JP2022111482A - 成熟軟骨細胞の製造方法 - Google Patents
成熟軟骨細胞の製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2022111482A JP2022111482A JP2021006928A JP2021006928A JP2022111482A JP 2022111482 A JP2022111482 A JP 2022111482A JP 2021006928 A JP2021006928 A JP 2021006928A JP 2021006928 A JP2021006928 A JP 2021006928A JP 2022111482 A JP2022111482 A JP 2022111482A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cartilage
- mature
- chondrocytes
- producing
- medium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 144
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 claims abstract description 115
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 claims abstract description 40
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 claims abstract description 33
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 claims abstract description 33
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 claims abstract description 33
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 30
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 claims abstract description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 18
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 54
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 54
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 43
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 claims description 26
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 claims description 21
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 claims description 21
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 102100021943 C-C motif chemokine 2 Human genes 0.000 claims description 18
- 101710155857 C-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 claims description 18
- XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N interleukin-8 Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@@H](NC(C)=O)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(N)=O)C1=CC=CC=C1 XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N 0.000 claims description 18
- 229940096397 interleukin-8 Drugs 0.000 claims description 18
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 claims description 13
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 claims description 13
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 claims description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 11
- 101000851007 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor receptor 2 Proteins 0.000 claims description 10
- 102100033177 Vascular endothelial growth factor receptor 2 Human genes 0.000 claims description 10
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 claims description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 9
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 8
- 229910001882 dioxygen Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 210000004728 ear cartilage Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000000216 zygoma Anatomy 0.000 claims description 6
- 230000003848 cartilage regeneration Effects 0.000 claims description 5
- 208000002325 Funnel Chest Diseases 0.000 claims description 4
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000002435 rhinoplasty Methods 0.000 claims description 4
- 210000000613 ear canal Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000003321 cartilage cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000002870 angiogenesis inducing agent Substances 0.000 claims 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 25
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 25
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 16
- -1 Flt-3L Proteins 0.000 description 14
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 13
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 11
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 11
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 11
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 11
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 10
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 8
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 8
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 8
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 7
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 6
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 6
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 6
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 6
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 6
- 230000009758 senescence Effects 0.000 description 6
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 5
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000007489 histopathology method Methods 0.000 description 5
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 5
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 4
- 102000026633 IL6 Human genes 0.000 description 4
- 102000014962 Monocyte Chemoattractant Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010064136 Monocyte Chemoattractant Proteins Proteins 0.000 description 4
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 4
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 4
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 4
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 208000032170 Congenital Abnormalities Diseases 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 3
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 3
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010081589 Becaplermin Proteins 0.000 description 2
- 102100032367 C-C motif chemokine 5 Human genes 0.000 description 2
- 102100032366 C-C motif chemokine 7 Human genes 0.000 description 2
- 101710155834 C-C motif chemokine 7 Proteins 0.000 description 2
- 101710098275 C-X-C motif chemokine 10 Proteins 0.000 description 2
- 108700012434 CCL3 Proteins 0.000 description 2
- 101800000267 CD40 ligand, soluble form Proteins 0.000 description 2
- 102400000432 CD40 ligand, soluble form Human genes 0.000 description 2
- 102000000013 Chemokine CCL3 Human genes 0.000 description 2
- 108010055166 Chemokine CCL5 Proteins 0.000 description 2
- 108010078239 Chemokine CX3CL1 Proteins 0.000 description 2
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 2
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 2
- 102400000739 Corticotropin Human genes 0.000 description 2
- 101800000414 Corticotropin Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102100023688 Eotaxin Human genes 0.000 description 2
- 101710139422 Eotaxin Proteins 0.000 description 2
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 102000013818 Fractalkine Human genes 0.000 description 2
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100039619 Granulocyte colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 2
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 2
- 102000014429 Insulin-like growth factor Human genes 0.000 description 2
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 description 2
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 description 2
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 description 2
- 108050003558 Interleukin-17 Proteins 0.000 description 2
- 102000013691 Interleukin-17 Human genes 0.000 description 2
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 2
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 2
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 2
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 2
- 108010002335 Interleukin-9 Proteins 0.000 description 2
- 102000004058 Leukemia inhibitory factor Human genes 0.000 description 2
- 108090000581 Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 101710098940 Pro-epidermal growth factor Proteins 0.000 description 2
- 101800004564 Transforming growth factor alpha Proteins 0.000 description 2
- 102400001320 Transforming growth factor alpha Human genes 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 2
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 2
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 2
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 description 2
- 230000022159 cartilage development Effects 0.000 description 2
- 210000000038 chest Anatomy 0.000 description 2
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 2
- IDLFZVILOHSSID-OVLDLUHVSA-N corticotropin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO)C1=CC=C(O)C=C1 IDLFZVILOHSSID-OVLDLUHVSA-N 0.000 description 2
- 229960000258 corticotropin Drugs 0.000 description 2
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 2
- 229920006237 degradable polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 210000001162 elastic cartilage Anatomy 0.000 description 2
- 238000012407 engineering method Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 210000001061 forehead Anatomy 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 2
- 230000001146 hypoxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 2
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 2
- 108010017843 platelet-derived growth factor A Proteins 0.000 description 2
- 108010000685 platelet-derived growth factor AB Proteins 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 229950003937 tolonium Drugs 0.000 description 2
- HNONEKILPDHFOL-UHFFFAOYSA-M tolonium chloride Chemical compound [Cl-].C1=C(C)C(N)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 HNONEKILPDHFOL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- 239000000275 Adrenocorticotropic Hormone Substances 0.000 description 1
- 239000000055 Corticotropin-Releasing Hormone Substances 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 101001055222 Homo sapiens Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- 101150106931 IFNG gene Proteins 0.000 description 1
- 108091058560 IL8 Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102100026236 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 101150073396 LTA gene Proteins 0.000 description 1
- 241001237732 Microtia Species 0.000 description 1
- 206010061875 Nose deformity Diseases 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QNVSXXGDAPORNA-UHFFFAOYSA-N Resveratrol Natural products OC1=CC=CC(C=CC=2C=C(O)C(O)=CC=2)=C1 QNVSXXGDAPORNA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LUKBXSAWLPMMSZ-OWOJBTEDSA-N Trans-resveratrol Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1\C=C\C1=CC(O)=CC(O)=C1 LUKBXSAWLPMMSZ-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 1
- 102100039037 Vascular endothelial growth factor A Human genes 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000010094 cellular senescence Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000000306 component Substances 0.000 description 1
- QTCANKDTWWSCMR-UHFFFAOYSA-N costic aldehyde Natural products C1CCC(=C)C2CC(C(=C)C=O)CCC21C QTCANKDTWWSCMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000000994 depressogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 210000000883 ear external Anatomy 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000000222 hyperoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 1
- 210000003692 ilium Anatomy 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- ISTFUJWTQAMRGA-UHFFFAOYSA-N iso-beta-costal Natural products C1C(C(=C)C=O)CCC2(C)CCCC(C)=C21 ISTFUJWTQAMRGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000005033 mesothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 229960002429 proline Drugs 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000002278 reconstructive surgery Methods 0.000 description 1
- 229940016667 resveratrol Drugs 0.000 description 1
- 235000021283 resveratrol Nutrition 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 229940082569 selenite Drugs 0.000 description 1
- MCAHWIHFGHIESP-UHFFFAOYSA-L selenite(2-) Chemical compound [O-][Se]([O-])=O MCAHWIHFGHIESP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 210000003625 skull Anatomy 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002417 xiphoid bone Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0655—Chondrocytes; Cartilage
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/32—Bones; Osteocytes; Osteoblasts; Tendons; Tenocytes; Teeth; Odontoblasts; Cartilage; Chondrocytes; Synovial membrane
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
- C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
- C12N2501/39—Steroid hormones
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
【課題】移植に適した成熟軟骨細胞の製造方法を提供する。【解決手段】第１の培養用培地を用いて軟骨を培養し，成熟軟骨細胞を得る軟骨培養工程を含む，成熟軟骨細胞の製造方法であって，第１の培養用培地は，ドロコルチゾン及びＦＧＦ－２を含む培地である成熟軟骨細胞の製造方法。【選択図】図１
Description
この発明は成熟軟骨細胞の製造方法に関する。
外科領域の手術では，骨・軟骨移植による再建術は数多く行われている。ドナーとして使用される部位は，頭蓋骨・肋骨・肋軟骨・腸骨などが使用されてきた。しかしながら，軟骨を大量に採取すればドナーの採骨後の機能的問題や変形が生じる可能性について拒むことはできない。複数回の再建手術を要する症例では，多くの採骨部の犠牲を伴う事が多い。また，採取量にも限界がある。
そこで，Vacantiらは動物の軟骨組織を酵素処理して得られた限られた数の軟骨細胞から軟骨を再生させるtissue engineering法を発明した。この方法は，軟骨細胞を人工的に合成された分解性ポリマーで作られた網の目構造の足場(scaffold)に播種し，足場に細胞が付着増殖して軟骨組織が再生されるという発明である[1,2]。しかし，軟骨組織が足場の中に軟骨が均一に生成されなかったため，臨床的に適用できる結果はいまだ得られていない。さらに，足場の合成ポリマーは，生体内で吸収されると炎症を誘発し，再生軟骨の吸収を引き起こすことがわかった[3-4]。後にVacantiらによって報告されたように。大量の細胞を含む人工軟骨構造は，通常，その成長と増殖のために高酸素環境を必要とする。したがって，軟骨が構造の中心まで形成されない場合，軟骨膜は形成されない [5]。したがって，それらの血液と栄養素の供給はかなり制限された。これは，細胞死と人工構築物の不可避の壊死を引き起こし，その後，形状と機能が失われることがわかった。
Vacanti CA, Langer R, Schloo B, Vacanti JP. Synthetic polymers seeded with chondrocytes provide a template for new cartilage formation. Plast Reconstr Surg. 1991; 88:753－759
Cao Y, Vacanti JP, Paige KT, Upton J, Vacanti CA. Transplantation of Chondrocytes Utilizing a Polymer-Cell Construct to Produce Tissue-Engineered Cartilage in the Shape of a Human Ear. Plast Reconstr Surg. 1997; 100: 297－302
Santavirta S, Konttinen YT, Saito T, et al. Immune response to polyglycolic acid implants. J Bone Joint Surg Br.1990; 72:597－600.
