WO2017131241A1

WO2017131241A1 - 細胞塊、細胞構造体及び立体組織体

Info

Publication number: WO2017131241A1
Application number: PCT/JP2017/003879
Authority: WO
Inventors: 中山　泰秀; 良輔岩井; 根本　泰
Original assignee: 国立研究開発法人国立循環器病研究センター; 株式会社ブリヂストン
Priority date: 2016-01-29
Filing date: 2017-01-27
Publication date: 2017-08-03
Also published as: US20210395687A1; US20210395688A1; US11697797B2

Abstract

本発明は温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物で被覆された培養面により、細胞塊、細胞構造体、又は立体組織体を効率よく製造する方法を提供することを目的とする。本発明の細胞塊、細胞構造体、又は立体組織体の製造方法は、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物で被覆された培養面に、細胞を播種し、培養することを特徴とする。

Description

細胞塊、細胞構造体及び立体組織体

　本発明は、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物で被覆された培養面により、細胞塊、細胞構造体、又は立体組織体を効率よく製造する方法、及びその方法により得られる細胞塊、細胞構造体、又は立体組織体に関する。
　特に、本発明（Ｉ）は、軟骨細胞塊及び移植材料の製造方法、軟骨細胞塊及び移植材料並びに複合材に関する。また、本発明（ＩＩ）は、上皮系細胞の培養方法、細胞構造体の製造方法、及び上皮系細胞用細胞培養器に関する。また、本発明（ＩＩＩ）は、立体組織体の作製装置、及び立体組織体の作製方法に関する。また、本発明（ＩＶ）は、細胞構造体の製造方法に関する。また、本発明（Ｖ）は、細胞構造体の製造方法、細胞構造体、細胞培養器に関する。また、本発明（ＶＩ）は、細胞構造体の製造方法に関する。また、本発明（ＶＩＩ）は、細胞構造体の製造方法に関する。

　発明（Ｉ）に関し、近年、患者のＱＯＬの向上を目的として、オーダーメイド医療の実現が望まれている。オーダーメイド医療では、患者自身の細胞を用いて機能障害や機能欠損に陥った組織や臓器の再生を図る、再生医療が主要な役割を担う。
　ここで、再生医療は、患者の組織から採取した細胞を、細胞培養器中で培養し、組織を形成させ、その後、その組織を患者に移植するというオペレーションを必要とする。そのため、細胞を培養して、組織等の細胞構造体を形成させる技術や、細胞構造体をそのままの状態で回収する技術が所望されている。

　一般的に、生体外に取り出された細胞は、その遺伝子制御に乱れを生じさせる様々なストレスを受けて、脱分化してしまうことが多く、また、細胞を増殖させるために脱分化させることが必要となる場合も多い。これにより、患者から採取した細胞を、単純な培養条件で培養しても、細胞は元の遺伝子発現状態を維持できないことが多いため、細胞構造体、ひいては組織を形成させることができず、また、その細胞の高度な機能を発揮することができないという問題がある。例えば、一般的なポリスチレン製の細胞培養皿で細胞培養を行った場合には、細胞が単層状の構造を形成するに留まり、高度に分化した細胞に見られる構造、例えば、軟骨細胞が生体内に存在している場合の形状であるペレット状の構造と同様の構造を有する細胞構造体を形成させることは困難であり、また、軟骨細胞に特異的な多くの機能が消失されてしまう。

　上記問題に関して、例えば、組織の構造を模倣した立体的構造を構築する細胞培養方法、例えば、スフェロイド培養、クラスター培養、ペレット培養、三次元担体培養等の方法が開発されている。立体的な構造を有する細胞外マトリックスを、細胞培養の足場（スキャホールド）として用いることにより、立体的な構造を有する細胞を作製する細胞培養方法が知られている。

　また、近年では、生体組織再生の分野において、無人自動化の細胞培養法、分化制御のための薬剤の発見、ウイルス感染検査方法等の関連技術の完成度が高まっていることを受けて、生体内の構造を模倣する高次的有形構造体を自在に設計する研究が盛んになっている（非特許文献１、２参照）。

　特に、培養軟骨の三次元化に関しては、脱分化した軟骨細胞を有形の鋳型に注入して、細胞にＢＭＰ２やｂ−ＦＧＦ等を用いた化学刺激により分化誘導することで、直径１０ｍｍ、厚さ１ｍｍのサイズの軟骨ディスクを調製することに成功した例が知られている。

　また、発明（ＩＩ）に関し、従来、上皮系細胞は、細胞培養器への接着性が弱く、通常の細胞培養器を用いた上皮系細胞の培養は極めて困難であった。また、細胞の接着性を向上させた細胞培養器として、コラーゲンコート細胞培養器（特許文献１参照）、フィブロネクチンコート細胞培養器（特許文献２参照）、ラミニンコート細胞培養器（特許文献３参照）等の細胞接着因子をコーティングした細胞培養器が知られている。しかしながら、天然物由来の細胞接着因子を用いた場合、未知物質や病原性物質が含まれる可能性があり、また動物資源の節減の観点からも、化学合成物質の細胞接着因子を用いた方法が望まれている。
　また、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン等の従来の細胞接着因子を用いた方法では、上皮系細胞と培養面との接着性が十分とはいえず、上皮系細胞の接着性に優れた細胞培養器が求められているのが現状である。

　また、発明（ＩＩＩ）に関し、従来、立体構造を有する細胞構造体、人工組織体の作製方法として、球状やシート状等単純な細胞構造体においては、ハンギングドロップ法（非特許文献３参照）、低接着性Ｕ字底培養皿（特許文献４参照）等が知られている。
　また、複雑な３次元形状の細胞構造体においてはとしては、３Ｄプリンターを利用した細胞構造体が知られている。

　また、発明（ＩＶ）に関し、生物学の分野における重要な実験技術として、１９００年頃に開発された細胞培養技術がある。開発当初は、培地成分の最適化等細胞を馴化することに注力されるに留まり、単層培養や浮遊培養の技術が中心に検討されてきた。

　近年、単層培養系の細胞と生体内組織の細胞との間で、種々の性質、刺激応答性、細胞機能等が異なることが明らかになり、単層構造を形成させる単層培養よりも、生体内の組織構造に近い３Ｄ構造を形成させる３Ｄ培養、特に、スフェロイド培養の需要が拡大している（非特許文献４参照）。

　古典的には、タンパク質系のゾル中に細胞を浮遊させ、この細胞浮遊液を何らかのトリッガー（熱、光、化学架橋剤等）でゲル化させることによって形成させた３Ｄゲル中に細胞を包埋させる技術、多孔質のスキャホールド中に細胞を生着させる技術、ＮＩＰＡＭを固定化した培養皿を用いて細胞シートの積層体を調製する技術等が盛んに開発されてきた。

　近年では、住友ベークライト社のＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ等の、非接着性の丸底面へ細胞を沈降させる手法；ＪＳＲ社のＮａｎｏ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｐｌａｔｅ、日立製作所のＮａｎｏ　Ｐｉｌｌａｒ　Ｐｌａｔｅ等の、レーザー加工により平滑面を規則正しい凹凸面にすることによって培養面に接着した細胞の遊走性を高め、これにより、培養面において細胞の自己組織化を誘導する手法；クラレ社のＥｌｐｌａｓｉａ、イワキ社のＥＺＳＰＨＥＲＥ等の、直径１００~５００μｍ、深さ５００μｍ程度の無数の穴が配設された培養皿を用いて、各穴の底面へ各穴に播種した細胞を沈降させる手法等が開発されている。

　また、近年では、管状部材の先端に細胞懸濁液の液滴を調製し、液滴の表面張力を利用して液滴の形状を球状に保ちながら液滴を所定期間（例えば、２週間程度）保持することによって、液滴中でスフェロイド状の細胞構造体を製造する、ハンギングドロップ法も知られている。

　また、発明（Ｖ）に関し、近年、患者のＱＯＬの向上を目的として、オーダーメイド医療の実現が望まれている。オーダーメイド医療では、患者自身の細胞を用いて機能障害や機能欠損に陥った組織や臓器の再生を図る、再生医療が主要な役割を担う。
　ここで、再生医療は、患者の組織から採取した細胞を、細胞培養器中で培養し、組織を形成させ、その後、その組織を患者に移植するというオペレーションを必要とする。そのため、細胞を培養して、組織等の細胞構造体を形成させる技術や、細胞構造体をそのままの状態で回収する技術が所望されている。

　上記問題に関して、例えば、組織の構造を模倣した立体的構造を構築する細胞培養方法、例えば、スフェロイド培養、クラスター培養、ペレット培養、三次元担体培養等の方法が開発されている。立体的な構造を有する細胞外マトリックスを、細胞培養の足場（スキャホールド）として用いることにより、立体的な構造を有する細胞構造体を作製する細胞培養方法が知られている（特許文献５参照）。
　また、立体的な構造を有する細胞構造体を作製する手法として、Ｕ字底の低接着性培養皿を用いる手法や、ハンギングドロップ法も開発されている。

　近年、特殊な温度応答性ポリマー及び／又は温度応答性ポリマー組成物で被覆した培養面において、細胞を播種・培養することによって、三次元構造を備える細胞構造体を簡便に製造する方法が報告されている（特許文献６参照）。

　また、発明（ＶＩ）に関し、心臓の機能障害の研究において、動物の生体心臓を心不全等の状態とする心疾患モデルとしては、冠状動脈の閉塞、薬剤投与、心筋ミオシンの下肢への筋注で自己免疫性に心筋炎を惹起させる等の方法で作製したモデル動物が公知である。

　心臓は、生命の維持にきわめて重要な臓器であるとともに、他の臓器の状態をも左右するため、心機能を低下させた心疾患モデルを再現よく作製することは困難であった。例えば、冠状動脈閉塞であれば、閉塞の程度が軽いと健常状態とほとんど差異がなく、少しでも重いとすぐに動物をロストすることとなり、その程度の差が近いために加減が非常に困難であった。また、ミオシン投与による自己免疫反応での心筋炎モデル作製では、免疫反応の程度によって心筋組織の病状が大きく変わり、さらに心機能自体が、離れた他の臓器の状態にも大きく影響するため、安定した実験、再現性のある実験系を組むことが極めて困難であった。
　また、作製した心疾患モデル臓器を生体内から摘出しても、多くの酸素を要求する心筋細胞を維持することが困難であった。
　また、実験動物の使用は、動物愛護や倫理上の問題もあった。

　一般に心不全等を起こした組織は、管状動脈の部分的閉塞、ウイルス・細菌の感染、自己免疫反応等により心筋細胞が壊死し、壊死した心筋細胞に置き換わって線維芽細胞が過増殖している状態にあることが知られている。
　そこで、心不全等を起こした心疾患の組織を試験管内で再現することが試みられている。これには、低酸素に弱い心筋細胞を保護しつつし、増殖が早い線維芽細胞と共培養して細胞構造体とする必要があり、細胞構造体の作製に１~２週間を要する従来のハンギングドロップ法や低接着性培養皿では困難であった。

　短時間で、効率よく細胞塊を製造する方法として、特定の温度応答性ポリマーを塗布した細胞培養器を用いた方法が知られている（特許文献６参照）。

　また、発明（ＶＩＩ）に関し、Ｍｕｓｅ細胞（多能性幹細胞）の移植等に代表される肝臓再生療法の研究において、肝不全モデル動物が使用されることがある。肝不全モデル動物の作製方法としては、例えば、肝臓の部分切除、門脈や上流血管の結刷、四塩化炭素等の肝傷害性薬剤の反復投与等の方法が公知である。また、多くの場合、病態肝臓は動物体内から摘出されることなく、ｉｎ　ｖｉｖｏ系での実験に供される。

　動物を使用した実験には、動物愛護や倫理観の問題が付随し、実験目的、成功率、得られる知見の価値とのバランスが重要になる。
　また、臓器の部分切除による方法では、肝不全の程度や動物個体の状態が、術者の手技に大きく依存する。また、肝傷害性薬剤を使用する方法では、公知の標準的プロトコールが存在するものの、反復投与が必要なケースが多く、症状の進行の程度を制御することが困難であった。このように、安定して、再現性のある肝不全モデル動物を用いた実験系を組むことは困難であった。

　肝細胞の培養は盛んに行われているが、肝不全モデルを再現するためには、線維芽細胞等を共培養する必要がある。しかしながら、上皮系細胞である肝細胞と間葉系細胞である線維芽細胞とでは、培養皿への接着性や培養方法が相違するため、作製に１~２週間を要する従来のハンギングドロップ法や低接着性培養皿では、肝細胞及び線維芽細胞を含む三次元構造の細胞構造体を作製するのは困難であった。

特開平０５−２６０９５０号公報特開平０６−０１４７６４号公報特開平０８−１７３１４４号公報特開２００９−０５０１９４号公報特開２０１０−５２４４５８号公報特許第５７４６２４０号公報

Ｍ．　Ｍａｔｓｕｓａｋｉ　ｅｔ　ａｌ，　Ａｄｖ．　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｍａｔｅｒ．，　２，　５３４　（２０１３）Ｍ．　Ｍａｔｓｕｓａｋｉ　ｅｔ　ａｌ，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．，　４５７，　３６３　（２０１５）Ｋｅｌｌｅｒ　Ｇ．　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｕｒｒ．　Ｏｐｉｎ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．，　７，　８６２−８６９　（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ　４２４，Ｐ８７０−８７２，２１　Ａｕｇｕｓｔ，２００３．

　本発明は、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物で被覆された培養面により、細胞塊、細胞構造体、又は立体組織体を効率よく製造する方法を提供することを目的とする。

　本発明（Ｉ）に関し、上記従来の方法により、より大きなサイズの及び／又はより複雑な構造の培養軟骨を調製しようとすると、構造体内部の細胞の壊死を招き、細胞がネクローシスにより死滅することが報告されている。
　そこで、本発明（Ｉ）は、関節、気管、鼻等の治療に有用な軟骨細胞塊及び移植材料並びに複合材を簡便に製造することを目的とする。

　また、本発明（ＩＩ）の目的は、細胞培養器に接着しにくい上皮系細胞の培養方法、細胞培養器に接着しにくい上皮系細胞を含む細胞構造体の製造方法、及び上皮系細胞の培養及びその細胞構造体の製造が可能な細胞培養器を提供することにある。

　また、本発明（ＩＩＩ）に関し、ハンギングドロップ法や低接着性Ｕ字底培養皿等を用いた方法では、細胞構造体内部に存在する細胞への酸素、栄養供給が、濃度勾配拡散に依存するため、サイズに限界があり、一般的には直径０．１ｍｍ程度が最大とされ、形状も球体に限定されている。
　また、３Ｄプリンターによる細胞構造体の作製方法では、トリプシン等の酵素を使用して細胞を個々に分散させた細胞浮遊液を使用して、細胞をノズルから吐出して細胞構造体を作製する。この方法では、吐出した細胞同士を結合させるには、吐出した個々の細胞の周辺へ外部から接着因子等を同時に吐出する必要がある。しかしながら、この接着因子は細胞が分泌したものでなく、得られる３次元形状の細胞構造体は、細胞同士の結合の強度や細胞の活性という点で、十分とはいえなかった。

　また、近年、機能障害や機能欠損に陥った組織や臓器の再生を図る再生医療等の観点から、細胞を細胞培養器内で培養して、例えばリング状、管腔状等の、組織の構造を模倣した立体的構造を有する細胞構造体を形成させる技術の重要性が高まってきている。また、組織の構造を模倣した立体的構造を有する細胞構造体として、細胞を主成分とする細胞構造体以外にも、細胞外マトリックスを主成分とする細胞構造体を作製する方法も求められてきている。
　しかしながら、リング状又は管腔状等の、組織の構造を模倣した立体組織体を容易に形成する方法は知られていないのが現状である。

　従って、本発明（ＩＩＩ）の目的は、容易にリング状又は管腔状等の立体組織体を得ることができる立体組織体の作製装置、及び容易にリング状又は管腔状等の立体組織体を得ることができる立体組織体の作製方法を提供することにある。

　また、本発明（ＩＶ）に関し、上記従来の方法を用いてスフェロイド状の細胞構造体を製造した場合、細胞構造体のバイアビリティが低い、所望のサイズとすることが容易ではない、形状を整えることが困難である等という問題があった。特に、細胞構造体のサイズや形状が揃わない場合には、製造した細胞構造体の分級作業が必要になり、製造工程が煩雑になりコストも増大することとなる。

　そこで、本発明（ＩＶ）は、所望のサイズの形状の整ったスフェロイド状の細胞構造体を簡便に製造することを目的とする。

　また、本発明（Ｖ）に関し、上記スフェロイド培養法等は、直径１０μｍ程度とサイズが小さく、細胞間ネットワークが弱いスフェロイド（多数の細胞の凝集体）しか調製することができないといった問題を有している。
　また、上記Ｕ字底の低接着性培養皿を用いる手法や、ハンギングドロップ法では、略真球状のスフェロイドしか得ることができず、敷石形態や紡錘形態といった細胞固有の形態を備えたスフェロイドを得ることができない。

　近年開発された上記特殊なポリマー及び／又はポリマー組成物を用いる方法は、得られる細胞構造体の形態を所望のものとするまでには必ずしも至っておらず、この方法に関する諸条件を最適化・好適化する余地を残している。

　そこで、本発明（Ｖ）は、細胞の凝集様式を制御することにより、所望の形態の細胞構造体を製造することを目的とする。

　また、本発明（ＶＩ）に関し、特許文献６に記載の方法において、心不全等の心疾患の組織の再現は検討されておらず、心疾患を試験管内で再現する方法が求められているが現状である。

　従って、本発明（ＶＩ）の目的は、心疾患モデルとして有用な、心筋細胞と線維芽細胞とを含む細胞構造体を容易に形成する、細胞構造体の製造方法を提供することにある。

　また、本発明（ＶＩＩ）に関し、特許文献６に記載の方法において、肝不全の組織の再現は検討されておらず、肝不全を試験管内で再現する方法が求められているが現状である。

　従って、本発明（ＶＩＩ）の目的は、肝不全モデルとして有用な、肝細胞と線維芽細胞とを含む細胞構造体を容易に形成する、細胞構造体の製造方法を提供することにある。

　本発明（Ｉ）~（ＶＩＩ）の要旨は以下の通りである。
　本発明（Ｉ）の軟骨細胞塊の製造方法は、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物で被覆された被覆培養面において、細胞塊の存在下、軟骨細胞に分化し得る細胞を播種し、前記細胞塊及び前記軟骨細胞に分化し得る細胞を培養することによって、軟骨細胞塊を調製する、播種培養工程を含むことを特徴とする。
　ここで、本発明（Ｉ）の軟骨細胞塊の製造方法では、前記細胞塊を、前記軟骨細胞に分化し得る細胞を播種し、これを培養することによって、調製することが好ましい。
　本発明（Ｉ）の軟骨細胞塊の製造方法では、前記播種培養工程を複数回行うことが好ましい。
　本発明（Ｉ）の軟骨細胞塊の製造方法では、前記被覆培養面は、細胞非接着性の壁で囲まれていることが好ましい。
　本発明（Ｉ）の軟骨細胞塊の製造方法では、前記被覆培養面の幅を３ｍｍ以下として、前記壁の高さを３ｍｍ以下とすることが好ましい。
　本発明（Ｉ）の軟骨細胞塊の製造方法では、前記被覆培養面が単位面積当たりに有する前記温度応答性ポリマー及び温度応答性ポリマー組成物の量を、０．１~３．０μｇ／ｃｍ^２とすることが好ましい。
　本発明（Ｉ）の軟骨細胞塊の製造方法では、前記播種培養工程において、前記軟骨細胞に分化し得る細胞を、０．３×１０^４~１０．０×１０^５個／ｃｍ^２の細胞密度で播種することが好ましい。

　本発明（Ｉ）の軟骨細胞塊は、上記本発明の軟骨細胞塊の製造方法により製造されたことを特徴とする。
　ここで、本発明（Ｉ）の軟骨細胞塊は、ドーナツ形であることが好ましい。

　本発明（Ｉ）の移植材料の製造方法は、上記本発明の軟骨細胞塊の存在下、間葉系細胞を播種し、前記軟骨細胞塊及び前記間葉系細胞を培養することによって、移植材料を調製する、工程を含むことを特徴とする。

　本発明（Ｉ）の移植材料は、本発明の移植材料の製造方法により製造されたことを特徴とする。

　本発明（Ｉ）の複合材は、上記本発明の軟骨細胞塊が管状構造体の外表面に設けられていることを特徴とする。
　ここで、本発明（Ｉ）の複合材は、管状構造体の内部に芯材が設けられていることが好ましい。

　本発明（ＩＩ）は、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を調製する、調製工程と、上記温度応答性ポリマー又は上記温度応答性ポリマー組成物で、細胞培養器の培養面の少なくとも一部を被覆して被覆領域Ａを形成し、被覆領域Ａを有する被覆細胞培養器を準備する、培養器準備工程と、上皮系細胞を上記被覆細胞培養器に播種する、播種工程と、上記被覆領域Ａに接着した上記上皮系細胞を培養する、培養工程と、を含み、上記被覆領域Ａにおける上記温度応答性ポリマー又は上記温度応答性ポリマー組成物の濃度が、０．３ｐｇ／ｍｍ^２以上であることを特徴とする、上皮系細胞の培養方法を提供する。
　本実施形態（ＩＩ）の上皮系細胞の培養方法は、上記細胞培養器の培養面の少なくとも一部に窪み部を有しており、上記被覆領域Ａ内に上記窪み部があることが好ましい。

　また、本発明（ＩＩ）は、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を調製する、調製工程と、上記温度応答性ポリマー又は上記温度応答性ポリマー組成物で、細胞培養器の培養面の少なくとも一部を被覆して被覆領域Ａを形成し、被覆領域Ａを有する被覆細胞培養器を準備する、培養器準備工程と、上皮系細胞を上記被覆細胞培養器に播種する、播種工程と、上記上皮系細胞から塊状の細胞構造体を形成し、上記被覆領域Ａに接着した細胞構造体を得る、培養工程と、を含み、上記被覆領域Ａにおける上記温度応答性ポリマー又は上記温度応答性ポリマー組成物の濃度が、０．３ｐｇ／ｍｍ^２以上であることを特徴とする、細胞構造体の製造方法を提供する。
　本実施形態（ＩＩ）の細胞構造体の製造方法は、上記培養器準備工程において、上記温度応答性ポリマー又は上記温度応答性ポリマー組成物で、細胞培養器の培養面の少なくとも一部であって、上記被覆領域Ａとは異なる位置に、被覆領域Ｂを形成し、上記被覆領域Ｂにおける上記温度応答性ポリマー又は上記温度応答性ポリマー組成物の濃度が、２００ｐｇ／ｍｍ^２未満であることが好ましい。
　本実施形態（ＩＩ）の細胞構造体の製造方法は、上記細胞培養器の培養面の少なくとも一部に窪み部を有しており、上記被覆領域Ａ内に上記窪み部があることが好ましい。

　また、本発明（ＩＩ）は、培養面の少なくとも一部に、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物で被覆された被覆領域Ａを有し、上記被覆領域Ａにおける上記温度応答性ポリマー又は上記温度応答性ポリマー組成物の濃度が、０．３ｐｇ／ｍｍ^２以上であることを特徴とする、上皮系細胞用細胞培養器を提供する。
　本実施形態（ＩＩ）の上皮系細胞用細胞培養器は、培養面の少なくとも一部であって、上記被覆領域Ａと異なる位置に、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物で被覆された被覆領域Ｂを有し、上記被覆領域Ｂにおける上記温度応答性ポリマー又は上記温度応答性ポリマー組成物の濃度が、２００ｐｇ／ｍｍ^２未満であることが好ましい。
　本実施形態（ＩＩ）の上皮系細胞用細胞培養器は、上記細胞培養器の培養面の少なくとも一部に窪み部を有しており、上記被覆領域Ａ内に上記窪み部があることが好ましい。

　本発明（ＩＩＩ）は、少なくとも１個の貫通孔を有する培養面と、上記貫通孔を挿通する心棒とからなる立体組織体の作製装置であって、上記培養面に温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物で被覆された被覆培養面を少なくとも１つ含み、１つの上記被覆培養面の内側に、少なくとも１個の上記貫通孔を有し、上記培養面が上記心棒の延在方向に可動であることを特徴とする、立体組織体の作製装置を提供する。
　上記立体組織体の作製装置は、複数の上記培養面を有し、１本の上記心棒が、上記複数の上記培養面の上記貫通孔を挿通していることが好ましい。

　また、本発明（ＩＩＩ）は、上記立体組織体の作製装置を用いた立体組織体の作製方法であって、上記被覆培養面上に少なくとも１種の細胞を播種する、播種工程と、播種した上記細胞を培養して、上記心棒の周囲に巻き付いたリング状の立体組織体を得る、培養工程と、を含むことを特徴とする、立体組織体の作製方法を提供する。
　上記立体組織体の作製方法は、心棒の周囲に巻き付いたリング状の立体組織体が得られた後に、上記培養面を上記心棒の延在方向に移動させる培養面移動工程と、移動後の上記被覆培養面上に少なくとも１種の細胞を播種する、播種工程と、播種した上記細胞を培養して、心棒の周囲に巻き付いたリング状の上記立体組織体に隣接する、心棒の周囲に巻き付いたリング状の立体組織体を得る、培養工程と、の繰り返しを更に含むことが好ましい。
　上記立体組織体の作製方法は、全ての上記被覆培養面に上記細胞を播種し、播種した上記細胞を培養して立体組織体を得ることが好ましい。
　上記立体組織体の作製方法は、上記播種工程において播種した上記細胞を含む立体組織体を得ることが好ましい。
　上記立体組織体の作製方法は、上記培養工程の後に、上記細胞を除去して、上記細胞から分泌された物質を含む立体組織体を得ることが好ましい。
　上記立体組織体の作製方法は、上記物質がタンパク質であることが好ましい。

　本発明（ＩＶ）の細胞構造体の製造方法は、培養面に温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物で被覆された被覆領域を調製し、該被覆領域に細胞懸濁液の液滴を形成し、該液滴中で細胞培養を行い、ここで、前記被覆領域の表面ゼータ電位を０~５０ｍＶとすることを特徴とする。
　ここで、本発明（ＩＶ）の細胞構造体の製造方法では、前記被覆領域に対する水の接触角を５０~９０°とすることが好ましい。
　また、本発明（ＩＶ）の細胞構造体の製造方法では、前記培養面に複数の前記被覆領域を調製することが好ましい。
　更に、本発明（ＩＶ）の細胞構造体の製造方法では、前記被覆領域に複数の前記液滴を形成することが好ましい。
　更に、本発明（ＩＶ）の細胞構造体の製造方法では、各前記被覆領域において、前記液滴の底面積を前記被覆領域の面積よりも小さくすることが好ましい。
　更に、本発明（ＩＶ）の細胞構造体の製造方法では、前記液滴に含まれる細胞の数を３．０×１０^５個／ｍＬ以下とすることが好ましい。
　更に、本発明（ＩＶ）の細胞構造体の製造方法では、前記液滴の径を１μｍ~８ｍｍとすることが好ましい。
　更に、本発明（ＩＶ）の細胞構造体の製造方法では、前記液滴の量を０．５~５０μＬとすることが好ましい。

　本発明（Ｖ）の要旨は以下の通りである。
　本発明（Ｖ）の細胞構造体の製造方法は、細胞培養器の培養面に、温度応答性ポリマー及び／又は温度応答性ポリマー組成物で被覆された第一被覆領域と、前記第一被覆領域の端部に設けられた、細胞接着性物質で被覆された複数の第二被覆領域とを準備する、準備工程と、
　細胞を前記第一被覆領域及び前記第二被覆領域に播種し、前記細胞を培養することによって、細胞構造体を調製する、播種培養工程と
を含むことを特徴とする。

　本発明（Ｖ）の細胞構造体の製造方法では、前記培養面を、細胞非接着性とすることが好ましい。
　本発明（Ｖ）の細胞構造体の製造方法では、前記細胞接着性物質を、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチンからなる群から選択される少なくとも１種とすることが好ましい。
　本発明（Ｖ）の細胞構造体の製造方法では、前記第一被覆領域及び前記第二被覆領域が占める領域を、細胞非接着性の壁で囲むことが好ましい。
　本発明（Ｖ）の細胞構造体の製造方法では、前記第一被覆領域を、所定方向に延びる形状とし、前記第一被覆領域の前記端部を、前記所定方向についての端部とすることが好ましい。

　本発明（Ｖ）の細胞構造体は、上記いずれかに記載の細胞構造体の製造方法により製造されたことを特徴とする。

　本発明（Ｖ）の細胞は、培養器培養面に、温度応答性ポリマー及び／又は温度応答性ポリマー組成物で被覆された第一被覆領域と、前記第一被覆領域の端部に設けられた、細胞接着性物質で被覆された複数の第二被覆領域とを有することを特徴とする。

　本発明（ＶＩ）は、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を調製する、調製工程と、上記温度応答性ポリマー又は上記温度応答性ポリマー組成物で、細胞培養器の培養面を被覆して、被覆細胞培養器を準備する、培養器準備工程と、心筋細胞と、上記心筋細胞１００個に対して２００~３００個の割合の線維芽細胞を上記被覆細胞培養器に播種する、播種工程と、播種した細胞を培養して塊状の細胞構造体を得る、培養工程とを含むことを特徴とする、細胞構造体の製造方法を提供する。
　上記播種工程において、血管内皮細胞をさらに播種することが好ましい。
　上記播種工程以降であって、上記細胞構造体が得られる前に、免疫系細胞を上記被覆細胞培養器にさらに添加することが好ましい。
　上記免疫系細胞が、マクロファージ及び／又はＴ細胞であることが好ましい。
　上記温度応答性ポリマー又は上記温度応答性ポリマー組成物で被覆された部分の面積が２００ｍｍ^２以下であることが好ましい。

　本発明（ＶＩＩ）は、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を調製する、調製工程と、上記温度応答性ポリマー又は上記温度応答性ポリマー組成物で、細胞培養器の培養面を被覆して、被覆細胞培養器を準備する、培養器準備工程と、肝細胞と、上記肝細胞１００個に対して１０~５０個の割合の線維芽細胞を上記被覆細胞培養器に播種する、播種工程と、播種した細胞を培養して塊状の細胞構造体を得る、培養工程とを含むことを特徴とする、細胞構造体の製造方法を提供する。
　上記播種工程において、血管内皮細胞をさらに播種することが好ましい。
　上記播種工程において、脂肪細胞をさらに播種することが好ましい。
　上記播種工程において、上記肝細胞１００個に対して上記脂肪細胞を５０個の割合で、且つ上記線維芽細胞１００個に対して上記脂肪細胞を１００~５００個の割合で播種することが好ましい。
　上記播種工程以降であって、上記細胞構造体が得られる前に、免疫系細胞を上記被覆細胞培養器にさらに添加することが好ましい。
　上記免疫系細胞が、単球、顆粒球、リンパ球、及びマクロファージからなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。

　本発明によれば、細胞塊、細胞構造体、又は立体組織体を効率よく製造する方法を提供することができる。

　特に本発明（Ｉ）によれば、関節、気管、鼻等の治療に有用な軟骨細胞塊及び移植材料並びに複合材を簡便に製造することができる。
　また、本発明（ＩＩ）の上皮系細胞の培養方法は、上記構成を有するため、細胞培養器に接着しにくい上皮系細胞を容易に培養することができる。また、本発明（ＩＩ）の細胞構造体の製造方法は、上記構成を有するため、細胞培養器に接着しにくい上皮系細胞を含む細胞構造体を容易に製造することができる。また、本発明（ＩＩ）の上皮系細胞用細胞培養器は、上記構成を有するため、上皮系細胞の培養及びその細胞構造体の製造が可能である。
　また、本発明（ＩＩＩ）の立体組織体の作製装置は、上記構成を有するため、容易にリング状又は管腔状等の立体組織体を作製することができる。また、本発明（ＩＩＩ）の立体組織体の作製方法によれば、上記構成を有するため、容易にリング状又は管腔状等の立体組織体を作製することができる。
　また、本発明（ＩＶ）によれば、所望のサイズの形状の整ったスフェロイド状の細胞構造体を簡便に製造することができる。
　また、本発明（Ｖ）によれば、細胞の凝集様式を制御して、所望の形態の細胞構造体を製造することができる。
　また、本発明（ＶＩ）の細胞構造体の製造方法は、上記構成を有するため、心疾患モデルとして有用な、心筋細胞と線維芽細胞とを含む細胞構造体を容易に形成することができる。
　また、本発明（ＶＩＩ）の細胞構造体の製造方法は、上記構成を有するため、肝不全モデルとして有用な、肝細胞と線維芽細胞とを含む細胞構造体を容易に形成することができる。

図１は、（ｉ）~（ｖｉｉｉ）は、本実施形態（Ｉ）における一例の軟骨細胞塊の製造方法の概要について示す図である。図２は、（ｉ）~（ｖｉ）は、本実施形態（Ｉ）における一例の軟骨細胞塊の製造方法の概要について示す図である。（ｉｖ）における括弧内には、構造物の断面図を示す。図３は、本実施形態（Ｉ）における、準備工程の変形例及びこれに続く播種培養工程の概略を示す図である。（ａ）は、準備工程の第一変形例を示す図であり、（ｂ）は、準備工程の第二変形例を示す図である。図４は、本実施形態（Ｉ）の移植材料の製造方法の概要について示す図である。図５は、本実施形態（Ｉ）における別の例の軟骨細胞塊の製造方法の概要について示す図である。図６は、（ｉ）~（ｖ）は、本実施形態（Ｉ）における一例の複合材の製造方法の概要について示す図である。図７は、本実施形態（Ｉ）の試験Ｉ−Ｃ−１（参考例Ｉ）における、培養開始から２４時間後（１日後）、２日後、６日後、１０日後の細胞構造体の様子を蛍光顕微鏡を用いて観察したときの写真を示す図である。特に、下図は、１０日後の細胞構造体の写真の一部を拡大して示したものである。図８は、本実施形態（Ｉ）の試験Ｉ−Ｃ−１（参考例Ｉ）において得られた細胞構造体を短軸方向断面で切断したときの写真を示す図である。図９は、本実施形態（Ｉ）の試験Ｉ−Ｃ−２における、培養開始から２７時間後、４４時間後、７０時間後、１２２時間後の細胞構造体の様子を蛍光顕微鏡を用いて観察したときの写真を示す図である。上図は、幅２ｍｍのドーナツ形のくり抜きを有する中敷きを用いた場合の細胞構造体の様子を示す図であり、下図は、幅２．５ｍｍのドーナツ形のくり抜きを有する中敷きを用いた場合の細胞構造体の様子を示す図である。図１０は、本実施形態（Ｉ）の試験Ｉ−Ｃ−３における、培養開始から８時間後、２０時間後、３２時間後、４２時間後の細胞構造体の様子を蛍光顕微鏡を用いて観察したときの写真を示す図である。上図は、幅２ｍｍのドーナツ形のくり抜きを有する中敷きを用いた場合の細胞構造体の様子を示す図であり、下図は、幅２．５ｍｍのドーナツ形のくり抜きを有する中敷きを用いた場合の細胞構造体の様子を示す図である。最下図は、４２時間後の細胞構造体の様子を実体顕微鏡を用いて観察したときの写真を示す図である。図１１の（ａ）は、本実施形態（Ｉ）の試験Ｉ−Ｄにおける培養開始から６日後の複合材の様子を肉眼で観察したときの写真を示す図であり、図１１の（ｂ）は、本実施形態（Ｉ）の試験Ｉ−Ｄにおける培養開始から２１日後の複合材の様子を肉眼で観察したときの写真を示す図である。図１２は、本実施形態（Ｉ）の試験Ｉ−Ｄにおける培養開始から２１日後の複合材の一部の様子を肉眼で観察したときの写真を拡大して示す図である。図１３は、本実施形態（Ｉ）の試験Ｉ−Ｄにおいて調製された複合材に対してピンセットで操作したときの様子を肉眼で観察したときの写真を示す図である。（ａ）は、無操作時の外周面、（ｂ）は、無操作時の内腔面、（ｃ）は、全体への圧潰時、（ｄ）は、側面の一部への引張時、の様子を示す図である。図１４は、本実施形態（Ｉ）の試験Ｉ−Ｄにおいて調製された複合材をヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）に供したときの様子を顕微鏡を用いて観察したときの写真を示す図である。（ａ）は、複合材の外観写真を示し、（ｂ）は、（ａ）の線Ａ−Ａに沿う面により切断したときの断面図を示す図であり、（ｃ）及び（ｄ）は、（ｂ）に示す写真を部分拡大したものを示す図である。図１５は、本発明（ＩＩ）の一実施形態の細胞構造体の製造方法を説明するための概略図である。図１６は、本発明（ＩＩ）の一実施形態の細胞構造体の製造方法を説明するための概略図である。図１７は、本発明（ＩＩ）において用いられる温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物上で上皮系細胞を９６時間培養したときの様子を示す写真である。図中、破線で囲まれた部分は被覆領域Ａを示し、黒枠矢印は被覆領域Ａで接着・生育している細胞を示し、黒塗矢印は非被覆領域で接着・生育している細胞を示す。図１８は、本発明（ＩＩＩ）の一実施形態の立体組織体の作製装置を説明するための概略図（斜視図）である。図１９は、本発明（ＩＩＩ）の一実施形態の立体組織体の作製装置を説明するための概略図（斜視図）である。図２０は、本発明（ＩＩＩ）の一実施形態の立体組織体の作製装置を説明するための概略図（斜視図）である。図２１は、本発明（ＩＩＩ）の一実施形態の立体組織体の作製装置の写真である。図２２は、本発明（ＩＩＩ）の一実施形態の立体組織体の作製方法を説明するための概略図である。図２３は、本発明（ＩＩＩ）の一実施形態の立体組織体の作製方法を説明するための概略図である。図２４は、本発明（ＩＩＩ）の実施例ＩＩＩ−４で得られたリング状の立体組織体の写真である。図２５は、本発明（ＩＩＩ）の実施例ＩＩＩ−５で得られた管腔状の立体組織体の写真である。図２６は、本発明（ＩＩＩ）の一実施形態の立体組織体の作製装置を説明するための概略図（斜視図）である。図２７は、本発明（ＩＩＩ）の一実施形態の立体組織体の作製方法を説明するための概略図である。図２８の（Ａ）は、本発明（ＩＩＩ）の実施例ＩＩＩ−８で得られた管腔状の立体組織体の写真である。図２８の（Ｂ）は、本発明（ＩＩＩ）の実施例ＩＩＩ−８で得られた管腔状の立体組織体のＨＥ染色切片像である。図２９は、本発明（ＩＩＩ）の実施例ＩＩＩ−９で得られた人工血管の写真である。図３０は、本発明（ＩＩＩ）の実施例ＩＩＩ−１０で得られた人工気管の写真である。図３１は、本発明（ＩＩＩ）の実施例ＩＩＩ−１１で得られたタンパク質を主成分とする立体組織体の写真である。図３２は、本発明（ＩＶ）の実施形態の細胞培養体の製造方法の一例の概略を示す図である。図３３の（ｉ）~（ｉｉｉ）は、本発明（ＩＶ）の実施形態の細胞培養体の製造方法の変形例を示す図である。図３４の（Ａ）~（Ｃ）は、本発明（ＩＶ）の実施例において培養面における液滴の量と液滴の径との相関を調査した結果を示す図である。（ｉ）~（ｖｉｉｉ）は、本実施形態（Ｖ）における一例の細胞構造体の製造方法の概要について示す図である。（ａ）~（ｃ）は、本実施形態（Ｖ）における第一被覆領域と第一被覆領域との配置態様について示す図である。本実施形態（Ｖ）における、準備工程の変形例及びこれに続く播種培養工程の概略を示す図である。（ａ）は、本実施形態（Ｖ）における、試験Ｖ−Ｃにおいて、試験Ｖ−Ｂで準備した第一被覆領域及び第二被覆領域においてＧＦＰ組換えルイスラットのＡＤＳＣを２時間培養した後の様子を、顕微鏡を用いて観察したときの写真を示す図である。（ｂ）は、試験Ｖ−Ｃにおいて、試験Ｖ−Ｂで準備した第一被覆領域及び第二被覆領域においてＧＦＰ組換えルイスラットのＡＤＳＣを２０時間培養した後の様子を、顕微鏡を用いて観察したときの写真を示す図である。（ｃ）は、（ｂ）に示す細胞構造体を倍率を下げて観察したときの写真を示す図である。（ｄ）は、（ｂ）の破線に示す細胞構造体の様子を蛍光顕微鏡を用いて観察したときの写真を示す図である。図３９は、本発明（ＶＩ）の一実施形態の細胞構造体の製造方法を説明するための概略図である。図４０は、本発明（ＶＩ）の一実施形態の細胞構造体の製造方法を説明するための概略図である。図４１は、本発明（ＶＩＩ）の一実施形態の細胞構造体の製造方法を説明するための概略図である。図４２は、本発明（ＶＩＩ）の一実施形態の細胞構造体の製造方法を説明するための概略図である。

　本発明は、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物で被覆された培養面に、細胞を播種し、培養することを特徴とする。具体的には、下記の発明（Ｉ）~（ＶＩＩ）が挙げられる。

［［発明（Ｉ）］］
　発明（Ｉ）に関し、発明者らはこれまでに、特定の物性を備え、細胞構造体の製造に極めて有用な、温度応答性ポリマー及び温度応答性ポリマー組成物を開発している。かかるポリマー及び／又はポリマー組成物で細胞培養器の培養面を被覆し、ここに約１００％コンフルエントに相当する数の細胞を播種・培養すると、細胞は被覆物に接着し、その後、被覆培養面上で一気に凝集して、被覆培養面の中央部分で細胞塊を形成する。この現象は、細胞間のネットワークによる収縮が、細胞の被覆培養面への接着を上回り、細胞が被覆培養面から剥離するためと考察されている。
　本発明（Ｉ）の軟骨細胞塊及び移植材料の製造方法は、この温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を用いるものである。

　以下、図面を参照して、本発明（Ｉ）の軟骨細胞塊及び移植材料の製造方法、並びに本発明（Ｉ）の軟骨細胞塊及び移植材料の実施形態について、詳細に例示説明する。

（軟骨細胞塊の製造方法）
　本発明（Ｉ）の実施形態（以下、「本実施形態（Ｉ）」ともいう。）の軟骨細胞塊の製造方法は、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物で被覆された被覆培養面において、細胞塊の存在下、軟骨細胞に分化し得る細胞を播種し、細胞塊及び軟骨細胞に分化し得る細胞を共培養することによって、軟骨細胞塊を調製する、播種培養工程を含む。

　好適には、本実施形態（Ｉ）の製造方法は、温度応答性ポリマー及び／又は温度応答性ポリマー組成物を調製する、調製工程と、上記温度応答性ポリマー及び／又は上記温度応答性ポリマー組成物で培養面の一部を被覆して、被覆培養面を準備する、準備工程と、上記被覆培養面において、細胞塊の存在下、軟骨細胞に分化し得る細胞を播種し、細胞塊及び軟骨細胞に分化し得る細胞を共培養することによって、軟骨細胞塊を調製する、播種培養工程と、を含む。

　図１（ｉ）~（ｖｉｉｉ）及び図２（ｉ）~（ｖｉ）に、本実施形態（Ｉ）における一例の軟骨細胞塊の製造方法の概要について示す。

　以下、本実施形態（Ｉ）における一例の軟骨細胞塊の製造方法における各工程の詳細を記載する。

　（調製工程）
　一例の製造方法では、まず、温度応答性ポリマー及び／又は温度応答性ポリマー組成物を調製する（調製工程）。

　本実施形態（Ｉ）で用いられる温度応答性ポリマー及び温度応答性ポリマー組成物としては、（Ａ）２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）単位と、アニオン性モノマー単位とを含む温度応答性ポリマー、（Ｂ）Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）単位と、カチオン性モノマー単位と、アニオン性モノマー単位とを含む温度応答性ポリマー、（Ｃ）２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）及び／又はその誘導体の重合体と、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（トリス）と、核酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、デキストラン硫酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリリン酸、硫酸化多糖類、カードラン及びポリアルギン酸並びにこれらのアルカリ金属塩からなる群から選択される１種以上のアニオン性物質とを含む温度応答性ポリマー組成物等が挙げられる。
　ここで、上記（Ａ）としては、例えば、（Ａ−１）ＤＭＡＥＭＡを水存在下で重合する方法により得られる温度応答性ポリマー、（Ａ−２）主としてＤＭＡＥＭＡを含むポリマーブロック（重合鎖α末端）と、主としてＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマーとを含むコポリマーブロック（重合鎖ω末端）とを含む、温度応答性ポリマー等が挙げられる。
　本実施形態（Ｉ）において、これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

　以下、上記（Ａ−１）の温度応答性ポリマー及びその製造方法について記載する。

（温度応答性ポリマーの製造方法）
　（Ａ−１）の温度応答性ポリマーの製造方法は、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）を含む混合物を調製する調製工程と、混合物に紫外線を照射する照射工程とを含み、ここで、調製工程において、混合物は重合禁止剤及び水を更に含み、照射工程において、紫外線は不活性雰囲気下において照射される、ことを特徴とする。

　（Ａ−１）の温度応答性ポリマーの製造方法では、まず、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）を含む混合物を調製する（調製工程）。ここで、混合物は、重合禁止剤及び水を更に含む。

　２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）としては、市販品を用いることができる。重合禁止剤としては、メチルヒドロキノン（ＭＥＨＱ）、ヒドロキノン、ｐ−ベンゾキノリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルヒドロキシルアミン、Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏ−Ｎ−ｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒｏｘｙｌａｍｉｎｅ（Ｃｕｐｆｅｒｒｏｎ）、ｔ−ブチルハイドロキノン、等が挙げられる。また、市販のＤＭＡＥＭＡに含まれるＭＥＨＱ等をそのまま用いてもよい。水としては、超純水が挙げられる。

　重合禁止剤の上記混合物に対する質量割合は、０．０１~１．５％であることが好ましく、０．１~０．５％であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、ラジカル重合反応の暴走を抑制して、制御できない架橋を低減することができ、製造される温度応答性ポリマーの溶媒に対する溶解性を確保することができる。
　水の上記混合物に対する質量割合は、１．０~５０％であることが好ましく、９．０~３３％であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、側鎖の加水分解反応の反応速度と、重合するポリマー鎖の成長反応の反応速度とを、バランスよく調和させることができる。これにより、側鎖が加水分解されたＤＭＡＥＭＡに対する、側鎖が加水分解されていないＤＭＡＥＭＡの割合（共重合割合）が１．０~２０程度の温度応答性ポリマーを得ることができる。

　次いで、（Ａ−１）の温度応答性ポリマーの製造方法では、混合物に紫外線を照射する（照射工程）。ここで、紫外線は、不活性雰囲気下において、照射される。ＤＭＡＥＭＡは、紫外線の照射により、ラジカル重合して、ポリマーとなる。
　この工程では、例えば、透明な密封バイアルに、上記混合物を加え、不活性ガスをバブリングすることによってバイアル内を不活性雰囲気とした後に、バイアルの外部から紫外線照射装置を用いて紫外線を照射する。

　紫外線の波長としては、２１０~６００ｎｍであることが好ましく、３６０~３８０ｎｍであることが更に好ましい。上記範囲とすれば、効率よく重合反応を進行させることができ、所期の共重合割合を有する高分子材料を安定的に得ることができる。また、製造したポリマー材料が着色することを防ぐこともできる。
　不活性ガスとしては、窒素、アルゴン、ヘリウム、ネオン等が挙げられる。

　反応条件に関して、温度条件としては、１５~５０℃であることが好ましく、２０~３０℃であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、熱による開始反応を抑制し、光照射による開始反応を優先的に進行させることができる。また、加水分解反応の反応速度をポリマー鎖の成長反応の反応速度に対してバランスのよいものにすることができる。
　反応時間としては、７~２４時間であることが好ましく、１７~２１時間であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、（Ａ−１）の温度応答性ポリマーを高収率で得ることができ、また、光分解反応や不要な架橋反応を抑制しながらラジカル重合を行うことができる。

　なお、調製工程において混合物が調製され終えてから、照射工程において紫外線の照射が開始されるまでの時間は、１０分~１時間であることが好ましい。

　混合物を加えたバイアルの内部の気体を置換して、バイアル内を不活性雰囲気とする際には、１０分程度の時間を要する。そのため、上記時間を１０分未満とすると、ラジカル重合に必要となる不活性雰囲気が得られない虞がある。また、混合物中では、ＤＭＡＥＭＡの加水分解反応が、紫外線の照射が開始される前に開始される。そのため、上記時間を１時間超とすると、ラジカル重合反応に不活性なメタクリル酸が混合物中に多数生じてしまう。

　（Ａ−１）の温度応答性ポリマーの製造方法では、混合物に水が含まれるため、ＤＭＡＥＭＡのラジカル重合反応と、ポリ２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＰＤＭＡＥＭＡ）の側鎖のエステル結合の加水分解反応とを、拮抗させることができる。
　この拮抗により、得られる生成物は、式（Ｉ）で表される繰り返し単位（Ａ）

、及び式（ＩＩ）で表される繰り返し単位（Ｂ）

を含むポリマーとなる。
　そのため、ポリマーが有するカチオン性官能基、すなわち、ジメチルアミノ基と、ポリマーが有するアニオン性官能基、すなわち、側鎖のエステル結合が加水分解されてできたカルボキシル基の両方を、バランスよく備えることができる。そして、（Ａ−１）の温度応答性ポリマーの製造方法によれば、カチオン性官能基及びアニオン性官能基を有する、ポリ（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）由来のポリマーを、少ない工程で簡便に製造することができる。

　なお、（Ａ−１）の温度応答性ポリマーの製造方法と同一の製造方法ではなくとも、ＤＭＡＥＭＡ、重合禁止剤、及び水が、紫外線照射時に反応系中に共存していれば、本発明（Ｉ）の温度応答性ポリマーの製造方法の上記効果と同様の効果を得ることができる。
　例えば、ＤＭＡＥＭＡ及び重合禁止剤を含む混合物と、水とを別々に準備し、次いで、混合物と水とに不活性ガスをバブリングし、その後、混合物と水とを不活性雰囲気下で混合すると同時に紫外線を照射するという、温度応答性ポリマーの製造方法も、（Ａ−１）の温度応答性ポリマーに含めることができる。

（温度応答性ポリマー）
　（Ａ−１）の温度応答性ポリマーは、上記（Ａ−１）の製造方法により製造される。

　ここで、（Ａ−１）の温度応答性ポリマーとしては、数平均分子量（Ｍｎ）が、１０~５００ｋＤａである分子が好ましい。また、重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）は、１．１~１０．０である分子が好ましい。
　（Ａ−１）の温度応答性ポリマーの分子量は、紫外線の照射時間及び照射強度の条件により、適宜調整することができる。

