CN110951687B - 一种扩增胎盘源造血干细胞的方法 - Google Patents

一种扩增胎盘源造血干细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及一种扩增造血干细胞的方法，具体涉及一种扩增胎盘源造血干细胞的方法。本法使用共培养体系对胎盘血单个核细胞进行共培养，所述共培养体系包括胚胎干细胞形成的饲养层、激动剂、细胞生长因子和灭活血清，经共培养后获得活化细胞。再对活化的细胞进行继代培养，可获得大量的CD34+造血干细胞。按照本方法进行胎盘源造血干细胞的扩增，可以增加造血干细胞扩增的数量和速度。本技术方案可以应用于造血干细胞的扩增的实践操作中，从而增加造血干细胞的移植成功率。

Description

一种扩增胎盘源造血干细胞的方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种扩增造血干细胞的方法，具体涉及一种扩增胎盘源造血干细胞的方法。
背景技术
胎盘源造血干细胞是造血干细胞的一个重要来源，是原始造血细胞。由胎盘源的造血干细胞可定向分化、增殖形成不同的血细胞系，并进一步生成血细胞。胎盘组织较其他组织(例如骨髓)，造血干细胞的含量高，并且获取胎盘组织中的造血干细胞的方法也相对容易，胎盘源的造血干细胞将有望取代骨髓、动员后外周血和脐带血造血干细胞用于血液疾病等的治疗中。
但是目前利用直接从胎盘上分离得到的造血干细胞进行血液疾病等的治疗时，仍存在造血干细胞数量不够、纯度不佳等问题，所以通常需要对胎盘源的造血干细胞进行扩增处理，使用扩增后造血干细胞进行血液疾病的治疗。在现有技术中，对造血干细胞进行扩增处理的手段往往都是对造血干细胞(存在于在单个核细胞群中)进行继代培养，并在培养基中加入细胞因子等物质以刺激造血干细胞增殖和生长。但是，单纯使用细胞因子来刺激单个核细胞群中的造血干细胞增殖的效果并不理想，且经过该培养方法扩增得到的造血干细胞往往会出现细胞损伤、细胞生长状态欠佳的情况，并且细胞扩增的数量和速度都不能满足要求。以这种方法得到的造血干细胞进行移植治疗，移植后的细胞会出现增殖能力差的情况，甚至有很大的可能会导致造血干细胞移植的失败。
发明内容
本发明的目的在于提供一种扩增胎盘源造血干细胞的方法，按照本方法进行胎盘源造血干细胞的扩增，可以增加造血干细胞扩增的数量和速度。
为解决上述技术问题，本发明技术方案如下：
一种扩增胎盘源造血干细胞的方法，包括以下步骤：
(1)共培养步骤：使用共培养体系对胎盘血单个核细胞进行共培养，所述共培养体系包括胚胎干细胞形成的饲养层、激动剂、细胞生长因子、灭活血清和培养基Ⅰ，经共培养后获得活化细胞；
(2)传代培养步骤：使用传代培养体系对活化细胞进行传代培养，传代培养体系包括激动剂、细胞生长因子、灭活血清和培养基Ⅱ。
采用上述技术方案，技术原理如下：在共培养步骤中，使用胚胎干细胞作为饲养层，可提供多种细胞因子为胎盘血单个核细胞提供营养，并塑造一个利于造血干细胞生长的微环境。单个核细胞中的造血干细胞从胎盘血中分离，在后续共培养过程中，需要一段时间的适应和恢复，无法很快恢复其自身的功能，所以需要给细胞提供充足且丰富的营养物质和生长环境，胚胎干细胞释放出来的细胞因子和创造的微环境刚好满足了造血干细胞恢复期的要求，给其提供一个顺利的过渡期，为后期的扩增打好基础。胚胎干细胞的饲养层联合激动剂和细胞因子，共同促进胎盘血单个核细胞中的造血干细胞活化，增加其增殖和生长的活性，并一定程度上抑制其分化。经过共培养之后，胎盘血单个核细胞中的造血干细胞处于增殖活跃状态，在后续的传代培养过程当中，造血干细胞大量增殖，造血干细胞的扩增速度和数量均能满足实际应用的需求。
有益效果：
