CN114891744A - 一种冷冻脐带血nk细胞体外扩增方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，尤其是NK细胞扩增技术领域，特别涉及一种冷冻脐带血NK细胞体外扩增方法。本发明提供了一种冷冻脐带血NK细胞体外扩增方法，其通过优化冻存脐血复苏技术，同时使用活化的富血小板血浆代替胎牛血清，由此建立了一套稳定可靠且规范化的NK细胞制备体系，可显著提高NK细胞的数量和纯度，且具有较强的杀伤能力。

Description

一种冷冻脐带血NK细胞体外扩增方法

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其是NK细胞扩增技术领域，特别涉及一种冷冻脐带血NK细胞体外扩增方法。

背景技术

自然杀伤( Natural killer，NK)细胞无MHC限制，具有广谱的肿瘤杀伤效果，在免疫监视和早期抗感染免疫过程中起重要作用，尤其当机体中的T细胞和B细胞免疫功能低下时，NK细胞的效果就更加显著。研究表明，NK细胞在没有抗原预先致敏的情况下，可以直接快速杀伤肿瘤细胞，与T细胞相比，NK细胞的抗原谱更宽，亲和力更高，具有巨大的肿瘤免疫治疗潜力，且应用广泛，在血液肿瘤和实体瘤都有应用。

由于人体自身NK细胞的含量有限，在体外快速扩增获得大量活化的NK细胞是临床应用NK 细胞治疗恶性肿瘤的关键。相较于外周血，脐带血来源的NK细胞不仅安全、便捷，而且含有更多的NK前体细胞，是更理想的NK细胞制备来源。

与新鲜脐血NK相比，配型脐血NK细胞具有较高的安全性以及耐受性，公开号CN107460167A的《一种无滋养细胞的NK细胞的扩增方法》中，新鲜脐血制备NK细胞未使用滋养层细胞，但培养过程添加了自体血浆。但是冻存脐带血没有自体血浆，故培养过程中一般添加胎牛血清，而胎牛血清属于动物源成份，在临床中存在一定的质疑。

发明内容

为了解决现有技术的问题，本发明提供了一种冷冻脐带血NK细胞体外扩增方法，其通过优化冻存脐血复苏技术，同时使用活化的富血小板血浆代替胎牛血清，由此建立了一套稳定可靠且规范化的NK细胞制备体系，可显著提高NK细胞的数量和纯度，且具有较强的杀伤能力。

本发明所采用的技术方案如下：

一种冷冻脐带血NK细胞体外扩增方法，包括以下步骤：

A、从冻存脐带血中提取、分离获得单个核细胞；

B、制备并活化富血小板血浆，利用活化后的富血小板血浆对NK细胞进行扩增；

C、将步骤A得到的单个核细胞进行培养。

优选的，步骤A具体包括：

A1、配置复苏保护液，所述的复苏保护液包括30mL人血清白蛋白，30mL右旋糖酐，500mL PBS缓冲液，复苏液使用前需预冷；

A2、将冻存脐带血从液氮中取出后置于37度水浴锅，解冻脐血；

A3、将解冻后的脐血放入超净工作台，用50ml注射器将血袋中的脐血缓慢注入含脐血洗涤液的250ml离心管中，用所述的复苏保护液补充至250mL，在室温下，离心力600G状态下离心5min；

A4、使用生理盐水与血细胞沉淀1:1稀释，吹打混匀，将混悬液缓慢加到Ficoll分离液上，在室温下，离心力1200G状态下离心20min；

A5、吸出白膜层，PBS缓冲液重悬，室温下离心力500G离心5min，离心后的上清液进行需氧/厌氧菌检测，单个核细胞制备完成。

优选的，人血清白蛋白浓度为20%-50%，所述右旋糖苷浓度为10%-50%。

优选的，步骤B具体包括：

B1、富血小板血浆的制备：

（1）将提取完造血干细胞后的废弃脐血，吸至50mL离心管中，室温下离心力500G离心10min，保留上清液，弃掉血细胞沉淀；

（2）将保留的上清液，在室温下离心力1200G状态下离心9-10min；去掉上清液，中间及底部沉淀即为富血小板血浆；

B2、活化所述的富血小板血浆：

（3）按照1mL富血小板血浆添加100微升氯化钙，在37℃孵育30min至富血小板血浆形成凝胶状，或放4℃冰箱16h，将已激活的富血小板血浆取出，在离心力3000G状态下室温离心20min，去掉沉淀取上清液即为活化的富血小板血浆；