　（Ａ−１）の温度応答性ポリマーによれば、曇点を、例えば室温（２５℃）以下に、低下させることができる。

　上記（Ａ−１）の温度応答性ポリマーでは、曇点以上の温度で形成された温度応答性ポリマーの不溶化物が、室温（約２５℃）条件下で再溶解するまでの時間が顕著に遅延する。これは、得られた（Ａ−１）の温度応答性ポリマーは、分子内にカチオン性官能基とアニオン性官能基とが存在するため、高い自己凝集性を有するためであると推定される。

　また、この（Ａ−１）の温度応答性ポリマーを用いて、後述するように、培養面にこの温度応答性ポリマーが被覆されている細胞培養器を調製することができる。

　更に、（Ａ−１）の温度応答性ポリマーによれば、後述するように、細胞を適切な培養条件で培養することにより、管腔状（チューブ状）、塊状（ペレット状）等の構造を有する細胞構造体を形成させることができる。

　（Ａ−１）の温度応答性ポリマーが有する、カチオン性官能基（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ基）の官能基数と、アニオン性官能基（カルボキシル基）の官能基数との比（Ｃ／Ａ比）は、０．５~３２であることが好ましく、４~１６であることが更に好ましい。

　Ｃ／Ａ比を上記範囲とすれば、曇点を低減させるという上記効果が得られやすい。上記Ｃ／Ａ比を有する温度応答性ポリマーでは、上記温度応答性ポリマー中でカチオン性官能基とアニオン性官能基とが、イオン結合的に分子間及び／又は分子内の凝集に作用して、温度応答性ポリマーの凝集力が強くなった結果であると推測される。

　また、Ｃ／Ａ比を上記範囲とすれば、上記温度応答性ポリマー中の正電荷と負電荷とのバランスを特に好適にして、正電荷による細胞傷害性を抑制することができ、また、上記温度応答性ポリマーの親水性と疎水性とのバランスを特に好適にして、細胞の遊走や配向を生じやすくすることができるものと推定される。

　以下、上記（Ａ−２）の温度応答性ポリマー及びその製造方法について記載する。

（温度応答性ポリマーの製造方法）
　（Ａ−２）の温度応答性ポリマーの製造方法は、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）を含む第一混合物に紫外線を照射する第一重合工程と、第一重合工程における重合物の数平均分子量が所定値以上となった時点で、第一混合物にアニオン性モノマーを添加して第二混合物を調製する添加工程と、第二混合物に紫外線を照射する第二重合工程と、を含むことを特徴とする。

　（Ａ−２）の温度応答性ポリマーの製造方法では、まず、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）を含む第一混合物に紫外線を照射する（第一重合工程）。
　ここで、第一混合物は、ＤＭＡＥＭＡ以外に、任意選択的に、例えば、他のモノマー、溶媒等を含んでよい。
　また、紫外線は、不活性雰囲気下において、照射されてよい。

　ＤＭＡＥＭＡとしては、市販品としてよい。
　第一混合物に含まれ得る他のモノマーとしては、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、ポリエチレングリコール側鎖を有するアクリル酸やメタクリル酸のエステル、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリルアミド等が挙げられ、特に、イオンバランスの調整を安定的に行うことを可能にする観点から、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、ポリエチレングリコール側鎖を有するアクリル酸やメタクリル酸のエステル、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドが好ましい。これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。ここで、他のモノマーの使用量のＤＭＡＥＭＡの使用量に対する割合（モル割合）は、０．００１~１とすることが好ましく、０．０１~０．５とすることが更に好ましい。

　溶媒としては、例えば、トルエン、ベンゼン、クロロホルム、メタノール、エタノール等が挙げられ、特に、ＤＭＡＥＭＡのエステル結合に対して不活性であるため、トルエン、ベンゼンが好ましい。これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

　この工程では、例えば、透明な密封バイアルに、上記第一混合物を加え、不活性ガスをバブリングすることによってバイアル内を不活性雰囲気とした後に、バイアルの外部から紫外線照射装置を用いて紫外線を照射する。

　紫外線の波長としては、２１０~６００ｎｍであることが好ましく、３６０~３８０ｎｍであることが更に好ましい。上記範囲とすれば、効率よく重合反応を進行させることができ、所期の共重合割合を有する高分子材料を安定的に得ることができる。また、製造したポリマー材料が着色することを防ぐこともできる。
　紫外線の照射強度としては、０．０１~５０ｍＷ／ｃｍ^２であることが好ましく、０．１~５ｍＷ／ｃｍ^２であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、無用な化学結合の切断等による分解を抑制しつつ、安定的に、適切な速度（時間）で重合反応を進行させることができる。
　不活性ガスとしては、窒素、アルゴン、ヘリウム、ネオン等が挙げられる。

　温度条件としては、１０~４０℃あることが好ましく、２０~３０℃あることが更に好ましい。上記範囲とすれば、通常の実験室の室温において反応を行うことができ、また、光とは別の手段（加熱等）により反応を抑制することが可能となる。
　反応時間としては、１０分~４８時間であることが好ましく、６０分~２４時間であることが更に好ましい。

　この工程において、ＤＭＡＥＭＡは、紫外線の照射により、ラジカル重合して、ポリマー（ポリ（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）（ＰＤＭＡＥＭＡ））となり、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートを含むホモポリマーブロックが形成される。他のモノマーも用いた場合には、ＤＭＡＥＭＡと他のモノマーとを含むポリマーブロックが形成される。

　次いで、（Ａ−２）の温度応答性ポリマーの製造方法では、第一重合工程における重合物（具体的には、ポリマー化した２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）の数平均分子量が所定値以上となった時点で、第一混合物にアニオン性モノマーを添加して第二混合物を調製する（添加工程）。
　ここで、第二混合物は、第一重合工程後の第一混合物、及びアニオン性モノマー以外に、例えば、他のモノマー、前述の第一混合物に含まれ得る溶媒（トルエン、ベンゼン、メタノール等）等を含んでよい。
　また、アニオン性モノマーは、不活性雰囲気下において、添加されてよい。

　アニオン性モノマーとしては、例えば、アクリル酸、メタクリル酸、側鎖にカルボキシル基、スルホン酸基及びリン酸基からなる群から選択される少なくとも１種の基を有するビニル誘導体等が挙げられ、特に、化学的安定性の観点から、アクリル酸、メタクリル酸が好ましい。
　これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

　第二混合物に含まれ得る他のモノマーとしては、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、ポリエチレングリコール側鎖を有するアクリル酸やメタクリル酸のエステル、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリルアミド等が挙げられ、特に、電気的に中性であり、且つ親水性である、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドが好ましい。これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。ここで、他のモノマーの使用量のＤＭＡＥＭＡの使用量に対する割合（モル）は、０．０１~１０とすることが好ましく、０．１~５とすることが更に好ましい。

　この工程では、例えば、バイアルに不活性ガスをフローさせることによってバイアル内を不活性雰囲気に保ちながら、上記第二混合物を添加する。

　数平均分子量の所定値は、曇点低減の効果を十分に得る観点から、好適には５，０００であり、更に好適には２０，０００であり、特に好適には１００，０００である。
　なお、第一重合工程後の第一混合物中におけるポリマー化したＰＤＭＡＥＭＡの数平均分子量は、所定の時点で重合系から少量の反応混合物を採取して、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）や光散乱法（ＳＬＳ）等の当業者に周知の方法により、測定することができる。

　この工程において、重合中のＤＭＡＥＭＡを含むホモポリマーに加えて、アニオン性モノマーも重合系に含められることとなり、バイアル内の重合系が、ＤＭＡＥＭＡの単独重合系から、ＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマーとの共重合系に、変わることとなる。

　そして、（Ａ−２）の温度応答性ポリマーの製造方法では、第二混合物に紫外線を照射する（第二重合工程）。
　ここで、紫外線は、不活性雰囲気下において、照射されてよい。

　この工程では、例えば、第二混合物を添加した後のバイアルの外部から紫外線照射装置を用いて紫外線を照射する。

　第二重合工程における、紫外線の波長、紫外線の照射強度、用いる不活性ガス、反応温度、反応時間等の諸条件は、第一重合工程における条件と同様としてよい。

　この工程において、ＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマーとが、紫外線の照射により、ラジカル重合して、第一重合工程において形成したＤＭＡＥＭＡを含むホモポリマーブロックの重合鎖α末端に連続する形態で、ＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマーとを含むコポリマーブロックが形成される。他のモノマーも用いた場合には、ＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマーと他のモノマーとを含むコポリマーブロックが形成される。

　上記の通り、ＤＭＡＥＭＡを含むホモポリマーブロックと、ＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマーとのコポリマーブロックとを含む温度応答性ポリマーが得られる。

　なお、（Ａ−２）の製造方法では、当業者に理解される通り、種々の分子量及び分子構造を有するポリマーの混合物が生成するところ、ＤＭＡＥＭＡを含むホモポリマーブロックと、ＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマーとのコポリマーブロックとを含む温度応答性ポリマーを主成分として得る観点から、第一重合工程、添加工程、及び第二重合工程に亘って、同一の条件下で重合を行うことが好ましい。

（温度応答性ポリマー）
　（Ａ−２）の温度応答性ポリマーは、上記（Ａ−２）の製造方法により製造される。

　（Ａ−２）の温度応答性ポリマーは、主として２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートを含み、任意選択的にジメチルアクリルアミド、ポリエチレングリコール側鎖を有するアクリル酸やメタクリル酸等の親水性モノマー等の他のモノマー単位を含むポリマーブロック（重合鎖α末端）と、主として２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートとアニオン性モノマー（重合鎖ω末端）とを含み、任意選択的に他のモノマー単位を含むコポリマーブロックとを含む。
　好適には、（Ａ−２）の温度応答性ポリマーは、ＤＭＡＥＭＡのホモポリマーブロックと、ＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマーとのコポリマーブロックとを含み、更に好適には、これらブロックからなる。

　ここで、（Ａ−２）の温度応答性ポリマーとしては、重合鎖α末端のポリマーブロック（例えば、ＤＭＡＥＭＡのホモポリマーブロック）の数平均分子量が５０００Ｄａ以上であることが好ましく、２００００Ｄａ以上であることが更に好ましい。

　（Ａ−２）の温度応答性ポリマーとしては、数平均分子量（Ｍｎ）が、１０~５００ｋＤａである分子が好ましい。また、重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）は、１．１~１０．０である分子が好ましい。
　温度応答性ポリマーの分子量は、紫外線の照射時間及び照射強度の条件により、適宜調整することができる。

　（Ａ−２）の温度応答性ポリマーによれば、曇点を、例えば室温（２５℃）以下に、低下させることができる。

　上記（Ａ−２）の温度応答性ポリマーでは、曇点以上の温度で形成された温度応答性ポリマーの不溶化物が、室温（約２５℃）条件下で再溶解するまでの時間が顕著に遅延する。これは、得られた温度応答性ポリマーは、分子内にカチオン性官能基とアニオン性官能基とが存在するため、高い自己凝集性を有するためであると推定される。

　特に、（Ａ−２）の温度応答性ポリマーは、重合鎖α末端に、高分子量（例えば、５０００Ｄａ以上）を有するＤＭＡＥＭＡのホモポリマーブロックを備えるため、ＤＭＡＥＭＡの側鎖の温度依存的なグロビュール転移が生じやすく、曇点を効果的に低減することが可能となると考えられる。

　また、この温度応答性ポリマーを用いて、後述するように、培養面にこの温度応答性ポリマーを被覆してなる細胞培養器を調製することができる。

　更に、（Ａ−２）の温度応答性ポリマーによれば、後述するように、細胞を適切な培養条件で培養することにより、管腔状（チューブ状）や塊状（ペレット状）等の構造を有する細胞構造体を形成させることができる。

　（Ａ−２）の温度応答性ポリマーが有する、カチオン性官能基（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ基）の官能基数と、アニオン性官能基（カルボキシル基）の官能基数との比（Ｃ／Ａ比）は、０．５~３２であることが好ましく、４~１６であることが更に好ましい。

　以下、上記（Ｂ）の温度応答性ポリマー及びその製造方法について記載する。

（温度応答性ポリマーの製造方法）
　（Ｂ）の温度応答性ポリマーの製造方法は、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）（以下、「モノマー（Ａ）」ともいう。）と、カチオン性モノマー（以下、「モノマー（Ｂ）」ともいう。）と、アニオン性モノマー（以下、「モノマー（Ｃ）」ともいう。）とを重合させるものである。任意選択的に、上記３種類のモノマーにこれら以外の他のモノマーを加えて重合させてよい。

　Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）としては、市販品としてよい。

　カチオン性モノマーとしては、カチオン性官能基を有するモノマーが挙げられ、カチオン性官能基としては、第１級~第４級アミノ基等のアミノ基、グアニジン基等が挙げられ、特に、化学的安定性、低細胞傷害性、滅菌安定性、強陽電荷性の観点から、第３級アミノ基が好ましい。
　より具体的には、カチオン性モノマーとしては、生理活性物質を担持したり、アルカリ性条件下においたりしても、安定性が高いものが好ましく、例えば、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル）−（メタ）アクリルアミド、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル）−（メタ）アクリレート、アミノスチレン、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）−（メタ）アクリルアミド、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）−（メタ）アクリレート等が挙げられる。
　これらの中で、特に、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル）アクリルアミドは、高い陽電荷強度を有することから、アニオン性物質の担持を容易にするため、好ましい。
　また、アミノスチレンは、高い陽電荷強度を有することから、アニオン性物質の担持を容易にすると共に、分子内の芳香環が水溶液中において他の物質の疎水性構造と相互作用することから、担持可能なアニオン性物質のバリエーションを広げるため、好ましい。
　更に、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）−メタクリルアミドは、中性域のｐＨで微弱な陽電荷を有し、且つ、水への溶解性が温度に影響されないことから、一度担持したアニオン性物質の放出を容易にするため、好ましい。
　これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

　アニオン性モノマーとしては、アニオン性官能基を有するモノマーが挙げられ、アニオン性官能基としては、カルボン酸基、スルホン酸基、硫酸基、リン酸基、ボロン酸基等が挙げられ、特に、化学的安定性、細胞親和性、高い精製度の観点から、カルボン酸基、スルホン酸基、リン酸基が好ましい。
　より具体的には、アクリル酸、メタクリル酸、ビニル安息香酸、等が挙げられ、特に、化学的安定性、細胞親和性の観点から、メタクリル酸、ビニル安息香酸が好ましい。
　これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

　他のモノマーとしては、例えば、ジメチルアクリルアミド、ポリエチレングリコール側鎖を有するアクリル酸やメタクリル酸等の中性の親水性モノマー等が挙げられる。
　これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　他のモノマーは、電荷以外の親水性・疎水性のバランスの調整に使用可能であり、バリエーションを広げることが可能となる。

　ここで、（Ｂ）の温度応答性ポリマーの製造方法におけるＮＩＰＡＭの使用量、カチオン性モノマーの使用量、他のモノマーの使用量それぞれの、モノマー（Ａ）~（Ｃ）の合計の使用量に対する割合（モル）は、モノマーの重合反応における反応性を考慮して、所望のモノマー成分の割合を得られるよう、当業者が適宜調整することができる。

　ここで、重合方法としては、ラジカル重合、イオン重合等が挙げられる。
　ラジカル重合としては、リビングラジカル重合が好ましく、リビングラジカル重合としては、可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、イニファーター重合等が挙げられ、イニファーター重合が好ましい。
　イオン重合としては、リビングアニオン重合が好ましい。

　（Ｂ）の温度応答性ポリマーの製造方法の一例は、ラジカル重合を用いる方法である。
　この製造方法の一例は、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）を含む第一混合物に紫外線を照射する第一重合工程と、第一混合物に、カチオン性モノマーとアニオン性モノマーとを添加して第二混合物を調製する添加工程と、第二混合物に紫外線を照射する第二重合工程と、を含む。

　この製造方法の一例では、まず、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）を含む第一混合物に紫外線を照射する（第一重合工程）。
　ここで、第一混合物は、ＮＩＰＡＭ以外に、任意選択的に、例えば、他のモノマー、溶媒、連鎖移動剤、安定剤、界面活性剤等を含んでよい。
　また、紫外線は、不活性雰囲気下において、照射されてよい。

　溶媒としては、例えば、ベンゼン、トルエン、クロロホルム、メタノール、水等が挙げられ、特に、溶解力の点、及び重合に不活性である点から、ベンゼン、トルエンが好ましい。これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

　紫外線の波長としては、２１０~６００ｎｍであることが好ましく、３６０~３８０ｎｍであることが更に好ましい。上記範囲とすれば、効率よく重合反応を進行させることができ、所期の共重合割合を有する高分子材料を安定的に得ることができる。また、製造したポリマー材料が着色することを防ぐこともできる。
　紫外線の照射強度としては、０．０１~５０ｍＷ／ｃｍ^２であることが好ましく、０．１~５ｍＷ／ｃｍ^２であることが更に好ましい。
　不活性ガスとしては、窒素、アルゴン、ヘリウム、ネオン等が挙げられる。

　温度条件としては、１０~４０℃あることが好ましく、２０~３０℃あることが更に好ましい。上記範囲とすれば、通常の実験室の室温において重合反応を行うことを可能とすることができ、また、光照射という手段とは別の加熱という手段での反応制御を可能とすることもできる。
　反応時間としては、反応時間としては、１０分~４８時間であることが好ましく、６０分~２４時間であることが更に好ましい。

　この工程において、ＮＩＰＡＭは、紫外線の照射により、ラジカル重合して、ポリマー（ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＭ））となり、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを含むホモポリマーブロックが形成される。他のモノマーも用いた場合には、ＮＩＰＡＭと他のモノマーとを含むポリマーブロックが形成される。

　次いで、（Ｂ）の温度応答性ポリマーの製造方法では、第一重合工程後の第一混合物にカチオン性モノマーとアニオン性モノマーとを添加して第二混合物を調製する（添加工程）。
　ここで、第二混合物は、第一重合工程後の第一混合物、カチオン性モノマー、及びアニオン性モノマー以外に、例えば、他のモノマー、溶媒、連鎖移動剤、安定剤、界面活性剤等を含んでよい。
　また、カチオン性モノマーとアニオン性モノマーとは、不活性雰囲気下において、添加されてよい。

　この工程では、例えば、バイアルに不活性ガスをフローさせることによってバイアル内を不活性雰囲気に保ちながら、上記カチオン性モノマーとアニオン性モノマーとを添加する。

　この工程において、重合中のＮＩＰＡＭを含むホモポリマーに加えて、カチオン性モノマー及びアニオン性モノマーも重合系に含められることとなり、バイアル内の重合系が、ＮＩＰＡＭの単独重合系から、ＮＩＰＡＭとカチオン性モノマーとアニオン性モノマーとの共重合系に、変わることとなる。

　そして、（Ｂ）の温度応答性ポリマーの製造方法では、第二混合物に紫外線を照射する（第二重合工程）。
　ここで、紫外線は、不活性雰囲気下において、照射されてよい。

　この工程では、例えば、カチオン性モノマーとアニオン性モノマーとを添加した後のバイアルの外部から紫外線照射装置を用いて紫外線を照射する。

　この工程において、ＮＩＰＡＭとカチオン性モノマーとアニオン性モノマーとが、紫外線の照射により、ラジカル重合して、第一重合工程において形成したＮＩＰＡＭを含むホモポリマーブロックの重合鎖α末端に連続する形態で、ＮＩＰＡＭとカチオン性モノマーとアニオン性モノマーとを含むコポリマーブロックが形成される。他のモノマーも用いた場合には、ＮＩＰＡＭと他のモノマーとを含むポリマーブロック、及び／又は、ＮＩＰＡＭとカチオン性モノマーとアニオン性モノマーと他のモノマーとを含むコポリマーブロックが形成される。

　上記の通り、ＮＩＰＡＭを含むホモポリマーブロックと、ＮＩＰＡＭとカチオン性モノマーとアニオン性モノマーとのコポリマーブロックとを含む温度応答性ポリマーが得られる。

　なお、この一例の製造方法では、効率的な反応を実現する観点から、第一重合工程、添加工程、及び第二重合工程に亘って紫外線を照射することが好ましい。

　（Ｂ）の温度応答性ポリマーの製造方法の別の例は、ラジカル重合を用いる方法であり、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）と、カチオン性モノマーと、アニオン性モノマーと、任意選択的に他のモノマーを含む混合物に紫外線を照射する。
　ここで、上記混合物は、例えば、溶媒、連鎖移動剤、安定剤、界面活性剤等を含んでよい。
　また、紫外線は、不活性雰囲気下において、照射されてよい。
　他の条件については、前述の一例の製造方法と同様としてよい。

　更には、イニファーター重合を用いる場合、イニファーターとして、ベンジル−（Ｎ，Ｎ−ジエチル）ジチオカルバメートを、溶媒として、トルエン等を用いてよく、近紫外線の照射によりリビング重合を行ってよい。ここで、１番目のモノマーによる重合後、単離操作を経て、２番目のモノマーによる重合を行うことによって、ブロック共重合体を得ることができる。

　更には、イオン重合を用いる場合、触媒として、ＮａＯＨ粉末を、溶媒として、精製に用いられる再沈殿用溶媒と共に非プロトン系溶媒を用いてよい。１番目のモノマーによる重合後、再沈殿操作（この操作後もω末端にイオン種が残る）を経て、２番目のモノマーによる重合を行うことによって、ブロック共重合体を得ることができる。

（温度応答性ポリマー）
　（Ｂ）の温度応答性ポリマーは、上記（Ｂ）の製造方法により製造される。

　（Ｂ）の温度応答性ポリマーは、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）単位と、カチオン性モノマー単位と、アニオン性モノマー単位とを含み、任意選択的に、他のモノマー単位を含む。本ポリマーは、前述の一例、別の例の製造方法により製造することができる。
　好適には、（Ｂ）の温度応答性ポリマーは、主としてＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）単位を含み、任意選択的に他のモノマー単位を含むポリマーブロック（重合鎖α末端）と、主としてカチオン性モノマー単位と、アニオン性モノマー単位とを含み、任意選択的に他のモノマー単位を含むコポリマーブロックとを含む。更に好適には、（Ｂ）の温度応答性ポリマーは、ＮＩＰＡＭのホモポリマーブロックと、ＮＩＰＡＭとカチオン性モノマーとアニオン性モノマーとのコポリマーブロックとを含み、特に好適には、これらブロックからなる。本ポリマーは、前述の一例の製造方法により製造することができる。

　従来の温度応答性ポリマーのうちの１つ（特開２０１４−１６２８６５号公報参照）では、ポリマーに温度応答性を与えるＤＭＡＥＭＡが、同時に、（アニオン性モノマーと共に）細胞構造体の形成に必要となるカチオン性モノマーであり、また、温度応答性に関わるＤＭＡＥＭＡは、ポリマーブロックとして重合鎖α末端に含まれている。
　かかる温度応答性ポリマーでは、重合鎖α末端に必ずカチオン性モノマーが存在することから、重合鎖中におけるカチオン性サイトの位置の調整の自由度が高くはなく、また、カチオン性モノマーが主としてＤＭＡＥＭＡに限られることから、カチオン性サイトの陽電荷強度の調整や、温度応答性ポリマー水溶液のｐＨの調整も必ずしも容易とは言えなかった。
　そして、上記温度応答性ポリマーを、例えば、温度応答性ポリマーを薬物送達（ＤＤＳ）に用いた場合、担持可能な薬剤の種類や量が限られる可能性があった。ＤＤＳの手法としては、例えば、細胞培養器に薬剤を担持させた温度応答性ポリマーを塗布して、塗布後の細胞培養器で細胞や組織を培養することによって、被覆物から細胞・組織に対して薬剤を徐放するといった手法等が挙げられる。ここで、上記従来の温度応答性ポリマーでは、陽電荷強度が小さいＤＭＡＥＭＡを含むため、アニオン性物質の薬剤の担持は必ずしも容易とは言えず、担持可能な薬剤の種類や量が限られる可能性があった。

　一方、（Ｂ）の温度応答性ポリマーでは、ポリマーに温度応答性を与えるＮＩＰＡＭは中性のモノマーであり、（アニオン性モノマーと共に）細胞構造体の形成に必要となるカチオン性モノマーはＮＩＰＡＭとは異なるモノマーである。
　（Ｂ）の温度応答性ポリマーでは、重合鎖α末端に必ずしもカチオン性モノマーが存在する必要はなく、重合鎖中におけるカチオン性サイトの位置を自由に調整することが可能であり、また、広範なカチオン性モノマーを用いることができるため、カチオン性サイトの陽電荷強度や温度応答性ポリマー水溶液のｐＨを容易に調整することが可能である。
　（Ｂ）の温度応答性ポリマーによれば、例えば、温度応答性ポリマーを薬物送達（ＤＤＳ）に用いた場合、担持可能な薬剤の種類を拡大しつつ、その量を増加させることが可能となり、ひいては、温度応答性ポリマーの応用範囲を拡大することができる。

　（Ｂ）の温度応答性ポリマーでは、ＮＩＰＡＭ単位の、ＮＩＰＡＭ単位、カチオン性モノマー単位、アニオン性モノマー単位の合計に対する割合（モル）が、０．６~０．９であることが好ましく、０．７~０．９であることが更に好ましく、０．９であることが特に好ましい。
　他のモノマーも用いた場合には、他のモノマー単位の、ＮＩＰＡＭ単位、カチオン性モノマー単位、アニオン性モノマー単位の合計に対する割合（モル）が、０．００１~０．２であることが好ましく、０．０１~０．１であることが更に好ましい。

　（Ｂ）の温度応答性ポリマーとしては、重合鎖α末端のポリマーブロック（例えば、ＮＩＰＡＭのホモポリマーブロック）の数平均分子量が５０００Ｄａ以上であることが好ましく、２００００Ｄａ以上であることが更に好ましい。

　（Ｂ）の温度応答性ポリマーとしては、数平均分子量（Ｍｎ）が、１０~５００ｋＤａである分子が好ましい。また、重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）は、１．１~１０．０である分子が好ましい。
　温度応答性ポリマーの分子量は、重合条件により、適宜調整することができる。

　（Ｂ）の温度応答性ポリマーによれば、曇点を、例えば室温（２５℃）以下に、低下させることができる。

　上記温度応答性ポリマーでは、曇点以上の温度で形成された温度応答性ポリマーの不溶化物が、室温（約２５℃）条件下で再溶解するまでの時間が顕著に遅延する。これは、得られた温度応答性ポリマーは、分子内にカチオン性官能基とアニオン性官能基とが存在するため、高い自己凝集性を有するためであると推定される。

　特に、前述の（Ｂ）の温度応答性ポリマーは、重合鎖α末端に、高分子量を有するＮＩＰＡＭのホモポリマーブロックを備えるため、ＮＩＰＡＭの側鎖の温度依存的なグロビュール転移が生じやすく、曇点を効果的に低減することが可能となると考えられる。

　更に、（Ｂ）の温度応答性ポリマーによれば、後述するように、細胞を適切な培養条件で培養することにより、管腔状（チューブ状）や塊状（ペレット状）等の構造を有する細胞構造体を形成させることができる。

　（Ｂ）の温度応答性ポリマーが有する、カチオン性官能基の官能基数と、アニオン性官能基の官能基数との比（Ｃ／Ａ比）は、０．５~３２であることが好ましく、４~１６であることが更に好ましい。

　以下、上記（Ｃ）の温度応答性ポリマー及びその製造方法について記載する。

（温度応答性ポリマー組成物の製造方法）
　（Ｃ）の温度応答性ポリマー組成物の製造方法は、まず、混合型温度応答性ポリマー組成物を調製する（混合物調製工程）。具体的には、（Ｃ１）２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）及び／又はその誘導体の重合体と、（Ｃ２）２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（トリス）と、（Ｃ３）核酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、デキストラン硫酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリリン酸、硫酸化多糖類、カードラン及びポリアルギン酸並びにこれらのアルカリ金属塩からなる群から選択される一種以上のアニオン性物質とを混合する。なお、（Ｃ２）トリスは任意選択的な成分である。

（温度応答性ポリマー組成物）
　（Ｃ）の温度応答性ポリマー組成物は、上記の通り、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体の重合体と、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオールと、核酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、デキストラン硫酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリリン酸、硫酸化多糖類、カードラン及びポリアルギン酸並びにこれらのアルカリ金属塩からなる群から選択される一種以上のアニオン性物質とを含む。

　（Ｃ１）のＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体は、温度応答性ポリマーであり、その曇点は３２℃である。（Ｃ２）のトリスは、曇点の若干の低下、及び／又は曇点よりも高温で形成されたポリマーが、曇点以下に冷却された際に再溶解する速度を低減させる役割を果たし、また、疎水化されたポリマー層中でも親水性を維持しながら、アミノ基に由来する陽電荷により細胞に刺激を与える役割を果たすと推定される。（Ｃ３）のアニオン性物質は、培養する細胞の遊走や配向を可能にする役割や細胞傷害性を抑制する役割を果たすと推定される。

　この混合型温度応答性ポリマー組成物によれば、曇点を室温（２５℃）以下に低減させることができる。
　上記組成物では、ＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体の側鎖とトリスとが、互いに相互作用（例えば、架橋する作用）して、上記重合体が凝集しやすくなっていると推定される。

　ここで、上記（Ｃ１）について、ＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体としては、数平均分子量（Ｍｎ）が、１０~５００ｋＤａである分子が好ましい。また、重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）は、１．１~６．０である分子が好ましい。

　また、（Ｃ１）のＤＭＡＥＭＡの誘導体としては、例えば、メタクリレートのメチル基の水素原子をハロゲン置換した誘導体、メタクリレートのメチル基を低級アルキル基で置換した誘導体、ジメチルアミノ基のメチル基の水素原子をハロゲン置換した誘導体、ジメチルアミノ基のメチル基を低級アルキル基で置換した誘導体が挙げられる。

　上記（Ｃ２）について、トリスは、純度９９．９％以上の純物質であるか、又は、トリス水溶液を、アルカリ性物質の添加等により、使用時に中性又は塩基性とすることが好ましい。トリスは、塩酸塩の状態で市販されているところ、これを用いた場合には、トリス水溶液のｐＨが下がるため、組成物の曇点が７０℃程度にまで上昇してしまう。そのため、トリス塩酸塩は好ましくない。

　上記（Ｃ３）に列挙したアニオン性物質のうち、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、その他１本鎖、２本鎖、オリゴ体、ヘアピン等の人工核酸等が挙げられる。

　また、上記（Ｃ３）に列挙したアニオン性物質は、ある程度の大きさ、例えば１~５，０００ｋＤａの分子量（Ｍ）を有していることが好ましい。
　分子量を上記範囲とすれば、アニオン性物質は、カチオン性物質とイオン結合して、カチオン性物質を、長時間捕捉する役割を果たすことができ、安定したイオン複合体微粒子を形成させることがでる。また、一般的にカチオン性物質が有する、細胞の細胞膜表面に対する静電的相互作用に起因する細胞傷害性を緩和することもできる。

　（Ｃ３）に列挙したアニオン性物質の他にも、例えば、カチオン性ポリマーであるポリ（４−アミノスチレン）の４−位のアミノ基に対してシュウ酸等のジカルボン酸を脱水縮合させることによって、アニオン性官能基を導入した、実質的にアニオン性物質として機能するポリマー誘導体も、用いることができる。

　なお、上記（Ｃ３）に列挙したアニオン性物質は、二種以上含まれていてもよい。

　ここで、（Ｃ１）２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）及び／又はその誘導体の重合体に対する、（Ｃ２）２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（トリス）の割合（（Ｃ２）／（Ｃ１））が、１．０以下とした混合型温度応答性ポリマー組成物を用いることが好ましい。
　なお、割合（（Ｃ２）／（Ｃ１））は、質量割合であるものとする。

　上記割合の混合型温度応答性ポリマー組成物を用いた場合、後述の培養工程で、細胞構造体を形成しやすくすることができる。
　この組成物によれば、上記組成物の親水性と疎水性とのバランスを更に好適にすることができる。そして、この好適なバランスが、培養面への細胞の接着性を好適に調整し、細胞の遊走や配向を活性化していると推定される。

　また、上記割合（（Ｃ２）／（Ｃ１））は、０．１以上あることが好ましい。
　上記割合を０．１以上とすることにより、曇点を低減させるという上記効果が得られやすい。また、細胞構造体を形成しやすくするという上記効果が得られやすい。

　上記と同様の理由により、上記割合（（Ｃ２）／（Ｃ１））は、０．１~０．５であることが更に好ましい。

　ここで、混合型温度応答性ポリマー組成物中のＣ／Ａ比（正電荷／負電荷）が、０．５~１６であることが好ましい。
　なお、本願明細書では、Ｃ／Ａ比とは、組成物中に含まれる物質が有する正電荷の、組成物中に含まれる物質が有する負電荷に対する割合を指す。具体的には、Ｃ／Ａ比は、（Ｃ１）ＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体のモル数をＮ１、（Ｃ３）アニオン性物質のモル数をＮ３としたときに、｛（重合体１分子当たりの正電荷）×Ｎ１｝／｛（アニオン性物質１分子当たりの負電荷）×Ｎ３｝という式で表される。
　またなお、本願明細書では、アニオン性物質をＤＮＡとした場合、アニオン性物質１分子当たりの負電荷数は、ＤＮＡの塩基対の数（ｂｐ数）×２で計算し、分子量（Ｄａ）は、ｂｐ数×６６０（ＡＴペア及びＣＧペアの平均分子量）で計算するものとする。

　Ｃ／Ａ比を０．５~１６とすることにより、管状細胞構造体を形成させやすくするという上記効果が得られやすくなる。
　上記組成物中の正電荷と負電荷とのバランスを好適にして、正電荷による細胞傷害性を抑制することができると推定される。また、上記組成物の親水性と疎水性とのバランスを更に好適にして、細胞の遊走や配向を生じやすくすることができると推定される。

　上記と同様の理由により、上記Ｃ／Ａ比は、２~１０とすることが更に好ましく、特にＣ／Ａ比は８付近であることが最も好ましい。

　（準備工程）
　—例の製造方法では、次いで、上記温度応答性ポリマー及び／又は上記温度応答性ポリマー組成物で培養面の一部を被覆して、被覆培養面を準備する（準備工程）（図１（ｉ）~（ｉｉｉ）参照）。

　ここで、被覆培養面以外の培養面は、細胞接着性としても、細胞非接着性としてもよいが、所望の形状の細胞塊を得られやすくする観点から、細胞非接着性とすることが好ましい。細胞非接着性の培養面の調製方法は、特に限定されることなく、例えば、細胞非接着性の培養面を備える細胞培養器、例えば、ＳＵＭＩＬＯＮ社製のＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（登録商標）や、大腸菌培養用の細胞培養器等の細胞接着のための表面処理を施していないもの等を用いてもよく、細胞非接着性のシートや中敷き等を用いてもよい。

　ここで、図１に示すように、被覆培養面は、細胞の壁との接触を抑制して、細胞塊の形状を整える観点から、非被覆培養面に取り囲まれるように設けられることが好ましい（図１（ｉｉ）、（ｉｉｉ）参照）。

　被覆培養面の形状は、所望する軟骨細胞塊の形状に合わせて、適宜調整してよく、平面視で、円形、矩形、ドーナツ形（リング形）等が挙げられる。

　上記準備工程は、例えば、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を、溶媒に溶解して、温度応答性ポリマー溶液としてから、細胞培養器の培養面上に塗布し、乾燥させて被覆細胞培養器を準備する工程（準備工程Ｉ）としてもよく、また、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を含む水溶液（温度応答性ポリマー水溶液）を温度応答性ポリマーの曇点以下に冷却し、冷却した温度応答性ポリマー水溶液を細胞培養器の培養面上に流延させ、曇点超の温度まで加熱して、被覆細胞培養器を準備する工程（準備工程ＩＩ）としてもよい。

　上記準備工程Ｉにおける温度応答性ポリマー溶液における溶媒としては、例えば、水；生理食塩水；緩衝液；メタノール、エタノール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、１−ブタノール、イソブチルアルコール、２−ブタノール、ｔ−ブチルアルコール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、２−メチル−２−ブタノール、３−メチル−２−ブタノール、２，２−ジメチル−１−プロパノール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、２−メチル−２−ブタノール、３−メチル−２−ブタノール、２，２−ジメチル−１−プロパノール、１−ヘキサノール、２−メチル−２−ペンタノール、アリルアルコール、ベンジルアルコール、サリチルアルコール等のアルコール；アセトン、エチルメチルケトン、ジエチルケトン、メチルプロピルケトン、メチルイソブチルケトン、メチルビニルケトン、シクロヘキサノン、２−メチルシクロペンタノン、アセトフェノン、ベンゾフェノン、イソホロン等のケトン；酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ｎ−ブチル、酢酸イソブチル、酢酸ｓｅｃ−ブチル、酢酸ｔｅｒｔ−ブチル、酢酸ビニル、ギ酸メチル、ギ酸エチル、ギ酸プロピル、上記アルコールとリン酸のエステル、上記アルコールと炭酸のエステル等のエステル；クロロホルム；ベンゼン；トルエン；ジエチルエーテル；ジクロロメタン；等が挙げられる。
　中でも、培養面に均一に被覆しやすく、また、温度応答性ポリマーの溶解性に優れるという観点から、メタノール、エタノール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、２−ブタノール、ｔ−ブチルアルコール、アリルアルコール等のアルコール；アセトン、エチルメチルケトン、ジエチルケトン、メチルビニルケトン等のケトン；酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ｔｅｒｔ−ブチル、酢酸ビニル等のエステル；クロロホルム；ベンゼン；トルエン；ジエチルエーテル；ジクロロメタンが好ましい。また、短時間で乾燥させることができ、培養面に一層均一に塗布しやすいという観点から、沸点が低い有機溶媒（例えば、炭素数１~４の低級アルコール、炭素数３~５の低級ケトン、及び炭素数１~４のアルキル基を有する酢酸アルキルエステルからなる群より選ばれる少なくとも１種、特に、水より沸点が低い、炭素数１~４の低級アルコール、炭素数３~５の低級ケトン、及び炭素数１~４のアルキル基を有する酢酸アルキルエステルからなる群より選ばれる少なくとも１種）がさらに好ましく、コスト、操作性にも優れる観点から、メタノール、エタノールが特に好ましい。
　上記溶媒は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
　溶媒は、温度応答性ポリマーの溶解性に優れるため、曇点以上の温度（例えば、室温や３７℃等）にしても、温度応答性ポリマーが不溶化して沈殿しにくい。そのため、温度応答性ポリマーを塗布する際に、温度応答性ポリマー溶液の温度管理をする手間が省け、簡易に被覆細胞培養器を準備することができる。

　上記準備工程Ｉにおいて、温度応答性ポリマー溶液には、細胞が自己凝集しやすくなるという観点から、親水性分子が含まれることが好ましい。親水性分子としては、温度応答性ポリマーのＣ／Ａ比に影響しない非イオン性かつ親水性であるもの、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡＡ）、グリセリン、ＴｒｉｔｏｎＸ、ポリプロピレングリコール等が挙げられる。

　上記準備工程Ｉにおいて、温度応答性ポリマー溶液中の温度応答性ポリマーの含有量は、温度応答性ポリマーが培養面に均一に被覆されやすくなるという観点から、温度応答性ポリマー溶液（１００重量％）に対して、０．０００７５~０．０１５重量％であることが好ましく、０．００１~０．０１重量％であることがより好ましい。

　上記準備工程Ｉにおいて、温度応答性ポリマー溶液中の親水性分子の含有量は、細胞が自己凝集しやすくなるという観点から、温度応答性ポリマー（１００重量％）に対して、０．００００１~０．０００１５重量％であることが好ましく、０．００００３~０．０００１重量％であることがより好ましい。

　上記準備工程Ｉにおいて、温度応答性ポリマー溶液は、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物が培養面に均一に被覆されやすくなるという観点から、水が含まれないことが好ましく、温度応答性ポリマー溶液（１００重量％）中の水の重量割合が０．５重量％以下であることがより好ましく、０．１重量％以下であることがさらに好ましい。
　なお、水の重量割合は、ガスクロマトグラフィー、カールフィッシャー法等当業者に周知の方法により測定可能である。

　上記準備工程Ｉにおいて、温度応答性ポリマー溶液は、培養面の全面に塗布してもよいし、培養面の一部に塗布してもよい。中でも、簡易に細胞構造体が得られるという観点から、培養面の全面に塗布することが好ましい。

　上記準備工程Ｉにおいて、塗布した温度応答性ポリマー溶液を乾燥させる条件としては、培養面に温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を均一に被覆する観点から、大気圧下、温度１０~７０℃、時間１~３，０００分が好ましい。塗布した温度応答性ポリマー溶液を、素早く乾燥させることにより、培養面上に温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物が偏ることなく、均一に被覆されやすくなる。
　塗布した温度応答性ポリマー溶液は、例えば、細胞培養器を３７℃のインキュベーター中で静置することによって乾燥させてもよい。

　上記準備工程ＩＩにおいて、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を溶解する溶媒としては、例えば、水；生理食塩水；リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス緩衝液等の緩衝液；等が挙げられる。

　上記準備工程ＩＩにおいて、温度応答性ポリマー水溶液を冷却する方法としては、例えば、温度応答性ポリマー水溶液を約４℃の冷蔵庫に入れて曇点以下の温度まで冷却する方法等が挙げられる。

　上記準備工程ＩＩにおいて、温度応答性ポリマー水溶液を培養面上に流延させる方法としては、例えば、曇点以下の温度を有する温度応答性ポリマー水溶液を、細胞培養器の培養面を傾けることによって伸ばす方法、スパチュラを用いて温度応答性ポリマー水溶液を延ばす方法等が挙げられる。

　上記準備工程ＩＩにおいて、流延した温度応答性ポリマー水溶液を曇点超まで加熱する方法としては、例えば、流延工程後の細胞培養器を３７℃のインキュベーター中で静置する方法等が挙げられる。

　図１に示す一例の軟骨細胞塊の製造方法では、準備工程を、細胞培養器（図１（ｉ）参照）の培養面の中央部分に、所望の形状を描きながら、上記温度応答性ポリマー及び／又は上記温度応答性ポリマー組成物を塗布し（図１（ｉｉ）参照）、塗布部分を乾燥する（図１（ｉｉｉ）参照）ことによって、行っている。

　また、本実施形態（Ｉ）における準備工程は、細胞培養器の培養面に、所望の形状の穴（くり抜き）を有するマスキングシート（図示せず）を敷き、そして、シートの上から上記温度応答性ポリマー及び／又は上記温度応答性ポリマー組成物を配置し、その後、シートを取り除くことによっても、行うことができる。
　かかるマスキングシートの素材としては、当業者に周知の素材が使用可能であり、例えば、接触角が７０°以下の素材、具体的には、親水性基で修飾したポリエチレンテレフタレート、ポリスチレン、ポリカーボネート、ガラス、ポリプロピレン等が挙げられ、特に、細胞培養に使用するために溶出物を少なくする観点から、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクルリルアミドが放射線グラフト重合により導入固定されたポリスチレン等が好ましい。
　シートの形状、サイズ、厚さ等は、特に限定されないが、厚さ０．０５~２．０ｍｍであることが好ましい。

　被覆培養面の面積は、特に限定されないが、例えば、φ３５ｍｍの細胞培養器を用いて、外径１~２０ｍｍ、内径０．１~１９ｍｍサイズのドーナツ形の軟骨細胞塊を製造する場合、０．５~３００ｍｍ^２としてよい。

　被覆培養面が単位面積当たりに有する温度応答性ポリマー及び温度応答性ポリマー組成物の量は、０．１~３．０μｇ／ｃｍ^２とすることが好ましく、０．５~２．５μｇ／ｃｍ^２とすることがより好ましい。

　被覆培養面のゼータ電位としては、０~５０ｍＶが好ましく、より好ましくは０~３５ｍＶ、更に好ましくは１０~２５ｍＶである。ゼータ電位が０ｍＶ以上であることにより、負に帯電する細胞が接着しやすくなる。また、ゼータ電位が５０ｍＶ以下であることにより、細胞毒性を軽減することができる。
　また、ゼータ電位を上記範囲とすることにより、細胞を適切な培養条件で培養するだけで、塊状（ペレット状）の構造を有する細胞構造体を一層簡便に作製させることができる。これは、表面ゼータ電位を上記範囲とすることによって、被覆培養面の表面に細胞毒性を惹起しない微弱な陽電荷を与えることができ、また、播種した細胞の速やかな接着を確保し、細胞の活性の向上及び細胞外マトリックスの分泌を促進し、更には、細胞遊走を適度に抑制して、細胞間の結合を強くすることができることによるものと推測される。
　なお、ゼータ電位とは、ポリスチレンラテックスをヒドロキシプロピルセルロースで被覆した粒子（ゼータ電位：−５~＋５ｍＶ）を標準のモニター粒子として、ゼータ電位計（例えば、型番「ＥＬＳＺ」、大塚電子社製等）で測定した、Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉ式により算出される値をいう。

　被覆培養面の表面に対する水の接触角としては、本発明（Ｉ）の効果を高める観点から、５０~９０°が好ましく、より好ましくは６０~８０°、更に好ましくは６２~７８°である。
　なお、被覆培養面に対する水の接触角とは、被覆培養面内の任意の数点において、ＪＩＳ　Ｒ３２５７に準拠して測定される接触角の平均値をいう。

　図３に、準備工程の変形例及びこれに続く播種培養工程の概略を示す。
　図３（ａ）に、準備工程の第一変形例を示す。
　準備工程の第一変形例では、細胞培養器の培養面内に納まる平面視形状を有し、所定程度の厚さを有し、中央部分が所望の平面視形状にくり抜かれた細胞非接着性の中敷き（パッド）を用いる（図３（ａ）（ｉ）参照）。
　なお、細胞非接着性とは、細胞が接着しない又は接着しにくいことをいう。
　そして、この第一変形例の準備工程では、まず、細胞培養器の培養面全面に上記温度応答性ポリマー及び／又は上記温度応答性ポリマー組成物を配置し、次いで、ポリマー及び／又はポリマー組成物の上に上記細胞非接着性のシートを敷く。これにより、被覆培養面は壁で囲まれる、すなわち、凹部の底面に設けられることとなる。
　かかる第一変形例によれば、後述の播種培養工程において細胞塊の形状を三次元的に制御することが可能となり、所望の形状を有する軟骨細胞塊をより精密に製造することが可能となる。

　第一変形例において用いることができる細胞非接着性の中敷きの素材としては、当業者に周知の素材が使用可能であり、例えば、接触角が７０°以下の素材、具体的には、親水性基で修飾したポリエチレンテレフタレート、ポリスチレン、ポリカーボネート、ガラス、ポリプロピレン等が挙げられ、特に、細胞培養に使用するために溶出物を少なくする観点から、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクルリルアミドが放射線グラフト重合により導入固定されたポリスチレン等が好ましい。
　中敷きの形状、サイズ、厚さ等は、特に限定されないが、例えば、φ３５ｍｍの細胞培養器を用いる場合、径（最大径）０．１~１０ｍｍであることが好ましい。

　なお、上記第一変形例では、細胞培養器の培養面内に納まるサイズを有し、中央部分に所望の平面視形状の凹部を備える細胞非接着性の中敷きを用いてもよい（図示せず）。
　この場合の準備工程では、中敷きの凹部の底面のみに上記温度応答性ポリマー及び／又は上記温度応答性ポリマー組成物を配置し、凹部の底面以外の面、すなわち、凹部の壁面及び凹部以外の中敷きの表面には、上記ポリマー及び／又は上記ポリマー組成物を配置しない（図示せず）。
　かかる例によっても、後述の播種培養工程において所望の形状を有する軟骨細胞塊を凹部においてより精密に製造することが可能となる。

　また、本実施形態（Ｉ）においては、異なるサイズの細胞非接着性の中敷きを用いてもよく、例えば、播種培養工程を経てサイズが拡大した軟骨細胞塊を、より大きなサイズの細胞非接着性の中敷きの凹部に移し、次の播種培養工程を行うこともできる。
　かかる手法によれば、各播種培養工程における、軟骨細胞塊のサイズに対する被覆培養面のサイズを、一定程度に保持することができ、軟骨細胞塊の形状をより所望の形状に近づけることが可能になる。

　図３（ｂ）に、準備工程の第二変形例を示す。
　準備工程の第二変形例では、細胞培養器の培養面に所望の平面視形状の凹部を彫り込む（図３（ｂ）参照）。
　そして、この第二変形例の準備工程では、彫り込んだ凹部の底面のみに温度応答性ポリマー及び／又は上記温度応答性ポリマー組成物を配置し、凹部の底面以外の面、すわわち、凹部の壁面及び凹部以外のシートの表面には、上記ポリマー及び／又は上記ポリマー組成物を配置していない（図３（ｂ）（ｉ）参照）。
　かかる第二変形例によれば、後述の播種培養工程において細胞塊の形状を三次元的に制御することが可能となり、所望の形状を有する軟骨細胞塊をより精密に製造することが可能となる。

　なお、前述の準備工程の第一変形例及び第二変形例において、播種される細胞と凹部の壁面との接着を抑制して、得られる細胞塊の形状を整える観点から、特に凹部の壁面は細胞非接着性とすることが好ましい。

（播種培養工程）
　本実施形態（Ｉ）における一例の製造方法では、次いで、被覆培養面において、細胞塊の存在下、軟骨細胞に分化し得る細胞を播種し、細胞塊及び軟骨細胞に分化し得る細胞を共培養することによって、軟骨細胞塊を調製する（播種培養工程）。

　なお、図１に示すように、本実施形態（Ｉ）における一例の製造方法では、前述の準備工程の後、後述する播種培養工程の前に、前述の準備工程において準備した被覆培養面に軟骨細胞に分化し得る細胞を播種し、これを培養することによって、後述する播種培養工程において用いられる細胞塊を調製している（図１（ｉｖ）~（ｖｉｉｉ）参照）。
　しかしながら、本実施形態（Ｉ）の製造方法は、これに限定されることなく、播種培養工程において用いる細胞塊を、別途、（例えば、別の細胞培養器で、）調製してもよい（図示せず）。

　図１に示す例では、播種培養工程を、被覆培養面上に細胞塊を存在させた状態で、細胞培養器に細胞及び細胞培養用培地を加え（図２（ｉ）参照）、その後、この細胞培養器を一般的な３７℃の細胞インキュベーターに入れ（図２（ｉｉ）参照）、培地交換により新たな細胞培養用培地を加え（図２（ｉｉｉ）参照）、細胞培養器を更に細胞インキュベーターに入れる（図２（ｉｖ）、（ｖ）参照）ことによって、行っている。なお、図２（ｉｖ）における括弧内には、構造物の断面図を示す。

