培養キャリア基材１０の基材厚みの下限は、１０μｍ越えが好ましく、１１μｍ以上がより好ましく、１２μｍ以上がさらに好ましい。これにより、基材厚みが１０μｍ越えの培養キャリア基材１０を用いることにより、細胞培養工程時において、培養キャリア基材１０を培養容器２０の内部に固定または固着しない状態で、細胞シート４０を製造することが可能となる。
　自立膜とは、培養キャリア基材１０の培養面１２の平面状態が、培養液３０中でも維持される膜であることが好ましく、培養面１２上に細胞シート４０が形成された後も平面状態が維持されることがより好ましい。培養面１２の平面状態が維持されるため、丸まらない培養キャリア基材１０は、固着しないで培養液３０中での細胞培養特性を高められる。
　また、この自立膜は、鑷子で一端を摘まんで持ち上げたとき、シート形状を一定程度保持できるものであってもよい。その際、培養キャリア基材１０の面積は１．６ｃｍ２以上であることが好ましい。
　培養キャリア基材１０の培養面１２は、親水化処理が施されていることが好ましい。これにより、細胞密着性を向上できる。この親水化処理は、例えば、ＵＶオゾン処理、プラズマ処理等が挙げられる。
　この中でも、培養面１２がプラズマ処理された培養キャリア基材１０を用いることが好ましい。
　本明細書において、親水化された面とは、θ／２法で測定された水滴接触角θの上限が７０°以下である表面を意味する。一方、親水化された面の水滴接触角θの下限は３°以上が好ましいが、これに限定されない。水滴接触角θは、基材に、２５℃環境下、２μｌの純水を置き、ＩＳＯ　１９４０３－２：２０１７に準拠したθ／２法にて、水滴と基材とのなす角を接触角計で測定する。
　また、親水化処理された培養面の表面粗さＲａの下限が、０．３ｎｍ以上、好ましくは０．５ｎｍ以上であり、上限が１００ｎｍ以下、好ましくは１０ｎｍ以下、より好ましくは２ｎｍ以下である。
　なお、ここでの表面粗さＲａとは、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）にて測定した表面形状データを用いて、一辺１００ｎｍの正方形の領域における算術平均粗さを指す。
　培養キャリア基材１０を構成する材料として、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、変性ポリフェニレンエーテル（ｍＰＰＥ）、ポリフェニレンスルフィド（ＰＰＳ）、ポリスルフォン（ＰＳＵ）、ポリアリレート（ＰＡＲ）、液晶ポリマー（ＬＣＰ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）等の樹脂材料が挙げられる。
　培養キャリア基材１０の一例は、これらの樹脂材料の少なくとも一つを主成分に含むフィルムで構成されていてもよく、好ましくはポリエーテルエーテルケトンフィルムまたはポリエチレンテレフタレートフィルム、より好ましくはポリエーテルエーテルケトンフィルムである。
　培養キャリア基材１０は、上記樹脂材料からなる樹脂層を１層または２層以上含むものが好ましい。２層以上の樹脂層は、互いに異なる種類の材料を含んでもよい。
　培養キャリア基材１０は、上記材料からなる樹脂層を含む樹脂基材からなる構成であってもよく、上記材料からなる樹脂層と他の材料からなる無機層とを含むラミネート基材からなる構成でもよい。ただし、樹脂層には、パリレンなどの化学蒸着によって形成される層やウェットコーティング層は含まなくてよい。また、ラミネート基材における無機層は、ガラス層を含まないことが好ましく、金属箔を含んでもよい。また、培養キャリア基材１０は、培養面１２側に不織布および繊維基材を含まないことが好ましい。
　ＰＥＥＫを含む培養キャリア基材１０は、低線膨張係数、耐溶剤性、耐熱性の観点から総合的に検討すると、ＰＥＴを含む場合と比べて好ましい。
　また、培養キャリア基材１０は、培養液３０よりも比重が高い材料で構成されているものが好ましい。
　培養キャリア基材１０の培養面１２を、レーザー顕微鏡で測定した際に、１００μｍ四方の範囲に、直径１μｍ以上１００μｍ以下、かつ深さ０．５μｍ以上１００μｍ以下の穴が３つ以下である培養キャリア基材である。前記穴の直径は、例えば１μｍ以上１００μｍ以下、好ましくは２μｍ以上５０μｍ以下、より好ましくは３μｍ以上３０μｍ以下である。前記穴の深さは、例えば０．５μｍ以上１００μｍ以下、好ましくは１μｍ以上５０μｍ以下、より好ましくは２μｍ以上２０μｍ以下である。
　穴の直径と穴の深さの範囲の組み合わせは、例えば穴の直径が１μｍ以上１００μｍ以下かつ穴の深さが０．５μｍ以上１００μｍ以下、穴の直径が１μｍ以上１００μｍ以下かつ穴の深さが１μｍ以上５０μｍ以下、穴の直径が１μｍ以上１００μｍ以下かつ穴の深さが２μｍ以上２０μｍ以下、穴の直径が２μｍ以上５０μｍ以下かつ穴の深さが０．５μｍ以上１００μｍ以下、穴の直径が２μｍ以上５０μｍ以下かつ穴の深さが１μｍ以上５０μｍ以下、穴の直径が２μｍ以上５０μｍ以下かつ穴の深さが２μｍ以上２０μｍ以下、穴の直径が３μｍ以上３０μｍ以下かつ穴の深さが０．５μｍ以上１００μｍ以下、穴の直径が３μｍ以上３０μｍ以下かつ穴の深さが１μｍ以上５０μｍ以下、穴の直径が３μｍ以上３０μｍ以下かつ穴の深さが２μｍ以上２０μｍ以下である。
　また、培養キャリア基材１０の空隙率の上限は、例えば、１５％以下、好ましくは１０％以下、より好ましくは５％以下である。一方、培養キャリア基材１０の空隙率の下限は、とくに限定されないが、０％以上でもよい。
　培養面１２の上記穴が３つ以下であること、および／または、培養キャリア基材１０の空隙率を上記上限値以下とすることにより、細胞シート４０との密着力を適度なものとすることができる。
　なお、穴の有無は、培養キャリア基材１０が培養面１２側に形成される樹脂層の表面を測定対象としてもよい。
　空隙率は、理論密度と実測密度から算出する。具体的には、空隙率＝｛１－（実密度／理論密度）｝×１００の計算式により算出する。
　また、培養キャリア基材１０の培養面１２は、温度応答性ポリマーを含まないように構成されてもよい。これにより、凍結保存工程などの低温環境下で、細胞シート４０と培養キャリア基材１０との密着性が低下することを抑制できる。
　温度応答性ポリマーは、細胞を培養する際の温度で細胞接着性を発揮し、そこから温度変化を行うことで細胞非接着性を発揮して細胞シートを容易に剥離することが可能となる材料である。温度応答性ポリマーが細胞接着性を発揮する温度領域が１０℃～４５℃、特に３３℃～４０℃の範囲であると、細胞を安定的に培養することができ好ましい。また、温度応答性ポリマーが細胞非接着性を発揮する温度領域は、１℃～３６℃、特に４℃～３２℃の範囲内であると、細胞シートの剥離に与えるダメージを減らすことができるため好ましい。温度応答性ポリマーを構成する材料としては、具体的には、ポリ－Ｎ－イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡＡｍ）、ポリ－Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド、ポリ－Ｎ－ｎ－プロピルメタクリルアミド、ポリ－Ｎ－エトキシエチルアクリルアミド、ポリ－Ｎ－テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、ポリ－Ｎ－テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド、および、ポリ－Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミドなどの温度応答性高分子を挙げることができ、なかでもＰＮＩＰＡＡｍ、ポリ－Ｎ－ｎ－プロピルメタクリルアミド、ポリ－Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミドが好ましい。
　細胞シートの培養に使用される前の培養キャリア基材１０は、包装材料に包装された包装体とすることができる。密封された包装体とすることで、培養面を汚損させずに保存、流通させることができる。また、この包装体は滅菌してもよい。滅菌方法は電子線滅菌、ガンマ線滅菌、ＥＯＧ滅菌、高圧蒸気滅菌、等が挙げられる。
　包装材料は、例えば、アルミニウム、ポリエチレンテレフタレート、アイオノマー、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリアクリロニトリル、エチレン酢酸ビニル共重合体、エチレン－ビニルアルコール共重合体、エチレン－メタクリル酸共重合体、ペルフルオロアルコキシフッ素樹脂、ナイロン、セロファン、紙材などが挙げられる。これらを単独で用いてもよいし、これらから二つ以上を組み合わせてもよい。ＥＯＧ滅菌や高圧蒸気滅菌のようにガス透過性が求められる滅菌を行う場合は、紙材と上記材料とを組合せた包装材料が好ましく用いられる。なお、包装材料は多重梱包としてもよく、滅菌後にさらに包装を重ねてもよく、包装体の最外部分は樹脂のフィルム状の包装材料であることが好ましい。
　培養キャリア基材１０上で細胞シート４０を培養することにより、細胞シート４０と培養キャリア基材１０の積層体を含む細胞シート付き培養キャリア基材５０が得られる。
　細胞シート付き培養キャリア基材５０において、細胞シート４０が、培養面１２側における表面のうち細胞が堆積可能な領域を、例えば、５０％以上１００％以下被覆した状態となる。培養キャリア基材１０の培養面１２の一部に対して重りで荷重固定する方法や、培養キャリア基材１０を器具により位置固定する方法を採用した場合は、細胞が堆積可能な領域とは、重りや器具などが接触しておらず細胞が堆積可能な領域である。また、培養キャリア基材１０の培養面１２に親水化処理が施されている場合は、細胞が堆積可能な領域とは、親水化処理がなされた領域である。細胞シート４０の被覆面積の下限値は、好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上である。細胞シート４０の被覆面積の上限値は、１００％以下でもよく、９９％以下でもよく、９８％以下でもよい。細胞シート４０の被覆面積は、例えば５０％以上１００％以下、５０％以上９９％以下、５０％以上９８％以下、７０％以上１００％以下、７０％以上９９％以下、７０％以上９８％以下、９０％以上１００％以下、９０％以上９９％以下、９０％以上９８％以下である。なお、培養キャリア基材１０の面積は、細胞シート４０の細胞が堆積可能な領域の面積と同じかそれより大きいことが好ましい。上記下限値以上とすることにより、治癒効果を向上できる。
　また、培養キャリア基材上で細胞シートを形成することにより、培養容器や凍結保存容器から細胞シートを取り出す際に破れたりする可能性を低くでき、容易に取り出すことができる。また、被移植部位に細胞シートを貼り付けた後、容易に培養キャリア基材から細胞シートを剥離できる。細胞シートの取り扱いが容易になることから、大きいサイズの細胞シートの作製が可能となる。
＜細胞シート付き培養キャリア基材の製造方法＞
　本実施形態の細胞シート付き培養キャリア基材５０の製造方法の一例は、例えば、培養容器２０の内部に、複数の細胞、培地（培養液３０）、および培養キャリア基材１０を導入して、培養キャリア基材１０の培養面１２に細胞シート４０を培養する、培養工程と、培養液３０から、細胞シート付き培養キャリア基材５０を取り出す、取出工程と、を含んでもよい。
　本実施形態の細胞シート４０は、細胞シート付き培養キャリア基材５０から剥離したものであり、細胞移植療法などの治療、予防などに用いることができる。
　剥離方法は、特に制限されるものではなく、医療、医薬品、医薬部外品、化粧品、食品、動物用薬品などの技術分野、及び再生医療、生物工学などの基礎技術分野において使用されている通常の手段を用いることができる。剥離方法としては、例えば、物理的処理などが挙げられる。
＜凍結保存方法＞
