CN113583947B - 间充质干细胞和造血干细胞体外培养方法和系统 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种间充质干细胞和造血干细胞体外培养的方法和系统。所述方法为先利用GelMA水凝胶对间充质干细胞重悬，所述GelMA水凝胶的浓度为4～10wt％，然后加入培养基进行体外培养，所述培养基中包括50‑100ng/ml TPO和10‑100ng/ml SCF等。本发明所创建的方法利用3D培养间充质干细胞模拟造血干细胞在骨髓内所处的生存环境，以期达到有效扩增造血干细胞并维持其干性的目的，从而使骨髓和脐血库资源得到有效利用成为可能。

Description

间充质干细胞和造血干细胞体外培养方法和系统

技术领域

本发明涉及一种细胞培养方法，特别是涉及一种人间充质干细胞(MSC)和造血干细胞(HSC)体外培养方法和系统。

背景技术

HSC移植是目前临床上运用最为成熟和广泛的干细胞疗法，常被用于治疗多种恶性疾病，如急性/慢性髓系/淋系白血病、淋巴瘤、脊髓发育不良、脊髓纤维化等。也可用于非恶性血液疾病的治疗，包括免疫缺陷综合征、血红蛋白病(如地中海贫血、镰刀型贫血)、溶酶体贮积病以及骨硬化病。

然而，HSC移植仍然存在较高风险，其移植成功的标志为连续三天中性粒细胞绝对数大于500/mm³,连续三次测试(不同日期)血小板数目均大于50,000/mm³，移植后早期死亡率甚至高达20％。

HSC移植根据移植细胞来源可分为骨髓移植及脐带血移植，而由于骨髓移植配型要求更高，且术后容易出现免疫排斥反应，近些年，脐带血移植的案例逐渐增多。但是，由于脐带血中所含HSC数量的限制，其移植成功率仍然受限。一支脐带血约含10⁶个CD34+细胞，仅能够用于治疗体重低于25千克的儿童(30,000–40,000CD34+细胞/千克体重)，也就意味着若是体重大于50千克的成年人，则需要2-3支脐带血。因此，HSC的有效扩增成了当今医疗发展的迫切需求。而传统的细胞培养，造血干祖细胞易分化并伴随细胞干性的丧失。

目前，扩增HSC的方法主要可分为四类：小分子药物筛选、细胞共培养、成熟细胞转分化以及胚胎干细胞诱导分化。

2010年，Athony领导的课题组通过高通量药物筛选的方法，发现在培养基中添加小分子药物SR1，21天后，具有重建造血系统能力的细胞增加了17倍。2014年，Fare Iman等人通过相同的方法，找到了另一个化学药物UM171，培养12天后有效扩增了13倍。并且发现，同时使用UM171与SR1可将扩增倍数增至28.5倍。2016年，SR1已成功完成了临床I期和II期实验，证明了SR1扩增后的脐带血HSC的安全性与有效性。17例患者同时移植两支脐带血，其中一支脐带血用SR1扩增后再移植，与对照组相比，中性粒细胞与血小板有效恢复更为迅速。

2012年，Marcos及其同事发现，将体外与骨髓间充质干细胞共培养后的脐血HSC与未经处理的脐带血HSC共同移植到患者体内，中性粒细胞及血小板的恢复速度明显增快，意味着与骨髓间充质干细胞共培养后的HSC数量有效扩增。我们可以注意到，无论是SR1扩增的HSC抑或是与骨髓间充质干细胞共培养的HSC，虽然中性粒细胞与血小板的恢复速度加快了，但仍需要移植两支脐带血。而另外两种方法，无论是成熟细胞转分化形成的，还是胚胎干细胞诱导分化产生的HSC，目前尚未进入临床试验阶段。因此，HSC的有效扩增，及其移植成功率的提升仍是尚未解决的难题。

