CN105754939A - 一种提高脐带血红系祖细胞定向分化效果的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于细胞技术领域，具体涉及一种提高脐带血红系祖细胞定向分化效果的方法。该方法以脐带血造血干细胞为标本细胞，使用含有天然化合物白皮杉醇的扩增培养基进行定向分化扩增。含有白皮杉醇的扩增培养基使红系祖细胞定向分化操作更简便安全和高效。在脐带血造血干细胞向红系祖细胞定向分化培养过程中，加入细胞因子的同时加入白皮杉醇，达到了既增加红系祖细胞生成数量的同时又提高BFU?E集落形成能力的效果，本发明的操作简便，成本低廉，得到的红系祖细胞安全性高，分化成红细胞的能力更好。

Description

一种提高脐带血红系祖细胞定向分化效果的方法
技术领域
本发明属于细胞技术领域，具体涉及一种提高脐带血红系祖细胞定向分化效果的方法。
背景技术
在临床治疗过程中，输血是重要的治疗辅助方式，红细胞是最常用的血液输注成分。国内的临床血液供应依赖无偿捐献，而需求量持续扩大的同时无偿献血增长量却相对落后，这使全国许多城市出现血液紧缺，无论是全血还是红细胞等成分血的供应都存在缺口。
为了弥补无偿献血量增长量相对滞后所带来的红细胞供应不足，科研人员便进行红细胞替代品的研究。目前开发的主要红细胞替代品有氟碳类化合物和血红蛋白氧载体，但这两种替代物都有各自局限，氟碳类化合物的携氧能力不强，体内代谢较缓慢且制备过程对临床使用的安全性有影响；而血红蛋白氧载体尽管避免了血红蛋白直接输注导致的不良反应，但稳定性差，同时游离血红蛋白所产生的毒副作用也对人体有直接的伤害，这些都限制了临床应用。所以，寻觅更有效的红细胞替代物具有实际意义。
干细胞研究的蓬勃开展以及相关的生物学技术应用作为生命科学的研究热点之一，为再生医学带来了希望。目前干细胞的应用方面，造血干细胞是应用时间最久且效果已被广泛验证的。造血干细胞能分化为红细胞、血小板、T淋巴细胞等血液成分、重建人体造血系统，所以从1950年代骨髓移植开始，造血干细胞便在世界范围内广泛应用于临床，作为重建患者造血体系、治疗血液系统疾病的重要方法。1989年Gluckman主持了世界第一例脐带血造血干细胞移植，从此脐带血造血干细胞便广泛用于临床治疗。脐带血造血干细胞采集过程简单、对供者无任何伤害、实物储存且细胞状态更为原始的优点，都是骨髓及外周血不具备的，是理想的造血干细胞来源。
世界范围内对造血干细胞的不断研究发现，体外进行造血干细胞分化从而为临床治疗提供相应的血液成分细胞是可行的，这是能够弥补无偿献血量不足的新研究方向。在人体内，造血干细胞选择红系方向分化成红系祖细胞，再由红系祖细胞继续分化成熟为红细胞，该过程是复杂的，而在体外进行该诱导分化过程同样存在许多待克服的问题，尤其是红细胞的规模化制备和红细胞分化成熟的效率方面，都制约了体外造血干细胞直接分化为红细胞的实际效果，从而限制了造血干细胞体外分化为红细胞的临床应用潜力。
随着研究的深入，发现输注红系祖细胞(Erythroid Progenitor Cell)，同样可以作为临床上补充红细胞的途径。2010年，Arvind等证实，造血干细胞在体外定向诱导分化为红系祖细胞后输注回机体，红系祖细胞可与骨髓基质细胞有效地相互作用，提高了红系祖细胞在体内的存活率和增加了后期成熟比例，因此输注红系祖细胞并在体内的成熟过程可视为一种新的可扩增的输注方法。
与输注一般的红细胞相比，输注红系祖细胞有几方面显著的优点：1)红系祖细胞在体内可以继续分化，最终形成4～64个红细胞，对比于红细胞，输注红系祖细胞所需要的细胞数量会大为减少，从而降低了身体的铁负荷；2)红系祖细胞在体内环境下成熟并分化产生的红细胞具有更长的存活时间，携氧能力更强，使患者的细胞输注频率降低，输注次数减少，相应地降低了红细胞输注过多而引起的血色病的发病可能性；3)红系祖细胞体内成熟分化的过程，对于受化疗放疗的肿瘤患者和慢性贫血的支持性治疗具有更好的效果；4)输注红系祖细胞能有效减少输注次数，减少了输注导致感染的可能性，从而提高了输注安全性。
红系祖细胞作为造血干细胞的重要分化方向，世界范围内已广泛开展研究。在体外，红系祖细胞的定向分化扩增普遍采用细胞因子诱导，通常使用IL-3(白介素-3)、SCF(干细胞因子)、EPO(红细胞生成素)、CSF(集落刺激因子)等因子的组合进行培养。对于单纯的细胞因子诱导，其扩增分化效率与临床需要有相当距离。如果采用生物反应器，红系祖细胞的生成量确实可以大幅提高，但随之而来大幅增加的成本同样制约着临床使用。所以，如何在提高造血干细胞向红系祖细胞诱导分化效果的同时降低成本负担，对实际应用有重大意义。