(1)利用激动剂联合细胞因子对胎盘造血干细胞扩增，对CD34+的细胞(造血干细胞的表面标记之一)扩增效果明显，从开始的不足1％扩增到30％以上，数量巨大，解决了现有扩增倍数低下，临床研究使用数量不足的问题。
(2)胚胎干细胞(ES)比间充质干细胞更具有原始性，其分泌多种细胞因子为胎盘源造血干细胞提供营养，同时塑造一个适合细胞生长及扩增的微环境，最终胚胎干细胞可被降解，避免了多细胞的交叉混合。
(3)利用本方案进行造血干细胞的扩增，所需时间为10天左右，相比一般的14天左右的周期，时间周期更短，降低生产成本，减少人力资源浪费，更加适合于规模化生产。细胞培养周期越短，细胞扩增代数越少，分化率更低，细胞的原始性越强，细胞的运用(如造血干细胞移植等)效果更好。
进一步，在步骤(1)中，饲养层由以下方法制备：培养胚胎干细胞至细胞融合度达到80-90％，形成贴壁细胞层；除去培养基后，-80℃冷冻处理所述贴壁细胞层，然后将所述贴壁细胞层室温放置处理，冷冻处理和室温放置处理交替进行2-3次，获得饲养层。
采用上述技术方案，对形成的贴壁细胞层进行冷冻和室温放置交替处理，将胚胎干细胞死亡裂解，将细胞中的细胞因子释放出来。细胞因子种类齐全，为起初细胞的刺激和扩增提供丰富的营养，胚胎干细胞裂解释放的大量细胞因子为造血干细胞营造适合其生长的微环境。
进一步，培养胚胎干细胞的培养基为MSC培养基；单次冷冻处理的时长为10-15min，单次室温放置处理的时长为10-15min。
采用上述技术方案，MSC培养基是适于胚胎干细胞生长的常规培养基，性质稳定且易于获取。采用上述的冷冻时间和室温放置时间，可以在确保将胚胎干细胞死亡裂解，将细胞中的细胞因子释放出来。胚胎干细胞的室温放置时间和冻存时间不能过短，否则细胞的不能完全杀死，细胞因子也不能完全释放出来，还有可能造成和造血干细胞的多细胞交叉污染。胚胎干细胞的室温放置时间和冻存时间不能过长，否则会影响胚胎干细胞释放的细胞因子的活性。
进一步，在步骤(1)和步骤(2)中，激动剂为UM171，细胞生长因子包括SCF、FLT3、TPO、IL-3和IL-6。
采用上述技术方案，小分子化合物UM171联合多种细胞因子对胎盘造血干细胞扩增有较大的促进作用。UM171作为一种造血干细胞激动剂，可以作用于转化生长因子β信号通路的几种重要蛋白质，从而促进造血干细胞的扩增。SCF(干细胞因子)、FLT3(FMS样的酪氨酸激酶3)、TPO(促血小板生成素)、IL-3(白细胞介素-3)和IL-6(白细胞介素-6)均为造血干细胞生长环境中存在的细胞因子，对营造细胞生长为环境并刺激细胞扩增起到了促进作用。
进一步，步骤(1)中的胎盘血单个核细胞由如下方法制备：取胎盘血离心，获得血浆和血细胞，用生理盐水重悬血细胞，使用Ficoll试剂进行离心分离，获得单个核细胞。
采用上述技术方案，可从胎盘血中获取单个核细胞，其中含有待扩增的胎盘源的造血干细胞。
进一步，步骤(1)和步骤(2)中的灭活血清由如下方法制备：取胎盘血离心，获得血浆和血细胞，对血浆进行灭活处理后进行离心处理，获得灭活血清。
采用上述技术方案，可避免细胞共培养时胚胎干细胞释放的物质对造血干细胞的抑制和排斥作用，并为造血干细胞提供全面营养和模拟血液微环境。因为胚胎干细胞和造血干细胞通常不是来源于同一个体，发明人在使用胚胎干细胞作为饲养层的尝试中，发现虽然胚胎干细胞分泌的生长因子可以很好的刺激造血干细胞中CD34+细胞扩增，但是这种促进作用并没有达到预期。发明人分析原因在于，胚胎干细胞对造血干细胞恢复期的生长和刺激起到很大的促进作用，但后期扩增传代后的营养供应和刺激有限，并且由于胚胎干细胞和造血干细胞来自异体，胚胎干细胞释放部分物质对造血干细胞具有抑制和排斥作用。如果能够消除胚胎干细胞对造血干细胞轻微的抑制作用，胚胎干细胞对造血干细胞的增值促进作用将会更强。同时发明人也尝试了加入各种类型灭活血清(包括常用的胎牛血清等)，想通过灭活血清提供更多的营养物质，以维持后期的快速扩增。但是意外的发现，在加入胎盘血灭活血清的培养体系中，造血干细胞的增殖速度得以加快，胚胎干细胞对造血干细胞的刺激作用得以进一步增强，胚胎干细胞的轻微抑制作用消失。