　本実施形態の凍結保存方法の一例は、図１（ｃ）に示すように、培養容器２０の内部の培養キャリア基材１０と培養キャリア基材１０の表面（培養面１２）に形成された細胞シート４０とを含む細胞シート付き培養キャリア基材５０を、凍結保存液６０中で冷却する冷却工程を含む。培養容器には、培養用の蓋（図示せず）または液漏れおよび微生物混入を防ぐ蓋（図示せず）をして凍結してもよい。図１（ｃ）では、培養容器２０の内部で細胞シート付き培養キャリア基材５０の凍結保存を行っているが、培養容器２０とは別の凍結保存容器に細胞シート付き培養キャリア基材５０を移し替えて凍結保存を行ってもよい。凍結保存容器としては、特に制限されるものではないが、例えば、培養容器２０で例示されたものを使用することができる。
　冷却工程において、細胞シート付き培養キャリア基材５０は、様々な態様を採用することが可能である。図３（ａ）（ｂ）に示すように、細胞シート付き培養キャリア基材５０は、細胞シート４０の片側に培養キャリア基材１０が形成された構造を有してもよく、図３（ｃ）に示すように、細胞シート４０の両面を２枚の培養キャリア基材１０ａ、１０ｂで挟み込む構造を備えてもよい。図３（ａ）では、培養キャリア基材１０が培養容器２０の底面に向いた状態で配置される。図３（ｂ）では、細胞シート４０が培養容器２０の底面に向いた状態で配置される。図３（ｃ）では、培養キャリア基材１０ａ、１０ｂは、同一材料で構成されてもよく、互いに別の材料で構成されてもよい。例えば、培養キャリア基材１０ａ、１０ｂは、両方とも、ＰＥＥＫを含む培養キャリア基材でもよく、一方が、ＰＥＥＫを含む培養キャリア基材であり、他方が、ＰＥＥＫを含まない培養キャリア基材でもよい。
（凍結保存液）
　凍結保存液６０は、凍結保存による細胞の損傷を低減するための溶液である。
　凍結保存液６０は、細胞の凍結保存に適したものであれば、特に制限されるものではないが、培養液に含まれる培養液成分、凍結保護剤などを含有してもよい。
　培養液成分である糖類、アミノ酸、ビタミン類、無機塩、微量金属、添加物については、上記（培養液）の項の説明を充足するものであればよい。また、凍結保存液は、凝固開始温度が－１５℃以上－５℃以下の範囲にあるものが好ましい。
　凍結保護剤は、凍結保存時の凍結や解凍による細胞への損傷を低減するために使用する物質である。凍結保護剤としては、例えば、細胞非浸透性凍結保護剤、細胞浸透性凍結保護剤が挙げられる。
　細胞非浸透性凍結保護剤の具体例としては、例えば、アルブミン、スクロース、トレハロース、デキストラン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリリジンなどが挙げられる。
　細胞浸透性凍結保護剤の具体例としては、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、プロパンジオールなどが挙げられる。
　また、これらの凍結保護剤は、単独で配合してもよいし、二種以上を組み合わせて配合してもよい。これらの凍結保護剤については、細胞の種類、凍結保存液の組成などに応じて公知のものから適宜設定すればよい。
　ＤＭＳＯを含まない市販の凍結保存液としては、例えば、ステムセルバンカー（登録商標）ＤＭＳＯフリーＧＭＰグレード（日本全薬工業社）、バンバンカー（登録商標）ＤＭＳＯフリー（ＣＧリンフォテック社）、クライオスカーレス（登録商標）ＤＭＳＯフリー（バイオベルデ社）、ステムセルキープ（バイオベルデ社）、ＣｒｙｏＮｏｖｏ（登録商標）Ｘ１２（Ａｋｒｏｎ　ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ　ＬＣＣ社）、ＣｒｙｏＮｏｖｏ（登録商標）Ｐ２４（Ａｋｒｏｎ　ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ　ＬＣＣ社）、ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞凍結保存用ＤＭＳＯフリー細胞凍結保存液（リプロセル社）、Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ　Ｏｎｅ（ナカライテスク社）、ＴｈｅｌｉｏＫｅｅｐ（登録商標：バイオベルデ社）、Ｃｅｌｌｖａｔｉｏｎ（登録商標：Ｐｒｏｔｉｄｅ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社）、ＲｅｐｒｏＣｒｙｏ　ＲＭ（リプロセル社）、ＳＯＦＯＲＯ　Ｃｒｙｏ（ＳＡＲＡＹＡ社）などが挙げられる。また、ＤＭＳＯを含む市販の凍結保存液としては、例えば、ステムセルバンカー（登録商標）ＧＭＰグレード（日本全薬工業社）、ステムセルバンカー（登録商標）ＥＸ　ＧＭＰグレード（日本全薬工業社）、バンバンカー（登録商標）ｈＲＭ（ＣＧリンフォテック社）、バンバンカー（登録商標）（ＣＧリンフォテック社）、ｉＳｔｏｃｋ（ＣＧリンフォテック）、ＣｒｙｏＳｔｏｒ　ＣＳ５（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｃｅｌｌ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，　ｉｎｃ）、ＣｒｙｏＳｔｏｒ　ＣＳ１０（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｃｅｌｌ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，　ｉｎｃ）などが挙げられる。
（冷却工程）
　冷却工程において、細胞シート付き培養キャリア基材５０を、凍結保存液中で非貫流式の冷却装置を用いて冷却することが好ましい。適当な培養キャリア基材１０上で、細胞シート４０を、非貫流式の冷却装置により、冷却対象物である細胞シートを均一な温度で冷却することが可能となるため、細胞へのダメージが少なく、細胞活性率の低下を抑制できる。
　冷却工程において、０～－５℃における冷却速度は、例えば、０．１℃／分以上１５℃／分以下、好ましくは０．２５℃／分以上１２．５℃／分以下、より好ましくは０．５℃／分以上１０℃／分以下である。
　上記下限値以上とすることにより、不必要な液状の凍結保護材と細胞の接触時間を減らすことができる。上記上限値以下とすることにより、細胞内氷晶の形成を抑制することができる。
　冷却工程において、凍結処理の温度は、培養細胞及び凍結保存液を凍結することができれば、特に制限されるものではない。凍結処理の温度としては、例えば、－１９６℃以上－２５℃以下である。下限値としては、より好ましくは－１８０℃以上、更に好ましくは－１６０℃以上、特に好ましくは－１５０℃以上である。一方、上限値としては、より好ましくは－２５℃以下、更に好ましくは－３０℃以下、特に好ましくは－３５℃以下である。凍結処理の温度は例えば、－１９６℃以上－２５℃以下、－１９６℃以上－３０℃以下、－１９６℃以上－３５℃以下、－１８０℃以上－２５℃以下、－１８０℃以上－３０℃以下、－１８０℃以上－３５℃以下、－１６０℃以上－２５℃以下、－１６０℃以上－３０℃以下、－１６０℃以上－３５℃以下、－１５０℃以上－２５℃以下、－１５０℃以上－３０℃以下、－１５０℃以上－３５℃以下である。
　凍結処理に用いる冷却装置は、特に制限されるものではなく、例えば、急速冷凍装置、極低温冷蔵装置などが挙げられる。冷却装置としては、培養容器に伝熱手段を接触させて培養容器及び細胞を凍結させるよりも、伝熱手段と非接触であり、冷気を一方向ではなく多方向、好ましくは全方向から培養容器に吹き付けて凍結する冷凍装置であることが、均一な温度で細胞を凍結して、解凍後の細胞の生存率を高める観点から好ましい。冷気を培養容器に吹き付けて凍結する冷凍装置としては、具体的には、冷却ファンによる冷気循環により、被冷却物を冷却させる冷却装置、例えば、特開２００５－１２７６６６号公報に開示されている、冷却ファンを備えた非貫流方式の冷却装置などが挙げられる。なお、上記「非貫流方式」とは、被冷却物からの貫流空気の大半が冷却器を通過（貫流）しない方式を意味する。
（冷凍保存工程）
　凍結保存方法は、冷却工程の後、例えば－１９６～－６０℃、好ましくは－１８０～－６５℃、より好ましくは－１５０～－８０℃にて細胞シート付き培養キャリア基材５０を保存する、凍結保存工程を含むことが好ましい。これにより、長期間にわたり細胞シートを安定に維持することができる。
　冷却工程の温度は、冷却装置の設定温度を採用してもよい。
　凍結保存は、細胞を安定に凍結保存することができれば、特に制限されるものではない。
　凍結保存の方法としては、例えば、冷却剤の液相、気相との接触、超低温冷凍庫の使用などが挙げられる。好ましい凍結保存の方法としては、温度の観点から冷却剤の液相、気相との接触である。
　冷却剤としては、例えば、液体窒素、液体エタン、液体プロパン、液体ヘリウム、ドライアイスなどが挙げられる。
　凍結保存の温度は、細胞を安定に凍結保存することができれば、特に制限されるものではない。凍結保存の温度としては、例えば、－１９６℃以上－６０℃以下、－１９６℃以上－１３４℃以下、－１３４℃以上－６０℃以下のいずれの範囲内でもよい。
　凍結保存の温度は、凍結対象となる細胞シート４０の表面温度を採用してもよい。表面温度は、例えば、Ｋ熱電対を用いて測定できる。
　細胞シート付き培養キャリア基材５０の凍結物は、培養キャリア基材１０と、培養キャリア基材１０の表面（培養面１２）に形成された細胞シート４０と、を含むものである。細胞シート付き培養キャリア基材５０中、培養キャリア基材１０および細胞シート４０が凍結保存状態である。
　上記凍結物において、培養キャリア基材１０および細胞シート４０が例えば、上述の凍結保存の温度にて、具体的には、好ましくは－６０℃以下、より好ましくは－１３５℃以下で凍結保存状態である。また、凍結物は、－１３４℃以上－６０℃以下の範囲で凍結保存状態としてもよい。なお、凍結物は、－１９６℃以上で凍結保存状態とする。
　培養容器や凍結保存容器の内部で凍結した細胞シート付き培養キャリア基材の凍結物は、培養容器内や凍結保存容器で凍結された状態か、容器から取り出された状態で、包装材料で包装された包装体とすることができる。密封された包装体とすることで、細胞シートへの微生物混入防止および細胞シートを汚損させずに保存、流通させることができる。一例として、細胞シート付き培養キャリア基材と凍結保存液を有する容器をフィルム状の包装材料で包装して密封した状態で凍結することで、凍結物の包装体を得ることができる。包装材料としては、アルミニウム、ポリエチレンテレフタレート、アイオノマー、ポリエチレン、ポリ塩化ビニリデン、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリロニトリル、エチレン酢酸ビニル共重合体、エチレン－ビニルアルコール共重合体、エチレン－メタクリル酸共重合体、ポリイミド、ペルフルオロアルコキシフッ素樹脂や四フッ化エチレン・六フッ化プロピレン共重合体（ＦＥＰ）等のフッ素系樹脂、ナイロンが好ましい。これらを単独で用いてもよいし、これらから二つ以上を組み合わせてもよい。
（解凍工程）
　本実施形態の移植方法が、上記冷凍保存方法を含む場合、冷凍保存方法は、さらに、細胞シート付き培養キャリア基材５０を解凍する、解凍工程を含む。
　解凍方法は、特に制限されるものではなく、医療、医薬品、医薬部外品、化粧品、食品、動物用薬品などの技術分野、及び再生医療、生物工学などの基礎技術分野において使用されている通常の手段を用いることができる。
　解凍の方法としては、例えば、ウォーターバス、インキュベータ、ホットプレート、デフロスターなどの使用や、凍結温度よりも高い温度の融解液に浸漬する、凍結温度よりも高い温度環境下に静置することなどが挙げられる。
　解凍時の凍結物に接する環境温度は、凍結温度より高い温度且つ５０℃未満であれば、特に制限されるものではない。上記の環境温度の上限は、例えば、４９℃以下、好ましくは４５℃以下、より好ましくは４０℃以下である。一方、環境温度の下限は、例えば、０℃以上、好ましくは５℃以上、より好ましくは１０℃、さらに好ましくは１５℃以上である。