B3、向活化后的富血小板血浆中添加IL-15重组蛋白和氢化可的松琥珀酸钠。

优选的，所述IL-15重组蛋白的浓度为20-50ng/mL，所述氢化可的松琥珀酸钠浓度为3×10^-8-8×10^-8 mol/L。

优选的，步骤C具体包括：

C1、培养前：在T175培养瓶中加入包被液，4℃冰箱过夜，或置于37℃培养箱中至少包被2h；

C2、将步骤A中分离出的单个核细胞用未加任何因子的免疫细胞无血清培养基配制成细胞悬液40ml，加入TBD试剂盒中的活化因子；将加入所述活化因子的细胞悬液加入到弃掉包被液的培养瓶中，加入8ml活化后的富血小板血浆，置于饱和湿度、37℃、5% CO₂培养箱中培养；

C3、每隔2-3天，视细胞生长状态补加培养基，整个培养过程，使得细胞浓度维持在1.0×10⁶cell/ml。

本发明通过优化冻存脐血复苏技术，同时使用活化的富血小板血浆（activatedplatelet-rich plasma，aPRP）代替胎牛血清，由此建立了一套稳定可靠且规范化的NK细胞制备体系。其中，aPRP为脐血提取物，经过密度梯度离心分离得到的血小板浓缩物，加入激活剂激活而获得，活化的富血小板血浆中富含多种细胞因子及蛋白成分，利于细胞生长。

本发明提供的技术方案带来的有益效果是：

1、本发明提供的NK扩增培养方法解决了脐带血单个核细胞获得难的问题，培养初始阶段排除了红细胞的影响，后期收获的NK细胞纯度均可达到80％以上，甚至高达95%，在同种异体NK细胞应用方面具有巨大的优势。

2、本发明克服了现有技术在脐带血NK培养中细胞数量不足、纯度低的问题，本方法同样适用于外周血。

3、本发明克服了现有培养过程中需要添加K562滋养层细胞，胎牛血清的技术偏见，极大提高了NK细胞的安全性、临床适用性。

4、本发明使用提取完造血干细胞后的废弃脐血制备富血小板血浆，充分利用脐血资源。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的一种冷冻脐带血NK细胞体外扩增方法实施后，冻存脐带血自然杀伤细胞形态特征示意图；

图2为通过本发明的方法扩增后的冻存脐带血自然杀伤细胞表面标记物示意图；

图3为通过本发明的方法扩增后的细胞体外杀伤实验效果示意图；

图4为通过本发明的方法扩增后的NK细胞与采用常规手段扩增培养的NK细胞比较图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

实施例一

本实施例提供一种冷冻脐带血NK细胞体外扩增方法，包括以下过程：

一、从冻存脐带血中提取、分离获得单个核细胞。

1、配制复苏保护液，配方为：30mL人血清白蛋白+30mL右旋糖酐+500mL PBS缓冲液，复苏液使用前需预冷。

所述人血清白蛋白浓度为20%-50%，所述右旋糖苷浓度为10%-50%。

2、将冻存脐血从液氮中取出后置于37度水浴锅，解冻脐血；

3、将脐血放入超净工作台，用50ml注射器将血袋中脐血缓慢注入含脐血洗涤液的250ml离心管中，尽量减少红细胞破裂，复苏液补充至250mL。在室温下以离心力600G离心5min。