进一步，对血浆进行灭活处理的温度为55-58℃，时长为20-40min。
采用上述技术方案，获得的灭活血清，可以为待扩增的造血干细胞提供模拟自身血液的微环境，使得造血干细胞的恢复及适应期变短。该灭活血清还具有营养物质全面的特点，促进造血干细胞的快速扩增。灭活温度过低，没有对血浆中的纤维蛋白和黏连蛋白等进行充分的灭活处理，无法离心去除，在加入到培养扩增体系中后，大量的细胞结团，造成细胞浪费严重。灭活温度过高，营养成分被破坏严重。
进一步，其特征在于，培养基Ⅰ为Stem SpanⅡ无血清培养基。
采用上述技术方案，Stem SpanⅡ无血清培养基是常规的造血干细胞用培养基，性质稳定且易于获取。
进一步，在步骤(1)中，激动剂在共培养体系中的含量为50ng/ml。
采用上述技术方案，采用上述浓度的激动剂可以对造血干细胞的扩增起到较好的促进作用。浓度过低刺激作用不明显，浓度过高会抑制造血干细胞的正常生长。
进一步，共培养步骤的时长为3-5天；传代培养步骤的时长为3-5天。
采用上述技术方案，本方案的培养方法可将培养时间缩短至6-10天。时间周期短，降低生产成本，减少人力资源浪费，更加适合于规模化生产。细胞培养周期越短，细胞扩增代数越少，分化率更低，细胞的原始性越强，细胞的运用效果更好。
附图说明
图1为实施例1-3和对比例1的表面抗原检测的柱状结果图。
图2为实施例1的流式细胞术检测结果图(CD34)。
图3为实施例1的流式细胞术检测结果图(CD38)。
图4为实施例1的流式细胞术检测结果图(CD133)。
图5为实施例1的集落实验结果图(20×光镜)。
图6为实施例2的流式细胞术检测结果图(CD34)。
图7为实施例2的流式细胞术检测结果图(CD38)。
图8为实施例2的流式细胞术检测结果图(CD133)。
图9为实施例2的集落实验结果图(20×光镜)。
图10为实施例3的流式细胞术检测结果图(CD34)。
图11为实施例3的流式细胞术检测结果图(CD38)。
图12为实施例3的流式细胞术检测结果图(CD133)。
图13为实施例3的集落实验结果图(20×光镜)。
图14为对比例1的流式细胞术检测结果图(CD34)。
图15为对比例1的流式细胞术检测结果图(CD38)。
图16为对比例1的流式细胞术检测结果图(CD133)。
图17为对比例1的集落实验结果图(20×光镜)。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
实施例1：扩增胎盘源的造血干细胞的实例
1.预处理：将分离检测合格的胚胎干细胞以2×106个细胞接种于T75培养瓶中，加入MSC培养基，待细胞达到90％左右融合度后，去除培养基(不可清洗贴壁细胞)，将培养瓶放入-80℃冰箱快速冰冻10min后取出，室温放置10min后又再次放入-80℃冰箱，反复冻融3次后备用。
2.血浆分离：将分离得到胎盘血分装到50ml离心管中，配平后，置于离心机离心(2000rmp,15min,室温,升8降7)，使血浆和血细胞分离,血浆56℃灭活30min后,离心去沉淀(3000rmp,5min,室温,升8降7)，获得灭活血清，备用。