　解凍時の凍結物に接する環境温度の範囲は例えば、０℃以上４９℃以下、０℃以上４５℃以下、０℃以上４０℃以下、５℃以上４９℃以下、５℃以上４５℃以下、５℃以上４０℃以下、１０℃以上４９℃以下、１０℃以上４５℃以下、１０℃以上４０℃以下、１５℃以上４９℃以下、１５℃以上４５℃以下、１５℃以上４０℃以下である。
　なお、解凍温度が５０℃以上である場合、細胞に熱ダメージが生じる可能性があるため好ましくない。また、解凍において凝固点以下の温度環境に一時的に保管してもよい。例えば、－８０℃に保管された凍結物を－３０℃の環境温度に曝した後に凝固点以上の環境温度で解凍することができる。
　凍結物の解凍に要する時間は、細胞に凍結による傷害が生じなければ、特に制限されない。通常、１０秒超、６０分以下であれば問題なく解凍できる。凍結物の解凍に要する時間の下限値としては、１０秒超であれば良く、２０秒以上が好ましく、３０秒以上がより好ましく、１分以上がさらに好ましい。上限値としては、６０分以下であれば良く、好ましくは５０分以下、より好ましくは４０分以下、さらに好ましく３０分以下である。例えば、解凍に要する時間は、１０秒超６０分以下、１０秒超５０分以下、１０秒超４０分以下、１０秒超３０分以下、２０秒以上６０分以下、２０秒以上５０分以下、２０秒以上４０分以下、２０秒以上３０分以下、３０秒以上６０分以下、３０秒以上５０分以下、３０秒以上４０分以下、３０秒以上３０分以下、１分以上６０分以下、１分以上５０分以下、１分以上４０分以下、１分以上３０分以下である。
　解凍が早すぎる場合、温度差による熱衝撃で凍結物に亀裂が生じ細胞シートが破損する恐れがある。解凍が遅すぎる場合、氷点下条件で水分子が再結晶し、氷晶が大きくなり、細胞に重篤な傷害が生じるため好ましくない。
　上記の解凍時間中において、上記の環境温度は、一定となるように設定されてもよく、段階的に上昇等の変動するように設定されてもよい。
　融解液は、培養細胞に損傷を与えないものであれば、特に制限されるものではない。融解液に含有する成分としては、例えば、スクロース、グルコース、マルトース、トレハロース、フルクトースなどが挙げられる。また、融解液は、上記（培養液）の項に記載の成分を含有してもよい。
　融解液の温度は、凍結温度よりも高い温度であれば、特に制限されるものではない。融解液の温度としては、例えば、０℃以上４５℃以下である。下限値としては、より好ましくは４℃以上、更に好ましくは２５℃以上、特に好ましくは２８℃以上である。一方、上限値としては、より好ましくは４０℃以下、更に好ましくは３９℃以下、特に好ましくは３８℃以下である。融解液の温度は例えば、０℃以上４５℃以下、０℃以上４０℃以下、０℃以上３９℃以下、０℃以上３８℃以下、４℃以上４５℃以下、４℃以上４０℃以下、４℃以上３９℃以下、４℃以上３８℃以下、２５℃以上４５℃以下、２５℃以上４０℃以下、２５℃以上３９℃以下、２５℃以上３８℃以下、２８℃以上４５℃以下、２８℃以上４０℃以下、２８℃以上３９℃以下、２８℃以上３８℃以下である。
　解凍した細胞シート４０および培養キャリア基材１０（細胞シート付き培養キャリア基材５０）は、必要に応じて、解凍処理直後に細胞洗浄液で洗浄してもよい。細胞洗浄液は、特に制限されるものではなく、上記（培養液）の項に記載の成分を含有してもよい。
　細胞洗浄液の温度は、特に制限されるものではない。細胞洗浄液の温度としては、例えば、０℃以上４５℃以下である。下限値としては、より好ましくは４℃以上、更に好ましくは２５℃以上、特に好ましくは２８℃以上である。一方、上限値としては、より好ましくは４０℃以下、更に好ましくは３９℃以下、特に好ましくは３８℃以下である。
　培養細胞の洗浄回数は、特に制限されるものではなく、１回又は複数回（例えば、２回、３回、４回、５回など）である。
本開示においては、培養面１２に温度応答性ポリマーを含まないため、凍結保存工程などの低温環境下で、細胞シート４０が培養キャリア基材１０から剥離することを抑制でき、凍結保存工程と解凍工程を経ても、細胞シートとフィルムの接着性を維持したままの細胞シート付き培養キャリア基材５０を得ることができる。
　以上、本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することができる。また、本発明は上述の実施形態に限定されるものではなく、本発明の目的を達成できる範囲での変形、改良等は本発明に含まれる。
　以下、参考形態Ａ～Ｊの例を付記する。
＜Ａ．培養キャリア基材＞
　培養キャリア基材の参考形態Ａとして、以下の１．～１３．が挙げられる。
１．　培養面に培養された細胞シートを搬送するために用いられる、培養キャリア基材であって、
　当該培養キャリア基材の基材厚みが５μｍ以上２５０μｍ以下である、培養キャリア基材。
２．　１．に記載の培養キャリア基材であって、
　前記培養キャリア基材の基材厚みが１０μｍ超であり、前記細胞シートの培養中に培養容器の内部に固着されずに自立膜として機能する、培養キャリア基材。
３．　１．または２．に記載の培養キャリア基材であって、
　前記培養面が、親水化処理がなされている、培養キャリア基材。
４．　３．に記載の培養キャリア基材であって、
　前記親水化処理は、ＵＶオゾン処理あるいはプラズマ処理された、培養キャリア基材。
５．　１．～４．のいずれか一つに記載の培養キャリア基材であって、
　当該培養キャリア基材がポリエーテルエーテルケトンフィルムまたはポリエチレンテレフタレートフィルムである、培養キャリア基材。
６．　１．～５．のいずれか一つに記載の培養キャリア基材であって、
　前記培養面が、温度応答性ポリマーを含まない、培養キャリア基材。
７．　１．～６．のいずれか一つに記載の培養キャリア基材であって、
　前記培養キャリア基材の面積が、０．３ｃｍ２以上１０００ｃｍ２以下である、培養キャリア基材。
８．　１．～７．のいずれか一つに記載の培養キャリア基材であって、
　前記培養キャリア基材が、樹脂材料からなる樹脂層を１層または２層以上含む、培養キャリア基材。
９．　１．～８．のいずれか一つに記載の培養キャリア基材であって、
　前記培養面を、レーザー顕微鏡で測定した際に、１００μｍ四方の観測範囲の少なくとも一つにおいて、直径１μｍ以上１００μｍ以下、かつ深さ０．５μｍ以上１００μｍの穴が３つ以下である、培養キャリア基材。
１０．　１．～９．のいずれか一つに記載の培養キャリア基材であって、
　空隙率が１５％以下である、培養キャリア基材。
１１．　１．～１０．のいずれか一つに記載の培養キャリア基材であって、
　前記培養面における水接触角が７０°以下である、培養キャリア基材。
１２．　１．～１１．のいずれか一つに記載の培養キャリア基材であって、
　前記培養面に形成された細胞シートを凍結保存するために用いる、培養キャリア基材。
１３．　１．～１２．のいずれか一つに記載の培養キャリア基材であって、
　前記培養面に形成された細胞シートを移植部位に貼り付けるために用いる、培養キャリア基材。
＜Ｂ．細胞シート付き培養キャリア基材＞
　細胞シート付き培養キャリア基材の参考形態Ｂとして、以下の１．～２１．が挙げられる。
１．　培養キャリア基材と、細胞シートとの積層体を有しており、
　前記細胞シートが、前記培養キャリア基材の前記培養面側における表面の少なくとも５０％を被覆した状態である、細胞シート付き細胞シート付き培養キャリア基材。
２．　１．に記載の細胞シート付き細胞シート付き培養キャリア基材であって、
　前記培養キャリア基材の基材厚みが５μｍ以上２５０μｍ以下である、細胞シート付き培養キャリア基材。
３．　１．または２．に記載の細胞シート付き培養キャリア基材であって、
　前記培養面が、親水化処理がなされている、細胞シート付き培養キャリア基材。
４．　３．に記載の細胞シート付き培養キャリア基材であって、
　前記親水化処理は、ＵＶオゾン処理あるいはプラズマ処理された、細胞シート付き培養キャリア基材。
５．　１．～４．のいずれか一つに記載の細胞シート付き培養キャリア基材であって、
　前記培養キャリア基材がポリエーテルエーテルケトンフィルムまたはポリエチレンテレフタレートフィルムである、細胞シート付き培養キャリア基材。
６．　１．～５．のいずれか一つに記載の細胞シート付き培養キャリア基材であって、
　前記培養面が、温度応答性ポリマーを含まない、細胞シート付き培養キャリア基材。
７．　１．～６．のいずれか一つに記載の細胞シート付き培養キャリア基材であって、
　前記培養キャリア基材の面積が、０．３ｃｍ２以上１０００ｃｍ２以下である、細胞シート付き培養キャリア基材。
８．　１．～７．のいずれか一つに記載の細胞シート付き培養キャリア基材であって、
　前記培養キャリア基材が、樹脂材料からなる樹脂層を１層または２層以上含む、細胞シート付き培養キャリア基材。
９．　１．～８．のいずれか一つに記載の細胞シート付き培養キャリア基材であって、
　前記培養面を、レーザー顕微鏡で測定した際に、１００μｍ四方の観測範囲の少なくとも一つにおいて、直径１μｍ以上１００μｍ以下、かつ深さ０．５μｍ以上１００μｍの穴が３つ以下である、細胞シート付き培養キャリア基材。
１０．　１．～９．のいずれか一つに記載の細胞シート付き培養キャリア基材であって、
　空隙率が１５％以下である、細胞シート付き培養キャリア基材。
１１．　１．～１０．のいずれか一つに記載の細胞シート付き培養キャリア基材であって、
　前記培養面における水接触角が７０°以下である、細胞シート付き培養キャリア基材。
１２．　１．～１１．のいずれか一つに記載の細胞シート付き培養キャリア基材であって、
　培養面に培養された細胞シートを搬送するために用いられる、細胞シート付き培養キャリア基材。
１３．　１．～１２．のいずれか一つに記載の細胞シート付き培養キャリア基材であって、
　前記培養面に形成された細胞シートを凍結保存するために用いる、細胞シート付き培養キャリア基材。
１４．　１．～１３．のいずれか一つに記載の細胞シート付き培養キャリア基材であって、
　前記培養面に形成された細胞シートを移植部位に貼り付けるために用いる、細胞シート付き培養キャリア基材。
１５．　１．～１４．のいずれか一つに記載の細胞シート付き培養キャリア基材であって、
　細胞移植療法に用いる、細胞シート付き培養キャリア基材。
１６．　１．～１５．のいずれか一つに記載の細胞シート付き培養キャリア基材であって、
　細胞移植療法が、細胞、組織、臓器の欠損及び機能障害、機能不全に関連する症状の発症及び再発を抑制、防止の少なくとも一つを含むものである、細胞シート付き培養キャリア基材。
１７．　１．～１６．のいずれか一つに記載の細胞シート付き培養キャリア基材であって、
　脊髄損傷、膝関節軟骨損傷、虚血性心疾患、加齢黄斑変性、角膜上皮幹細胞疲弊症、再生不良性貧血、重症下肢虚血、難治性皮膚潰瘍、術後合併症予防、熱傷の少なくとも一つを治療するために用いる、細胞シート付き培養キャリア基材。
１８．　１．～１７．のいずれか一つに記載の細胞シート付き培養キャリア基材であって、
　細胞シートの培養工程、細胞シートの凍結保存工程、細胞シートの凍結物の解凍工程、および細胞シートの被移植部位への貼り付け工程の少なくとも一つを含む、移植方法に用いる、細胞シート付き培養キャリア基材。
１９．　１．～１８．のいずれか一つに記載の細胞シート付き培養キャリア基材を含む移植材料。
２０．　１９．に記載の移植材料であって、
　疾病部位に細胞シートを貼り付けるために用いる、移植材料。
２１．　１９．または２０．に記載の移植材料であって、
　脊髄損傷、膝関節軟骨損傷、虚血性心疾患、加齢黄斑変性、角膜上皮幹細胞疲弊症、再生不良性貧血、重症下肢虚血、難治性皮膚潰瘍、術後合併症予防、熱傷の少なくとも一つを治療するための治療用の移植材料。
　上記の細胞シート付き培養キャリア基材は、参考形態Ａの１．～１３．のいずれか一つの培養キャリア基材を含んでもよい。
＜Ｃ．細胞シート付き培養キャリア基材の凍結物＞