造血干细胞的各个分化方向中，许多信号通道分别参与各阶段的进程，如MAPK、WNT信号通道等。在向红系祖细胞的分化过程中，MAPK信号通道起着主要作用，当中尤其是p38MAPK信号通道。MAPK信号通道全称有丝分裂原活化蛋白激酶信号通道(mitogen activated protein kinases)，广泛参与在细胞的增殖、分化、存活和凋亡过程。MAPK信号通道主要成员包括ERK、JNK以及p38MAPK。跟造血干细胞密切相关的是p38MAPK，在红细胞生成的调控上有着关键作用。1998年，Nagata Y.等阐述了p38MAPK信号通道的活化在EPO诱导红细胞生成过程中是不可或缺的。随后在1999年，同样是Nagata Y.等证实了在不添加EPO的状态下，p38MAPK信号通道的短暂活化可以促使红系祖细胞的分化。而Witt O.等在2000年证实了抑制ERK信号通道的同时活化p38MAPK可使人K562细胞向红系细胞分化，从而更进一步说明了p38MAPK活性的提高在红系祖细胞向红细胞分化的过程中具有极其重要的促进作用。
随着研究的不断深入，影响p38MAPK信号通道活性的化学物质逐渐得以发现。Liu等，在2012使用白皮杉醇(Piceatannol)处理细胞的实验中同时发现了p38MAPK信号通道的激活和ERK信号通道的失活，随后在2013年进一步证明了白皮杉醇直接提高了p38MAPK蛋白的表达。
白皮杉醇(Piceatannol)，C14H12O4，芪类化合物，具有较强的抗氧化能力以及清除羟基自由基的能力，在抑制癌细胞活性促进癌细胞凋亡方面有明显效果，鉴于其对于p38MAPK信号通道活性的明确提升作用，因此，在体外进行脐带血造血干细胞向红系祖细胞分化过程中，通过添加入白皮杉醇激活p38MAPK信号通道，从而明显提高脐带血造血干细胞向红系祖细胞分化扩增的效果，具有实质性的理论依据。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种提高脐带血红系祖细胞定向分化效果的方法。该方法添加天然的化合物白皮杉醇(Piceatannol)，培养后获得红系祖细胞产品，制备过程简单、可靠，重复性好且成本低廉。通过上述方法，在已知临床应用所需的红系祖细胞数量时，可以减少制备时间；或者在提供相同数量的红系祖细胞的情况下能最终产生更多红细胞，为临床应用提供了更有效和快捷的支持。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种提高脐带血红系祖细胞定向分化效果的方法，包含如下步骤：
以脐带血造血干细胞为标本细胞，在含有白皮杉醇(Piceatannol)的扩增培养基中进行定向分化，得到红系祖细胞；
所述的含有白皮杉醇的扩增培养基中白皮杉醇的浓度为5～15μmol/L；优选为5μmol/L；
所述的含有白皮杉醇的扩增培养基优选为：以基本扩增培养基为基础加入白皮杉醇，其中，基本扩增培养基为含有细胞因子IL-3、EPO、SCF和DEX的Stemspan培养基；
所述的细胞因子IL-3的终浓度优选为20ng/mL、EPO的终浓度优选为1.5U/mL、SCF的终浓度优选为100ng/mL、DEX的终浓度优选为1nM；
所述的Stemspan培养基购自STEMCELL公司；
一种提高脐带血红系祖细胞定向分化效果的方法，优选包括如下具体步骤：
(1)白皮杉醇溶解于细胞保护剂中，得到白皮杉醇储存溶液；
(2)将步骤(1)得到的白皮杉醇储存溶液添加到基本扩增培养基中，得到含有白皮杉醇的扩增培养基；
(3)将脐带血造血干细胞接种至步骤(2)得到的含有白皮杉醇的扩增培养基中进行定向分化培养，得到红系祖细胞；
步骤(1)中所述的白皮杉醇的纯度≥99％，GC；
步骤(1)中所述的白皮杉醇储存溶液浓度为10mmol/L，该浓度为储存浓度，扩增时直接使用储存浓度并根据样本体积进行终浓度调配，储存溶液须放置于4℃遮光保存；
步骤(1)中所述的细胞保护剂优选为二甲基亚砜(DMSO)与低分子右旋糖酐(Dextron)按体积比1:1混合得到的混合液；
步骤(2)中所述的基本扩增培养基为含有细胞因子IL-3、EPO、SCF和DEX的Stemspan培养基；所用的细胞因子全称分别为人白细胞介素-3(Interleukin-3，IL-3)、促红细胞生成素(Erythropoietin，EPO)、人干细胞生长因子(Stem cellfactor,SCF)，共3种细胞因子，以及地塞米松(dexamethasone)；