3.胎盘血单个核细胞制备：将去除血浆后的血细胞用2倍体积的生理盐水混匀。将上述混悬物小心加到含15mlFicoll层的50ml离心管中离心(1800rmp,18min，室温，升5降3)。离心完成后，吸取PBMC层(单个核细胞层)，尽量吸尽两液面交界处的细胞，在吸取液中加入生理盐水，生理盐水和吸取液的体积比为3：1，离心(1600rmp,12min，室温，升8降7)。离心完成后，去除上清液，加入生理盐水混匀吹打均匀定容至50ml，离心(1400rmp,12min，室温，升8降7)，除去上清液，获得单个核细胞。
4.细胞接种(day0)：将制备好的单个核细胞用Stem SpanⅡ无血清培养基吹打混匀，按照1.5×106个/ml细胞量接种于预处理过T75培养瓶中，补充培养基至10ml，加入体积浓度为5％的灭活血清，以及添加终浓度为50ng/ml的UM171,终浓度为50ng/ml的SCF，终浓度为50ng/ml的FLT3，终浓度为50ng/ml的TPO，终浓度为10ng/ml的IL-3，终浓度为10ng/ml的IL-6，置于37℃、5％CO2培养箱培养观察。
5.补液(day3)：细胞计数后按照1.5×106个/ml细胞量(细胞量可以为1.2-1.8×106个/ml)接种补加细胞因子及培养基(Stem SpanⅡ无血清培养基)，按照终体积总量加入体积浓度为5％的灭活血清，以及添加终浓度为50ng/ml的UM171,终浓度为50ng/ml的SCF，终浓度为50ng/ml的FLT3，终浓度为50ng/ml的TPO，终浓度为10ng/ml的IL-3，终浓度为10ng/ml的IL-6，置于37℃、5％CO2培养箱培养观察。
6.传代(day5)：细胞计数后将75瓶(步骤5中获得)中的细胞吹匀转入175培养瓶中，按照1.5-2.0×106个/ml细胞量接种补加细胞因子及培养基(Stem SpanⅡ无血清培养基)，按照终体积总量加入体积浓度为5％的灭活血清，以及添加终浓度为50ng/ml的UM171,终浓度为50ng/ml的SCF，终浓度为50ng/ml的FLT3，终浓度为50ng/ml的TPO，终浓度为10ng/ml的IL-3，终浓度为10ng/ml的IL-6，置于37℃、5％CO2培养箱培养观察。
7.补液(day8)：按照1.5-2.0×106个/ml细胞量接种补加细胞因子及培养基(StemSpanⅡ无血清培养基)，按照终体积总量加入体积浓度为5％的灭活血清，以及添加终浓度为50ng/ml的UM171,终浓度为50ng/ml的SCF，终浓度为50ng/ml的FLT3，终浓度为50ng/ml的TPO，终浓度为10ng/ml的IL-3，终浓度为10ng/ml的IL-6，置于37℃、5％CO2培养箱培养观察。
8.细胞收集(day10)：将培养瓶(步骤7中获得)中的细胞收集离心，用生理盐水洗涤两次后，上清做需厌氧检测和内毒素检测，计数后的细胞送检流式(CD34+、CD38-、CD133+)(实验结果见图1、图2、图3和图4)，取适量细胞送检集落(实验结果见表1和图5)，并计算细胞扩增倍数以及CD34阳性率(实验结果见表2)。
实施例2：扩增胎盘源的造血干细胞的实例
本实施例基本同实施例1，不同点在于：
在预处理中，胚胎干细胞的融合度为80％，交替的冷冻处理和室温放置处理重复2次，冷冻处理时长为15min，室温放置处理的时长为15min。
在血浆分离中，灭活血浆的温度为55℃，时长为40min。
实验结束后，将收集的细胞(其中含有大量的造血干细胞)计数后的细胞送检流式(CD34+、CD38-、CD133+)(实验结果见图1、图6、图7和图8)，取适量细胞送检集落(实验结果见表1和图9)，并计算细胞扩增倍数以及CD34阳性率(实验结果见表2)。
实施例3：扩增胎盘源的造血干细胞的实例
本实施例基本同实施例1，不同点在于：
在预处理中，胚胎干细胞的融合度为85％，交替的冷冻处理和室温放置处理重复2次。在血浆分离中，灭活血浆的温度为58℃，时长为20min。
