CN116323919A - 成熟软骨细胞及含有成熟软骨细胞的组合物的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题是提供适于移植的成熟软骨细胞的制造方法。本发明的解决手段是一种成熟软骨细胞的制造方法，其包含使用第一培养用培养基培养软骨而获得成熟软骨细胞的软骨培养工序，第一培养用培养基为包含氢化可的松以及FGF‑2的培养基。

Description

成熟软骨细胞及含有成熟软骨细胞的组合物的制造方法
技术领域
本发明涉及成熟软骨细胞及含有成熟软骨细胞的组合物的制造方法。
背景技术
在外科领域的手术中，大量进行由骨/软骨移植所进行的重建术。被使用作为供体的部位，一直以来是使用头盖骨、肋骨、肋软骨、髂骨等。然而，若大量采集软骨，则无法避免供体在采骨后发生功能性问题或变形的可能性。在需要多次重建手术的病例中，大多伴随着许多采骨部的牺牲。并且，采集量也有极限。
于是，Vacanti等人发明了组织工程法，所述组织工程法是将动物的软骨组织进行酶处理，并从所得到的有限数量的软骨细胞使软骨再生。此方法是将软骨细胞接种于由人工合成的分解性聚合物所制作而成的网格结构的支架(scaffold)，且使细胞在支架附着增殖而再生软骨组织的发明[1,2]。但是，因为软骨组织在支架中没有均匀地生成软骨，所以至今还没有得到临床上可应用的结果。再者，已知支架的合成聚合物若在生物体内被吸收则会诱发炎症，并引起再生软骨的吸收[3-4]。如Vacanti等人后来所报告，包含大量细胞的人工软骨结构为了生长和增殖通常需要高氧环境。因此，在软骨未形成到结构的中心的情形，不会形成软骨膜[5]。因此，其等的血液和营养素的供给受到很大限制。由此可知，会引起细胞死亡和人工构筑物的不可避免的坏死，之后，会丧失形状和功能。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:Vacanti CA,Langer R,Schloo B,Vacanti JP.Syntheticpolymers seeded with chondrocytes provide a template for new cartilageformation.Plast Reconstr Surg.1991；88:753-759
非专利文献2:Cao Y,Vacanti JP,Paige KT,Upton J,VacantiCA.Transplantation of Chondrocytes Utilizing a Polymer-Cell Construct toProduce Tissue-Engineered Cartilage in the Shape of a Human Ear.PlastReconstr Surg.1997；100:297-302
非专利文献3:Santavirta S,Konttinen YT,Saito T,et al.Immune responseto polyglycolic acid implants.J Bone Joint Surg Br.1990；72:597-600.
非专利文献4:Neidel J,Zeidler U.Independent effects of interleukin 1onproteoglycan synthesis and proteoglycan breakdown of bovine articularcartilage in vitro.Agents Actions.1993；39:82-90.
非专利文献5:Vacanti CA.The history of tissue engineering.J Cell MolMed2006；10:569-576.
非专利文献6:Yanaga H.,Imai K.,Koga M.,Yanaga K.Cell-engineered humanelastic chondrocytes regenerate natural scaffold in vitro and neocartilagewith neo-perichondrium in the human body post-transplantation.Tissue Eng.PartA.2012；18:2020-2029