Neidel J, Zeidler U. Independent effects of interleukin 1 on proteoglycan synthesis and proteoglycan breakdown of bovine articular cartilage in vitro. Agents Actions. 1993; 39:82－90.
Vacanti CA. The history of tissue engineering. J Cell Mol Med 2006; 10: 569－576.
Yanaga H., Imai K., Koga M., Yanaga K. Cell-engineered human elastic chondrocytes regenerate natural scaffold in vitro and neocartilage with neo-perichondrium in the human body post-transplantation. Tissue Eng. Part A. 2012; 18:2020－2029
Yanaga H., Imai K., Fujimoto T., Yanaga K. Generating ears from cultured autologous auricular chondrocytes by using two-stage implantation in treatment of microtia. Plast Reconstr Surg. 2009; 124:817－825
これまで培養軟骨細胞を移植しても，十分な量の大きさが得られないため，臨床応用することが難しかった。この発明は，移植に適した成熟軟骨細胞の製造方法を提供することを目的とする。
この明細書に記載される最初の発明は，成熟軟骨細胞の製造方法に関する。この成熟軟骨細胞は，例えば後述するように軟骨再生術などに用いることができる。
この成熟軟骨細胞の製造方法は，第１の培養用培地を用いて軟骨を培養し，成熟軟骨細胞を得る軟骨培養工程を含む。
そして，第１の培養用培地は，ヒドロコルチゾン及びＦＧＦ－２を含む培地である。
この成熟軟骨細胞の製造方法は，第１の培養用培地を用いて軟骨を培養し，成熟軟骨細胞を得る軟骨培養工程を含む。
そして，第１の培養用培地は，ヒドロコルチゾン及びＦＧＦ－２を含む培地である。
軟骨の例は耳介軟骨である。軟骨は細断された軟骨（微小軟骨）であってもよい。
軟骨培養工程は，例えば，２％以上１５％以下の炭酸ガス及び１％以上１０％以下の酸素ガスの環境下において軟骨を培養する工程を含む。軟骨培養工程は，初代培養と継代培養とで別の培地を用いてもよい。例えば，初代培養には，自己血清及びＦＧＦ－２を含む培地を用いてもよい。また，例えば一定期間，軟骨又は成熟軟骨細胞を凍結保存後に培養する場合は，自己血清およびＦＢＳ，ヒドロコルチゾン及びＦＧＦ－２を含む培地を用いてもよい。
この明細書に記載される上記とは別の発明は，成熟軟骨細胞含有組成物の製造方法に関する。
この方法は，
第１の培養用培地を用いて軟骨を培養し，成熟軟骨細胞を得る軟骨培養工程と，
成熟軟骨細胞と，軟骨養工程を経て得られる馴化培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）とを含む成熟軟骨細胞を含む組成物を得る成熟軟骨細胞含有組成物取得工程とを含む。
そして，第１の培養用培地は，ヒドロコルチゾン及びＦＧＦ－２を含む培地である。
この方法は，
第１の培養用培地を用いて軟骨を培養し，成熟軟骨細胞を得る軟骨培養工程と，
成熟軟骨細胞と，軟骨養工程を経て得られる馴化培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）とを含む成熟軟骨細胞を含む組成物を得る成熟軟骨細胞含有組成物取得工程とを含む。
そして，第１の培養用培地は，ヒドロコルチゾン及びＦＧＦ－２を含む培地である。
軟骨の例は耳介軟骨である。軟骨は細断された軟骨であってもよい。
軟骨培養工程は，例えば，２％以上１５％以下の炭酸ガス及び１％以上１０％以下の酸素ガスの環境下において軟骨を培養する工程を含む。軟骨培養工程は，初代培養と継代培養とで別の培地を用いてもよい。例えば，初代培養には，自己血清及びＦＧＦ－２を含む培地を用いてもよい。また，例えば一定期間，軟骨又は成熟軟骨細胞を凍結保存後に培養する場合は，ＦＢＳ，ヒドロコルチゾン及びＦＧＦ－２を含む培地を用いてもよい。
馴化培地は，例えば，インターロイキン８（ＩＬ－８），成長関連遺伝子（ＧＲＯ），単球走化性因子－１（ＭＣＰ－１）,及びＶＥＧＦを含む。
成熟軟骨細胞含有組成物は，軟骨再生の為の移植に用いられる組成物である。
成熟軟骨細胞含有組成物は，耳介形成，外耳道形成,鼻形成，下顎形成，頬骨の硬組織陥凹形成術，頭蓋の硬組織陥凹形成術，気管,漏斗胸などの硬組織陥凹形成術に用いられる組成物である。
成熟軟骨細胞含有組成物は，耳介形成，外耳道形成,鼻形成，下顎形成，頬骨の硬組織陥凹形成術，頭蓋の硬組織陥凹形成術，気管,漏斗胸などの硬組織陥凹形成術に用いられる組成物である。
この明細書に記載される上記とは別の発明は，血管再生促進剤の製造方法に関する。
血管再生促進剤は，管誘導因子と，ＶＥＧＦＲ２陽性細胞とを含む，成熟軟骨細胞含有組成物を含む。
そして，この方法は，上記した成熟軟骨細胞含有組成物の製造方法により，成熟軟骨細胞含有組成物を製造する工程を含む。
血管再生促進剤は，管誘導因子と，ＶＥＧＦＲ２陽性細胞とを含む，成熟軟骨細胞含有組成物を含む。
そして，この方法は，上記した成熟軟骨細胞含有組成物の製造方法により，成熟軟骨細胞含有組成物を製造する工程を含む。
この発明によれば，移植に適した成熟軟骨細胞の製造方法を提供することができる。例えば，培養軟骨細胞と馴化培地（例えば成熟軟骨細胞の上清液）を移植時に同時に加えて移植することにより，軟骨周囲の血管再生を上げて，軟骨細胞移植の生着率を向上させ，移植軟骨の大きさを拡大し長期生存を可能にすることができる。このことにより移植された再生軟骨は血液と栄養素の供給が十分行われることにより，細胞死と壊死を抑制し，その後，形状と機能が保たれる。また，軟骨に栄養が供給されるため，大量の軟骨細胞が生着し，軟骨吸収が抑制され，これまで得られなかった大きな再生軟骨が得られるようになった。
培養軟骨細胞とその細胞が産生する上清液を移植時に同時に加えて，軟骨形成を促進し再生軟骨を大きく増大させて，移植を成功させることができる。軟骨細胞と上清液（condition medium）と共に移植すると軟骨周囲に血管新生が起こり高い移植率が達成できた。そこで，培養細胞からどんな因子があるかを確認したところ，幾つかの高濃度の血管誘導を起こすサイトカイン/ケモカインが特異的に見出された。成熟軟骨細胞とその成熟軟骨細胞が産生する血管形成を促進する特異的なサイトカイン/ケモカインの中で特にGRO,IL8, MCP-1,VEGFを含む上清液（CM: conditioned medium）を軟骨細胞に添加し，移植後の吸収を抑制し生着率を向上させることができる。
以下，図面を用いて本発明を実施するための形態について説明する。本発明は，以下に説明する形態に限定されるものではなく，以下の形態から当業者が自明な範囲で適宜修正したものも含む。
この明細書に記載される最初の発明は，成熟軟骨細胞の製造方法に関する。この成熟軟骨細胞は，例えば後述するように軟骨再生術などに用いることができる。
この成熟軟骨細胞の製造方法は，第１の培養用培地を用いて軟骨を培養し，成熟軟骨細胞を得る軟骨培養工程を含む。
そして，第１の培養用培地は，ヒドロコルチゾン及びＦＧＦ－２を含む培地である。この培地は，自己血清およびＦＢＳのいずれか又は両方を含んでもよい。
この成熟軟骨細胞の製造方法は，第１の培養用培地を用いて軟骨を培養し，成熟軟骨細胞を得る軟骨培養工程を含む。
そして，第１の培養用培地は，ヒドロコルチゾン及びＦＧＦ－２を含む培地である。この培地は，自己血清およびＦＢＳのいずれか又は両方を含んでもよい。
軟骨の例は耳介軟骨である。軟骨は細断された軟骨（微小軟骨）であってもよい。軟骨を細断し，洗浄後，血液成分を除去されたものであってもよい。
軟骨培養工程は，例えば，２％以上１５％以下の炭酸ガス及び１％以上１０％以下の酸素ガスの環境下において軟骨を培養する工程を含む。軟骨培養工程は，初代培養と継代培養とで別の培地を用いてもよい。例えば，初代培養には，自己血清及びＦＧＦ－２を含む培地を用いてもよい。また，例えば一定期間，軟骨又は成熟軟骨細胞を凍結保存後に培養する場合は，自己血清およびＦＢＳ，ヒドロコルチゾン及びＦＧＦ－２を含む培地を用いてもよい。