在成年哺乳动物中，HSC主要位于骨髓内，复杂的血管神经网络及骨髓基质细胞构建了HSC理想的生存环境。在小鼠的长骨中，横向分布着大量静脉窦，纵向分布的主要为小动脉，而骨基质附近则是直径更小的，有利于物质交换的血管网络，交感神经细胞以螺旋的方式缠绕于动脉上，骨髓间充质干细胞(BMSC)紧邻于静脉窦内皮。BMSC高表达Scf及Cxcl12，既可维持HSC干性，也与HSC的增殖相关。2012年Marcos等人发表于The NewEngland of Medicine上的研究同样表明，骨髓间充质干细胞作为HSC的微环境细胞，可有效促进HSC的扩增。上述基础研究发现，勾画了HSC在体内的生存环境，为我们体外模拟HSC的生境，促进其扩增提供了新的思路。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种人MSC和HSC体外培养方法和系统，用于解决HSC体外培养增殖效率低的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种MSC体外培养方法，所述方法为先利用GelMA水凝胶对BMSC重悬，所述GelMA水凝胶的浓度为4～10wt％，然后利用培养基培养，所述培养基中50-100ng/ml TPO、10-100ng/ml SCF。

本发明所述MSC是指人或者其他哺乳动物来源的MSC；例如人骨髓、脐带血、脂肪或其他组织来源的MSC，发明人已经通过实验证实了多物种来源的MSC均可采用上述培养方法。同样，针对HSC本发明也证实了针对人或其他哺乳动物来源的HSC都可采用本申请的方法培养，例如人脐带血、骨髓或动员外周血HSC来源的HSC。在下文具体实施例中列举了部分实验加以说明。

GelMA水凝胶由甲基丙烯酸酐与明胶制备获得，配制过程：将主要成分是明胶，利用甲基丙烯酸改性引入双键，做交联位点，光引发剂(酰基亚磷酸锂)在紫外下产生自由基引发聚合，交联后即可。以上试剂可以通过商业购买获得。

所述利用GelMA水凝胶对MSC重悬是指将MSC添加至GelMA水凝胶中进行重悬。

进一步地，所述GelMA水凝胶是指甲基丙烯酸酐化明胶。

优选地，所述GelMA水凝胶的浓度为5-7.5wt％，更优选为5％。

进一步地，所述GelMA水凝胶中还含有光引发剂，所述光引发剂的终浓度低于0.1wt％。

进一步地，所述培养基的制备方法为：向适合MSC和HSC培养的基础培养基中添加TPO至其终浓度为50-100ng/ml和SCF至其终浓度为10-100ng/ml。

所述适合MSC和HSC培养的基础培养基是商业上可以获得的，一般采用无血清培养基，为本领域所公知。例如可以采用StemSpan^TM SFEM II，此培养基可以通过市场购买获得。

本发明的另一方面提供了一种MSC体外培养系统，包括上述用于MSC重悬的GelMA水凝胶制剂和培养基，所述培养基中包括50-100ng/ml TPO、10-100ng/ml SCF。

进一步地，所述水凝胶制剂中GelMA水凝胶的浓度为4～10wt％。优选地，所述GelMA水凝胶制剂中的GelMA水凝胶浓度为5-7.5wt％，更优选为5wt％。

进一步地，所述GelMA水凝胶中还含有光引发剂，所述光引发剂的终浓度低于0.1wt％。

本发明的另一方面提供了上述培养基的制备方法为：向适合MSC和HSC培养的基础培养基中添加TPO至其终浓度为50-100ng/ml和SCF至其终浓度为10-100ng/ml。