所述的细胞因子IL-3的终浓度优选为20ng/mL、EPO的终浓度优选为1.5U/mL、SCF的终浓度优选为100ng/mL、DEX的终浓度优选为1nM；
步骤(2)中所述的含有白皮杉醇的扩增培养基中白皮杉醇的浓度为5～15μmol/L；优选为5μmol/L；
步骤(3)中所述的脐带血造血干细胞的制备方法优选为：采集的新鲜脐带血，通过Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞，经过离心后，收集白膜层，加生理盐水重悬再离心；加入细胞保护剂后程控降温，储存于液氮中；诱导分化前，脐带血造血干细胞解冻，加生理盐水重悬洗涤再离心，收集得到脐带血造血干细胞；所述的细胞保护剂优选为二甲基亚砜(DMSO)与低分子右旋糖酐(Dextron)按体积比1:1混合得到的混合液；
步骤(3)中所述的定向分化培养的条件优选为：在37℃，二氧化碳浓度为5％的条件下培养；
步骤(3)中所述的定向分化培养的时间为1～21天；
一种红系祖细胞，通过上述方法制备得到；
所述的红系祖细胞在制备临床细胞治疗产品领域中的应用；具体可以为临床提供辅助治疗和术后恢复的细胞；
本发明的原理：为了提高体外分化扩增红系祖细胞的效果，在脐带血造血干细胞向红系祖细胞定向分化培养过程中，本发明使用细胞因子组合作为红系祖细胞的扩增基础上加入白皮杉醇(Piceatannol)，在造血干细胞向红系祖细胞分化扩增过程中，白皮杉醇能更有效激活p38MAPK信号通道活性，最终达到提高造血干细胞向红系祖细胞分化的效果。本发明所使用细胞因子组合包括IL-3(白介素-3)、SCF(干细胞因子)、EPO(红细胞生成素)，另外加入DEX(地塞米松)以促进EPO和SCF的协同作用效果。在上述细胞因子及DEX基础上，本发明加入白皮杉醇，分别在第7天、第14天、第21天检测红系祖细胞的生成量、流式检测结果及BFU-E集落形成能力。经检测，本发明通过添加微量的白皮杉醇显著提高了红系祖细胞的定向分化扩增效果，进而为更广泛的临床试验提供前期技术基础，且本发明的操作简便，成本低，得到的红系祖细胞安全性高，BFU-E集落形成能力更好。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明有效提高了脐带血造血干细胞向红系祖细胞定向分化获得的细胞总数量，最终获得更大量的红系祖细胞，成本低廉。
(2)本发明扩增后的红系祖细胞具有更优异的BFU-E集落形成能力，表明这些红系祖细胞具有更强的红细胞形成潜力，意味着使用相同数量的红系祖细胞最终能产生更大量的红细胞，可以更有效地支持临床治疗需要。
(3)本发明使用的含有白皮杉醇的扩增培养基是白皮杉醇培养基，为独有配置的扩增培养基，该含有白皮杉醇的扩增培养基使红系祖细胞定向分化操作更简便安全和高效。
(3)本发明配制的白皮杉醇储存溶液，是把白皮杉醇溶解于二甲基亚砜(DMSO)和低分子右旋糖酐(Dextron)体积比为1:1的细胞保护剂中。二甲基亚砜是常用的有机溶剂，但对细胞有一定的毒性作用，低分子右旋糖酐对细胞有保护作用，该种方法配制的白皮杉醇储存液用于细胞培养，不但保证了白皮杉醇在细胞培养过程中药效的发挥，而且较少了二甲基亚砜对细胞的毒性作用。
附图说明
图1是各浓度白皮杉醇培养基作用下，脐带血造血干细胞各样本在第1、7、14、21天的细胞总数量变化的结果图。
图2是各浓度白皮杉醇培养基作用下，脐带血造血干细胞各样本在第7、14、21天相对于第1天的细胞总数量的扩增倍数分析图。
图3是各浓度白皮杉醇培养基作用下，脐带血造血干细胞各样本在第1、7、14、21天的CD71+表面抗原表达情况分析图。
图4是各浓度白皮杉醇培养基作用下，脐带血造血干细胞各样本在第1、7、14、21天的CD71+细胞总数量分析图。
图5是各浓度白皮杉醇培养基作用下，脐带血造血干细胞各样本在第7、14、21天相对于第1天的CD71+细胞总数量的扩增倍数分析图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
Stemspan培养基购自STEMCELL公司；
细胞保护剂为DMSO与Dextron按体积比1:1混合得到的混合液；
实施例1
脐带血采自健康产妇孕婴，经检测乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒、艾滋、巨细胞病毒、TORCH检测、支原体、衣原体、G-6PD和地贫均为阴性。标本自采集到运回血库的运输条件保持在4～8℃。按以下方法进行巨核祖细胞定向分化操作：