この明細書に記載される上記とは別の発明は，成熟軟骨細胞含有組成物の製造方法に関する。成熟軟骨細胞含有組成物は，軟骨再生の為の移植に用いられる組成物である。成熟軟骨細胞含有組成物は，耳介形成，外耳道形成,鼻形成，下顎形成，頬骨の硬組織陥凹形成術，頭蓋の硬組織陥凹形成術，気管,漏斗胸などの硬組織陥凹形成術に用いられる組成物である。
軟骨培養工程
軟骨培養工程は，第１の培養用培地を用いて軟骨を培養し，成熟軟骨細胞を得るための工程である。軟骨培養工程は，採取した軟骨を（洗浄後）そのまま培養してもよい。また，軟骨培養工程は，裁断した微小軟骨を培養する工程であってもよいし，細断ろ過した微小軟骨を培養する工程であってもよい。以下，細断ろ過した微小軟骨を培養する工程に基づいて説明する。
軟骨培養工程は，第１の培養用培地を用いて軟骨を培養し，成熟軟骨細胞を得るための工程である。軟骨培養工程は，採取した軟骨を（洗浄後）そのまま培養してもよい。また，軟骨培養工程は，裁断した微小軟骨を培養する工程であってもよいし，細断ろ過した微小軟骨を培養する工程であってもよい。以下，細断ろ過した微小軟骨を培養する工程に基づいて説明する。
第１の培養用培地は，ヒドロコルチゾン及びＦＧＦ－２を含む培地である。この培地は，自己血清およびＦＢＳのいずれか又は両方を含んでもよい。第１の培養用培地は，自己血清，ヒドロコルチゾン及びＦＧＦ－２を含む培地であるか，ＦＢＳ，ヒドロコルチゾン及びＦＧＦ－２を含む培地であることが好ましい。
培地には，基本培地に適宜必要な要素を添加すればよい。基本培地の例は，α－ＭＥＭ培地，イーグル基礎培地，及びＤＭＥＭである。試薬は，培地に用いる公知のものを適宜添加すればよい。試薬の例は，ウシ胎児血清（ＦＢＳ），ＨＣ（ヒドロコルチゾン），ＦＧＦ２，ＩＧＦ（インスリン様増殖因子），インスリン，ＰＤＧＦ（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ），ＡＣＴＨ（副腎皮質刺激ホルモン），ＬＩＦ（白血病阻害因子），ＴＧＦβ，ＢＭＰ，ステロイド，軟骨酸，大豆トリプシン阻害剤，アスコルビン酸，ヒアルロン酸，プロリン，デキサメタゾン，インスリン，トランスフェリン，亜セレン酸である。アスコルビン酸などを培地に添加する場合，２－リン酸塩など塩の形のものを添加してもよい。それぞれ培地に０．１ｎｇ／ｍＬ以上２０μｇ／ｍＬ以下（又は０．２ｎｇ／ｍＬ以上１０μｇ／ｍＬ以下）となるように添加すればよい。これらは精製の程度や必要量に応じて適宜調整して添加すればよい。ＦＢＳにかえて，自己血清を添加してもよい。また，無血清培地をもちいてもよい。いずれにせよ培地には，ＨＣ（ヒドロコルチゾン），及びＦＧＦ－２を添加することが好ましい。
培養用培地の例はα－ＭＥＭ培地に１～１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）, ２０ｎｇ/ｍｌ以上１００ｎｇ／ｍｌ以下のヒドロコルチゾン（Hydrocortisone）, ５ｎｇ／ｍｌ以上２０ｎｇ／ｍｌ（又は５０ｎｇ／ｍｌ）のＦＧＦ２（Fibroblast Growth Factor 2）を添加したものである。１～１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）とともに又はこれと代えて，１～１０％自己血清を添加してもよい。これらの量は適宜調整してもよい。例えば，ＦＢＳ及び自己血清は，培地に０．１％～２０％含ませてもよい。
微小軟骨を通常の培養条件で培養・増殖させてもよい。細胞量は１０％前後から１００％コンフルエントな状態まで可能であり，また，１００％コンフルエントを超えるような高密度，重層状態での培養も可能である。移植後すぐに，あるいはしばらく静置した後，低酸素状態に移行させてもよい。低酸素培養は，例えば市販の窒素ガスなどを混合し，酸素分圧を低下させるタイプの低酸素インキュベーターを用いることもできるし，適当な空間に窒素ガスなどを吹き込んで酸素分圧を下げるなどして培養してもよい。
軟骨培養工程は，例えば，２％以上１５％以下の炭酸ガス及び１％以上１０％以下の酸素ガスの環境下において軟骨を培養する工程を含む。軟骨培養工程は，初代培養と継代培養とで別の培地を用いてもよい。例えば，初代培養には，自己血清及びＦＧＦ－２を含む培地を用いてもよい。また，例えば一定期間，軟骨又は成熟軟骨細胞を凍結保存後に培養する場合は，ＦＢＳ，ヒドロコルチゾン及びＦＧＦ－２を含む培地を用いてもよい。
成熟軟骨細胞含有組成物取得工程
成熟軟骨細胞含有組成物取得工程は，成熟軟骨細胞と，軟骨培養工程を経て得られる馴化培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）とを含む成熟軟骨細胞含有組成物を得るための工程である。成熟軟骨細胞含有組成物は，成熟軟骨細胞と培養上清を含むものであってもよい。
成熟軟骨細胞含有組成物取得工程は，成熟軟骨細胞と，軟骨培養工程を経て得られる馴化培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）とを含む成熟軟骨細胞含有組成物を得るための工程である。成熟軟骨細胞含有組成物は，成熟軟骨細胞と培養上清を含むものであってもよい。
成熟軟骨細胞の好ましい例は，ケモカイン／サイトカインであるインターロイキン８（ＩＬ－８），成長関連遺伝子（ＧＲＯ），単球走化性因子－１（ＭＣＰ－１）,及びＶＥＧＦを，それぞれＩＬ－６よりも４倍以上発現する細胞である。ＩＬ－８，ＧＲＯ及びＭＣＰ－１のいずれか又は２種以上をＩＬ－６よりも１０倍以上発現するものであってもよいし，ＩＬ－６よりも２０倍以上発現するものであってもよいし，ＩＬ－６よりも２０倍以上発現するものであってもよい。このように血管再生促進能が高く炎症性の少ないサイトカイン／ケモカインを含むことで，成熟軟骨細胞含有組成物は，移植した際に，炎症を惹き起こさずに高い血管促進能を発揮するため，移植に適している。この成熟軟骨細胞含有組成物は，特に移植を行う患者から採取した軟骨を含む物が好ましい。
成熟軟骨細胞の好ましい例は，インターロイキン８（ＩＬ－８），成長関連遺伝子（ＧＲＯ），単球走化性因子－１（ＭＣＰ－１）,及びＶＥＧＦのいずれか又は２種以上を，ＴＮＦ－αに比べて１０倍以上発現するものであり，ＴＮＦ－αに比べて５０倍以上発現するものが好ましく，ＴＮＦ－αに比べて１００倍以上発現するものが好ましく，ＴＮＦ－αに比べて５００倍以上発現するものが好ましい。
成熟軟骨細胞の好ましい例は，インターロイキン８（ＩＬ－８），成長関連遺伝子（ＧＲＯ），単球走化性因子－１（ＭＣＰ－１）,及びＶＥＧＦのいずれか又は２種以上を，ＩＬ－１－βに比べて１０倍以上発現するものであり，ＩＬ－１－βに比べて５０倍以上発現するものが好ましく，ＩＬ－１－βに比べて１００倍以上発現するものが好ましく，ＩＬ－１－βに比べて５００倍以上発現するものが好ましい。
成熟軟骨細胞の好ましい例は，インターロイキン８（ＩＬ－８），成長関連遺伝子（ＧＲＯ），単球走化性因子－１（ＭＣＰ－１）,及びＶＥＧＦのいずれか又は２種以上を，ＩＮＦ－γに比べて１０倍以上発現するものであり，ＩＮＦ－γに比べて５０倍以上発現するものが好ましく，ＩＮＦ－γに比べて１００倍以上発現するものが好ましく，ＩＮＦ－γに比べて５００倍以上発現するものが好ましい。
成熟軟骨細胞含有組成物は，目的に応じて適切な量の成熟軟骨細胞や馴化培地（又は培養上清）を含めばよい。また，この組成物は，通常の組成物と同様に必要な容器に収容し，必要に応じて利用できるようにすればよい。成熟軟骨細胞の量は，例えば，１回用途当たり１×１０４ 細胞以上１×１０１０細胞でもよいし，１回用途当たり１×１０５ 細胞以上１×１０８細胞でもよい。
培養上清を有効成分として含む剤は，例えば，特開２０１３－１８７５６号公報，特許第５１３９２９４号，及び特許第５５２６３２０号公報に開示されるとおり公知である。したがって，馴化培地を含む組成物を，公知の方法を用いて製造することができる。
成熟軟骨細胞の培養上清の例は，遠心分離により培養上清を固液分離して得られる上清成分である培養上清を，凍結乾燥により水分を除去して得られる処理物，エバポレーター等を用いて培養上清を減圧濃縮して得られる処理物，限外ろ過膜等を用いて培養上清を濃縮して得られる処理物，又はフィルターを用いて培養上清を固液分離して得られる処理物，もしくは，上述のような処理をする前の培養上清の原液である。また，例えば，本発明の成熟軟骨細胞を培養した上澄みを,遠心分離（例えば，１，０００×ｇ，１０分）した後，硫安（例えば，６５％飽和硫安）で分画し，沈殿物を適切な緩衝液で懸濁した後に透析処理を行い,シリンジフィルター（例えば，０．２μｍ）で濾過し，無菌的な培養上清を得てもよい。採取した培養上清を，そのまま用いても，また凍結保存しておき使用時に解凍して用いることもできる。また薬剤学的に許容される担体を加えて，取り扱いやすい液量となるように滅菌容器に分注してもよい。さらに,感染性病原体リスクの対策として,培養上清をウイルスクリアランスフィルターや紫外線照射により処理してもよい。成熟軟骨細胞含有組成物は，培養上清を１投与単位として１ｍＬ以上１，０００ｍＬ以下含むことが好ましく，さらに好ましくは，３０ｍＬ以上３００ｍＬ以下である。