非专利文献7:Yanaga H.,Imai K.,Fujimoto T.,Yanaga K.Generating earsfrom cultured autologous auricular chondrocytes by using two-stageimplantation in treatment of microtia.Plast Reconstr Surg.2009；124:817-825
发明内容
发明所欲解决的课题
迄今为止，即使移植培养软骨细胞，因为无法获得对于确保移植所需的组织大小而言为足够的细胞量，所以也难以进行临床应用。本发明目的在于提供一种适于移植的成熟软骨细胞的制造方法及包含成熟软骨细胞的含有成熟软骨细胞的组合物。
解决课题的技术手段
本说明书中记载的最初的发明涉及成熟软骨细胞的制造方法。此成熟软骨细胞例如如后文所述可用于软骨再生术等。
此成熟软骨细胞的制造方法包含使用第一培养用培养基培养软骨而获得成熟软骨细胞的软骨培养工序。
而且，第一培养用培养基为包含氢化可的松和FGF-2的培养基。
软骨的例子为耳郭软骨。软骨可为经切碎的软骨(微小软骨)。
软骨培养工序例如包含在2％以上且15％以下的碳酸气体以及1％以上且10％以下的氧气的环境下培养软骨的工序。软骨培养工序可以在初代培养和传代培养中使用不同的培养基。例如，在初代培养中可以使用包含自身血清和FGF-2的培养基。并且，例如在将软骨或成熟软骨细胞冷冻保存一定时间后进行培养的情形，也可以使用包含自身血清、FBS、氢化可的松以及FGF-2的培养基。
本说明书中记载的与上述不同的发明涉及含有成熟软骨细胞的组合物的制造方法。
此方法包含：
软骨培养工序，其使用第一培养用培养基培养软骨而获得成熟软骨细胞；
含有成熟软骨细胞的组合物的取得工序，其获得包含成熟软骨细胞的组合物，所述组合物包含成熟软骨细胞和通过软骨培养工序而获得的条件培养基(conditionedmedium)。
而且，第一培养用培养基是包含氢化可的松以及FGF-2的培养基。
软骨的例子为耳郭软骨。软骨可为经切碎的软骨。
软骨培养工序例如包含在2％以上且15％以下的碳酸气体以及1％以上且10％以下的氧气的环境下培养软骨的工序。软骨培养工序也可以在初代培养和传代培养中使用不同的培养基。例如，在初代培养中可以使用包含自身血清以及FGF-2的培养基。并且，例如在将软骨或成熟软骨细胞冷冻保存一定时间后进行培养的情形，也可以使用包含FBS、氢化可的松以及FGF-2的培养基。
条件培养基例如包含白细胞介素8(IL-8)、生长相关基因(GRO)、单核细胞趋化因子-1(MCP-1)以及VEGF。
含有成熟软骨细胞的组合物是用于软骨再生的移植所使用的组合物。
含有成熟软骨细胞的组合物是使用于耳郭形成、外耳道形成、鼻形成、下颌形成、颧骨的硬组织凹陷成形术、颅的硬组织凹陷成形术、气管、漏斗胸等硬组织凹陷成形术的组合物。
本说明书中记载的与上述不同的发明涉及血管再生促进剂的制造方法。
血管再生促进剂包含含有成熟软骨细胞的组合物，所述含有成熟软骨细胞的组合物包含血管诱导因子和VEGFR2阳性细胞。
而且，此方法包含通过上述的含有成熟软骨细胞的组合物的制造方法而制造含有成熟软骨细胞的组合物的工序。
发明功效
根据本发明，可提供适于移植的成熟软骨细胞的制造方法。例如，通过在移植时同时加入培养软骨细胞和条件培养基(例如成熟软骨细胞的上清液)并进行移植，而可提高软骨周围的血管再生，使软骨细胞移植的生存率提升，扩大移植软骨的大小并使其能长期生存。通过此方法所移植的再生软骨通过充分供给血液和营养素，而抑制细胞死亡和坏死，之后，形状和功能得以保持。并且，因为向软骨供给营养，所以大量的软骨细胞植活，软骨吸收受到抑制，而得到迄今未得到的大的再生软骨。
在移植时同时加入培养软骨细胞和软骨细胞产生的上清液，可促进软骨形成，使再生软骨大幅增大，使移植成功。若将软骨细胞和上清液(条件培养基)一起移植，则会在软骨周围发生血管新生，可达成高移植率。于是，在从培养细胞确认到存在何种因子后，特异性地发现了几个高浓度的引起血管诱导的细胞因子/趋化因子。将成熟软骨细胞和包含所述成熟软骨细胞产生的促进血管形成的特异性细胞因子/趋化因子特别是GRO、IL8、MCP-1、VEGF的上清液(CM，conditioned medium，条件培养基)添加至软骨细胞，而可抑制移植后的吸收，使植活率提升。
附图说明