实验结束后，将收集的细胞(其中含有大量的造血干细胞)计数后的细胞送检流式(CD34+、CD38-、CD133+)(实验结果见图1、图10、图11和图12)，取适量细胞送检集落(实验结果见表1和图13)，并计算细胞扩增倍数以及CD34阳性率(实验结果见表2)。
对比例1
本对比例采用的是单个核细胞进行各项检测，也就是空白对照组，单个核细胞的制备过程见实施例1中的第2和第3步，对收集到的单个核细胞进行流式细胞术检测(实验结果见图1、图14、图15和图16)以及集落检测(实验结果见表1和图17)，并计算细胞扩增倍数以及CD34阳性率(实验结果见表2)。
对比例2
本对比例基本同实施例1，不同点在于，在第4-7步中不加入UM171。对收集到的细胞(其中含有大量的造血干细胞)进行流式细胞术检测和集落检测，并计算细胞扩增倍数以及CD34阳性率(实验结果见表2)。
对比例3
本对比例基本同实施例1，不同点在于，在第1步中，不使用冰冻处理和室温放置处理交替进行的方式，直接将去除培养基的带有胚胎干细胞层的T75培养瓶来进行后续的共培养。对收集到的细胞(其中含有大量的造血干细胞)进行流式细胞术检测和集落检测，并计算细胞扩增倍数以及CD34阳性率(实验结果见表2)。由于本对比例中胚胎干细胞没有使用冻融处理，所以在共培养(第4和5步)结束后，培养瓶的底部仍有大量贴壁细胞存在，具有细胞交叉混合的风险，且胚胎干细胞未完全裂解释放细胞因子，没有充分发挥其作用。
对比例4
本对比例基本同实施例1，不同点在于，在第4和5步中，培养基中不加入灭活血清。对收集到的细胞(其中含有大量的造血干细胞)进行流式细胞术检测和集落检测，并计算细胞扩增倍数以及CD34阳性率(实验结果见表2)。
对比例5
本对比例基本同实施例1，不同点在于，在第4和5步中，使用胎牛血清(也经过了灭活处理，56℃，30min，然后3000rmp室温离心5min,取上清液)替代灭活血清。对收集到的细胞(其中含有大量的造血干细胞)进行流式细胞术检测和集落检测，并计算细胞扩增倍数以及CD34阳性率(实验结果见表2)。
对比例6
本对比例基本同实施例1，不同点在于，不包括第1步，即不使用胚胎干细胞作为饲养层来培养造血干细胞。对收集到的细胞(其中含有大量的造血干细胞)进行流式细胞术检测和集落检测，并计算细胞扩增倍数以及CD34阳性率(实验结果见表2)。
对比例7
本对比例基本同实施例1，不同点在于，使用脐带间充质干细胞代替胚胎干细胞作为饲养层。
对比例8
本对比例基本同实施例1，不同点在于，在血浆分离中，灭活血浆的温度为50℃，时长为40min。
表1：集落实验结果
Figure BDA0002346681030000091
由表1的数据可知，实施例1-3和对比例1中获得的细胞均能够形成集落，说明其中含有造血干细胞。由于实施例1-3中的细胞的造血干细胞的含量更高(较对比例1)，所以获得的集落更多。使用对比例2-7中获得的细胞进行集落实验，也均能产生集落(结果未展示)，由于其中造血干细胞的含量不如实施例1-3，所以产生集落的数量也相对较少。
表2：细胞扩增倍数以及CD34阳性率
细胞扩增倍数 收获细胞的CD34阳性率
实施例1 8.3 42.13
实施例2 9.6 33.02
实施例3 9.2 38.25
对比例1 N/A 0.64
对比例2 3.1 2.52
对比例3 5.4 5.33
对比例4 4.7 7.58
对比例5 8.1 31.62
对比例6 4.4 6.83
对比例7 6.2 15.62
对比例8 3.7 8.61