培養軟骨細胞と馴化培地（例えば成熟軟骨細胞の上清液）を移植時に同時に加えて移植することにより，軟骨周囲の血管再生を上げて，軟骨細胞移植の生着率を向上させることにより再生軟骨を大きく増大させて，移植を成功させることができる。この組成物は，例えば，耳介形成，鼻形成，下顎形成，頬骨の硬組織陥凹形成術，頭蓋の硬組織陥凹形成術，漏斗胸の硬組織陥凹形成術に用いられる。
この明細書に記載される上記とは別の発明は，血管再生促進剤に関する。この血管再生促進剤は，例えば，上記したいずれかの成熟軟骨細胞含有組成物の製造方法によって得られた成熟軟骨細胞含有組成物を含む。つまりこの血管再生促進剤は，上記した成熟軟骨細胞含有組成物と同様である。血管再生促進剤は，例えば注射剤であってもよい。注射器内に，上記した成熟軟骨細胞含有組成物を含有させておき，必要に応じて患者の組織と混合し，患者の必要個所に移植すればよい。血管再生促進剤は，管誘導因子と，ＶＥＧＦＲ２陽性細胞とを含む，成熟軟骨細胞含有組成物を含む。そして，この方法は，上記した成熟軟骨細胞含有組成物の製造方法により，成熟軟骨細胞含有組成物を製造する工程を含む。
１平方センチメートルの耳介軟骨が患者の耳の残骸から採取した。破片を細かく刻み，抗生物質を補充したリン酸緩衝生理食塩水（Ca-）でリンスした。次に，それらを0.3％コラゲナーゼ（Worthington Biochemical，Freehold，NJ）/ PBSで処理し，スターラーで37℃,4～6時間回転させた後，軟骨細胞を単離した。初代培養では軟骨細胞を1×103 cells / cm2の細胞密度で播種し，10％自家血清，FGF－2（5～10ng / ml，FIBRAST（登録商標），Kaken Pharmaceuticals，東京）を添加したDMEM培地で初代培養した。継代培養では，軟骨細胞を175cm2培養フラスコあたり1X103 cells / cm2で播種した。つぎに継代培養細胞を播種し，軟骨細胞およびCMを含む移植材料を最終産物(1 × 107 cells / 1 cc CM)として得た。培地はHigh glucose-DME培地に５％ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum）, 40ng/ml Hydrocortisone, 10ng/ml Fibroblast Growth Factor 2を添加してものを使用した．培養条件は，5～10％炭酸ガス下で行った．初代培養12日目に2～3x106 cellsの培養細胞を回収した．この細胞の一部を凍結し，他の細胞を4～5x104/cm2の密度で播種し，14日間培養した．15日後にPBS(-)で３回洗浄し，2日間上記の培地成分からＦＢＳを除いた培地にて培養した．この培地を馴化培地（Conditioned Medium）として分析に用いた．
培地組成
培地はHigh glucose-DME培地培地に５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ：Fetal Bovine Serum）, 40ng/ml ヒドロコルチゾン（Hydrocortisone）, 10ng/ml ＦＧＦ２（Fibroblast Growth Factor 2）を添加したものを使用した．培養条件は，１０％炭酸ガス，５％酸素ガス下で行った．図1は，実施例1の軟骨細胞の位相差顕微鏡写真を示す図面に代わる写真である。
培地はHigh glucose-DME培地培地に５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ：Fetal Bovine Serum）, 40ng/ml ヒドロコルチゾン（Hydrocortisone）, 10ng/ml ＦＧＦ２（Fibroblast Growth Factor 2）を添加したものを使用した．培養条件は，１０％炭酸ガス，５％酸素ガス下で行った．図1は，実施例1の軟骨細胞の位相差顕微鏡写真を示す図面に代わる写真である。
抗体固体化磁気ビーズ法（Antibody－Immobilized Magnetic Beads法）で培養成熟軟骨細胞の馴化培地（Conditioned Medium）のサイトカイン／ケモカイン分析を行った． 馴化培地（Conditioned Medium）サンプルを１３，０００ G，4℃で5分間遠心して得られた上清を測定に使用した。馴化培地（Conditioned Medium）内の４０の標的タンパク質の濃度を，Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）システムを使用して測定した。前処理されたサンプルをウェルあたり２５μLで使用し，測定を3回行った。標準液をマニュアルに基づいて1点追加し，5倍希釈系列を7点用意し，3回測定した。対象タンパク質40品目は，EGF，FGF－2，エオタキシン，TGF－α，G－CSF，Flt－3L，GM－CSF，フラクタルカイン，IFNα2, IFNg, GRO, IL－10, MCP－3, IL－ 12P40, MDC, IL－12P70, PDGF－AA, IL－13, PDGF－AB ／ BB, IL－15, sCD40L, IL－17A, IL－1RA, IL－1α, IL－9, IL－1b, IL－2, IL－3, IL－4, IL－5, IL－6, IL－7, IL－8, IP－10, MCP－1, MIP－1α, MIP－1b, RANTES, TNFα, TNFb, 及びVEGFであった。
Antibody-Immobilized Magnetic Beads法で培養成熟軟骨細胞の馴化培地（Conditioned Medium）のサイトカイン／ケモカイン分析を行った．その結果を図２に示す。図２は，培養成熟軟骨細胞を培養した際に得られた馴化培地（Conditioned Medium）に含まれるサイトカイン及びケモカインの分析結果を示す図面に代わるグラフである。図２に示される通り，血管再生能の高いサイトカインであるIL-８,GRO, MCP-1が多量（ng/ml）に産生していることが証明された．一方，炎症を起こすTNF-αや炎症惹起力の強いIL-1-β，INF-γはこの細胞では殆ど産生されていないので，安全であることも示された．
ヒトへの軟骨細胞移植（耳介再建のための軟骨形成）
[症例 1]：22歳男性 両側小耳症（外耳がない）および頬骨低形成のために培養軟骨による再建治療を行った。右遺残耳介軟骨より軟骨組織を15mm×15mm採取し，除菌して播種培養を行った培地はHigh glucose-DME培地に自家血清および５％ＦＢＳ，ヒドロコルチゾン，ＦＧＦ２ 2を添加したものを使用した．初代培養11日目に4.3×106cells ，初代培養13日目に2.2×10^7 cellsの培養細胞を回収した。この培養細胞を一旦凍結保存した。移植前に，解凍した細胞を，底面積150cm^2のフラスコ30枚に40日間培養した。培養成熟軟骨細胞及び馴化培地（Conditioned Medium）を含む組成物を総量230cc (1 X 107 cells / 1 cc CM)準備した 。両側下腹部に培養成熟軟骨細胞及び馴化培地（Conditioned Medium）を含む組成物を注入移植し，移植後1年後に採取した再生軟骨を利用して両側耳介と頬骨を再建した。
図３は，移植1年後，腹部から採取された再生軟骨を示す図面に代わる写真である。図３において，再生軟骨の大きさは80x200x8mmであった。軟骨の割面は全層性に白い軟骨組織であった。
[症例 1]：22歳男性 両側小耳症（外耳がない）および頬骨低形成のために培養軟骨による再建治療を行った。右遺残耳介軟骨より軟骨組織を15mm×15mm採取し，除菌して播種培養を行った培地はHigh glucose-DME培地に自家血清および５％ＦＢＳ，ヒドロコルチゾン，ＦＧＦ２ 2を添加したものを使用した．初代培養11日目に4.3×106cells ，初代培養13日目に2.2×10^7 cellsの培養細胞を回収した。この培養細胞を一旦凍結保存した。移植前に，解凍した細胞を，底面積150cm^2のフラスコ30枚に40日間培養した。培養成熟軟骨細胞及び馴化培地（Conditioned Medium）を含む組成物を総量230cc (1 X 107 cells / 1 cc CM)準備した 。両側下腹部に培養成熟軟骨細胞及び馴化培地（Conditioned Medium）を含む組成物を注入移植し，移植後1年後に採取した再生軟骨を利用して両側耳介と頬骨を再建した。