　この工程において、図２（ｉ）に示す通り、細胞塊は被覆培養面の中央部分に存在させることが、軟骨細胞塊の全体形状を整える観点から、好ましい。

　培地交換前に用いる細胞培養用培地と、培地交換後に用いる細胞培養用培地とは、目的や用途に応じて適宜選択されてよく、例えば、前の培地を増殖用培地とし、後の培地を分化用培地や再分化用培地としてもよい。

　軟骨細胞に分化し得る細胞としては、軟骨細胞、脂肪、滑膜、筋膜、骨膜、歯根膜、歯髄、骨髄由来の間葉系幹細胞、およびｉＰＳ細胞が挙げられる。
　上記軟骨細胞に分化し得る細胞は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。

　播種培養工程において細胞を播種する際の細胞密度は、０．３×１０^４個／ｃｍ^２以上、好ましくは０．３×１０^５個／ｃｍ^２以上、より好ましくは０．５×１０^５個／ｃｍ^２以上であり、また、培養中の細胞同士の接触による増殖停止等の、細胞周期に関する問題を生じにくくするため、１０．０×１０^５個／ｃｍ^２以下とすることが好ましく、より好ましくは４．５×１０^５個／ｃｍ^２以下である。

　培養条件は、使用する細胞種や実験目的に基づいて、当業者は適切に定めることができ適宜定めてよく、例えば、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気等としてよい。

　ここで、播種培養工程において生じる現象を、図２を参照しながら、以下に記載する。
　この工程においては、まず、播種された細胞が、中央部分に細胞塊が存在している被覆培養面上、及び非被覆培養面上に、沈降する。このとき、被覆培養面上に沈降した細胞は、被覆培養面上に接着して、生存する一方、非被覆培養面上に沈降した細胞は、非被覆培養面上には接着することなく存在する（図２（ｉｉ）参照）ところ、播種後１回目の培地交換により、接着しなかった細胞は吸引除去される（図２（ｉｉｉ）参照）。なお、かかる細胞の除去は、アポトーシスに伴うヒートショックプロテインや炎症性サイトカイン等の有害成分の放出を抑制する観点から、迅速に行うことが好ましい。
　そして、被覆培養面に接着した細胞を更に培養すると、被覆培養面と非被覆培養面との境界付近に位置する細胞が、該細胞よりも被覆培養面の中央部分側に位置する細胞をも伴いながら、中央部分にある細胞塊を包み込むように、被覆培養面から凝集し始める（図２（ｉｖ）参照）。言い換えると、接着していた細胞が、培養面から遠ざかるように、被覆培養面の中央部分に向かって、剥離して、シート状であった細胞全体がその周縁において反り返る。
　最終的に、予め配置されていた細胞塊と播種された細胞とが、断面視で積層構造をなすように、一体化する（図２（ｖ）参照）。

　本発明（Ｉ）の播種培養工程において用いられた軟骨に分化し得る細胞は、上記凝集の過程を経て軟骨細胞に分化、成熟するが、軟骨細胞は、当業者に周知のように、成熟すると低酸素状態を許容する特殊な性質を有する細胞である。従って、凝集の過程を経て得られた細胞塊中の軟骨細胞は低酸素状態でも生存することが可能となり、次の播種培養工程において、新たな軟骨に分化し得る細胞に包み込まれて、低酸素状態に置かれても、生存し続けることができる。

　なお、播種された細胞は、被覆培養面以外に細胞塊自体の上にも、沈降することとなるが、細胞が凝集する際に、併せて一体化することとなる。

　そして、本実施形態（Ｉ）における一例の製造方法では、前述の播種培養工程を複数回行う（図２（ｖｉ）参照）。
　播種培養工程を複数回行うことによって、サイズの大きな軟骨細胞塊を得ることができ、また、そのサイズを目的や用途に応じたものに調整することができる。
　かかる態様によれば、前の播種培養工程において形成された成熟した細胞で構成される細胞塊の周囲に、後の播種培養工程において未成熟の細胞を順次配置していくことが可能となり、軟骨に分化し得る細胞の成熟と、細胞塊の成長とを両立することが可能となる。
　なお、ここで、未成熟の細胞（増殖するが軟骨の性質は不十分な細胞）と、成熟した細胞（増殖しないが軟骨細胞の性質を獲得した細胞；低酸素環境を許容できる、高弾性な柔軟性を有する等の特性を備える）との制御は、培地を適切に選択することで行うことが可能である。例えば、使用する培地にＴＧＦ−β１等の分化誘導因子を混合すれば、細胞の分化を促進することが可能となる。

　前の播種培養工程において細胞塊が被覆培養面の中央部分に形成されてから、次の播種培養工程において細胞を播種するまでの時間は、特に限定されないが、形成した細胞塊を軟骨細胞塊に成熟させること、及び、軟骨細胞塊の活性の低下を抑制することを考慮し、また、使用する再分化培地の種類や濃度等を総合的に勘案して、当業者によって適宜設定されてよい。

（軟骨細胞塊）
　本実施形態（Ｉ）の軟骨細胞塊は、本実施形態（Ｉ）の軟骨細胞塊の製造方法により製造されたものである。
　軟骨細胞塊のサイズとしては、特に限定されないが、径（最大径）は１~１００ｍｍとしてよく、特にドーナツ形の軟骨細胞塊の場合、外径は３~５０ｍｍとしてよく、内径は０．３~４９ｍｍとしてよい。

（移植材料の製造方法）
　本実施形態（Ｉ）の移植材料の製造方法は、本実施形態（Ｉ）の軟骨細胞塊の製造方法により製造された軟骨細胞塊の存在下、間葉系細胞を播種し、軟骨細胞塊及び間葉系細胞を共培養することによって、移植材料を調製する、工程を含む。
　図４に、本実施形態（Ｉ）の移植材料の製造方法の概要について示す。

　本実施形態（Ｉ）の移植材料の製造方法における上記工程は、用いる細胞を間葉系細胞とすること以外、前述の本実施形態（Ｉ）の軟骨細胞塊の製造方法における播種培養工程と同様に行ってよい。

　ここで、間葉系細胞としては、軟骨細胞、線維芽細胞、ＡＤＳＣ等が挙げられる。

（移植材料）
　本実施形態（Ｉ）の移植材料は、本実施形態（Ｉ）の移植材料の製造方法により製造されたものである。
　本実施形態（Ｉ）の移植材料は、軟骨細胞塊の最外側に間葉系細胞、特に線維芽細胞が配置されているものであるため、生体に移植した際に、移植部位の周囲組織と頑強に接着しやすい傾向がある。このため、移植部位における治癒の効果を高め、予後をより良好なものとすることができる。

　図５に、本実施形態（Ｉ）における別の例の軟骨細胞塊の製造方法の概要について示す。
　本実施形態（Ｉ）における別の例の軟骨細胞塊の製造方法は、前述の準備工程の第一変形例を含むものである。

　具体的には、別の例の製造方法は、中央部分に平面視でドーナツ形（例えば、外径（φｏ）８ｍｍ、内径（φｉ）４ｍｍ、幅２ｍｍ）のくり抜きを設けた、細胞非接着性の中敷き（例えば、厚さ１ｍｍ）を用いるものである。
　ここで、被覆培養面の外輪郭線がなす線と、被覆培養面の外輪郭線がなす線とが、同心円をなすことが、軟骨細胞塊のドーナツ形状を整える意味で、好ましい。

　本実施形態（Ｉ）における別の例の軟骨細胞塊の製造方法における各工程の詳細は、前述の本実施形態（Ｉ）における一例の軟骨細胞塊の製造方法における各工程と同様としてよい（図５（ｉ）~（ｉｘ）参照）。

　別の例の製造方法において、例えば、細胞培養器としてφ３５ｍｍプレートを用いる場合、より形の整ったドーナツ形（リング形）の軟骨細胞塊を得る観点から、被覆培養面の幅を３ｍｍ以下とすることが好ましく、２．５ｍｍ以下とすることがより好ましく、壁の高さを３ｍｍ以下とすることが好ましく、２．５ｍｍ以下とすることがより好ましい。

（複合材の製造方法）
　本実施形態（Ｉ）の複合材の製造方法は、本実施形態（Ｉ）の軟骨細胞塊のうち特にドーナツ形の軟骨細胞塊を管状構造体に嵌装させることによって、複合体を調製する複合体調製工程と、複合体を培養して、複合材を調製する培養工程とを含む。

　好適には、本実施形態（Ｉ）の複合材の製造方法は、管状構造体と芯材とを準備したうえで（図６（ｉ）参照）、芯材を管状構造体の中空部の一方端から他方端に向かって挿入する（図６（ｉｉ）参照）工程と、本実施形態（Ｉ）のドーナツ形の軟骨細胞塊を上記管状構造体に嵌装させることによって、複合体を調製する複合体調製工程（図６（ｉｉｉ）参照）と、複合体を培養して、複合材を調製する（図６（ｉｖ）参照）培養工程と上記複合材から芯材を取り出す（図６（ｖ）参照）工程とを含む。

　図６（ｉ）~（ｖ）に、本実施形態（Ｉ）における一例の複合材の製造方法の概要について示す。

　管状構造体としては、中空部を有しているものとしてよく、バイオチューブ（人工血管）、コラーゲン製チューブ、エラスチン製チューブ、ポリグルコン酸製チューブ、ポリ乳酸製チューブ等としてよい。
　バイオチューブは、コラーゲンを主成分とするものとしてよく、例えば、特開２００４−２６１２６０号公報の実施例に記載される方法で作成されてよい。
　管状構造体の外径としては、本実施形態（Ｉ）のドーナツ形の細胞構造体の内径と同様としてよく、例えば、１~１００ｍｍとしてよく、管状構造体の内径としては、特に限定されないが、例えば、０．１~５０ｍｍとしてよい。管状構造体の長さとしては、目的や用途に応じて適宜定められてよく、特に限定されないが、例えば、１~３００ｍｍとしてよい。

　芯材としては、中実体でも多孔体でも使用可能であり、具体的には、シリコン製の棒状構造物、アクリル製の棒状構造物、金属製の棒状構造物、素焼き、金属メッシュ圧縮構造体等としてよく、多孔体を使用すると、複合体の内腔側からの培地、酸素の拡散も可能となる。
　芯材の外径としては、上記管状構造体の内径と同様としてよく、例えば、０．１~５０ｍｍとしてよい。
　芯材の長さとしては、管状構造体の長さと同様としてよく、管状構造体の長さよりも、例えば０．１~１０ｍｍだけ長くても又は短くてもよい。

　上記複合体調製工程では、例えば、本実施形態（Ｉ）のドーナツ形の軟骨細胞塊をピンセットで固定しつつ、前述の工程で調製された（芯材が内部に設けられた）管状構造体を軟骨細胞塊の輪に通すことによって、行うことができる。
　管状構造体１個に対して用いられるドーナツ形の軟骨細胞塊の数は、目的や用途に応じて適宜定められてよく、特に限定されないが、例えば、１~１，０００個としてよい。
　また、軟骨細胞塊を複数用いた場合の、隣接する２つ軟骨細胞塊間の距離としては、目的や用途に応じて適宜定められてよく、特に限定されないが、例えば、この工程後・後述の培養工程前において、０．１~１００ｍｍとしてよい。

　前述の複合体調製工程において管状構造体の嵌装が終了してから、後述の培養工程において複合体の培養を開始するまでの時間としては、細胞の活性を維持する観点から、１~１８０分間とすることが好ましく、より好ましくは１~１２０分間である。

　上記培養工程は、例えば、前述の複合体調製工程で調製された複合体を、適切な条件（例えば、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気等）の下に、所定時間（例えば、１２時間~１５０日間）置くことによって、行うことができる。
　なお、上記培養工程は、生体内にて、行うこともでき、例えば、前述の複合体を生体内に埋入し、これを所定時間留置して、複合体の外表面を包囲するように形成される生体組織と複合体とを一体化することによって、行うこともできる。

　複合材からの芯材の取り出しは、ピンセット等を用いて、適宜行うことができる。

　なお、上記工程における各操作は、手動で行ってもよく、機械や装置を用いて行ってもよく、特に限定されない。

（複合材）
　本実施形態（Ｉ）の複合材は、本実施形態（Ｉ）の軟骨細胞塊のうち特にドーナツ形の軟骨細胞塊が管状構造体の外表面に設けられているものである（図６（ｖ）参照）。
　管状構造体の素材、外径、内径、長さ等；管状構造体１個に対して用いられるドーナツ形の軟骨細胞塊の数等は、本実施形態（Ｉ）の複合材の製造方法について前述した通りとしてよい。
　また、軟骨細胞塊を複数用いた場合の、隣接する２つ軟骨細胞塊（軟骨組織）間の距離としては、目的や用途に応じて適宜定められてよく、特に限定されないが、例えば、０．１~１００ｍｍとしてよく、隣接する２つ軟骨細胞塊（軟骨組織）が重なり合っていてもよい（すなわち、距離０ｍｍ）。

　本実施形態（Ｉ）の複合材では、管状構造体の内部に芯材が設けられていてもよい（図６（ｖ）参照）。
　芯材の素材、外径、長さ等は、本実施形態（Ｉ）の複合材の製造方法について前述した通りとしてよい。

　本実施形態（Ｉ）の複合材は、本実施形態の複合材の製造方法により製造されたものとしてよい。

　本実施形態（Ｉ）の軟骨細胞塊、移植材料、複合材は、関節、気管、鼻等の治療に有用であり、より具体的には、半月板、気管軟骨、鼻軟骨、耳軟骨、椎間板、関節軟骨、靭帯、アキレス腱、等の治療に好適に用いることができる。
　本実施形態（Ｉ）の軟骨細胞塊、移植材料、複合材の製造方法によれば、例えば、患者の患部のＣＴ画像をＣＡＤ図面化し、かかる図面に従って軟骨細胞塊及び移植材料の形状を整えることも可能となることから、本実施形態の軟骨細胞塊、移植材料、複合材の製造方法は、テーラーメイド医療の実現に大きく貢献する可能性を秘めている。

［［発明（ＩＩ）］］
　上皮系細胞は、細胞培養器に接着しにくい、培養器への接着が不十分であると増殖後の細胞の形態が不安定になる等の問題があり、従来の方法では安定した細胞培養が難しかった。また、上皮系細胞はアクチンフィラメントが発達しておらず細胞間の結合が弱いため、細胞培養器への接着が弱いと細胞培養面から剥がれやすかった。また、上皮系細胞から形成したスフェロイドも細胞培養器に接着しにくく、細胞培養器中で浮遊しやすいため、培地交換等の際に、誤吸引するおそれが非常に大きかった。
　発明（ＩＩ）に関し、本発明者らは、温度応答性ポリマーで被覆した細胞培養器は、上皮系細胞の接着性に極めて優れていること、特に、上皮系細胞以外の細胞は、温度応答性ポリマーで被覆した細胞培養器に適度な力で接着し、密度が一定以上となると自己凝集する性質を有することが多いが、上皮系細胞と温度応答性ポリマーで被覆した細胞培養器とを組み合わせると、他の細胞とは異なり、培養面と強く接着することを見出した。そして、温度応答性ポリマーで被覆した細胞培養器を用いることにより、上皮系細胞の培養が容易となり、増殖中の細胞の形態も優れることを見出した。また、細胞構造体が被覆細胞培養面から剥がれにくくなり、培地交換等の際に誤吸引しにくくなり、効率よく上皮系細胞の細胞構造体を形成できる方法を見出した。

［上皮系細胞の培養方法］
　本発明（ＩＩ）の上皮系細胞の培養方法は、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を調製する、調製工程と、上記温度応答性ポリマー又は上記温度応答性ポリマー組成物で、細胞培養器の培養面の少なくとも一部を被覆して被覆領域Ａを形成し、被覆領域Ａを有する被覆細胞培養器を準備する、培養器準備工程と、上皮系細胞を上記被覆細胞培養器に播種する、播種工程と、上記被覆領域Ａに接着した上記上皮系細胞を培養する、培養工程と、を含み、上記被覆領域Ａにおける上記温度応答性ポリマー又は上記温度応答性ポリマー組成物の濃度が、０．３ｐｇ／ｍｍ^２以上である。
　本発明（ＩＩ）の上皮系細胞の培養方法によれば、培養中の上皮系細胞の意図しない剥離が起こりにくくなり、容易に上皮系細胞を培養することができる。
　上記被覆細胞培養器は、培養面全面が被覆領域Ａであってもよいし、培養面の一部が被覆領域Ａであってもよい。また、培養面に１個の被覆領域Ａを有していてもよいし、複数の被覆領域Ａを有していてもよい。

（調製工程）
　実施形態（ＩＩ）における調製工程としては、上記発明（Ｉ）における調製工程と同様の工程が挙げられ、好適例としても同様のものが挙げられる。
　なお、本実施形態（ＩＩ）において、培養方法に用いられる温度応答性ポリマー及び温度応答性ポリマー組成物としては、上皮系細胞の接着性に一層優れるという観点から、（Ａ）が好ましい。
　また、本実施形態（ＩＩ）において、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）を含む混合物を調製する調製工程を、混合物調製工程と称する場合がある。

（培養器準備工程）
　本発明（ＩＩ）の実施形態（以下、「本実施形態（ＩＩ）」ともいう。）の培養方法において、上記培養器準備工程は、上記温度応答性ポリマー又は上記温度応答性ポリマー組成物で、細胞培養器の培養面の少なくとも一部を被覆して被覆領域Ａを形成し、被覆領域Ａを有する被覆細胞培養器を準備する工程である。

　上記培養器準備工程は、例えば、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を、溶媒に溶解して、温度応答性ポリマー溶液としてから、細胞培養器の培養面上に塗布し、乾燥させて被覆細胞培養器を準備する工程（培養器準備工程Ｉ）としてもよく、また、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を含む水溶液（温度応答性ポリマー水溶液）を温度応答性ポリマーの曇点以下に冷却し、冷却した温度応答性ポリマー水溶液を細胞培養器の培養面上に流延させ、曇点超の温度まで加熱して、被覆細胞培養器を準備する工程（培養器準備工程ＩＩ）としてもよい。
　ここで、被覆領域Ａを形成する際に使用する温度応答性ポリマー溶液を、温度応答性ポリマー溶液Ａ、被覆領域Ａを形成する際に使用する温度応答性ポリマー水溶液を、温度応答性ポリマー水溶液Ａを称する場合がある。

　上記培養器準備工程Ｉにおける温度応答性ポリマー溶液における溶媒としては、例えば、水；生理食塩水；緩衝液；メタノール、エタノール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、１−ブタノール、イソブチルアルコール、２−ブタノール、ｔ−ブチルアルコール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、２−メチル−２−ブタノール、３−メチル−２−ブタノール、２，２−ジメチル−１−プロパノール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、２−メチル−２−ブタノール、３−メチル−２−ブタノール、２，２−ジメチル−１−プロパノール、１−ヘキサノール、２−メチル−２−ペンタノール、アリルアルコール、ベンジルアルコール、サリチルアルコール等のアルコール；アセトン、エチルメチルケトン、ジエチルケトン、メチルプロピルケトン、メチルイソブチルケトン、メチルビニルケトン、シクロヘキサノン、２−メチルシクロペンタノン、アセトフェノン、ベンゾフェノン、イソホロン等のケトン；酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ｎ−ブチル、酢酸イソブチル、酢酸ｓｅｃ−ブチル、酢酸ｔｅｒｔ−ブチル、酢酸ビニル、ギ酸メチル、ギ酸エチル、ギ酸プロピル、上記アルコールとリン酸のエステル、上記アルコールと炭酸のエステル等のエステル；クロロホルム；ベンゼン；トルエン；ジエチルエーテル；ジクロロメタン；等が挙げられる。
　中でも、培養面に均一に被覆しやすく、また、温度応答性ポリマーの溶解性に優れるという観点から、水、メタノール、エタノール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、２−ブタノール、ｔ−ブチルアルコール、アリルアルコール等のアルコール；アセトン、エチルメチルケトン、ジエチルケトン、メチルビニルケトン等のケトン；酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ｔｅｒｔ−ブチル、酢酸ビニル等のエステル；クロロホルム；ベンゼン；トルエン；ジエチルエーテル；ジクロロメタンが好ましい。また、短時間で乾燥させることができ、培養面に一層均一に塗布しやすいという観点から、沸点が低い有機溶媒（例えば、炭素数１~４の低級アルコール、炭素数３~５の低級ケトン、及び炭素数１~４のアルキル基を有する酢酸アルキルエステルからなる群より選ばれる少なくとも１種、特に、水より沸点が低い、炭素数１~４の低級アルコール、炭素数３~５の低級ケトン、及び炭素数１~４のアルキル基を有する酢酸アルキルエステルからなる群より選ばれる少なくとも１種）がさらに好ましく、コスト、操作性にも優れる観点から、メタノール、エタノールが特に好ましい。
　上記溶媒は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
　溶媒は、温度応答性ポリマーの溶解性に優れるため、曇点以上の温度（例えば、室温や３７℃等）にしても、温度応答性ポリマーが不溶化して沈殿しにくい。そのため、温度応答性ポリマーを塗布する際に、温度応答性ポリマー溶液の温度管理をする手間が省け、簡易に被覆細胞培養器を準備することができる。

　上記培養器準備工程Ｉにおいて、温度応答性ポリマー溶液には、上皮系細胞の接着性を調整する目的で、適宜、親水性分子を加えてもよい。親水性分子としては、温度応答性ポリマーのＣ／Ａ比に影響しない非イオン性かつ親水性であるもの、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡＡ）、グリセリン、ＴｒｉｔｏｎＸ、ポリプロピレングリコール等が挙げられる。

　上記培養器準備工程Ｉにおいて、温度応答性ポリマー溶液Ａ中の温度応答性ポリマーの含有量は、温度応答性ポリマーが培養面に均一に被覆されやすくなるという観点から、温度応答性ポリマー溶液（１００質量％）に対して、０．０００００００９~０．０１質量％であることが好ましく、０．００００００９~０．０１質量％であることがより好ましい。

　上記培養器準備工程Ｉにおいて、温度応答性ポリマー溶液Ａ中の親水性分子の含有量は、細胞が自己凝集しやすくなるという観点から、温度応答性ポリマー（１００質量％）に対して、０．００００１~０．０００１５質量％であることが好ましく、０．００００３~０．０００１質量％であることがより好ましい。

　上記培養器準備工程Ｉにおいて、温度応答性ポリマー溶液Ａは、培養面の全面に塗布してもよいし、培養面の一部に塗布してもよい。
　培養面の一部に温度応答性ポリマー溶液を塗布する場合は、培養面上に、被覆領域を１個設けてもよいし、複数の被覆領域を設けてもよい。なお、培養面の一部に温度応答性ポリマー溶液を塗布する場合は、培養面が細胞非接着性である細胞培養器を用いることが好ましい。
　また、温度応答性ポリマー溶液は、被覆領域Ａ全体で均一の濃度となるように塗布してもよいし、一部分に濃く塗布し、他の部分は薄く塗布してもよい。
　なお、「細胞非接着性」とは、接着系細胞（例えば、線維芽細胞、心筋細胞、血管内皮細胞等）が、通常の培養条件下で、接着しない又は接着しにくい性質をいい、いわゆる「低接着性」のものも含む。

　上記培養器準備工程Ｉにおいて、塗布した温度応答性ポリマー溶液を乾燥させる条件としては、培養面に温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を均一に被覆する観点から、大気圧下、温度１０~７０℃、時間１~３，０００分が好ましい。塗布した温度応答性ポリマー溶液を、素早く乾燥させることにより、培養面上に温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物が偏ることなく、均一に被覆されやすくなる。
　塗布した温度応答性ポリマー溶液は、例えば、細胞培養器を３７℃のインキュベーター中で静置することによって乾燥させてもよい。

　上記培養器準備工程ＩＩにおいて、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を溶解する溶媒としては、例えば、水；生理食塩水；リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス緩衝液等の緩衝液；等が挙げられる。

　上記培養器準備工程ＩＩにおいて、温度応答性ポリマー水溶液を冷却する方法としては、例えば、温度応答性ポリマー水溶液を約４℃の冷蔵庫に入れて曇点以下の温度まで冷却する方法等が挙げられる。

　上記培養器準備工程ＩＩにおいて、温度応答性ポリマー水溶液を培養面上に流延させる方法としては、例えば、曇点以下の温度を有する温度応答性ポリマー水溶液を、細胞培養器の培養面を傾けることによって伸ばす方法、スパチュラを用いて温度応答性ポリマー水溶液を延ばす方法等が挙げられる。

　上記培養器準備工程ＩＩにおいて、流延した温度応答性ポリマー水溶液を曇点超まで加熱する方法としては、例えば、流延工程後の細胞培養器を３７℃のインキュベーター中で静置する方法等が挙げられる。

　上記細胞培養器としては、市販のマルチウェルプレート、ディッシュ、フラスコ等が挙げられる。上記細胞培養器の材質としては、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリプロピレン、ポリブテン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ガラス等が挙げられる。中でも、精密な成形加工が容易であり、種々の滅菌法を適用することが可能であり、透明性があるため顕微鏡観察に向いているという観点から、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）が好ましい。

　上記細胞培養器は、培養面表面に細胞接着処理等の処理が施されたものであってもよいし、表面が無処理であってもよい。上記培養面表面は、細胞の接着性を調整するために、コーティング処理、加工処理等がされていてもよい。

　上記培養面の平面視形状は、特に限定されないが、例えば、略四角形等の略多角形、略円形等の形状が挙げられる。中でも、より均質な細胞構造体が得られやすいという観点から、略円形が好ましい。

　上記培養面の底形状（底面の断面形状）は、特に限定されないが、平底、丸底（Ｕ底）、Ｖ底、凹凸状底等が挙げられる。特に、上皮系細胞の培養方法、及び後述の細胞構造体の培養工程において、上皮系細胞がスフェロイド状の細胞構造体
　上記培養面の少なくとも一部に窪み部を有していてもよい。その場合、上記被覆領域Ａ内に窪み部を設けることが好ましい。中でも、窪み部は被覆領域Ａの中央部に設けられることが好ましい。
　上記窪み部の深さは、例えば、０．００１~１０．０ｍｍであることが好ましく、０．０１~１ｍｍであることがより好ましい。
　また、上記窪み部の平面視面積は、例えば、０．０１~１０．０ｍｍ^２であることが好ましく、０．１~１ｍｍ^２であることがより好ましい。

　上記細胞培養器の培養面の面積は、１５０ｃｍ^２以下であることが好ましく、２１ｃｍ^２以下であることがより好ましく、２００ｍｍ^２以下であることがさらに好ましい。なお、上記細胞培養器の培養面の面積の下限値は、市販サイズのものであれば使用可能であり、特に限定されない。

　被覆領域Ａの面積は、１５０ｃｍ^２以下であることが好ましく、２１ｃｍ^２以下であることがより好ましく、２００ｍｍ^２以下であることがさらに好ましい。
　また、細胞培養器の培養面の全面積（１００％）に対する、被覆領域Ａの面積は、５０~１００％であることが好ましく、８０~１００％であることがより好ましい。

　上記被覆領域Ａにおける、単位面積当たりの有する温度応答性ポリマーの量は、０．３ｐｇ／ｍｍ^２以上であり、３．０ｐｇ／ｍｍ^２以上であることが好ましく、３０ｐｇ／ｍｍ^２以上であることがより好ましく、また、２００ｎｇ／ｍｍ^２以下であることが好ましい。上記範囲とすれば、上皮系細胞が培養面に接着して一層培養が容易となる。

　上記被覆細胞培養器における、被覆領域Ａのゼータ電位としては、０~５０ｍＶが好ましく、より好ましくは０~３５ｍＶ、更に好ましくは１０~２５ｍＶである。ゼータ電位が０ｍＶ以上であることにより、負に帯電する細胞が接着しやすくなる。また、ゼータ電位が５０ｍＶ以下であることにより、細胞毒性を軽減することができる。
　また、ゼータ電位を上記範囲とすることにより、上皮系細胞と被覆領域Ａとの接着性が一層向上する。これは、表面ゼータ電位を上記範囲とすることによって、被覆領域Ａに細胞毒性を惹起しない微弱な陽電荷を与えることができ、また、播種した細胞の速やかな接着を確保し、細胞の活性の向上及び細胞外マトリックスの分泌を促進し、更には、細胞遊走を適度に抑制して、細胞間の結合を強くすることができることによるものと推測される。
　なお、ゼータ電位とは、ポリスチレンラテックスをヒドロキシプロピルセルロースで被覆した粒子（ゼータ電位：−５~＋５ｍＶ）を標準のモニター粒子として、ゼータ電位計（例えば、型番「ＥＬＳＺ」、大塚電子社製等）で測定した、Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉ式により算出される値をいう。

　上記被覆領域Ａに対する水の接触角としては、本発明（ＩＩ）の効果を高める観点から、５０~９０°が好ましく、より好ましくは６０~８０°、更に好ましくは６２~７８°である。なお、被覆領域Ａに対する水の接触角とは、被覆領域Ａ内の任意の数点において、ＪＩＳ　Ｒ３２５７に準拠して測定される接触角の平均値をいう。

（播種工程）
　上記播種工程は、上皮系細胞を上記被覆細胞培養器に播種する工程である。細胞の複数回に分けて播種してもよい。

　上皮系細胞としては、例えば、創薬試験で多用されるＨｅｐＧ２、ＨｅｐａＲＧ、ＨｅｐａＲＡ等の肝癌由来培養細胞、肝細胞、ＢｘＰＣ−３等の膵癌由来細胞、生体から採取したこれらの初代培養細胞等が挙げられる。中でも、細胞が有する固有の性質のすべてが平均的で、当業者に周知である、ＨｅｐａＲＧ、ＨｅｐａＲＡ細胞等の肝癌由来培養細胞が創薬試験には好ましく、初代細胞が抗がん剤開発や臨床検査に好適である。
　上記上皮系細胞は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。

　上記播種工程において、上記上皮系細胞以外にも、間葉系幹細胞、間質細胞等の他の細胞が含まれていてもよい。

　上記播種工程において、播種後の上記上皮系細胞の被覆領域Ａ上の密度は、薄すぎて上皮系細胞が死滅しない程度の密度であれば特に限定されず、例えば、上記被覆領域Ａの表面積に対して、５~１００％コンフルエントが好ましく、より好ましくは５０~１００％コンフルエント、さらに好ましくは８０~１００％コンフルエントである。播種する細胞密度が上記範囲であると、上皮系細胞を一層容易に培養することができる。
　播種後の細胞の被覆領域Ａ上の密度としては、薄すぎて上皮系細胞が死滅しない程度の密度であれば特に限定されず、例えば、２０~１５，０００個／ｍｍ^２が好ましく、５０~１，５００個／ｍｍ^２がより好ましい。例えば、培養面の面積が８．４ｍｍ^２である３８４ウェル細胞培養プレートに、２５μＬの細胞液を加えて播種する場合、細胞液中の細胞数は７~５０４０個／μＬが好ましい。なお、播種される細胞は、生きた細胞とする。

　細胞の播種は、例えば、３７℃のインキュベーター中に静置しておいた被覆細胞培養器を、室温のクリーンベンチに取り出して、行うことができる。
　なお、細胞は培地に希釈して播種することが好ましい。希釈する培地としては、上皮系細胞の培養が可能な培地であれば、特に限定されない。

（培養工程）
　上記培養工程は、上記被覆領域Ａに接着した上記上皮系細胞を培養する工程である。
　上皮系細胞の培養は、例えば、一般的な３７℃の細胞インキュベーターを用いて行うことができる。
　培養した上皮系細胞は、ＰＢＳ等で洗浄した後、トリプシン、トリプシン−ＥＤＴＡ、市販の細胞剥離溶液等を使用して、剥離し、希釈して継代をすることができる。

［上皮間葉転移誘導剤］
　発明者らは、上述の本発明（ＩＩ）の実施形態の培養方法に用いられる温度応答性ポリマー及び温度応答性ポリマー組成物が、上皮系細胞の間葉系細胞への転移（上皮間葉転移（ＥＭＴ））を誘導する効果を有することを見出した。
　すなわち、本発明（ＩＩ）は上皮間葉転移誘導剤に関し、該上皮間葉転移誘導剤は、上述の本発明（ＩＩ）の実施形態の培養方法に用いられる温度応答性ポリマー及び温度応答性ポリマー組成物を含み、好適には上記温度応答性ポリマー及び温度応答性ポリマー組成物からなる。

　上皮間葉転移を誘発させる従来の技術としては、ＴＧＦ（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ）−β、ＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ）等の増殖因子を使用してＥＭＴを誘発させる技術や、上皮系癌細胞をタイプＩＶコラーゲン上で培養することでＥＭＴを誘発させる技術が公知である。
　しかしながら、上述の従来技術では、ＴＧＦ−βやＥＧＦ等の増殖因子として天然物由来のものを用いた場合、増殖因子に未知物質や病原性物質が含まれる可能性が否定できず、また、ロット間のバラツキ等により実験の再現性に悪影響を及ぼす可能性がある。また、増殖因子として遺伝子組換え技術で調製したものを用いた場合、増殖因子に大腸菌由来のエンドトキシンが混入する問題や、得られるタンパク質が宿主大腸菌特有の糖鎖修飾を受け、天然物由来の増殖因子とは構造も性質も異なるものとなってしまうという問題がある。
　本発明（ＩＩ）の上皮間葉転移誘導剤によれば、メカニズムは不明であるが増殖因子を要することなく、１００％化学合成による温度応答性ポリマー及び温度応答性ポリマー組成物が塗布された培養面上で上皮系細胞を培養するだけで、上皮間葉転移を誘発させることができる。そのため、転移に悪影響を及ぼし得る物質の混入のリスク、ロット間のバラツキが少なく、増殖因子を用いた場合に必要となる厳密な温度管理も不要であり、動物資源の節減に貢献することも可能となる。本発明（ＩＩ）の上皮間葉転移誘導剤によれば、安価かつ簡便に上皮間葉転移を実現することができる。

　本実施形態（ＩＩ）における温度応答性ポリマー及び温度応答性ポリマー組成物としては、本実施形態（ＩＩ）において前述の、（Ａ）２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）単位と、アニオン性モノマー単位とを含む温度応答性ポリマー、（Ｂ）Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）単位と、カチオン性モノマー単位と、アニオン性モノマー単位とを含む温度応答性ポリマー、（Ｃ）２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）及び／又はその誘導体の重合体と、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（トリス）と、核酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、デキストラン硫酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリリン酸、硫酸化多糖類、カードラン及びポリアルギン酸並びにこれらのアルカリ金属塩からなる群から選択される１種以上のアニオン性物質とを含む温度応答性ポリマー組成物等が挙げられ、中でも、上皮系細胞の接着性に一層優れるという観点から、（Ａ）が好ましい。
　ここで、上記（Ａ）としては、例えば、（Ａ−１）ＤＭＡＥＭＡを水存在下で重合する方法により得られる温度応答性ポリマー、（Ａ−２）主としてＤＭＡＥＭＡを含むポリマーブロック（重合鎖α末端）と、主としてＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマーとを含むコポリマーブロック（重合鎖ω末端）とを含む、温度応答性ポリマー等が挙げられ、中でも、上皮間葉転移の誘発を高める観点から、（Ａ−１）が好ましい。
　（Ａ）~（Ｃ）の温度応答性ポリマー及び温度応答性ポリマー組成物の詳細については前述の通りとしてよい。

　本実施形態（ＩＩ）では、温度応答性ポリマー又は上記温度応答性ポリマー組成物で、細胞培養器の培養面の少なくとも一部を被覆して被覆領域Ａを形成し、被覆領域Ａを有する被覆細胞培養器を準備し、次いで、上皮系細胞を上記被覆細胞培養器に播種し、その後、上記被覆領域Ａに接着した上記上皮系細胞を培養することによって、上皮間葉転移誘導剤としての上皮間葉転移の効果を得ることができる。
　培養器の準備、細胞の播種、細胞の培養の詳細については、特に限定されることなく、本実施形態（ＩＩ）の上皮系細胞の培養方法、本実施形態（ＩＩ）の細胞構造体の製造方法の場合と同様としてよい。

［細胞構造体の製造方法］
　本発明（ＩＩ）の細胞構造体の製造方法は、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を調製する、調製工程と、上記温度応答性ポリマー又は上記温度応答性ポリマー組成物で、細胞培養器の培養面の少なくとも一部を被覆して被覆領域Ａを形成し、被覆領域Ａを有する被覆細胞培養器を準備する、培養器準備工程と、上皮系細胞を上記被覆細胞培養器に播種する、播種工程と、上記上皮系細胞から塊状の細胞構造体を形成し、上記被覆領域Ａに接着した細胞構造体を得る、培養工程と、を含み、上記被覆領域Ａにおける上記温度応答性ポリマー又は上記温度応答性ポリマー組成物の濃度が、０．３ｐｇ／ｍｍ^２以上である。

（調製工程）
　本実施形態（ＩＩ）の細胞構造体の製造方法における調製工程としては、上述の本実施形態（ＩＩ）の上皮系細胞の培養方法における調製工程と同様の工程が挙げられる。

（培養器準備工程）
　本実施形態（ＩＩ）の細胞構造体の製造方法における調製工程としては、上述の本実施形態（ＩＩ）の上皮系細胞の培養方法における調製工程と同様の工程が挙げられる。

　本実施形態（ＩＩ）の細胞構造体の製造方法における調製工程の上記培養器準備工程Ｉにおいて、温度応答性ポリマー溶液Ａ中の温度応答性ポリマーの含有量は、温度応答性ポリマーが培養面に均一に被覆されやすくなるという観点から、温度応答性ポリマー溶液（１００質量％）に対して、０．０００００００９~０．０００１質量％であることが好ましく、０．０００００００９~０．００００００９質量％であることがより好ましい。

　本実施形態（ＩＩ）の細胞構造体の製造方法における調製工程の上記細胞培養器の培養面の面積は、上皮系細胞を含む細胞構造体の製造が一層容易となる観点から、２００ｍｍ^２以下であることが好ましく、５０ｍｍ^２以下であることがより好ましく、１０ｍｍ^２以下であることがさらに好ましい。なお、上記細胞培養器の培養面の面積の下限値は、市販サイズのものであれば使用可能であり、特に限定されない。

　本実施形態（ＩＩ）の細胞構造体の製造方法における調製工程の被覆領域Ａの面積は、上皮系細胞を含む細胞構造体が被覆領域Ａにより強固に接着し、ピペッティング等の操作によって細胞構造体が剥がれにくくなる観点から、１０ｍｍ^２以下であることが好ましく、１．０ｍｍ^２以下であることがより好ましく、０．１ｍｍ^２以下であることがさらに好ましい。
　また、本実施形態（ＩＩ）の細胞構造体の製造方法における調製工程の細胞培養器の培養面の全面積（１００％）に対する、被覆領域Ａの面積は、０．１~５０％であることが好ましく、０．１~１０％であることがより好ましい。
　さらに、被覆領域Ａは、細胞培養器の底部のみならず側面にも及ぶことが、細胞構造体を形成しやすくする観点から好ましい。

　本実施形態（ＩＩ）の細胞構造体の製造方法における調製工程の上記被覆領域Ａにおける、単位面積当たりの有する温度応答性ポリマーの量は、０．３ｐｇ／ｍｍ^２以上であり、０．３~２００ｐｇ／ｍｍ^２であることが好ましく、０．３~１５０ｐｇ／ｍｍ^２であることがより好ましく、０．３~９ｐｇ／ｍｍ^２であることがさらに好ましい。上記範囲とすれば、細胞構造体が被覆領域Ａに一層強固に接着する。

　本実施形態（ＩＩ）の細胞構造体の製造方法における調製工程において、細胞外マトリックスが豊富に分泌され細胞の活性が高い細胞構造体が得られる観点から、培養面の全面に温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を塗布することが好ましい。

　人の手では培地交換等の操作が困難な３８４ウェルプレート、１５３６ウェルプレートで細胞を培養する場合や、細胞を数多くのウェルで培養する場合には、自動培養器によって細胞培養の操作が行われることが多い。しかしながら、自動培養器による操作では、浮遊する細胞構造体を誤吸引しないように、培地を吸引する吸引口の位置をウェルごとに調整することが困難であり、浮遊する細胞構造体を誤吸引しやすく、細胞構造体の培養の効率が悪かった。特に、上皮系細胞の細胞構造体は、培養面に接着しにくいため、誤吸引が起こりやすかった。
　培養面の底部（例えば、被覆領域Ａ）の温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物の濃度が高く、側面の温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物の濃度は低く又は０とすると、側面は上皮系細胞が一時的に接着するが重力の影響で剥がれやすく、底面は側面から剥がれ落ちた上皮系細胞が集合して形成された細胞構造体が強く接着するため、作製が容易であると共に、培地交換時に誤吸引しにくい上皮系細胞の細胞構造体を形成することができる。また、側面の温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物の濃度は低くすると、上皮系細胞が側面に一度接着して細胞マトリックスを分泌した後に、剥離して底部に落下することで、細胞の活性が高い上皮系細胞を含む細胞構造体を得ることができる。

　培養面の底部の温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物の濃度が高く、側面の温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物の濃度は低い細胞培養器としては、例えば、培養面の少なくとも一部に被覆領域Ａを有し、培養面の少なくとも一部であって被覆領域Ａとは異なる位置に被覆領域Ｂを有する細胞培養器が挙げられる。
　被覆領域Ｂは、被覆領域Ａの周囲を囲むように形成されていることが好ましい。例えば、丸底の培養面において、その中央部（最深部）に被覆領域Ａを設け、それ以外の部分に被覆領域Ｂを設けることにより、被覆領域Ｂ上の上皮系細胞は重力の影響で落下し、中央部の被覆領域Ａに集まって、細胞構造体を一層形成しやすくなる。また、形成された細胞構造体は、被覆領域Ａで強固に接着するため、ピペッティング等の操作によって剥がれにくくなる。

　被覆領域Ｂにおける上記温度応答性ポリマー又は上記温度応答性ポリマー組成物の濃度は、被覆領域Ａより低いことが好ましく、２００ｐｇ／ｍｍ^２未満であることがより好ましく、１００ｐｇ／ｍｍ^２未満であることがより好ましく、５０ｐｇ／ｍｍ^２以下であることがさらに好ましい。
　また、被覆領域Ｂの温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物の濃度は、被覆領域Ａの温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物の濃度に対して、５~９０％の濃度であることが好ましく、１０~５０％の濃度であることがより好ましい。
　被覆領域Ｂにおける上記温度応答性ポリマー又は上記温度応答性ポリマー組成物の濃度は、全領域で均一な濃度であってもよいし、一部分で濃く、他の部分で薄くてもよい。また、被覆領域Ｂには、上記温度応答性ポリマー又は上記温度応答性ポリマー組成物がない部分が存在していてもよい。

　本実施形態（ＩＩ）の細胞構造体の製造方法における調製工程において、培養面の底形状（底面の断面形状）は、上皮系細胞が培養面の最深部に集まって細胞構造体を形成しやすくなる観点から、丸底（Ｕ底）、Ｖ底、凹状底であることが好ましく、スフェロイド状の細胞構造体を形成しやすくなる観点から、丸底（Ｕ底、紡錘底）であることが特に好ましい。

　丸底（Ｕ底、紡錘底）を有する細胞培養器について、
　細胞培養器の深さ方向に沿う断面における培養面の底部の輪郭線の曲率半径Ｒは、丸底（Ｕ底、紡錘底）全体の平均で、５０ｍｍ以下であることが好ましく、より好ましくは１０ｍｍ以下であり、さらに好ましくは５ｍｍ以下であり、特に好ましくは２ｍｍ以下であり、また、０．１ｍｍ以上であることが好ましく、より好ましくは０．２ｍｍ以上であり、さらに好ましくは０．４ｍｍ以上であり、特に好ましくは０．８ｍｍ以上である。
　細胞培養器の最大幅Ｌは、１００ｍｍ以下であることが好ましく、より好ましくは５０ｍｍ以下であり、さらに好ましくは２０ｍｍ以下であり、特に好ましくは１０ｍｍ以下であり、また、１ｍｍ以上であることが好ましく、より好ましくは２ｍｍ以上であり、さらに好ましくは３ｍｍ以上であり、特に好ましくは４ｍｍ以上である。
　丸底（Ｕ底、紡錘底）の最深部は、図１５に示す形状に限定されず、所定幅を有する平面であってもよい。

　被覆領域Ａで温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物の濃度を高くし、被覆領域Ｂで温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物の濃度を被覆領域Ａよりも低くする方法としては、例えば、培養面の底部に凹部状の窪み部（図１６（ｉ）参照）を設けた培養器を用いて、温度応答性ポリマー溶液を添加し、窪み部の温度応答性ポリマー溶液を多くし、側面の温度応答性ポリマー溶液を少なくした状態で乾燥させる方法等が挙げられる。
　なお、窪み部の形状としては、上述の形状が挙げられる。

（播種工程）
　本実施形態（ＩＩ）の細胞構造体の製造方法における播種工程としては、上述の本実施形態（ＩＩ）の上皮系細胞の培養方法における播種工程と同様の工程が挙げられる。

　本実施形態（ＩＩ）の細胞構造体の製造方法における播種工程において、播種後の上記上皮系細胞の被覆領域Ａ上の密度は、薄すぎて上皮系細胞が死滅しない程度の密度であれば特に限定されず、例えば、上記被覆領域Ａの表面積に対して、５~１００％コンフルエントが好ましく、より好ましくは５０~１００％コンフルエント、さらに好ましくは８０~１００％コンフルエントである。播種する細胞密度が上記範囲であると、上皮系細胞の細胞構造体を一層容易に調製することができる。
　この播種工程において、播種する細胞数としては、細胞構造体を一層形成しやすくなるという観点から、２０個／ｍｍ^２以上であることが好ましく、５０個／ｍｍ^２以上であることがより好ましく、１００個／ｍｍ^２以上であることがさらに好ましく、５００個／ｍｍ^２以上であることが特に好ましく、１５，０００個／ｍｍ^２以下、１０，０００個／ｍｍ^２以下、５，０００個／ｍｍ^２以下、１，５００個／ｍｍ^２以下であることが好ましい。例えば、培養面の面積が８．４ｍｍ^２である３８４ウェル細胞培養プレートに、２５μＬの細胞液を加えて播種する場合、細胞液中の細胞数は７~５０４０個／μＬが好ましい。なお、播種される細胞は、生きた細胞とする。

（培養工程）
　上記培養工程は、上記上皮系細胞から塊状の細胞構造体を形成し、上記被覆領域Ａに接着した細胞構造体を得る工程である。
　播種した細胞は、静置することが好ましい。播種した細胞を静置する温度は、特に限定されないが、例えば、３０℃以上が好ましく、より好ましくは３５~３８℃、さらに好ましくは３７℃である。
　播種した細胞を静置する時間は、特に限定されないが、例えば、１~２４０時間培養することが好ましく、１０~９６時間培養することがより好ましい。

　以下に、本実施形態（ＩＩ）の細胞構造体の製造方法の例について、図１５、１６を用いて説明する。

　図１５は、上皮系細胞を含む細胞構造体の製造方法の一例である。
　丸底の培養面を有する細胞培養器（例えば、３８４ウェルプレート、１５３６ウェルプレート等）に温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を塗布して被覆し、被覆領域Ａを有する被覆細胞培養器を準備する（図１５（ｉ）（ｉｉ）参照）。その後、被覆細胞培養器に、培地で希釈した、上皮系細胞を含む細胞液を加える（図１５（ｉｉｉ）参照）。播種した上皮系細胞は、被覆領域Ａ全面に接着する（図１５（ｉｖ）参照）。なお、この例では、上皮系細胞の密度は、１００％コンフルエントである（図１５（ｉｖ）参照）。上皮系細胞は、被覆領域Ａに一度接着することで、細胞外マトリックス成分を分泌し、細胞の活性を高く保つことができる。被覆領域Ａに接着した側面の上皮系細胞は、重力の影響を受けて被覆領域Ａから剥離し、培養面底面に集まる。底面に集まった上皮系細胞は、接着して細胞構造体を形成する（図１５（ｖ）参照）。形成された細胞構造体は、培養面底面で被覆細胞培養器に接着している（図１５（ｖ）参照）。
　なお、この例において、被覆領域Ａにおける温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物の濃度は、側面に接着した上皮系細胞は重力の影響で剥離するが、底部に接着した上皮系細胞はピペッティング等の操作によっても剥がれにくい程度に強固に接着している。

　図１６は、上皮系細胞を含む細胞構造体の製造方法の一例である。
　底面に窪み部（凹部）を有する丸底の培養面の細胞培養器（例えば、３８４ウェルプレート、１５３６ウェルプレート等）に温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を含む溶液を添加する。ここで、溶液は底面の窪み部に集まり、窪み部には温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物の濃度が高い被覆領域Ａが形成される。一方、側面の溶液は窪み部に比べて量が少なくなるため、側面には温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物の濃度が被覆領域Ａに比べて低い被覆領域Ｂが形成される。そして、被覆領域Ａ及び被覆領域Ｂを有する被覆細胞培養器を準備する（図１６（ｉ）（ｉｉ）参照）。側面の被覆領域Ｂでは、上皮系細胞が一時的に接着するものの重力の影響で剥がれやすく、底面の被覆領域Ａは、側面から剥がれ落ちた上皮系細胞が集合して形成された細胞構造体が強く接着する。これにより、培地交換時の誤吸引を抑えることができる（図１６（ｉｉ）参照）。被覆細胞培養器に、培地で希釈した、上皮系細胞を含む細胞液を加える（図１６（ｉｉｉ）参照）。播種した上皮系細胞は、被覆領域Ａ及び被覆領域Ｂに接着する（図１６（ｉｖ）参照）。なお、この例では、上皮系細胞の密度は、１００％コンフルエントである（図１６（ｉｖ）参照）。上皮系細胞は、被覆領域Ａ及び被覆領域Ｂに一度接着することで、細胞外マトリックス成分を分泌し、細胞の活性を高く保つことができる。被覆領域Ｂに接着した側面の上皮系細胞は、重力の影響を受けて被覆領域Ｂから剥離し、培養面底面に集まる。底面に集まった上皮系細胞は、接着して細胞構造体を形成する（図１６（ｖ）参照）。形成された細胞構造体は、被覆領域Ａで被覆細胞培養器に接着している（図１６（ｖ）参照）。

［上皮系細胞用細胞培養器］
　本発明（ＩＩ）の上皮系細胞用細胞培養器は、培養面の少なくとも一部に、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物で被覆された被覆領域Ａを有し、上記被覆領域Ａにおける上記温度応答性ポリマー又は上記温度応答性ポリマー組成物の濃度が、０．３ｐｇ／ｍｍ^２以上である。
　本発明（ＩＩ）の上皮系細胞用細胞培養器によれば、培養中に上皮系細胞が剥離しにくく、容易に上皮系細胞を培養することが可能となる。また、容易に上皮系細胞を含む細胞構造体を製造することができる。