由表2的数据可知，使用实施例1-3中的方法，可以获得CD34阳性率高的细胞群，并且细胞的增殖倍数大。对比例1是直接提取获得的单个核细胞，并未经过扩增过程，作为阴性对照。对比例2不加入UM171，细胞扩增倍数低，且获得的细胞CD34阳性率低，说明获得造血干细胞的比率较低。对比例3不冻融处理带有胚胎干细胞层的培养瓶，胚胎干细胞在共培养结束之后还大量存在，影响了造血干细胞的纯度，另外，未经冻融处理的胚胎干细胞不能大量释放生长因子，不能有效促进造血干细胞增值。所以本对比例中，造血干细胞的扩增倍数和CD34阳性率均较低。对比例4共培养过程中不加灭活血清，缺少灭活血清提供营养和营造微环境，导致造血干细胞的扩增率和CD34的阳性率均较低。对比例5在共培养过程中，使用胎牛血清代替灭活血清，发现虽然细胞扩增倍数增加，但是对CD34的阳性率的增加并未达到预期。说明胎牛血清不能代替胎盘血灭活血清，虽然两者都能提供充足的营养物质，但是，胎牛血清不能消除胚胎干细胞对造血干细胞的少量的抑制因子。发明人分析认为，胎盘血的灭活血清和造血干细胞来自同一个体，其中含有一些可以结合或者中和胚胎干细胞的抑制因子的物质，使用灭活血清获得了预料不到的技术效果。对比例6不使用胚胎干细胞形成的饲养层，没有胚胎干细胞提供营养物质的生长因子，造血干细胞的扩增倍数和CD34的阳性率均较低。对比例7使用脐带间充质干细胞作为饲养层，脐带间充质干细胞的原始性不如胚胎干细胞，分泌的生长因子的量以及生长刺激作用均不如胚胎干细胞。对比例8血浆灭活的温度过低，导致没有对血浆中的纤维蛋白和黏连蛋白等进行充分的灭活处理，导致细胞结团，造血干细胞无法有效扩增。
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

Claims (6)

1.一种扩增胎盘源造血干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)共培养步骤：使用共培养体系对胎盘血单个核细胞进行共培养，所述共培养体系包括胚胎干细胞形成的饲养层、激动剂、细胞生长因子、灭活血清和培养基Ⅰ，经共培养后获得活化细胞；
(2)传代培养步骤：使用传代培养体系对活化细胞进行传代培养，传代培养体系包括激动剂、细胞生长因子、灭活血清和培养基Ⅱ；
所述饲养层由如下方法制备：培养胚胎干细胞至细胞融合度达到80-90％，形成贴壁细胞层；除去培养基后，-80℃冷冻处理所述贴壁细胞层，然后将所述贴壁细胞层室温放置处理，冷冻处理和室温放置处理交替进行2-3次，获得饲养层；
激动剂为UM171，细胞生长因子包括SCF、FLT3、TPO、IL-3和IL-6；
所述灭活血清由如下方法制备：取胎盘血离心，获得血浆和血细胞，对血浆进行灭活处理后进行离心处理，获得灭活血清；对血浆进行灭活处理的温度为55-58℃，时长为20-40min。
2.根据权利要求1所述的一种扩增胎盘源造血干细胞的方法，其特征在于，培养胚胎干细胞的培养基为MSC培养基；单次冷冻处理的时长为10-15min，单次室温放置处理的时长为10-15min。
3.根据权利要求1所述的一种扩增胎盘源造血干细胞的方法，其特征在于，步骤(1)中的胎盘血单个核细胞由如下方法制备：取胎盘血离心，获得血浆和血细胞，用生理盐水重悬血细胞，使用Ficoll试剂进行离心分离，获得单个核细胞。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的一种扩增胎盘源造血干细胞的方法，其特征在于，培养基Ⅰ为Stem SpanⅡ无血清培养基。
5.根据权利要求4所述的一种扩增胎盘源造血干细胞的方法，其特征在于，在步骤(1)中，激动剂在共培养体系中的含量为40-60ng/ml。
6.根据权利要求1所述的一种扩增胎盘源造血干细胞的方法，其特征在于，共培养步骤的时长为3-5天；传代培养步骤的时长为3-5天。
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