CN103194428A - 一种胰岛素样生长因子联合多种细胞因子体外分化并扩增人天然杀伤细胞的培养方法 - Google Patents

一种胰岛素样生长因子联合多种细胞因子体外分化并扩增人天然杀伤细胞的培养方法 Download PDF

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魏海明
倪芳
田志刚
孙汭
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Abstract

本发明提供一种胰岛素样生长因子(IGF-1)联合多种细胞因子体外扩增天然杀伤细胞(NK细胞)的新方法，所述方法包括：在CD34+造血干细胞的培养体系中加入下列细胞因子：胰岛素样生长因子IGF-1，干细胞因子SCF，Flt3配体Flt3-L和IL-15。具体地，从骨髓或新生儿脐带血中分离CD34+造血干细胞，在培养第0天即在培养体系中加入SCF(终浓度20-40ng/ml)，Flt3-L(终浓度40-50ng/ml)，IL-15(终浓度30-50ng/ml)以及IGF-1(终浓度100ng/ml)进行培养，可以使CD34+造血干细胞分化成NK细胞，并且达到进一步提高NK细胞扩增效率及扩增后的NK细胞杀伤功能的目的。采用IGF-1联合多细胞因子扩增NK细胞的方法有效地提高了NK细胞体外扩增倍数，而且扩增出的NK细胞具有更强的杀伤潜能。本发明的NK细胞发育培养体系具有明显的扩增优势。