　本実施形態（ＩＩ）の上皮系細胞用細胞培養器における、温度応答性ポリマー及び温度応答性ポリマー組成物としては、上述と同様のものが挙げられる。

　本実施形態（ＩＩ）の上皮系細胞用細胞培養器としては、上述の被覆細胞培養器が挙げられる。
　本実施形態（ＩＩ）の上皮系細胞用細胞培養器は、例えば、上述の調製工程、培養器準備工程により製造することができる。

［［発明（ＩＩＩ）］］
［立体組織体の作製装置］
　本実施形態（ＩＩＩ）の立体組織体の作製装置は、少なくとも１個の貫通孔を有する培養面と、上記貫通孔を挿通する心棒とからなる立体組織体の作製装置であって、上記培養面に温度応答性ポリマー又は上記温度応答性ポリマー組成物で被覆された被覆培養面を少なくとも１つ含み、１つの上記被覆培養面の内側に、少なくとも１個の上記貫通孔を有し、上記培養面が上記心棒の延在方向に可動である。
　なお、本発明（ＩＩＩ）において、ポリマーの「曇点」とは、必ずしも厳密な意味で、「所定の温度未満では溶解するが、所定の温度以上では不溶化して沈殿する、その温度」を指すものではなく、「不溶化して沈殿したポリマーを所定の温度未満の条件下で溶解する際に、溶解に要する時間が１０分以上である、その温度」をも指す。

　本実施形態（ＩＩＩ）の立体組織体の作製装置は、構成部品が少なく医療用品としての適用が比較的容易であり、感染のリスクが少ない。また、密封されたプラスチック容器内に設置して、衛生的に、無菌的に、立体組織体を作製することができる。また、構成部品が少なく、小型であるため、医療用品として廃棄する際の廃棄物の量を少なくすることができる。

（心棒）
　上記心棒は、得られる立体組織体の寸法安定性を確保できれば特に限定されず、具体的には、上記心棒の材質としては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリプロピレン、ポリブテン、ポリエチレン、アクリル樹脂、ポリウレタン樹脂、尿素樹脂、ポリカーボネート等のプラスチック；シリコンゴム、クロロプレンゴム（ネオプレン（登録商標）等）、ＳＢＲ等のゴム・エラストマー；セラミック；ガラス；ステンレス、チタン、ニチノール（登録商標）等の金属・無機材料等が挙げられる。中でも、種々の滅菌法を適用することが可能であり、溶出物が少なく医療材料としての実績があるという観点から、ポチスチレン、ポリウレタン樹脂、アクリル樹脂、ポリカーボネート等のプラスチック、ステンレス、ニチノール（登録商標）等の金属が好ましい。

　上記心棒の表面は、細胞接着性であってもよいし、細胞非接着性であってもよい。中でも、心棒に巻き付いた立体組織体の構造を保持しやすいという観点から、心棒の表面は細胞非接着性であることが好ましい。また、細胞から分泌された物質を含む立体組織体を心棒から剥がしやすい（抜き取りやすい）という観点から、心棒の表面にはタンパク質が含まれないことが好ましい。
　心棒の表面の細胞接着性は、心棒の表面に細胞接着性物質をコーティングする方法、細胞接着性物質の膜で心棒の表面を被覆する方法、放射線・プラズマ放電等をして細胞接着性の分子団を心棒の表面に導入する方法等により、調整することができる。
　上記細胞接着性物質としては、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチン、ペプチド、カチオン性ポリマー、ポリスチレン等が挙げられる。上記ペプチドとしては、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸の配列を有するペプチド、アルギニン残基が８個以上連続する配列を有するペプチド等が挙げられる。上記カチオン性ポリマーとしては、アミノスチレン等が挙げられる。これらの中でも、細胞接着性が高い、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチンが好ましい。また、上記列挙の細胞接着性物質を含む試薬も好適に用いることができ、かかる試薬としては、血清等が挙げられる。
　心棒の周囲に巻き付くリング状の立体組織体は、自ら分泌した細胞外マトリックスに覆われているため、心棒の表面を細胞接着性にする処理をしなくても、心棒周囲に巻き付くことができる。
　なお、「細胞接着性」とは、接着系細胞（例えば、血管内皮細胞、血管細胞、軟骨細胞、線維芽細胞等）が、通常の培養条件下で、接着する性質をいい、いわゆる「低接着性」のものも含む。

　なお、心棒の周囲に巻き付くようにして形成したリング状又は管腔状等の立体組織体は、心棒の表面が細胞接着性である場合でも、心棒表面から剥がすことができる。また、心棒表面が、テフロン（登録商標）、シリコンゴム、親水性コーティング等の細胞非接着性である場合は、例えば、心棒表面をコラーゲンチューブで被覆することで、コラーゲンチューブと一緒にリング状又は管腔状等の立体組織体を抜き取ることができる。

　上記心棒の延在方向（長さ方向）に垂直な面の断面形状としては、例えば、略円形、略多角形、半月形、三日月形、弦形、涙形等が挙げられる。中でも、軟骨輪、血管、気管等の形状に近い立体組織体が得られる観点から、略円形が好ましい。即ち、上記心棒は、略円柱状が好ましい。
　なお、上記心棒の延在方向に垂直な面の断面形状は、延在方向に、同一形状であってもよいし、異なる形状であってもよい。
　また、心棒の延在方向の形状は、直線状（図１８~２０参照）であってもよいし、Ｃ字状、Ｕ字状、渦巻き状等の曲線状であってもよい。

　上記心棒の寸法は、特に限定されないが、例えば、長さは０．１~６００ｍｍであることが好ましく、１~３００ｍｍであることがより好ましい。また、心棒の延在方向に垂直な面の断面形状が略円形である場合、その最大径は、０．０１~１５０ｍｍであることが好ましく、０．１~５０ｍｍであることがより好ましい。

　上記心棒の表面は、平滑であってもよいし、凹凸があってもよい。また、表面に孔を有していてもよく、網目状、多数の細孔が設けられた多孔質状等であってもよい。
　また、上記心棒は、内部が空洞であってもよい。
　中でも、心棒の周囲に巻き付いた立体組織体に含まれる細胞全体に、培地成分、酸素を安定的に供給することができ細胞の活性を高く維持できるという観点、細胞の代謝産生物を速やかに排除できるという観点から、上記心棒の内部が空洞で、心棒の表面が多孔質状であることが好ましい。
　心棒がスポンジのような連続気泡体からなる多孔質体の場合、細胞が心棒内部へ浸潤して、深部まで到達した細胞が壊死する可能性や、形成される立体組織体と心棒が頑強に接着して剥離困難となる可能性があるため、心棒表面の最大孔径が２００μｍ以下であることが好ましい。心棒が金属繊維の織布のような繊維集合体からなる場合、細胞が心棒表面に接着しやすく、また、細胞の分化に影響する可能性があるため、１０μｍ以上であることが好ましい。
　なお、複数本の心棒が用いられる場合、各心棒の材質、寸法、形状等は、同じであってもよいし異なっていてもよい。また、心棒間の距離は特に限定されず、例えば、複数本の心棒が接していてもよい。

（培養面）
　上記培養面は、少なくとも一部の表面上に、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物で被覆された被覆培養面を少なくとも一つ有する。上記培養面には、１つの被覆培養面が設けられていてもよいし、複数の被覆培養面が設けられていてもよい。
　１つの被覆培養面が設けられている場合、上記培養面は、全面が被覆培養面であってもよいし（図１８、２０参照）、一部が被覆培養面であってもよい（図１９参照）。中でも、製造が容易である観点から、培養面の全面が被覆培養面であることが好ましい。
　また、培養面が、板状、円盤状等の二つの表面を有する形状である場合、片面のみに被覆培養面を有していてもよいし、両面に被覆培養面を有していてもよい。

　上記培養面の材質としては、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリプロピレン、ポリブテン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ガラス、シリコン樹脂、アクリル樹脂、ポリウレタン樹脂等が挙げられる。中でも、精密な成形加工が容易であり、種々の滅菌法を適用することが可能であるという観点から、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ガラス、シリコン樹脂、アクリル樹脂が好ましい。

　上記培養面は、表面に細胞接着処理等の処理が施されたものであってもよいし、表面が無処理であってもよい。上記培養面表面は、細胞の接着性を調整するために、コーティング処理、加工処理等がされていてもよい。

　上記培養面の平面視形状は、特に限定されないが、例えば、略四角形等の略多角形（貫通孔を有する略多角形）、略円形（リング状等の貫通孔を有する略円形）等の形状が挙げられる。

　上記培養面の面積は、リング状又は管腔状等の立体組織体を一層容易に製造することができるという観点から、０．１ｍｍ^２~１５０ｃｍ^２であることが好ましく、８．４ｍｍ^２~２１ｃｍ^２であることがより好ましい。

　上記培養面の底形状（底面の断面形状）は、特に限定されないが、平底、丸底、凹凸状底等が挙げられる。中でも、リング状又は管腔状等の立体組織体が得られやすいという観点から、平底が好ましい。

　上記培養面は、同時に複数の立体組織体を形成することができ、より短時間でより効率的に管腔状の立体組織体を形成することができる観点から、複数（例えば、２以上、５以上、１０以上等）設けられていてもよい。なお、培養面の上限数は、細胞の播種、培養等が可能で、立体組織体を作製することができる範囲であれば、特に限定されない。
　培養面が複数設けられている場合、１本の上記心棒が、少なくとも２の上記培養面の上記貫通孔を挿通していることが好ましく、１本の上記心棒が、全ての上記培養面の上記貫通孔を挿通していることがより好ましい。
　なお、本実施形態（ＩＩＩ）の立体組織体の作製装置としては、例えば、１本の心棒が挿通している複数の培養面（心棒の延在方向に培養面が棚状に配置された、心棒と複数の培養面とからなる部材）を１個有していてもよいし、複数個有していてもよい。

　培養面が複数設けられている場合、上記心棒の延在方向における各培養面間の距離は、同じであってもよいし、異なっていてもよい。上記心棒の延在方向における各培養面間の距離は、各培養面で作製したリング状又は管腔状の立体組織体が、容易につながるという観点から、例えば、使用する細胞の心棒の延在方向の長さに対して１０倍以下であることが好ましく、７．５倍以下であることがより好ましい。具体的には、上記心棒の延在方向における各培養面間の距離は、０．１~１０ｍｍであることが好ましく、より好ましくは０．２~２．０ｍｍである。
　なお、各培養面で作製したリング状又は管腔状の立体組織体がつながるとは、各培養面で作製した、リング状又は管腔状の各立体組織体を構成する細胞同士が接着する以外にも、各培養面で作製した、リング状又は管腔状の各立体組織体を構成する細胞から分泌されたタンパク質（例えば、細胞外マトリックスを構成するタンパク質等）を介して、各培養面で作製したリング状又は管腔状の立体組織体がつながっている場合も含む。

　上記被覆培養面の温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物としては、後述の調製工程に記載のものが挙げられる。
　上記被覆培養面において、単位面積当たりに含まれる温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物の含有量としては、リング状又は管腔状等の立体組織体がより容易に得られるという観点から、５~５０ｎｇ／ｍｍ^２が好ましく、より好ましくは１５~４０ｎｇ／ｍｍ^２である。
　なお、被覆培養面が複数設けられている場合、各被覆培養面の単位面積当たりに含まれる温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物の含有量は、同じであってもよいし異なっていてもよい。

　上記被覆培養面の平面視形状は、特に限定されないが、例えば、略四角形等の略多角形（貫通孔を有する略多角形）、略円形（リング状等の貫通孔を有する略円形）等の形状が挙げられる。中でも、細胞の分布がより均質な立体組織体が得られやすいという観点から、略円形が好ましい。
　なお、被覆培養面が複数設けられている場合、各被覆培養面の平面視形状は、同じであってもよいし異なっていてもよい。

　上記被覆培養面の表面積としては、細胞の分布がより均質な立体組織体が得られやすいという観点から、０．１ｍｍ^２~１５０ｃｍ^２が好ましく、８．４ｍｍ^２~２１ｃｍ^２がより好ましい。被覆培養面が複数設けられている場合、各被覆培養面の表面積は、同じであってもよいし異なっていてもよい。
　また、被覆培養面の面積が小さいと、心棒に巻き付く細胞数が減り、細胞マトリックスを主成分とする立体組織体を形成しやすくなる。細胞マトリックスを主成分とする立体組織体を形成する際の被覆培養面の面積としては、例えば、０．１~５０ｍｍ^２が挙げられる。
　なお、被覆培養面の表面積は、顕微鏡写真の画像解析等の当業者に周知の方法により測定することができる。

　上記被覆培養面表面のゼータ電位としては、０~５０ｍＶが好ましく、より好ましくは０~３５ｍＶ、更に好ましくは１０~２５ｍＶである。ゼータ電位が０ｍＶ以上であることにより、負に帯電する細胞が接着しやすくなる。また、ゼータ電位が５０ｍＶ以下であることにより、細胞毒性を軽減することができる。
　また、ゼータ電位を上記範囲とすることにより、細胞を適切な培養条件で培養するだけで、播種した細胞を、心棒の周囲に巻き付いたリング状の立体組織体とすることができる。これは、表面ゼータ電位を上記範囲とすることによって、被覆培養面表面に細胞毒性を惹起しない微弱な陽電荷を与えることができ、また、播種した細胞の速やかな接着を確保し、細胞の活性の向上及び細胞外マトリックスの分泌を促進し、更には、細胞遊走を適度に抑制して、細胞間の結合を強くすることができることによるものと推測される。
　被覆培養面が複数設けられている場合、各被覆培養面のゼータ電位は、同じであってもよいし異なっていてもよい。
　なお、ゼータ電位とは、ポリスチレンラテックスをヒドロキシプロピルセルロースで被覆した粒子（ゼータ電位：−５~＋５ｍＶ）を標準のモニター粒子として、ゼータ電位計（例えば、型番「ＥＬＳＺ」、大塚電子社製等）で測定した、Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉ式により算出される値をいう。

　上記被覆培養面に対する水の接触角としては、本発明（ＩＩＩ）の効果を高める観点から、５０~９０°が好ましく、より好ましくは６０~８０°、更に好ましくは６２~７８°である。被覆培養面が複数設けられている場合、各被覆培養面に対する水の接触角は、同じであってもよいし異なっていてもよい。
　なお、被覆培養面に対する水の接触角とは、被覆培養面内の任意の数点において、ＪＩＳ　Ｒ３２５７に準拠して測定される接触角の平均値をいう。

　上記培養面は、少なくとも１個の貫通孔を有する。上記貫通孔が１個である場合、培養面の中央部にあることが好ましい。上記貫通孔に上記心棒が挿通することにより、上記培養面と上記心棒とが一体となった立体組織体の作製装置となる。

　上記貫通孔の平面視形状は、特に限定されないが、例えば、略多角形、略円形等の形状が挙げられ、細胞がより均一に分布した立体組織体が得られやすいという観点から、上記心棒の延在方向に垂直な面の断面形状と同じ形状であることが好ましい。中でも、上記心棒の延在方向に垂直な面の断面形状、及び上記貫通孔の平面視形状が、共に略円形であること（図１８~２０参照）が好ましい。
　なお、貫通孔は、心棒が挿通する形状であれば、心棒の延在方向に垂直な面の断面形状と同じ形状であってもよいし、異なる形状であってもよい。また、貫通孔が複数個設けられている場合、各貫通孔の平面視形状は同じであってもよいし異なっていてもよい。

　上記貫通孔は、上記被覆培養面の内側に少なくとも１個設けられており、１個設けられていることが好ましい。
　上記貫通孔は、上記被覆培養面の内側に設けられており、１個の貫通孔が上記被覆培養面の中央部に設けられていることが好ましく、上記被覆培養面の重心を含む部分に設けられていることがより好ましい。上記被覆培養面が略円形である場合は、被覆培養面の中心から０．７５ｒ以内（ｒは、被覆培養面の半径）の領域に貫通孔が設けられていることが好ましい。上記貫通孔が、被覆培養面の中央部に設けられていると、細胞が凝集する方向を中央部へ集中させることができ、細胞の分布が一層均質な立体組織体を作製することができる。なお、貫通孔を被覆培養面の中央部からずらして設けることで、リングの輪の太さが不均一な立体組織体を作製することができる。

　上記貫通孔は、寸法形状がよい立体組織体が得られやすいという観点から、１つの上記被覆培養面の内側に、１個設けられていることが好ましい。
　なお、本実施形態（ＩＩＩ）の作製装置は、複数の被覆培養面が設けられている場合、全被覆培養面のうち少なくとも１つの被覆培養面において、被覆培養面の内側に少なくとも１個の貫通孔が設けられていればよく、被覆培養面の数と貫通孔の数が同数であり、各被覆培養面の内側に１個の貫通孔が設けられていてもよい。例えば、本実施形態（ＩＩＩ）の作製装置は、培養面に５つの被覆培養面が設けられており、そのうちの１つの被覆培養面の内側に、１個貫通孔が設けられた、５つの被覆培養面と１個の貫通孔を有する作製装置であってもよいし、培養面に５つの被覆培養面が設けられており、各被覆培養面の内側にそれぞれ１個ずつの貫通孔が設けられた、５つの被覆培養面と５個の貫通孔を有する作製装置等であってもよい。

　上記貫通孔の表面積としては、０．１ｍｍ^２~１５０ｃｍ^２が好ましく、８．４ｍｍ^２~２１ｃｍ^２がより好ましい。また、貫通孔が略円形である場合、最大径は０．０１~１５０ｍｍであることが好ましい。なお、貫通孔が複数個設けられている場合、各貫通孔の表面積は、同じであってもよいし異なっていてもよい。

　被覆培養面の内側に１個の貫通孔が設けられている被覆培養面においては、上記被覆培養面の表面積（１００％）に対する、上記貫通孔の表面積の割合は、０．１~５０％が好ましく、より好ましくは１~３０％である。割合が上記範囲であることにより、心棒の周囲に巻き付いた立体組織体を一層容易に得ることができる。

（心棒と培養面との位置関係）
　上記心棒は、上記貫通孔を挿通していればよく、心棒と培養面は接していてもよいし（図１８、１９参照）、心棒と培養面の間に隙間があってもよい（図２０参照）。心棒と培養面の間の隙間としては、凝集した細胞が隙間を飛び越えて心棒に巻き付くことができる、及び／又は、培養面を心棒の延在方向に移動させた時に心棒の周囲に巻き付いた立体組織体が剥がれない距離であることが好ましく、５．０ｍｍ以内であることがより好ましく、０．５ｍｍ以内であることがさらに好ましい。
　上記培養面が複数設けられている場合、各培養面に細胞が均一に分布しやすくなり、各培養面で作製したリング状又は管腔状の立体組織体を容易につなげることができる観点から、心棒と培養面の間に隙間があることが好ましい。

　上記培養面は、心棒の延在方向に可動であり、中でも、培養面を動かす際に生じる培地の流動によって、心棒の周囲に巻き付いた立体組織体へ物理的なストレスを与えるおそれが少なく、より容易にリング状又は管腔状等の立体組織体が得られる観点から、被覆培養面から培養面に向かう方向に可動であることが好ましい。また、上記培養面と心棒の延在方向とがなす角度は、特に限定されないが、垂直であることが好ましい。

　貫通孔が複数個設けられている場合、全ての貫通孔に心棒が挿通していてもよいし、一部の貫通孔に心棒が挿通していてもよい。中でも、播種した細胞が培養面よりも下側に落ちにくくなり、播種した細胞を被覆培養面に接着させることができるという観点から、全ての貫通孔に心棒が挿通していることが好ましい。

　以下に、本実施形態（ＩＩＩ）の立体組織体の作製装置の一例について、図１８~２１、２６を用いて説明する。図１８~２１、２６の作製装置は、構成部品が少なく医療用品としての適用が比較的容易であり、感染のリスクが少ないという観点、及びバイオチューブの作製が容易であるという観点から好ましい。中でも、一層容易にリング状又は管腔状等の立体組織体が得られる観点から、図２０、２６の立体組織体の作製装置が好ましい。
　図１８は、本実施形態（ＩＩＩ）の一例の立体組織体の作製装置の概略図である。
　この例では、円盤状の培養面の一方の表面の全面に、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物で被覆された被覆培養面が設けられている。被覆培養面の中央部には貫通孔があり、円柱状の心棒が貫通孔を挿通している。被覆培養面と心棒との間に隙間はなく、被覆培養面と心棒とは接している。培養面は、心棒の延在方向に対して垂直であり、心棒の延在方向に可動である。なお、図１８~２１の培養面は、図の上方向（培養面から被覆培養面に向かう方向）にも、図の下方向（被覆培養面から培養面に向かう方向）にも可動である。培養面が動く方向、動く距離、及び／又は動かすタイミングは、例えば、コンピューター等で制御して自動的に行ってもよい。

　図１９は、本実施形態（ＩＩＩ）の一例の立体組織体の作製装置の概略図である。
　この例では、円盤状の培養面の一方の表面の一部に、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物で被覆された被覆培養面が設けられている。

　図２０は、本実施形態（ＩＩＩ）の一例の立体組織体の作製装置の概略図である。
　この例では、円盤状の培養面の一方の表面の全面に、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物で被覆された被覆培養面が設けられている。被覆培養面と心棒との間には隙間がある。即ち、貫通孔の孔径に対して、心棒の径が小さい。

　図２１は、本実施形態（ＩＩＩ）の一例の立体組織体の作製装置の写真である。
　この例では、円盤状のプラスチック製の培養面の一方の表面の全面に温度応答性ポリマーで被覆された被覆培養面が設けられている。被覆培養面の中央部には貫通孔があり、円柱状の心棒が貫通孔を挿通している。心棒の内部は空洞、心棒の表面は網目状であり、心棒の内部に金属棒を通して、作製装置を固定している。被覆培養面と心棒との間には、隙間がある。培養面は、心棒の延在方向に対して垂直であり、心棒の延在方向に可動である。
　本実施形態（ＩＩＩ）の立体組織体の作製装置は、培養面の外径よりもわずかに大きな内径の容器に入れられている。これにより、図２１の上部から播種した細胞が、培養面よりも下側に落ちにくくなり、播種した細胞を被覆培養面に接着させることができる。

　図２６は、本実施形態（ＩＩＩ）の一例の立体組織体の作製装置の概略図である。
　この例では、円盤状の培養面の一方の表面の全面に、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物で被覆された被覆培養面が設けられた培養面が２つ設けられている。１本の心棒が、２の培養面の貫通孔を挿通しており、２つの培養面で、同時にリング状又は管腔状の立体組織体を形成することができる。被覆培養面と心棒との間には隙間がある。２つの培養面間の距離を調整することにより、２つの培養面で作製したリング状又は管腔状の各立体組織体は、各立体組織体に含まれる細胞同士が接着して、又は各立体組織体に含まれる細胞が分泌したタンパク質を介して、容易につなげることができる。

（立体組織体の作製装置の製造方法）
　本実施形態（ＩＩＩ）の立体組織体の作製装置の製造方法としては、例えば、
　温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を調製する、調製工程と、
　上記温度応答性ポリマー又は上記温度応答性ポリマー組成物で、上記培養面を被覆して、被覆培養面を準備する、被覆培養面準備工程と、
を含む方法等が挙げられる。

−調製工程−
　実施形態（ＩＩＩ）における調製工程としては、上記発明（Ｉ）における調製工程と同様の工程が挙げられ、好適例としても同様のものが挙げられる。
　なお、本実施形態（ＩＩＩ）において、培養方法に用いられる温度応答性ポリマー及び温度応答性ポリマー組成物としては、リング状又は管腔状等の立体組織体が一層容易に得られるという観点から、（Ａ）が好ましい。
　また、本実施形態（ＩＩＩ）において、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）を含む混合物を調製する調製工程を、混合物調製工程と称する場合がある。
　また、本実施形態（ＩＩＩ）において、（Ａ−１）の温度応答性ポリマーによれば、後述するように、細胞を適切な培養条件で培養することにより、リング状又は管腔状等の立体組織体を形成させることができる。
　また、本実施形態（ＩＩＩ）において、（Ａ−２）の温度応答性ポリマーによれば、後述するように、細胞を適切な培養条件で培養することにより、リング状又は管腔状等の立体組織体を形成させることができる。
　また、本実施形態（ＩＩＩ）において、（Ｂ）の温度応答性ポリマーによれば、後述するように、細胞を適切な培養条件で培養することにより、リング状又は管腔状等の立体組織体を形成させることができる。
　また、本実施形態（ＩＩＩ）において、上記割合の混合型温度応答性ポリマー組成物を用いた場合、後述の培養工程で、立体組織体を形成しやすくすることができる。
　また、本実施形態（ＩＩＩ）において、Ｃ／Ａ比を０．５~１６とすることにより、リング状又は管腔状等の立体組織体を形成させやすくするという上記効果が得られやすくなる。

−被覆培養面準備工程−
　上記被覆培養面準備工程は、上記温度応答性ポリマー又は上記温度応答性ポリマー組成物で、培養面を被覆して、被覆培養面を準備する工程である。

　上記被覆培養面準備工程は、例えば、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を、溶媒に溶解して、温度応答性ポリマー溶液としてから、培養面上に塗布し、乾燥させて被覆培養面を準備する工程（被覆培養面準備工程Ｉ）としてもよく、また、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を含む水溶液（温度応答性ポリマー水溶液）を温度応答性ポリマーの曇点以下に冷却し、冷却した温度応答性ポリマー水溶液を培養面上に流延させ、曇点超の温度まで加熱して、被覆培養面を準備する工程（被覆培養面準備工程ＩＩ）としてもよい。

　上記被覆培養面準備工程Ｉにおける温度応答性ポリマー溶液における溶媒としては、例えば、水；生理食塩水；緩衝液；メタノール、エタノール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、１−ブタノール、イソブチルアルコール、２−ブタノール、ｔ−ブチルアルコール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、２−メチル−２−ブタノール、３−メチル−２−ブタノール、２，２−ジメチル−１−プロパノール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、２−メチル−２−ブタノール、３−メチル−２−ブタノール、２，２−ジメチル−１−プロパノール、１−ヘキサノール、２−メチル−２−ペンタノール、アリルアルコール、ベンジルアルコール、サリチルアルコール等のアルコール；アセトン、エチルメチルケトン、ジエチルケトン、メチルプロピルケトン、メチルイソブチルケトン、メチルビニルケトン、シクロヘキサノン、２−メチルシクロペンタノン、アセトフェノン、ベンゾフェノン、イソホロン等のケトン；酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ｎ−ブチル、酢酸イソブチル、酢酸ｓｅｃ−ブチル、酢酸ｔｅｒｔ−ブチル、酢酸ビニル、ギ酸メチル、ギ酸エチル、ギ酸プロピル、上記アルコールとリン酸のエステル、上記アルコールと炭酸のエステル等のエステル；クロロホルム；ベンゼン；トルエン；ジエチルエーテル；ジクロロメタン；等が挙げられる。
　中でも、培養面に均一に被覆しやすく、また、温度応答性ポリマーの溶解性に優れるという観点から、水、メタノール、エタノール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、２−ブタノール、ｔ−ブチルアルコール、アリルアルコール等のアルコール；アセトン、エチルメチルケトン、ジエチルケトン、メチルビニルケトン等のケトン；酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ｔｅｒｔ−ブチル、酢酸ビニル等のエステル；クロロホルム；ベンゼン；トルエン；ジエチルエーテル；ジクロロメタンが好ましい。また、短時間で乾燥させることができ、培養面に一層均一に塗布しやすいという観点から、沸点が低い有機溶媒（例えば、炭素数１~４の低級アルコール、炭素数３~５の低級ケトン、及び炭素数１~４のアルキル基を有する酢酸アルキルエステルからなる群より選ばれる少なくとも１種、特に、水より沸点が低い、炭素数１~４の低級アルコール、炭素数３~５の低級ケトン、及び炭素数１~４のアルキル基を有する酢酸アルキルエステルからなる群より選ばれる少なくとも１種）がさらに好ましく、コスト、操作性にも優れる観点から、メタノール、エタノールが特に好ましい。
　上記溶媒は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
　溶媒は、温度応答性ポリマーの溶解性に優れるため、曇点以上の温度（例えば、室温や３７℃等）にしても、温度応答性ポリマーが不溶化して沈殿しにくい。そのため、温度応答性ポリマーを塗布する際に、温度応答性ポリマー溶液の温度管理をする手間が省け、簡易に被覆培養面を準備することができる。

　上記被覆培養面準備工程Ｉにおいて、温度応答性ポリマー溶液には、使用する細胞種によって、例えば、接着性の強い間葉系細胞や、凝集力が弱い癌細胞の場合、細胞が自己凝集しやすくなるという観点から、親水性分子が含まれることが好ましい場合がある。親水性分子としては、温度応答性ポリマーのＣ／Ａ比に影響しない非イオン性かつ親水性であるもの、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡＡ）、グリセリン、ＴｒｉｔｏｎＸ、ポリプロピレングリコール等が挙げられる。

　上記被覆培養面準備工程Ｉにおいて、温度応答性ポリマー溶液中の温度応答性ポリマーの含有量は、温度応答性ポリマーが培養面に均一に被覆されやすくなるという観点から、温度応答性ポリマー溶液（１００質量％）に対して、０．００１０~３．０質量％であることが好ましく、０．００１２~２．５質量％であることがより好ましい。

　上記被覆培養面準備工程Ｉにおいて、温度応答性ポリマー溶液中の親水性分子の含有量は、細胞が自己凝集しやすくなるという観点から、温度応答性ポリマー（１００質量％）に対して、０．００００１~０．０００１５質量％であることが好ましく、０．００００３~０．０００１質量％であることがより好ましい。

　上記被覆培養面準備工程Ｉにおいて、温度応答性ポリマー溶液は、培養面の全面に塗布してもよいし、培養面の一部に塗布してもよい。培養面の一部に温度応答性ポリマー溶液を塗布する場合は、培養面上に、被覆培養面を１個設けてもよいし、複数の被覆培養面を設けてもよい。なお、培養面の一部に温度応答性ポリマー溶液を塗布する場合は、培養面が細胞非接着性である細胞培養器を用いることが好ましい。

　上記被覆培養面準備工程Ｉにおいて、塗布した温度応答性ポリマー溶液を乾燥させる条件としては、培養面に温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を均一に被覆する観点から、大気圧下、温度１０~７０℃、時間１~３，０００分が好ましい。塗布した温度応答性ポリマー溶液を、素早く乾燥させることにより、培養面上に温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物が偏ることなく、均一に被覆されやすくなる。
　塗布した温度応答性ポリマー溶液は、例えば、細胞培養器を３７℃又は４０℃のインキュベーター中で静置することによって乾燥させてもよい。

　上記被覆培養面準備工程ＩＩにおいて、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を溶解する溶媒としては、例えば、水；生理食塩水；リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス緩衝液等の緩衝液；等が挙げられる。

　上記被覆培養面準備工程ＩＩにおいて、温度応答性ポリマー水溶液を冷却する方法としては、例えば、温度応答性ポリマー水溶液を約４℃の冷蔵庫に入れて曇点以下の温度まで冷却する方法等が挙げられる。

　上記被覆培養面準備工程ＩＩにおいて、温度応答性ポリマー水溶液を培養面上に流延させる方法としては、例えば、曇点以下の温度を有する温度応答性ポリマー水溶液を、培養面を傾けることによって伸ばす方法、スパチュラを用いて温度応答性ポリマー水溶液を延ばす方法等が挙げられる。

　上記被覆培養面準備工程ＩＩにおいて、流延した温度応答性ポリマー水溶液を曇点超まで加熱する方法としては、例えば、流延工程後の培養面を３７℃のインキュベーター中で静置する方法等が挙げられる。

［立体組織体の作製方法］
　本実施形態（ＩＩＩ）の立体組織体の作製方法には、上述の本実施形態（ＩＩＩ）の立体組織体の作製装置を用いる。
　本実施形態（ＩＩＩ）の立体組織体の作製方法は、上記被覆培養面上に少なくとも１種の細胞を播種する、播種工程（本発明（ＩＩＩ）において「１回目の播種工程」と称する場合がある）と、播種した上記細胞を培養して、上記心棒の周囲に巻き付いたリング状の立体組織体を得る、培養工程（本発明（ＩＩＩ）において「１回目の培養工程」と称する場合がある）と、を含む。
　なお、本発明（ＩＩＩ）において、１回の播種、培養工程で得られた、心棒の周囲に巻き付いた立体組織体を「リング状の立体組織体」、リング状の立体組織体が複数積み重なった立体組織体を「管腔状の立体組織体」と称する場合がある。
　なお、１回目の播種工程、１回目の培養工程の操作は、ヒトの手で操作しないことで、より無菌的、衛生的に操作できる可能性があるという観点から、コンピューター等を用いて制御し、自動的に行ってもよい。

（１回目の播種工程）
　上記播種工程で播種する細胞として、例えば、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞等の血管細胞、心筋細胞、軟骨細胞、神経細胞、脂肪細胞、脂肪幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、腎細胞、平滑筋細胞、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞等が挙げられる。細胞外マトリックスを主成分とする立体組織体を製造する場合、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞等の血管細胞、心筋細胞、軟骨細胞、神経細胞、脂肪細胞、脂肪幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、腎細胞、平滑筋細胞が好ましく、線維芽細胞、間葉系細胞がより好ましい。上記細胞は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
　特に、血管内皮細胞、平滑筋細胞を用いることにより、人工血管を得ることができる。また、軟骨細胞、線維芽細胞を用いることにより、人工気管を得ることができる。また、細胞外マトリックスを構成する物質等の細胞から分泌された物質を含む立体組織体を製造する場合、ＳＶ４０プロモーター等のプロモーターを有し、エラスチン、コラーゲン等の細胞外マトリックスを構成するタンパク質を発現する遺伝子を組み込んだ発現ベクターを導入した、ＬａｒｇｅＴ抗原を発現する樹立細胞（例えば、ＣＯＳ細胞等）を用いてもよい。ＣＯＳ細胞等の上記樹立細胞を用いると、導入した遺伝子のコピーが支持可能となり、多量の遺伝子発現により効率良く、細胞外マトリックスを主成分とする立体組織体を製造できる。

　上記播種工程において、播種後の全細胞の被覆培養面上の密度は、上記被覆培養面の表面積に対して、９０~１００％コンフルエントが好ましく、より好ましくは９５~１００％コンフルエント、さらに好ましくは９９~１００％コンフルエントである。播種した細胞は、増殖をする際に性質が変化する場合がある。播種する細胞密度が上記範囲であると、播種した細胞が増殖しにくくなり、細胞が増殖する前に心棒の周囲に巻き付いたリング状の立体組織体を形成することができるため、播種時と同じ性質の細胞を含む立体組織体を形成することができる。
　細胞の種類にもよるが、播種後の全細胞の被覆培養面上の密度としては、２０~１５，０００個／ｍｍ^２が好ましい。なお、播種される細胞は、生きた細胞とする。

　上記播種工程において、播種した細胞が培養面より下側に分散せず、被覆培養面に細胞が接着しやすくなる観点から、培養面の外側端部に壁面を設けてもよい。また、本実施形態（ＩＩＩ）の立体組織体の作製装置を、培養面の外径よりも大きな内径を有する容器に入れてもよい（図２１参照）。これにより、播種した細胞が、培養面よりも下側に落ちにくくなり、播種した細胞を被覆培養面に接着させることができる。なお、培養面の外径と、上記容器の内径との差は、播種した細胞が隙間から落ちにくく、培地の拡散を阻害しないという観点から、１５．０ｍｍ以下が好ましい。

　細胞の播種は、例えば、３７℃のインキュベーター中に静置しておいた立体組織体の作製装置を、室温のクリーンベンチに取り出して、行うことができる。
　なお、細胞は培地に希釈して播種することが好ましい。希釈する培地としては、細胞の培養が可能な培地であれば、特に限定されない。

（１回目の培養工程）
　播種した細胞を培養する条件としては、例えば、一般的な３７℃の細胞インキュベーターを用いて行うことができる。細胞の培養は、心棒の周囲に巻き付いたリング状の立体組織体が得られるまで続けることが好ましく、具体的には、１０~９６時間培養することが好ましく、１５~４８時間培養することがより好ましい。

　上記被覆培養面に接着、培養した細胞は、被覆培養面の内側に向かって自己凝集をし、心棒の周囲にリング状の形態で巻き付く。心棒の周囲に巻き付いたリング状の立体組織体は、その立体組織体内に生存している細胞を有する。
　心棒の周囲に巻き付いたリング状の立体組織体としては、細胞を主成分とする立体組織体が挙げられ、細胞からなる立体組織体であってもよい。また、心棒の周囲に巻き付いたリング状の立体組織体は、細胞外マトリックスを構成するタンパク質等を分泌して細胞外マトリックスを構築し、細胞外マトリックスを主成分とする立体組織体であってもよい。また、心棒の周囲に巻き付いたリング状の立体組織体は、細胞から分泌された物質（例えば、細胞外マトリックスを構成するタンパク質等のタンパク質等）を含む立体組織体であってもよく、細胞から分泌された物質を主成分とする立体組織体であることが好ましく、細胞から分泌された物質のみからなる立体組織体であってもよい。上記細胞から分泌された物質としては、例えば、タンパク質、糖、脂質等が挙げられ、タンパク質が好ましい。
　ここで、「主成分とする」とは、立体組織体の質量（１００質量％）に対して、５０質量％超をいい、６０質量％以上が好ましく、７０質量％以上がより好ましい。

　全ての被覆培養面に細胞を播種し、播種した細胞を培養して立体組織体を得ることが好ましい。

（培養面移動工程）
　本実施形態（ＩＩＩ）の立体組織体の作製方法は、心棒の周囲に巻き付いたリング状の上記立体組織体が得られた後に、上記培養面を上記心棒の延在方向に移動させる培養面移動工程と、上記移動後の上記被覆培養面上に少なくとも１種の細胞を播種する、播種工程（本発明（ＩＩＩ）において「２回目以降の播種工程」と称する場合がある）と、播種した上記細胞を培養して、心棒の周囲に巻き付いたリング状の上記立体組織体に隣接する、上記心棒の周囲に巻き付いたリング状の立体組織体を得る、培養工程（本発明（ＩＩＩ）において「２回目以降の培養工程」と称する場合がある）と、の繰り返しを更に含むことが好ましい。即ち、１回目の播種工程、１回目の培養工程を経て、リング状の立体組織体が得られた後に、培養面移動工程と２回目以降の播種工程と２回目以降の培養工程との繰り返しを含んでいてもよい。
　なお、培養面移動工程、２回目以降の播種工程、２回目以降の培養工程の操作は、ヒトの手で操作しないことで、より無菌的、衛生的に操作できる可能性があるという観点から、コンピューター等を用いて制御し、自動的に行ってもよい。

　培養面移動工程は、前回の播種工程において、心棒の周囲に巻き付いたリング状の上記立体組織体が得られた後に設けられる工程である。培養面移動工程は、前回の培養工程において、心棒の周囲に巻き付いたリング状の上記立体組織体が得られた直後に設けられてもよいし、間隔（例えば、１分~９６時間の間隔等）をあけて設けられてもよい。

　上記培養面移動工程において、培養面を心棒の延在方向に移動させる距離としては、０．０１~５０ｍｍが好ましく、０．１~１０ｍｍがより好ましい。
　なお、１回目の播種工程、１回目の培養工程を経て得られたリング状の立体組織体と、２回目の播種工程、２回目の培養工程を経て得られたリング状立体組織体とは、互いに細胞同士が接着していてもよいし、離れていてもよい。離れている２つのリング状の立体組織体間の距離としては、培養面を心棒の延在方向に移動させる上記距離が挙げられる。リング状の立体組織体内の細胞が伸縮・遊走等をして、２つのリング状の立体組織体内の細胞同士が接着し、２つのリング状の立体組織体がつながる；２つのリング状の立体組織体内の細胞が分泌する物質（例えば、タンパク質等）を介して２つのリング状の立体組織体がつながる；別途作製したタンパク質、細胞等を２つのリング状の立体組織体間に加えて２つのリング状の立体組織体がつなげる；これらの組み合わせにより、２つのリング状の立体組織体がつなげる；等により、離れている２つのリング状の立体組織体を容易につなげることができる。なお、培養面の移動の際は、培養面を固定して心棒を動かしてもよいし、心棒を固定して培養面を動かしてよいし、培養面及び心棒を動かしてもよい。

　なお、立体組織体の厚みを制御する観点から、例えば、培養面移動工程を設けずに、２回目以降の播種工程及び２回目以降の培養工程、又は２回目以降の播種工程及び２回目以降の培養工程の繰り返しを設けることにより、前回の播種工程で得られた、心棒の周囲に巻き付いたリング状の上記立体組織体の周囲に、更に他のリング状の立体組織体を巻き付けて、立体組織体の一部を厚くすることも可能である。
　また、心棒の周囲に巻き付いたリング状の上記立体組織体の周囲に、更に他のリング状の立体組織体を巻き付けた後に、培養面移動工程を設け、同様の操作を続けることにより、立体組織体の全体を厚くすることも可能である。心棒の周囲に巻き付いたリング状の立体組織体を形成する細胞と、その周囲に巻き付くリング状の立体組織体を形成する細胞の種類を変えることで、異なる細胞の層を有する立体組織体を得ることができる。

（２回目以降の播種工程）
　上記２回目以降の播種工程としては、１回目の播種工程と同様の工程が挙げられる。
　上記２回目以降の播種工程で用いる細胞の種類、濃度等は、１回目の播種工程と同じであってもよいし、異なっていてもよい。また、２回目以降の播種工程で用いる細胞の種類、濃度等は、２回目以降の各回の播種工程で同じであってもよいし、異なっていてもよい。

（２回目以降の培養工程）
　播種した細胞を培養する条件としては、上述の１回目の培養工程と同様の条件が挙げられる。
　上記２回目以降の培養工程の条件等は、１回目の培養工程と同じであってもよいし、異なっていてもよい。また、２回目以降の培養工程の条件等は、２回目以降の各回の培養工程で同じであってもよいし、異なっていてもよい。

　２回目以降の培養工程により、前回の培養工程において得られた、心棒の周囲に巻き付いたリング状の上記立体組織体（前回のリング状の立体組織体）に隣接する、新たな心棒の周囲に巻き付いたリング状の立体組織体（新たなリング状の立体組織体）が形成される。前回のリング状の立体組織体と、新たなリング状の立体組織体とは、例えば、３７℃で１時間~３０日間培養することで互いに接着し、管腔状の立体組織体が得られる。

　上記培養面移動工程、上記２回目以降の播種工程、上記２回目以降の培養工程の繰り返し数は、管腔状の立体組織体の厚さ、長さによって適宜選択することができ、例えば、１~２０回の繰り返しが好ましく、１~１０回の繰り返しがより好ましい。

　細胞外マトリックスを含む立体組織体等の播種工程で播種した細胞から分泌された物質（特に、タンパク質）を含む立体組織体を製造する場合、例えば、培養工程後に、立体組織体に含まれる細胞を除去する工程を設けてもよい。立体組織体に含まれる細胞を除去する方法としては、例えば、高圧処理、アルコール処理、界面活性剤処理等の処理や、細胞が生存困難な条件での培養等で細胞を死滅させる方法等が挙げられる。立体組織体に含まれる細胞を除去する工程を設けることにより、立体組織体中の少なくとも一部の細胞を除去することができる。
　また、複数種の細胞を用いて立体組織体を製造し、特定の細胞だけを除去（例えば、軟骨細胞と、細胞外マトリックスを構成するタンパク質を発現する遺伝子を組み込んだＣＯＳ細胞とを含む立体組織体から、ＣＯＳ細胞のみを除去）してもよい。特定の細胞だけを除去する方法としては、例えば、細胞の抗生物質への感受性を増大させて抗生物質を含む培地で培養する、得られる立体組織体中に残したい細胞へのみ抗生物質への耐性を付与して抗生物質を含む培地で培養する等の、特定の細胞のみが生存可能又は生存困難な条件で培養をする等の方法が挙げられる。

　本実施形態（ＩＩＩ）の立体組織体の作製方法で得られる立体組織体は、リング状の立体組織体であってもよいし、管腔状の立体組織体であってもよい。立体組織体の内径は、０．０１~１００ｍｍであることが好ましく、０．１~５０ｍｍであることがより好ましい。また、立体組織体の外径は、０．１~１２０ｍｍであることが好ましく、０．２~７０ｍｍであることがより好ましい。管腔状の立体組織体の長さは、０．１~３００ｍｍであることが好ましく、１~２５０ｍｍであることがより好ましい。

　本実施形態（ＩＩＩ）の立体組織体の作製方法で得られる立体組織体は、細胞を主成分とする立体組織体であってもよいし、細胞外マトリックスを主成分とする立体組織体等の細胞から分泌された物質を含む立体組織体であってもよい。
　細胞外マトリックスを主成分とする立体組織体の作製に好ましい条件としては、例えば、ｉ）コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、エラスチン等の細胞マトリックスの産生能が高い細胞（例えば、線維芽細胞、間葉系細胞等）を用いる、ｉｉ）細胞外マトリックスの産生を促成するアスコルビン酸を培地に添加する、ｉｉｉ）細胞の播種密度を下げて、細胞に対する細胞外マトリックスの比率を高くする、ｉｖ）心棒の周囲に巻き付いたリング状又は管腔状等の立体組織体を培養する時間を増やす（例えば、上記１回目の培養工程、及び又は上記２回目の培養工程において２４~３５０時間（好ましくは４８~１７０時間）培養する）ことで細胞外マトリックスの産生（分泌）量を増やし、細胞外マトリックスの結合（例えば、コラーゲン線維の結合）を成熟させる、ｖ）表面に孔を有する心棒を用いることで、細胞へ栄養と酸素とを安定して供給し、且つ細胞の代謝物を培地中へ拡散しやすくすることで細胞外マトリックスの産生を促す、ｖｉ）培養面移動工程における培養面の移動距離を大きくすることで心棒の延在方向の細胞密度を低くする、等の条件が挙げられる。
　得られる細胞外マトリックスを主成分とする立体組織体としては、例えば、人工血管、人工気管等に用いることも可能な、コラーゲン性の管腔状のバイオチューブ等が挙げられる。

　本実施形態（ＩＩＩ）の立体組織体は、例えば、人工血管、人工気管等に用いることができる、播種工程において播種した細胞を含む立体組織体；細胞から分泌されたタンパク質を主成分とする立体組織体、細胞外マトリックスを含む立体組織体、細胞外マトリックスを主成分とする立体組織体等の、細胞から分泌された物質を含む立体組織体；等が挙げられる。

　人工血管に用いることができる立体組織体としては、例えば、以下の方法で得られる立体組織体が挙げられる。
　１回目の播種工程、１回目の培養工程で、心棒の周囲に血管内皮細胞のリング状の立体組織体（例えば、２~３回、血管内皮細胞の播種工程、培養工程を続けることで、厚い血管内皮細胞のリング状の立体組織体としてもよい）を得た後に、２回目の播種工程、２回目の培養工程で、上記血管内皮細胞のリング状の立体組織体の周囲に、平滑筋細胞のリング状の立体組織体（例えば、３~３０回、平滑筋細胞の播種工程、培養工程を続けることで、厚い平滑筋細胞の立体組織体としてもよい）を巻き付けて、心棒の周囲の血管内皮細胞の層と、血管内皮細胞の層の外側の平滑筋細胞の層とを有する２層構造のリング状の立体組織体としてもよい。さらに、培養面移動工程を設けて、同様の操作を行うことにより、内壁に血管内皮細胞の層、その外周に平滑筋細胞の層を有する、生体中の血管と類似構造を有する、２層構造のリング状又は管腔状の立体組織体を得ることができる。
　また、上記立体組織体において、各層を形成する細胞が混ざりにくくなる観点、及び血管の強度、柔軟性を調整する観点から、例えば、血管内皮細胞の層を形成する工程と、平滑筋細胞の層を形成する工程との間に、間葉系幹細胞や線維芽細胞等のコラーゲン、エラスチンを分泌する細胞を播種、培養する工程を設ける；血管内皮細胞の層を、コラーゲンのチューブやエラスチンのチューブ（例えば、本実施形態（ＩＩＩ）の立体組織体の製造方法で製造された細胞から分泌されたタンパク質を含む立体組織体等）で被覆する；等の方法により、血管内皮細胞の層と平滑筋細胞の層との間に、コラーゲン、エラスチン等を主成分とする（特に、エラスチンを主成分とする）、血管内皮細胞と平滑筋細胞とが混ざりにくくする、バリアとしての機能を有する層を配置することもできる。生体の血管中に見られる内弾性板のような、バリアとしての機能を有する上記層を配置することにより、遊走性を有する細胞が立体組織体を形成した後に各層間を移動することを防ぎ、一層生体の血管に近い構造を有する立体組織体が得られる。

　人工気管に用いることができる立体組織体としては、例えば、以下の方法で得られる立体組織体が挙げられる。
　第１の播種工程、第１の培養工程により、軟骨細胞のリング状の立体組織体（ａ）を得た後に、培養面移動工程を設けて、第２の播種工程、第２の培養工程により、軟骨細胞のリング状の立体組織体に隣接する、新たな線維芽細胞のリング状の立体組織体（ｂ）が形成される。上記工程を適宜繰り返すことにより、例えば、心棒の延在方向に、ａ−ｂ−ｂ−ａ−ｂ−ｂ等の順にリング状の立体組織体が重なった管腔状の立体組織体を得ることができる。なお、リング状の立体組織体間には、細胞外マトリックスを主成分とするリング状の立体組織体、細胞から分泌された物質を含む立体組織体、細胞外マトリックスを構成する成分等の物質を分泌する細胞を含むリング状の立体組織体等を設けてもよい。また、強度を調整する観点から、得られた管腔状の立体組織体を、コラーゲンのチューブやエラスチンのチューブ（例えば、本実施形態（ＩＩＩ）の立体組織体の製造方法で製造された細胞から分泌されたタンパク質を含む立体組織体等）で被覆してもよい。
　なお、軟骨細胞のリング状の立体組織体のみを用いた場合でも、軟骨細胞から分泌される細胞外マトリックスで、軟骨細胞のリング状の各立体組織体が連結され、人工気管を形成することができる。人工気管の強度の観点、及び移植後に血管が這い込みやすくなるという観点から、人工気管は、軟骨細胞のリング状の立体組織体と線維芽細胞のリング状の立体組織体とを含むことが好ましい。

