WO2004092359A1 - 移植用軟骨細胞の製法 - Google Patents

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    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/06—Materials or treatment for tissue regeneration for cartilage reconstruction, e.g. meniscus

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing normal human chondrocytes and a normal human chondrocyte obtained by such a method.
  • the present invention also relates to a cartilage treatment material using the thus obtained normal human chondrocytes.
  • transplantation treatment especially autologous chondrocyte transplantation, has been considered for the treatment of diseases related to cartilage. It has been experimentally confirmed that transplantation treatment by this method is possible when a large amount of cells such as rabbits, eagle, etc. are obtained other than humans (eg, Ben try, et al. al., Nature 230: 385-388 (1971), Green, CI in.Ort op.124: 237-250 (1977), Wakitani et al., J.
  • the inventor of the present invention rapidly and in large quantities allows human chondrocytes to co-culture with cartilage peripheral cells at the chondrogenic stage as feeder cells that support the ability of proliferating cartilage cells. Proposed to cultivate cells (W0 02/12451 (2002)) o However, using feeder cells from animals other than humans is problematic due to infection by bacteria and unexpected viruses. A complicated process was necessary to prevent it. Related literature
  • An object of the present invention is to provide a method for obtaining normal chondrocytes or a cell mass thereof in rabbit chondrocytes without fear of infection by bacteria / viruses and in large quantities.
  • Another object of the present invention is to provide a cartilage therapeutic material using the normal human chondrocytes or the cell masses thus obtained. That is, the present invention is as follows.
  • a method for producing rabbit chondrocytes characterized by culturing chondrocytes obtained from cartilage having perichondrium together with perichondrium.
  • a cartilage therapeutic material comprising human soft bone cells alone or the chondrocytes and an embedding material obtained by the production method according to the above (1) to (4).
  • the embedding material is collagen, polydalicolic acid, polylactic acid, alginic acid, polyethylene oxide, fibrin adhesive, polylactic acid / polyglycolic acid copolymer, proteodalycan, darcosaminoglycan or human dermis.
  • Fig. 1 is a photograph showing a sheet-like gel mass obtained after two weeks of culturing of chondrocytes obtained in subculture.
  • Fig. 2 is a photograph showing the result of staining the gel-like chondrocyte mass of Fig. 1 with hematoxylin-eosin.
  • Figure 3 is a photograph showing the results of immunostaining for type I I collagen, a molecular marker for cartilage tissue.
  • Fig. 4 is a photograph showing the results of partial extraction from the transplant site and staining with hematoxylin azine (H. E).
  • Fig. 5 is a photograph showing the result of immunostaining of type I I collagen, a molecular marker of cartilage tissue, partially collected from the transplant site.
  • Fig. 6 is a photograph showing the result of toluidine blue staining after partial extraction from the transplant site.
  • the present inventor has further improved the previously proposed method using feeder cells (W02 / 12451 (2002)), which makes it easier to use chondrocytes such as auricular cartilage without using feeder cells.
  • the method of the present invention can be simplified by avoiding complicated operations when using a feeder cell, and can also avoid the risk of infection from the feeder cell, and is optimal for self-transplantation into chicken. It can be said that it is safe.
  • rabbit chondrocytes proliferated by such a method can be further cultivated to form a cartilage mass, which can be used for transplantation treatment without a supporting substance.
  • the rabbit cartilage used in the present invention is auricular cartilage
  • the collected cartilage tissue at this time preferably has a perichondrium attached to one side. As a result of this operation, the cartilage collection site is quickly regenerated from the remaining perichondrium, and the entire healing is performed faster.
  • the collected auricular cartilage with perichondrium is finely cut (dice) and monolayer culture is started. It is preferable to add a cytokin necessary for the growth of chondrocytes to the medium used at this time.
  • This monolayer culture alone can be transplanted, By carrying out multi-layer culture several times using cells grown in this monolayer culture, it has physical strength that can be handled with tweezers and other instruments, and is not dispersed or absorbed when transplanted into a living body. Get an organization. The number of seeding of the stratification varies depending on the desired tissue size, but generally 3 to 4 times are preferable.