[图1]图1是表示实施例1的软骨细胞的相差显微镜照片的代替图的照片；
[图2]图2是表示培养培养成熟软骨细胞时所得到的条件培养基(ConditionedMedium)所包含的细胞因子以及趋化因子的分析结果的代替图的图表；
[图3]图3是表示移植1年后从腹部提取的再生软骨的代替图的照片；
[图4]图4是表示病理组织学分析结果的代替图的照片；
[图5]图5是表示传代中的培养软骨细胞的VEGFR2的变化的代替图的照片；
[图6]图6是表示软骨细胞的可传代数和PDL的代替图的图表；
[图7]图7是表示20岁女性的培养成熟软骨细胞(P＝13)的代替图的照片；
[图8]图8是表示63岁女性的培养成熟软骨细胞(P＝13)的代替图的照片；
[图9]图9是表示37岁女性的培养成熟软骨细胞(P＝14)的代替图的照片；
[图10]图10是表示29岁女性的培养成熟软骨细胞(P＝14)的代替图的照片。
具体实施方式
以下使用附图而针对用于实施本发明的方式进行说明。本发明并不受限于以下说明的方式，也包含在本领域技术人员显而易见的范围内从以下的方式进行适当修改而成的方法。
本说明书中记载的最初的发明涉及成熟软骨细胞的制造方法。此成熟软骨细胞例如如后文所述可用于软骨再生术等。
此成熟软骨细胞的制造方法包含使用第一培养用培养基培养软骨而获得成熟软骨细胞的软骨培养工序。
而且，第一培养用培养基为包含氢化可的松以及FGF-2的培养基。此培养基也可包含自身血清以及FBS中的任一者或两者。
软骨的例子为耳郭软骨。软骨可以是经切碎的软骨(微小软骨)。也可以是将软骨切碎并在洗净后去除血液成分的物质。
软骨培养工序例如包含在2％以上且15％以下的碳酸气体以及1％以上且10％以下的氧气的环境下培养软骨的工序。软骨培养工序可以在初代培养和传代培养中使用不同的培养基。例如，在初代培养中，可以使用包含自身血清以及FGF-2的培养基。并且，例如在将软骨或成熟软骨细胞冷冻保存一定时间后进行培养的情形，也可以使用包含自身血清、FBS、氢化可的松以及FGF-2的培养基。
本说明书中记载的与上述不同的发明涉及含有成熟软骨细胞的组合物的制造方法。含有成熟软骨细胞的组合物是用于软骨再生的移植所使用的组合物。含有成熟软骨细胞的组合物是使用于耳郭形成、外耳道形成、鼻形成、下颌形成、颧骨的硬组织凹陷成形术、颅的硬组织凹陷成形术、气管、漏斗胸等硬组织凹陷成形术的组合物。
软骨培养工序
软骨培养工序是使用第一培养用培养基培养软骨而获得成熟软骨细胞的工序。软骨培养工序也可以将采集到的软骨(洗净后)直接培养。并且，软骨培养工序可以是将已裁剪的微小软骨进行培养的工序，也可以是将已切碎过滤的微小软骨进行培养的工序。以下，基于将已切碎过滤的微小软骨进行培养的工序进行说明。
第一培养用培养基是包含氢化可的松以及FGF-2的培养基。此培养基也可以包含自身血清以及FBS中的任一者或两者。第一培养用培养基优选为包含自身血清、氢化可的松以及FGF-2的培养基，或者包含FBS、氢化可的松以及FGF-2的培养基。
在培养基中，只要在基本培养基中适当添加必要的要素即可。基本培养基的例子为α-MEM培养基、基础Eagle培养基(BME)以及DMEM。试剂可以适当添加用于培养基的公知的试剂即可。试剂的例子为胎牛血清(FBS)、HC(氢化可的松)、FGF2、IGF(胰岛素样生长因子)、胰岛素、PDGF(血小板衍生生长因子)、ACTH(促肾上腺皮质激素)、LIF(白血病抑制因子)、TGFβ、BMP、类固醇、硫酸软骨素、大豆胰蛋白酶抑制剂、抗坏血酸、透明质酸、脯氨酸、地塞米松、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸。在培养基中添加抗坏血酸等的情形，也可以添加2-磷酸盐等盐形式的物质。分别只要以成为0.1ng/mL以上且20μg/mL以下(或0.2ng/mL以上且10μg/mL以下)的方式添加至培养基即可。此等只要因应精制程度或需要量而适当调节并添加即可。在FBS的基础上也可以添加自身血清。并且，也可以使用无血清培养基。无论如何，优选为在培养基中添加HC(氢化可的松)以及FGF-2。