　細胞シート付き培養キャリア基材の凍結物の参考形態Ｃとして、以下の１．～８．が挙げられる。
１．　培養キャリア基材と、
　前記培養キャリア基材の表面に形成された細胞シート、を含み、
　前記培養キャリア基材および前記細胞シートが凍結保存状態である、凍結物。
２．　１．に記載の凍結物であって、
　－１９６℃～－６０℃で凍結保存状態である、凍結物。
３．　１．に記載の凍結物であって、
　－１９６℃～－１３５℃で凍結保存状態である、凍結物。
４．　１．に記載の凍結物であって、
　－１３４℃～－６０℃で凍結保存状態である、凍結物。
５．　１．～４．のいずれか一つに記載の凍結物であって、
　凍結保存液を含む、凍結物。
６．　５．に記載の凍結物であって、
　前記凍結保存液が、培養液成分および凍結保護剤の少なくとも一つを含む、凍結物。
７．　５．または６．に記載の凍結物であって、
　前記保存液が、ＤＭＳＯを含まない、凍結物。
８．　１．～４．のいずれか一つに記載の凍結物であって、
　前記培養キャリア基材および前記細胞シートの全体が凍結保存液で覆われた凍結保存状態である、凍結物。
　上記の細胞シート付き培養キャリア基材の凍結物において、参考形態Ａの１．～１３．のいずれか一つの培養キャリア基材を含んでもよく、参考形態Ｂの１．～２１のいずれか一つの細胞シート付き培養キャリア基材を含んでもよい。
＜Ｄ．包装体＞
　包装体の参考形態Ｄとして、以下の１．～８．が挙げられる。
１．　培養キャリア基材と、前記培養キャリア基材を包装する包装材料と、を備える、包装体。
２．　培養キャリア基材と、キャリア基材の培養面に形成された細胞シートと、を含む細胞シート付き培養キャリア基材と、
　前記細胞シート付き培養キャリア基材を包装する包装材料と、を備える、包装体。
３．　培養キャリア基材と、キャリア基材の培養面に形成された細胞シートと、を含む細胞シート付き培養キャリア基材の凍結物と、
　前記凍結物を包装する包装材料と、を備える、包装体。
４．　１．～３．のいずれか一つに記載の包装体であって、
　前記包装材料の内部に、培養容器および／または凍結保存容器を含む、包装体。
５．　１．～４．のいずれか一つに記載の包装体であって、
　前記包装材料の内部が密封された状態である、包装体。
６．　１．～５．のいずれか一つに記載の包装体であって、
　搬送および／または保管するために用いられる、包装体。
　上記の包装体において、参考形態Ａの１．～１３．のいずれか一つの培養キャリア基材を含んでもよく、参考形態Ｂの１．～２１のいずれか一つの細胞シート付き培養キャリア基材を含んでもよく、参考形態Ｃの１．～８のいずれか一つの細胞シート付き培養キャリア基材の凍結物を含んでもよい。
＜Ｅ．凍結保存方法、または解凍方法＞
　凍結保存方法または解凍方法の参考形態Ｅとして、以下の１．～１０．が挙げられる。
１．　培養キャリア基材と前記培養キャリア基材の表面に形成された細胞シートとを含む細胞シート付き培養キャリア基材を、凍結保存液中で冷却する冷却工程を含む、凍結保存方法。
２．　１．に記載の凍結保存方法であって、
　前記冷却工程において、前記細胞シート付き培養キャリア基材を、凍結保存液中で非貫流式の冷却装置を用いて冷却する、凍結保存方法。
３．　１．または２．に記載の凍結保存方法であって、
　前記冷却工程において、０～－５℃における冷却速度が、０．１℃／分以上１５℃／分以下である、凍結保存方法。
４．　１．～３．のいずれか一つに記載の凍結保存方法であって、
　前記冷却工程の後、－１９６～－６０℃にて前記細胞シート付き培養キャリア基材を保存する、凍結保存工程を含む、凍結保存方法。
５．　１．～４．のいずれか一つに記載の凍結保存方法であって、
　前記冷却工程により、前記培養キャリア基材および前記細胞シートを含む凍結物を得る、凍結保存方法。
６．　培養キャリア基材と、
　前記培養キャリア基材の表面に形成された細胞シート、を含み、
　前記培養キャリア基材および前記細胞シートが凍結保存状態である、凍結物を解凍する解凍工程を含む、解凍方法。
７．　６．に記載の解凍方法であって、
　１．～４．のいずれか一つに記載の凍結保存方法の冷却工程の後、前記解凍工程を含む、解凍方法。
８．　６．または７．に記載の解凍方法であって、
　５．に記載の凍結保存方法で得られた凍結物を解凍する解凍工程を含む、解凍方法。
９．　６．～８．のいずれか一つに記載の解凍方法であって、
　前記解凍工程において、解凍時の環境温度が０℃以上５０℃未満である、解凍方法。
１０．　６．～９．のいずれか一つに記載の解凍方法であって、
　前記解凍工程において、解凍時間が１０秒超、６０分以下である、解凍方法。
　上記の凍結保存方法または凍結方法において、参考形態Ａの１．～１３．のいずれか一つの培養キャリア基材を含んでもよく、参考形態Ｂの１．～２１のいずれか一つの細胞シート付き培養キャリア基材を含んでもよい。
　凍結保存方法で得られた凍結物は、参考形態Ｃの１．～８．のいずれか一つの細胞シート付き培養キャリア基材の凍結物を含んでもよい。
　また、凍結保存方法で得られた凍結物および／または解凍方法で得られた解凍物は、後述の移植方法に使用できる。
＜Ｆ．細胞シート付き培養キャリア基材の製造方法＞
　細胞シート付き培養キャリア基材の製造方法の参考形態Ｆとして、以下の１．～３．が挙げられる。
１．　培養容器の内部に、複数の細胞、培地、および培養キャリア基材を導入して、前記培養キャリア基材の培養面に細胞シートを培養する、培養工程と、
　前記培養容器から、前記細胞シート付きの前記培養キャリア基材を取り出す、取出工程と、を含む、細胞シート付き培養キャリア基材の製造方法。
２．　１．に記載の細胞シート付き培養キャリア基材の製造方法であって、
　前記培養工程において、前記培養キャリア基材を培養容器の内部に固着せずに、前記細胞シートを培養する、細胞シート付き培養キャリア基材の製造方法。
３．　１．または２．に記載の細胞シート付き培養キャリア基材の製造方法であって、
　前記取出工程において、前記培養容器から前記培養キャリア基材を物理的手段により分離する操作が不要である、細胞シート付き培養キャリア基材の製造方法。
　上記細胞シート付き培養キャリア基材の製造方法において、参考形態Ａの１．～１３．のいずれか一つの培養キャリア基材を含んでもよい。
＜Ｇ．移植方法＞
　移植方法の参考形態Ｇとして、以下の１．～２５．が挙げられる。
１．　培養キャリア基材と前記培養キャリア基材の培養面に形成された細胞シートとを含む細胞シート付き培養キャリア基材を用いて、前記細胞シートを被移植部位に貼り付けた後、前記細胞シートから前記培養キャリア基材を剥離する、移植工程と、を含む、移植方法。
２．　１．に記載の移植方法であって、
　前記移植工程において、前記培養キャリア基材と、前記細胞シートとの積層体を有しており、前記細胞シートが、前記培養キャリア基材の前記培養面側における表面の少なくとも５０％を被覆した状態である、前記細胞シート付き培養キャリア基材を用いる、移植方法。
３．　１．又は２．に記載の移植方法であって、
　前記移植工程において、包装体から前記細胞シート付き培養キャリア基材を取り出して用いる、または、包装体から前記細胞シート付き培養キャリア基材の凍結物を取り出し、当該凍結物を解凍してから用いる、移植方法。
４．　１．～３．のいずれか一つに記載の移植方法であって、
　前記培養キャリア基材の前記培養面に前記細胞シートを培養し、前記細胞シート付き培養キャリア基材を得る、培養工程を含む、移植方法。
５．　４．に記載の移植方法であって、
　前記培養工程において、前記培養キャリア基材の前記培養面および側面のそれぞれの少なくとも一部が培養液に接触した状態で、前記細胞シートを培養する、移植方法。
６．　４．または５．に記載の移植方法であって、
　前記培養工程において、前記培養キャリア基材を重りにより荷重固定した状態手段および／または前記培養キャリア基材を器具により位置固定した状態で、前記細胞シートを培養する、移植方法。
７．　４．～６．のいずれか一つに記載の移植方法であって、
　前記培養工程において、培養する細胞の密度が、５×１０２細胞／ｃｍ２以上１×１０９細胞／ｃｍ２以下である、移植方法。
８．　４．～７．のいずれか一つに記載の移植方法であって、
　前記培養キャリア基材の基材厚みが１０μｍ超であり、前記培養工程において、前記培養キャリア基材が培養容器の内部に固着されずに自立膜として機能する、移植方法。
９．　１．～８．のいずれか一つに記載の移植方法であって、
　前記細胞シート付き培養キャリア基材を凍結保存液中で冷却し、前記細胞シート付き培養キャリア基材の凍結物を得る冷却保存工程を含む、移植方法。
１０．　１．～９．のいずれか一つに記載の移植方法であって、
　前記細胞シート付き培養キャリア基材の凍結物を解凍する解凍工程を含む、移植方法。
１１．　１．～１０．のいずれか一つに記載の移植方法であって、
　前記培養キャリア基材の基材厚みが５μｍ以上２５０μｍ以下であり、
　前記培養キャリア基材がポリエーテルエーテルケトンフィルムまたはポリエチレンテレフタレートフィルムであり、
　前記培養キャリア基材の前記培養面は親水化処理がなされている、移植方法。
１２．　１．～１１．のいずれか一つに記載の移植方法であって、
　前記移植工程において、貼り付けた後から剥離するまでの時間が、１０分以下である、移植方法。
１３．　１．～１２．のいずれか一つに記載の移植方法であって、
　前記細胞シートの面積が、０．３ｃｍ２以上である、移植方法。
１４．　１．～１３．のいずれか一つに記載の移植方法であって、
　前記移植工程の後、前記剥離後における前記培養キャリア基材上の前記細胞シートの残存率は、面積比換算で、５０％以下である、移植方法。
１５．　１．～１４．のいずれか一つに記載の移植方法であって、
　前記細胞シートの厚みが、０．００１ｍｍ以上２．０ｍｍ以下である、移植方法。
１６．　１．～１５．のいずれか一つに記載の移植方法であって、
　前記培養キャリア基材の面積が、０．３ｃｍ２以上１０００ｃｍ２以下である、移植方法。
１７．　１．～１６．のいずれか一つに記載の移植方法であって、
　前記培養キャリア基材が、樹脂材料からなる樹脂層を１層または２層以上含む、移植方法。
１８．　１．～１７．のいずれか一つに記載の移植方法であって、
　前記培養面を、レーザー顕微鏡で測定した際に、１００μｍ四方の観測範囲の少なくとも一つにおいて、直径１μｍ以上１００μｍ以下、かつ深さ０．５μｍ以上１００μｍの穴が３つ以下である前記培養キャリア基材を用いる、移植方法。
１９．　１．～１８．のいずれか一つに記載の移植方法であって、
　前記培養キャリア基材の空隙率が１５％以下である、移植方法。
２０．　１．～１９．のいずれか一つに記載の移植方法であって、
　前記培養キャリア基材の前記培養面における水接触角が７０°以下である、移植方法。
２１．　１．～２０．のいずれか一つに記載の移植方法であって、
　前記培養キャリア基材の前記培養面における細胞堆積可能領域のうち、前記細胞シートが５０％以上１００％以下被覆した状態となる、細胞シート付き培養キャリア基材を得る、移植方法。
２２．　１．～２１．のいずれか一つに記載の移植方法であって、
　細胞移植療法に用いる、移植方法。
２３．　２２．に記載の移植方法であって、
　細胞移植療法が、細胞、組織、臓器の欠損及び機能障害、機能不全に関連する症状の発症及び再発を抑制、防止の少なくとも一つを含むものである、移植方法。
２４．　１．～２３．のいずれか一つに記載の移植方法であって、
　前記移植工程において、疾病部位に前記細胞シートを貼り付ける、移植方法。
２５．　１．～２４．のいずれか一つに記載の移植方法であって、
　前記疾病が、脊髄損傷、膝関節軟骨損傷、虚血性心疾患、加齢黄斑変性、角膜上皮幹細胞疲弊症、再生不良性貧血、重症下肢虚血、難治性皮膚潰瘍、術後合併症予防、熱傷の少なくとも一つを含む、移植方法。