  • This tissue is placed in a syringe and attached to the cartilage defect site after attaching an injection needle, deformed nose, raised nose, facial bone deformity, facial bone defect, wrinkle formation, skull deformation, skull defect, deformation It can be used for the treatment and repair of osteoarthritis, microtia, other diseases with cartilage loss, and cartilage defects.
  • collagen polyglycolic acid (PGA), polylactic acid, alginate, polyethyleneoxide, fibrin adhesive, polylactic acid as a carrier in this cartilage tissue -Polyglycolic acid copolymer, proteoglycans, and glucosaminoglycan may be used in combination.
  • the chondrocytes obtained by the production method of the present invention can be put to practical use without a carrier.
  • the method for producing chondrocytes of the present invention can be used for culturing chondrocytes of human cartilage tissue with attached perichondrium, such as auricular cartilage, costal cartilage, articular cartilage, intervertebral cartilage and tracheal cartilage. It is particularly suitable for the culture and proliferation of auricular cartilage chondrocytes.
  • Chondrocytes used in the production method of the present invention can be obtained from human cartilage tissue to which perichondrium is attached by a known method.
  • the extracted cartilage tissue is preferably minced with a scalpel or the like, treated with collagenase, and cultured and grown.
  • a specific example of this process is as follows.
  • chondrocytes can be obtained from a 1 cm 2 human auricular cartilage tissue in the first passage.
  • a known growth factor particularly one that stimulates the growth of cartilage, for example, FGF (eg bFGF), IGF (eg IGF-1) and bone morphogenetic factor 9 (BMP9) is appropriately selected. Or can be used in combination.
  • chondrocytes For the culture of human chondrocytes, a known medium suitable for the culture of chondrocytes can be used. In addition to urine fetal serum (FBS), rabbit serum, and hydrocortisone, growth factors such as human bFGF and human IGF-1 are appropriately added to the medium (Cuevas et al., Biochem. Biophy. Res. Commun. 156, 611-18, 1988; Froger_Gai 11 ard et al., Endocrinol.
  • FBS urine fetal serum
  • rabbit serum rabbit serum
  • hydrocortisone growth factors such as human bFGF and human IGF-1 are appropriately added to the medium (Cuevas et al., Biochem. Biophy. Res. Commun. 156, 611-18, 1988; Froger_Gai 11 ard et al., Endocrinol.
  • ME (H) medium contains FBS (preferably 10 %), Human bFGF (preferably And a medium supplemented with hydrocortisone (preferably 40 ng / ml) and human IGF-1 (preferably 5 ng / ml).
  • FBS preferably 10 %
  • Human bFGF preferably And a medium supplemented with hydrocortisone (preferably 40 ng / ml)
  • human IGF-1 preferably 5 ng / ml.
  • patient-derived autologous serum can also be used, and thus safety can be improved.
  • a specific example of the culture method of the present invention is as follows.
  • chondrocytes placed medium and cultured chondrocytes conditions suitable for culturing (e.g., 3 7 ° C, 1 0% C0 2 under) carbon dioxide incubator in at. Incubate until the proliferated cells are monolayered and confluent (usually between 10 and 14 days).
  • medium and cultured chondrocytes conditions suitable for culturing e.g., 3 7 ° C, 1 0% C0 2 under
  • Subculture can be performed in the same medium as the primary culture (usually 1 day for 7 days).
  • the number of cells in the auricular cartilage increases by about 100-fold in P0 (primary culture) ⁇ P4.
  • the number of passages can be appropriately increased.
  • a gelatinous chondrocyte mass can be obtained by seeding and culturing rabbit chondrocytes obtained by subculture one or more times, preferably 3 to 4 times.
  • human chondrocytes are surrounded by a cartilage matrix containing aggrecan and the like, and chondrocytes are bonded together via a matrix such as aggrecan to form a gel-like cell mass.