　細胞から分泌された物質を含む立体組織体としては、例えば、以下の方法で得られるタンパク質（例えば、細胞外マトリックスを構成するタンパク質）等の物質を含む立体組織体が挙げられる。
　ＳＶ４０プロモーターの配列を有し、エラスチン、コラーゲン等の細胞外マトリックスを構成するタンパク質を発現する遺伝子を組み込んだ発現ベクターを導入した、ＣＯＳ細胞を用いてリング状又は管腔状の立体組織体を形成し、ＣＯＳ細胞からタンパク質等を分泌させる。培養工程後に、高圧処理、アルコール処理、界面活性剤処理等の処理や、ＣＯＳ細胞が生存困難な条件（例えば、ＣＯＳ細胞の抗生物質への感受性を増大させて、抗生物質を含む培地でＣＯＳ細胞を培養する等）での培養等で死滅させる等の方法により、ＣＯＳ細胞を死滅させ、除去する。なお、本実施形態（ＩＩＩ）の立体組織体は、細胞が完全に除去されていない、死滅した細胞、生存している細胞等を含む立体組織体であってもよい。
　得られた細胞外マトリックスを構成するタンパク質を含む立体組織体は、例えば、本実施形態（ＩＩＩ）の製造方法で得られる立体組織体の強度を補強する被覆材料、人工血管、心筋パッチ、欠損部補填材等に用いることができる。

　以下に、本実施形態（ＩＩＩ）の立体組織体の作製方法の一例について、図２２、図２３、図２７を用いて説明する。
　図２２は、本実施形態（ＩＩＩ）の一例の立体組織体の作製方法の概略図である。
　培養面の貫通孔に、心棒が挿通している立体組織体の作製装置（図２２（ｉ）参照）の培養面に、温度応答性ポリマーを塗布して、被覆し、被覆培養面を準備する（図２２（ｉｉ）参照）。なお、この例では、培養面と心棒とは接している。その後、立体組織体の作製装置を、培養面の外径よりわずかに大きい内径を有する容器に入れ、培地に浸し、細胞を播種する（１回目の播種工程、図２２（ｉｉｉ）参照）。播種した細胞は、被覆培養面に接着する（図２２（ｉｖ）参照）。なおこの例では、細胞の密度は、１００％コンフルエントである。その後、被覆培養面に接着した細胞は、被覆培養面中央部に向かって凝集し始め、端部が被覆培養面から離れて反り返り始めて、端部が反り返った細胞構造体となる（図２２（ｖ）参照）。その後、更に凝集を続けてリング状となり、心棒の周囲に巻き付いたリング状の立体組織体が得られる（図２２（ｖｉ）参照）。ここで、心棒の周囲に巻き付いたリング状の立体組織体は、心棒からずれ落ちない程度に心棒に巻き付いているため、心棒が細胞接着性でない場合でも、立体組織体の作製中に巻き付いた位置が大きく変わることはない。その後、培養面を心棒の延在方向下側に移動させ、得られたリング状の立体組織体の下側に隣接する、他のリング状の立体組織体を形成する隙間を設ける（培養面移動工程、図２２（ｖｉｉ）参照）。その後、再度細胞を播種し（２回目の播種工程、図２２（ｖｉｉｉ）参照）、培養することでリング状の立体組織体が積層した管腔状の立体組織体が得られる。培養面移動工程、２回目以降の播種工程、２回目以降の培養工程を繰り返すことにより、長い管腔状の立体組織体が得られる（図２２（ｉｘ）参照）。
　なお、上記の例において、例えば、播種する細胞数を少なくしたり、心棒の周囲に巻き付いたリング状の立体組織体が得られた後に静置して細胞外マトリックスを構成するタンパク質の分泌を待つこと等により、細胞外マトリックスを主成分とする立体組織体を得ることもできる。なお、上記の全て、又は一部の工程を、コンピューター等を用いて制御し、自動的に行ってもよい。

　図２３は、培養面と心棒との間に隙間がある立体組織体の作製装置を用いた、本実施形態（ＩＩＩ）の一例の立体組織体の作製方法の概略図である。
　培養面の貫通孔に、心棒が挿通している立体組織体の作製装置（図２３（ｉ）参照）の培養面に、温度応答性ポリマーを塗布して、被覆し、被覆培養面を準備する（図２３（ｉｉ）参照）。なお、この例では、心棒の径は、貫通孔の孔径よりも小さく、培養面と心棒との間に隙間がある。その後、立体組織体の作製装置を、培養面の外径よりわずかに大きい内径を有する容器に入れ、培地に浸し、細胞を播種する（１回目の播種工程、図２３（ｉｉｉ）参照）。播種した細胞は、被覆培養面に接着する（図２３（ｉｖ）参照）。なおこの例では、細胞の密度は、１００％コンフルエントである。その後、被覆培養面に接着した細胞は、被覆培養面中央部に向かって凝集し始め、端部が被覆培養面から離れて反り返り始めて、端部が反り返った細胞構造体となる（図２３（ｖ）参照）。その後、更に凝集を続けてリング状となり、凝集する細胞構造体は、培養面と心棒との間には隙間を飛び越えるようにして、心棒の周囲に巻き付き、リング状の立体組織体を形成する（図２３（ｖｉ）参照）。その後、培養面を心棒の延在方向上側に移動させ、得られたリング状の立体組織体の上側に隣接する、他のリング状の立体組織体を形成する隙間を設ける（培養面移動工程、図２３（ｖｉｉ）参照）。その後、再度細胞を播種し（２回目の播種工程、図２３（ｖｉｉｉ）参照）、培養することでリング状の立体組織体が積層した管腔状の立体組織体が得られる。培養面移動工程、２回目以降の播種工程、２回目以降の培養工程を繰り返すことにより、長い管腔状の立体組織体が得られる（図２３（ｉｘ）参照）。
　なお、上記の全て、又は一部の工程を、コンピューター等を用いて制御し、自動的に行ってもよい。

　図２７は、培養面を複数有し、培養面と心棒との間に隙間がある立体組織体の作製装置を用いた、本実施形態（ＩＩＩ）の一例の立体組織体の作製方法の概略図である。
　２つの培養面の貫通孔に、１本の心棒が挿通している立体組織体の作製装置（図２７（ｉ）参照）の２つの培養面に、温度応答性ポリマーを塗布して、被覆し、被覆培養面を準備する（図２７（ｉｉ）参照）。なお、この例では、心棒の径は、貫通孔の孔径よりも小さく、培養面と心棒との間に隙間がある。その後、立体組織体の作製装置を、培養面の外径より大きい内径を有する容器に入れ、培地に浸し、細胞を播種する（１回目の播種工程、図２７（ｉｉｉ）参照）。播種した細胞は、被覆培養面に接着する（図２７（ｉｖ）参照）。なおこの例では、細胞の密度は、１００％コンフルエントである。その後、被覆培養面に接着した細胞は、被覆培養面中央部に向かって凝集し始め、端部が被覆培養面から離れて反り返り始めて、端部が反り返った細胞構造体となる（図２７（ｖ）参照）。その後、更に凝集を続けてリング状となり、凝集する細胞構造体は、培養面と心棒との間には隙間を飛び越えるようにして、心棒の周囲に巻き付き、リング状の立体組織体を形成する（図２７（ｖｉ）参照）。その後、培養することで、２つのリング状の立体組織体がつながり、管腔状の立体組織体が得られる（図２７（ｖｉｉ）参照）。
　なお、図２７（ｖｉｉ）では、管腔状の立体組織体を見やすくするため、培養面の図示を省いている。図２７では、培養面と心棒との間に隙間があるため、培養面がある状態でも、培養面を除いた状態でも、２つのリング状の立体組織体はつながり、管腔状の立体組織体が得られる。
　また、培養面の数を増やす、培養面移動工程、２回目以降の播種工程、２回目以降の培養工程を設ける、等の方法により、更に長い管腔状の立体組織体が得ることもできる。
　なお、上記の全て、又は一部の工程を、コンピューター等を用いて制御し、自動的に行ってもよい。

［［発明（ＩＶ）］］
（細胞構造体の製造方法）
　本発明（ＩＶ）の実施形態の細胞構造体の製造方法（以下、「本実施形態（ＩＶ）の製造方法」ともいう。）は、培養面に温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物で被覆された被覆領域を調製し、該被覆領域に細胞懸濁液の液滴を形成し、該液滴中で細胞培養を行うものである。

　より具体的には、本実施形態（ＩＶ）の製造方法の一例では、図３２に示すように、まず、培養面を準備し（図３２（ｉ）参照）、培養面上に温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を配置し（図３２（ｉｉ）参照）、培養面を温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物で被覆して被覆領域を調製し（図３２（ｉｉｉ）参照）、被覆領域に細胞懸濁液の液滴を形成し（図３２（ｉｖ）参照）、液滴中で細胞培養を行い（図３２（ｖ）参照）、細胞構造体を形成させる（図３２（ｖｉ）参照）。

　ここで、本実施形態（ＩＶ）の製造方法では、後述のとおり細胞構造体を自発的に形成する効果を得る観点から、培養面に調製しした被覆領域の表面ゼータ電位を、０~５０ｍＶとすることが肝要である。

　以下、本実施形態（ＩＶ）の製造方法における作用効果について記載する。

　細胞構造体の製造方法として公知のハンギングドロップ法では、管状部材の先端に細胞懸濁液の液滴を調製し、液滴の表面張力を利用して液滴の形状を球状に保ちながら液滴を所定期間（例えば、２週間程度）保持することによって、液滴中でスフェロイド状の細胞構造体を製造している。しかしながら、液滴を保持するために操作が煩雑なものとなり、スフェロイド状の細胞構造体を簡便に製造することが困難である。
　一方、本実施形態（ＩＶ）の製造方法によれば、液滴を培養面に載せた状態で保持することができるため、スフェロイド状の細胞構造体を簡便に製造することが可能となる。

　また、例えば、培養面と壁面とで区画される１つ又は複数のウェルを備える細胞培養器を用いて、ウェルの培養面に被覆領域と被覆領域でない領域である非被覆領域とを調製し、ウェルに細胞懸濁液を加える方法も考えられるが、かかる方法に対しては本実施形態（ＩＶ）の製造方法は下記のような効果を有している。

　上述の方法では、被覆領域も非被覆領域も細胞懸濁液で浸るように、細胞培養液を細胞培養器に対して加えるため、非被覆領域に播種した細胞が接着するおそれがある。このとき、非被覆領域の細胞が、被覆領域における形状の整ったスフェロイド状の細胞構造体の形成を阻害することがある。そのため、壁面を有する細胞培養器を用いる場合には、培養面の全部又は一部に細胞非接着性を与える処理を施すことが必要となることもある。そして、ときに、かかる処理に起因して細胞に毒性のある物質が培地に溶出することもある。
　一方、本実施形態（ＩＶ）の製造方法によれば、被覆領域における細胞懸濁液の液滴は非被覆領域から隔離されているため、上記の細胞非接着性を与えるような処理が必要とならず、そして、細胞の生育に悪い影響を与える可能性が低くなる。

　また、上述の方法では、ウェルに細胞懸濁液を加えた後、被覆領域には細胞が接着し、細胞非接着性を与えるような処理を施した非被覆領域には細胞が接着しないこととなる。非被覆領域における接着しなかった細胞は、アポトーシスを生じさせたりヒートショックプロテインを産生させたりして、被覆領域において接着した細胞の生育に対して悪い影響を与えるおそれがある。そのため、この方法では、非被覆領域の細胞を培地交換等の操作によりウェルから除去することが必要となる場合がある。
　一方、本実施形態（ＩＶ）の製造方法によれば、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物で被覆されることで細胞接着性を備えることとなった被覆領域に、非被覆領域から隔離された状態で、細胞懸濁液の液滴を形成するため、非被覆領域の細胞を除去する必要性が小さいため、使用する細胞の量を低減することができ、また、培地交換ンどの操作の必要性が小さいため、使用する培地の量を低減することができる。総じて、本実施形態（ＩＶ）の製造方法によれば、製造コストを低減することが可能になる。

　本実施形態（ＩＶ）の製造方法では、３８４ウェル細胞培養プレート等に使用されている自動培養装置をそのまま利用することが可能（例えば、１６連ノズルで細胞浮遊液をマルチプレートに注入するプログラムで、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を塗布した培養面に細胞懸濁液の液滴を吐出することが可能）であり、また、細胞培養プレートの分析機器も当該技術分野において通常用いられているものを利用することが可能である。そのため、本実施形態（ＩＶ）の製造方法によれば、細胞構造体の製造コストを抑制することができると共に、上記装置や機器の用途を広げるという意味で経済効果を生み出すことができる。

　本発明（ＩＶ）の実施形態の細胞構造体の製造方法では、前述のとおり、被覆領域の表面ゼータ電位を０~５０ｍＶとすることが肝要である。表面ゼータ電位を０ｍＶ以上とすれば、負に帯電する細胞を接着させることができ、また、５０ｍＶ以下とすれば、細胞毒性を軽減することができる。
　上記と同様の理由から、表面ゼータ電位は、好適には０~３５ｍＶであり、更に好適には１０~２５ｍＶである。

　表面ゼータ電位は、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物における、Ｃ／Ａ比を調整することによって、調整することができる。

　上記特定の範囲の表面ゼータ電位を有する培養面によれば、細胞を適切な培養条件で培養するだけで、塊状（ペレット状）の構造を有する細胞構造体（スフェロイド）を簡便に形成させることができる。
　これは、上記特定の範囲の表面ゼータ電位とすることによって、培養面に細胞毒性を惹起しない微弱な陽電荷を与えることができ、また、播種した細胞の速やかな接着を確保し、細胞の活性の向上及び細胞外マトリックスの分泌を促進し、更には、細胞遊走を適度に抑制して、細胞間の結合を強くすることができるものと推測される。

　上記特定の範囲の表面ゼータ電位を有する培養面における細胞構造体を形成する現象の再現性は極めて高く、均質な細胞構造体を作製することが可能となる。

　従来の細胞培養器を用いて作製された細胞の塊は、細胞非接着性の培養面に接着できない細胞が寄せ集められたものに過ぎないため、細胞の塊を構成する細胞のバイアビリティが低いという問題があった。
　一方、本実施形態（ＩＶ）の製造方法で製造された細胞構造体（スフェロイド）は、培養面上に速やかに接着し、増殖しながら伸展するという経過を経たうえで形成されるものであるため、細胞間に産生された細胞外マトリックスが豊富に存在する。そのため、細胞構造体自体のバイアビリティ（活性）が極めて高い。

　そして、本実施形態（ＩＶ）の製造方法では、細胞構造体のサイズは、実験者が目的に応じて適宜定めることができ、サイズに分布を持たせることも、サイズを均一にすることも可能となる。
　細胞構造体のサイズは、微小サイズ（例えば、数百μｍ以下のサイズ）とすることができ、５０~１，５００μｍ径としてよく、５０~２００μｍ径であることが好ましい。

　また、本実施形態（ＩＶ）の製造方法では、平板な培養面において細胞構造体を作製することが可能であるため、細胞培養器を用いて作製した細胞構造体に対してアッセイを行う場合に、この培養器を直接的に顕微鏡により観察することも可能となる。

　更に、本実施形態（ＩＶ）の製造方法によれば、細胞が細胞培養器の培養面と壁との境界である培養面の外縁に接着させないことも可能となり、サイズの均質性を長時間維持することができる。

　以下、本発明（ＩＶ）の実施形態の細胞培養器の製造方法における各工程について詳細に記載する。

　本実施形態（ＩＶ）の製造方法の一例では、まず、培養面を準備する（図３２（ｉ）参照）。

　ここで、培養面としては、細胞培養器の培養面であってもよく、細胞培養器以外の部材の培養面であってもよく、例えば、市販のプレート、ディッシュ、フラスコ、ガラス板、シリコンシート等が挙げられる。

　培養面は、細胞接着性であっても細胞非接着性であってもよい。
　なお、「細胞非接着性」とは、付着細胞（例えば、線維芽細胞、肝細胞、血管内皮細胞等）が、通常の培養条件下で、接着しない又は接着しにくい性質をいう。

　培養面の材質としては、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリプロピレン、ポリブテン、ポリエチレン、ポリカーボネート等が挙げられ、精密な成形加工が容易であり、種々の滅菌法を適用することが可能であり、透明性があるため顕微鏡観察に向いているという観点から、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）が好ましい。

　なお、一般的な細胞培養用のプレートは、ポリスチレン等のプラスチックでできているが、表面処理（例えば、プラズマ処理）が施されており、培養面に細胞が接着しやすくなっている。

　なお、本発明（ＩＶ）の細胞構造体の製造方法では、培養面を準備すればよく、細胞培養器を用いなくてもよい。

　次いで、培養面上に温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を配置する（図３２（ｉｉ）参照）。

　以下、本発明（ＩＶ）の実施形態の製造方法において培養面に配置される温度応答性ポリマー及び温度応答性ポリマー組成物について詳述する。
　実施形態（ＩＶ）における温度応答性ポリマー及び温度応答性ポリマー組成物としては、上記発明（Ｉ）における温度応答性ポリマー及び温度応答性ポリマー組成物と同様のものが挙げられ、好適例としても同様のものが挙げられる。
　なお、本実施形態（ＩＶ）において、（Ａ−１）の温度応答性ポリマーの製造方法は、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）を含む混合物を調製する調製工程と、混合物に紫外線を照射する照射工程とを含み、ここで、調製工程において、混合物は重合禁止剤及び水を更に含み、照射工程において、紫外線は不活性雰囲気下において照射される、ことを特徴とする方法に限定されず、他の方法であってもよい。
　また、本実施形態（ＩＶ）において、（Ａ−１）の温度応答性ポリマーによれば、後述するように、細胞を適切な培養条件で培養することにより、管腔状（チューブ状）及び塊状（ペレット状）の構造を有する細胞構造体を形成させることができる。
　また、本実施形態（ＩＶ）において、（Ａ−２）の温度応答性ポリマーの製造方法は、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）を含む第一混合物に紫外線を照射する第一重合工程と、第一重合工程における重合物の数平均分子量が所定値以上となった時点で、第一混合物にアニオン性モノマーを添加して第二混合物を調製する添加工程と、第二混合物に紫外線を照射する第二重合工程と、を含むことを特徴とする方法に限定されず、他の方法であってもよい。
　また、本実施形態（ＩＶ）において、（Ｃ）の温度応答性ポリマー組成物は、上記の通り、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体の重合体と、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオールと、核酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、デキストラン硫酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリリン酸、硫酸化多糖類、カードラン及びポリアルギン酸並びにこれらのアルカリ金属塩からなる群から選択される一種以上のアニオン性物質とを含んでいてもよい。
　また、本実施形態（ＩＶ）において、上記（Ｃ３）に列挙したアニオン性物質におけるＤＮＡとしては、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、間葉系幹細胞等の幹細胞を分化細胞、特に、心筋細胞、肝細胞、神経細胞、血管内皮細胞、に分化誘導できるＤＮＡが好ましい。

　ここで、本実施形態（ＩＶ）の製造方法の一例では、培養面全面に被覆領域を調製してもよく（図３３（ｉ）、（ｉｉ）参照）、培養面に複数の被覆領域を調製してよい（図３３（ｉｉｉ）参照）。

　培養面全面に被覆領域を調製する場合、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物溶液を培養面に流延させてよい。
　培養面に複数の被覆領域を調製する場合、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物の配置（スポット）手法としては、例えば、８連マイクロピペッターによる手技、溶液を定量吐出するスポッター印刷法、回転スクリーンドラム印刷法等が挙げられる。

　特に、培養面に複数の被覆領域を調製する場合、
　被覆領域の面積は、０．１~３０ｍｍ^２であることが好ましい。上記範囲とすれば、目的の微小サイズのスフェロイドが得られやすい。
　被覆領域間の距離が、０．１~１０ｍｍであることが好ましい。なお、「被覆領域間の距離」とは、被覆領域間の培養面上における最短距離をいう。０．１ｍｍ以上とすれば、隣接する被覆領域間で、それぞれの領域に播種された細胞どうしが接着してしまうことを抑制することができる。１０ｍｍ以下とすれば、大量の細胞構造体（スフェロイド等）を効率良い作製することができる。

　特に、培養面に複数の被覆領域を調製する場合、被覆領域の数は、実験者の目的に応じて適宜定められてよく、２以上としてよく、１０以上としてよく、１，０００以上としてよい。

　特に、培養面に複数の被覆領域を調製する場合、被覆領域の平面視形状は、円形、楕円形、外輪郭線の内側に曲率中心を有する形状であることが好ましい。
　曲率半径としては、０．１~５０ｍｍであることが好ましく、１~１０ｍｍであることが更に好ましい。
　円形の被覆領域の直径としては、１０μｍ~１０ｍｍであることが好ましく、３０μｍ~１５００μｍであることが更に好ましい。
　これらの形状は、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

　本実施形態（ＩＶ）の製造方法の一例では、培養面の被覆領域が、単位面積当たりに有する、温度応答性ポリマーの量が、５．０~５０ｎｇ／ｍｍ^２であることが好ましく、１５~４０ｎｇ／ｍｍ^２であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、細胞構造体を形成させやすくするという効果が得られやすい。

　本実施形態（ＩＶ）の製造方法の一例では、温度応答性ポリマーは、水溶液の状態からの沈殿、溶液の塗布及び溶媒の乾燥、放射線照射、低温プラズマ照射、コロナ放電、グロー放電、紫外線、ラジカル発生剤を使用したグラフト重合等の手法により細胞培養器の培養面に被覆されていてよい。

　培養面を温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物で被覆する方法、及び被覆領域となる複数の培養面上における位置に温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を配置する方法については後述する。

　本実施形態（ＩＶ）の製造方法における培養面は、細胞培養用プレート（例えば、３５ｍｍディッシュ等）をベースとして作製されてよく、例えば、再生医療の分野において好適に用いることができる。
　一方、培養面は、マイクロプレート（例えば、９６穴プレート等）をベースとして作製されてよく、例えば、創薬の分野（特に、薬剤スクリーニング）において好適に用いることができる。

　上記温度応答性ポリマー又は上記温度応答性ポリマー組成物は、加熱乾燥、凍結乾燥、減圧蒸留等により水分を除去して、メタノール、エタノール等のアルコール、ケトン、エステル等の有機溶媒に溶解してもよい。これらの中でも、表面張力と沸点が低く速やかな乾燥が可能であり、温度応答性ポリマーをより均一に被覆できる観点から、メタノールに溶解させることが好ましい。また、有機溶媒に溶解する場合には、更に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡＡ）、グリセリン、ＴｒｉｔｏｎＸ、ポリプロピレングリコール等の非イオン性でかつ親水性である親水性分子を加えてもよい。

　こうして、この製造方法の一例では、培養面を温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物で被覆して被覆領域を調製する（図３２（ｉｉｉ）参照）。

　本実施形態（ＩＶ）の製造方法では、前述のとおり、被覆領域の表面ゼータ電位が、０~５０ｍＶとすることが肝要であり、０~３５ｍＶであることが好ましく、１０~２５ｍＶであることが更に好ましい。

　また、本実施形態（ＩＶ）の製造方法では、本発明（ＩＶ）の効果を高める観点から、培養面の被覆領域に対する水の接触角が、５０~９０°であることが好ましく、６０~８０°であることが更に好ましく、６２~７８°であることが特に好ましい。
　なお、被覆領域に対する水の接触角とは、被覆領域内の任意の数点において、ＪＩＳ　Ｒ３２５７に準拠して、測定される接触角の平均値を指す。

　上記の通り、被覆領域は、細胞表面との間の相互作用を高めて、細胞の被覆領域に対する接着性を高める観点から、所定程度以上の疎水性を有する領域であることが好ましい。

　培養面の被覆領域に対する水の接触角は、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物における疎水性基の構造や量を調整することによって、調整することができる。

　本実施形態（ＩＶ）の製造方法の一例では、各被覆領域において、液滴の底面積を被覆領域の面積よりも小さくすることが好ましい。
　培養面を被覆する工程においては、被覆領域の端縁では被覆領域の中央部分と比較して、単位面積当たりに対する温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物の量が多くなり、ときに被覆領域の端縁が中央部分に対して盛り上がることがある。この場合、被覆領域に接着した細胞がなす細胞構造体の形状が整いにくい傾向がある。液滴の底面積を被覆領域の面積よりも小さくすれば、被覆領域において温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物の量が不均一になるおそれのある領域には細胞を接着させないようにすることができるようになるため、形状の整った細胞構造体を調製しやすくなる。
　上記と同様の理由から、具体的には、各被覆領域において、被覆領域の面積に対する液滴の底面積の割合の上限を９９％以下としてよく、上限は、９７％、９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％することも好ましい。
　また、上記割合の下限を１０％以上としてよく、下限は、２０％、３０％とすることも好ましい。上記割合を１０％以上とすれば、十分なサイズの細胞構造体を効率良く調製することが可能となる。

　本発明（ＩＶ）の実施形態の細胞培養器を用いた細胞培養方法の一例では、被覆領域に細胞懸濁液の液滴を形成する（図３２（ｉｖ）参照）。

　本実施形態（ＩＶ）の製造方法は、製造した細胞構造体の直径に極めて高い均質性が要求される細胞（例えば、創薬試験に利用される細胞や多分化能幹細胞等）や、分化状態の精密制御のために培養コストが高額になる細胞（具体的には、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、間葉系幹細胞、癌幹細胞等の幹細胞、並びに、それらの分化誘導細胞；血管内皮細胞、脂肪細胞、脂肪幹細胞、線維芽細胞、心筋細胞、筋芽細胞等の間葉系細胞；ＨｅｐａＲＡ、ＨｅｐａＲＧ、ＨｅｐＧ２、ＢｘＰＣ−３等の上皮系の細胞；等）に対して、特に好適に適用することができる。初代細胞の場合は、コロニーを形成する接着性細胞を選択すれば良く、当業者によって適宜選択可能である。

　この製造方法の一例では、被覆領域に細胞懸濁液の液滴を形成するに当たって、底面の形状が好適には円形となるように、細胞懸濁液を滴下することが好ましい。かかる手法によれば、形状の整ったスフェロイド状の細胞構造体を得られやすくなる。

　本実施形態（ＩＶ）の製造方法の一例では、液滴に含まれる細胞の数を、３．０×１０^５個／ｍＬ以下とすることが好ましい。
　細胞を播種する工程において、細胞密度が高過ぎる場合には、細胞が重なり合った状態で沈殿してしまい、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物と接触しない細胞が生じることとなる。この場合、このようなポリマー又はポリマー組成物と非接触の細胞は、例えば、他の細胞との融合によりその性質を変えてしまう等といった有害な影響をもたらす可能性がある。液滴に含まれる細胞の数を３．０×１０^５個／ｍＬ以下とすれば、被覆領域にほぼ単層で細胞を沈殿させることができ、細胞を好適な条件下で培養することが可能となる。

　また、液滴に含まれる細胞の数は、十分なサイズの細胞構造体を調製する観点から、１．０×１０^４個／ｍＬ以上とすることが好ましい。

　上記と同様の理由から、液滴に含まれる細胞の数は、更に好適には１．０×１０^５個~３．０×１０^５個／ｍＬであり、特に好適には２．０×１０^５個~３．０×１０^５個／ｍＬであり、播種した細胞の形態やサイズ等を考慮して当業者によって適宜調整可能である。なお、上記の細胞の数とは、生細胞の数を意味する。

　この製造方法の一例では、液滴の径を１μｍ~８ｍｍとすることが好ましい。
　液滴の径が１μｍより少ないと、培地量が少なくなりすぎるため、乾燥が引き起こされる等細胞培養において適当でない環境となる可能性がある。
　液滴の径が８ｍｍを超えると、細胞が液滴内でポリマー又はポリマー組成物上に沈殿する際に、ポリマー上に配置される細胞の細胞密度にばらつきが生じ、スフェロイド形成が複数箇所で生じ（細胞の凝集の核となる応力発生点が複数箇所となり）、スフェロイドが真球状となりにくいおそれがある。
　上記と同様の理由から、液滴の径は、更に好適には１００μｍ~４ｍｍであり、特に好適には３００μｍ~３ｍｍである。

　本実施形態（ＩＶ）の製造方法の一例では、形状の整った細胞構造体を調製しやすくする観点から、液滴の量を０．５~５０μＬとすることが好ましく、１．０~４０μＬとすることが更に好ましく、５．０~２５μＬとすることが特に好ましい。

　また、この製造方法の一例では、１つの被覆領域に、１つの液滴を形成してもよく、複数の液滴を形成してもよい。

　特に、１つの被覆領域に複数の液滴を形成する場合には、液滴間の間隔（液滴間の最近接距離）としては、１~５００μｍであることが好ましい。
　１μｍより少ないと、液滴同士が結合してしまう可能性がある。５００μｍを超えると、効率的にスフェロイドを大量生産するという目的を達成できない可能性がある。
　上記と同様の理由から、液滴間の間隔は、２~２５０μｍであることが更に好ましく、５~１００μｍであることが特に好ましい。

　この製造方法の一例では、液滴中で細胞培養を行う（図３２（ｖ）参照）。

　培養条件は、使用する細胞に応じて適宜定めてよく、例えば、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気等としてよい。

　細胞培養の際には、水ミストの噴霧等により培養器内を積極的に加湿する方法、リン脂質、高級カルボン酸、流動パラフィン等の低比重で不活性な油性成分の被膜で細胞懸濁液の液滴表面を覆うことによって、液滴中の水分の揮発を抑制する方法を用いてよい。かかる方法は、特に、細胞懸濁液の液滴の量が１０μＬ未満である場合に、液滴を維持するために特に有効である。

　その後、この製造方法の一例では、更に培養を続けることによって、細胞構造体を形成させる（図３２（ｖｉ）参照）。

　このとき、特定の特性を有する被覆領域において、塊状（ペレット状）の構造を有する細胞構造体を簡便に形成させることができる。

　以下、本発明（ＩＶ）の実施形態の細胞構造体の製造方法において用いられる好適な培養面について記載する。

　好適な培養面は、ガラス製の培養面と、培養面から始端する前述の本発明（ＩＶ）の実施形態の細胞構造体の製造方法において用いられる温度応答性ポリマーと、を含むものである。

　好適な培養面によれば、ガラス自体が有機溶媒に対する耐性を備えるため、培養面を有機溶媒で洗浄することが可能となり、より細胞毒性物質を低減することが可能となる。
　また、この培養面は、従来的に用いられてきた放射線照射を伴うグラフト重合の方法を用いることなく製造することが可能であること（後述）、また、ため、放射線照射により生じる重合体の分解物の量を低減することができ、細胞の生育に良好な環境を提供することができる。

　ガラス製の培養面としては、ガラス製の細胞培養器の培養面やガラス板の表面等としてよい。
　温度応答性ポリマーとしては、前述の（Ａ）２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）単位と、アニオン性モノマー単位とを含む温度応答性ポリマー、（Ｂ）Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）単位と、カチオン性モノマー単位と、アニオン性モノマー単位とを含む温度応答性ポリマー等が挙げられる。

　より具体的には、かかる好適な細胞培養器の製造方法としては、例えば、（ａ）ガラス製の培養面をビニル基を有するシランカップリング剤で処理し、処理された培養面上において２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）を水存在下で紫外線を照射しながら重合させる方法、
（ｂ）ガラス製の培養面をハロゲン化アルキル基を有するシランカップリング剤で処理し、また、ハロゲン化アルキル基とＮ，Ｎ−ジアルキル置換ジチオカバミル酸との置換反応で、Ｎ，Ｎ−ジアルキル置換ジチオカルバモイル基を培養面に導入し、かかる培養面上において、Ｎ，Ｎ−ジアルキル置換ジチオカルバモイル基をラジカル重合開始点として２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）を水存在下で紫外線を照射しながらイニファーター重合させる方法、
が挙げられる。

　上記（ａ）の方法に関して、ビニル基を有するシランカップリング剤としては、有機物との反応や相互作用をする機能を備える反応性官能基（Ｙ）として、ビニル基、スチリル基、メタクリル基、アクリル基からなる群から選択される少なくとも１つを有し、ガラスとの反応や相互作用をする機能を備える反応性官能基（Ｘ）として、アルコキシ基、ハロゲンからなる群から選択される少なくとも１つを有するものが挙げられる。
　具体的には、ビニルトリメトキシシラン、ｐ−スチリルトリメトキシシラン、３−メタクリロイルオキシプロピルトリメトキシシラン、３−アクリロイルオキシプロピルトリエトキシシラン等が挙げられる。
　シランカップリング剤での処理の条件は、常法の通りとしてよい。

　処理された培養面上におけるＤＭＡＥＭＡの重合の方法としては、（Ａ）２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）単位と、アニオン性モノマー単位とを含む温度応答性ポリマーについて記載した通りとしてよい。
　特に、上記（ａ）の方法では下記の条件とすることが好ましい。
・紫外線照射における紫外線の波長としては、重合体の分解物の量を低減する観点から、近紫外線の波長であることが好ましく、３３０~４００ｎｍであることが更に好ましく、３５０~３９０ｎｍであることが特に好ましい。
・処理された培養面の裏側から光を照射する（ガラスを透過させるように光を照射する）と、光源に含まれる短波長の紫外線をカットし、近紫外線領域の波長の光線を選択的に照射することも可能となり、かつ、ビニル基を有するシランカップリング剤側からＤＭＡＥＭＡ側に向かって光照射して、モノマーの分解等よりも重合反応を優先させることも可能となるため、好ましい。

　上記（ｂ）の方法に関して、ハロゲン化アルキル基を有するシランカップリング剤としては、有機物との反応や相互作用をする機能を備える反応性官能基（Ｙ）として、ハロゲン化アルキル基、より具体的には、ｐ−クロロメチルベンジル基、３−クロロプロピル基、ｐ−ブロモメチルベンジル基、３−ブロモプロピル基からなる群から選択される少なくとも１つを有し、ガラスとの反応や相互作用をする機能を備える反応性官能基（Ｘ）として、アルコキシ基、ハロゲンからなる群から選択される少なくとも１つを有するものが挙げられる。
　具体的には、３−クロロプロピルトリメトキシシラン、ｐ−クロロメチルベンジルトリクロロシラン、３−クロロプロピルトリクロロシラン等が挙げられる。
　シランカップリング剤での処理の条件は、常法の通りとしてよい。

　ガラス表面（培養面）へ導入されたＮ，Ｎ−ジアルキル置換ジチオカルバモイル基をラジカル重合開始点とする２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）のイニファーター重合の反応条件は、常法の通りとしてよい。
　特に、上記（ｂ）の方法では下記の条件とすることが好ましい。
・紫外線照射における紫外線の波長としては、重合体の分解物の量を低減する観点から、近紫外線の波長であることが好ましく、３３０~４００ｎｍであることが更に好ましく、３５０~３９０ｎｍであることが特に好ましい。
・処理された培養面の裏側から光を照射する（ガラスを透過させるように光を照射する）と、光源に含まれる短波長の紫外線をカットし、近紫外線領域の波長の光線を選択的に照射することも可能となり、かつ、シランカップリング剤側からＤＭＡＥＭＡ側に向かって光照射して、モノマーの分解等よりも重合反応を優先させることも可能となるため、好ましい

　以上、図面を参照して、本発明（ＩＶ）の細胞構造体の製造方法の実施形態について例示説明したが、本発明（ＩＶ）の細胞構造体の製造方法は、上記の例に限定されることはなく、上記実施形態（ＩＶ）には、適宜変更を加えることができる。

［［発明（Ｖ）］］
　以下、図面を参照して、本発明（Ｖ）の細胞構造体の製造方法、本発明（Ｖ）の細胞構造体、本発明（Ｖ）の細胞培養器の実施形態について詳細に例示説明する。

　本発明（Ｖ）の実施形態（以下、「本実施形態（Ｖ）」ともいう。）の細胞構造体の製造方法は、
　細胞培養器の培養面に、温度応答性ポリマー及び／又は温度応答性ポリマー組成物で被覆された第一被覆領域と、前記第一被覆領域の端部に設けられた、細胞接着性物質で被覆された複数の第二被覆領域とを準備する、準備工程と、
　細胞を前記第一被覆領域及び前記第二被覆領域に播種し、前記細胞を培養する、播種培養工程と
を含む。

　本実施形態（Ｖ）における一例の製造方法は、温度応答性ポリマー及び／又は温度応答性ポリマー組成物を調製する、調製工程と、前述の準備工程と、前述の播種培養工程とを含む。

　図３５（ｉ）~（ｖｉｉｉ）に、本実施形態（Ｖ）における一例の細胞構造体の製造方法の概要について示す。

　以下、本実施形態（Ｖ）における一例の細胞構造体の製造方法における各工程の詳細を記載する。

　（調製工程）
　実施形態（Ｖ）における調製工程としては、上記発明（Ｉ）における調製工程と同様の工程が挙げられ、好適例としても同様のものが挙げられる。

　（準備工程）
　一例の製造方法では、次いで、細胞培養器の培養面に、温度応答性ポリマー及び／又は温度応答性ポリマー組成物で被覆された第一被覆領域と、第一被覆領域の端部に設けられた、細胞接着性物質で被覆された複数の第二被覆領域とを準備する（準備工程）（図３５（ｉ）~（ｉｉｉ）参照）。

　ここで、第一被覆領域及び第二被覆領域以外の培養面は、細胞接着性としても、細胞非接着性としてもよいが、所望の形状の細胞構造体を得られやすくする観点から、細胞非接着性とすることが好ましい。
　細胞非接着性の培養面の調製方法は、特に限定されることなく、例えば、細胞非接着性の培養面を備える細胞培養器、例えば、ＳＵＭＩＬＯＮ社製のＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（登録商標）を用いてもよく、細胞非接着性のシートや中敷き等を用いてもよく、未処理のポリスチレン製の培養面を備える細胞培養器を用いてもよい。

　ここで、図３５に示すように、第一被覆領域及び第二被覆領域は、細胞培養器の壁との接触を抑制して、細胞構造体の形状を整える観点から、非被覆領域（培養面に特に被覆が施されていない領域）に取り囲まれるように設けられることが好ましい（図３５（ｉｉ）、（ｉｉｉ）参照）。

　第一被覆領域の面積は、特に限定されないが、例えば、φ３５ｍｍの細胞培養器の培養面を用いて、１~３０ｍｍサイズの細胞構造体を製造する場合、１~７５０ｍｍ^２としてよく、好ましくは１０~７００ｍｍ^２である。

　第一被覆領域の形状は、特に限定されることなく、平面視で、円形（円、楕円等）、矩形（正方形、長方形、三角形等）、線形としてよく、矩形は角が丸みを帯びていてもよい。
　中でも、上記形状は、細胞の凝集様式を制御する観点から、所定方向に延びる形状、より具体的には、長軸方向及び短軸方向が存在する形状、外輪郭線上の任意の２点間の距離に最大及び最小が存在する形状が好ましく、長方形が更に好ましい。

　第一被覆領域の形状が矩形である場合、そのアスペクト比（長辺長：短辺長）としては、１~５０としてよく、５~５０が好ましく、より好ましくは１０~５０である。

　第一被覆領域の形状が長方形である場合、細胞構造体の形状を制御する観点から、その幅は０．１~５０ｍｍであることが好ましく、より好ましくは０．１~３０ｍｍであり、その長さは０．１~１５０ｍｍであることが好ましく、より好ましくは０．１~１００ｍｍである。

　第一被覆領域表面のゼータ電位としては、０~５０ｍＶが好ましく、より好ましくは０~３５ｍＶ、更に好ましくは１０~２５ｍＶである。ゼータ電位が０ｍＶ以上であることにより、負に帯電する細胞が接着しやすくなる。また、ゼータ電位が５０ｍＶ以下であることにより、細胞毒性を軽減することができる。
　また、ゼータ電位を上記範囲とすることにより、細胞を適切な培養条件で培養するだけで、塊状（ペレット状）の構造を有する細胞構造体を一層簡便に作製させることができる。これは、表面ゼータ電位を上記範囲とすることによって、第一被覆領域表面に細胞毒性を惹起しない微弱な陽電荷を与えることができ、また、播種した細胞の速やかな接着を確保し、細胞の活性の向上及び細胞外マトリックスの分泌を促進し、更には、細胞遊走を適度に抑制して、細胞間の結合を強くすることができることによるものと推測される。
　なお、ゼータ電位とは、ポリスチレンラテックスをヒドロキシプロピルセルロースで被覆した粒子（ゼータ電位：−５~＋５ｍＶ）を標準のモニター粒子として、ゼータ電位計（例えば、型番「ＥＬＳＺ」、大塚電子社製等）で測定した、Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉ式により算出される値をいう。

　第一被覆領域表面に対する水の接触角としては、本発明（Ｖ）の効果を高める観点から、５０~９０°が好ましく、より好ましくは６０~８０°、更に好ましくは６２~７８°である。
　なお、第一被覆領域に対する水の接触角とは、被覆領域内の任意の数点において、ＪＩＳ　Ｒ３２５７に準拠して測定される接触角の平均値をいう。

　第二被覆領域に被覆される細胞接着性物質としては、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチン、ペプチド、カチオン性ポリマー、ポリスチレン等が挙げられる。上記ペプチドとしては、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸の配列を有するペプチド、アルギニン残基が８個以上連続する配列を有するペプチド等が挙げられる。上記カチオン性ポリマーとしては、アミノスチレン等が挙げられる。これらの中でも、細胞接着性が高い、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチンが好ましい。
　また、上記列挙の細胞接着性物質を含む試薬も好適に用いることができ、かかる試薬としては、血清等が挙げられる。
　上記細胞接着性物質は、１種単独で用いてもよく、複数種を併用してもよい。

　第二被覆領域の面積は、特に限定されないが、例えば、φ３５ｍｍの細胞培養器の培養面を用いて、１~３０ｍｍサイズの細胞構造体を製造する場合、０．１~７５ｍｍ^２としてよく、好ましくは０．１~１０ｍｍ^２である。

　第二被覆領域の形状は、特に限定されることなく、平面視で、円形（円、楕円等）、矩形（正方形、長方形、三角形等）としてよく、矩形は角が丸みを帯びていてもよい。
　中でも、上記形状は、細胞が凝集する際に第二被覆領域に接着した細胞にかかる力を緩和する観点から、円形が好ましい。

　第二被覆領域の形状が円形である場合、細胞構造体の形状を制御する観点から、その直径は０．１~５０ｍｍであることが好ましく、より好ましくは０．１~１０ｍｍである。

　上記第二被覆領域の面積（Ｓ２）の上記第一被覆領域の面積（Ｓ１）に対する割合（Ｓ２／Ｓ１）は、特に限定されないが、細胞の凝集様式を制御しやすくする観点から、０．００１~１．０であることが好ましく、より好ましくは０．０１~０．５である。

　本実施形態（Ｖ）では、第一被覆領域と第二被覆領域とは、互いに重なり合っていてもよく、互いの外輪郭線が接していてもよく、互いの最短距離で０．１~１０ｍｍだけ離間していてもよい。
　なお、第一被覆領域の培養面における位置、及び第二被覆領域の培養面における位置は、それぞれの重心の位置としてよい。

　本実施形態（Ｖ）では、第二被覆領域は第一被覆領域の端部に設けられていればよく、ここで、端部とは、第一被覆領域の外輪郭線から内側へ０．０１~１ｍｍの領域をいう。

　本実施形態（Ｖ）では、第一被覆領域の端部に設けられる第二被覆領域の数は、複数であれば特に限定されることなく、３以上、４以上等としてもよい。なお、複数の第二被覆領域間において、被覆される細胞接着性物質は、同じであってもよく、異なっていてもよい。

　図３６（ａ）~（ｃ）に、本実施形態（Ｖ）における第一被覆領域と第一被覆領域との配置態様について示す。
　図３６（ａ）（ｉ）及び図３５（ｉ）~（ｖｉｉｉ）に示す例では、第一被覆領域を平面視で円形とし、第二被覆領域を、円形の第一被覆領域の両端部に、第一被覆領域と重ねながら、配置している。
　本実施形態（Ｖ）では、円形の第一被覆領域の端部に、第二被覆領域を、第一被覆領域と重ねながら、３箇所配置してもよく（図３６（ａ）（ｉｉ）参照）、４箇所配置してもよい（図３６（ａ）（ｉｉｉ）参照）。
　また、本実施形態（Ｖ）では、図３６（ｂ）に示すように、角が丸みを帯びた長方形の第一被覆領域の両端部に、第二被覆領域を、第一被覆領域と重ねながら、配置してもよい。
　更に、本実施形態（Ｖ）では、図３６（ｃ）に示すように、所望の形状の第一被覆領域の複数（図では５箇所）の端部に、第二被覆領域を、第一被覆領域と重ねながら、配置してもよい。

　なお、図３５に示す一例の細胞構造体の製造方法では、準備工程を、細胞培養器（図３５（ｉ）参照）の培養面の中央部分に、平面視で円形の形状を描きながら、上記温度応答性ポリマー及び／又は上記温度応答性ポリマー組成物を塗布し（図３５（ｉｉ）参照）、塗布部分を乾燥する（図３５（ｉｉｉ）参照）ことによって、第一被覆領域を設け、その後、この円形の第一被覆領域の中心を通る直線上に位置し、第一被覆領域の端部に位置する２箇所に、平面視で円形の形状を描きながら、細胞接着性物質を塗布し（図３５（ｉｉ）参照）、塗布部分を乾燥する（図３５（ｉｉｉ）参照）ことによって、第二被覆領域を設けている。

　上記準備工程は、例えば、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を、溶媒に溶解して、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を含む溶液（温度応答性ポリマー溶液）としてから、細胞培養器の培養面上に塗布し、乾燥させて被覆細胞培養器を準備する工程（準備工程Ｉ）としてもよく、また、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を含む水溶液（温度応答性ポリマー水溶液）を温度応答性ポリマーの曇点以下に冷却し、冷却した温度応答性ポリマー水溶液を細胞培養器の培養面上に流延させ、曇点超の温度まで加熱して、被覆細胞培養器を準備する工程（準備工程ＩＩ）としてもよい。

　上記準備工程Ｉにおける温度応答性ポリマー溶液における溶媒としては、例えば、水；生理食塩水；緩衝液；メタノール、エタノール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、１−ブタノール、イソブチルアルコール、２−ブタノール、ｔ−ブチルアルコール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、２−メチル−２−ブタノール、３−メチル−２−ブタノール、２，２−ジメチル−１−プロパノール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、２−メチル−２−ブタノール、３−メチル−２−ブタノール、２，２−ジメチル−１−プロパノール、１−ヘキサノール、２−メチル−２−ペンタノール、アリルアルコール、ベンジルアルコール、サリチルアルコール等のアルコール；アセトン、エチルメチルケトン、ジエチルケトン、メチルプロピルケトン、メチルイソブチルケトン、メチルビニルケトン、シクロヘキサノン、２−メチルシクロペンタノン、アセトフェノン、ベンゾフェノン、イソホロン等のケトン；酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ｎ−ブチル、酢酸イソブチル、酢酸ｓｅｃ−ブチル、酢酸ｔｅｒｔ−ブチル、酢酸ビニル、ギ酸メチル、ギ酸エチル、ギ酸プロピル、上記アルコールとリン酸のエステル、上記アルコールと炭酸のエステル等のエステル；クロロホルム；ベンゼン；トルエン；ジエチルエーテル；ジクロロメタン；等が挙げられる。
　中でも、培養面に均一に被覆しやすく、また、温度応答性ポリマーの溶解性に優れるという観点から、メタノール、エタノール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、２−ブタノール、ｔ−ブチルアルコール、アリルアルコール等のアルコール；アセトン、エチルメチルケトン、ジエチルケトン、メチルビニルケトン等のケトン；酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ｔｅｒｔ−ブチル、酢酸ビニル等のエステル；クロロホルム；ベンゼン；トルエン；ジエチルエーテル；ジクロロメタンが好ましい。また、短時間で乾燥させることができ、培養面に一層均一に塗布しやすいという観点から、沸点が低い有機溶媒（例えば、炭素数１~４の低級アルコール、炭素数３~５の低級ケトン、及び炭素数１~４のアルキル基を有する酢酸アルキルエステルからなる群より選ばれる少なくとも１種、特に、水より沸点が低い、炭素数１~４の低級アルコール、炭素数３~５の低級ケトン、及び炭素数１~４のアルキル基を有する酢酸アルキルエステルからなる群より選ばれる少なくとも１種）がさらに好ましく、コスト、操作性にも優れる観点から、メタノール、エタノールが特に好ましい。
　上記溶媒は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
　溶媒は、温度応答性ポリマーの溶解性に優れるため、曇点以上の温度（例えば、室温や３７℃など）にしても、温度応答性ポリマーが不溶化して沈殿しにくい。そのため、温度応答性ポリマーを塗布する際に、温度応答性ポリマー溶液の温度管理をする手間が省け、簡易に被覆細胞培養器を準備することができる。

　上記準備工程Ｉにおいて、温度応答性ポリマー溶液は、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物が培養面に均一に被覆されやすくなるという観点から、水が含まれないことが好ましく、温度応答性ポリマー溶液（１００重量％）中の水の重量割合が０．５重量％以下であることがより好ましく、０．１重量％以下であることがさらに好ましい。
　なお、水の重量割合は、ガスクロマトグラフィー、カールフィッシャー法など当業者に周知の方法により測定可能である。

　本実施形態（Ｖ）の細胞培養方法では、準備工程において、第一被覆領域及び第二被覆領域が占める領域を、細胞非接着性の壁で囲むことが好ましく、具体的には、下記の変形例が挙げられる。
　なお、細胞非接着性とは、付着細胞が接着しない又は接着しにくいことをいう。
　かかる態様によれば、後述の播種培養工程において、播種される細胞と凹部の壁面との接着を抑制して、細胞の凝集様式を制御することが容易となり、所望の配向性を有する細胞構造体をより精密に製造することが可能となる。

　図３７に、準備工程の変形例及びこれに続く播種培養工程の概略を示す。
　準備工程の変形例では、細胞培養器の培養面に、図３５における第一被覆領域及び第二被覆領域の形状をなすような平面視形状（大サイズの円、及びその端部２箇所に配置された小サイズの円）の凹部を彫り込む（図３７参照）。
　そして、この変形例の準備工程では、彫り込んだ凹部の底面のみに温度応答性ポリマー及び／又は上記温度応答性ポリマー組成物、並びに細胞接着性物質を配置し、凹部の底面以外の面、すわわち、凹部の壁面の表面には、上記ポリマー及び／又は上記ポリマー組成物、並びに細胞接着性物質を配置していない（図３７（ｉ）参照）。
　かかる変形例によれば、所望の配向性を有する細胞構造体をより精密に製造することができる（図３７（ｉｉ）参照）。

　（播種培養工程）
　本実施形態（Ｖ）における一例の製造方法では、次いで、細胞を第一被覆領域及び第二被覆領域に播種し、細胞を培養することによって、細胞構造体を調製する（播種培養工程）。