図３は，移植1年後，腹部から採取された再生軟骨を示す図面に代わる写真である。図３において，再生軟骨の大きさは80x200x8mmであった。軟骨の割面は全層性に白い軟骨組織であった。
次に，軟骨が再生されたことを証明するために病理組織学的解析を行った。その結果を図４に示す。図４は，病理組織学的解析の結果を示す図面に代わる写真である。図４ＡはＨＥ染色の結果を示す。図４Ｂはトルイジンブルー染色の結果を示す。図４Ｃはアルシアンブルー染色の結果を示す。図４Ｄはエラスティカファンギーソン染色の結果を示す。図４Ａに示される通り，軟骨の周囲に軟骨膜が形成され，その中には血管腔が多数認められる。これは軟骨膜から軟骨へ栄養が供給されることが示されている。また,図４Ｂ～図４Ｄから，軟骨を特異的に染色する色素にそれぞれ染色されているので，軟骨が形成されていることがわかる，図４に示される通り，成熟した再生軟骨と再生軟骨膜が移植後に形成され，耳介起源由来弾性軟骨組織の形質と特性が維持されていることがわかる。
ヒトへの軟骨細胞移植：漏斗胸胸部陥凹再建
18歳男性に対し，漏斗胸術後胸部陥凹（正中剣状突起周辺～季肋部）残存を認めた。左耳介より軟骨組織を10mm×7mm採取し，除菌して播種培養を行った。培地はHigh glucose-DME培地に自家血清, Hydrocortisone, Fibroblast Growth Factor 2を添加してものを使用した．初代培養21日目に4.2×106cells，初代培養23日目に3.3×106cellsの培養細胞を回収した。この培養細胞を一旦凍結保存した。移植前に，解凍した細胞を，底面積150ｃｍ２のフラスコ15枚に40日間培養した。培養成熟軟骨細胞とcondition mediumの移植総量は84mL1X107 cells / 1ccCM）であった。移植後2年，軟骨は吸収されず，胸部の外貌形態は良好であった。
18歳男性に対し，漏斗胸術後胸部陥凹（正中剣状突起周辺～季肋部）残存を認めた。左耳介より軟骨組織を10mm×7mm採取し，除菌して播種培養を行った。培地はHigh glucose-DME培地に自家血清, Hydrocortisone, Fibroblast Growth Factor 2を添加してものを使用した．初代培養21日目に4.2×106cells，初代培養23日目に3.3×106cellsの培養細胞を回収した。この培養細胞を一旦凍結保存した。移植前に，解凍した細胞を，底面積150ｃｍ２のフラスコ15枚に40日間培養した。培養成熟軟骨細胞とcondition mediumの移植総量は84mL1X107 cells / 1ccCM）であった。移植後2年，軟骨は吸収されず，胸部の外貌形態は良好であった。
ヒトへの軟骨細胞移植：鼻部変形，頭蓋の陥凹変形
20歳女性，鞍鼻，短鼻，前額部の陥凹変形を認めたために前額部と鼻部に培養軟骨による再建治療を行った。左耳介より軟骨組織を10mm×15mm採取し，除菌して播種培養を行った。培地はHigh glucose-DME培地に自家血清, Hydrocortisone, Fibroblast Growth Factor 2を添加してものを使用した．初代培養18日目に1.1×107 cellsの培養細胞を回収した。この培養細胞を一旦凍結保存した。移植前に，解凍した細胞を，底面積150ｃｍ２のフラスコ7枚に40日間培養した。培養成熟軟骨細胞とcondition mediumの移植総量は27.3mL（1X107 cells / 1ccCM）であった。移植後3年，軟骨は吸収されず，外貌形態は良好であった。
20歳女性，鞍鼻，短鼻，前額部の陥凹変形を認めたために前額部と鼻部に培養軟骨による再建治療を行った。左耳介より軟骨組織を10mm×15mm採取し，除菌して播種培養を行った。培地はHigh glucose-DME培地に自家血清, Hydrocortisone, Fibroblast Growth Factor 2を添加してものを使用した．初代培養18日目に1.1×107 cellsの培養細胞を回収した。この培養細胞を一旦凍結保存した。移植前に，解凍した細胞を，底面積150ｃｍ２のフラスコ7枚に40日間培養した。培養成熟軟骨細胞とcondition mediumの移植総量は27.3mL（1X107 cells / 1ccCM）であった。移植後3年，軟骨は吸収されず，外貌形態は良好であった。
継代における培養軟骨細胞のVEGFR2 の変化
VEGFR2は，血管内皮細胞とその前駆細胞にしか発現しない。このためVEGFR2が初戦すれば，培養成熟軟骨細胞及び馴化培地（Conditioned Medium）を含む組成物は，血管を造成することがわかる。移植に用いたのはP2からP4の細胞である。VEGFR2はP1からP４まで全てにVEGFR2を発現する細胞が存在していた。このchondrocyteの培養系では，P1からP4まで全てにendothelium 系の細胞が含まれていることが明らかになった。したがって，この細胞系を移植すれば，軟骨組織と共に血管内皮細胞が出現し，その結果軟骨組織の周囲に血管網が構築され，移植後の軟骨組織の維持が期待できる。図５は，継代における培養軟骨細胞のVEGFR2 の変化を示す図面に代わる写真である。
VEGFR2は，血管内皮細胞とその前駆細胞にしか発現しない。このためVEGFR2が初戦すれば，培養成熟軟骨細胞及び馴化培地（Conditioned Medium）を含む組成物は，血管を造成することがわかる。移植に用いたのはP2からP4の細胞である。VEGFR2はP1からP４まで全てにVEGFR2を発現する細胞が存在していた。このchondrocyteの培養系では，P1からP4まで全てにendothelium 系の細胞が含まれていることが明らかになった。したがって，この細胞系を移植すれば，軟骨組織と共に血管内皮細胞が出現し，その結果軟骨組織の周囲に血管網が構築され，移植後の軟骨組織の維持が期待できる。図５は，継代における培養軟骨細胞のVEGFR2 の変化を示す図面に代わる写真である。
次に，培養軟骨細胞の継代可能数を調べる目的で，軟骨細胞の継代可能数とPDLを計測した。腫瘍化した細胞では増殖が停止しないで，増殖し続けるという特性がある。今回作成した培養軟骨細胞の安全性を確認する目的で軟骨細胞のAgingの検査を行った。細胞を培養し，継代し続けて増殖が停止するかどうかをみる検査である。
４名の耳介軟骨細胞を３か月間培養して増殖停止するまでのPDL(CPD)を計測した。（何回分裂したかの意味）。その結果を図６に示す。図６は，軟骨細胞の継代可能数とPDLを示す図面に代わるグラフである。図６に示されるように，Agingによる増殖停止が起こっていることが確認された。
P14=total 84 day culture:縦軸CDL(=PDL). A(20歳,B（37歳,C（29歳,D（63歳）
４名の耳介軟骨細胞を３か月間培養して増殖停止するまでのPDL(CPD)を計測した。（何回分裂したかの意味）。その結果を図６に示す。図６は，軟骨細胞の継代可能数とPDLを示す図面に代わるグラフである。図６に示されるように，Agingによる増殖停止が起こっていることが確認された。
P14=total 84 day culture:縦軸CDL(=PDL). A(20歳,B（37歳,C（29歳,D（63歳）
細胞が老化すると老化関連β－ガラクトシダーゼ（SA－β－gal）の陽性染色を示すことから，細胞の老化を調べる４名の継代P13,P14の耳介軟骨細胞の老化関連酵素Senescence-associate galactosidae活性染色を行った結果, それぞれの段階で，Senescence-associate galactosidae活性染色を行ったその結果，増殖停止の前に上記酵素活性が出現したので，Agingによる増殖停止が起こっていることが確認された。Senescence-associate galactosidae活性染色にはSA X－ Gal staining Cellular Senescence Kit : OZBIOSCIENCES (Catalog Number:GXS0003)を使用した
図７は，20歳女性の培養成熟軟骨細胞（Ｐ＝１３）を示す図面に代わる写真である。
A. 20歳女性軟骨細胞 (P-13にて増殖停止）
PDL=0.8952 (P-12:2.5x10^5⇒4.65x10^5/dish)
Total PDL: 27.6676 SA X- Gal: 92%陽性