  • C. Cartilage treatment material The subcultured or multi-layered human chondrocytes or cell mass obtained by the present invention can be used as they are or embedded in a biomaterial and used as a cartilage treatment material for transplantation.
  • carriers that embed human chondrocytes or cell clusters include collagen, polyglycolic acid (PGA), polylactic acid, alginate, polyethyleneoxide, fibrin Adhesives, polylactic acid-polyglycolic acid copolymers, proteoglycans, and glucosaminoglycan may be used in combination.
  • the cartilage therapeutic material can induce not only cartilage but also endochondral ossification by appropriately selecting and combining carriers for embedding chondrocytes.
  • the carrier that can induce such endochondral ossification includes, for example, human dermis, and further promotes ossification using growth factors that promote bone formation, such as bone morphogenetic factor (BMP).
  • BMP bone morphogenetic factor
  • DME (H) medium was supplemented with 10% FBS, 10 ng / ml human FGF (Kaken Pharmaceutical), 40 ng / nil Hydrocort isone (Sigma), and 5 ng / ml human IGF-1 (GIBC0) .
  • the cartilage fragments obtained above were sterilized with penicillin G (800u / ml), kanamycin (lmg / ml) and fungison (2.5ug / ml), then minced with mess, The cells were allowed to stand at 4 ° C in F-12 medium containing 03% collagenase typell (Wor thingt on Biochemical). The next day, the mixture was shaken at 37 ° C for 4 hours and then centrifuged, and the precipitate was used as a cell fraction at the start of culture.
  • the cell fraction was seeded in a flask having a bottom area of 75 cm 2 using the medium.
  • the flask was cultured by setting C0 2 concentration to 1 0% in C0 2 Incubator.
  • the medium was changed twice a week. As a result, the cartilage cells became confluent in a monolayer after 10 to 14 days of culture. The obtained cells were used for the next subculture.
  • the subculture was performed under the same conditions as the primary culture by seeding 1 ⁇ 10 6 cells of the primary culture in a flask having a bottom area of 1 75 cm 2 . After 7 days of culture, the cells became monolayered and used for the next subculture. As a result, the number of cells increased about 100 times that of the first generation at the fourth passage.
  • chondrocytes obtained at a density of 1 XI 0 6 cells / cm 2 in subculture was performed. After 2 weeks of culture, A gel-like gel mass was formed (Fig. 1). When this gel-like chondrocyte mass was stained with hematoxylin-eosin (H.E), it was shown that the cells were stratified and bound to each other via a substrate (Fig. 2). In addition, when immunostaining was performed on type II collagen, a molecular marker for cartilage tissue, the extracellular matrix was stained, indicating that the extracellular matrix was a substrate specific to cartilage (Fig. 3).
  • H.E hematoxylin-eosin
  • the cells were collected with a cell line, and the collected cells were collected by aspiration into an injection or the like.
  • the chondrocytes in the collected syringe were injected into the cartilage defect site of nude mice using an injection needle.
  • a part was collected from the transplantation site, examined histologically, and confirmed to have been engrafted. That is, when the collected tissue was stained with hematoxylin eosin (H.E), it was shown that the cells were stratified and the cells were bound to each other through the substrate (FIG. 4).