所述适合MSC和HSC培养的培养基是商业上可以获得的，一般采用无血清培养基，为本领域所公知。例如可以采用StemSpan^TM SFEM II。

所述MSC是指人或者其他哺乳动物来源的MSC。

本发明的另一方面提供了上述MSC体外培养系统用于体外培养MSC和/或HSC的用途。

本发明的另一方面提供了一种HSC体外培养方法，所述方法为采用上述MSC体外培养系统同时培养MSC和HSC。

进一步地，所述MSC是指人或者其他哺乳动物来源的MSC，所述HSC是指人或者其他哺乳动物来源的HSC。

如上所述，本发明的MSC和HSC体外培养方法和系统，具有以下有益效果：

我们所创建的方法利用3D系统培养MSC，模拟HSC在骨髓内所处的生存环境，达到有效扩增HSC并维持其干性的目的，从而使骨髓和脐血库资源得到有效利用成为可能。

附图说明

图1显示为实施例1中流式细胞仪分析结果示意图。

图2显示为实施例2中细胞电镜图。

图3显示为实施例3中流式细胞仪分析结果示意图。

图4显示为实施例4中基因表达结构统计图。

图5显示为实施例5中流式细胞仪分析结果示意图。

图6显示为实施例5中流式细胞仪分析结果示意图。

图7显示为实施例5中优化后培养基培养细胞后流式细胞仪分析结果示意图。

图8显示为实施例5中优化后培养基培养细胞后流式细胞仪分析结果示意图。

图9显示为实施例5中小鼠实验流程图。

图10显示为实施例5中流式细胞仪分析结果示意图。

图11显示为实施例6中实验结构图。

图12显示为实施例7实验结果分析统计图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

甲基丙烯酸酐化明胶缩写GelMA

造血干细胞缩写HSC

骨髓间充质干细胞缩写BMSC

实施例1 BMSC在传统体外培养的过程中SCF及Cxcl12的表达量逐渐降低

利用Scf-GFP；Cxcl12-DsRed转基因小鼠作为reporter，取其股骨与胫骨，冲出骨髓后，碾碎骨基质，将骨髓与骨基质共同消化并重悬为单细胞，培养于低氧培养箱。

由于其特殊基因型，若该小鼠骨髓间充质干细胞表达干细胞生长因子Scf，则细胞将表达绿色荧光蛋白GFP，细胞在荧光显微镜下为绿色。同理。若表达趋化因子Cxcl12，则细胞也将表达红色荧光蛋白DsRed，细胞在荧光显微镜下为红色。

通过荧光显微镜及流式细胞术，我们基本确定，在体外培养骨髓间充质干细胞的过程中，其Scf及Cxcl12的表达量逐渐下降(图1A-1E)。而Scf及Cxcl12对于HSC而言，是维持其干性及增殖的重要环境因子。随后，我们又通过RT-qPCR的方法，验证了多个其它HSC因子，如Angpt1、Jagged1、Slit3、Flt3l，其表达量同样出现明显下降(图1F)。

实施例2利用GelMA构建BMSC 3D培养体系

GelMA全称为甲基丙烯酸酐化明胶(图2A)，由甲基丙烯酸酐与明胶制备获得，是一种光敏性的生物水凝胶材料。冻干后的GelMA用PBS溶解为10％的浓度，37℃水浴溶解至澄清透明。同时称取少量光引发剂酰基亚磷酸锂，同样用PBS稀释至10％的浓度，避光常温溶解至澄清透明。按1:100的比例，添加10％的光引发剂至10％GelMA溶液中，用0.22um的滤头过滤后备用。取适合体积的GelMA于容器内，UVA照射60s即可成胶。可根据不同实验需求将10％的GelMA进一步稀释为不同浓度，一般光引发剂的终浓度不超过0.1％，防止其对细胞产生毒性作用。

我们可以知道，小鼠不同组织的软硬度差异较大，柔软如大脑，为0.1-1.0KPa弹性模量，坚硬如骨基质，约为25-40Kpa¹。而骨髓本身，不同样本之间的软硬度，也存在较大的差异，约为0.2–0.4KPa弹性模量。为了尽可能地模拟小鼠BMSC在骨髓中生长环境，我们试图将体外所构建的细胞培养3D支架软硬度尽可能地接近小鼠骨髓的硬度，由此，我们可以搭建一个跟体内较为接近的BMSC生长物理环境。