A. 20歳女性軟骨細胞 (P-13にて増殖停止）
PDL=0.8952 (P-12:2.5x10^5⇒4.65x10^5/dish)
Total PDL: 27.6676 SA X- Gal: 92%陽性
図８は，６３歳女性の培養成熟軟骨細胞（Ｐ＝１３）を示す図面に代わる写真である。
D.63歳女性軟骨細胞 (P-13にて増殖停止）
PDL=0.2388 (P-12:2.5x10^5⇒2.95x10^5/dish)
Total PDL: 27.6676 SA X- Gal: 95%陽性
D.63歳女性軟骨細胞 (P-13にて増殖停止）
PDL=0.2388 (P-12:2.5x10^5⇒2.95x10^5/dish)
Total PDL: 27.6676 SA X- Gal: 95%陽性
図９は，３７歳女性の培養成熟軟骨細胞（Ｐ＝１４）を示す図面に代わる写真である。
B.37歳女性軟骨細胞
PDL=0.5109 (P-14:1x10^5⇒1.425x10^5/dish)
Total PDL: 44.0962 SA X- Gal: 100%陽性
B.37歳女性軟骨細胞
PDL=0.5109 (P-14:1x10^5⇒1.425x10^5/dish)
Total PDL: 44.0962 SA X- Gal: 100%陽性
図１０は，２９歳女性の培養成熟軟骨細胞（Ｐ＝１４）を示す図面に代わる写真である。
C.29歳女性軟骨細胞
PDL=0.2013 (P-14:1x10^5⇒1.15x10^5/dish)
Total PDL: 47.1421 SA X- Gal: 100%陽性
C.29歳女性軟骨細胞
PDL=0.2013 (P-14:1x10^5⇒1.15x10^5/dish)
Total PDL: 47.1421 SA X- Gal: 100%陽性
考察
再生軟骨の形成とその吸収を抑制するためには軟骨膜の形成が必要とされる。大量の細胞を含む人工軟骨構造は，通常，その成長と増殖のために高酸素環境を必要とする。したがって，軟骨が構造の中心まで形成されない場合，軟骨膜は形成されない [5]。したがって，それらの血液と栄養素の供給はかなり制限された。これは，細胞死と人工構築物の不可避の壊死を引き起こし，その後，形状と機能が失われることがわかった[6-8]。
他方，成熟軟骨細胞含有組成物は，血管再生促進能が高く炎症性の少ないサイトカイン／ケモカインを含むことで，移植した際に，炎症を惹き起こさずに高い血管促進能を発揮するため，再生軟骨周囲に再生軟骨膜が形成されるので再生軟骨の移植に適している。軟骨の馴化培地はVEGFがIL6の7倍，GROがIL6の20倍，IL8はIL6の80倍，MCP-1はIL6の100倍を含む。TNF－αや炎症惹起力の強いIL－1－β，INF－γはこの細胞では殆ど産生されていないので，安全であることも示された。また、Aging試験では増殖停止が起こることが確認されたので腫瘍化した細胞ではないことが確認され、安全であることも示された。
再生軟骨の形成とその吸収を抑制するためには軟骨膜の形成が必要とされる。大量の細胞を含む人工軟骨構造は，通常，その成長と増殖のために高酸素環境を必要とする。したがって，軟骨が構造の中心まで形成されない場合，軟骨膜は形成されない [5]。したがって，それらの血液と栄養素の供給はかなり制限された。これは，細胞死と人工構築物の不可避の壊死を引き起こし，その後，形状と機能が失われることがわかった[6-8]。
他方，成熟軟骨細胞含有組成物は，血管再生促進能が高く炎症性の少ないサイトカイン／ケモカインを含むことで，移植した際に，炎症を惹き起こさずに高い血管促進能を発揮するため，再生軟骨周囲に再生軟骨膜が形成されるので再生軟骨の移植に適している。軟骨の馴化培地はVEGFがIL6の7倍，GROがIL6の20倍，IL8はIL6の80倍，MCP-1はIL6の100倍を含む。TNF－αや炎症惹起力の強いIL－1－β，INF－γはこの細胞では殆ど産生されていないので，安全であることも示された。また、Aging試験では増殖停止が起こることが確認されたので腫瘍化した細胞ではないことが確認され、安全であることも示された。
ＩＬ－８の血管形成能も文献（Ｍｉｋｕｌａ－Pietrasik J Kuczmarska A, Kucin´ska M. Muriaset M. al. Resveratrol and its synthetic derivatives exert opposite effects on mesothelial cell-dependent angiogenesis via modulating secretion of VEGF and IL-8/CXCL8. Angiogenesis 2012; 15:361-376及び上記Keglowich1ら）で示されている。
ＭＣＰ－１は血管新生ケモカインとして報告され血管形成能も他の１つの文献（6.Niu J, Azfer A, Zhelyabovska O, Fatma S, and Kolattukudy PE.Monocyte Chemotactic Protein (MCP)-1 Promotes Angiogenesis via a Novel Transcription Factor, MCP-1-induced Protein (MCPIP). J Biol Chem2008 May 23;283(21): 14542-51.doi: 10.1074/jbc.M802139200）で示されている。また，ＭＣＰ－１がVEGFの血管形成能にmediateすることが文献（3.Hong KH, Ryu J, Han KH. Monocyte Chemoattractant protein-1-induced Angiogenesis Is Mediated by Vascular Endothelial Growth factor-A. Blood 2005; 105:1405-1407 DOI:10,1182/blood-2004-08-3178）で示されている。血管形成にはマクロファージの出動が必須であり，ＭＣＰ－１がそれを行う必須因子である。
したがって，実施例における培養軟骨細胞が分泌する馴化培地の中にあるものの４種のサイトカイン（ＭＣＰ－１, ＩＬ－８, ＧＲＯ,VEGF）全てに血管形成能があることが示された。
この発明は，医療機器の分野などで利用されうる。
そこで，Vacantiらは動物の軟骨組織を酵素処理して得られた限られた数の軟骨細胞から軟骨を再生させるtissue engineering法を発明した。この方法は，軟骨細胞を人工的に合成された分解性ポリマーで作られた網の目構造の足場(scaffold)に播種し，足場に細胞が付着増殖して軟骨組織が再生されるという発明である[1,2]。しかし，軟骨組織が足場の中に軟骨が均一に生成されなかったため，臨床的に適用できる結果はいまだ得られていない。さらに，足場の合成ポリマーは，生体内で吸収されると炎症を誘発し，再生軟骨の吸収を引き起こすことがわかった[3-4]。後にVacantiらによって報告されたように，大量の細胞を含む人工軟骨構造は，通常，その成長と増殖のために高酸素環境を必要とする。したがって，軟骨が構造の中心まで形成されない場合，軟骨膜は形成されない [5]。したがって，それらの血液と栄養素の供給はかなり制限された。これは，細胞死と人工構築物の不可避の壊死を引き起こし，その後，形状と機能が失われることがわかった。
１平方センチメートルの耳介軟骨を患者の耳の残骸から採取した。破片を細かく刻み，抗生物質を補充したリン酸緩衝生理食塩水（Ca-）でリンスした。次に，それらを0.3％コラゲナーゼ（Worthington Biochemical，Freehold，NJ）/ PBSで処理し，スターラーで37℃,4～6時間回転させた後，軟骨細胞を単離した。初代培養では軟骨細胞を1×103 cells / cm2の細胞密度で播種し，10％自家血清，FGF－2（5～10ng / ml，FIBRAST（登録商標），Kaken Pharmaceuticals，東京）を添加したDMEM培地で初代培養した。継代培養では，軟骨細胞を175cm2培養フラスコあたり1×103 cells / cm2で播種した。つぎに継代培養細胞を播種し，軟骨細胞およびCMを含む移植材料を最終産物(1 × 107 cells / 1 cc CM)として得た。培地はHigh glucose-DME培地に５％ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum）, 40ng/ml Hydrocortisone, 10ng/ml Fibroblast Growth Factor 2を添加してものを使用した。培養条件は，5～10％炭酸ガス下で行った。初代培養12日目に2～3×106 cellsの培養細胞を回収した．この細胞の一部を凍結し，他の細胞を4～5x104/cm2の密度で播種し，14日間培養した．15日後にPBS(-)で３回洗浄し，2日間上記の培地成分からＦＢＳを除いた培地にて培養した。この培地を馴化培地（Conditioned Medium）として分析に用いた。