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Abstract

本発明は、ヒトの軟骨細胞を、細菌・ウイルスによる感染の恐れがなく、しかも、迅速かつ大量に正常な軟骨細胞またはその細胞塊を得る方法を提供することを目的とし、　軟骨膜を有する軟骨から得られる軟骨細胞、例えば耳介軟骨を軟骨膜と共に培養することを特徴とするヒト軟骨細胞の製法であり、また、培養細胞を単層的または重層的に１回または２回以上播種して培養し、軟骨細胞塊を得ることを特徴とするヒト軟骨細胞の製法である。

Description

明細書
移植用軟骨細胞の製法 技術分野
本発明は、 正常ヒ ト軟骨細胞の製法およびかかる製法により得 られる正常ヒ ト軟骨細胞に関する。 また、 本発明は、 かく して得 られた正常ヒ ト軟骨細胞を用いた軟骨治療材に関する。 背景技術
軟骨細胞は組織中では基質の中に細胞が包埋された状態で存 在しており、 酵素、 例えばコラゲナ一ゼで軟骨を処理して、 基質 成分から軟骨細胞を単離することができる。 この単離した軟骨細 胞を利用して、 軟骨に関わる疾患の治療に対し、 移植治療、 特に 軟骨細胞の自家移植が考えられてきた。 ヒ ト以外の動物、 例えば ゥサギ、 ゥシ等の如く多量の細胞が得られる場合については、 こ の方法による移植治療が可能であることが実験的に確認されて いる（例えば、 Ben try, et al. , Nature 230: 385-388 ( 1971) , Green, CI in. Ort op. 124:237-250 (1977) , Wakitani et al. , J. Bone and Joint Surgery 71B: 74-80 (1989) , Paige et al. , Plastic and Reconstructive Surgery 96: 1390-1398 (1995) , Paige et al. , Plastic and Reconstructive Surgery 97: 168-178 (1996) ) 。
これまで、 ヒ トにおいても関節軟骨、 耳介軟骨および肋軟骨等 の軟骨細胞の培養が試みられてきた （Aulthouse et al.， In Vitro Cellular & Developmental Biology 25: 659-668 ( 1989) , Brr i t tberg et al. , The New England Journal of Medicine 331: 889-895 (1994) , Ting et al. , Annals of Plastic Surgery 40: 413-421 (1998) , Rodriguez et al. , Plastic and Reconstructive Surgery 103 : 1111-1119 (1999) )。
しかしながら、 ヒ 卜ではわずかの量の軟骨しか採取できないた め、 培養開始時に僅かな数の軟骨細胞しか用いることができない 上に、 ヒ ト軟骨細胞は従来の培養法では増殖が著しく少なく、 更 に増殖すると軟骨細胞から繊維芽細胞に形質を変えてしまうた めに移植治療の実用に供することは極めて困難であった。 即ち、 ヒ トにおいては、 移植のために大量の正常な軟骨細胞が必要であ るにもかかわらず、 充分な量の軟骨細胞を得ることができないと いう問題があった。
この問題を解決するために、 本発明者はヒ ト軟骨細胞を軟骨細 胞増殖能を支持するフィーダ一細胞として軟骨形成期の軟骨周 辺細胞と共培養することにより迅速且つ大量にヒ ト軟骨細胞を 培養することを提案した (W0 02/ 12451 (2002) )o しかし、 ヒ ト 以外の動物のフィーダ一細胞を使用することは、 細菌や不測のゥ ィルスによる感染の問題があり、 それを防ぐために煩雑な処理が 必要であった。 関連文献
1. Bentry, et al. , Nature 230: 385-388 (1971)
2. Green, Clin. Orthop. 124:237-250 (1977)