由此，我们设计了5％和10％两个浓度梯度的GelMA水凝胶实验组，其水凝胶用保存模量表示，如图2B所示，10％GelMA水凝胶的保存模量约400-600Pa，5％GelMA水凝胶的保存模量约为100-200Pa。将表达红色荧光的骨髓间充质干细胞分别培养于5％和10％的GelMA水凝胶中，我们发现，生长于5％GelMA水凝胶中的细胞成网络状态生长，细胞伸展性好；而10％GelMA水凝胶中的BMSC则表现出聚团生长，细胞延展状态较差(图2C)。此外，我们还尝试了7.5％的水凝胶，细胞培养效果劣于5％GelMA水凝胶，此处数据未展示。电镜分析结果表明，5％的GelMA水凝胶孔隙直径约在100μm左右，有利于骨髓间充质干细胞的伸展与生长(图2D)。由此，我们确定了5％GelMA作为最终的水凝胶浓度(决定了其水凝胶的软硬度及孔隙大小)，细胞密度固定在20,000cells/50μl水凝胶。培养7天后，结果如图2E所示，原本在2D培养过程中，表达量显著降低的Scf-GFP和Cxcl12-DsRed重新开始表达，而2D培养的细胞，则由于快速，甚至开始出现了分化，而Scf-GFP仍旧不表达。Cxcl12-DsRed重新表达的主要原因之一推测为，BMSC分化形成的成骨细胞表达较高水平的Cxcl12。

实施例3 3D培养的小鼠BMSC显著上调HSC维持因子

将20,000个SCF-GFP；Cxcl12-DsRed小鼠骨髓间充质干细胞离心取上清后用50ul5％的GelMA水凝胶重悬(光引发剂终浓度为0.05％)。UVA照射60s后成胶，添加BMSC生长培养基后放于低氧培养箱中培养。1天后骨髓间充质干细胞开始伸展，3-4天换液一次，连续观察7天。

由于荧光显微镜对于3D系统荧光定量的局限性，我们利用流式细胞数连续多天分析其荧光强度，确定在3D培养系统中的骨髓间充质干细胞红色荧光及绿色荧光逐渐增强，意味着Scf及Cxcl12的表达量逐渐恢复(图3A-3B)。在3D培养第7天，我们提取了骨髓间充质干细胞的RNA，通过qPCR验证了除Scf及Cxcl12以外的多个其它HSC环境因子，与普通2D培养的骨髓间充质干细胞相比，Angpt1、Flt3l、Jagged1及Slit3的表达量均显著恢复(图3C)。

实施例4 3D培养的BMSC部分恢复体内状态

取Scf-GFP；Cxcl12-DsRed小鼠股骨与胫骨，消化并重悬为1ml单细胞悬液后，其中100ul直接培养于低氧培养箱中，Day1和Day5换液。在Day7消化细胞，计数后取5,000BMSCs，500ul Trizol吹散后冻存于-80℃冰箱，作为2D组。再取20,000BMSCs用50μl 5％的GelMA重悬后，UVA辐照60s成胶，加入合适体积的培养基后放于低氧培养箱中继续培养，Day4换液。在Day7消化细胞，计数后取5,000BMSCs，500μl Trizol吹散后冻存于-80℃冰箱，作为3D组。另外900μl单细胞悬液通过流式分选，直接分选5,000个未培养的BMSCs于500μl Trizol中，冻存于-80℃冰箱，作为primary组。

提取并纯化微量RNA，用改良的SmartSeq2方法完成建库后，送公司illumina平台二代测序。对于测序返回的数据，PCA分析不同实验组之间的空间差异，DESeq2比较组与组之间的差异基因，并用ClusterProfiler做进一步分析。分析结果表明，除Scf、Cxcl12、Angiopoietin1等HSC因子以外，总共1413个在2D中表达上调的基因，在3D培养过程中表达量显著下降；953个在2D中表达下调的基因，在3D培养过程中表达量显著上升。换言之，总共有2366个2D与unculture组差异表达的基因，在3D培养过程中明显恢复(图4A-4C)。