培养用培养基的例子是在α-MEM培养基中添加1-10％胎牛血清(FBS)、20ng/ml以上且100ng/ml以下的氢化可的松(Hydrocortisone)、5ng/ml以上且20ng/ml(或50ng/ml)的FGF2(Fibroblast Growth Factor 2，成纤维细胞生长因子2)的培养基。也可以与1-10％胎牛血清(FBS)一起添加1-10％自身血清，或代替1～10％胎牛血清(FBS)而添加1-10％自身血清。此等量可以适当调节。例如，FBS以及自身血清可以在培养基中被包含0.1％-20％。
也可以使微小软骨在一般的培养条件下进行培养/增殖。细胞量能从10％左右到100％汇合的状态为止。并且，也能在如超过100％汇合般的高密度、多层状态下进行培养。也可以在移植后立即或静置一段时间后，使其转移到低氧状态。低氧培养例如可以混合市场上销售的氮气等并使用降低氧分压的类型的低氧培养箱，也可以对适当的空间吹入氮气等而降低氧分压等而进行培养。
软骨培养工序例如包含在2％以上且15％以下的碳酸气体以及1％以上且10％以下的氧气的环境下培养软骨的工序。软骨培养工序也可以在初代培养和传代培养中使用不同的培养基。例如，在初代培养中，可以使用包含自身血清以及FGF-2的培养基。并且，例如在将软骨或成熟软骨细胞冷冻保存一定时间后进行培养的情形，也可以使用包含FBS、氢化可的松以及FGF-2的培养基。
含有成熟软骨细胞的组合物的取得工序
含有成熟软骨细胞的组合物的取得工序是用于获得含有成熟软骨细胞的组合物的工序，所述含有成熟软骨细胞的组合物包含成熟软骨细胞和通过软骨培养工序所得到的条件培养基(conditioned medium)。含有成熟软骨细胞的组合物也可以包含成熟软骨细胞和培养上清液。
成熟软骨细胞的优选例子为分别以IL-6的4倍以上的量表达趋化因子/细胞因子亦即白细胞介素8(IL-8)、生长相关基因(GRO)、单核细胞趋化因子-1(MCP-1)以及VEGF的细胞。也可以为以比IL-6的10倍以上的量表达IL-8、GRO以及MCP-1中的任一种或两种以上的细胞，也可以为以比IL-6的20倍以上的量表达IL-8、GRO以及MCP-1中的任一种或两种以上的细胞。通过如此包含血管再生促进能力高且炎症性少的细胞因子/趋化因子，而含有成熟软骨细胞的组合物因为在移植时不会引起炎症，发挥高的血管促进能力，所以适于移植。此含有成熟软骨细胞的组合物特别优选为包含从进行移植的患者采集的软骨的物质。
成熟软骨细胞的优选例子为将白细胞介素8(IL-8)、生长相关基因(GRO)、单核细胞趋化因子-1(MCP-1)以及VEGF中的任一种或两种以上以TNF-α的10倍以上的量进行表达的成熟软骨细胞，优选为以TNF-α的50倍以上的量进行表达的成熟软骨细胞，优选为以TNF-α的100倍以上的量进行表达的成熟软骨细胞，优选为以TNF-α的500倍以上的量进行表达的成熟软骨细胞。
成熟软骨细胞的优选例子为将白细胞介素8(IL-8)、生长相关基因(GRO)、单核细胞趋化因子-1(MCP-1)以及VEGF中的任一种或两种以上以IL-1-β的10倍以上的量进行表达的成熟软骨细胞，优选为以IL-1-β的50倍以上的量进行表达的成熟软骨细胞，优选为以IL-1-β的100倍以上的量进行表达的成熟软骨细胞，优选为以IL-1-β的500倍以上的量进行表达的成熟软骨细胞。
成熟软骨细胞的优选例子为将白细胞介素8(IL-8)、生长相关基因(GRO)、单核细胞趋化因子-1(MCP-1)以及VEGF中的任一种或两种以上以INF-γ的10倍以上的量进行表达的成熟软骨细胞，优选为以INF-γ的50倍以上的量进行表达的成熟软骨细胞，优选为以INF-γ的100倍以上的量进行表达的成熟软骨细胞，优选为以INF-γ的500倍以上的量进行表达的成熟软骨细胞。
含有成熟软骨细胞的组合物只要因应目的而包含适当量的成熟软骨细胞或条件培养基(或培养上清液)即可。并且，此组合物只要与一般的组合物同样地收纳在必要的容器中并可因应需要被利用即可。成熟软骨细胞的量例如可以是每一次使用为1×104细胞以上且1×1010细胞，也可以是每一次使用为1×105细胞以上且1×108细胞。
包含培养上清液作为有效成分的制剂如同例如日本特开2013-18756号公报、日本特许第5139294号以及日本特许第5526320号公报中所公开，为公知常识。因此，可使用公知的方法制造包含条件培养基的组合物。