Description

一种胰岛素样生长因子联合多种细胞因子体外分化并扩增人天然杀伤细胞的培养方法
技术领域
本发明涉及一种改进的人天然杀伤细胞(NK细胞)体外分化并扩增培养的方法，尤其是能提高NK细胞扩增倍数及扩增后NK细胞的杀伤潜能的方法。具体地，本发明提供一种胰岛素样生长因子(IGF-1)联合多种细胞因子体外分化并扩增NK细胞的新方法，其中用到的细胞因子包括胰岛素样生长因子(IGF-1)、干细胞因子(SCF)、Flt3配体(Flt3-L)和白介素15(IL-15)。 
背景技术
目前，体外扩增天然杀伤细胞(NK细胞，natural killer cells)的方法很多。但是，很多体外NK细胞扩增体系所产生的NK细胞数量不足，扩增后的NK细胞杀伤功能低下，很难满足临床应用。胰岛素样生长因子即insulin-like growth factor(IGF)-1，作为一类生长因子其生物学功能非常广泛，已经有文献报道IGF-1也可以促进T、B细胞的发育和生物学功能；另外脐带血来源的CD34+造血干细胞在体外经多细胞因子如SCF(干细胞因子)、Flt3-L(Flt3配体)以及IL-15(白介素15)刺激可以分化发育为NK细胞，然而目前的研究成果表明这种体系扩增出的NK细胞数量有限且杀伤功能较弱。 
发明内容
为了克服体外NK细胞扩增倍数及NK细胞的杀伤功能低下的难题，本发明的目的是提供一种IGF-1联合多种细胞因子体外分化并扩增NK细胞的培养方法，该方法不仅能扩增出更多的NK细胞，而且能提高扩增后NK细胞的杀伤潜能。因此，本发明对NK细胞用于临床免疫治疗具有重大意义。 
具体地，本发明提供一种胰岛素样生长因子(IGF-1)联合多种细胞因子体外分化并扩增NK细胞的培养方法，所述培养方法包括：在CD34+造血干细胞的培养体系中同时加入下列细胞因子：胰岛素样生长因子(IGF-1)，干细胞因子(SCF)，Flt3配体(Flt3-L)和白介素15(IL-15)。 
所述方法可以使CD34+造血干细胞分化成NK细胞，并且达到进一步提高NK细胞扩增效率及扩增后的NK细胞杀伤功能的目的。并且，所述方法有效地提高了NK细胞体外扩增倍数，而且扩增出的NK细胞具有更强的杀伤潜能。 
其中所述CD34+造血干细胞由骨髓或新生儿脐带血分离，优选由新生儿脐带血分离。 
其中IGF-1的终浓度可以为100ng/ml，SCF的终浓度可以为20-40ng/ml，Flt3-L的终浓度可以为40-50ng/ml，IL-15的终浓度为30-50ng/ml。 
其中所述细胞因子IGF-1、SCF、Flt3-L和IL-15在CD34+造血干细胞培养的第0天同时加入到培养基中。 
加入所述细胞因子后，所述CD34+造血干细胞在5％CO2和37℃下培养28天。 
在一个优选的实施方案中，从新生儿脐带血分离纯化CD34+造血干细胞，将纯化的CD34+造血干细胞用SCGM(GMP Serum-free Stem Cell Growth Medium，
Figure BDA00003065935400021
/CellGenixTM)培养基(购自Gibco公司)重悬，1×105细胞/孔，在培养第0天即在培养体系中加入SCF(终浓度30ng/ml)，Flt3-L(终浓度50ng/ml)，IL-15(终浓度50ng/ml)以及IGF-1(终浓度100ng/ml)，期间每3-4天半量换液一次，并补充相应浓度新鲜细胞因子，于5％CO2、37℃培养箱中连续培养28天，即可以获得大量的高纯度的NK细胞。 
在培养结束时，对所述培养体系所获得的NK细胞进行比例的检测和数量的统计：在IGF-1联合多细胞因子进行体外扩增培养的第28天，计数并收集细胞进行流式细胞仪检测，可以发现加入IGF-1培养体系所获得的CD3-CD56+NK细胞的比例和绝对数都显著提高。 
在培养结束时，对所述培养体系所获得的NK细胞进行功能的检测：在IGF-1联合多细胞因子进行体外扩增培养的第28天，收集细胞进行流式细胞检测，可以发现加入IGF-1培养体系所获得的NK细胞表达perforin  和CDl07a显著上调，表明NK细胞的杀伤潜能有显著提高。 
本发明所用的细胞因子均为市售来源的细胞因子。 
综上所述，本发明提供下列各项： 
1.一种胰岛素样生长因子联合多种细胞因子体外分化并扩增天然杀伤细胞的方法，所述方法包括：在CD34+造血干细胞的培养体系中同时加入下列细胞因子：胰岛素样生长因子(IGF-1)，干细胞因子(SCF)，Flt3配体(Flt3-L)和白介素15(IL-15)。 
2.根据第1项所述的方法，其中所述CD34+造血干细胞由骨髓或新生儿脐带血分离。 
3.根据第1项所述的方法，其中胰岛素样生长因子IGF-1的终浓度为100ng/ml，干细胞因子SCF的终浓度为20-40ng/ml，Flt3配体Flt3-L的终浓度为40-50ng/ml，IL-15的终浓度为30-50ng/ml。 
4.根据第3项所述的方法，其中干细胞因子SCF的终浓度为30ng/ml，Flt3配体Flt3-L的终浓度为50ng/ml，IL-15的终浓度为50ng/ml。 
5.根据第1项所述的方法，其中所述细胞因子IGF-1、SCF、Flt3-L和IL-15在CD34+造血干细胞培养的第0天同时加入到培养基中。 
6.根据第1项所述的方法，其中加入所述细胞因子后，所述CD34+造血干细胞在5％CO2和37℃下培养28天。 
7.根据第1项所述的方法，其中所用的培养基为SCGM培养基。 
附图说明
从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中： 
图1，IGF-1联合多种细胞因子可以显著提高脐血CD34+细胞的扩增倍数。 
图2，IGF-1联合多种细胞因子可以显著提高NK细胞的比例和绝对数量。 
图3，IGF-1联合多种细胞因子可以显著提高NK细胞的杀伤潜能。 
具体实施方式
下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，本发明并不限于这些具体的实施例。 
实施例中的实验方法，如无特别说明，均采用本领域常规技术，实验试剂均为市售产品。 
实施例1：IGF-1明显促进脐血CD34+细胞的扩增 
首先分离纯化脐带血CD34+造血干细胞，SCGM培养基(GMP Serum-free Stem Cell Growth Medium，
Figure BDA00003065935400041
/CellGenixTM，购自Gibco公司)重悬，1×105细胞/孔，在培养第0天向培养液中加入多种细胞因子：SCF(终浓度30ng/ml，购自Peprotech公司)，Flt3-L(终浓度50ng/ml，购自Peprotech公司)，IL-15(终浓度50ng/ml，Peprotech公司)以及IGF-1(终浓度100ng/ml，购自Peprotech公司)，在5％CO2和37℃下培养28天，期间每周半量换液两次，并计数，细胞扩增倍数有显著提高(图1)。 
实施例2：IGF-1显著促进NK细胞的发育 
分离纯化的脐血CD34+造血干细胞，SCGM培养基重悬，在培养第0天即向培养液中同时加入IGF-1(终浓度100ng/ml，购自Peprotech公司)及多种细胞因子：SCF(终浓度30ng/ml，购自Peprotech公司)，Flt3-L(终浓度50ng/ml，购自Peprotech公司)和IL-15(终浓度50ng/ml，购自Peprotech公司)，培养28天后，收集细胞，流式细胞术检测发现加入IGF-1可以显著提高NK细胞的比例(图2a)和绝对数(图2b)。 
实施例3：IGF-1显著促进NK细胞的杀伤潜能 
实施例2的结果表明IGF-1联合多种细胞因子可以促进脐血CD34+造血干细胞向NK细胞的分化，同时，流式细胞术检测发现，加入IGF-1后，上述分化的NK细胞表达CD107a和perforin(穿孔素)的比例都显著提高(图3)，表明IGF-1促进了NK细胞的杀伤潜能。 
应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由权利要求书所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。 