3. Wakitani et al. , J. Bone and Joint Surgery 71B: 74-80 (1989)
4 . Paige et al. , Plastic and Reconstructive Surgery 96:1390-1398 ( 1995)
5 . Paige et al. , Plastic and Reconstructive Surgery
97: 168-178 (1996)
6 . Aul thouse et al. , In Vitro Cellular & Developmental
Biology 25: 659-668 ( 1989)
7. Brr i t tberg et al. , The New England Journal of Medicine 331: 889-895 ( 1994)
8. Ting et al. , Annals of Plastic Surgery 40: 413-421 (1998)
9 . Rodriguez e t al. , Plastic and Reconstructive Surgery
103: 1111-1119 (1999)
10. WO 02/ 12451 (2002) 発明の開示
本発明は、 ヒ 卜の軟骨細胞を、 細菌 · ウィルスによる感染の恐 れがなく、 しかも、 迅速かつ大量に正常な軟骨細胞またはその細 胞塊を得る方法を提供することを目的とする。 また、 本発明は、 かく して得られた正常ヒ ト軟骨細胞またはその細胞塊を用いた 軟骨治療材を提供することを目的とする。 即ち、 本発明は次の通 りである。
( 1 ) 軟骨膜を有する軟骨から得られる軟骨細胞を軟骨膜と共に 培養することを特徴とするヒ 卜軟骨細胞の製法。
( 2 ) 該軟骨が、 耳介軟骨であることを特徴とする （ 1 ) に記載 の製法。
( 3 ) 培養細胞を単層的または重層的に 1 回または 2回以上播種 して培養し、 軟骨細胞塊を得ることを特徴とする （ 1 ) の製法。 ( 4 ) 培養細胞を単層的または重層的に 1回または 2回以上播種 して培養し、 軟骨細胞塊を得ることを特徴とする （ 2 ) 記載の製 法。
( 5 ) 前項 （ 1 ) 乃至 （ 4 ) に記載の製法により得られるヒ ト軟 骨細胞単独または該軟骨細胞と包埋材料とからなる軟骨治療材。
( 6 )該包埋材料が、 コラーゲン、 ポリダリコール酸、 ポリ乳酸、 アルギン酸、 ポリエチレンォキシド、 フイブリ ン接着剤、 ポリ乳 酸 · ポリグリコール酸共重合体、 プロテオダリカン、 ダルコサミ ノグリカンまたはヒ トの真皮の一種又は二種以上から選ばれる 請求項 5に記載の軟骨治療材。 図面の簡単な説明
図 1 は、 継代培養において得られた軟骨細胞を 2週間の重層培 養後に得られた、 シート状のゲル塊を示す写真である。
図 2 は、 図 1 のゲル状の軟骨細胞塊についてへマ トキシリ ン一 ェォジンで染色した結果を示す写真である。
図 3は、 軟骨組織の分子マーカーである I I 型コラーゲンにつ いて免疫染色を行った結果を示す写真である。
図 4は、 移植部位から一部採取して、 へマトキシリ ン一ェォジ ン（H. E)染色した結果を示す写真である。
図 5は、 移植部位から一部採取して、 軟骨組織の分子マーカー である I I 型コラーゲンについて免疫染色を行った結果を示す写 真である。
図 6は、 移植部位から一部採取して、 トルイジン · ブルー染色 を行った結果を示す写真である。 発明を実施するための最良の形態
本発明者は、 先に提案したフィーダ一細胞を用いる方法 （W0 02 / 1245 1 (2002) ) を更に改良し、 耳介軟骨等の軟骨細胞を、 フ ィーダ一細胞を用いることなく、 より簡便に培養し増殖させる方 法を見出した。 従来は、 軟骨細胞の培養 · 増殖にはフィーダ一細 胞が必要であると考えられていたが、 本発明者は、 フィーダ一細 胞を用いずとも、 軟骨細胞の培養 · 増殖が可能であることを見出 した。 かく して、 本発明の方法は、 フィーダ一細胞を用いる場合 の煩雑な操作を回避でき簡便化できるとともに、 フィーダ一細胞 からの感染等の危険も回避でき、 ヒ 卜への自家移植に最適で安全 なものと言える。