实施例5小鼠HSC在3D共培养系统中显著扩增

1.1小鼠HSC在3D共培养系统中显著扩增

在该实验中，我们设计了如下4种培养基：

野生型小鼠BMSC培养7天后，消化计数，取80,000BMSCs并分选400个野生型小鼠HSCs，用200ul 5％GelMA重悬后加到24孔低吸附培养板，UVA照射60s后成胶，加入500ul培养基，低氧培养。同时设置2D对照小组，除培养方式(2D或3D)不同外，其余培养条件均相同，也就是说总共有8个实验组，如下：

	2D	3D
			HSC medium	1组	1组
HSC medium+BMSC medium(1:1)	1组	1组
			HSC medium+10％FBS	1组	1组
Basal medium+10％FBS	1组	1组

Day4，细胞换液。Day 7消化后细胞计数。同时消化后的细胞分为2组：第一组利用流式细胞术分析细胞类型及HSC比例；第二组通过甲基纤维素半固体培养基分析day7细胞在体外的成克隆能力及其成克隆类型。

实验结果表明：第一，与传统培养方法相比，3D培养的HSC，在HSC medium+BMSCmedium(1:1)和HSC medium+10％FBS这两种培养基中显著增殖(图5A)；第二，培养7天后的HSC发生了一定程度的分化，但无论使LSK细胞(即含有造血干祖细胞)总数或其占总细胞量的百分比，3D共培养组明显优于传统HSC培养方法(图5B，5F)，包括处于HSC分化更为上游的造血干祖细胞，如HSC、MPP、CD48+LSK等，也可得出相似结论(图5C-E，5G-I)；第三，甲基纤维素半固体培养基所形成的克隆包括BFU-E,CFU-G，CFU-M，CFU-GM，CFU-GEMM，其形成克隆的数量及比例可用于分析day7细胞中造血干祖细胞的数量及比例，无论是总克隆数还是CFU-GEMM克隆数，3D培养组均显著增多(图6)，且我们可以明显观察到，从克隆总数的角度出发，所得出的结论基本与之前相同，即3D培养组的HSC medium+BMSC medium(1:1)和HSCmedium+10％FBS这两组的培养基，培养效果更佳。由此我们基本确定了使用HSC medium+BMSC medium(1:1)或HSC medium+10％FBS培养基，在3D培养条件下可显著扩增HSC的扩增(图6A-F)。由于流式分析分析细胞表面标记物在并不能真正鉴别具有功能性的HSC，而体外成克隆实验则可以确定该细胞是否具有分化能力，具有多强的分化能力等。综上考虑，我们最终确定了HSC medium+10％FBS作为该实验最终的选择。

5.2优化3D培养系统培养基

在上述培养条件的基础上，我们继续对培养基进行了优化，设计了如下8种培养基，全部在上述3D培养条件下进行培养：

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实验结果表明：第一，培养7天后无论从细胞总数的角度出发(图7A)，还是更为细致地分析各种细胞类型数目(图7B-F)，Scf&Tpo培养基培养效果均表现出最佳状态。而分析各种类型的造血干祖细胞在全部细胞中的占比，并无明显差异。第二，甲基纤维素半固体培养基所形成的总克隆数包括BFU-E,CFU-G，CFU-M，CFU-GM，CFU-GEMM数，Scf&Tpo组培养基也表现出较好结果(图8A-F)。

5.3HSC竞争性验证其扩增效率

竞争性移植可客观反应出体外扩增的细胞是否为真正的HSC，是否具有重建整个造血系统的能力。根据之前的实验结果，我们总共设计了5个实验组(所采用培养基条件见附图)，重复了2次独立实验，n＝4-10，实验结果如图9所示。