成熟软骨细胞的培养上清液的例子为将通过离心分离而将培养上清液进行固液分离而得到的上清成分亦即培养上清液通过冷冻干燥而去除水分所得到的处理物、使用蒸发器等将培养上清液进行减压浓缩所得到的处理物、使用超滤膜等将培养上清液进行浓缩所得到的处理物、或者使用过滤器将培养上清液进行固液分离所得到的处理物、或者进行如上述般的处理前的培养上清的原液。并且，例如，也可以将培养过本发明的成熟软骨细胞的上清液进行离心分离(例如，1000×g，10分钟)后，用硫酸铵(例如，65％饱和硫酸铵)进行分级，将沉淀物用适当的缓冲液悬浮后进行透析处理，用注射过滤器(例如，0.2μm)进行过滤，而获得无菌的培养上清液。采集到的培养上清液可以直接使用，也可以先进行冷冻保存并在使用时解冻使用。并且，亦可以加入药剂学上允许的载体，以成为容易处理的液量的方式分注到灭菌容器。再者，作为感染性病原体风险的对策，也可以通过病毒筛选过滤器或紫外线照射而对培养上清液进行处理。含有成熟软骨细胞的组合物优选为包含1mL以上且1000mL以下的培养上清液作为一个给药单元，更优选为30mL以上且300mL以下。
通过在移植时同时加入培养软骨细胞和条件培养基(例如成熟软骨细胞的上清液)进行移植，而提高软骨周围的血管再生，通过使软骨细胞移植的植活率提升，而使再生软骨大幅增大，可使移植成功。此组合物例如使用于耳郭形成、鼻形成、下颌形成、颧骨的硬组织凹陷成形术、颅的硬组织凹陷成形术、漏斗胸的硬组织凹陷成形术。
本说明书中记载的与上述不同的发明涉及血管再生促进剂。此血管再生促进剂例如包含通过上述的任一含有成熟软骨细胞的组合物的制造方法所得到的含有成熟软骨细胞的组合物。亦即，此血管再生促进剂与上述的含有成熟软骨细胞的组合物同样。血管再生促进剂例如可以是注射剂。只要在注射器内预先包含上述的含有成熟软骨细胞的组合物，再因应需要而与患者的组织进行混合，并移植到患者的需要处即可。血管再生促进剂包含含有成熟软骨细胞的组合物，所述含有成熟软骨细胞的组合物包含管诱导因子和VEGFR2阳性细胞。而且，此方法包含通过上述的含有成熟软骨细胞的组合物的制造方法而制造含有成熟软骨细胞的组合物的工序。
实施例1
从患者的耳朵残骸采集1平方厘米的耳郭软骨。将碎片仔细切碎，并使用已补充抗生素的磷酸缓冲生理盐水(Ca-)进行冲洗。接下来，将它们用0.3％胶原酶(WorthingtonBiochemical，Freehold，NJ)/PBS进行处理，用搅拌器在37℃旋转4-6小时后，分离软骨细胞。在初代培养中，将软骨细胞以1×103cells/cm2的细胞密度进行接种，并使用已添加10％自体血清、FGF-2(5～10ng/ml，FIBRAST(注册商标)，Kaken Pharmaceuticals，东京)的DMEM培养基进行初代培养。在传代培养中，在每个175cm2培养瓶以1×103cells/cm2接种软骨细胞。接下来，接种传代培养细胞，得到包含软骨细胞以及CM的移植材料以作为最终产物(1×107cells/1cc CM)。培养基是使用在高糖-DME培养基中添加5％FBS(Fetal BovineSerum)、40ng/ml氢化可的松、10ng/ml成纤维细胞生长因子2而成的培养基。培养条件是在5-10％碳酸气体下进行。在初代培养第12天回收2-3×106cells的培养细胞。将此细胞的一部分进行冷冻，并将其它细胞以4-5×104/cm2的密度进行接种，培养14天。在15天后用PBS(-)清洗3次，利用已从上述的培养基成分去除FBS的培养基培养2天。将此培养基作为条件培养基(Conditioned Medium)并且用于分析。
培养基组成
培养基是使用在高糖-DME培养基中添加5％胎牛血清(FBS，Fetal BovineSerum)、40ng/ml氢化可的松(Hydrocortisone)、10ng/ml FGF2(Fibroblast GrowthFactor 2，成纤维细胞生长因子2)而成的培养基。培养条件是在10％碳酸气体、5％氧气下进行。图1是表示实施例1的软骨细胞的相差显微镜照片的代替图的照片。
实施例2