4、生理盐水与血细胞沉淀1:1稀释，吹打混匀，将混悬液缓慢加到Ficoll分离液上，室温1200G离心20min。

5、吸出白膜层，PBS缓冲液重悬，室温下500g离心5min，离心后的上清液进行需氧/厌氧菌检测，单个核细胞制备完成。

二、NK细胞的培养和扩增

1、富血小板血浆的制备

（1）将提取完造血干细胞后的废弃脐血，吸至50mL离心管中，室温下500g离心10min，保留上清液，弃掉血细胞沉淀。

（2）将保留的上清液，在室温下离心力1200g离心9-10min；去掉大部分上清，中间及底部沉淀即为富血小板血浆。

（3）按照1mL富血小板血浆添加100微升氯化钙的比例激活富血小板血浆。37℃孵育30min 至富血小板血浆形成凝胶状，或放4℃冰箱16h，将已激活的富血小板血浆取出，离心力3000g 室温下离心20min，去掉沉淀取上清即为活化的富血小板血浆，血小板激活后可以更加充分释放细胞培养因子。

（4）向活化后的富血小板血浆中添加IL-15和氢化可的松琥珀酸钠，充分利用IL-15对NK细胞的扩增作用，以及氢化可的松琥珀酸钠对T细胞增殖的抑制作用。

所述IL-15的浓度为20-50ng/mL，所述氢化可的松琥珀酸钠浓度为3*10^-8-8*10^-8mol/L。

2、细胞培养

（1）培养前：T175培养瓶中加入包被液，4℃冰箱过夜，或置于37℃培养箱中至少包被2h。

（2）分离出的单个核细胞用未加任何因子的免疫细胞无血清培养基配制成细胞悬液40ml，加入TBD试剂盒中的活化因子。将加入所述活化因子的细胞悬液加入到弃掉包被液的培养瓶中，加入8ml aPRP，置于饱和湿度、37℃、5% CO2培养箱中培养。

（3）每隔2-3天，视细胞生长状态，补加培养基，整个培养过程，使得细胞浓度维持在1.0×106cell/ml。

三、细胞数量及细胞表型鉴定

1、冻存脐带血NK细胞数量及形态

1.1、如下表所示，给出两组不同的冷冻脐血，采用本实施例的方法进行扩增。

表一：冷冻脐血NK细胞数量与培养时间的关系

Day0

Day8

Day11

Day13

Day16

Day20

例1

1.2×10^8个

3.59×10^8个

12.8×10^8个

27.4×10^8个

67.7×10^8个

181×10^8个

例2

1.02×10^8个

3.93×10^8个

15.5×10^8个

44.3×10^8个

159×10^8个

194×10^8个

经过本方法扩增培养的冻存脐血NK细胞，随着培养时间的延长，培养至20天NK细胞总数可达10^10以上，细胞纯度在80%以上，高达95%。具体细胞形态如下图1所示。

1.2、NK细胞扩增倍数比较

采用本专利方法（组1）诱导培养8份冻存脐血NK细胞，培养周期20天，离心、收集细胞，台盼蓝染色、计数，扩增培养的NK细胞倍数为328.32 ± 116.36，最终NK细胞总数量 >5×10⁹；而采用K562滋养层细胞+胎牛血清传统方法（组2）扩增培养的NK细胞倍数为51.47±4.28，两组间差异有显著性意义(P < 0.05)，如附图4所示。

2、冻存脐带血NK细胞表面标记物（CD3-CD56+）检测

培养至20天的NK细胞采用流式细胞法进行表型分析，FITC标记的anti-CD3，APC标记的anti-CD56与细胞表面标志性Marker结合，结果如图2所示，细胞表达NK细胞的表面标志CD56，不表达CD3，且CD3-CD56+指标在80%以上，符合NK细胞表型特征。

四、冻存脐带血NK细胞体外杀伤实验

以冻存脐血NK细胞作为效应细胞；K562肿瘤细胞作为靶细胞，按照效靶比5:1、10:1、20:1、50:1的比例加入96孔板，每孔总体积200uL，每组设置3个复孔，放入37℃、5% CO2培养箱培养24小时。加入CCK-8 20uL/孔，置入培养箱中继续孵育4h，于450nm处测定吸光度A值。根据公式计算杀瘤效率。杀瘤效率=[1-(实验孔OD-效应孔OD）/靶细胞孔OD]×100%。