　図３５に示す例では、播種培養工程を、細胞培養器に細胞及び細胞培養用培地を加え（図３５（ｉｖ）参照）、その後、この細胞培養器を一般的な３７℃の細胞インキュベーターに入れ（図３５（ｖ）参照）、培地交換により新たな細胞培養用培地を加え（図３５（ｖｉ）参照）、細胞培養器を更に細胞インキュベーターに入れる（図３５（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）参照）ことによって、行っている。

　本実施形態（Ｖ）の細胞培養方法に用いることが可能な細胞としては、ＡＤＳＣ、心筋細胞、心筋線維芽細胞、神経細胞、神経芽細胞、線維芽細胞、軟骨細胞、血管内皮細胞、血管間質細胞、平滑筋細胞等が挙げられる。
　上記細胞は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。

　播種培養工程において細胞を播種する際の細胞密度は、０．３×１０^４個／ｃｍ^２以上とすることが好ましく、より好ましくは１．０×１０^４個／ｃｍ^２以上であり、また、培養中の細胞同士の接触による増殖停止等の、細胞周期に関する問題を生じにくくするため、５．０×１０^４個／ｃｍ^２以下とすることが好ましく、より好ましくは４．５×１０^４個／ｃｍ^２以下である。

　播種後の第一被覆領域においては、９０~１００％コンフルエントが好ましく、より好ましくは９５~１００％コンフルエント、さらに好ましくは９９~１００％コンフルエントである。
　上記範囲であると、各細胞がそれぞれコロニーを形成せずに、均質分散した状態を維持して凝集して細胞構造体を形成することができる。また、細胞の密度が高いと、播種した細胞が増殖しにくくなり、細胞が増殖する前に塊状の細胞構造体を形成することができる。また、播種した細胞は、増殖する際の性質が変化する場合があるが、細胞が増殖しにくいと、播種時と同じ性質の細胞を含む細胞構造体を形成することができる。

　ここで、播種培養工程において生じる現象を、図３５を参照しながら、以下に記載する。
　この工程においては、まず、播種された細胞が、第一被覆領域及び第二被覆領域上に、沈降する。このとき、第一被覆領域及び第二被覆領域上に沈降した細胞は、被覆領域上に接着して、生存する一方、非被覆領域上に沈降した細胞は、非被覆領域上に接着することなく、死滅する（図３５（ｖ）参照）。
　次いで、培地交換により、培養面に接着しなかった細胞が細胞培養器から除去される（図３５（ｖｉ）参照）。
　そして、第一被覆領域及び第二被覆領域に接着した細胞を更に培養すると、第一被覆領域と非被覆領域との境界付近に位置する細胞が、該細胞よりも第一被覆領域の中央部分側に位置する細胞をも伴いながら、中央部分に向かって凝集し始める（図３５（ｖｉｉ）参照）。言い換えると、接着していた細胞が、第一被覆領域から遠ざかるように剥離し、第一被覆領域の中央部分に向かって反り返る。
　一方で、第二被覆領域に接着した細胞は、第二被覆領域から剥離することなく、当初の位置に接着し続ける（図３５（ｖｉｉ）参照）。
　最終的に、第一被覆領域に接着していた細胞は、第二被覆領域に接着し続ける２つの細胞集団の間を繋げるように、第一被覆領域の中央部分で、直線状の構造を有する細胞構造体を形成する（図３５（ｖｉｉｉ）参照）。

　ここで、播種培養工程において得られた細胞構造体のうち、第一被覆領域に接着していた細胞により形成される部分においては、細胞が、直線状の構造の延在方向に沿って引き伸ばされた形状をなし、２つの第二被覆領域を結ぶ線の方向に沿う方向への配向性を備える。

　こうして得られた細胞構造体を複数用いて、適宜、編み込んだり、連結させたりすることによって、所望の形状の細胞構造体を作製することも可能である。

　また、得られた細胞構造体は、バイアビリティの観点から、可能な限り形成直後に実験等に用いることが好ましく、２４時間以内に使用することが更に好ましい。

　本実施形態（Ｖ）の細胞構造体の製造方法によれば、単層構造で栄養と酸素とを十分に供給されていた細胞が短時間内に凝集して細胞構造体を形成するため、該細胞構造体の内部の細胞が酸欠で壊死する等といった従来技術における問題が生じにくい。特に、酸素供給の必要性が特に高い心筋細胞からなる細胞構造体の培養に有用である。

　生体内の環境における細胞構造体を試験管内において得ることは、実験技術の観点から、極めて重要な意味を有するところ、本実施形態（Ｖ）の細胞構造体の製造方法によれば、細胞の配向性を生体内におけるものと同様に揃える（例えば、心筋細胞の場合、所定方向への紡錘形態）ことが可能となる。

　例えば、心筋細胞に関する創薬試験では、不整脈惹起等の心毒性の有無を検出するため、培養心筋細胞の心電波形を評価することが行われており、ここでは、測定精度（ＳＮ比）を高める観点から、細胞からの電気信号を可能な限り大きくすることが望まれる。
　本実施形態（Ｖ）の細胞構造体の製造方法によれば、前述の通り、大きなサイズの細胞構造体を、生来の配向性を備えた状態で得ることができるため、生体内で生きている心筋細胞を模倣した検体を得ることができる。このため、心筋細胞に関する創薬試験の精度を高めることが可能となる。

［［発明（ＶＩ）］］
［細胞構造体の製造方法］
　本発明（ＶＩ）の細胞構造体の製造方法は、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を調製する、調製工程と、上記温度応答性ポリマー又は上記温度応答性ポリマー組成物で、細胞培養器の培養面を被覆して、被覆細胞培養器を準備する、培養器準備工程と、心筋細胞と、上記心筋細胞１００個に対して２００~３００個の割合の線維芽細胞を上記被覆細胞培養器に播種する、播種工程と、播種した細胞を培養して塊状の細胞構造体を得る、培養工程とを、この順に含む。
　なお、本明細書において、細胞培養器の培養面における、上記温度応答性ポリマー又は上記温度応答性ポリマー組成物で被覆された部分を「被覆培養面」と称する場合がある。また、被覆細胞培養器とは、被覆培養面を有する細胞培養器である。被覆細胞培養器は、培養面全面が被覆培養面であってもよいし、培養面の一部が被覆培養面であってもよい。また、培養面に１個の被覆培養面を有していてもよいし、複数の被覆培養面を有していてもよい。

　心筋細胞と線維芽細胞とを含む細胞構造体は、公知のＵ字低接着性培養皿やハンギングドロップ法で１~２週間もの長い時間かけてスフェロドを形成させることも可能であるが、作製に時間がかかるため、低酸素状態に極めて弱い心筋細胞の維持が困難となる問題、増殖速度の異なる細胞同士の共培養が困難という問題等があった。
　本発明者らは、驚くべきことに、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物で、細胞培養器の培養面を被覆した被覆細胞培養器に、心筋細胞と線維芽細胞とを播種することで、心不全を起こした心疾患の組織を模倣した細胞構造体を容易に形成できることを見出した。
　本実施形態（ＶＩ）の細胞構造体の製造方法によれば、心筋細胞と線維芽細胞とが均質分散した状態を維持して凝集させることが可能であり、心筋細胞と線維芽細胞とを含む、生体内に存在する状態に近い、心不全を起こした組織を再現することができる。

　本実施形態（ＶＩ）の細胞構造体の製造方法によれば、播種された混合細胞は被覆培養面に接着し、更に培養すると、混合細胞は自己凝集をして収縮して、シート状に広がった細胞の端部が被覆培養面から離れて反り返るようにして凝集し、塊状の細胞構造体を形成する。
　特に、本実施形態（ＶＩ）の細胞構造体の製造方法では、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物で培養面が被覆されており、被覆培養面と細胞との接着力が適度な範囲にあるため、凝集しにくい性質を有する心筋細胞を含む混合細胞であっても、塊状の細胞構造体を形成することができる。また、凝集しやすい線維芽細胞と組み合わせることにより、容易に塊状の細胞構造体を形成することができる。

　心筋細胞と、線維芽細胞とは、増殖速度が異なるため、従来の長時間培養をして細胞構造体を形成する方法では、心筋細胞を多く含む細胞構造体を形成することができなかった。本実施形態（ＶＩ）の細胞構造体の製造方法によれば、心筋細胞と線維芽細胞とを増殖させることなく細胞構造体を形成することができるため、播種時の心筋細胞と線維芽細胞との細胞比と、ほぼ同様の比率の細胞で構成される細胞構造体を得ることができる。そのため、細胞構造体を構成する細胞の混合比率を容易に調整することができる。また、本実施形態（ＶＩ）の細胞構造体の製造方法によれば、被覆培養面と細胞との接着力が適度な範囲にある被覆細胞培養器を用いているため、細胞の増殖を必要とせず、例えば、播種後２４時間以内等の短時間で、心筋細胞と線維芽細胞との混合細胞が凝集して丸まるため、増殖速度が異なる２種以上の細胞からなり、心筋細胞を生きた状態で含み、且つ拍動している塊状の細胞構造体を容易に形成することができる。

（調製工程）
　実施形態（ＶＩ）の細胞培養器に用いられる温度応答性ポリマー及び温度応答性ポリマー組成物を調製する調製工程としては、上記発明（Ｉ）における調製工程と同様の工程が挙げられ、好適例としても同様のものが挙げられる。
　なお、本実施形態（ＶＩ）において、製造方法に用いられる温度応答性ポリマー及び温度応答性ポリマー組成物としては、心筋細胞と線維芽細胞とを含む、塊状の細胞構造体が一層得られやすいという観点から、（Ａ）が好ましい。
　また、本実施形態（ＶＩ）において、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）を含む混合物を調製する調製工程を、混合物調製工程と称する場合がある。

（培養器準備工程）
　本発明（ＶＩ）の実施形態の製造方法において、上記培養器準備工程は、上記温度応答性ポリマー又は上記温度応答性ポリマー組成物で、細胞培養器の培養面を被覆して、被覆細胞培養器を準備する工程である。

　上記培養器準備工程は、例えば、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を、溶媒に溶解して、温度応答性ポリマー溶液としてから、細胞培養器の培養面上に塗布し、乾燥させて被覆細胞培養器を準備する工程（培養器準備工程Ｉ）としてもよく、また、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を含む水溶液（温度応答性ポリマー水溶液）を温度応答性ポリマーの曇点以下に冷却し、冷却した温度応答性ポリマー水溶液を細胞培養器の培養面上に流延させ、曇点超の温度まで加熱して、被覆細胞培養器を準備する工程（培養器準備工程ＩＩ）としてもよい。

　上記培養器準備工程Ｉにおいて、温度応答性ポリマー溶液には、細胞が自己凝集しやすくなるという観点から、親水性分子が含まれることが好ましい。親水性分子としては、温度応答性ポリマーのＣ／Ａ比に影響しない非イオン性かつ親水性であるもの、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡＡ）、グリセリン、ＴｒｉｔｏｎＸ、ポリプロピレングリコール等が挙げられる。

　上記培養器準備工程Ｉにおいて、温度応答性ポリマー溶液中の温度応答性ポリマーの含有量は、温度応答性ポリマーが培養面に均一に被覆されやすくなるという観点から、温度応答性ポリマー溶液（１００質量％）に対して、０．０５~２．０質量％であることが好ましく、０．１~１．５質量％であることがより好ましい。

　上記培養器準備工程Ｉにおいて、温度応答性ポリマー溶液中の親水性分子の含有量は、細胞が自己凝集しやすくなるという観点から、温度応答性ポリマー（１００質量％）に対して、０．００００１~０．０００１５質量％であることが好ましく、０．００００３~０．０００１質量％であることがより好ましい。

　上記培養器準備工程Ｉにおいて、温度応答性ポリマー溶液は、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物が培養面に均一に被覆されやすくなるという観点から、水が含まれないことが好ましく、温度応答性ポリマー溶液（１００質量％）中の水の質量割合が０．５質量％以下であることがより好ましく、０．１質量％以下であることがさらに好ましい。
　なお、水の質量割合は、ガスクロマトグラフィー、カールフィッシャー法等当業者に周知の方法により測定可能である。

　上記培養器準備工程Ｉにおいて、温度応答性ポリマー溶液は、培養面の全面に塗布してもよいし、培養面の一部に塗布してもよい。培養面の一部に温度応答性ポリマー溶液を塗布する場合は、培養面上に、被覆培養面を１個設けてもよいし、複数の被覆培養面を設けてもよい。なお、培養面の一部に温度応答性ポリマー溶液を塗布する場合は、培養面が細胞非接着性である細胞培養器を用いることが好ましい。
　なお、「細胞非接着性」とは、付着細胞（例えば、線維芽細胞、心筋細胞、血管内皮細胞等）が、通常の培養条件下で、接着しない又は接着しにくい性質をいう。

　上記培養面の底形状（底面の断面形状）は、特に限定されないが、平底、丸底、凹凸状底等が挙げられる。中でも、より均質で球状の細胞構造体が得られやすいという観点から、平底又は若干のＲがついた凹面底が好ましい。

　上記細胞培養器の培養面の面積は、心筋細胞への酸素供給の観点から、２００ｍｍ^２以下であることが好ましく、７５ｍｍ^２以下であることがより好ましく、３２ｍｍ^２以下であることがさらに好ましい。なお、上記細胞培養器の培養面の面積の下限値は、市販サイズのものであれば使用可能であり、特に限定されない。

　上記被覆培養面の各面積（温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物で被覆された部分の各面積）は、心筋細胞への酸素供給の観点から、２００ｍｍ^２以下であることが好ましく、７５ｍｍ^２以下であることがより好ましく、３２ｍｍ^２以下であることがさらに好ましい。

　上記被覆細胞培養器は、被覆培養面が単位面積当たりに有する温度応答性ポリマーの量が、０．１~１０．０ｎｇ／ｍｍ^２であることが好ましく、０．５~５．０ｎｇ／ｍｍ^２であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、塊状の細胞構造体を形成させやすくするという効果が得られやすい。

　上記被覆細胞培養器における、被覆培養面のゼータ電位としては、０~５０ｍＶが好ましく、より好ましくは０~３５ｍＶ、更に好ましくは１０~２５ｍＶである。ゼータ電位が０ｍＶ以上であることにより、負に帯電する細胞が接着しやすくなる。また、ゼータ電位が５０ｍＶ以下であることにより、細胞毒性を軽減することができる。
　また、ゼータ電位を上記範囲とすることにより、細胞を適切な培養条件で培養するだけで、塊状（ペレット状）の細胞構造体を一層作製しやすくなる。これは、表面ゼータ電位を上記範囲とすることによって、被覆培養面に細胞毒性を惹起しない微弱な陽電荷を与えることができ、また、播種した細胞の速やかな接着を確保し、細胞の活性の向上及び細胞外マトリックスの分泌を促進し、更には、細胞遊走を適度に抑制して、細胞間の結合を強くすることができることによるものと推測される。
　なお、ゼータ電位とは、ポリスチレンラテックスをヒドロキシプロピルセルロースで被覆した粒子（ゼータ電位：−５~＋５ｍＶ）を標準のモニター粒子として、ゼータ電位計（例えば、型番「ＥＬＳＺ」、大塚電子社製等）で測定した、Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉ式により算出される値をいう。

　上記被覆培養面に対する水の接触角としては、本発明（ＶＩ）の効果を高める観点から、５０~９０°が好ましく、より好ましくは６０~８０°、更に好ましくは６２~７８°である。なお、被覆培養面に対する水の接触角とは、被覆培養面内の任意の数点において、ＪＩＳ　Ｒ３２５７に準拠して測定される接触角の平均値をいう。

（播種工程）
　上記播種工程は、心筋細胞と、上記心筋細胞１００個に対して２００~３００個の割合の線維芽細胞を上記被覆細胞培養器に播種する工程である。細胞の播種は、全細胞を混合して一度に播種してもよいし、複数回に分けて播種してもよい。また、各細胞は、一度に播種してもよいし、複数回に分けて播種してもよい。

　上記被覆細胞培養器の上記被覆培養面に播種する細胞は、少なくとも心筋細胞、線維芽細胞を含む。
　上記心筋細胞としては、心筋細胞と線維芽細胞とが一層均質に分散した細胞構造体が得られやすいという観点から、心筋細胞、心筋幹細胞、および分化誘導段階のｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞等が好ましい。
　上記心筋細胞は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。

　上記線維芽細胞としては、心筋線維芽細胞、皮下脂肪、筋膜、滑膜、骨膜由来の間葉系幹細胞等が挙げられる。中でも、心筋細胞と線維芽細胞とが一層均質に分散した細胞構造体が得られやすいという観点から、心筋線維芽細胞、皮下脂肪由来の間葉系幹細胞が好ましい。
　上記線維芽細胞は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。

　上記播種工程において、さらに血管内皮細胞や血管間質細胞を播種してもよい。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。

　上記播種工程において、さらに免疫系細胞を播種してもよい。上記免疫系細胞としては、例えばマクロファージ、ＣＤ４陽性Ｔ細胞等のＴ細胞、単球等が挙げられる。中でも、心不全等の心疾患を起こした組織に一層近い細胞構造体が得られるという観点から、マクロファージ及び／又はＴ細胞を含むことが好ましい。
　上記免疫系細胞は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。

　上記播種工程において、心筋細胞１００個に対する線維芽細胞の割合は、２００~３００個であり、２００~２５０個であることが好ましく、２００~２３０個であることがより好ましい。線維芽細胞の割合を、心筋細胞１００個に対して２００個以上とすることにより、混合細胞が丸まって塊状の細胞構造体を形成しやすくなる。また、３００個以下とすることにより、心不全等の心疾患を起こした組織により近い細胞構造体を得ることができる。

　上記播種工程において、播種する全細胞中の心筋細胞の割合は、心不全等の心疾患を起こした組織により近い細胞構造体が得られる観点から、全細胞数（１００％）に対して、２５~５０％であることが好ましく、２５~３０％であることがより好ましい。

　上記播種工程において、心筋細胞１００個に対する血管内皮細胞の割合は、心不全等の心疾患を起こした組織により近い細胞構造体が得られる観点から、５~５０個であることが好ましく、１０~３０個であることがより好ましい。

　上記播種工程において、心筋細胞１００個に対する免疫系細胞の割合は、心不全等の心疾患を起こした組織により近い細胞構造体が得られる観点から、５~５０個であることが好ましく、１０~３０個であることがより好ましい。

　上記播種工程において、播種後の全細胞の被覆培養面上の密度は、上記被覆培養面の表面積に対して、９０~１００％コンフルエントが好ましく、より好ましくは９５~１００％コンフルエント、さらに好ましくは９９~１００％コンフルエントである。播種する細胞密度が上記範囲であると、各細胞がそれぞれコロニーを形成せずに、均質分散した状態を維持して凝集して細胞構造体を形成することができる。また、細胞の密度が高いと、播種した細胞が増殖しにくくなり、細胞が増殖する前に塊状の細胞構造体を形成することができるため、播種した細胞と細胞数の割合が同じ細胞構造体を形成することができる。また、細胞の増殖速度の違いによる影響を受けにくい。また、播種した細胞は、増殖する際の性質が変化する場合があるが、細胞が増殖しにくいと、播種時と同じ性質の細胞を含む細胞構造体を形成することができる。
　細胞の種類にもよるが、播種後の全細胞の被覆培養面上の密度としては、２０~１５，０００個／ｍｍ^２が好ましい。例えば、被覆培養面の面積が２００ｍｍ^２である２４ウェル細胞培養プレートに、１．０ｍＬの細胞液を加えて播種する場合、４×１０^４~３０×１０^４個／ｍＬが好ましい。なお、播種される細胞は、生きた細胞とする。

　細胞の播種は、例えば、３７℃のインキュベーター中に静置しておいた被覆細胞培養器を、室温のクリーンベンチに取り出して、行うことができる。
　なお、細胞は培地に希釈して播種することが好ましい。希釈する培地としては、細胞の培養が可能な培地であれば、特に限定されない。

（培養工程）
　上記培養工程は、播種した細胞を培養して塊状の細胞構造体を得る工程である。

　心筋炎を起こした組織では、心筋細胞が壊死し、壊死した心筋細胞に置き換わって線維芽細胞が過増殖していることに加え、炎症性の免疫細胞も多く浸潤していることが知られている。免疫系細胞が浸潤した心筋炎組織を試験管内で再現するには、心筋細胞、線維芽細胞に加え、浮遊細胞である免疫系細胞を浸潤させた細胞構造体を作製することが望ましい。しかしながら、細胞構造体の作製に１~２週間を要する従来のハンギングドロップ法や低接着性培養皿では、これは困難であった。
　本実施形態（ＶＩ）の製造方法では、上記培養工程において、さらに免疫系細胞を被覆細胞培養器に添加してもよい。免疫系細胞を添加するタイミングとしては、上記播種工程以降（細胞の播種と同時以降）であって、細胞構造体が得られる前であることが好ましく、播種した細胞が被覆培養面に付着してシート状の細胞構造体を形成（図４０の（ｉｉｉ）参照）した以降、シート状の細胞構造体が被覆培養面中央部に向かって凝集し始め、端部が被覆培養面から離れて反り返り始めて、端部が反り返った細胞構造体を形成する前までがより好ましい。即ち、免疫系細胞の添加は、播種工程時に播種してもよいし、播種工程後に添加してもよい。
　具体的には、細胞の播種と同時以降、細胞（例えば、最後に播種する細胞）の播種後４８時間以内に免疫系細胞を添加することが好ましい。
　免疫系細胞を上記のタイミングで添加することにより、浮遊細胞である免疫系細胞が重力の作用で沈降し、被覆培養面に接着した細胞が巾着袋状に凝集する際に免疫系細胞が内部に取り込まれ、これによって内部に免疫系細胞を含む細胞構造体を形成することができ、心筋炎、心不全等を起こした心疾患モデルの組織に一層近い細胞構造体を得ることができる（図４０参照）。

　播種した細胞を培養する条件としては、例えば、一般的な３７℃の細胞インキュベーターを用いて行うことができる。細胞の培養は、塊状細胞構造体が形成されるまで続けることが好ましく、具体的には、１０~９６時間培養することが好ましく、１５~５０時間培養することがより好ましい。
　なお、本実施形態（ＶＩ）の細胞構造体の製造方法では、驚くべきことに、接着細胞（例えば、心筋細胞等）と、浮遊細胞（例えば、免疫系細胞等）とを混合して、播種、培養する場合であっても、特殊な培地を用意することなく、使用する接着細胞に適した培地又は使用する浮遊細胞に適した培地（好ましくは接着細胞に適した培地）を用いて、接着細胞と浮遊細胞とを同時に、播種、培養すれば、細胞構造体を得ることができる。

　上記被覆培養面に接着、培養した、上記心筋細胞及び上記線維芽細胞を含む混合細胞は、自己凝集をして、塊状の細胞構造体を形成する。得られた細胞構造体は、その塊状の構造体内に生存している細胞を有する。

　上記細胞構造体の大きさは、内部に生きた心筋細胞を含み、拍動した細胞構造体が得られるという観点から、例えば、外径が３０~２００μｍであることが好ましく、４０~１５０μｍであることがより好ましく、５０~１００μｍであることがさらに好ましい。

　本実施形態（ＶＩ）の細胞構造体の製造方法により得られる細胞構造体は、心不全等の心疾患を起こした組織を再現した心疾患モデルであり、例えば、心筋梗塞、心不全、心筋炎等の心疾患の研究、心疾患の薬剤開発、心疾患の治療法開発の用途に用いることができる。

　以下に、本実施形態（ＶＩ）の細胞構造体の製造方法の一例について、図３９、４０を用いて説明する。

　図３９は、心筋細胞と線維芽細胞とを含む細胞構造体の製造方法の一例である。
　細胞培養器の培養面に、温度応答性ポリマーを塗布して、被覆し、被覆培養面を有する被覆細胞培養器を準備する（図３９（ｉ）（ｉｉ）参照）。その後、被覆培養面に、培地で希釈した、心筋細胞と線維芽細胞との混合細胞を加え、混合細胞を播種する（図３９（ｉｉ）参照）。播種した混合細胞は、被覆培養面全面に接着する（図３９（ｉｉｉ）参照）。なお、この例では、混合細胞の密度は、１００％コンフルエントである（図３９（ｉｉｉ）参照）。その後、被覆培養面に接着した混合細胞は、被覆培養面中央部に向かって凝集し始め、端部が被覆培養面から離れて反り返り始めて、端部が反り返った細胞構造体となる（図３９（ｉｖ）参照）。その後、更に凝集を続け、塊状の細胞構造体となり、被覆培養面から浮遊する（図３９（ｖ）参照）。

　図４０は、心筋細胞、線維芽細胞、マクロファージ等の免疫系細胞（浮遊細胞）を含む細胞構造体の製造方法の一例である。
　細胞培養器の培養面に、温度応答性ポリマーを塗布して、被覆し、被覆培養面を有する被覆細胞培養器を準備する（図４０（ｉ）（ｉｉｉ）参照）。その後、被覆培養面に、培地で希釈した、心筋細胞と線維芽細胞との混合細胞を加え、混合細胞を播種する（図４０（ｉｉ）参照）。播種した混合細胞は、被覆培養面全面に接着し、シート状の細胞構造体（単層）を形成する（図４０（ｉｉｉ）参照）。なお、この例では、混合細胞の密度は、１００％コンフルエントである（図４０（ｉｉｉ）参照）。
　心筋細胞と線維芽細胞とがシート状の細胞構造体を形成した後に、マクロファージ等の免疫系細胞を添加する（図４０（ｉｖ））。その後、被覆培養面に接着した混合細胞は、被覆培養面中央部に向かって凝集し始め、端部が被覆培養面から離れて反り返り始めて、端部が反り返った細胞構造体となる（図４０（ｖ）参照）。その際、シート状の細胞構造体に付着したり、培養皿中に浮遊したりしている免疫系細胞を包み込む。その後、更に凝集を続け、心筋細胞、線維芽細胞及び免疫系細胞を含む塊状の細胞構造体となり、被覆培養面から浮遊する（図４０（ｖｉ）参照）。

［［発明（ＶＩＩ）］］
［細胞構造体の製造方法］
　本発明（ＶＩＩ）の細胞構造体の製造方法は、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を調製する、調製工程と、上記温度応答性ポリマー又は上記温度応答性ポリマー組成物で、細胞培養器の培養面を被覆して、被覆細胞培養器を準備する、培養器準備工程と、肝細胞と、上記肝細胞１００個に対して１０~５０個の割合の線維芽細胞を上記被覆細胞培養器に播種する、播種工程と、播種した細胞を培養して塊状の細胞構造体を得る、培養工程とを、この順に含む。
　なお、本明細書において、細胞培養器の培養面における、上記温度応答性ポリマー又は上記温度応答性ポリマー組成物で被覆された部分を「被覆培養面」と称する場合がある。また、被覆細胞培養器とは、被覆培養面を有する細胞培養器である。被覆細胞培養器は、培養面全面が被覆培養面であってもよいし、培養面の一部が被覆培養面であってもよい。また、培養面に１個の被覆培養面を有していてもよいし、複数の被覆培養面を有していてもよい。

　肝細胞と線維芽細胞とを含む細胞構造体は、公知のＵ字低接着性培養皿やハンギングドロップ法で１~２週間もの長い時間かけてスフェロドを形成させることも可能であるが、作製に時間がかかるため、増殖速度、培養面への接着性、好適培養条件が異なる細胞同士の共培養が困難という問題等があった。
　本発明者らは、驚くべきことに、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物で、細胞培養器の培養面を被覆した被覆細胞培養器に、肝細胞と線維芽細胞とを播種することで、肝不全を起こした組織を模倣した細胞構造体を容易に形成できることを見出した。
　本実施形態（ＶＩＩ）の細胞構造体の製造方法によれば、肝細胞と線維芽細胞とが均質分散した状態を維持して凝集させることが可能であり、肝細胞と線維芽細胞とを含む、生体内に存在する状態に近い、肝不全を起こした組織を再現することができる。

　肝細胞と、線維芽細胞とは、増殖速度、培養面への接着性、及び培養条件が異なるため、従来の長時間培養をして細胞構造体を形成する方法では、肝細胞と線維芽細胞とを含む細胞構造体を形成することが極めて困難であった。本実施形態（ＶＩＩ）の細胞構造体の製造方法によれば、被覆培養面と細胞との接着力が適度な範囲にある被覆細胞培養器を用いているため、細胞の増殖を必要とせず、例えば、播種後２４時間以内等の短時間で、肝細胞と線維芽細胞が凝集して丸まるため、肝細胞と線維芽細胞とを含む塊状の細胞構造体を容易に形成することができる。

（調製工程）
　実施形態（ＶＩＩ）の細胞培養器に用いられる温度応答性ポリマー及び温度応答性ポリマー組成物を調製する調製工程としては、上記発明（Ｉ）における調製工程と同様の工程が挙げられ、好適例としても同様のものが挙げられる。
　なお、本実施形態（ＶＩＩ）において、製造方法に用いられる温度応答性ポリマー及び温度応答性ポリマー組成物としては、肝細胞と線維芽細胞とを含む、塊状の細胞構造体が一層得られやすいという観点から、（Ａ）が好ましい。
　また、本実施形態（ＶＩＩ）において、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）を含む混合物を調製する調製工程を、混合物調製工程と称する場合がある。

（培養器準備工程）
　本発明（ＶＩＩ）の実施形態の製造方法において、上記培養器準備工程は、上記温度応答性ポリマー又は上記温度応答性ポリマー組成物で、細胞培養器の培養面を被覆して、被覆細胞培養器を準備する工程である。

　上記培養器準備工程Ｉにおいて、温度応答性ポリマー溶液中の温度応答性ポリマーの含有量は、温度応答性ポリマーが培養面に均一に被覆されやすくなるという観点から、温度応答性ポリマー溶液（１００質量％）に対して、０．０１~３．０質量％であることが好ましく、０．２５~２．５質量％であることがより好ましい。

　上記培養器準備工程Ｉにおいて、温度応答性ポリマー溶液は、培養面の全面に塗布してもよいし、培養面の一部に塗布してもよい。培養面の一部に温度応答性ポリマー溶液を塗布する場合は、培養面上に、被覆培養面を１個設けてもよいし、複数の被覆培養面を設けてもよい。なお、培養面の一部に温度応答性ポリマー溶液を塗布する場合は、培養面が細胞非接着性である細胞培養器を用いることが好ましい。
　なお、「細胞非接着性」とは、付着細胞（例えば、線維芽細胞、肝細胞、血管内皮細胞等）が、通常の培養条件下で、接着しない又は接着しにくい性質をいう。

　上記細胞培養器の培養面の面積は、塊状の細胞構造体を一層容易に製造することができるという観点から、３２ｍｍ^２以下であることが好ましく、１０ｍｍ^２以下であることがより好ましく、８ｍｍ^２以下であることがさらに好ましい。なお、上記細胞培養器の培養面の面積の下限値は、市販サイズのものであれば使用可能であり、特に限定されない。

　上記被覆培養面の各面積（温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物で被覆された部分の各面積）は、塊状の細胞構造体を一層容易に製造することができるという観点から、３２ｍｍ^２以下であることが好ましく、１０ｍｍ^２以下であることがより好ましく、８ｍｍ^２以下であることがさらに好ましい。

　上記被覆細胞培養器は、被覆培養面が単位面積当たりに有する温度応答性ポリマーの量が、０．１５~１５．０ｎｇ／ｍｍ^２であることが好ましく、１．０~５．０ｎｇ／ｍｍ^２であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、塊状の細胞構造体を形成させやすくするという効果が得られやすい。

　上記被覆培養面に対する水の接触角としては、本発明（ＶＩＩ）の効果を高める観点から、５０~９０°が好ましく、より好ましくは６０~８０°、更に好ましくは６２~７８°である。なお、被覆培養面に対する水の接触角とは、被覆培養面内の任意の数点において、ＪＩＳ　Ｒ３２５７に準拠して測定される接触角の平均値をいう。

（播種工程）
　上記播種工程は、肝細胞と、上記肝細胞１００個に対して１０~５０個の割合の線維芽細胞を上記被覆細胞培養器に播種する工程である。細胞の播種は、全細胞を混合して一度に播種してもよいし、複数回に分けて播種してもよい。また、各細胞は、一度に播種してもよいし、複数回に分けて播種してもよい。

　上記被覆細胞培養器の上記被覆培養面に播種する細胞は、少なくとも肝細胞、線維芽細胞を含む。
　上記肝細胞としては、例えば、生体から採取した初代細胞、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞から誘導した肝細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＨｅｐＲＡ細胞等の肝癌細胞などが使用可能であるが、中でも、トランスポーター、代謝活性、アルブミン産生などの肝細胞機能が平均的であり、線維芽細胞と均質分散した細胞構造体が得られやすいという観点から、ＨｅｐＧ２細胞、ＨｅｐＲＡ細胞が好ましい。
　上記肝細胞は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。

　上記線維芽細胞としては、皮下組織由来線維芽細胞、滑膜、歯髄、骨髄、皮下脂肪由来の間葉系幹細胞等が挙げられる。中でも、免疫寛容で共培養する細胞への影響が少なく、かつ、接着性が強く、肝細胞と線維芽細胞とが一層均質に分散した細胞構造体が得られやすいという観点から、皮下脂肪由来間葉系幹細胞が好ましい。
　上記線維芽細胞は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。

　上記播種工程において、血管内皮細胞をさらに播種してもよい。
　上記血管内皮細胞は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。

　上記播種工程において、脂肪細胞をさらに播種してもよい。上記脂肪細胞としては、例えば、脂肪組織由来の接着性脂肪細胞等が挙げられる。
　上記脂肪細胞は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。

　上記播種工程において、免疫系細胞をさらに播種してもよい。上記免疫系細胞としては、肝不全を起こした組織に一層近い細胞構造体が得られるという観点から、単球、顆粒球、リンパ球、及びマクロファージからなる群から選択される少なくとも１種を含むことが好ましい。
　上記免疫系細胞は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。

　上記播種工程において、肝細胞１００個に対する線維芽細胞の割合は、１０~５０個であり、１０~４５個であることが好ましい。線維芽細胞の割合を、肝細胞１００個に対して１０個以上とすることにより、混合細胞が丸まって塊状の細胞構造体を形成しやすくなる。また、５０個以下とすることにより、肝不全を起こした組織により近い細胞構造体を得ることができる。

　上記播種工程において、播種する全細胞中の肝細胞の割合は、肝不全を起こした組織により近い細胞構造体が得られる観点から、全細胞数（１００％）に対して、５０~９５％であることが好ましい。

　上記播種工程において、肝細胞１００個に対する血管内皮細胞の割合は、肝不全を起こした組織により近い細胞構造体が得られる観点から、１０~１００個であることが好ましい。

　上記播種工程において、肝細胞１００個に対する脂肪細胞の割合は、肝不全を起こした組織により近い細胞構造体が得られる観点から、１０~１００個であることが好ましく、５０個であることがより好ましい。
　また、線維芽細胞１００個に対する脂肪細胞の割合は、肝不全を起こした組織により近い細胞構造体が得られる観点から、１００~５００個であることが好ましい。
　中でも、肝細胞１００個に対して脂肪細胞を５０個の割合で含み、且つ線維芽細胞１００個に対して脂肪細胞を１００~５００個の割合で含むことが好ましい。

　上記播種工程において、肝細胞１００個に対する免疫系細胞の割合は、肝不全を起こした組織により近い細胞構造体が得られる観点から、１０~１００個であることが好ましい。

　上記播種工程において、播種後の細胞の被覆培養面上の密度は、上記被覆培養面の表面積に対して、９０~１００％コンフルエントが好ましく、より好ましくは９５~１００％コンフルエント、さらに好ましくは９９~１００％コンフルエントである。播種する細胞密度が上記範囲であると、各細胞がそれぞれコロニーを形成せずに、均質分散した状態を維持して凝集して細胞構造体を形成することができる。また、細胞の密度が高いと、播種した混合細胞が増殖しにくくなり、細胞が増殖する前に塊状の細胞構造体を形成することができるため、播種した混合細胞と細胞数の割合が同じ細胞構造体を形成することができる。また、細胞の増殖速度の違いによる影響を受けにくい。また、播種した細胞は、増殖する際の性質が変化する場合があるが、細胞が増殖しにくいと、播種時と同じ性質の細胞を含む細胞構造体を形成することができる。
　細胞の種類にもよるが、播種後の細胞の被覆培養面上の密度としては、２０~１５，０００個／ｍｍ^２が好ましい。例えば、被覆培養面の面積が２００ｍｍ^２である２４ウェル細胞培養プレートに、１．０ｍＬの細胞液を加えて播種する場合、４×１０^４~３０×１０^４個／ｍＬが好ましい。なお、播種される細胞は、生きた細胞とする。

　肝不全を起こした組織では、線維芽細胞が過増殖していることに加え、炎症性の免疫細胞も多く存在している場合があることが知られている。免疫系細胞を含む肝不全組織を試験管内で再現するには、肝細胞、線維芽細胞に加え、浮遊細胞である免疫系細胞を加えた細胞構造体を作製することが望ましい。しかしながら、細胞構造体の作製に１~２週間を要する従来のハンギングドロップ法や低接着性培養皿では、これは困難であった。その理由は、例えば、増殖速度が異なることや、最適な培地の組成が異なること以外で、混合したマクロファージが長い培養期間中に線維芽細胞へ分化してしまう可能性が高いことが挙げられる。
　本実施形態（ＶＩＩ）の製造方法では、上記培養工程において、さらに免疫系細胞を被覆細胞培養器に添加してもよい。免疫系細胞を添加するタイミングとしては、上記播種工程以降（細胞の播種と同時以降）であって、細胞構造体が得られる前であることが好ましく、播種した細胞が被覆培養面に付着してシート状の細胞構造体を形成（図４２の（ｉｉｉ）参照）した以降、シート状の細胞構造体が被覆培養面中央部に向かって凝集し始め、端部が被覆培養面から離れて反り返り始めて、端部が反り返った細胞構造体を形成する前までがより好ましい。即ち、免疫系細胞は、播種工程時に播種してもよいし、播種工程後に添加してもよい。
　具体的には、細胞の播種と同時以降、細胞（例えば、最後に播種する細胞）の播種後４８時間以内に免疫系細胞を添加することが好ましい。
　免疫系細胞を上記のタイミングで添加することにより、浮遊細胞である免疫系細胞が重力の作用で沈降し、被覆培養面に接着した細胞が巾着袋状に凝集する際に免疫系細胞が内部に取り込まれ、これによって内部に免疫系細胞を含む細胞構造体を形成することができ、肝不全モデルの組織に一層近い細胞構造体を得ることができる（図４２参照）。

　播種した混合細胞を培養する条件としては、例えば、一般的な３７℃の細胞インキュベーターを用いて行うことができる。細胞の培養は、塊状細胞構造体が形成されるまで続けることが好ましく、具体的には、５~９６時間培養することが好ましく、９~５０時間培養することがより好ましい。
　なお、本実施形態（ＶＩＩ）の細胞構造体の製造方法では、驚くべきことに、接着細胞（例えば、肝細胞等）と、浮遊細胞（例えば、免疫系細胞等）とを混合して、播種、培養する場合であっても、特殊な培地を用意することなく、使用する接着細胞に適した培地又は使用する浮遊細胞に適した培地（好ましくは接着細胞に適した培地）を用いて、接着細胞と浮遊細胞とを同時に、播種、培養すれば、細胞構造体を得ることができる。

　上記被覆培養面に接着、培養した、上記肝細胞及び上記線維芽細胞を含む混合細胞は、自己凝集をして、塊状の細胞構造体を形成する。得られた細胞構造体は、その塊状の構造体内に生存している細胞を有する。

　上記細胞構造体の大きさは、肝細胞と線維芽細胞とが均質に分布する細胞構造体が得られるという観点から、例えば、外径が５０~２，５００μｍであることが好ましく、５０~５００μｍであることがより好ましく、５０~１５０μｍであることがさらに好ましい。

　本実施形態（ＶＩＩ）の細胞構造体の製造方法により得られる細胞構造体は、肝不全を起こした組織を再現した肝不全モデルであり、例えば、肝不全や肝臓再生の研究、肝不全の薬剤開発、肝不全の治療法開発の用途に用いることができる。

　以下に、本実施形態（ＶＩＩ）の細胞構造体の製造方法の一例について、図４１、４２を用いて説明する。

　図４１は、肝細胞と線維芽細胞とを含む細胞構造体の製造方法の一例である。
　細胞培養器の培養面に、温度応答性ポリマーを塗布して、被覆し、被覆培養面を有する被覆細胞培養器を準備する（図４１（ｉ）（ｉｉ）参照）。その後、被覆培養面に、培地で希釈した、肝細胞と線維芽細胞との混合細胞を加え、混合細胞を播種する（図４１（ｉｉ）参照）。播種した混合細胞は、被覆培養面全面に接着する（図４１（ｉｉｉ）参照）。なお、この例では、混合細胞の密度は、１００％コンフルエントである（図４１（ｉｉｉ）参照）。その後、被覆培養面に接着した混合細胞は、被覆培養面中央部に向かって凝集し始め、端部が被覆培養面から離れて反り返り始めて、端部が反り返った細胞構造体となる（図４１（ｉｖ）参照）。その後、更に凝集を続け、塊状の細胞構造体となり、被覆培養面から浮遊する（図４１（ｖ）参照）。

　図４２は、肝細胞、線維芽細胞、マクロファージ等の免疫系細胞（浮遊細胞）を含む細胞構造体の製造方法の一例である。
　細胞培養器の培養面に、温度応答性ポリマーを塗布して、被覆し、被覆培養面を有する被覆細胞培養器を準備する（図４２（ｉ）（ｉｉ）参照）。その後、被覆培養面に、培地で希釈した、肝細胞と線維芽細胞との混合細胞を加え、混合細胞を播種する（図４２（ｉｉ）参照）。播種した混合細胞は、被覆培養面全面に接着し、シート状の細胞構造体（単層）を形成する（図４２（ｉｉｉ）参照）。なお、この例では、混合細胞の密度は、１００％コンフルエントである（図４２（ｉｉｉ）参照）。
　肝細胞と線維芽細胞とがシート状の細胞構造体を形成した後に、マクロファージ等の免疫系細胞を添加する（図４２（ｉｖ））。その後、被覆培養面に接着した混合細胞は、被覆培養面中央部に向かって凝集し始め、端部が被覆培養面から離れて反り返り始めて、端部が反り返った細胞構造体となる（図４２（ｖ）参照）。その際、シート状の細胞構造体に付着したり、培養皿中に浮遊したりしている免疫系細胞を包み込む。その後、更に凝集を続け、肝細胞、線維芽細胞及び免疫系細胞を含む塊状の細胞構造体となり、被覆培養面から浮遊する（図４２（ｖｉ）参照）。

　以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明は下記の実施例に何ら限定されるものではない。

［［発明（Ｉ）の実施例］
　下記の試験において、市販の試薬は、特に断りのない限り更に精製することなく用いた。

（試験Ｉ−Ａ）温度応答性ポリマーの調製
　容量５０ｍＬの軟質ガラス製の透明なバイアル瓶に、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）１０．０ｇ、及び水５，０００μＬを加えて、磁気撹拌器を用いて撹拌した。そして、この混合物（液体）に対してＧ１グレードの高純度（純度：９９．９９９９５％）の窒素がスを１０分間パージ（流速：２．０Ｌ／分）することにより、この混合物を脱酸素した。なお、用いたＤＭＡＥＭＡには、重合禁止剤であるメチルヒドロキノン（ＭＥＨＱ）が０．５重量％含まれていた。
　その後、この反応物に対して、丸型ブラック蛍光灯（ＮＥＣ社製、型番：ＦＣＬ２０ＢＬ、１８Ｗ）を用いて、２２時間紫外線照射することにより、上記反応物を重合させた。反応物は、５時間後に粘性を帯び１５時間後に固化して、重合体が反応生成物として得られた。この反応生成物を２−プロパノールに溶解させ、溶液を透析チューブに移した。そして、透析を７２時間行い、反応生成物を精製した。
　反応生成物を含む溶液を、セルロース混合エステル製の０．２μｍフィルター（東洋濾紙社製、型番：２５ＡＳ０２０）で濾過し、得られた濾液を凍結乾燥させることにより、分子内イオン複合体型の温度応答性ポリマーが得られた（収量：６．８ｇ、転化率：６８％）。このポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）を、ＧＰＣ（島津社製、型番：ＬＣ−１０ｖｐシリーズ）を用いて、ポリエチレングリコール（Ｓｈｏｄｅｘ社製、ＴＳＫシリーズ）を標準物質として測定し、Ｍｎ＝１００，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１０．０）と決定した。

（試験Ｉ−Ｂ）被覆培養面の準備
（試験Ｉ−Ｂ−１）マスキングシートを使用した被覆培養面の準備
　細胞培養器として、φ３５ｍｍプレート（ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（登録商標）、ＳＵＭＩＬＯＮ社製）（細胞低吸着性プレート）を用いた。
　親水性基で修飾したシリコン製の部材（タイガースポリマー株式会社製、Ｋ−１２５）（厚さ１．０ｍｍ）を準備し、このシートの中央部分に平面視でドーナツ形（外径（φｏ）８ｍｍ、内径（φｉ）４ｍｍ、幅２ｍｍ）のくり抜きを設けた。このドーナツ形の穴を有するシートをマスキングシートとして用いた。
　上記プレートの培養面上に上記マスキングシートを敷き、ここに、室温条件下において、前述の試験Ｉ−Ａで調製したポリマーの水溶液（濃度：３ｎｇ／μＬ）２２．５μＬを加え、その後、該水溶液を４５℃で３時間乾燥させた。乾燥後、上記シリコン製のシートを剥がした。

（試験Ｉ−Ｂ−２）細胞非接着性のシートを使用した被覆培養面の準備
　細胞培養器として、φ３５ｍｍプレート（ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（登録商標）、ＳＵＭＩＬＯＮ社製）（細胞低吸着性プレート）を用いた。
　親水性基で修飾したシリコン製の部材を準備し、このシートの中央部分に平面視でドーナツ形（外径（φｏ）８ｍｍ、内径（φｉ）４ｍｍ又は３ｍｍ、幅２ｍｍ又は２．５ｍｍ）のくり抜きを設けた。このドーナツ形の穴を有するシートを中敷きとして用いた。
　上記プレートの培養面上に、室温条件下において、前述の試験Ｉ−Ａで調製したポリマーの水溶液（濃度：３ｎｇ／μＬ）２２．５μＬを加え、その後、該水溶液を４５℃で３時間乾燥させた。乾燥後、被覆された培養面上に上記中敷きを敷いた。

　被覆培養面の表面のゼータ電位を、ゼータ電位計（大塚電子社製、型番：ＥＬＳＺ）及び平板試料用セルユニットを用いて測定した。測定では、セルとしては、石英セルを用い、標準のモニター粒子としては、ポリスチレンラテックス（粒子径：約５００ｎｍ）をヒドロキシプロピルセルロース（Ｍｗ＝３０，０００）で被覆した粒子（ゼータ電位：−５ｍＶ~＋５ｍＶ）を用い、溶媒として、１０ｍＭの塩化ナトリウム水溶液をｐＨ＝７、３７℃の条件下で用いた。ゼータ電位は、Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉ式により算出した。
　その結果、温度応答性ポリマーにより被覆された第一被覆領域の表面のゼータ電位は、＋２０ｍＶであった。なお、当業者に周知の通り、上記ゼータ電位の測定値は、±１０％程度のバラツキを有するものである。

　細胞培養プレートの第一被覆領域に対する水の接触角を、ＪＩＳ　Ｒ３２５７に準拠して、接触角計（商品名：ＤＭｓ−４００、協和界面科学社製）を用いて測定したところ、７０°±１０°であった。

（試験Ｉ−Ｃ）細胞の播種・培養
（試験Ｉ−Ｃ−１）（参考例Ｉ）
　上記試験Ｉ−Ｂ−１で準備した細胞培養器を用いた。
　ＧＦＰ組換えラット軟骨細胞Ａ（Ｒａｔ　Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ−Ａ（ＧＦＰ））を、増殖用培地（ＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）＋１０ｎｇ／μＬ　ＦＧＦ−２；ＤＭＥＭ：ギブコ社製；ＦＢＳ：バイオロジカルインダストリー社製、ロット番号７１５９２９；ＦＧＦ−２：ペプロテック社製、カタログ番号４００−２９）中に浮遊させて、細胞懸濁液を調製した。
　上記プレートに、室温条件下で、細胞密度１．０×１０^５個／ｃｍ^２以上となるように、細胞懸濁液を加えた。
　そして、この細胞を、３７℃、５％ＣＯ_２の細胞培養インキュベーター中で培養した。
　培養開始から約１５時間後、軟骨細胞は被覆培養面から凝集し始め、培養開始から２４時間後、ドーナツ形（リング形）の細胞構造体を形成した。
　培養開始から３時間後に、再分化用培地（ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）＋１０ｎｇ／μＬ　組換えラットＴＧＦ−β１（Ｒａｔ　ＴＧＦ−β１　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）＋５０μｇ／ｍＬ　アスコルビン酸二リン酸；ＤＭＥＭ：ギブコ社製、型番１１９６５；ＦＢＳ：バイオラッド社製、ロット番号７１５９２９；組換えラットＴＧＦ−β１：ペプロテック社製、カタログ番号１００−２１；アスコルビン酸二リン酸（和光純薬社製、カタログ番号１９６−０１２５２））で培地交換した。
　培地交換後、細胞の培養を更に２１時間継続した。
　上記の通り、試験Ｉ−Ｃ−１（参考例Ｉ）では、細胞塊の非存在下で、播種培養を１回行った。

　図７に、試験Ｉ−Ｃ−１（参考例Ｉ）における、培養開始から２４時間後（１日後）、２日後、６日後、１０日後の細胞構造体の様子を蛍光顕微鏡を用いて観察したときの写真を示す。特に、下図は、１０日後の細胞構造体の写真の一部を拡大して示したものである。
　図７に示す写真から、得られた細胞構造体を構成する細胞が、軟骨様の円形の細胞形態を示していることがわかった。

　図８に、試験Ｉ−Ｃ−１（参考例Ｉ）において得られた細胞構造体を短軸方向断面で切断したときの写真を示す。
　図８に示す写真から、得られた細胞構造体を構成する細胞は、丸形であり繭状の部屋をなす独特の軟骨小腔構造を有しており、周辺の核がない部分には、コンドロイチンやコラーゲン等の細胞外マトリックスが存在していることが明らかとなり、細胞構造体は軟骨様の組織をなしていることがわかった。