利用抗体固定化磁珠法(Antibody-Immobilized Magnetic Beads法)进行培养成熟软骨细胞的条件培养基(Conditioned Medium)的细胞因子/趋化因子分析。将条件培养基(Conditioned Medium)样品在13000G、4℃离心分离5分钟所得到的上清液用于测量。使用Luminex(注册商标)系统测量条件培养基(Conditioned Medium)内的40个目标蛋白质的浓度。将已进行预处理的样品以每孔25μl使用，并进行3次测量。根据手册追加一份标准液，且准备7份5倍稀释系列，并测量3次。对象蛋白质40种类为EGF、FGF-2、嗜酸性粒细胞趋化因子、TGF-α、G-CSF、Flt-3L、GM-CSF、不规则趋化因子、IFNα2、IFNγ、GRO、IL-10、MCP-3、IL-12P40、MDC、IL-12P70、PDGF-AA、IL-13、PDGF-AB/BB、IL-15、sCD40L、IL-17A、IL-1RA、IL-1α、IL-9、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IP-10、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、TNFα、TNFβ以及VEGF。
用Antibody-Immobilized Magnetic Beads法进行培养成熟软骨细胞的条件培养基(Conditioned Medium)的细胞因子/趋化因子分析。将结果表示于图2。图2是表示培养培养成熟软骨细胞时所得到的条件培养基(Conditioned Medium)中所包含的细胞因子以及趋化因子的分析结果的代替图的图表。如同图2所示，证明了大量(ng/ml)产生血管再生能力高的细胞因子亦即IL-8、GRO、MCP-1。另一方面还显示引起炎症的TNF-α或炎症激发力强的IL-1-β、INF-γ在此细胞中几乎没有产生，因此为安全。
实施例3
对于人的软骨细胞移植(用于耳郭重建的软骨形成)
[病例1]：22岁男性，因为两侧小耳症(无外耳)以及颧骨发育不良，所以进行由培养软骨所进行的重建治疗。从右残留耳郭软骨采集软骨组织15mm×15mm，进行除菌并进行接种培养的培养基是使用在高糖-DME培养基中添加自体血清以及5％FBS、氢化可的松、FGF2 2而成的培养基。在初代培养第11天回收4.3×106cells，在初代培养第13天回收2.2×107cells的培养细胞。将此培养细胞暂时冷冻保存。移植前，将已解冻的细胞在30个底面积为150cm2的烧瓶中培养40天。准备总量为230cc(1×107cells/1cc CM)的包含培养成熟软骨细胞以及条件培养基(Conditioned Medium)的组合物。在两侧下腹部注入移植包含培养成熟软骨细胞以及条件培养基(Conditioned Medium)的组合物，在移植1年后，使用采集的再生软骨重建两侧耳郭和颧骨。
图3是表示移植1年后从腹部采集的再生软骨的代替图的照片。图3中，再生软骨的大小为80×200×8mm。软骨的切断面为全层性白色软骨组织。
接下来，进行用于证明软骨已再生的病理组织学性分析。将结果显示于图4。图4是表示病理组织学性分析的结果的代替图的照片。图4A表示HE染色的结果。图4B表示甲苯胺蓝染色的结果。图4C表示阿尔新蓝染色的结果。图4D表示Elastica-van Gieson染色的结果。如同图4A所示，软骨的周围形成软骨膜，其中发现许多血管腔。此表示从软骨膜将营养供给往软骨。并且，依据图4B至图4D，因为分别被对软骨进行特异性染色的色素染色，所以可以知道形成有软骨。如同图4所示，可以知道在移植后形成有成熟的再生软骨和再生软骨膜，维持着源自耳郭的弹性软骨组织的性状和特性。
实施例4
对于人的软骨细胞移植：漏斗胸胸部凹陷重建
对于18岁男性，在漏斗胸术后发现胸部凹陷(正中剑突周边～季肋部)残留。从左耳郭采集10mm×7mm的软骨组织，进行除菌并进行接种培养。培养基是使用在高糖-DME培养基中添加自体血清、氢化可的松、成纤维细胞生长因子2而成的培养基。在初代培养第21天回收4.2×106cells，在初代培养第23天回收3.3×106cells的培养细胞。将此培养细胞暂时冷冻保存。移植前，将已解冻的细胞在15个底面积150cm2的烧瓶中培养40天。培养成熟软骨细胞和条件培养基的移植总量为84mL 1×107cells/1cc CM)。移植后2年，软骨未被吸收，胸部的外貌形态良好。
实施例5
对于人的软骨细胞移植：鼻部变形、颅的凹陷变形