由以上实验可知，本实施例的方法解决了脐带血单个核细胞获得难的问题，培养初始阶段排除了红细胞的影响，后期收获的NK细胞纯度均可达到80％以上，甚至高达95%，在同种异体NK细胞应用方面具有巨大的优势。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种冷冻脐带血NK细胞体外扩增方法，包括以下步骤：

A、从冻存脐带血中提取、分离获得单个核细胞；

B、制备并活化富血小板血浆，利用活化后的富血小板血浆对NK细胞进行扩增；

C、将步骤A得到的单个核细胞进行培养。

2.根据权利要求1所述的一种冷冻脐带血NK细胞体外扩增方法，其特征在于，所述的步骤A具体包括：

A1、配置复苏保护液，所述的复苏保护液包括30mL人血清白蛋白，30mL右旋糖酐，500mLPBS缓冲液，复苏液使用前需预冷；

A2、将冻存脐带血从液氮中取出后置于37度水浴锅，解冻脐血；

A3、将解冻后的脐血放入超净工作台，用50ml注射器将血袋中的脐血缓慢注入含脐血洗涤液的250ml离心管中，用所述的复苏保护液补充至250mL，在室温下，离心力600G状态下离心5min；

A4、使用生理盐水与血细胞沉淀1:1稀释，吹打混匀，将混悬液缓慢加到Ficoll分离液上，在室温下，离心力1200G状态下离心20min；

A5、吸出白膜层，PBS缓冲液重悬，室温下离心力500G离心5min，离心后的上清液进行需氧/厌氧菌检测，单个核细胞制备完成。

3.根据权利要求2所述的一种冷冻脐带血NK细胞体外扩增方法，其特征在于，所述的人血清白蛋白浓度为20%-50%，所述右旋糖苷浓度为10%-50%。

4.根据权利要求1所述的一种冷冻脐带血NK细胞体外扩增方法，其特征在于，所述的步骤B具体包括：

B1、富血小板血浆的制备：

（1）将提取完造血干细胞后的废弃脐血，吸至50mL离心管中，室温下离心力500G离心10min，保留上清液，弃掉血细胞沉淀；

（2）将保留的上清液，在室温下离心力1200G状态下离心9-10min；去掉上清液，中间及底部沉淀即为富血小板血浆；

B2、活化所述的富血小板血浆：

（3）按照1mL富血小板血浆添加100微升氯化钙，在37℃孵育30min，或放4℃冰箱16h，至富血小板血浆形成凝胶状，将已激活的富血小板血浆取出，在离心力3000G状态下室温离心20min，去掉沉淀取上清液即为活化的富血小板血浆；

B3、向活化后的富血小板血浆中添加IL-15重组蛋白和氢化可的松琥珀酸钠。

5.根据权利要求4所述的一种冷冻脐带血NK细胞体外扩增方法，其特征在于，所述的所述IL-15重组蛋白的浓度为20-50ng/mL，所述氢化可的松琥珀酸钠浓度为3×10^-8-8×10^-8mol/L。

6.根据权利要求1所述的一种冷冻脐带血NK细胞体外扩增方法，其特征在于，所述的步骤C具体包括：

C1、培养前：在T175培养瓶中加入包被液，4℃冰箱过夜，或置于37℃培养箱中至少包被2h；

C2、将步骤A中分离出的单个核细胞用未加任何因子的免疫细胞无血清培养基配制成细胞悬液40ml，加入TBD试剂盒中的活化因子；将加入所述活化因子的细胞悬液加入到弃掉包被液的培养瓶中，加入8ml活化后的富血小板血浆，置于饱和湿度、37℃、5% CO₂培养箱中培养；

C3、每隔2-3天，视细胞生长状态补加培养基，整个培养过程，使得细胞浓度维持在1.0×10⁶cell/ml。

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