また、 かかる方法で増殖させたヒ 卜軟骨細胞を更に重層培養し て軟骨塊とし、 これを支持物質無しで移植治療に用いることが可 能であることも見出した。
本発明で用いるヒ 卜軟骨が耳介軟骨である場合は、 美容的配慮 から耳介後部基部より僅かな皮膚切開で少量 ( 1 X 1平方センチ 程度） の軟骨組織を採取することが好ましい。 この時の採取軟骨 組織は片面に軟骨膜が付着していることが好ましい。 この操作に より、 軟骨採取部位は残されたもう片面の軟骨膜より軟骨が素早 く再生され治癒全体も早く行われる結果となる。
次に必要な移植用細胞を得るため、 採取された軟骨膜付き耳介 軟骨を細かく切断し （d i c e)、 単層培養を開始する。 この時に使用 する培地には軟骨細胞の増殖に必要なサイ トカイ ンを添加する ことが好ましい。 この単層培養だけでも移植可能であるが、更に、 この単層培養で増殖した細胞を用いて数回に渡り重層培養を行 う ことにより、 ピンセッ ト等の器具で取り扱える程度の物理的強 度を有し、 且つ生体に移植した時に分散 · 吸収されない組織を得 ることができる。 重層の播種回数は、 所望する組織の大きさによ つて異なるが、 一般的には 3〜 4回が好ましい。
この組織は、 注射筒等に入れ、 注射針を付けてから軟骨欠損部 位に注入して鼻の変形、 隆鼻、顔面骨変形、顔面骨欠損、 頤形成、 頭蓋骨変形、 頭蓋部欠損、 変形性関節症、 小耳症、 その他軟骨欠 損を伴う疾患や軟骨欠損部の治療 · 修復に供することができる。 この時に、 この軟骨組織にキャリア一としてコラーゲン、 ポリグ リ コール酸 (PGA ； polygycol ic acid)、 ポリ乳酸 （polylact ic acid)、 アルギン酸塩（Alginate)、 ポリエチレンォキシド、 フィ ブリ ン接着剤、 ポリ乳酸ーポリグリ コール酸共重合体、 プロテオ ダ リ カ ン (proteoglycans) 、 グ リ コ サ ミ ノ ダ リ カ ン (glucosaminoglycan)を混合して用いても良い。 なお、 本発明の 製法により得られる軟骨細胞はキャ リア一無しでも実用に供す ることが出来る。
A . ヒ ト軟骨細胞
本発明の軟骨細胞の製法は、 軟骨膜が付着した状態のヒ 卜軟骨 組織、 例えば耳介軟骨、 肋軟骨、 関節軟骨、 椎間軟骨および気管 軟骨の軟骨細胞の培養に用いることができるが、 特に耳介軟骨の 軟骨細胞の培養 · 増殖に適している。
本発明の製法に供される軟骨細胞は、 公知の方法により軟骨膜 を付着させたヒ ト軟骨組織から得ることができる。 一般的には摘 出した軟骨組織をメス等を用いて細切してコラゲナーゼで処理 し、 培養 · 増殖させることが好ましい。 そのプロセスを具体的に 例示すれば次のようである。
1 ) 摘出した軟骨組織を抗生物質 （例えばペニシリ ン、
カナマイシン） や抗真菌剤 （例えばアムホテリシン B ) にて一晩 約 4 °Cで静置して除菌し、 次にメス等を用いて軟骨組織を細切す る。
2 ) 細切した軟骨組織を II 型コラゲナーゼを含む培地に移し、 ー晚約 4 °Cで静置する。さらに、 3 7 °Cにして 4時間振とうする。
3 )次に、処理した組織を遠心して、 この沈澱物を培養に供する。 この方法により、 1平方センチのヒ ト耳介軟骨組織から継代 1 代目で 3〜 5 X 1 0 6細胞個の軟骨細胞を得ることができる。 ま た、 本発明の培養方法において、 公知の増殖因子、 特に軟骨の増 殖を刺激するもの、例えば FGF (例えば bFGF)、 IGF (例えば IGF - 1) および骨形成因子 9 (BMP9)から適宜選択し、 或いは組合わせて使 用することができる。
B . ヒ ト軟骨細胞培養方法