（試験Ｉ−Ｃ−２）
　上記試験Ｉ−Ｂ−２で準備した細胞培養器を用いた。
　ＧＦＰ組換えラット軟骨細胞Ａ（Ｒａｔ　Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ−Ａ（ＧＦＰ））を、増殖用培地（ＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）＋１０ｎｇ／μＬ　ＦＧＦ−２；ＤＭＥＭ：ギブコ社製；ＦＢＳ：バイオラッド社製、ロット番号７１５９２９；ＦＧＦ−２：ペプロテック社製、カタログ番号４００−２９）中に浮遊させて、細胞懸濁液を調製した。
　上記プレートに、室温条件下で、細胞密度１．０×１０^５個／ｃｍ^２以上となるように、細胞懸濁液を加えた。
　そして、この細胞を、３７℃、５％ＣＯ_２の細胞培養インキュベーター中で培養した。
　培養開始から１５時間後、軟骨細胞は被覆培養面から凝集し始め、培養開始から２４時間後、ドーナツ形（リング形）の細胞構造体を形成した。細胞構造体は、中敷きの凹部の底面の幅方向中央部分に沈降して留まっていた。
　培養開始から３~５時間後に再分化用培地（ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）＋１０ｎｇ／μＬ　組換えラットＴＧＦ−β１（Ｒａｔ　ＴＧＦ−β１　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）＋５０μｇ／ｍＬ　アスコルビン酸二リン酸；ＤＭＥＭ：ギブコ社製、型番１１９６５；ＦＢＳ：バイオラッド社製、ロット番号７１５９２９；組換えラットＴＧＦ−β１：ペプロテック社製、カタログ番号１００−２１；アスコルビン酸二リン酸（和光純薬社製、カタログ番号１９６−０１２５２））で培地交換した。
　培地交換後、細胞の培養を更に２４時間継続した。

　培地を再び増殖用培地に戻した上で、細胞構造体の存在下、室温条件下で、細胞密度１．０×１０^５個／ｃｍ^２以上となるように、細胞懸濁液を加えた。
　そして、この細胞を、３７℃、５％ＣＯ_２の細胞培養インキュベーター中で培養した。
　培養開始から１５時間後、播種した軟骨細胞は被覆培養面から凝集し始め、ドーナツ形（リング形）の細胞構造体を包み込むように凝集して、一回りサイズが拡大したドーナツ形（リング形）の細胞構造体が形成した。細胞構造体は、中敷きの凹部の底面の幅方向中央部分に沈降して留まっていた。培養開始から２７時間後の細胞構造体の様子を図９に示す。
　上記の細胞構造体の存在下での播種培養を３回繰り返した。１~３回の繰り返し後の細胞構造体の様子を図９に示す。

　図９に、試験Ｉ−Ｃ−２における、培養開始から２７時間後、４４時間後、７０時間後、１２２時間後の細胞構造体の様子を蛍光顕微鏡を用いて観察したときの写真を示す。上図に、幅２ｍｍのドーナツ形のくり抜きを有する中敷きを用いた場合の細胞構造体の様子を示し、下図に、幅２．５ｍｍのドーナツ形のくり抜きを有する中敷きを用いた場合の細胞構造体の様子を示す。
　図９に示す写真から、新たな細胞の播種及び培養を経てドーナツ形（リング形）の軟骨細胞塊のサイズが拡大したことがわかった。

（試験Ｉ−Ｃ−３）
　上記試験Ｉ−Ｂ−２で準備した細胞培養器を用いた。
　ＧＦＰ組換えルイスラットの脂肪組織由来間葉系幹細胞（ＡＤＳＣ（Ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｖａｓｃｕｌａｒ　ｓｔｒｏｍａｌ　ｃｅｌｌ））を、増殖用培地（ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）；ＤＭＥＭ：ギブコ社製、型番１１９６５；ＦＢＳ：バイオラッド社製、ロット番号７１５９２９）中に浮遊させて、細胞懸濁液を調製した。
　上記プレートに、室温条件下で、細胞密度１．０×１０^５個／ｃｍ^２以上となるように、細胞懸濁液を加えた。
　そして、この細胞を、３７℃、５％ＣＯ_２の細胞培養インキュベーター中で培養した。
　培養開始から６時間後、軟骨細胞は被覆培養面から凝集し始め、培養開始から８時間後、ドーナツ形（リング形）の細胞構造体を形成した。細胞構造体は、中敷きの凹部の底面の幅方向中央部分に沈降して留まっていた。
　培養開始から１．５時間後に、軟骨分化用培地（ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）＋１％ＩＴＳ　Ｐｒｅｍｉｘ＋５０μｇ／ｍＬ　アスコルビン酸二リン酸＋１０ｎｇ／μＬ　組換えラットＴＧＦ−β１（Ｒａｔ　ＴＧＦ−β１　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）＋１０Ｍ　デキサメタゾン；ＤＭＥＭ：ギブコ社製、型番１１９６５；ＦＢＳ：バイオラッド社製、ロット番号７１５９２９；ＩＴＳ　Ｐｒｅｍｉｘ：ＢＤバイオサイエンス社製、カタログ番号３５４３４１；アスコルビン酸二リン酸（和光純薬社製、カタログ番号１９６−０１２５２）；組換えラットＴＧＦ−β１：ペプロテック社製、カタログ番号１００−２１；デキサメタゾン：和光純薬社製、カタログ番号０４７−１８８６３）で培地交換した。
　培地交換後、細胞の培養を更に２４時間継続した。

　培地を再び増殖用培地に戻した上で、細胞構造体の存在下、室温条件下で、細胞密度１．０×１０^５個／ｃｍ^２以上となるように細胞懸濁液を加えた。
　そして、この細胞を、３７℃、５％ＣＯ_２の細胞培養インキュベーター中で培養した。
　培養開始から６時間後、播種した軟骨細胞は被覆培養面から凝集し始め、ドーナツ形（リング形）の細胞構造体を包み込むように凝集して、一回りサイズが拡大したドーナツ形（リング形）の細胞構造体が形成した。培養開始から８時間後の細胞構造体の様子を図１０に示す。
　上記の細胞構造体の存在下での播種培養を３回繰り返した。１~３回の繰り返し後の細胞構造体の様子を図１０に示す。

　図１０に、試験Ｉ−Ｃ−３における、培養開始から８時間後、２０時間後、３２時間後、４２時間後の細胞構造体の様子を蛍光顕微鏡を用いて観察したときの写真を示す。上図に、幅２ｍｍのドーナツ形のくり抜きを有する中敷きを用いた場合の細胞構造体の様子を示し、下図に、幅２．５ｍｍのドーナツ形のくり抜きを有する中敷きを用いた場合の細胞構造体の様子を示す。なお、最下図には、４２時間後の細胞構造体の様子を実体顕微鏡を用いて観察したときの写真を示す。
　図１０に示す写真から、新たな細胞の播種及び培養を経てドーナツ形（リング形）の軟骨細胞塊のサイズが拡大したことがわかった。
　特に、３回の播種培養の繰り返し後（培養開始から４２時間後）に、ドーナツ形（リング形）の軟骨細胞塊は、中敷きの凹部の外に、はみ出ることとなったことがわかる。

　なお、試験Ｉ−Ｃ−２及び試験Ｉ−Ｃ−３において得られたドーナツ形（リング形）の軟骨細胞塊に対して、間葉系細胞であるＡＤＳＣ細胞を用いて播種培養工程を更に１回行って、移植材料を調製することができた（図示せず）。

（試験Ｉ−Ｄ）複合材の調製
　まず、管状構造体として、コラーゲンを主成分とするバイオチューブ（例えば、特開２００４−２６１２６０号公報の実施例に記載の方法参照）（外径：３ｍｍ、内径：２ｍｍ、長さ：２０ｍｍ）を準備した。また、芯材として、シリコン製の棒状構造物（円柱状の形状、長さ：２０ｍｍ、外径：１．８ｍｍ）を準備した（図６（ｉ）参照）。
　次いで、棒状構造物をバイオチューブの中空部の一方端から他方端に向かって挿入した（図６（ｉｉ）参照）。
　そして、試験Ｉ−Ｃ−２において作製したドーナツ形の軟骨細胞塊４つを上記バイオチューブに約１ｍｍの間隔を空けながら嵌装させて、複合体を調製した（図６（ｉｉｉ）参照）。
　嵌装終了後３分後に、複合体を３７℃、５％ＣＯ_２の細胞培養インキュベーター中で培養し始めた。その後、複合体を２１日間培養した。培養開始から２１日後の時点で、バイオチューブと軟骨細胞塊とが一体化して、複合材が調製された（図６（ｉｖ）参照）。

　図１１（ａ）に、試験Ｉ−Ｄにおける培養開始から６日後の複合材の様子を肉眼で観察したときの写真を示す。
　図１１（ｂ）に、試験Ｉ−Ｄにおける培養開始から２１日後の複合材の様子を肉眼で観察したときの写真を示す。

　図１２に、試験Ｉ−Ｄにおける培養開始から２１日後の複合材の一部の様子を肉眼で観察したときの写真を拡大して示す。
　図１２に示すように、バイオチューブの外表面には軟骨組織が形成されていた。
　なお、複合体を調製した際に約１ｍｍであった軟骨細胞塊間の間隔は、約１ｍｍとなっていた。

　図１３に、試験Ｉ−Ｄにおいて調製された複合材に対してピンセットで操作したときの様子を肉眼で観察したときの写真を示す。（ａ）は、無操作時の外周面、（ｂ）は、無操作時の内腔面、（ｃ）は、全体への圧潰時、（ｄ）は、側面の一部への引張時、の様子を示す。
　図１３（ａ）~（ｄ）に示すように、複合材は上記通常の操作に耐え得る機械的強度を備えており、軟骨組織もバイオチューブに強固に接着したままであることがわかった。

　図１４に、試験Ｉ−Ｄにおいて調製された複合材をヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）に供したときの様子を顕微鏡を用いて観察したときの写真を示す。（ａ）に、複合材の外観写真を示し、（ｂ）に、（ａ）の線Ａ−Ａに沿う面により切断したときの断面図を示し、（ｃ）及び（ｄ）に、（ｂ）に示す写真を部分拡大したものを示す。
　図１４（ｃ）、（ｄ）中、ピンク色に染まっている部分（図中、実線矢印にて示す）はコラーゲンであり、青紫色に染まっている部分が細胞である。ここに示すように、バイオチューブのコラーゲン線維と軟骨細胞の細胞外マトリックスとが一体化していることがわかる。

［［発明（ＩＩ）の実施例］
　以下に、実施例に基づいて本発明（ＩＩ）をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。

（温度応答性ポリマーの調製）
　容量５０ｍＬの軟質ガラス製の透明なバイアル瓶に、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）１０．０ｇ、及び水５ｍＬを加えて、磁気撹拌器を用いて撹拌した。そして、この混合物（液体）に対してＧ１グレードの高純度（純度：９９．９９９９５％）の窒素ガスを１０分間パージ（流速：２．０Ｌ／分）することにより、この混合物を脱酸素した。なお、用いたＤＭＡＥＭＡには、重合禁止剤であるメチルヒドロキノン（ＭＥＨＱ）が０．５質量％含まれていた。
　その後、この反応物に対して、丸型ブラック蛍光灯（ＮＥＣ社製、型番：ＦＣＬ２０ＢＬ、１８Ｗ）を用いて、２２時間紫外線照射することにより、上記反応物を重合させた。反応物は、５時間後に粘性を帯び１５時間後に固化して、重合体が反応生成物として得られた。この反応生成物を２−プロパノールに溶解させ、溶液を透析チューブに移した。そして、透析を７２時間行い、反応生成物を精製した。
　反応生成物を含む溶液を、セルロース混合エステル製の０．２μｍフィルター（東洋濾紙社製、型番：２５ＡＳ０２０）で濾過し、得られた濾液を凍結乾燥させることにより、温度応答性（ホモ）ポリマーが得られた（収量：６．８ｇ、転化率：６８％）。このポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）を、ＧＰＣ（島津社製、型番：ＬＣ−１０ｖｐシリーズ）を用いて、ポリエチレングリコール（Ｓｈｏｄｅｘ社製、ＴＳＫシリーズ）を標準物質として測定し、Ｍｎ＝１．０×１０^５ｇ／ｍｏｌ（Ｍｗ／Ｍｎ＝１０．０）と決定した。

　上述の温度応答性ポリマーの核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）を、核磁気共鳴装置（Ｖａｒｉａｎ社製、型番：Ｇｅｍｉｎｉ３００）を用いて、重水（Ｄ_２Ｏ）を標準物質として測定した。下記には、代表的なピークを示す。
　^１Ｈ−ＮＭＲ（ｉｎ　Ｄ_２Ｏ）δ　０．８−１．２（ｂｒ，−ＣＨ_２−Ｃ（ＣＨ_３）−），１．６−２．０（ｂｒ，−ＣＨ_２−Ｃ（ＣＨ_３）−），２．２−２．４（ｂｒ，−Ｎ（ＣＨ_３）_２），２．５−２．７（ｂｒ，−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）_２），４．０−４．２（ｂｒ，−Ｏ−ＣＨ_２−）．
　ここで、主鎖のメチル基（δ　０．８−１．２）のプロトン数（ＤＭＡＥＭＡのホモポリマーの場合はモノマー１分子につき３個）Ａと、側鎖のジメチルアミノ基（δ　２．２−２．４）のメチルプロトン数（ＤＭＡＥＭＡのホモポリマーの場合はモノマー１分子につき６個で）Ｂとから、側鎖が有するアミノ基の官能基数と、重合反応と同時に進行する側鎖のエステル結合の加水分解反応により生じた側鎖のカルボキシル基の官能基数との比を算出した。
　その結果、上述の温度応答性ポリマーの場合は９４：６となった。これは、カチオン性ポリマーとアニオン性ポリマーとを含む２成分混合系におけるイオン複合体で言うＣ／Ａ比に換算すると、Ｃ／Ａ比＝１５．６となる。

　上述の温度応答性ポリマーの曇点を以下の方法で測定した。
　温度応答性ポリマーの３％水溶液を調製し、この水溶液の６６０ｎｍにおける吸光度を、２０~４０℃の間で測定した。
　その結果、２０~３０℃では、水溶液は透明であり、吸光度がほぼ０であったが、３１℃付近から水溶液中に白濁が見られるようになり、３２℃で吸光度が急激に上昇した。これにより、温度応答性ポリマーは、約３２℃の曇点を有することを確認した。
　なお、温度応答性ポリマーを３７℃まで昇温させると、ポリマー水溶液は、良好な応答性で、懸濁し、その後、水溶液全体が固化した。この固化物を室温（２５℃）で維持したところ、数十時間の間、固化した状態のままであった。その後、固化物が徐々に溶解して、均質な水溶液に変化した。固化したポリマーは４℃まで冷却すると、速やかに溶解した。そして、上記昇温及び降温の操作を繰り返し行なっても、応答性に変化は生じなかったことから、ポリマーが可逆的に相転移を生じさせることが確認された。

（被覆細胞培養器の製造）
　上述の温度応答性ポリマーを、純水に溶解して、温度応答性ポリマー溶液を調製した。各温度応答性ポリマー溶液中の温度応答性ポリマーの濃度は、温度応答性ポリマーａ：０．１２５ｎｇ／μＬ、温度応答性ポリマーｂ：０．２５ｎｇ／μＬ、温度応答性ポリマーｃ：０．５ｎｇ／μＬ、温度応答性ポリマーｄ：１．０ｎｇ／μＬとした。
　３８４ウェルプレート（住友ベークライト社製、品名「ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ」（登録商標）、ＭＳ−９３８４Ｕ）のウェルに、温度応答性ポリマー溶液ａ~ｄ２５μＬを、添加した。
　そして、インキュベーター（４０℃）中で６時間放置することによって、塗布した温度応答性ポリマーの水溶液を乾燥させ、被覆領域Ａを有する被覆細胞培養器ａ~ｄを準備した。

　上述の温度応答性ポリマーを、生理食塩水に溶解して、温度応答性ポリマー溶液を調製した。各温度応答性ポリマー溶液中の温度応答性ポリマーの濃度は、温度応答性ポリマーｅ：６ｎｇ／μＬ、温度応答性ポリマーｆ：１２ｎｇ／μＬ、温度応答性ポリマーｇ：２４ｎｇ／μＬとした。
　３８４ウェルプレート（住友ベークライト社製、品名「ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ」（登録商標）、ＭＳ−９３８４Ｕ）のウェルに、温度応答性ポリマー溶液ｅ~ｇ２５μＬを、添加した。なお、このプレートのウェルでは、丸底の曲率半径（平均）Ｒは約１．６ｍｍであり、最大幅Ｌは約２．５ｍｍであった。
　そして、インキュベーター（３７℃）中で３時間放置し、被覆領域Ａを有する被覆細胞培養器ｅ~ｇを準備した。なお、被覆細胞培養器ｅ~ｇにおいて、ウェル中に添加した温度応答性ポリマー溶液は、乾燥させていない。

　上述の温度応答性ポリマーを、純水に溶解して、温度応答性ポリマー溶液を調製した。各温度応答性ポリマー溶液中の温度応答性ポリマーの濃度は、温度応答性ポリマーｈ：０．９ｐｇ／μＬ、温度応答性ポリマーｉ：１．８ｐｇ／μＬ、温度応答性ポリマーｊ：７．５ｐｇ／μＬ、温度応答性ポリマーｋ：１５ｐｇ／μＬ、温度応答性ポリマーｌ：３１ｐｇ／μＬ、温度応答性ポリマーｍ：６７ｐｇ／μＬ、温度応答性ポリマーｎ：１２５ｐｇ／μＬ、温度応答性ポリマーｏ：５００ｐｇ／μＬとした。
　３８４ウェルプレート（住友ベークライト社製、品名「ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ」（登録商標）、ＭＳ−９３８４Ｕ）のウェルに、温度応答性ポリマー溶液ｈ~ｏ２．５μＬを、添加した。
　そして、インキュベーター（４０℃）中で６時間放置することによって、塗布した温度応答性ポリマーの水溶液を乾燥させ、被覆領域Ａを有する被覆細胞培養器ｈ~ｏを準備した。

　３８４ウェルプレート（住友ベークライト社製、品名「ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ」（登録商標）、ＭＳ−９３８４Ｕ）のウェルに、生理食塩水２５μＬを、添加した。
　そして、インキュベーター（３７℃）中で３時間放置し、細胞培養器ｐを準備した。なお、細胞培養器ｐは、温度応答性ポリマーが被覆されていない細胞培養器である。

［上皮系細胞の培養方法］
（実施例ＩＩ−１~ＩＩ−３５）
　ヒト肝癌細胞（コスモバイオ社、品番「ＨｅｐＧ２−５００」）を、培地（ＤＭＡＥＭ＋１０％ＦＢＳ（ギブコ社製、ロット番号：７１５９２９）中に混ぜて、０．５×１０^３ｃｅｌｌｓ／５０μＬ（細胞溶液Ｉ）、１．０×１０^３ｃｅｌｌｓ／５０μＬ（細胞溶液ＩＩ）、２．０×１０^３ｃｅｌｌｓ／５０μＬ（細胞溶液ＩＩＩ）、４．０×１０^３ｃｅｌｌｓ／５０μＬ（細胞溶液ＩＶ）、８．０×１０^３ｃｅｌｌｓ／５０μＬ（細胞溶液Ｖ）、の濃度の細胞溶液を調製した。
　そして、被覆細胞培養器ａ~ｇの各ウェルに、細胞溶液Ｉ~Ｖを５０μＬ加え、細胞を播種した。各実施例における被覆細胞培養器、細胞溶液の組み合わせは、表１に記載の通りである。
　その後、細胞インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）中で、２４時間培養した。その後、顕微鏡（株式会社ニコン製、ＥＣＬＩＰＳＥ−Ｔｉ）で観察した。

（実施例ＩＩ−３６~ＩＩ−７５）
　ヒト肝癌細胞（コスモバイオ社、品番「ＨｅｐＧ２−５００」）を、培地（ＤＭＡＥＭ＋１０％ＦＢＳ（ギブコ社製、ロット番号：７１５９２９）中に混ぜて、０．５×１０^３ｃｅｌｌｓ／２５μＬ（細胞溶液ＶＩ）、１．０×１０^３ｃｅｌｌｓ／２５μＬ（細胞溶液ＶＩＩ）、２．０×１０^３ｃｅｌｌｓ／２５μＬ（細胞溶液ＶＩＩＩ）、４．０×１０^３ｃｅｌｌｓ／２５μＬ（細胞溶液ＩＸ）、８．０×１０^３ｃｅｌｌｓ／２５μＬ（細胞溶液Ｘ）、の濃度の細胞溶液を調製した。
　そして、被覆細胞培養器ｈ~ｏの各ウェルに、細胞溶液ＶＩ~Ｘを２５μＬ加え、細胞を播種した。各実施例における被覆細胞培養器、細胞溶液の組み合わせは、表１に記載の通りである。
　その後、細胞インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）中で、２４時間培養した。その後、顕微鏡（株式会社ニコン製、ＥＣＬＩＰＳＥ−Ｔｉ）で観察した。

（比較例ＩＩ−１~ＩＩ−５）
　細胞培養器ｐのウェルに、細胞溶液Ｉ~Ｖを５０μＬ加え、細胞を播種した。各比較例における被覆細胞培養器、細胞溶液の組み合わせは、表１に記載の通りである。
　その後、細胞インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）中で、２４時間培養した。その後、顕微鏡（株式会社ニコン製、ＥＣＬＩＰＳＥ−Ｔｉ）で観察した。

［細胞構造体の製造方法］
（実施例ＩＩ−７６~ＩＩ−８０）
　被覆細胞培養器ｅのウェルに、細胞溶液Ｉ~Ｖを５０μＬ加え、細胞を播種した。各実施例における被覆細胞培養器、細胞溶液の組み合わせは、表２に記載の通りである。
　その後、細胞インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）中で、２４時間培養し、顕微鏡（株式会社ニコン製、ＥＣＬＩＰＳＥ−Ｔｉ）で観察した。そして、全ウェルの底面に塊状の細胞構造体が形成されたことを確認した。また、下記の細胞構造体の剥がれにくさの評価を行った。その結果を表２に示す

（実施例ＩＩ−８１~ＩＩ−１００）
　被覆細胞培養器ｈ~ｋのウェルに、細胞溶液ＶＩ~Ｘを２５μＬ加え、細胞を播種した。各実施例における被覆細胞培養器、細胞溶液の組み合わせは、表２に記載の通りである。
　その後、細胞インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）中で、２４時間培養し、顕微鏡（株式会社ニコン製、ＥＣＬＩＰＳＥ−Ｔｉ）で観察した。そして、全ウェルの底面に塊状の細胞構造体が形成されたことを確認した。また、下記の細胞構造体の剥がれにくさの評価を行った。その結果を表２に示す

（比較例ＩＩ−６~ＩＩ−１０）
　細胞培養器ｐのウェルに、細胞溶液Ｉ~Ｖを５０μＬ加え、細胞を播種した。各比較例における細胞培養器、細胞溶液の組み合わせは、表２に記載の通りである。
　その後、細胞インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）中で、２４時間培養し、顕微鏡（株式会社ニコン製、ＥＣＬＩＰＳＥ−Ｔｉ）で観察した。
　ＨｅｐＧ２は培養面に付着せず、底面で凝集していた。凝集した細胞構造体は、プレートを揺らすだけで移動し、底面に付着していなかった。また、ピペッティングを行ったところ、細胞外マトリックスの分泌が少ないせいか、細胞構造体が崩れる例も見られた。

［評価］
（被覆領域への細胞の接着）
　実施例ＩＩ−１~ＩＩ−７５、比較例ＩＩ−１~ＩＩ−５で培養したＨｅｐＧ２を、顕微鏡（株式会社ニコン製、ＥＣＬＩＰＳＥ−Ｔｉ）で観察した。そして、ＨｅｐＧ２が被覆領域に接着しており、培養可能である場合を良好（○）、被覆領域に接着していない場合を不良（×）と評価した。

（細胞構造体の外観）
　実施例ＩＩ−７６~ＩＩ−１００、比較例ＩＩ−６~ＩＩ−１０で得られた細胞構造体を、顕微鏡（株式会社ニコン製、ＥＣＬＩＰＳＥ−Ｔｉ）で観察した。その後、ピペッター（エッペンドルフ社製、商品名「Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ」）を用いて強くピペッティングし、再度細胞構造体を観察した。そして、以下の基準で細胞構造体の外観を評価した。
○（良好）：塊状の細胞構造体が形成されていた。また、強くピペッティングをしても、細胞構造体が崩れなかった。
×（不良）：塊状の細胞構造体が形成されていたが、強くピペッティングをすると、細胞構造体が崩れた。

（細胞構造体の剥離しにくさ）
　実施例ＩＩ−７６~ＩＩ−１００、比較例ＩＩ−６~ＩＩ−１０で得られた細胞構造体を、ピペッター（エッペンドルフ社製、商品名「Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ」）を用いて手動でピペッティングし、細胞構造体が培養面から剥離するまでの回数を測定した。
◎（優れる）：１０回超ピペッティングしても細胞構造体が剥離しなかった。
○（良好）：２~１０回ピペッティングで細胞構造体が剥離した。
△（普通）：１回ピペッティングで細胞構造体が剥離した。
×（不良）：細胞構造体が培養面に接着していなかった。

［上皮間葉転移誘導剤］
（実施例ＩＩ−１０１）
　ヒト肝癌細胞（コスモバイオ社、品番「ＨｅｐＧ２−５００」）を、培地（ＤＭＡＥＭ＋１０％ＦＢＳ（ギブコ社製、ロット番号：７１５９２９）中に混ぜて、４．０×１０^３ｃｅｌｌｓ／２５μＬの濃度の細胞溶液を調製した。
　２４ウェルプレート（住友ベークライト社製、品名「スミロンセルタイト」、ＭＳ−９０２４Ｘ）のウェルの中心部分に、上述の温度応答性ポリマーｄ（１．０ｎｇ／μＬ）をマイクロピペッター（柴田科学製、デジフィット）を用いて０．５μＬを液滴として滴下した。
　そして、インキュベーター（３７℃）中で３時間放置することによって、塗布した温度応答性ポリマーの水溶液を乾燥させ、被覆領域Ａを有する被覆細胞培養器ｑを準備した。
　そして、被覆細胞培養器ｑのウェルに、細胞溶液Ｉを１，０００μＬ加え、細胞を播種した。
　その後、細胞インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）中で、９６時間培養した。その後、顕微鏡（株式会社ニコン製、ＥＣＬＩＰＳＥ−Ｔｉ）で観察した。

（上皮細胞から間質細胞への転移の有無）
　実施例ＩＩ−１０１で培養したＨｅｐＧ２を、顕微鏡（株式会社ニコン製、ＥＣＬＩＰＳＥ−Ｔｉ）で観察した。そして、被覆領域に接着したＨｅｐＧ２の接着の様子を評価し、上皮細胞から間質細胞への転移の有無を判定した。

　図１７に、本発明において用いられる温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物上で上皮系細胞を９６時間培養したときの様子の写真を示す。図中、破線で囲まれた部分は被覆領域Ａを示し、黒枠矢印は被覆領域Ａで接着・生育している細胞を示し、黒塗矢印は非被覆領域で接着・生育している細胞を示す。

　図１７に示すように、培養９６時間後で、被覆領域Ａ上で培養された細胞はコンフルエントに達しており、線維芽細胞様の形態を有しており、一方、非被覆領域上で培養された細胞は敷石様（島状）に散在し、上皮系細胞の特徴を保持していることがわかった。
　この結果から、本発明において用いられる温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物が上皮間質転移の効果を有することが示された。

［［発明（ＩＩＩ）の実施例］
　以下に実施例に基づいて本発明（ＩＩＩ）をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。

（実施例ＩＩＩ−１）
（立体組織体の作製装置の製造）
　心棒として表面が網目構造のステンレスチューブ（富士フィルター工業製、３φ）を、培養面として商品名「ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ」（登録商標）（住友ベークライト株式会社製、品番「ＭＳ−９０２４Ｘ」）の一部を切り取って貫通孔（約３ｍｍ径）を設けたものを、使用し、培養面と貫通孔とが接している装置を製造した。培養面は、略円形であり、その外径は約２５ｍｍであった。なお、装置の形状は、図１８の形状とした。

　容量５０ｍＬの軟質ガラス製の透明なバイアル瓶に、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）１０．０ｇ、及び水５ｍＬを加えて、磁気撹拌器を用いて撹拌した。そして、この混合物（液体）に対してＧ１グレードの高純度（純度：９９．９９９９５％）の窒素ガスを１０分間パージ（流速：２．０Ｌ／分）することにより、この混合物を脱酸素した。なお、用いたＤＭＡＥＭＡには、重合禁止剤であるメチルヒドロキノン（ＭＥＨＱ）が０．５質量％含まれていた。
　その後、この反応物に対して、丸型ブラック蛍光灯（ＮＥＣ社製、型番：ＦＣＬ２０ＢＬ、１８Ｗ）を用いて、２２時間紫外線照射することにより、上記反応物を重合させた。反応物は、５時間後に粘性を帯び１５時間後に固化して、重合体が反応生成物として得られた。この反応生成物を２−プロパノールに溶解させ、溶液を透析チューブに移した。そして、透析を７２時間行い、反応生成物を精製した。
　反応生成物を含む溶液を、セルロース混合エステル製の０．２μｍフィルター（東洋濾紙社製、型番：２５ＡＳ０２０）で濾過し、得られた濾液を凍結乾燥させることにより、温度応答性（ホモ）ポリマーが得られた（収量：６．８ｇ、転化率：６８％）。このポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）を、ＧＰＣ（島津社製、型番：ＬＣ−１０ｖｐシリーズ）を用いて、ポリエチレングリコール（Ｓｈｏｄｅｘ社製、ＴＳＫシリーズ）を標準物質として測定し、Ｍｎ＝１．０×１０^５ｇ／ｍｏｌ（Ｍｗ／Ｍｎ＝１０．０）と決定した。

　上述の温度応答性ポリマーの核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）を、核磁気共鳴装置（Ｖａｒｉａｎ社製、型番：Ｇｅｍｉｎｉ３００）を用いて、重水（Ｄ_２Ｏ）を標準物質として測定した。下記には、代表的なピークを示す。
　^１Ｈ−ＮＭＲ（ｉｎ　Ｄ_２Ｏ）δ　０．８−１．２（ｂｒ，−ＣＨ_２−Ｃ（ＣＨ_３）−），１．６−２．０（ｂｒ，−ＣＨ_２−Ｃ（ＣＨ_３）−），２．２−２．４（ｂｒ，−Ｎ（ＣＨ_３）_２），２．５−２．７（ｂｒ，−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）_２），４．０−４．２（ｂｒ，−Ｏ−ＣＨ_２−）
　ここで、主鎖のメチル基（δ　０．８−１．２）のプロトン数（ＤＭＡＥＭＡのホモポリマーの場合はモノマー１分子につき３個）Ａと、側鎖のジメチルアミノ基（δ　２．２−２．４）のメチルプロトン数（ＤＭＡＥＭＡのホモポリマーの場合はモノマー１分子につき６個で）Ｂとから、側鎖が有するアミノ基の官能基数と、重合反応と同時に進行する側鎖のエステル結合の加水分解反応により生じた側鎖のカルボキシル基の官能基数との比を算出した。
　その結果、上述の温度応答性ポリマーの場合は９４：６となった。これは、カチオン性ポリマーとアニオン性ポリマーとを含む２成分混合系におけるイオン複合体で言うＣ／Ａ比に換算すると、Ｃ／Ａ比＝１５．６となる。

　上述の温度応答性ポリマーを、純水に溶解して、温度応答性ポリマー溶液（終濃度１５ｎｇ／μＬ）を調製した。この溶液を上述の装置の培養面の全面に塗布し、インキュベーター（４０℃）中で１時間放置することによって、塗布した温度応答性ポリマーの水溶液を乾燥させ、被覆培養面を有する立体組織体の作製装置を準備した。

（実施例ＩＩＩ−２）
　心棒として表面が網目構造のステンレスチューブ（富士フィルター工業製、３φ）を、培養面として商品名「ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ」（登録商標）（住友ベークライト株式会社製、品番「ＭＳ−９０２４Ｘ」）の一部を切り取って貫通孔（約３．２ｍｍ径）を設けたものを、使用し、培養面と貫通孔との間に隙間がある装置を製造した。培養面は、略円形であり、その外径は約２５ｍｍであり、培養面と貫通孔との隙間は０．２ｍｍであった。なお、装置の形状は、図２０の形状とした。
　実施例ＩＩＩ−１と同様にして、温度応答性ポリマーで培養面を被覆し、被覆培養面を有する立体組織体の作製装置を準備した。

（実施例ＩＩＩ−３）
（リング状の立体組織体の作製）
　実施例ＩＩＩ−１で製造した立体組織体の作製装置を、内径３０ｍｍのコニカルチューブ（イワキ社製、商品コード「２３４５−０５０」）に入れ、培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製、ロット番号：７１５９２９）＋５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸二リン酸塩（和光純薬製、商品番号：１９６−１２５２））中に浸した。その後、ＧＦＰ組換えルイスラット脂肪組織由来間葉系幹細胞（ＡＤＳＣ）を、作製装置を浸した培地と同様の培地中に混ぜ、細胞浮遊液を調製した。その後、６０×１０^５個／ｍＬの細胞浮遊液を２ｍＬ添加し、細胞を播種した。
　その後、細胞インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）中で、２４時間培養し、心棒の周囲に巻き付いたリング状の立体組織体が得られたことを確認した。
　得られたリング状の立体組織体は、図２４とほぼ同様のものであった。得られたリング状の立体組織体は、ＡＤＳＣを主成分とする立体組織体であった。

（実施例ＩＩＩ−４）
（リング状の立体組織体の作製）
　実施例ＩＩＩ−２で作製した立体組織体の作製装置を用いた以外は、実施例ＩＩＩ−３と同様にしてリング状の立体組織体を作製したところ、凝集した細胞は、培養面と貫通孔との間の隙間を飛び越えて、心棒の周囲に巻き付いたリング状の立体組織体が得られたことを確認した。
　図２４に、実施例ＩＩＩ−４で得られたリング状の立体組織体を示す。得られたリング状の立体組織体は、ＡＤＳＣを主成分とする立体組織体であった。

（実施例ＩＩＩ−５）
（管腔状の立体組織体の作製）
　実施例ＩＩＩ−１で製造した立体組織体の作製装置を、内径３０ｍｍのコニカルチューブ（イワキ社製、商品コード「２３４５−０５０」）入れ、培地（ＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製、ロット番号：７１５９２９）＋１０ｎｇ／μＬ　ｒａｔ　ＴＧＦ−β１　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製、商品番号：１００−２１）＋５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸二リン酸（和光純薬工業株式会社製、商品番号：１９６−０１２５２））中に浸した。その後、ＧＦＰ組換えルイスラット膝関節から定法に従って採取した軟骨細胞を、作製装置を浸した培地と同様の培地中に混ぜ、細胞浮遊液を調製した。その後、６０×１０^５個／ｍＬの細胞浮遊液を２ｍＬ添加し、細胞を播種し、細胞インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）中で、４８時間培養し、心棒の周囲に巻き付いたリング状の立体組織体が得られたことを確認した。
　その後、培養面を心棒の延在方向下側に０．５ｍｍ移動させ、更に上記細胞浮遊液を２ｍＬ添加し、細胞を再度播種し、細胞インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）中で、４８時間培養した（２回目の細胞播種、培養）。
　同様にして、細胞の播種、培養を続け、播種と培養の繰り返しを合計９回行った。
　そして、９個のリング状の立体組織体が互いに連なって接着した、管腔状の立体組織体が得られたことを確認した。
　図２５に、実施例ＩＩＩ−５で得られた管腔状の立体組織体を示す。なお、図２５は、心棒であるステンレスチューブを抜き取り、シリコン樹脂製のチューブと入れ替えた後に撮影した写真である。

（実施例ＩＩＩ−６）
（管腔状の立体組織体の作製）
　実施例ＩＩＩ−２で製造した立体組織体の作製装置を用い、培養面を心棒の延在方向上側に０．２ｍｍ移動させたこと以外は、実施例ＩＩＩ−５と同様にして管腔状の立体組織体を作製し、９個のリング状の立体組織体が互いに連なって接着した、管腔状の立体組織体が得られたことを確認した。
　得られた管腔状の立体組織体は、図２５とほぼ同様のものであった。

（実施例ＩＩＩ−７）
（複数の培養面を有する立体組織体の作製装置の製造）
　心棒として表面が網目構造のステンレスチューブ（富士フィルター工業製、３φ）を、培養面として商品名「ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ」（登録商標）（住友ベークライト株式会社製、品番「ＭＳ−９０２４Ｘ」）の一部を切り取って貫通孔（約３．２ｍｍ径）を設けたものを、使用し、培養面と貫通孔との間に隙間がある、９個の培養面を有する装置を製造した。全ての培養面は、略円形であり、その外径は約２４ｍｍであり、培養面と貫通孔との隙間は０．２ｍｍであった。なお、装置の形状は、１本の心棒が９個の培養面の貫通孔を相通した、図２６において培養面を９個有する形状とした。
　実施例ＩＩＩ−１と同様にして、温度応答性ポリマーで全ての培養面を被覆し、被覆培養面を有する立体組織体の作製装置を準備した。
　なお、各培養面の間隔は１ｍｍとした。

（実施例ＩＩＩ−８）
（管腔状の立体組織体の作製）
　実施例ＩＩＩ−７で製造した立体組織体の作製装置を、内径３０ｍｍのコニカルチューブ（イワキ社製、商品コード「２３４５−０５０」）入れ、培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製、ロット番号：７１５９２９）中に浸した。その後、ラット皮下脂肪由来間葉系幹細胞を、作製装置を浸した培地と同様の培地中に混ぜ、細胞浮遊液を調製した。その後、６０×１０^６個／ｍＬの細胞浮遊液を２ｍＬ添加し、各被覆培養面上に細胞を播種し、細胞インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）中で、４８時間培養し、各被覆培養面から心棒の周囲に巻き付いたリング状の立体組織体が得られたことを確認した。
　その後、更に４８時間培養を続けたところ、各被覆培養面から形成された９個のリング状の立体組織体が互いに連なって接着し、管腔状の立体組織体が得られたことを確認した。
　図２８Ａに、実施例ＩＩＩ−８で得られた管腔状の立体組織体（３．８％グルタアルデヒド固定後の写真）を、図２８Ｂに、ＨＥ染色切片像を示す。

（実施例ＩＩＩ−９）
（人工血管）
　実施例ＩＩＩ−７で製造した立体組織体の作製装置の９個の培養面へ、セルリンカーキットで赤色蛍光標識した臍帯血由来血管内皮細胞を、培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製、ロット番号：７１５９２９）中に混ぜ、６０×１０^５個／ｍＬの密度で１ｍＬずつ添加して細胞播種を行った。これを、内径３０ｍｍのコニカルチューブ（イワキ社製、商品コード「２３４５−０５０」）入れ、培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製、ロット番号：７１５９２９）中に浸し、細胞インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）中で、４８時間培養し、心棒の周囲に巻き付いた血管内皮細胞のリング状の立体組織体が得られたことを確認した。
　その後、ＧＦＰノックインラット皮下脂肪由来の間葉系幹細胞、作製装置を浸した培地と同様の培地中に混ぜ、間葉系幹細胞浮遊液を調製した。６０×１０^５個／ｍＬを１０ｍＬ添加し、細胞を播種し、細胞インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）中で、４８時間培養し、血管内皮細胞の層の外周に、間葉系幹細胞の層を有する、２層構造の９個のリング状の立体組織体が互いに連なって接着した、管腔状の立体組織体（人工血管）が得られたことを確認した。
　図２９に、実施例ＩＩＩ−９で得られた人工血管の蛍光顕微鏡像を示す。

（実施例ＩＩＩ−１０）
（人工気管）
　実施例ＩＩＩ−１で製造した立体組織体の作製装置を、内径３０ｍｍのコニカルチューブ（イワキ社製、商品コード「２３４５−０５０」）に入れ、培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｉｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製、ロット番号：７１５９２９）＋５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸二リン酸塩（和光純薬製、商品番号：１９６−１２５２））中に浸した。
　その後、ビーグル犬膝関節由来の軟骨細胞を、作製装置を浸した培地と同様の培地中に混ぜ、軟骨細胞浮遊液を調製した。その後、６０×１０^５個／ｍＬの軟骨細胞浮遊液を２ｍＬ添加し、細胞を播種し、細胞インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）中で、４８時間培養し、心棒の周囲に巻き付いた軟骨細胞のリング状の立体組織体が得られたことを確認した。
　その後、培養面を心棒の延在方向下側に０．５ｍｍ移動させ、ラット脂肪組織由来間葉系幹細胞（ＡＤＳＣ）を、作製装置を浸した培地と同様の培地中に混ぜて調製した線維芽細胞浮遊液（６０×１０^５個／ｍＬ）を２ｍＬ添加し、細胞を再度播種し、細胞インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）中で、４８時間培養した（２回目の細胞播種、培養）。
　軟骨細胞、間葉系幹細胞を、交互に使用した。そして、６個のリング状の立体組織体が互いに連なって接着した、管腔状の立体組織体（人工気管）が得られたことを確認した。
　図３０に、実施例ＩＩＩ−１０で得られた人工気管を示す。なお、図３０は、心棒であるステンレスチューブを抜き取り、シリコン樹脂製のチューブと入れ替えた後に撮影した写真である。

（実施例ＩＩＩ−１１）
（タンパク質を主成分とする立体組織体）
　実施例ＩＩＩ−１で製造した立体組織体の作製装置を、内径３０ｍｍのコニカルチューブ（イワキ社製、商品コード「２３４５−０５０」）に入れ、培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製、ロット番号：７１５９２９）＋５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸二リン酸塩（和光純薬製、商品番号：１９６−１２５２））中に浸した。
　その後、ラット脂肪組織由来間葉系幹細胞（ＡＤＳＣ）細胞を、作製装置を浸した培地と同様の培地中に混ぜ、細胞浮遊液を調製した。その後、６０×１０^５個／ｍＬの細胞浮遊液を２ｍＬ添加し、細胞を播種し、細胞インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）中で、４８時間培養し、心棒の周囲に巻き付いたリング状の立体組織体が得られたことを確認した。
　その後、培養面を心棒の延在方向下側に０．５ｍｍ移動させ、更に上記細胞浮遊液を２ｍＬ添加し、細胞を再度播種し、細胞インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）中で、４８時間培養した（２回目の細胞播種、培養）。
　同様にして、細胞の播種、培養を続け、播種と培養の繰り返しを合計６回行った。
　そして、６個のリング状の立体組織体が互いに連なって接着した、管腔状の立体組織体が得られたことを確認した。
　その後、得られた管腔状の立体組織体を、ドデシル硫酸ナトリムおよびエタノールで処理後、３．８％グルタルアルデヒドで処理することにより、立体組織体中の細胞を死滅させて、管腔状のタンパク質を主成分とする立体組織体が得られたことを確認した。
　図３１に、実施例ＩＩＩ−１１で得られたタンパク質を主成分とする立体組織体を示す。

［［発明（ＩＶ）の実施例］
　以下、実施例により本発明（ＩＶ）を更に詳細に説明するが、本発明は下記の実施例に何ら限定されるものではない。
　下記の試験において、市販の試薬は、特に断りのない限り更に精製することなく用いた。

（実施例ＩＶ−Ａ１）
（試験ＩＶ−Ａ１）ポリマーの製造
　容量５０ｍＬの軟質ガラス製の透明なバイアル瓶に、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）１０．０ｇ、及び水５ｍＬを加えて、磁気撹拌器を用いて撹拌した。そして、この混合物（液体）に対してＧ１グレードの高純度（純度：９９．９９９９５％）の窒素ガスを１０分間パージ（流速：２．０Ｌ／分）することにより、この混合物を脱酸素した。なお、用いたＤＭＡＥＭＡには、重合禁止剤であるメチルヒドロキノン（ＭＥＨＱ）が０．５質量％含まれていた。
　その後、この反応物に対して、丸型ブラック蛍光灯（ＮＥＣ社製、型番：ＦＣＬ２０ＢＬ、１８Ｗ）を用いて、２２時間紫外線照射することにより、上記反応物を重合させた。反応物は、５時間後に粘性を帯び１５時間後に固化して、重合体が反応生成物として得られた。この反応生成物を２−プロパノールに溶解させ、溶液を透析チューブに移した。そして、透析を７２時間行い、反応生成物を精製した。
　反応生成物を含む溶液を、セルロース混合エステル製の０．２μｍフィルター（東洋濾紙社製、型番：２５ＡＳ０２０）で濾過し、得られた濾液を凍結乾燥させることにより、温度応答性（ホモ）ポリマーが得られた（収量：６．８ｇ、転化率：６８％）。このポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）を、ＧＰＣ（島津社製、型番：ＬＣ−１０ｖｐシリーズ）を用いて、ポリエチレングリコール（Ｓｈｏｄｅｘ社製、ＴＳＫシリーズ）を標準物質として測定し、Ｍｎ＝１．０×１０^５ｇ／ｍｏｌ（Ｍｗ／Ｍｎ＝１０．０）と決定した（実施例ポリマー１）。

　実施例ポリマー１の３％水溶液を調製し、この水溶液の６６０ｎｍにおける吸光度を、２０℃~４０℃の間で測定した。
　その結果、２０℃~３０℃では、水溶液は透明であり、吸光度がほぼ０であったが、３１℃付近から水溶液中に白濁が見られるようになり、３２℃で吸光度が急激に上昇した。これにより、上記ポリマーは、約３２℃の曇点を有することを確認した。
　なお、実施例ポリマーを３７℃まで昇温させると、ポリマー水溶液は、良好な応答性で、懸濁し、その後、水溶液全体が固化した。この固化物を室温（２５℃）で維持したところ、数十時間の間、固化した状態のままであった。その後、固化物が徐々に溶解して、均質な水溶液に変化した。固化したポリマーは４℃まで冷却すると、速やかに溶解した。そして、上記昇温及び降温の操作を繰り返し行なっても、応答性に変化は生じなかったことから、ポリマーが可逆的に相転移を生じさせることが確認された。

（試験ＩＶ−Ａ２）細胞構造体の製造
　実施例ＩＶ−Ａ１では、塗布・乾燥により調製した培養面を用いて、細胞構造体の製造を行った。
　細胞培養器として、ポリスチレン製の３５ｍｍ細胞培養プレート（イワキ社製、型番：３０００−０３５−ＭＹＰ、１ウェル当たりの底面積：９ｃｍ^２）を用いた。
　次いで、培養面上に、曇点以下に冷却した温度応答性ポリマーの水溶液（濃度：１５μｇ／ｍＬ）４０μＬを、全面に亘って、塗布した。
　そして、クリーンベンチ内にて放置することによって、塗布した温度応答性ポリマーの水溶液を乾燥させた。
　こうして、細胞培養プレートの培養面に温度応答性ポリマーで被覆した被覆領域を設けた。

（試験ＩＶ−Ａ３）ゼータ電位の測定
　細胞培養プレートの小片に（試験ＩＶ−Ａ２）の手順と同様の手順に従って設けた被覆領域の表面ゼータ電位を、ゼータ電位計（大塚電子社製、型番：ＥＬＳＺ）及び平板試料用セルユニットを用いて測定した。
　具体的には、石英セルの下面に小片の試料を密着させ、セル内部にモニター粒子懸濁液を注入した。ここで、標準のモニター粒子として、ポリスチレンラテックス（粒子径：約５００ｎｍ）をヒドロキシプロピルセルロース（Ｍｗ＝３０，０００）で被覆した粒子（ゼータ電位：−５ｍＶ~＋５ｍＶ）を用いた。また、溶媒として、１０ｍＭの塩化ナトリウム水溶液をｐＨ＝７、３７℃の条件下で用いた。そして、ゼータ電位は、Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉ式を用いて算出した。
　非被覆の細胞培養プレートの小片の表面のゼータ電位は−６８ｍＶであり、一般的な熱可塑性樹脂の固体表面のゼータ電位として当業者に周知の値であった。
　一方、温度応答性ポリマーにより被覆された細胞培養プレートの小片の表面のゼータ電位は、＋２０ｍＶであった。
　なお、当業者に周知の通り、現在の技術では、固体表面のゼータ電位の測定値は、±１０％程度のバラツキを有するものであり、また、試料の調製工程においても、コーティング操作自体にバラツキが存在するものであるため、上記ゼータ電位の測定値はある程度の誤差を有し得る。

（試験ＩＶ−Ａ４）接触角の測定
　細胞培養プレートの被覆領域に対する水の接触角を、ＪＩＳ　Ｒ３２５７に準拠して、接触角計（商品名：ＤＭｓ−４００、協和界面科学社製）を用いて測定したところ、７０°±１０°であった。

（試験ＩＶ−Ａ５）細胞培養
　ここで、ＧＦＰでタグ付けしたラット皮下脂肪由来の間葉系脂肪幹細胞３．０×１０^５個／ｍＬを、完全培地（ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）溶液、ＤＭＥＭ：ギブコ社製、型番：１１９９５−０６５、ＦＣＳ：インビロトジェン社製、ロット番号：９２８６９６）中に浮遊させ、細胞懸濁液を調製した。
　細胞懸濁液をピペッターで、０．５μＬ、２μＬ、４μＬ、２０μＬの量を適宜選択しつつ、１００箇所に液滴として滴下した（図３２（ｉｖ）参照）。液滴の形状はほぼ真円形であり、液滴の径は、０．５μＬの場合について１ｍｍ、２μＬの場合について２ｍｍ、４μＬの場合について３ｍｍ、２０μＬの場合について５．５ｍｍであった。液滴間の間隔は、どの液滴間についても、２００μｍ以上となるようにした。液滴の底面積の被覆領域の面積に対する割合は約７５％であった。
　この播種したラット皮下脂肪由来の脂肪幹細胞を、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気の細胞培養インキュベーター中で８時間培養した。
　培養開始から０時間後（滴下直後）には、脂肪幹細胞が被覆領域の全面に接着していた（図３２（ｖ）参照）。
　培養開始から２時間後に、被覆領域の外縁付近に位置する細胞が、自発的に剥離し始めた。
　培養開始から３時間後~６時間後にかけて、細胞の自発的な剥離は、被覆領域の外縁側から被覆領域の中心側に向かって、徐々に進行した。
　培養開始から８時間後に、遂には、各被覆領域における培養から、被覆領域の数だけ、スフェロイド状の構造を有する細胞構造体が形成した（図３２（ｖｉ）参照）。
　形成したスフェロイド状の細胞構造体は、いずれも液滴の量に応じた所望のサイズの、ほぼ球形状の形状の整ったものであった。