　上記の移植方法において、参考形態Ａの１．～１３．のいずれか一つの培養キャリア基材を含んでもよく、参考形態Ｂの１．～２１のいずれか一つの細胞シート付き培養キャリア基材を含んでもよく、参考形態Ｃの１．～８．のいずれか一つの細胞シート付き培養キャリア基材の凍結物を含んでもよい。
　また、上記の移植方法において、参考形態Ｆの１．～３．のいずれか一つの細胞シート付き培養キャリア基材の製造方法またはその培養工程を含んでもよく、参考形態Ｅの１．～１０．のいずれか一つの凍結保存方法または解凍方法を含んでもよい。
　また、参考形態Ｈとして、参考形態Ａの１．～１３．のいずれか一つの培養キャリア基材、参考形態Ｂの１．～２１のいずれか一つの細胞シート付き培養キャリア基材、および参考形態Ｃの１．～８．のいずれか一つの細胞シート付き培養キャリア基材の凍結物の少なくとも一つを用いる、細胞、組織、臓器の欠損及び機能障害、機能不全に関連する症状の発症及び再発を抑制、防止の少なくとも一つを含む治療方法が挙げられる。この治療方法は、かかる関連する症状として、上述の疾病の少なくとも一つを含んでもよい。
　また、参考形態Ｉとして、細胞、組織、臓器の欠損及び機能障害、機能不全に関連する症状の発症及び再発を抑制、防止の少なくとも一つを含む治療するための、参考形態Ａの１．～１３．のいずれか一つの培養キャリア基材、参考形態Ｂの１．～２１のいずれか一つの細胞シート付き培養キャリア基材、および参考形態Ｃの１．～８．のいずれか一つの細胞シート付き培養キャリア基材の凍結物の少なくとも一つの使用が挙げられる。この使用は、かかる関連する症状として、上述の疾病の少なくとも一つを含んでもよい。
　また、参考形態Ｊとして、細胞、組織、臓器の欠損及び機能障害、機能不全に関連する症状の発症及び再発を抑制、防止の少なくとも一つを含む治療するための治療薬の製造における、参考形態Ａの１．～１３．のいずれか一つの培養キャリア基材、参考形態Ｂの１．～２１のいずれか一つの細胞シート付き培養キャリア基材、および参考形態Ｃの１．～８．のいずれか一つの細胞シート付き培養キャリア基材の凍結物の少なくとも一つの使用が挙げられる。この使用は、かかる関連する症状として、上述の疾病の少なくとも一つを含んでもよい。
　以下、本発明について実施例を参照して詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例の記載に何ら限定されるものではない。
［実施例１］
＜培養キャリア基材の製造＞
　ＰＥＥＫフィルム（信越ポリマー社製、ポリエーテルエーテルケトンフィルム、Ｓｈｉｎ－Ｅｔｓｕ　Ｓｅｐｌａ　Ｆｉｌｍ（登録商標）　低結晶タイプ　１２μｍ厚さ）の培養面（表面）に対して、プラズマ処理を実施した。プラズマ処理後における表面粗さは、プラズマ処理前よりも粗面化されており、そのＲａが０．６ｎｍであった。なお、Ｒａの測定を以下のように行った。ＡＦＭ（島津製作所製ＳＰＭ－９７００）を用い、探針は先端径が小さいシリコン単結晶探針（曲率半径約１０ｎｍ）を用いた。表面を範囲１μｍ×１μｍで観察した。Ｒａの算出には装置に付属する解析ソフトを用い、ＸおよびＹ方向の平滑化処理を行った後に、異物や表面の傷を避けた範囲１００ｎｍ×１００ｎｍで表面粗さ解析を実行した。算術平均粗さＲａは、基準長さ内での基準線からの距離の平均値である。
　また、ＰＥＥＫフィルムは、空隙率が５％以下であり、培養面をレーザー顕微鏡で測定した際に、１００μｍ四方の範囲に、直径１μｍ以上１００μｍ以下、かつ深さ０．５μｍ以上１００μｍの穴が１つもない、中実なフィルムであった。空隙率は、「｛１－（実測密度／理論密度）｝×１００」から算出した。
　その後、得られた表面処理済みのフィルムをΦ３３．５ｍｍサイズに切断し、円盤状の培養キャリア基材を得た。
＜細胞シートの製造＞
　上記＜培養キャリア基材の製造＞で製造された培養キャリア基材を、７０％エタノール、リン酸緩衝液、培地の順に洗浄した後、細胞培養マルチウェルプレート（６穴）における各穴の平底にそれぞれ設置した。このとき、培養キャリア基材の培養面がウェルプレートの開口を向くように、すなわち培養キャリア基材の裏面がウェルプレートの穴部の平底と接触するように配置した。ただし、培養キャリア基材とウェルプレート（培養容器）の内部とを固着させなかった。
　凍結保存されたヒト線維芽細胞（ヒト口腔内組織由来）を３７℃で解凍し、培地を用いて洗浄した。５×１０５個の細胞を５％血清含有培地に懸濁し、２枚のディッシュ（６０．１ｃｍ２）に２．５×１０５個ずつ播種した後、３日間培養した。培養した細胞を回収し、５％血清含有培地に懸濁し、４個のフラスコ（２２５ｃｍ２）に２．５×１０５個ずつ播種して継代した後、４日間培養した。
　培養した細胞を回収し、２％血清含有培地に懸濁し、培養キャリア基材が設置済みの細胞培養マルチウェルプレート中の各穴に５５．８×１０４個／ｃｍ２の播種密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ２の環境で１日間インキュベートし、培養キャリア基材の培養面上に細胞シートを作製した。
＜移植＞
　上記＜細胞シートの製造＞の後、マルチプレートから細胞シート付き培養キャリア基材を取り出した。取り出した細胞シート付き培養キャリア基材を、別の場所に用意した、細胞組織を模した豚肉片（被移植部位）の上まで搬送した。細胞シートの表面を豚肉片の表面に貼り付けた後、細胞シートから培養キャリア基材を剥離した。
　なお、貼付後剥離するまでの間、特に基材を冷却することは行わなかったため、基材の温度は３０℃以上が保たれていた。
［実施例２］
　上記＜培養キャリア基材の製造＞において、ポリエーテルエーテルケトンフィルムに代えて、厚さ２５μｍのＰＥＴフィルム（東レ社製、ポリエチレンテレフタレートフィルム、ルミラー（登録商標））を使用した以外、実施例１と同様に、＜培養キャリア基材の製造＞、＜細胞シートの製造＞および＜移植＞を実施した。
［実施例３］
　上記＜培養キャリア基材の製造＞において、表面処理済みのフィルムの切断サイズをΦ３３．５ｍｍに代えて、Φ１４．０ｍｍとし、上記＜細胞シートの製造＞において、播種の際に、２４穴・平底の細胞培養マルチウェルプレートの使用、および播種密度を２７．９×１０４個／ｃｍに変更した以外は、実施例１と同様に、＜細胞シートの製造＞および＜移植＞を実施した。
［比較例１］
　上記＜培養キャリア基材の製造＞で製造された培養キャリア基材を使用しないで、＜細胞シートの製造＞において、接着細胞用マルチウェルプレートの穴内の平底上に細胞シートを製造し、＜移植＞において、その平底から細胞シートを剥離したものを、豚肉片の表面に貼り付けた以外、実施例１と同様に、＜細胞シートの製造＞および＜移植＞を実施した。
［比較例２］
　上記＜培養キャリア基材の製造＞において、基材の培養面に対してプラズマ処理を実施しない以外、実施例１と同様に、＜培養キャリア基材の製造＞、＜細胞シートの製造＞および＜移植＞を実施した。
［比較例３］
　上記＜培養キャリア基材の製造＞において、基材の培養面に対してプラズマ処理を実施しない以外、実施例２と同様に、＜培養キャリア基材の製造＞、＜細胞シートの製造＞および＜移植＞を実施した。
　各実施例、各比較例について、細胞シートの培養および移植について評価を行った。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　実施例１～３は、＜細胞シートの製造＞において、細胞シートが基材培養面の１００％以上を被覆している、細胞シート付き培養キャリア基材を得ることができた。
　＜移植＞において、細胞シート付き培養キャリア基材は、マルチプレートに固着されていないため、容易に取り出すことができた。なお、実施例２のＰＥＴフィルムでは、細胞シートを少しピンセットで押さえて基材を剥離したが、実施例１および３のＰＥＥＫフィルムでは、細胞シートを押さえずに基材をスライドすることでより容易に剥離でき、取扱容易性に優れることが分かった。
　また、＜移植＞において、細胞シートから培養キャリア基材が容易に取れた。具体的には、細胞シートと豚肉はすぐに密着するため、貼付から剥離まで１分以内に行った。つまり、移植時の操作が簡便となるため操作時間を短時間化することが可能となる。なお、＜移植＞の後、豚肉上で細胞シートを培養する必要はなかった。
　実施例１～３結果より、プラズマ処理されたＰＥＥＫフィルムまたはプラズマ処理されたＰＥＴフィルムを培養キャリア基材として使用することにより、細胞シートの培養と移植の両方を実施できることが確認できた。
　また、実施例１～３の＜移植＞の剥離後において、培養キャリア基材の培養面に残存する細胞シートは、面積比換算で、１％以下であった。このため、移植工程時の細胞シート残りを低減することが可能となる。なお、細胞シートから培養キャリア基材を剥離する際、培養前の培養面にディスパーゼ処理を施すことは不要であった。
　比較例１では、＜細胞シートの製造＞において、接着細胞用マルチウェルプレート内で細胞シートを製造できた。しかしながら、＜移植＞において、接着細胞用マルチウェルプレートから細胞シートを取り出す際に鑷子等で細胞シートが破損しないように、接着細胞用マルチウェルプレートの平底から細胞シートを剥がす操作が困難であった。また、細胞シートを剥がすことができたとしても、細胞シートを把持することができず細胞シートの貼り付け作業が困難であった。
　比較例２、３では、細胞シートが製造できなかったので、移植操作を実施しなかった。
［実施例４］
＜細胞シートの製造＞
　実施例１の＜培養キャリア基材の製造＞で表面処理済みのフィルムの切断サイズをΦ３３．５ｍｍに代えて、Φ１４．０ｍｍとして得られた培養キャリア基材を用いて、播種の際に、２４穴・平底の細胞培養マルチウェルプレートの使用、および播種密度を２７．９×１０４個／ｃｍ２に変更した以外は、実施例１の＜細胞シートの製造＞と同様にして、培養キャリア基材の培養面上に細胞シート（培養キャリア基材付きの細胞シート）を製造した。
　なお、下記の手順に従って、凍結前の細胞活性率を測定した。
＜細胞シートの凍結保存＞
　上記＜細胞シートの製造＞の後、細胞培養マルチウェルプレートを氷上に設置し、培養キャリア基材付きの細胞シートをリン酸緩衝液で洗浄した後、凍結保護剤（ＳＴＥＭＣＥＬＬ－ＢＡＮＫＥＲ　ＧＭＰ　ｇｒａｄｅ、日本全薬工業社製））を０．３ｍＬ／ウェルとなるように添加した。
　その後、細胞培養マルチウェルプレートをチャック付きポリ袋で包装した包装体を、－３５℃に冷やされた非貫流方式の冷却装置（３Ｄフリーザー（登録商標）、ＫＳＳ－４０ＢＬＷ－２４００Ｖ、コガサン社製）に投入し、３０分間保持した。なお、０～－５℃における冷却速度は３．４℃／分であった。
　その後、冷却処理された包装体を速やかに、－８０℃の冷凍庫（ＲＤＥ５００８６ＦＤ型　超低温フリーザー、ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に投入し、１時間保持した。
　Ｋ熱電対を用いて、８０℃の冷凍庫で保存された細胞シート（培養キャリア基材付きの細胞シート）の温度を測定したところ、－７０℃であった。
＜細胞シートの解凍＞
　上記凍結期間の後、－８０℃の冷凍庫から包装体を取り出し、その中にある細胞培養マルチウェルプレートを安全キャビネット内の室温で解凍した。この時の解凍時間は１６分であった。解凍後、細胞シートの外観は良好であった。
　解凍後、凍結保護剤を吸引し、２％血清含有培地を２ｍＬ加えた。その後、３７℃、５％ＣＯ２の環境で２４時間インキュベートした。インキュベート後、細胞活性を測定した。その結果、凍結前の細胞活性をＣ０とし、凍結後の細胞活性をＣ１としたとき、（Ｃ１／Ｃ０）×１００により算出される「凍結前後の細胞活性の変動割合」が８９％であることが分かった。また、培養上清を回収し、－８０℃で上清を凍結した翌日以降に血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）および肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の測定を実施したところ、上清中のＶＥＧＦは１４５１ｐｇであり、ＨＧＦは４６０８ｐｇであることが分かった。