ヒ ト軟骨細胞の培養は、 軟骨細胞の培養に適した公知の培地を 用いることができる。 また、 培地にはゥシ胎仔血清（FBS)又はヒ 卜血清、 ヒ ドロコルチゾン（Hydrocortisone)の他に、 ヒ ト bFGF、 ヒ ト IGF-1 等の増殖因子を適宜添加する （Cuevas ら、 Biochem. Biophy. Res. Commun. 156, 611-18, 1988 ； Froger_Ga i 11 ard等、 Endocrinol.124, 2365-72) 0 そのような培地の例として、 ME (H) 培地に、 FBS (好ましくは 1 0 %程度）、 ヒ ト bFGF (好ましくは 10ng/ml 程度）、 ヒ ドロコルチゾン （好ましくは 40ng/ml )、 ヒ ト I GF- 1 (好ましくは 5ng/ml ) を添加した培地を挙げることができ る。 なお、 患者由来自家血清を用いることもでき、 かくすること により、 より安全を図ることができる。
本発明の培養方法を具体的に例示すれば次のようである。
1 ) 初代培養
培地を入れたフラスコに軟骨細胞を播種し、 軟骨細胞の培養 に適した条件 （例えば 3 7 °C、 1 0 % C02 条件下） にて炭酸ガス 培養器中で培養する。 培養は、 増殖した細胞が単層で密集的 (c on f l uent )になるまで行う （通常 1 0〜 1 4 日間）。
2 ) 継代培養
継代培養は初代培養と同じ培地で行う ことができる (通常、 1継代 7 日間）。 初代培養で得られた細胞を継代した場合、 耳介 軟骨では P0 (初代培養） →P 4において細胞数が 1 0 0 0倍程度 増加する。 さらに多数の軟骨細胞を所望する場合には継代回数を 適宜増加させることができる。
3 ) 重層培養
継代培養により得られたヒ 卜軟骨細胞を重層的に 1回また は 2回以上、 好ましくは 3〜 4回播種して培養することによって ゲル状の軟骨細胞塊を得ることができる。 得られた軟骨細胞塊中 において、 ヒ ト軟骨細胞はァグリカン等を含む軟骨基質で囲まれ ており、 軟骨細胞同士がァグリカン等の基質を介して結合してゲ ル状の細胞塊を形成する。
C . 軟骨治療材 本発明により得られた前記の継代培養または重層培養したヒ ト軟骨細胞または細胞塊をそのまま又は生体材料に包埋し、 これ を軟骨洽療材として移植に供することができる。 ヒ ト軟骨細胞ま たは細胞塊を包埋するキャリアーの例としてコラーゲン、 ポリグ リ コール酸 （PGA ； polygycolic acid) , ポリ乳酸 （polylact ic acid) , アルギン酸塩（Alginate)、 ポリエチレンォキシド、 フィ ブリン接着剤、 ポリ乳酸ーポリグリコール酸共重合体、 プロテオ ダ リ カ ン (proteoglycans) 、 グ リ コ サ ミ ノ ダ リ カ ン (glucosaminoglycan)が混合して用いても良い。
また、 当該軟骨治療材は、 軟骨細胞を包埋するキャリアーを 適宜選択し、 組合わせることにより、 軟骨ばかりか内軟骨性骨化 を誘導することができる。 そのような内軟骨性骨化を誘導し得る キャ リア一としては例えばヒ ト真皮が挙げられるが、 さらに骨形 成を促進する成長因子、 例えば骨形成因子（BMP)を用いて骨化を 促進させることができる。 以下実施例により本発明をさらに詳細に説明する。 ただし、 以 下の実施例は例示であり、 本発明がこれらの実施例に制限される ことはない。
実施例 1 軟骨細胞培養
培地組成 ： DME(H)培地に 10%FBS、 10ng/ml ヒ 卜 FGF (科研製 薬）、 および 40ng/nil Hydrocort isone (Sigma) , および 5ng/ml ヒ ト IGF- 1 (GIBC0)を添加した。
採取軟骨： ヒ 卜耳介後部基部軟骨から約 1 X I平方センチの片 面に軟骨膜の付着した軟骨を採取した。 (a)軟骨細胞画分
上記に得た、 軟骨片をペニシリ ン G (800u/ml)およびカナマイ シン（lmg/ml)およびファンギーソン （2.5ug/ml)で除菌し、 次にメ ス で 細 切 し た 後 、 03%コ ラ ゲナ ー ゼ typell (Wor thingt on Biochemical )を含む F- 12培地中で 4 °Cでー晚静置した。 翌日 3 7 °Cで 4時間振とう した後、 遠心し、 その沈殿物を培養開始の細 胞画分とした。