20岁女性，因为确认到鞍鼻、短鼻、前额部的凹陷变形，所以在前额部和鼻部进行由培养软骨所进行的重建治疗。从左耳郭采集10mm×15mm的软骨组织，进行除菌并进行接种培养。培养基是使用在高糖-DME培养基中添加自体血清、氢化可的松、成纤维细胞生长因子2而成的培养基。在初代培养第18天回收1.1×107cells的培养细胞。将此培养细胞暂时冷冻保存。移植前，将已解冻的细胞在7个底面积150cm2的烧瓶中培养40天。培养成熟软骨细胞和条件培养基的移植总量为27.3mL(1×107cells/1cc CM)。移植后3年，软骨未被吸收，外貌形态良好。
实施例6
传代中的培养软骨细胞的VEGFR2的变化
VEGFR2只在血管内皮细胞以及其前体细胞中表达。因此可知，若VEGFR2混合存在，则包含培养成熟软骨细胞以及条件培养基(Conditioned Medium)的组合物会形成血管。移植所使用的是P2到P4的细胞。关于VEGFR2，从P1到P4都存在表达VEGFR2的细胞。在此软骨细胞的培养系统中，明确了从P1到P4全部都包含内皮系统的细胞。因此，若移植此细胞系统，则血管内皮细胞会与软骨组织一起出现，其结果会在软骨组织的周围构筑血管网，可期待维持移植后的软骨组织。图5是表示传代中的培养软骨细胞的VEGFR2的变化的代替图的照片。
实施例7
接下来，以调查培养软骨细胞的可传代数为目的，测量软骨细胞的可传代数和PDL。已肿瘤化的细胞具有增殖不会停止而会继续增殖的特性。以确认此次制作的培养软骨细胞的安全性为目的，进行软骨细胞的老化的检查。培养细胞，并继续传代，检查增殖是否停止。
将4名的耳郭软骨细胞培养3个月，测量直至停止增殖的PDL(CPD)。(意指分裂了几次)。将结果显示于图6。图6是表示软骨细胞的可传代数和PDL的代替图的图表。如图6所示，确认到发生由老化所导致的增殖停止。
P14＝总共84天培养:纵轴CDL(＝PDL).A(20岁、B(37岁、C(29岁、D(63岁)
若细胞老化，则显示老化关联β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)的阳性染色，因此，调查细胞老化的4名的传代P13、P14的耳郭软骨细胞的老化相关酶亦即衰老相关半乳糖苷酶活性染色的结果，在各个阶段进行衰老相关半乳糖苷酶活性染色的结果，因为在增殖停止前发现上述酶活性，所以确认到发生由老化所导致的增殖停止。衰老相关半乳糖苷酶活性染色是使用SA X-Gal染色细胞衰老试剂盒:OZBIOSCIENCES(Catalog Number:GXS0003)。
图7是表示20岁女性的培养成熟软骨细胞(P＝13)的代替图的照片。
A.20岁女性软骨细胞(在P-13停止增殖)
Figure BDA0004169359970000131
总PDL:27.6676SA X-Gal:92％阳性
图8是表示63岁女性的培养成熟软骨细胞(P＝13)的代替图的照片。
D.63岁女性软骨细胞(在P-13停止增殖)
Figure BDA0004169359970000132
总PDL:27.6676SA X-Gal:95％阳性
图9是表示37岁女性的培养成熟软骨细胞(P＝14)的代替图的照片。
B.37岁女性软骨细胞
Figure BDA0004169359970000133
总PDL:44.0962SA X-Gal:100％阳性
图10是表示29岁女性的培养成熟软骨细胞(P＝14)的代替图的照片。
C.29岁女性软骨细胞
Figure BDA0004169359970000134
总PDL:47.1421SA X-Gal:100％阳性
考察
为了抑制再生软骨的形成和其吸收，需要形成软骨膜。包含大量的细胞的人工软骨结构通常为了生长和增殖而需要高氧环境。因此，在软骨未形成到结构的中心的情形，不会形成软骨膜[5]。因此，其等的血液和营养素的供给受到相当大的限制。此已知会引起细胞死亡和人工构筑物不可避免的坏死，之后，会丧失形状和功能[6-8]。
另一方面，含有成熟软骨细胞的组合物因为包含血管再生促进能力高且炎症性少的细胞因子/趋化因子，所以在移植时不会引起炎症并发挥高的血管促进能力，因此在再生软骨周围形成再生软骨膜，因此适于再生软骨的移植。软骨的条件培养基包括IL6的7倍的VEGF、IL6的20倍的GRO、IL6的80倍的IL8、IL6的100倍的MCP-1。TNF-α或炎症激发力强的IL-1-β、INF-γ在此细胞中几乎没有产生，因此也表示是安全的。并且，在老化试验中，确认到发生增殖停止，因此确认不是已肿瘤化的细胞，也表示是安全的。