（解凍時間の測定方法）
　解凍時間は、凍結保護剤を加えて、凍結保存した凍結物を解凍するのに要した時間であって、解凍される環境に曝された時点から、凍結物が完全に液体となった時点を終点として、解凍時間を測定した。
（細胞活性率の測定）
　細胞活性は、生細胞数測定試薬（Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔ　Ｒｅａｇｅｎｔ　ＳＦ、ナカライテスク社製）とプレートリーダー（ｉＭａｒｋ、ＢＩＯ－ＲＡＤ社製）を用いて測定した。生細胞測定試薬を培地で２０倍希釈（試薬／培地＝１／１９体積比）して試験溶液を作製した。培養後の細胞シートを含む細胞培養マルチウェルプレートの各ウェルの上清を吸引し、試験溶液を０．５ｍＬ／ウェルずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２の環境で１時間インキュベートした。インキュベート後、細胞培養マルチウェルプレート（９６穴、ＣＯＲＮＩＮＧ社製）に上清を０．１ｍＬ／ウェル加え、この上清をプレートリーダーで測定した。細胞活性の計算は以下のとおりである。
・細胞活性［Ａｂｓ．］＝｛測定試料の吸光度［吸光度（４５０ｎｍ）－測定試料の吸光度（６３０ｎｍ）］｝－｛ブランクの吸光度［吸光度（４５０ｎｍ）－ブランクの吸光度（６３０ｎｍ）］｝
　ブランクは試験溶液を用いた。
（血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）および肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の測定）
　血管新生に関わるサイトカインとしてＶＥＧＦおよびＨＧＦを測定した。これらサイトカインは、それぞれＶＥＧＦ，Ｈｕｍａｎ，ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ，Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（９６ｗｅｌｌ）（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ＤＶＥ００）、ＨＧＦ，Ｈｕｍａｎ，ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ，Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（９６ｗｅｌｌ）（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ＤＨＧ００Ｂ）とプレートリーダー（ｉＭａｒｋ、ＢＩＯ－ＲＡＤ社製）を用いて測定した。使用方法は、各キットの使用説明書に従って使用した。試験サンプルは、解凍後に２４時間培養した上清を回収し凍結保存した。凍結翌日以降の測定時に試験サンプルを解凍した。またキットに付属している希釈液で試験サンプルを２～４倍に希釈して測定を行った。検量線は、各キットに付属するスタンダードを使用した。各サンプルおよび検量線用スタンダードの吸光度は以下の計算式から算出し、得られた吸光度を検量線に当てはめてＶＥＧＦおよびＨＧＦの濃度を算出した。
・サンプルおよび検量線用スタンダードの吸光度［Ａｂｓ．］＝吸光度（４５０ｎｍ）－吸光度（５７０ｎｍ）
＜解凍後の移植＞
　解凍後の培養キャリア基材付きの細胞シートを細胞培養マルチプレートから取り出し、細胞シート面を豚肉へ貼付し、基材を剥離した。なお、貼付後剥離するまでの間、特に基材を加熱や冷却することは行わなかったため、基材の温度は室温（２３℃）が保たれていた。
［実施例５～１１］
　上記＜細胞シートの凍結保存＞の凍結期間を表２に示す値に変更した以外、実施例４と同様にして、＜細胞シートの製造＞、＜細胞シートの凍結保存＞、＜細胞シートの解凍＞、および＜解凍後の移植＞を実施した。
［比較例４］
　比較例４では、培養キャリア基材を使用せず、かつ、細胞培養マルチウェルプレートをシャーレ（ＵｐＣｅｌｌ（登録商標）、セルシード社製）に変更する以外は、実施例４と同様にして、＜細胞シートの製造＞を実施した。
［比較例５］
　比較例５では、培養キャリア基材を使用せず、かつ、細胞培養マルチウェルプレートを接着細胞用マルチウェルプレート（２４穴）に変更する以外は、実施例４と同様にして、＜細胞シートの製造＞、＜細胞シートの凍結保存＞、および＜細胞シートの解凍＞を実施した。
　各実施例、各比較例について、冷凍保存および解凍後の移植について評価を行った。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　比較例４では、シャーレを冷却する際に、細胞シートがシャーレから剥離したため、細胞シートを凍結保存することができなかった。そのため、凍結後の細胞活性率の測定、および解凍後の移植操作を実施しなかった。
　比較例５では、細胞シートがマルチウェルプレートに密着した状態で凍結保存できたが、凍結前後の細胞活性率の変動割合が低下する結果が示された。
　これに対して、実施例４～１１では、細胞シートが培養キャリア基材に密着したまま冷凍保存でき、凍結前後の細胞活性率の変動割合やＶＥＧＦおよびＨＧＦの少なくとも一方が、比較例５よりも高くなる結果を示した。また、解凍後の移植においても、細胞シートから培養キャリア基材を容易に剥離することができた。なお、細胞シートと豚肉はすぐに密着するため、貼付から剥離まで１分以内に行い、豚肉上で細胞シートを培養する必要はなかった。
　実施例４～１１の結果より、プラズマ処理されたＰＥＥＫフィルムを培養キャリア基材として使用することにより、細胞シートを凍結し、解凍後に移植することが可能であり、また、解凍後の細胞シートは長期間凍結されていても高い細胞活性率を維持できることが確認できた。
［実施例１２～２３］
　上記＜細胞シートの凍結保存＞の凍結期間を表３に示す値に変更し、凍結保護剤をバンバンカー（登録商標）ｈＲＭ（ＣＧリンフォテック社）を使用し、－１５０℃の冷凍庫を使用した以外、実施例４と同様にして、＜細胞シートの製造＞、＜細胞シートの凍結保存＞、＜細胞シートの解凍＞、および＜解凍後の移植＞を実施した。この時の解凍時間は１８分であった。解凍後、細胞シートの外観は良好であった。
　なお、Ｋ熱電対を用いて、－１５０℃の冷凍庫で保存された細胞シート（培養キャリア基材付きの細胞シート）の温度を測定したところ、－１４０℃であった。
　各実施例について、冷凍保存および解凍後の移植について評価を行った。結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　実施例１２～２３では、細胞シートが培養キャリア基材に密着したまま冷凍保存でき、凍結前後の細胞活性率の変動割合やＶＥＧＦおよびＨＧＦのいずれも、比較例５よりも高くなる結果を示した。また、解凍後の移植においても、細胞シートから培養キャリア基材を容易に剥離することができた。なお、細胞シートと豚肉はすぐに密着するため、貼付から剥離まで１分以内に行い、豚肉上で細胞シートを培養する必要はなかった。
［実施例２４～２６］
　上記＜細胞シートの凍結保存＞の凍結期間を表４に示す値に変更した以外、実施例１２と同様にして、＜細胞シートの製造＞、＜細胞シートの凍結保存＞、＜細胞シートの解凍＞、および＜解凍後の移植＞を実施した。
　ただし、各実施例の凍結時の状態を、図３（ａ）～図３（ｃ）に示すように構成した。
　図３（ａ）では、培養キャリア基材１０側が培養容器２０の底面を向くように配置した状態で、図３（ｂ）では、細胞シート４０側が培養容器２０の底面を向くように配置した状態で、図３（ｃ）では、細胞シート４０を２枚の培養キャリア基材１０で挟んだ状態で、＜細胞シートの凍結保存＞、＜細胞シートの解凍＞を実施した。
　各実施例について、冷凍保存および解凍後の移植について評価を行った。結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　実施例２４～２６では、細胞シートが培養キャリア基材に密着したまま冷凍保存でき、凍結前後の細胞活性率の変動割合が、比較例５よりも高くなる結果を示した。また、解凍後の移植においても、細胞シートから培養キャリア基材を容易に剥離することができた。なお、細胞シートと豚肉はすぐに密着するため、貼付から剥離まで１分以内に行い、豚肉上で細胞シートを培養する必要はなかった。
　なお、ＰＥＥＫフィルムは、低線膨張特性を有することから、凍結処理にも有用な培養キャリア基材として用いることができることが分かった。
［実施例２７］
　実施例１２の＜細胞シートの解凍＞に示す方法において、安全キャビネット内の室温での解凍を、デフロスター（ＤＥＣ社製）のヒートシンク上に細胞培養マルチウェルプレートを設置して解凍した以外は、実施例１２と同様にして、＜細胞シートの製造＞、＜細胞シートの凍結保存＞、＜細胞シートの解凍＞および＜解凍後の移植＞を実施した。デフロスターの設定温度は、ヒートシンクの温度を示し、３７℃に設定して解凍した。この時の解凍時間は３分であった。
　なお、Ｋ熱電対を用いて、－１５０℃の冷凍庫で保存された細胞シート（培養キャリア基材付きの細胞シート）の温度を測定したところ、－１４０℃であった。解凍後、細胞シートの外観は良好であった。
［実施例２８］
　実施例２７のデフロスターの設定温度を２０℃にした以外は、実施例２６と同様にして、＜細胞シートの製造＞、＜細胞シートの凍結保存＞、＜細胞シートの解凍＞、および＜解凍後の移植＞を実施した。この時の解凍時間は５分であった。解凍後、細胞シートの外観は良好であった。
［実施例２９］
　実施例２７のデフロスターの設定温度を４℃にした以外は、実施例２６と同様にして、＜細胞シートの製造＞、＜細胞シートの凍結保存＞、＜細胞シートの解凍＞、および＜解凍後の移植＞を実施した。この時の解凍時間は８分であった。解凍後、細胞シートの外観は良好であった。
［実施例３０］
　実施例１２の＜細胞シートの解凍＞に示す方法において、安全キャビネット内の室温での解凍を、４℃に設定した冷蔵庫内での解凍に変更した以外は、実施例２６と同様にして、＜細胞シートの製造＞、＜細胞シートの凍結保存＞、＜細胞シートの解凍＞、および＜解凍後の移植＞を実施した。この時の解凍時間は３７分であった。解凍後、細胞シートの外観は良好であった。
　実施例２７～３０について、細胞シートの外観、細胞活性率の測定、および解凍後の移植について評価を行った。結果を表５に示す。なお、表５には、参考のため、実施例４および実施例１２の結果を再度示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　実施例４、１２、および２７～３０では、いずれも細胞シートの外観に問題はなかった。また、実施例４、１２、および２７～３０は、比較例５と比べて、「凍結前後の細胞活性の変動割合」が高い結果を示した。つまり言い換えると、凍結後の細胞生存率を高く維持できていると言える。この中でも、実施例４、１２、および２７～２９は、凍結時間が相対的に長い実施例３０と比べて、「凍結前後の細胞活性の変動割合」が高いことが分かった。また、いずれの実施例の解凍物は、解凍後の移植も良好に行うことができた。
　上述の実施例１～３０において、ヒト線維芽細胞に代えて、マウス繊維芽細胞を使用しても、同様の結果を示すことが確認できた。
　この出願は、２０２３年７月１４日に出願された日本出願特願２０２３－１１５６２３号および２０２３年１２月２７日に出願された日本出願特願２０２３－２２０５０６を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
１０　培養キャリア基材
１２　培養面（表面）
１４　非培養面（裏面）
２０　培養容器
３０　培養液
４０　細胞シート
５０　細胞シート付き培養キャリア基材
６０　凍結保存液
７０　被移植部位