(b)初代培養
上記細胞画分を上記培地を用いて底面積 7 5 cm2 のフラスコに 播種した。 このフラスコを C02 Incubator 中で C02濃度を 1 0 % に設定して培養した。 培地は週 2回交換した。 その結果、 軟骨細 胞は、 1 0〜 1 4 日間の培養により単層で集蜜的になった。 得ら れた細胞を次の継代培養に使用した。
なお、 FBSに代えて、 患者の自家血を 3000rpniで 10分間遠心分 離して得られる自家血清を用いても同様の結果が得られること が確認された。
(c)継代培養
継代培養は初代培養の細胞 1 X 1 06個を底面積 1 7 5 c m2 フラスコに播種して、 初代培養と同じ条件で行った。 7 日間の培 養により単層で集蜜的になり、 得られた細胞を次の継代培養に使 用した。 その結果、 4継代で細胞数が初代の 1 0 0 0倍程度増加 した。
(d)重層培養
継代培養において得られた軟骨細胞を 1 X I 06個/ cm2 の密度 で 3回播種し重層させ重層培養を実施した。 2週間の培養後、 シ 一卜状のゲル塊が形成された （図 1 )。 このゲル状の軟骨細胞塊 についてへマトキシリ ン一ェォジン （H. E)染色したところ、 細胞 が重層化して細胞同士が基質を介して結合していることが示さ れた （図 2 )。 また、 軟骨組織の分子マーカ一である I I型コラー ゲンについて免疫染色を行ったところ、 細胞外基質に染色を呈し- 当該細胞外基質が軟骨に特異的な基質であることが示された （図 3 )。 実施例 2 軟骨細胞の移植
先ず継代培養または重層培養のフラスコから培地を除去した 後、 細胞をセル · リ フ夕一で集め、 この集まった細胞を注射等に 吸引して採取した。 この採取した注射筒にある軟骨細胞をヌード マウスの軟骨欠損部位に注射針を用いて注入した。 この移植 6 月 後に移植部位から一部採取して組織学的に検討し生着したこと を確認した。 即ち、 採取した組織をへマ トキシリ ンーェォジン (H. E)染色したところ、 細胞が重層化して細胞同士が基質を介し て結合しているが示された (図 4 )。 また、 軟骨組織の分子マー カーである I I 型コラーゲンについて免疫染色を行ったところ、 細胞外基質に染色を呈し、 当該細胞外基質が軟骨に特異的な基質 であることが示された (図 5 )。 さ らに、 卜ルイジン · ブルー染 色でメタクロマジ一が示され、 軟骨のマーカ一であるァグリカン の存在を示唆された （図 6 )。 以上から、 移植した軟骨細胞は軟 骨組織を形成していたことが示された。 産業上の利用可能性 本発明によれば、 ヒ トの軟骨細胞を、 細菌 · ウィルスによる感 染の恐れがなく、 しかも、 迅速かつ大量に正常な軟骨細胞または その細胞塊を得ることができる。

Claims

請求の範囲
1 . 軟骨膜を有する軟骨から得られる軟骨細胞を軟骨膜と共に培 養することを特徴とするヒ 卜軟骨細胞の製法。
2 . 該軟骨が、 耳介軟骨であることを特徴とする請求項 1 に記載 の製法。
3 . 培養細胞を単層的または重層的に 1 回または 2回以上播種し て培養し、 軟骨細胞塊を得ることを特徴とする請求項 1 の製法。
4 . 培養細胞を単層的または重層的に 1回または 2回以上播種し て培養し、 軟骨細胞塊を得ることを特徴とする請求項 2記載の製 法。
5 . 請求項 1乃至 4に記載の製法により得られるヒ ト軟骨細胞単 独または該軟骨細胞と包埋材料とからなる軟骨治療材。
6 . 該包埋材料が、 コラーゲン、 ポリグリ コール酸、 ポリ乳酸、 アルギン酸、 ポリエチレンォキシド、 フイブリ ン接着剤、 ポリ乳 酸 · ポリグリコール酸共重合体.， プロテオダリカン、 ダルコサミ ノグリカンまたはヒ トの真皮の一種又は二種以上から選ばれる 請求項 5に記載の軟骨治療材。
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