培地組成
培地はHigh glucose-DME培地に５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ：Fetal Bovine Serum）, 40ng/ml ヒドロコルチゾン（Hydrocortisone）, 10ng/ml ＦＧＦ２（Fibroblast Growth Factor 2）を添加したものを使用した。培養条件は，１０％炭酸ガス，５％酸素ガス下で行った。図1は，実施例1の軟骨細胞の位相差顕微鏡写真を示す図面に代わる写真である。
培地はHigh glucose-DME培地に５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ：Fetal Bovine Serum）, 40ng/ml ヒドロコルチゾン（Hydrocortisone）, 10ng/ml ＦＧＦ２（Fibroblast Growth Factor 2）を添加したものを使用した。培養条件は，１０％炭酸ガス，５％酸素ガス下で行った。図1は，実施例1の軟骨細胞の位相差顕微鏡写真を示す図面に代わる写真である。
抗体固体化磁気ビーズ法（Antibody－Immobilized Magnetic Beads法）で培養成熟軟骨細胞の馴化培地（Conditioned Medium）のサイトカイン／ケモカイン分析を行った。馴化培地（Conditioned Medium）サンプルを１３，０００ G，4℃で5分間遠心して得られた上清を測定に使用した。馴化培地（Conditioned Medium）内の４０の標的タンパク質の濃度を，Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）システムを使用して測定した。前処理されたサンプルをウェルあたり２５μLで使用し，測定を3回行った。標準液をマニュアルに基づいて1点追加し，5倍希釈系列を7点用意し，3回測定した。対象タンパク質40品目は，EGF，FGF－2，エオタキシン，TGF－α，G－CSF，Flt－3L，GM－CSF，フラクタルカイン，IFNα2, IFNγ, GRO, IL－10, MCP－3, IL－ 12P40, MDC, IL－12P70, PDGF－AA, IL－13, PDGF－AB ／ BB, IL－15, sCD40L, IL－17A, IL－1RA, IL－1α, IL－9, IL－1β, IL－2, IL－3, IL－4, IL－5, IL－6, IL－7, IL－8, IP－10, MCP－1, MIP－1α, MIP－1β, RANTES, TNFα, TNFβ, 及びVEGFであった。
次に，軟骨が再生されたことを証明するために病理組織学的解析を行った。その結果を図４に示す。図４は，病理組織学的解析の結果を示す図面に代わる写真である。図４ＡはＨＥ染色の結果を示す。図４Ｂはトルイジンブルー染色の結果を示す。図４Ｃはアルシアンブルー染色の結果を示す。図４Ｄはエラスティカファンギーソン染色の結果を示す。図４Ａに示される通り，軟骨の周囲に軟骨膜が形成され，その中には血管腔が多数認められる。これは軟骨膜から軟骨へ栄養が供給されることが示されている。また,図４Ｂ～図４Ｄから，軟骨を特異的に染色する色素にそれぞれ染色されているので，軟骨が形成されていることがわかる。図４に示される通り，成熟した再生軟骨と再生軟骨膜が移植後に形成され，耳介起源由来弾性軟骨組織の形質と特性が維持されていることがわかる。
Claims (9)
- 第１の培養用培地を用いて軟骨を培養し，成熟軟骨細胞を得る軟骨培養工程を含む，成熟軟骨細胞の製造方法であって，
第１の培養用培地は，
ドロコルチゾン及びＦＧＦ－２を含む培地である
成熟軟骨細胞の製造方法。 - 請求項１に記載の成熟軟骨細胞の製造方法であって，
前記軟骨は耳介軟骨である，方法。 - 請求項１に記載の成熟軟骨細胞の製造方法であって，
前記軟骨培養工程は，２％以上１５％以下の炭酸ガス及び１％以上１０％以下の酸素ガスの環境下において前記軟骨を培養する工程を含む，
方法。 - 第１の培養用培地を用いて軟骨を培養し，成熟軟骨細胞を得る軟骨培養工程と，
前記成熟軟骨細胞と，前記軟骨養工程を経て得られる馴化培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）とを含む成熟軟骨細胞を含む組成物を得る成熟軟骨細胞含有組成物取得工程とを含む，
成熟軟骨細胞含有組成物の製造方法であって，
第１の培養用培地は，
ヒドロコルチゾン及びＦＧＦ－２を含む培地である
成熟軟骨細胞含有組成物の製造方法。 - 請求項４に記載の成熟軟骨細胞含有組成物の製造方法であって，
前記軟骨培養工程は，２％以上１５％以下の炭酸ガス及び１％以上１０％以下の酸素ガスの環境下において前記軟骨を培養する工程を含む，
成熟軟骨細胞含有組成物の製造方法。 - 請求項４に記載の成熟軟骨細胞含有組成物の製造方法であって，
前記馴化培地は，インターロイキン８（ＩＬ－８），成長関連遺伝子（ＧＲＯ），単球走化性因子－１（ＭＣＰ－１）,及びＶＥＧＦを含む，方法。 - 請求項４に記載の成熟軟骨細胞含有組成物の製造方法であって，
前記成熟軟骨細胞含有組成物は，軟骨再生の為の移植に用いられる組成物である，方法。 - 請求項４に記載の成熟軟骨細胞含有組成物の製造方法であって，
前記成熟軟骨細胞含有組成物は，
耳介形成，外耳道形成,鼻形成，下顎形成，頬骨の硬組織陥凹形成術，頭蓋の硬組織陥凹形成術，気管,漏斗胸などの硬組織陥凹形成術に用いられる組成物である，方法。 - 血管再生促進剤の製造方法であって，
前記血管再生促進剤は，血管誘導因子と，ＶＥＧＦＲ２陽性細胞とを含む，成熟軟骨細胞含有組成物を含み，
請求項４に記載の成熟軟骨細胞含有組成物の製造方法により，前記成熟軟骨細胞含有組成物を製造する工程を含む，方法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2021006928A JP2022111482A (ja) | 2021-01-20 | 2021-01-20 | 成熟軟骨細胞の製造方法 |
| EP21921254.5A EP4282953A1 (en) | 2021-01-20 | 2021-12-07 | Method for producing mature chondrocytes and mature chondrocyte-containing composition |
| CN202180069373.2A CN116323919A (zh) | 2021-01-20 | 2021-12-07 | 成熟软骨细胞及含有成熟软骨细胞的组合物的制造方法 |
| PCT/JP2021/045015 WO2022158152A1 (ja) | 2021-01-20 | 2021-12-07 | 成熟軟骨細胞および成熟軟骨細胞含有組成物の製造方法 |
| CA3206324A CA3206324A1 (en) | 2021-01-20 | 2021-12-07 | Method for producing mature chondrocyte and tropic factors secreted from the cell |
| AU2021421584A AU2021421584A1 (en) | 2021-01-20 | 2021-12-07 | Methods for producing mature chondrocyte and tropic factors secreted from the cell |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2021006928A JP2022111482A (ja) | 2021-01-20 | 2021-01-20 | 成熟軟骨細胞の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2022111482A true JP2022111482A (ja) | 2022-08-01 |
Family
ID=82549733