Claims (26)

  1. 　培養キャリア基材の培養面に細胞シートを培養する、培養工程と、
    　前記培養キャリア基材の前記培養面に形成された前記細胞シートを被移植部位に貼り付けた後、前記細胞シートから前記培養キャリア基材を剥離する、移植工程と、を含む、移植方法。
  2. 　請求項１に記載の移植方法であって、
    　前記培養キャリア基材の基材厚みが５μｍ以上２５０μｍ以下であり、
    　前記培養キャリア基材がポリエーテルエーテルケトンフィルムまたはポリエチレンテレフタレートフィルムであり、
    　前記培養キャリア基材の前記培養面は親水化処理がなされている、移植方法。
  3. 　請求項１または２に記載の移植方法であって、
    　前記培養キャリア基材の基材厚みが１０μｍ超であり、前記培養工程において、前記培養キャリア基材が培養容器の内部に固着されずに自立膜として機能する、移植方法。
  4. 　請求項１～３のいずれか一項に記載の移植方法であって、
    　前記移植工程において、貼り付けた後から剥離するまでの時間が、１０分以下である、移植方法。
  5. 　請求項１～４のいずれか一項に記載の移植方法であって、
    　前記培養工程により得られた前記細胞シートの面積が、０．３ｃｍ２以上である、移植方法。
  6. 　培養面に培養された細胞シートを搬送するために用いられる、培養キャリア基材であって、
    　当該培養キャリア基材の基材厚みが５μｍ以上２５０μｍ以下である、培養キャリア基材。
  7. 　請求項６に記載の培養キャリア基材であって、
    　前記培養キャリア基材の基材厚みが１０μｍ超であり、前記細胞シートの培養中に培養容器の内部に固着されずに自立膜として機能する、培養キャリア基材。
  8. 　請求項６または７に記載の培養キャリア基材であって、
    　前記培養面が、親水化処理がなされている、培養キャリア基材。
  9. 　請求項８に記載の培養キャリア基材であって、
    　前記親水化処理は、プラズマ処理された、培養キャリア基材。
  10. 　請求項６～９のいずれか一項に記載の培養キャリア基材であって、
    　当該培養キャリア基材がポリエーテルエーテルケトンフィルムまたはポリエチレンテレフタレートフィルムである、培養キャリア基材。
  11. 　請求項６～１０のいずれか一項に記載の培養キャリア基材であって、
    　前記培養面が、温度応答性ポリマーを含まない、培養キャリア基材。
  12. 　請求項６～１１のいずれか一項に記載の培養キャリア基材を包装材料で包装した包装体。
  13. 　請求項６～１１のいずれか一項に記載の培養キャリア基材と、細胞シートとの積層体を有しており、
    　前記細胞シートが、前記培養キャリア基材の前記培養面側における表面の少なくとも５０％を被覆した状態である、細胞シート付き培養キャリア基材。
  14. 　請求項１３に記載の細胞シート付き培養キャリア基材であって、
    　前記細胞シートの面積が、０．３ｃｍ２以上である、細胞シート付き培養キャリア基材。
  15. 　培養容器の内部に、複数の細胞、培地、および請求項６～１１のいずれか一項に記載の培養キャリア基材を導入して、前記培養キャリア基材の培養面に細胞シートを培養する、培養工程と、
    　前記培養容器から、前記細胞シート付きの前記培養キャリア基材を取り出す、取出工程と、を含む、細胞シート付き培養キャリア基材の製造方法。
  16. 　請求項１５に記載の細胞シート付き培養キャリア基材の製造方法であって、
    　前記培養工程において、前記培養キャリア基材を培養容器の内部に固着せずに、前記細胞シートを培養する、細胞シート付き培養キャリア基材の製造方法。
  17. 　請求項１５または１６に記載の細胞シート付き培養キャリア基材の製造方法であって、
    　前記取出工程において、前記培養容器から前記培養キャリア基材を物理的手段により分離する操作が不要である、細胞シート付き培養キャリア基材の製造方法。
  18. 　培養キャリア基材と前記培養キャリア基材の表面に形成された細胞シートとを含む細胞シート付き培養キャリア基材を、凍結保存液中で冷却する冷却工程を含む、凍結保存方法。
  19. 　請求項１８に記載の凍結保存方法であって、
    　前記冷却工程において、前記細胞シート付き培養キャリア基材を、凍結保存液中で非貫流式の冷却装置を用いて冷却する、凍結保存方法。
  20. 　請求項１８または１９に記載の凍結保存方法であって、
    　前記冷却工程において、０～－５℃における冷却速度が、０．１℃／分以上１５℃／分以下である、凍結保存方法。
  21. 　請求項１８～２０のいずれか一項に記載の凍結保存方法であって、
    　前記冷却工程の後、－１９６～－６０℃にて前記細胞シート付き培養キャリア基材を保存する、凍結保存工程を含む、凍結保存方法。
  22. 　培養キャリア基材と、
    　前記培養キャリア基材の表面に形成された細胞シート、を含み
    　前記培養キャリア基材および前記細胞シートが凍結保存状態である、細胞シート付き培養キャリア基材の凍結物。
  23. 　請求項２２に記載の細胞シート付き培養キャリア基材の凍結物であって、
    　－１９６℃～－６０℃で凍結保存状態である、細胞シート付き培養キャリア基材の凍結物。
  24. 　請求項２２に記載の細胞シート付き培養キャリア基材の凍結物であって、
    　－１９６℃～－１３５℃で凍結保存状態である、細胞シート付き培養キャリア基材の凍結物。
  25. 　請求項２２に記載の細胞シート付き培養キャリア基材の凍結物であって、
    　－１３４℃～－６０℃で凍結保存状態である、細胞シート付き培養キャリア基材の凍結物。
  26. 　請求項２２～２５のいずれか一項に記載の凍結物を包装材料で包装した包装体。
PCT/JP2024/024961 2023-07-14 2024-07-10 移植方法、培養キャリア基材、包装体、細胞シート付き培養キャリア基材、細胞シート付き培養キャリア基材の製造方法、凍結保存方法、および細胞シート付き培養キャリア基材の凍結物 Pending WO2025018249A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202480046934.0A CN121548437A (zh) 2023-07-14 2024-07-10 移植方法、培养载体基材、包装体、带细胞片的培养载体基材、带细胞片的培养载体基材的制造方法、冷冻保存方法及带细胞片的培养载体基材的冷冻物
JP2025534005A JPWO2025018249A1 (ja) 2023-07-14 2024-07-10
AU2024296215A AU2024296215A1 (en) 2023-07-14 2024-07-10 Transplantation method, culturing carrier substrate, package, culturing carrier substrate with cell sheet, method of manufacturing culturing carrier substrate with cell sheet, cryopreservation method, and frozen product of culturing carrier substrate with cell sheet
KR1020267004208A KR20260042204A (ko) 2023-07-14 2024-07-10 이식 방법, 배양 캐리어 기재, 포장체, 세포 시트 부착 배양 캐리어 기재, 세포 시트 부착 배양 캐리어 기재의 제조 방법, 동결 보존 방법, 및 세포 시트 부착 배양 캐리어 기재의 동결물