移植后小鼠每四周尾静脉取血一次，裂解红细胞后孵育T细胞抗体antiCD3-PE(图10A)，B细胞抗体antiB220-APC(图10B)，髓系细胞抗体antiCD11b-APC，antiGr1-PE/Cy7(图10C)，以及antiCD45.1-APC/Cy7和antiCD45.2-FITC用以区分供体、受体及竞争者(图10D)。分析至16周后，处死小鼠并取其长骨骨髓，分析其供体来源的T细胞(图10F)、B细胞(图10H)、髓系细胞(图10G)及CD45.2阳性细胞占全部CD45阳性细胞(图10E)的比例。我们发现，3D共培养体系扩增7天后的细胞，不论与未经培养的细胞抑或是与传统培养方法所培养的细胞相比，均表现出更强的重建造血系统的能力，其中Scf&Tpo培养基组与其他实验组相比，表现出最强的血液系统重建能力，这与我们之前的实验结果一致。

实施例6 3D培养的人BMSC细胞因子及趋化因子表达量显著上升

取骨髓来源的间充质干细胞，消化后培养于低氧培养箱，取第3-5代的骨髓间充质干细胞消化计数后，5,000细胞用500ul Trizol吹散后冻存于-80℃冰箱作为2D组，取20,000BMSCs用如上5％GelMA重悬为50ul后，UVA照射60s成胶，添加常规人骨髓间充质干细胞培养基(DMEM+10％FBS+1％P/S+1ng/ml bFGF)后低氧培养，Day4换液，Day7消化计数后，5,000细胞用500ul Trizol吹散后冻存于-80℃冰箱作为3D组。由于目前人源骨髓间充质干细胞marker仍存在争议，因此此次实验不设置unculture组。

提取并纯化微量RNA，用改良的SmartSeq2方法完成建库后，送公司illumina平台二代测序。对于测序返回的数据，PCA分析不同实验组之间的空间差异，DESeq2比较组与组之间的差异基因，并用ClusterProfiler做进一步分析。

分析结果表明，除CXCL12、Angiopoietin1、IL6、LIF、IL7外，还有大量趋化因子及细胞因子在3D培养后，其表达量显著高于2D培养的BMSCs(图11A)，并用qPCR做了进一步验证(图11B)。

实施例7人脐带血来源HSC在3D共培养系统中显著扩增

通过对添加细胞因子设置多个浓度梯度、选择添加或不添加血清/血清类似物、2D或3D培养，设置了多个实验组，如下表格所示。3D共培养骨髓间充质干细胞及脐带血来源的CD34阳性细胞，Day7分析其表型。

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/>

我们发现，添加了10％FBS及100ng/ml TPO、50ng/ml SCF于StemSpan SFEMII基础培养基后，无论是总细胞量、造血干祖细胞量还是甲基纤维素半固体培养基内的成克隆能力及数量，显著优于其它实验组。添加血清或血清替代物后，3D培养CD34阳性细胞扩增明显强于2D培养，且优于传统的2D培养(去血清或血清替代物)(图12A-I，其中，Blank组的3D体外培养，血细胞几乎没有扩增，导致无法统计细胞总数及其它参数)。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims (5)

1.一种造血干细胞体外培养方法，所述方法为采用间充质干细胞体外培养系统同时培养间充质干细胞和造血干细胞；

所述间充质干细胞体外培养系统包括间充质干细胞重悬的GelMA水凝胶制剂和培养基，所述培养基中添加的生长因子为50-100ng/ml TPO和10-100ng/ml SCF。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述间充质干细胞是指人或者其他哺乳动物来源的间充质干细胞,所述造血干细胞是指人或者其他哺乳动物来源的造血干细胞。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述水凝胶制剂中GelMA的浓度为4～10wt％。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述基础培养基为无血清培养基。

5.间充质干细胞体外培养系统用于体外同时培养间充质干细胞和造血干细胞的用途，其特征在于：所述间充质干细胞体外培养系统包括间充质干细胞重悬的GelMA水凝胶制剂和培养基，所述培养基中添加的生长因子为50-100ng/ml TPO和10-100ng/ml SCF。

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