在文献(Mikula-Pietrasik J Kuczmarska A,Kucin′ska M.MuriasetM.al.Resveratrol and its synthetic derivatives exert opposite effects onmesothelial cell-dependent angiogenesis via modulating secretion of VEGF andIL-8/CXCL8.Angiogenesis 2012；15:361-376以及上述Keglowich1人等)中也示出IL-8的血管形成能力。
MCP-1作为血管新生趋化因子而被报告，血管形成能力也在其它一个文献(6.NiuJ,Azfer A,Zhelyabovska O,Fatma S,and Kolattukudy PE.Monocyte ChemotacticProtein(MCP)-1Promotes Angiogenesis via a Novel Transcription Factor,MCP-1-induced Protein(MCPIP).J Biol Chem2008 May 23；283(21):14542-51.doi:10.1074/jbc.M802139200)中示出。并且，文献(3.Hong KH,Ryu J,Han KH.MonocyteChemoattractant protein-1-induced Angiogenesis Is Mediated by VascularEndothelial Growth factor-A.Blood 2005；105:1405-1407DOI:10,1182/blood-2004-08-3178)示出MCP-1介导VEGF的血管形成能力。在血管形成中，必须出动巨噬细胞，MCP-1是进行这一操作的必要因子。
因此，显示在实施例中的培养软骨细胞所分泌的条件培养基中存在的4种细胞因子(MCP-1、IL-8、GRO、VEGF)全部具有血管形成能力。
产业可利用性
本发明能被利用于医疗器械的领域等。

Claims (9)

1.一种成熟软骨细胞的制造方法，其特征在于，包含使用第一培养用培养基培养软骨而获得成熟软骨细胞的软骨培养工序，其中，
第一培养用培养基为包含氢化可的松以及FGF-2的培养基。
2.根据权利要求1所述的成熟软骨细胞的制造方法，其特征在于，
所述软骨为耳郭软骨。
3.根据权利要求1所述的成熟软骨细胞的制造方法，其特征在于，
所述软骨培养工序包含在2％以上且15％以下的碳酸气体以及1％以上且10％以下的氧气的环境下培养所述软骨的工序。
4.一种含有成熟软骨细胞的组合物的制造方法，其特征在于，包含：
软骨培养工序，其使用第一培养用培养基培养软骨而获得成熟软骨细胞；以及
含有成熟软骨细胞的组合物的取得工序，其获得包含成熟软骨细胞的组合物，所述包含成熟软骨细胞的组合物包含所述成熟软骨细胞和通过所述软骨培养工序而获得的条件培养基(conditioned medium)，
第一培养用培养基为包含氢化可的松以及FGF-2的培养基。
5.根据权利要求4所述的含有成熟软骨细胞的组合物的制造方法，其特征在于，
所述软骨培养工序包含在2％以上且15％以下的碳酸气体以及1％以上且10％以下的氧气的环境下培养所述软骨的工序。
6.根据权利要求4所述的含有成熟软骨细胞的组合物的制造方法，其特征在于，
所述条件培养基包含白细胞介素8(IL-8)、生长相关基因(GRO)、单核细胞趋化因子-1(MCP-1)以及VEGF。
7.根据权利要求4所述的含有成熟软骨细胞的组合物的制造方法，其特征在于，
所述含有成熟软骨细胞的组合物是用于软骨再生的移植所使用的组合物。
8.根据权利要求4所述的含有成熟软骨细胞的组合物的制造方法，其特征在于，
所述含有成熟软骨细胞的组合物是使用于耳郭形成、外耳道形成、鼻形成、下颌形成、颧骨的硬组织凹陷成形术、颅的硬组织凹陷成形术、气管、漏斗胸等硬组织凹陷成形术的组合物。
9.一种血管再生促进剂的制造方法，其特征在于，
所述血管再生促进剂包含含有成熟软骨细胞的组合物，所述含有成熟软骨细胞的组合物包含血管诱导因子和VEGFR2阳性细胞，
所述血管再生促进剂的制造方法包含通过如权利要求4所述的含有成熟软骨细胞的组合物的制造方法而制造所述含有成熟软骨细胞的组合物的工序。
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