（実施例ＩＶ−Ａ２~ＩＶ−Ａ５）
　実施例ＩＶ−Ａ２については、ポリマーの製造の条件を調整することにより、被覆領域の表面ゼータ電位を＋２０ｍＶから＋１５ｍＶに変更した以外は上記実施例ＩＶ−Ａ１と同様に、実験を行ったところ、実施例ＩＶ−Ａ１と同様に所望のサイズの形状の整ったスフェロイド状の構造を有する細胞構造体が得られた。
　実施例ＩＶ−Ａ３については、ポリマーの製造の条件を調整することにより、被覆領域の表面ゼータ電位を＋２０ｍＶから＋３５ｍＶに変更した以外は上記実施例ＩＶ−Ａ１と同様に、実験を行ったところ、実施例ＩＶ−Ａ１と同様に所望のサイズの形状の整ったスフェロイド状の構造を有する細胞構造体が得られた。
　実施例ＩＶ−Ａ４については、ポリマーの製造の条件を調整することにより、被覆領域に対する水の接触角を７０°±１０°から６５°±７°に変更した以外は上記実施例ＩＶ−Ａ１と同様に、実験を行ったところ、実施例ＩＶ−Ａ１と同様に所望のサイズの形状の整ったスフェロイド状の構造を有する細胞構造体が得られた。
　実施例ＩＶ−Ａ５については、ポリマーの製造の条件を調整することにより、被覆領域に対する水の接触角を７０°±１０°から７５°±５°に変更した以外は上記実施例ＩＶ−Ａ１と同様に、実験を行ったところ、実施例ＩＶ−Ａ１と同様に所望のサイズの形状の整ったスフェロイド状の構造を有する細胞構造体が得られた。

（実施例ＩＶ−Ｂ１）
（試験ＩＶ−Ｂ１）培養面の調製
　松浪硝子製の精密ガラス板：ＭＩＣＲＯ　ＣＯＶＥＲ　ＧＬＡＳＳ（３０ｍｍ×４０ｍｍ×０．１５ｍｍ厚）をジエチルエーテルで洗浄して乾燥させた。ガラス板同士の貼り付き防止用の油性成分や異物を清浄する目的で行った。

（試験ＩＶ−Ｂ１−１）＜ポリマーを培養面の全面に被覆した場合＞
　Ｖｉｎｙｌｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅを４％酢酸水溶液へ溶解し、終濃度が０．５％または２．０％となるように調整した。このシラン化合物溶液をガラスの全面へ流延し，溶液厚が約０．１μｍとなるよう液切りし、塩化カリウムの飽和溶液で８４％となるように加湿した２５℃の密閉デシケーター中で７２時間静置した。ＲＯ水で洗浄した後に１００℃で１０分間処理して水分を蒸発させ、更にＲＯ水および２−プロパノールで洗浄した。ＩＲの分析によりシランカプリング剤Ｖｉｎｙｌｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅに由来するビニル基がガラス表面へ固定されていることが確認された。
　２−（Ｎ，Ｎ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅを１０ｇ、ＲＯを５ｇ混合した溶液を１０分間窒素ガスでバブリングした。上記（１）で作製したビニル基が導入されたガラス板を１００ｍｍ径シャーレへ配置し、窒素ガスバブリングにより脱酸素したモノマー水溶液１０ｍＬを加えてガラス板を浸漬し、内部が窒素雰囲気となるように密閉した。シャーレの底面から３７５ｎｍのブラックライトを１０時間照射し、ガラス板をＲＯ水、２−プロパロールで洗浄して乾燥し、細胞培養器（１）を得た。

　試験ＩＶ−Ｂ１−１で調製した細胞培養器（１）について、液滴の量と液滴の径との相関を調査した。
　共重合体が固定されたガラス板表面上へラット皮下脂肪由来の間葉系幹細胞浮遊液（細胞密度：３．０×１０^５個／ｍＬ、完全培地（ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）溶液、ＤＭＥＭ：ギブコ社製、型番：１１９９５−０６５、ＦＣＳ：インビロトジェン社製、ロット番号：９２８６９６））をピペッターで０．５μＬ~５０μＬの液滴として滴下し、底面の投影像から液滴の直径を測定した。液滴の量と液滴の径とは、図３４（Ａ）の通り、０．５μＬ~５０μＬの液滴容量の全範囲では一次相関とはならなかった。
　一方、図３４（Ｂ）、（Ｃ）の通り、０．５μＬ~５．０μＬの範囲および５．０μＬ~５０μＬの範囲へ分離すると、それぞれの領域で線形相関が確認され、液滴容量で液滴の直径が制御できることが示唆された。
　図３４（Ａ）~（Ｃ）に、実施例において培養面における液滴の量と液滴の径との相関を調査した結果を示す。

（試験ＩＶ−Ｂ１−２）＜ポリマーを培養面の複数箇所に被覆した場合＞
　Ｖｉｎｙｌｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅを４％酢酸水溶液へ溶解し、終濃度が２．０％となるように調整した。このシランカップリング剤の溶液を松浪硝子製の精密ガラス板上へ，０．５μＬずつ、液滴の中心部から起算して１．２ｍｍ~１２ｍｍの間隔を空けて４列×５行の２０滴を滴下し、塩化カリウムの飽和溶液で８４％に加湿した２５℃のデシケーター中で７２時間静置した。液滴をキャピラリーで吸引し、水およびメタノールで洗浄後して乾燥し、細胞培養器（２）を得た。
　試験ＩＶ−Ｂ１−１の場合と同様に、グラフト重合を行なった。ＩＲの分析によりシランカップリン剤Ｖｉｎｙｌｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ溶液を滴下した液滴（ドット）上にのみ共重合体が固定されていることが確認された。

（試験ＩＶ−Ｂ２）細胞構造体の製造
　実施例ＩＶ−Ｂ２では、グラフト重合により調製した培養面を用いて、細胞構造体の製造を行った。

（試験ＩＶ−Ｂ２−１）
　試験ＩＶ−Ｂ１−１で製造した共重合体が固定されたガラス板表面上へラット皮下脂肪由来の間葉系幹細胞浮遊液（細胞密度：３．０×１０^５個／ｍＬ、完全培地（ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）溶液、ＤＭＥＭ：ギブコ社製、型番：１１９９５−０６５、ＦＣＳ：インビロトジェン社製、ロット番号：９２８６９６））をピペッターで０．５μＬ~２．０μＬの範囲で４列×５行の２０滴の液滴として滴下し、細胞培養インキュベーター（三洋電機，ＭＣＯ−５Ｃ）で２４時間培養した（３７℃、５％炭酸ガス）。
　個々の液滴中で細胞は単層を形成してガラス表面上へ接着し、細胞の上へ細胞が積載される状態はほとんど確認されなかった。液滴の滴下から１時間後には全数の細胞がガラス板上に接着して伸展していた。さらに培養を継続すると約９時間後から液滴の外周から中心に向かって凝集が始まり、２１時間後には全細胞が一箇所へ集合して塊となって中心部でスフェロイドを形成した。
　ガラス板を０．３％メチルセルロースのＰＢＳ溶液へ浸漬すると、すべてのスフェロイドをスフェロイド浮遊液として回収可能であった。
　液滴と液滴の間の距離が３０μｍ以下となると液滴同士が引力や空気相に対する表面張力の関係からか、お互いに融合し、結果、ガラス板の全面に浮遊液が流延した状態となり、細胞凝集の現象は随所で同時に起こる結果となった。

［［発明（Ｖ）の実施例］
　以下、実施例により本発明（Ｖ）を更に詳細に説明するが、本発明は下記の実施例に何ら限定されるものではない。

　下記の試験において、市販の試薬は、特に断りのない限り更に精製することなく用いた。

（実施例Ｖ−１）
（試験Ｖ−Ａ）温度応答性ポリマーの調製
　容量５０ｍＬの軟質ガラス製の透明なバイアル瓶に、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）１０．０ｇ、及び水５，０００μＬを加えて、磁気撹拌器を用いて撹拌した。そして、この混合物（液体）に対してＧ１グレードの高純度（純度：９９．９９９９５％）の窒素ガスを１０分間パージ（流速：２．０Ｌ／分）することにより、この混合物を脱酸素した。なお、用いたＤＭＡＥＭＡには、重合禁止剤であるメチルヒドロキノン（ＭＥＨＱ）が０．５重量％含まれていた。
　その後、この反応物に対して、丸型ブラック蛍光灯（ＮＥＣ社製、型番：ＦＣＬ２０ＢＬ、１８Ｗ）を用いて、２２時間紫外線照射することにより、上記反応物を重合させた。反応物は、５時間後に粘性を帯び１５時間後に固化して、重合体が反応生成物として得られた。この反応生成物を２−プロパノールに溶解させ、溶液を透析チューブに移した。そして、透析を７２時間行い、反応生成物を精製した。
　反応生成物を含む溶液を、セルロース混合エステル製の０．２μｍフィルター（東洋濾紙社製、型番：２５ＡＳ０２０）で濾過し、得られた濾液を凍結乾燥させることにより、分子内イオン複合体型の温度応答性ポリマーが得られた（収量：６．８ｇ、転化率：６８％）。このポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）を、ＧＰＣ（島津社製、型番：ＬＣ−１０ｖｐシリーズ）を用いて、ポリエチレングリコール（Ｓｈｏｄｅｘ社製、ＴＳＫシリーズ）を標準物質として測定し、Ｍｎ＝１００，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１０．０）と決定した。

　温度応答性ポリマーの核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）を、核磁気共鳴装置（Ｖａｒｉａｎ社製、型番：Ｇｅｍｉｎｉ３００）を用いて、重水（Ｄ_２Ｏ）を標準物質として測定した。下記には、実施例ポリマーＶ−１に共通する代表的なピークを示す。
　^１Ｈ−ＮＭＲ（ｉｎ　Ｄ_２Ｏ）δ　０．８−１．２（ｂｒ，３Ｈ，−ＣＨ_２−Ｃ（ＣＨ_３）−），１．６−２．０（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ_２−Ｃ（ＣＨ_３）−），２．２−２．４（ｂｒ，６Ｈ，−Ｎ（ＣＨ_３）_２），２．５−２．７（ｂｒ，１．９Ｈ，−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）_２），４．０−４．２（ｂｒ，１．９Ｈ，−Ｏ−ＣＨ_２−）．
　ここで、α位に結合したメチル基（δ　０．８−１．２）のプロトン数（ＤＭＡＥＭＡユニットの場合もメタクリル酸ユニットの場合も３個）Ａと、側鎖のエステル結合の酸素に結合しているエチル基（δ　４．０−４．２）のメチルプロトン数（ＤＭＡＥＭＡユニットの場合は２個で、メタクリル酸ユニットの場合は０個）Ｂとから、ＤＭＡＥＭＡの側鎖が有するアミノ基の官能基数と、メタアクリル酸の側鎖のカルボキシル基の官能基数との比を算出した。
　その結果、得られたポリマーＶ−１の場合９４：６となった。これは、カチオン性ポリマーとアニオン性ポリマーとを含む２成分混合系におけるイオン複合体で言うＣ／Ａ比に換算すると、Ｃ／Ａ比＝１５．６となる。

　更に、得られた温度応答性ポリマーの３％水溶液を調製し、この水溶液の６６０ｎｍにおける吸光度を、２０℃~４０℃の間で測定したところ、約３２℃であった。

（試験Ｖ−Ｂ）第一被覆領域及び第二被覆領域の準備
　細胞培養器として、φ３５ｍｍプレート（ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（登録商標）、ＳＵＭＩＬＯＮ社製）（細胞低吸着性プレート）を用いた。
　上記プレートの培養面上の６箇所に、室温条件下において、前述の試験Ｖ−Ａで調製したポリマーの水溶液（濃度：１５ｎｇ／μＬ）を４．０μＬずつスポットして、その後、この水溶液を３７℃で３０分間乾燥させて、それぞれ円形の第一被覆領域（面積４．５ｍｍ^２）を準備した。
　乾燥後、６箇所の円形の第一被覆領域のうちの一つにおいて、第一被覆領域の中心を通る直線上に位置し、第一被覆領域の端部に位置する２箇所に、第一被覆領域と重なり合うように、フィブロネクチン溶液（ヒト血漿由来）（濃度：２００ｎｇ／μＬ）（ＢＤバイオサイエンス社製、ロット番号３３５３５６３）を０．２μＬずつスポットして、その後、この溶液を３７℃で５分間乾燥させて、それぞれ円形の第二被覆領域（面積０．８ｍｍ^２）を準備した（図３８（ａ）参照）。

　第一被覆領域の表面のゼータ電位を、ゼータ電位計（大塚電子社製、型番：ＥＬＳＺ）及び平板試料用セルユニットを用いて測定した。測定では、セルとしては、石英セルを用い、標準のモニター粒子としては、ポリスチレンラテックス（粒子径：約５００ｎｍ）をヒドロキシプロピルセルロース（Ｍｗ＝３０，０００）で被覆した粒子（ゼータ電位：−５ｍＶ~＋５ｍＶ）を用い、溶媒として、１０ｍＭの塩化ナトリウム水溶液をｐＨ＝７、３７℃の条件下で用いた。ゼータ電位は、Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉ式により算出した。
　その結果、温度応答性ポリマーにより被覆された第一被覆領域の表面のゼータ電位は、＋２０ｍＶであった。なお、当業者に周知の通り、上記ゼータ電位の測定値は、±１０％程度のバラツキを有するものである。

（試験Ｖ−Ｃ）細胞の播種・培養
　上記試験Ｖ−Ｂで準備した細胞培養器を用いた。
　ＧＦＰ組換えルイスラットの脂肪組織由来間葉系幹細胞（ＡＤＳＣ（Ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｖａｓｃｕｌａｒ　ｓｔｒｏｍａｌ　ｃｅｌｌ））を、培地（ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）；ＤＭＥＭ：ギブコ社製、型番１１９６５；ＦＢＳ：バイオロジカルインダストリー社製、ロット番号７１５９２９）中に浮遊させて、細胞懸濁液を調製した。
　上記プレートに、室温条件下で、細胞密度２．５×１０^５個／ｃｍ^２）となるように、細胞懸濁液を加えた（９５％コンフルエント）。
　そして、この細胞を、３７℃、５％ＣＯ_２の細胞培養インキュベーター中で２時間培養した。
　培養開始から２時間後、前述の培地で培地交換を行い、死滅した細胞を除去した。
　図３８（ａ）に、試験Ｖ−Ｃにおいて、試験Ｖ−Ｂで準備した第一被覆領域及び第二被覆領域においてＧＦＰ組換えルイスラットのＡＤＳＣを２時間培養した後の様子を、顕微鏡を用いて観察したときの写真を示す。
　そして、細胞を、３７℃、５％ＣＯ_２の細胞培養インキュベーター中で更に１８時間培養した。
　更なる１８時間の培養中、第一被覆領域に接着していた細胞は、中央部分に向かって凝集し、一方、第二被覆領域に接着した細胞は、当初の位置に接着し続けた。播種された細胞の成熟による細胞間のネットワークの結合力が、細胞の第一被覆領域に対する接着力を上回るようになり、細胞の凝集現象が生じた。このとき、長軸方向への凝集・収縮は制限される一方、短軸方向への凝集・収縮が優先された。最終的に、第二被覆領域に接着し続ける２つの細胞集団と、これらの細胞集団の間を連結するスティック状の細胞集団とからなる、直線状の構造を有する細胞構造体が形成した。
　図３８（ｂ）に、試験Ｖ−Ｃにおいて、試験Ｖ−Ｂで準備した第一被覆領域及び第二被覆領域においてＧＦＰ組換えルイスラットのＡＤＳＣを２０時間培養した後の様子を、顕微鏡を用いて観察したときの写真を示す。

　なお、図３８（ｃ）に、図３８（ｂ）に示す細胞構造体を倍率を下げて観察したときの写真を示す。

　図３８（ｄ）に、図３８（ｂ）の破線に示す細胞構造体の様子を蛍光顕微鏡を用いて観察したときの写真を示す。
　試験Ｖ−Ｃにおいて得られた細胞構造体のうちスティック状の細胞集団においては、細胞が細胞構造体の延在方向に沿って伸びる形状をなし、第二被覆領域に接着し続ける２つの細胞集団を結ぶ線の方向に沿う方向への配向性を備えることがわかった。

（実施例Ｖ−２）
　用いる細胞接着性物質を、フィブロネクチン溶液から、ラミニン（濃度：５０ｎｇ／μＬ）（ニッピ社製）に代えて、前述の実施例Ｖ−１の試験Ｖ−Ｂと同様の試験を行った。
　そして、用いる細胞を、ＧＦＰ組換えルイスラットのＡＤＳＣから、心筋細胞（生後１日目の新生ルイス系ラットから定法に従って分離）に代えて、前述の実施例Ｖ−１の試験Ｖ−Ｃと同様の試験を行った。
　この場合においても、前述の図３８に示す細胞構造体と同様の構造を備える細胞構造体が得られた。

［［発明（ＶＩ）の実施例］
　以下に、実施例に基づいて本発明（ＶＩ）をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。

（実施例ＶＩ−１）
　容量５０ｍＬの軟質ガラス製の透明なバイアル瓶に、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）１０．０ｇ、及び水５ｍＬを加えて、磁気撹拌器を用いて撹拌した。そして、この混合物（液体）に対してＧ１グレードの高純度（純度：９９．９９９９５％）の窒素ガスを１０分間パージ（流速：２．０Ｌ／分）することにより、この混合物を脱酸素した。なお、用いたＤＭＡＥＭＡには、重合禁止剤であるメチルヒドロキノン（ＭＥＨＱ）が０．５質量％含まれていた。
　その後、この反応物に対して、丸型ブラック蛍光灯（ＮＥＣ社製、型番：ＦＣＬ２０ＢＬ、１８Ｗ）を用いて、２２時間紫外線照射することにより、上記反応物を重合させた。反応物は、５時間後に粘性を帯び１５時間後に固化して、重合体が反応生成物として得られた。この反応生成物を２−プロパノールに溶解させ、溶液を透析チューブに移した。そして、透析を７２時間行い、反応生成物を精製した。
　反応生成物を含む溶液を、セルロース混合エステル製の０．２μｍフィルター（東洋濾紙社製、型番：２５ＡＳ０２０）で濾過し、得られた濾液を凍結乾燥させることにより、温度応答性（ホモ）ポリマーが得られた（収量：６．８ｇ、転化率：６８％）。このポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）を、ＧＰＣ（島津社製、型番：ＬＣ−１０ｖｐシリーズ）を用いて、ポリエチレングリコール（Ｓｈｏｄｅｘ社製、ＴＳＫシリーズ）を標準物質として測定し、Ｍｎ＝１．０×１０^５ｇ／ｍｏｌ（Ｍｗ／Ｍｎ＝１０．０）と決定した。

　上述の温度応答性ポリマーの核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）を、核磁気共鳴装置（Ｖａｒｉａｎ社製、型番：Ｇｅｍｉｎｉ３００）を用いて、重水（Ｄ_２Ｏ）を標準物質として測定した。下記には、代表的なピークを示す。
　^１Ｈ−ＮＭＲ（ｉｎ　Ｄ_２Ｏ）　δ　０．８−１．２（ｂｒ，−ＣＨ_２−Ｃ（ＣＨ_３）−），１．６−２．０（ｂｒ，−ＣＨ_２−Ｃ（ＣＨ_３）−），２．２−２．４（ｂｒ，−Ｎ（ＣＨ_３）_２），２．５−２．７（ｂｒ，−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）_２），４．０−４．２（ｂｒ，−Ｏ−ＣＨ_２−）．
　ここで、主鎖のメチル基（δ　０．８−１．２）のプロトン数（ＤＭＡＥＭＡのホモポリマーの場合はモノマー１分子につき３個）Ａと、側鎖のジメチルアミノ基（δ　２．２−２．４）のメチルプロトン数（ＤＭＡＥＭＡのホモポリマーの場合はモノマー１分子につき６個で）Ｂとから、側鎖が有するアミノ基の官能基数と、重合反応と同時に進行する側鎖のエステル結合の加水分解反応により生じた側鎖のカルボキシル基の官能基数との比を算出した。
　その結果、上述の温度応答性ポリマーの場合は９４：６となった。これは、カチオン性ポリマーとアニオン性ポリマーとを含む２成分混合系におけるイオン複合体で言うＣ／Ａ比に換算すると、Ｃ／Ａ比＝１５．６となる。

　上述の温度応答性ポリマーを、純水に溶解して、温度応答性ポリマー溶液（終濃度６ｎｇ／μＬ）を調製した。３５ｍｍディッシュ（住友ベークライト社製、品名「ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ」（登録商標）、ＭＳ−９０３５Ｘ）の培養面上の１０箇所に、温度応答性ポリマー溶液０．５μＬを、円形状に塗布した。
　１箇所あたりの円形の被覆培養面の直径は、約２，０００μｍであり、また、各被覆培養面間の距離は、約２，０００μｍであった。
　そして、インキュベーター（４０℃）中で１時間放置することによって、塗布した温度応答性ポリマーの水溶液を乾燥させ、複数の被覆培養面を有する被覆細胞培養器を準備した。

　新生Ｌｅｗｉｓ系ラット心筋細胞１００個に対して、ＧＦＰ組換えルイスラット脂肪組織由来間葉系幹細胞（ＡＤＳＣ）３００個の割合で混合した混合細胞を、培地（ＳｋＧＭ（ロンザ株式会社、型番：ＣＣ−３２４５）＋１０％ＦＢＳ（ギブコ社製、ロット番号：７１５９２９）中に混ぜて調製した、７．２×１０^６個／ｍＬの混合細胞溶液５ｍＬを被覆細胞培養器に加え、細胞を播種した。
　その後、細胞インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）中で、１時間培養し、新たな培地を用いて培地交換し、さらに細胞インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）中で、４８時間培養して、塊状の細胞構造体を得た。

（実施例ＶＩ−２）
　新生Ｌｅｗｉｓ系ラット心筋細胞１００個に対して、ＧＦＰ組換えルイスラット脂肪組織由来間葉系幹細胞を２３３個の割合で混合したこと以外、実施例ＶＩ−１と同様にして塊状の細胞構造体を得た。

（実施例ＶＩ−３）
　細胞には、心筋細胞としての新生Ｌｅｗｉｓ系ラット心筋細胞、間葉系幹細胞としてのＧＦＰ組換えルイスラット脂肪組織由来間葉系幹細胞（ＡＤＳＣ）、免疫系細胞としてのマクロファージの３種を使用した。マクロファージとしては、ラット骨髄由来の単球から分化誘導して使用した（コスモバイオ社製、骨髄単球培養キット、品番：ＢＭＭ０１）。
　第一段階として、新生Ｌｅｗｉｓ系ラット心筋細胞１００個に対して、ＧＦＰ組換えルイスラット脂肪組織由来間葉系幹細胞２５０個の割合で混合した細胞を実施例ＶＩ−１と同様にして播種し、５時間後に、細胞が接着して単層を形成した後に、培地交換を行った。この単層の上へ、新生Ｌｅｗｉｓ系ラット心筋細胞１００個に対して、ラット由来マクロファージ５個の割合となるように、マクロファージを含むラット由来マクロファージ浮遊液を加え、静置培養を継続したこと以外、実施例ＶＩ−１と同様の操作を行なった。
　心筋細胞と間葉系幹細胞からなる単層培養層が巾着袋状に凝集する際に、該単層培養層の上に沈降していたマクロファージは凝集に巻き込まれ、１個の塊状の細胞構造体を得た。露出した培養面にマクロファージは確認されず、播種したマクロファージの全数が細胞凝集塊中に取り込まれたことが確認された。

（比較例ＶＩ−１）
　新生Ｌｅｗｉｓ系ラット心筋細胞１００個に対して、ＧＦＰ組換えルイスラット脂肪組織由来間葉系幹細胞を７５個の割合で混合したこと以外、実施例ＶＩ−１と同様にして塊状の細胞構造体を得た。

（比較例ＶＩ−２）
　ＧＦＰ組換えルイスラット脂肪組織由来間葉系幹細胞を混ぜずに、新生Ｌｅｗｉｓ系ラット心筋細胞のみから細胞溶液を調製したこと以外、実施例ＶＩ−１と同様にして塊状の細胞構造体を得た。

（比較例ＶＩ−３）
　新生Ｌｅｗｉｓ系ラット心筋細胞１００個に対して、ＧＦＰ組換えルイスラット脂肪組織由来間葉系幹細胞を３３個の割合で混合したこと以外、実施例ＶＩ−１と同様にして塊状の細胞構造体を得た。

（比較例ＶＩ−４）
　新生Ｌｅｗｉｓ系ラット心筋細胞１００個に対して、ＧＦＰ組換えルイスラット脂肪組織由来間葉系幹細胞を２５個の割合で混合したこと以外、実施例ＶＩ−１と同様にして塊状の細胞構造体を得た。

（比較例ＶＩ−５）
　新生Ｌｅｗｉｓ系ラット心筋細胞１００個に対して、ＧＦＰ組換えルイスラット脂肪組織由来間葉系幹細胞を１００個の割合で混合したこと以外、実施例ＶＩ−１と同様にして塊状の細胞構造体を得た。

［評価］
（細胞構造体の外観）
　実施例、比較例で得られた塊状の細胞構造体を、顕微鏡（ニコン社製、商品名「ＥＣＬＩＰＥＳ−Ｔｉ」）で観察し、以下の基準で細胞の外観を評価した。
○（良好）：１０箇所全ての被覆培養面において、球形の塊状の細胞構造体が得られた。
△（不良）：１０箇所のいずれかの被覆培養面において、被覆培養面に接着した細胞が凝集せず単層のまま、又は凝集する部分と被覆培養面から剥離しない接着部分とが混在する端部が反り返った細胞構造体、の例が見られた。

（拍動の有無）
　実施例、比較例で得られた塊状の細胞構造体を、顕微鏡（ニコン社製、商品名「ＥＣＬＩＰＥＳ−Ｔｉ」）で観察した。その後、４８時間にわたって、観察を行った。そして、以下の基準で拍動の有無を評価した。
○（良好）：４８時間の観察期間中、当初は拍動が確認されたが、その後拍動が見られなくなった。
×（不良）：４８時間の観察期間中、毎回の観察で拍動が確認された。

　表５に示すように、実施例の細胞構造体は、細胞構造体形成直後は拍動していたものの、その後拍動が見られなり、心疾患モデルとして使用可能と判断した。一方比較例の細胞構造体は、４８時間の観察期間において、拍動が観察され、健常な心臓に近い形態と判断した。

［［発明（ＶＩＩ）の実施例］
　以下に、実施例に基づいて本発明（ＶＩＩ）をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。

（実施例ＶＩＩ−１）
　容量５０ｍＬの軟質ガラス製の透明なバイアル瓶に、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）１０．０ｇ、及び水５ｍＬを加えて、磁気撹拌器を用いて撹拌した。そして、この混合物（液体）に対してＧ１グレードの高純度（純度：９９．９９９９５％）の窒素ガスを１０分間パージ（流速：２．０Ｌ／分）することにより、この混合物を脱酸素した。なお、用いたＤＭＡＥＭＡには、重合禁止剤であるメチルヒドロキノン（ＭＥＨＱ）が０．５質量％含まれていた。
　その後、この反応物に対して、丸型ブラック蛍光灯（ＮＥＣ社製、型番：ＦＣＬ２０ＢＬ、１８Ｗ）を用いて、２２時間紫外線照射することにより、上記反応物を重合させた。反応物は、５時間後に粘性を帯び１５時間後に固化して、重合体が反応生成物として得られた。この反応生成物を２−プロパノールに溶解させ、溶液を透析チューブに移した。そして、透析を７２時間行い、反応生成物を精製した。
　反応生成物を含む溶液を、セルロース混合エステル製の０．２μｍフィルター（東洋濾紙社製、型番：２５ＡＳ０２０）で濾過し、得られた濾液を凍結乾燥させることにより、温度応答性（ホモ）ポリマーが得られた（収量：６．８ｇ、転化率：６８％）。このポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）を、ＧＰＣ（島津社製、型番：ＬＣ−１０ｖｐシリーズ）を用いて、ポリエチレングリコール（Ｓｈｏｄｅｘ社製、ＴＳＫシリーズ）を標準物質として測定し、Ｍｎ＝１．０×１０^５ｇ／ｍｏｌ（Ｍｗ／Ｍｎ＝１０．０）と決定した。

　上述の温度応答性ポリマーの核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）を、核磁気共鳴装置（Ｖａｒｉａｎ社製、型番：Ｇｅｍｉｎｉ３００）を用いて、重水（Ｄ_２Ｏ）を標準物質として測定した。下記には、代表的なピークを示す。
　^１Ｈ−ＮＭＲ（ｉｎ　Ｄ_２Ｏ）δ０．８−１．２（ｂｒ，−ＣＨ_２−Ｃ（ＣＨ_３）−），１．６−２．０（ｂｒ，−ＣＨ_２−Ｃ（ＣＨ_３）−），２．２−２．４（ｂｒ，−Ｎ（ＣＨ_３）_２），２．５−２．７（ｂｒ，−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）_２），４．０−４．２（ｂｒ，−Ｏ−ＣＨ_２−）．
　ここで、主鎖のメチル基（δ　０．８−１．２）のプロトン数（ＤＭＡＥＭＡのホモポリマーの場合はモノマー１分子につき３個）Ａと、側鎖のジメチルアミノ基（δ　２．２−２．４）のメチルプロトン数（ＤＭＡＥＭＡのホモポリマーの場合はモノマー１分子につき６個で）Ｂとから、側鎖が有するアミノ基の官能基数と、重合反応と同時に進行する側鎖のエステル結合の加水分解反応により生じた側鎖のカルボキシル基の官能基数との比を算出した。
　その結果、上述の温度応答性ポリマーの場合は９４：６となった。これは、カチオン性ポリマーとアニオン性ポリマーとを含む２成分混合系におけるイオン複合体で言うＣ／Ａ比に換算すると、Ｃ／Ａ比＝１５．６となる。

　上述の温度応答性ポリマーを、純水に溶解して、温度応答性ポリマー溶液（終濃度１５ｎｇ／μＬ）を調製した。３５ｍｍディッシュ（住友ベークライト社製、品名「ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ」（登録商標）、ＭＳ−９０３５Ｘ）の培養面上の８箇所に、温度応答性ポリマー溶液０．５μＬを、円形状に塗布した。
　１箇所あたりの円形の被覆培養面の直径は、約２，０００μｍであり、また、各被覆培養面間の距離は、約２，５００μｍであった。
　そして、インキュベーター（３７℃）中で３０分間放置することによって、塗布した温度応答性ポリマーの水溶液を乾燥させ、複数の被覆培養面を有する被覆細胞培養器を準備した。

　ヒト肝癌細胞（コスモバイオ社、品番「ＨｅｐＧ２−５００」）を、ＰＫＨ２６　Ｒｅｄ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｌｉｎｋｅｒ　Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ社製）を用いて、染色した。染色したヒト肝癌細胞１００個に対して、ＧＦＰ組換えルイスラット脂肪組織由来間葉系幹細胞（ＡＤＳＣ）３３個の割合で混合した混合細胞を、培地（ＤＭＡＥＭ＋１０％ＦＢＳ（ギブコ社製、ロット番号：７１５９２９）中に混ぜて調製した、３．２×１０^５個／ｍＬの混合細胞浮遊液２５μＬを被覆細胞培養器に加え、混合細胞を播種した。
　その後、細胞インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）中で、２時間培養し、新たな培地を用いて培地交換し、さらに細胞インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）中で、４８時間培養して、塊状の細胞構造体を得た。

（実施例ＶＩＩ−２）
　ヒト肝癌細胞１００個に対して、ＧＦＰ組換えルイスラット脂肪組織由来間葉系幹細胞を１０個の割合で混合したこと以外、実施例ＶＩＩ−１と同様にして塊状の細胞構造体を得た。

（実施例ＶＩＩ−３）
　ヒト肝癌細胞１００個に対して、ＧＦＰ組換えルイスラット脂肪組織由来間葉系幹細胞を５０個の割合で混合したこと以外、実施例ＶＩＩ−１と同様にして塊状の細胞構造体を得た。

（実施例ＶＩＩ−４）
　ヒト肝癌細胞１００個に対して、ＧＦＰ組換えルイスラット脂肪組織由来間葉系幹細胞を３３個、ルイスラット脂肪組織由来の接着性脂肪細胞を３３個、の割合で混合したこと以外、実施例ＶＩＩ−１と同様にして塊状の細胞構造体を得た。

（実施例ＶＩＩ−５）
　細胞には、肝細胞として実施例ＶＩＩ−１と同様にして染色したヒト肝癌細胞（ＨｅｐＧ２）、線維芽細胞としてＧＦＰ組換えルイスラット脂肪組織由来間葉系幹細胞（ＡＤＳＣ）、免疫系細胞としてマクロファージを使用した。マクロファージは、ラット骨髄由来の単球から分化誘導して使用した（コスモバイオ社製、骨髄単球培養キット、品番：ＢＭＭ０１）。
　第一段階として、ヒト肝癌細胞１００個に対して、ＧＦＰ組換えルイスラット脂肪組織由来間葉系幹細胞２５個の割合で混合した細胞を、実施例ＶＩＩ−１と同様にして播種し、５時間後に、細胞が接着して単層を形成した後に、培地交換を行った。この単層の上へ、ヒト肝癌細胞１００個に対して、マクロファージ５個の割合となるように、マクロファージを含むマクロファージ浮遊液を加え、静置培養を継続したこと以外、実施例ＶＩＩ−１と同様の操作を行なった。
　肝癌細胞と間葉系幹細胞からなる単層培養層が巾着袋状に凝集する際に、該単層培養層の上に沈降していたマクロファージは凝集に巻き込まれ、１個の塊状の細胞構造体を得た。露出した培養面にマクロファージは確認されず、播種したマクロファージの全数が細胞凝集塊中に取り込まれたことが確認された。

（比較例ＶＩＩ−１）
　ヒト肝癌細胞１００個に対して、ＧＦＰ組換えルイスラット脂肪組織由来間葉系幹細胞を３００個の割合で混合したこと以外、実施例ＶＩＩ−１と同様にして塊状の細胞構造体を得た。

（比較例ＶＩＩ−２）
　ヒト肝癌細胞１００個に対して、ＧＦＰ組換えルイスラット脂肪組織由来間葉系幹細胞を１００個の割合で混合したこと以外、実施例ＶＩＩ−１と同様にして塊状の細胞構造体を得た。

（比較例ＶＩＩ−３）
　ＧＦＰ組換えルイスラット脂肪組織由来間葉系幹細胞を混ぜずに、ヒト肝癌細胞のみから細胞溶液を調製したこと以外、実施例ＶＩＩ−１と同様にして塊状の細胞構造体を得た。

（比較例ＶＩＩ−４）
　ヒト肝癌細胞１００個に対して、ＧＦＰ組換えルイスラット脂肪組織由来間葉系幹細胞を５個の割合で混合したこと以外、実施例ＶＩＩ−１と同様にして塊状の細胞構造体を得た。

（比較例ＶＩＩ−５）
　ヒト肝癌細胞１００個に対して、ＧＦＰ組換えルイスラット脂肪組織由来間葉系幹細胞を６７個の割合で混合したこと以外、実施例ＶＩＩ−１と同様にして塊状の細胞構造体を得た。

［評価］
（細胞構造体の外観）
　実施例、比較例で得られた塊状の細胞構造体（培養４８時間後）を、顕微鏡（ニコン社製、商品名「ＥＣＬＩＰＥＳ−Ｔｉ」）で観察し、以下の基準で細胞の外観を評価した。
○（良好）：８箇所全ての被覆培養面において、球形の塊状の細胞構造体が得られた。
△（不良）：８箇所のいずれかの被覆培養面において、被覆培養面に接着した細胞が凝集せず単層のまま、又は凝集する部分と被覆培養面から剥離しない接着部分とが混在する端部が反り返った細胞構造体、の例が見られた。

（細胞構造体中の細胞の形態）
　播種、培養した細胞を、培養２時間後に、顕微鏡（ニコン社製、商品名「ＥＣＬＩＰＥＳ−Ｔｉ」）で観察したところ、被覆培養面に接着していた。接着した細胞のうち、肝細胞の形態を、以下の基準で評価した。なお、何れの例においても、播種する肝細胞（被覆培養面に接着する前の肝細胞）の形態は、敷石状であった。
○（良好）：多くの肝細胞の形態が変化し、紡錘形の線維芽細胞様の形態をしていた。
×（不良）：肝細胞の形態の変化は見られなかった。

　表６に示すように、特定の割合で肝細胞と線維芽細胞とを混合した実施例の細胞構造体では、肝細胞の形態が敷石状から線維芽細胞様へと変化していた。そのため、実施例の細胞構造体に含まれる肝細胞は、浸潤性がより高く、悪性度の高いがん細胞へと変化しており、肝不全モデルとして使用可能と判断した。なお、各実施例の細胞構造体を崩して培養皿に再播種し、形態を観察したところ、肝細胞は線維芽細胞様の形態をしていた。
　一方、比較例の細胞構造体中の肝細胞の形態は、敷石状のまま変化は見られなかった。なお、比較例の細胞構造体を崩して培養皿に再播種し、形態を観察したところ、肝細胞は敷石状の形態をしていた。

　本発明によれば、細胞塊、細胞構造体、又は立体組織体を効率よく製造する方法を提供することができる。
　特に、本発明（Ｉ）によれば、関節、気管、鼻等の治療に有用な軟骨細胞塊及び移植材料を簡便に製造することができる。また、本発明（ＩＩ）によれば、上皮系細胞を容易に培養することができ、また、上皮系細胞を含む細胞構造体を容易に製造することができ、また、上皮系細胞の培養及びその細胞構造体の製造が可能である。また、本発明（ＩＩＩ）によれば、容易にリング状又は管腔状等の立体組織体を作製することができる。また、容易にリング状又は管腔状等の立体組織体を作製することができる。また、本発明（ＩＶ）によれば、所望のサイズの形状の整ったスフェロイド状の細胞構造体を簡便に製造することができる。また、本発明（Ｖ）によれば、細胞の凝集様式を制御して、所望の形態の細胞構造体を製造することができる。また、本発明（ＶＩ）によれば、心疾患モデルとして有用な、心筋細胞と線維芽細胞とを含む細胞構造体を容易に形成することができる。また、本発明（ＶＩＩ）によれば、肝不全モデルとして有用な、肝細胞と線維芽細胞とを含む細胞構造体を容易に形成することができる。

Claims

　温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物で被覆された被覆培養面において、細胞塊の存在下、軟骨細胞に分化し得る細胞を播種し、前記細胞塊及び前記軟骨細胞に分化し得る細胞を培養することによって、軟骨細胞塊を調製する、播種培養工程を含むことを特徴とする、軟骨細胞塊の製造方法。
　前記細胞塊を、前記軟骨細胞に分化し得る細胞を播種し、これを培養することによって、調製する、請求項１に記載の軟骨細胞塊の製造方法。
　前記播種培養工程を複数回行う、請求項１又は２に記載の軟骨細胞塊の製造方法。
　前記被覆培養面は、細胞非接着性の壁で囲まれている、請求項１~３のいずれか一項に記載の軟骨細胞塊の製造方法。
　前記被覆培養面の幅を３ｍｍ以下として、前記壁の高さを３ｍｍ以下とする、請求項４に記載の軟骨細胞塊の製造方法。
　前記被覆培養面が単位面積当たりに有する前記温度応答性ポリマー及び温度応答性ポリマー組成物の量を、０．１~３．０μｇ／ｃｍ^２とする、請求項１~５のいずれか一項に記載の軟骨細胞塊の製造方法。
　前記播種培養工程において、前記軟骨細胞に分化し得る細胞を、０．３×１０^４~１０．０×１０^５個／ｃｍ^２の細胞密度で播種する、請求項１~６のいずれか一項に記載の軟骨細胞塊の製造方法。
　請求項１~７のいずれか一項に記載の軟骨細胞塊の製造方法により製造されたことを特徴とする、軟骨細胞塊。
　ドーナツ形である、請求項８に記載の軟骨細胞塊。
　請求項８又は９に記載の軟骨細胞塊の存在下、間葉系細胞を播種し、前記軟骨細胞塊及び前記間葉系細胞を培養することによって、移植材料を調製する、工程を含むことを特徴とする、移植材料の製造方法。
　請求項１０に記載の移植材料の製造方法により製造されたことを特徴とする、移植材料。
　請求項９に記載の軟骨細胞塊が管状構造体の外表面に設けられていることを特徴とする、複合材。
　前記管状構造体の内部に芯材が設けられている、請求項１２に記載の複合材。
　温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を調製する、調製工程と、
　前記温度応答性ポリマー又は前記温度応答性ポリマー組成物で、細胞培養器の培養面の少なくとも一部を被覆して被覆領域Ａを形成し、被覆領域Ａを有する被覆細胞培養器を準備する、培養器準備工程と、
　上皮系細胞を前記被覆細胞培養器に播種する、播種工程と、
　前記被覆領域Ａに接着した前記上皮系細胞を培養する、培養工程と、
を含み、
　前記被覆領域Ａにおける前記温度応答性ポリマー又は前記温度応答性ポリマー組成物の濃度が、０．３ｐｇ／ｍｍ^２以上であることを特徴とする、上皮系細胞の培養方法。
　前記細胞培養器の培養面の少なくとも一部に窪み部を有しており、前記被覆領域Ａ内に前記窪み部がある、請求項１４に記載の上皮系細胞の培養方法。
　温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を調製する、調製工程と、
　前記温度応答性ポリマー又は前記温度応答性ポリマー組成物で、細胞培養器の培養面の少なくとも一部を被覆して被覆領域Ａを形成し、被覆領域Ａを有する被覆細胞培養器を準備する、培養器準備工程と、
　上皮系細胞を前記被覆細胞培養器に播種する、播種工程と、
　前記上皮系細胞から塊状の細胞構造体を形成し、前記被覆領域Ａに接着した細胞構造体を得る、培養工程と、
を含み、
　前記被覆領域Ａにおける前記温度応答性ポリマー又は前記温度応答性ポリマー組成物の濃度が、０．３ｐｇ／ｍｍ^２以上であることを特徴とする、細胞構造体の製造方法。
　前記培養器準備工程において、前記温度応答性ポリマー又は前記温度応答性ポリマー組成物で、細胞培養器の培養面の少なくとも一部であって、前記被覆領域Ａとは異なる位置に、被覆領域Ｂを形成し、
　前記被覆領域Ｂにおける前記温度応答性ポリマー又は前記温度応答性ポリマー組成物の濃度が、２００ｐｇ／ｍｍ^２未満である、請求項１６に記載の細胞構造体の製造方法。
　前記細胞培養器の培養面の少なくとも一部に窪み部を有しており、前記被覆領域Ａ内に前記窪み部がある、請求項１６又は１７に記載の細胞構造体の製造方法。
　培養面の少なくとも一部に、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物で被覆された被覆領域Ａを有し、
　前記被覆領域Ａにおける前記温度応答性ポリマー又は前記温度応答性ポリマー組成物の濃度が、０．３ｐｇ／ｍｍ^２以上であることを特徴とする、上皮系細胞用細胞培養器。
　培養面の少なくとも一部であって、前記被覆領域Ａと異なる位置に、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物で被覆された被覆領域Ｂを有し、
　前記被覆領域Ｂにおける前記温度応答性ポリマー又は前記温度応答性ポリマー組成物の濃度が、２００ｐｇ／ｍｍ^２未満である、請求項１９に記載の上皮系細胞用細胞培養器。
　前記細胞培養器の培養面の少なくとも一部に窪み部を有しており、前記被覆領域Ａ内に前記窪み部がある、請求項１９に記載の上皮系細胞用細胞培養器。
　少なくとも１個の貫通孔を有する培養面と、前記貫通孔を挿通する心棒とからなる立体組織体の作製装置であって、
　前記培養面に温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物で被覆された被覆培養面を少なくとも１つ含み、
　１つの前記被覆培養面の内側に、少なくとも１個の前記貫通孔を有し、
　前記培養面が前記心棒の延在方向に可動であることを特徴とする、立体組織体の作製装置。
　複数の前記培養面を有し、
　１本の前記心棒が、前記複数の前記培養面の前記貫通孔を挿通している、請求項２２に記載の立体組織体の作製装置。
　請求項２２又は２３に記載の立体組織体の作製装置を用いた立体組織体の作製方法であって、
　前記被覆培養面上に少なくとも１種の細胞を播種する、播種工程と、
　播種した前記細胞を培養して、前記心棒の周囲に巻き付いたリング状の立体組織体を得る、培養工程と、
を含むことを特徴とする、立体組織体の作製方法。
　心棒の周囲に巻き付いたリング状の立体組織体が得られた後に、前記培養面を前記心棒の延在方向に移動させる培養面移動工程と、
　移動後の前記被覆培養面上に少なくとも１種の細胞を播種する、播種工程と、
　播種した前記細胞を培養して、心棒の周囲に巻き付いたリング状の前記立体組織体に隣接する、心棒の周囲に巻き付いたリング状の立体組織体を得る、培養工程と、
の繰り返しを更に含む、請求項２４に記載の立体組織体の作製方法。
　全ての前記被覆培養面に前記細胞を播種し、播種した前記細胞を培養して立体組織体を得る、請求項２４又は２５に記載の立体組織体の作製方法。
　前記播種工程において播種した前記細胞を含む立体組織体を得る、請求項２４~２６のいずれか一項に記載の立体組織体の作製方法。
　前記培養工程の後に、前記細胞を除去して、
　前記細胞から分泌された物質を含む立体組織体を得る、請求項２４~２６のいずれか一項に記載の立体組織体の作製方法。
　前記物質がタンパク質である、請求項２８に記載の立体組織体の作製方法。
　培養面に温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物で被覆された被覆領域を調製し、該被覆領域に細胞懸濁液の液滴を形成し、該液滴中で細胞培養を行い、
　ここで、前記被覆領域の表面ゼータ電位を０~５０ｍＶとする
ことを特徴とする、細胞構造体の製造方法。
　前記被覆領域に対する水の接触角を５０~９０°とする、請求項３０に記載の細胞構造体の製造方法。
　前記培養面に複数の前記被覆領域を調製する、請求項３０又は３１に記載の細胞構造体の製造方法。
　前記被覆領域に複数の前記液滴を形成する、請求項３０~３２のいずれか一項に記載の細胞構造体の製造方法。
　各前記被覆領域において、前記液滴の底面積を前記被覆領域の面積よりも小さくする、請求項３０~３３のいずれか一項に記載の細胞構造体の製造方法。
　前記液滴に含まれる細胞の数を３．０×１０^５個／ｍＬ以下とする、請求項３０~３４のいずれか一項に記載の細胞構造体の製造方法。
　前記液滴の径を１μｍ~８ｍｍとする、請求項３０~３５のいずれか一項に記載の細胞構造体の製造方法。
　前記液滴の量を０．５~５０μＬとする、請求項３０~３６のいずれか一項に記載の細胞構造体の製造方法。
　細胞培養器の培養面に、
　温度応答性ポリマー及び／又は温度応答性ポリマー組成物で被覆された第一被覆領域と、
　前記第一被覆領域の端部に設けられた、細胞接着性物質で被覆された複数の第二被覆領域と
を準備する、準備工程と、
　細胞を前記第一被覆領域及び前記第二被覆領域に播種し、前記細胞を培養することによって、細胞構造体を調製する、播種培養工程と
を含むことを特徴とする、細胞構造体の製造方法。
　前記培養面を、細胞非接着性とする、請求項３８に記載の細胞構造体の製造方法。
　前記細胞接着性物質を、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチンからなる群から選択される少なくとも１種とする、請求項３８又は３９に記載の細胞構造体の製造方法。
　前記第一被覆領域及び前記第二被覆領域が占める領域を、細胞非接着性の壁で囲む、請求項３８~４０のいずれか一項に記載の細胞構造体の製造方法。
　前記第一被覆領域を、所定方向に延びる形状とし、前記第一被覆領域の前記端部を、前記所定方向についての端部とする、請求項３８~４１のいずれか一項に記載の細胞構造体の製造方法。
　請求項３８~４２のいずれか一項に記載の細胞構造体の製造方法により製造されたことを特徴とする、細胞構造体。
　培養面に、
　温度応答性ポリマー及び／又は温度応答性ポリマー組成物で被覆された第一被覆領域と、
　前記第一被覆領域の端部に設けられた、細胞接着性物質で被覆された複数の第二被覆領域と
を有することを特徴とする、細胞培養器。
　温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を調製する、調製工程と、
　前記温度応答性ポリマー又は前記温度応答性ポリマー組成物で、細胞培養器の培養面を被覆して、被覆細胞培養器を準備する、培養器準備工程と、
　心筋細胞と、前記心筋細胞１００個に対して２００~３００個の割合の線維芽細胞を前記被覆細胞培養器に播種する、播種工程と、
　播種した細胞を培養して塊状の細胞構造体を得る、培養工程と
を含むことを特徴とする、細胞構造体の製造方法。
　前記播種工程において、血管内皮細胞をさらに播種する、請求項４５に記載の細胞構造体の製造方法。
　前記播種工程以降であって、前記細胞構造体が得られる前に、免疫系細胞を前記被覆細胞培養器にさらに添加する、請求項４５又は４６に記載の細胞構造体の製造方法。
　前記免疫系細胞が、マクロファージ及び／又はＴ細胞である、請求項４７に記載の細胞構造体の製造方法。
　前記温度応答性ポリマー又は前記温度応答性ポリマー組成物で被覆された部分の面積が２００ｍｍ^２以下である、請求項４５~４８のいずれか一項に記載の細胞構造体の製造方法。
　温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を調製する、調製工程と、
　前記温度応答性ポリマー又は前記温度応答性ポリマー組成物で、細胞培養器の培養面を被覆して、被覆細胞培養器を準備する、培養器準備工程と、
　肝細胞と、前記肝細胞１００個に対して１０~５０個の割合の線維芽細胞を前記被覆細胞培養器に播種する、播種工程と、
　播種した細胞を培養して塊状の細胞構造体を得る、培養工程と
を含むことを特徴とする、細胞構造体の製造方法。
　前記播種工程において、血管内皮細胞をさらに播種する、請求項５０に記載の細胞構造体の製造方法。
　前記播種工程において、脂肪細胞をさらに播種する、請求項５０又は５１に記載の細胞構造体の製造方法。
　前記播種工程において、前記肝細胞１００個に対して前記脂肪細胞を１０~５０個の割合で、且つ前記線維芽細胞１００個に対して前記脂肪細胞を１００~５００個の割合で播種する、請求項５２に記載の細胞構造体の製造方法。
　前記播種工程以降であって、前記細胞構造体が得られる前に、免疫系細胞を前記被覆細胞培養器にさらに添加する、請求項５０~５３のいずれか一項に記載の細胞構造体の製造方法。
　前記免疫系細胞が、単球、顆粒球、リンパ球、及びマクロファージからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項５４に記載の細胞構造体の製造方法。