1、白皮杉醇(Piceatannol)溶液及基础扩增培养基的配制
白皮杉醇(≥99％，GC)，溶解于细胞保护剂中，配制成浓度为10mmol/L白皮杉醇储存溶液；
基本扩增培养基：Stemspan培养基中添加细胞因子IL-3(终浓度为20ng/mL)、EPO(终浓度为1.5U/mL)、SCF(终浓度为100ng/mL)和DEX(终浓度为1nM)；
含有白皮杉醇的扩增培养基：将上述配制的白皮杉醇储存溶液添加到基本扩增培养基中，得到含有白皮杉醇的扩增培养基；其中，白皮杉醇的终浓度分别为0μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L；白皮杉醇的终浓度为0μmol/L为对照组(Control组)。
2、脐带血造血干细胞的准备
从采集运输到库在4小时内的新鲜健康人脐带血中获取富含CD34+造血干细胞的单个核细胞层，程控降温，冷冻于液氮中保存；诱导分化前解冻复苏，然后接种于6孔板中，加入含有白皮杉醇的扩增培养基。具体过程如下：
(1)采集新鲜的脐带血，4小时内运输回广东省脐带血库，通过Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞，经过离心后，收集白膜层(白膜层在血浆层和分离液层中间)，加生理盐水重悬洗涤，加入细胞保护剂后，经程控降温仪降温并冷冻保存于液氮中；
(2)将步骤(1)制得的脐带血造血干细胞解冻复苏，转移至离心管，总体积约10ml，加入30ml生理盐水(3倍体积)，洗涤1次，离心力200g，离心8分钟，收集细胞沉淀，即得脐带血造血干细胞；把脐带血造血干细胞接种在6孔培养板上，加入含有白皮杉醇的扩增培养基，使得各个样本对应相应浓度白皮杉醇；
3、红系祖细胞的鉴定
红系祖细胞的鉴定通过以下方法
(1)红系祖细胞的形态学分析及细胞计数：将培养的细胞在倒置显微镜观察细胞状态并拍照。取微量细胞悬液，计算细胞数量。
(2)流式细胞仪的表型测定：分别取培养后第1天，第7天，第14天，第21天的细胞，进行CD71+检测。
(3)红系祖细胞的BFU-E集落形成能力测定：分别取培养后第1天，第7天，第14天，第21天的细胞接种于6孔板半固体培养基MethoCultTMH4434Classic中，接种细胞浓度为5×103/ml，于温度37℃、5％CO2的培养箱中进行周期为14天的BFU-E集落培养。
造血干细胞/红系祖细胞鉴定结果、细胞活性及BFU-E集落生成能力分析：
①倒置显微镜下观察接种后第1天的脐带血造血干细胞，细胞数量充足，形态较为单一，呈分散状态，细胞饱圆，胞体透亮。细胞计数结果，Control及5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L白皮杉醇各样本的造血干/祖细胞数量分别为：1.4×106个、1.6×106个、1.2×106、2.3×106；如图1所示。
经过流式细胞仪检测，在CD71+细胞比例方面，Control及5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L白皮杉醇各样本的数值均为43.7％；如图3所示。
CD71+细胞总量方面，Control及5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L白皮杉醇各样本的数值分别为：0.61×106个、0.7×106个、0.52×106个、1.0×106个；如图4所示。
②倒置显微镜下观察接种后第7天的脐带血造血干细胞分化状况，与第1天相比，细胞数量明显增加，形态出现分化，部分是分散的胞体透亮的造血干/祖细胞，部分发生分化，细胞体积略有缩小，颜色加深，出现部分红色聚团，呈较紧密聚集状排列。细胞计数结果，Control及5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L白皮杉醇各样本的造血干/祖细胞数量分别为：8.56×106个、7.28×106个、7.2×106个、9.58×106个；如图1所示。对比于第1天，细胞数量比值分别为：611％、455％、600％、417％；如图2所示。
经过流式细胞仪检测，在CD71+细胞比例方面，Control及5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L白皮杉醇各样本的数值分别为：79.03％、80.2％、79.32％、72.2％；如图3所示。