Claims (7)

1.一种胰岛素样生长因子联合多种细胞因子体外分化并扩增天然杀伤细胞的方法，所述方法包括：在CD34+造血干细胞的培养体系中同时加入下列细胞因子：胰岛素样生长因子IGF-1，干细胞因子SCF，Flt3配体Flt3-L和IL-15。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述CD34+造血干细胞由骨髓或新生儿脐带血分离。
3.根据权利要求1所述的方法，其中胰岛素样生长因子IGF-1的终浓度为100ng/ml，干细胞因子SCF的终浓度为20-40ng/ml，Flt3配体Flt3-L的终浓度为40-50ng/ml，IL-15的终浓度为30-50ng/ml。
4.根据权利要求3所述的方法，其中干细胞因子SCF的终浓度为30ng/ml，Flt3配体Flt3-L的终浓度为50ng/ml，IL-15的终浓度为50ng/ml。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞因子IGF-1、SCF、Flt3-L和IL-15在CD34+造血干细胞培养的第0天同时加入到培养基中。
6.根据权利要求1所述的方法，其中加入所述细胞因子后，所述CD34+造血干细胞在5％CO2和37℃下培养28天。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所用的培养基为SCGM培养基。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104894065A (zh) * 2015-07-09 2015-09-09 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种nk细胞培养基及nk细胞的培养方法
CN106701677A (zh) * 2015-11-18 2017-05-24 深圳爱生再生医学科技有限公司 Nk细胞的体外扩增培养方法
CN113046314A (zh) * 2021-03-30 2021-06-29 中国科学技术大学 一种人脐血或骨髓造血干细胞体外诱导扩增蜕膜样自然杀伤细胞的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FANG NI等: "An improved protocol for ex vivo expansion of highly lytic NK cells from human umbilical cord blood CD34+ cells", 《PROTOCOL EXCHANGE》 *
FANG NI等: "IGF-1 promotes the development and cytotoxic activity of human NK cells", 《NATURE COMMUNICATIONS》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104894065A (zh) * 2015-07-09 2015-09-09 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种nk细胞培养基及nk细胞的培养方法
CN104894065B (zh) * 2015-07-09 2018-04-03 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种nk细胞培养基及nk细胞的培养方法
CN106701677A (zh) * 2015-11-18 2017-05-24 深圳爱生再生医学科技有限公司 Nk细胞的体外扩增培养方法
CN113046314A (zh) * 2021-03-30 2021-06-29 中国科学技术大学 一种人脐血或骨髓造血干细胞体外诱导扩增蜕膜样自然杀伤细胞的方法

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