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2021006928A Pending JP2022111482A (ja) | 2021-01-20 | 2021-01-20 | 成熟軟骨細胞の製造方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP4282953A1 (ja) |
| JP (1) | JP2022111482A (ja) |
| CN (1) | CN116323919A (ja) |
| AU (1) | AU2021421584A1 (ja) |
| CA (1) | CA3206324A1 (ja) |
| WO (1) | WO2022158152A1 (ja) |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998004681A2 (en) * | 1996-07-25 | 1998-02-05 | Genzyme Corporation | Chondrocyte media formulations and culture procedures |
| AU7984498A (en) * | 1997-06-25 | 1999-01-04 | Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The | Serum-free cell growth medium |
| ATE414141T1 (de) * | 2000-08-09 | 2008-11-15 | Hiroko Yanaga | Verfahren zur kultivierung humaner chondrozyten |
| JP3680067B2 (ja) * | 2003-04-15 | 2005-08-10 | 矢永博子 | 移植用軟骨細胞の製法 |
| WO2005105992A1 (en) * | 2004-04-21 | 2005-11-10 | New York Eye & Ear Infirmary | Chondrocyte culture formulations |
| JP2006314759A (ja) * | 2005-04-11 | 2006-11-24 | Hiroko Yanaga | 移植用軟骨組成物 |
| CN101500585A (zh) | 2006-08-04 | 2009-08-05 | 日本化学研究株式会社 | 妊娠促进剂 |
| JP5526320B2 (ja) | 2008-09-04 | 2014-06-18 | 国立大学法人旭川医科大学 | 腸管保護剤 |
| JP6132459B2 (ja) | 2011-07-13 | 2017-05-24 | 株式会社 バイオミメティクスシンパシーズ | 間葉系幹細胞の培養上清を含む腸炎の予防・治療剤 |
| CN104630138B (zh) * | 2013-11-06 | 2017-11-14 | 陕西瑞盛生物科技有限公司 | 一种无血清软骨细胞培养液 |
| EP3536778B1 (en) * | 2014-11-14 | 2021-05-19 | Regenesis Science Co., Ltd. | Method for serum-free culture of chondrocytes and serum-free culture medium |
-
2021
- 2021-01-20 JP JP2021006928A patent/JP2022111482A/ja active Pending
- 2021-12-07 WO PCT/JP2021/045015 patent/WO2022158152A1/ja unknown
- 2021-12-07 EP EP21921254.5A patent/EP4282953A1/en active Pending
- 2021-12-07 CA CA3206324A patent/CA3206324A1/en active Pending
- 2021-12-07 AU AU2021421584A patent/AU2021421584A1/en active Pending
- 2021-12-07 CN CN202180069373.2A patent/CN116323919A/zh active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2021421584A1 (en) | 2023-06-15 |
| CN116323919A (zh) | 2023-06-23 |
| AU2021421584A9 (en) | 2024-06-13 |
| EP4282953A1 (en) | 2023-11-29 |
| CA3206324A1 (en) | 2022-07-28 |
| WO2022158152A1 (ja) | 2022-07-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6483187B2 (ja) | 増強された幹細胞組成物 | |
| JP2019150040A (ja) | 血液疾患を治療するための、濃縮されかつ増殖したヒト臍帯血幹細胞 | |
| EP2865749A1 (en) | High-concentration stem cell production method | |
| US20050059152A1 (en) | In vitro culture of mesenchymal stem cells (MSC) and a process for the preparation thereof for therapeutic use | |
| CN113151165B (zh) | 一种人脐带间充质干细胞扩增用培养基及培养方法 | |
| WO2022158152A1 (ja) | 成熟軟骨細胞および成熟軟骨細胞含有組成物の製造方法 | |
| JP2006314759A (ja) | 移植用軟骨組成物 | |
| JP2007000077A (ja) | 付着性動物細胞の無血清培養方法及び付着性動物細胞の無血清培養用培地 | |
| JP6826744B1 (ja) | 成熟脂肪細胞含有組成物の製造方法 | |
| Xu et al. | Immunoregulatory effect of neuronal-like cells in inducting differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells. | |
| JP2022189188A (ja) | 間葉系幹細胞の製造方法 | |
| CN108517313B (zh) | 一种用于培养扩增牙髓干细胞的血清/血浆替代物 | |
| WO2020151418A1 (zh) | 一种扩增培养人肝祖细胞的培养基及其应用 | |
| CN116836920B (zh) | 一种无血清培养基及其制备间充质干细胞的方法 | |
| JP2006000059A (ja) | 細胞外基質を用いた動物細胞の増殖及び分化促進方法 | |
| CN110951687B (zh) | 一种扩增胎盘源造血干细胞的方法 | |
| VE et al. | Participation of cultured mesenchymal multipotent stromal cells in regeneration of a large persisting defect of rabbit radius bone | |
| AU2004269062A1 (en) | Follicular fluid for prolonged growth and survival of cells for cell therapies | |
| JP2001037471A (ja) | 移植可能な造血細胞の産生法 | |
| CN113930394A (zh) | 一种人脂肪间充质干细胞培养基及其制备方法 | |
| CN117802039A (zh) | 一种无血清间充质干细胞三维培养基及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210826 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20220330 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20220330 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220630 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20231130 |