CD71+细胞总量方面，Control及5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L白皮杉醇各样本的数值分别为：6.76×106个、5.84×106个、5.71×106个、6.92×106个；如图4所示。对比于第1天，CD71+细胞数量比值分别为：11.06倍、8.36倍、10.89倍、6.92倍；如图5所示。
将第7天的细胞进行为期14天的BFU-E集落培养，Control及5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L白皮杉醇各样本的BFU-E集落数值分别为：98个、139个、127个、106个。
经过7天培养后，添加白皮杉醇培养基的样本细胞增殖比例均低于Control，10μmol/L样本与Control接近；流式结果方面，含有5μmol/L、10μmol/L白皮杉醇的样本比Control略高；BFU-E集落方面，添加白皮杉醇培养基的样本均高于Control，5μmol/L样本结果最优，比Control高了41％。
③倒置显微镜下观察接种后第14天的脐带血造血干细胞分化状况，与第7天相比，细胞数量继续大幅增加，形态出现明显分化，≤40％是分散状胞体透亮的造血干/祖细胞，超过一半为分化的红系祖细胞，明显的成簇聚集，红色团状细胞团明显增多。细胞计数结果，Control及5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L白皮杉醇各样本的造血干/祖细胞数量分别为：32.74×106个、34.33×106个、35.17×106个、38.21×106个；如图1所示。分别相当于第1天各样本原始细胞数量的：23.38倍、21.46倍、29.31倍、16.61倍；如图2所示。
经过流式细胞仪检测，在CD71+细胞比例方面，Control及5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L白皮杉醇各样本的数值分别为：86.36％、97.34％、81.55％、78.91％；如图3所示。
CD71+细胞总量方面，Control及5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L白皮杉醇各样本的数值分别为：28.28×106个、33.42×106个、28.68×106个、30.15×106个；如图4所示。分别相当于第1天各样本原始细胞数量的：46.22倍、47.8倍、54.7倍、30倍；如图5所示。
将第14天的细胞进行为期14天的BFU-E集落培养，Control及5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L白皮杉醇各样本的BFU-E集落数值分别为：13个、11个、8个、10个。
经过14天培养后，添加白皮杉醇的样本，细胞增殖比例方面，10μmol/L样本明显高于Control，5μmol/L略低于Control，15μmol/L远低于Control。
在流式结果方面，CD71+细胞比例，5μmol/L样本明显高于Control，10μmol/L与15μmol/L样本低于Control。
BFU-E集落数目方面，添加白皮杉醇培养基的样本均低于Control。
④倒置显微镜下观察接种后第21天的脐带血造血干细胞分化状况，与第14天相比，细胞数量大幅增加，形态出现明显分化，<20％是分散状胞体透亮的造血干/祖细胞，其余为分化形成的红系祖细胞，明显的成簇聚集，红色团状细胞团遍布目镜范围，红色细胞明显比第14天增加更多。细胞计数结果，Control及5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L白皮杉醇各样本的造血干/祖细胞数量分别为：35.7×106个、49.2×106个、39.83×106个、47.69×106个；如图1所示。分别相当于于第1天各样本原始细胞数量的：25.5倍、30.75倍、33.19倍、20.7倍；如图2所示。
经过流式细胞仪检测，在CD71+细胞比例方面，Control及5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L白皮杉醇各样本的数值分别为：79.14％、77.51％、74.97％、72.47％；如图3所示。