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2023115623 2023-07-14
JP2023-115623 2023-07-14
JP2023220506 2023-12-27
JP2023-220506 2023-12-27

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2025018249A1 true WO2025018249A1 (ja) 2025-01-23

Family

ID=94281646

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2024/024961 Pending WO2025018249A1 (ja) 2023-07-14 2024-07-10 移植方法、培養キャリア基材、包装体、細胞シート付き培養キャリア基材、細胞シート付き培養キャリア基材の製造方法、凍結保存方法、および細胞シート付き培養キャリア基材の凍結物

Country Status (6)

Country Link
JP (1) JPWO2025018249A1 (ja)
KR (1) KR20260042204A (ja)
CN (1) CN121548437A (ja)
AU (1) AU2024296215A1 (ja)
TW (1) TW202505021A (ja)
WO (1) WO2025018249A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7737763B1 (ja) * 2025-02-28 2025-09-11 ソラリスバイオ株式会社 細胞の凍結保存用組成物、細胞の凍結方法、および細胞調製物

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005127666A (ja) 2003-10-27 2005-05-19 Air Operation Technologies Inc 冷却装置
WO2006093151A1 (ja) * 2005-02-28 2006-09-08 Cellseed Inc. 培養細胞シート、製造方法及びその利用方法
JP2011115058A (ja) * 2009-12-01 2011-06-16 Terumo Corp 単離されたシート状細胞培養物の製造方法
JP2013247909A (ja) * 2012-05-31 2013-12-12 Japan Tissue Engineering:Kk 培養皿及び培養キット
JP2016013111A (ja) 2014-07-03 2016-01-28 大日本印刷株式会社 底面部を剥離可能な培養容器
JP2022008269A (ja) * 2020-06-27 2022-01-13 国立大学法人山口大学 培養細胞の凍結保存方法及び細胞移植療法に用いるための細胞含有組成物
JP2023115623A (ja) 2022-02-08 2023-08-21 株式会社ジェーシービー プログラム、送金管理装置、及び送金管理方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005127666A (ja) 2003-10-27 2005-05-19 Air Operation Technologies Inc 冷却装置
WO2006093151A1 (ja) * 2005-02-28 2006-09-08 Cellseed Inc. 培養細胞シート、製造方法及びその利用方法
JP2011115058A (ja) * 2009-12-01 2011-06-16 Terumo Corp 単離されたシート状細胞培養物の製造方法
JP2013247909A (ja) * 2012-05-31 2013-12-12 Japan Tissue Engineering:Kk 培養皿及び培養キット
JP2016013111A (ja) 2014-07-03 2016-01-28 大日本印刷株式会社 底面部を剥離可能な培養容器
JP2022008269A (ja) * 2020-06-27 2022-01-13 国立大学法人山口大学 培養細胞の凍結保存方法及び細胞移植療法に用いるための細胞含有組成物
JP2023115623A (ja) 2022-02-08 2023-08-21 株式会社ジェーシービー プログラム、送金管理装置、及び送金管理方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7737763B1 (ja) * 2025-02-28 2025-09-11 ソラリスバイオ株式会社 細胞の凍結保存用組成物、細胞の凍結方法、および細胞調製物

Also Published As

Publication number Publication date
KR20260042204A (ko) 2026-03-30
AU2024296215A1 (en) 2026-02-12
CN121548437A (zh) 2026-02-17
JPWO2025018249A1 (ja) 2025-01-23
TW202505021A (zh) 2025-02-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6861627B2 (ja) シート状細胞培養物の凍結保存方法
JP6948261B2 (ja) 多能性幹細胞または脂肪組織もしくは骨髄由来の間葉系幹細胞由来の心筋細胞の凍結保存方法
AU647803B2 (en) Cryopreservation of cultured epithelial sheets
CN105229145A (zh) 片状细胞培养物的制造方法
WO2025018249A1 (ja) 移植方法、培養キャリア基材、包装体、細胞シート付き培養キャリア基材、細胞シート付き培養キャリア基材の製造方法、凍結保存方法、および細胞シート付き培養キャリア基材の凍結物
WO2018097225A1 (ja) 生細胞または生細胞を含む組成物の保存液
JP7736289B2 (ja) 培養細胞の凍結保存方法及び細胞移植療法に用いるための細胞含有組成物
WO2018097228A1 (ja) 生細胞または生細胞を含む組成物の保存液
JP7262443B2 (ja) 貫通構造を有するシート状細胞培養物
JPWO2018084167A1 (ja) 接着状態の細胞培養物の改変方法
Kirschenlohr et al. Cultures of proliferating vascular smooth muscle cells from adult human aorta
WO2025205329A1 (ja) 細胞培養用フィルム基材、包装体、細胞シート付フィルム基材、細胞シート付フィルム基材の凍結物、細胞培養用フィルム基材の製造方法、および細胞シート付フィルム基材の製造方法
AU639982B2 (en) Cool storage of cultured epithelial sheets
WO2025205330A1 (ja) 細胞培養用フィルム基材の製造方法、細胞培養用フィルム基材、品質管理方法、包装体、細胞シート付フィルム基材、細胞シート付フィルム基材の製造方法、細胞シート付フィルム基材の凍結物、金属箔付きフィルム基材、梱包体、および梱包体の製造方法
WO2018097226A1 (ja) 生細胞または生細胞を含む組成物の保存液
JPH0723779A (ja) 表皮細胞シートの凍結保存用液
JP2002272449A (ja) 肝細胞付培養器及びその製造方法
CN111787959A (zh) 用于消化道再生的片状细胞培养物
WO2025158889A1 (ja) Ｘ線造影材料を含む樹脂フィルム
NZ568555A (en) Method of cryopreserving hepatocytes adhered to a matrix
TW202548005A (zh) 三維細胞培養體的冷凍物、包含三維細胞培養體的冷凍物的容器、細胞冷凍套件、冷凍保存液、冷凍物的製造方法、冷凍物的使用方法、三維細胞培養體之解凍物的製造方法及冷凍保存液的使用方法
CN100463963C (zh) 一种家猪皮肤组织冷冻保存方法
JP2002253206A (ja) 動物細胞の解凍方法
JP2018083793A (ja) 生細胞または生細胞を含む組成物の保存液
WO2020067442A1 (ja) 細胞の凍結保存方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 24843041

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2025534005

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: AU2024296215

Country of ref document: AU

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 1020267004208

Country of ref document: KR

Free format text: ST27 STATUS EVENT CODE: A-0-1-A10-A15-NAP-PA0105 (AS PROVIDED BY THE NATIONAL OFFICE)

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1020267004208

Country of ref document: KR

Ref document number: 202647013976

Country of ref document: IN

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2024296215

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20240710

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2024843041

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 202647013976

Country of ref document: IN

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1020267004208

Country of ref document: KR