CD71+细胞总量方面，Control及5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L白皮杉醇各样本的数值分别为：28.25×106个、38.14×106个、29.86×106个、34.56×106个；如图4所示。分别相当于第1天各样本原始细胞数量的：46.18倍、54.55倍、56.9倍、34.56倍；如图5所示。
将第21天的细胞进行为期14天的BFU-E集落培养，Control及5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L白皮杉醇各样本的BFU-E集落数值分别为：14个、19个、20个、12个。
经过21天培养后，含有5μmol/L、10μmol/L白皮杉醇的样本，细胞增殖数量明显高于Control，尤其是10μmol/L白皮杉醇样本，细胞增殖效果最为明显。
在流式结果方面，含有白皮杉醇的样本CD71+细胞比例均略低于Control，但数值很接近。BFU-E集落数目方面，含有5μmol/L、10μmol/L白皮杉醇培养基的样本均明显高于Control。
综上所述，按照本发明的方法进行脐带血造血干细胞向红系祖细胞的定向扩增，终结果显示，含有5μmol/L白皮杉醇的扩增培养基样本显著提高了扩增的细胞总量及CD71+红系祖细胞数量，CD71+红系祖细胞总数明显高于Control；含有10μmol/L白皮杉醇的扩增培养基对细胞总量及CD71+红系祖细胞数量的扩增效果比5μmol/L白皮杉醇样本更优，但各个阶段流式结果均不高于Control；BFU-E集落生成能力方面，使用5μmol/L和10μmol/L白皮杉醇的扩增培养基的样本均明显高于Control。
总概而言，含有5μmol/L白皮杉醇的扩增培养基显著提高了红系祖细胞的生成总数量，同时提高了BFU-E的集落生成能力；在培养过程的各个阶段均对红系祖细胞的产生数量有提升作用，尤其第14～21天阶段，细胞总数和CD71+细胞总数比其他所有样本有更明显的增长；流式结果同样优于其他浓度的白皮杉醇样本从而全面提高了红系祖细胞的定向扩增效果，且操作过程简单、安全。故优选含有5μmol/L白皮杉醇的扩增培养基。
实施例2
参照实施例1的方法进行脐带血造血干细胞向红系祖细胞定向扩增：
经过21天培养后，最终结果：Control及5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L白皮杉醇各样本的造血干/祖细胞数量分别为：39.02×106个、44.29×106个、40.25×106个、47.52×106个；对比于第1天，细胞数量比值分别为：24.85倍、28.21倍、25.63倍、30.26倍。
经过流式细胞仪检测，在CD71+细胞比例方面，各样本结果分别为：73.97％、67.18％、66.65％、68.6％；
CD71+细胞总数方面，白皮杉醇各浓度样本结果分别为：28.86×106个、29.76×106个、26.83×106个、32.6×106个；对比于第1天，细胞数量比值分别为：42.07倍、43.37倍、39.1倍、47.51倍。
BFU-E集落数目方面，结果分别为：12个、18个、31个、14个。
第21天的结果：细胞增殖比例方面，5μmol/L白皮杉醇样本明显高于Control；流式结果比较显示，Control略高于含有白皮杉醇各浓度的样本；CD71+细胞总数方面，5μmol/L白皮杉醇样本同样高于Control；BFU-E集落培养结果显示，含有5μmol/L与10μmol/L白皮杉醇的样本均显著高于Control。重复实验中15μmol/L白皮杉醇样本在细胞总量增殖及CD71+细胞增殖倍数比Control高，也略优于5μmol/L白皮杉醇样本，但是BFU-E低于5μmol/L白皮杉醇样本，与实施例1综合比较，依然是5μmol/L白皮杉醇样本为最优选择。
总概而言，添加含有5μmol/L白皮杉醇的扩增培养基培养的细胞样本，细胞增殖数量明显高于Control，CD71+细胞增殖比例同样高于Control，BFU-E集落数量也明显高于Control，结论与实施例1相同，含有5μmol/L白皮杉醇的扩增培养基为最优选择。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种提高脐带血红系祖细胞定向分化效果的方法，其特征在于包含如下步骤：
以脐带血造血干细胞为标本细胞，在含有白皮杉醇的扩增培养基中进行定向分化，得到红系祖细胞。
2.根据权利要求1所述的提高脐带血红系祖细胞定向分化效果的方法，其特征在于：
所述的含有白皮杉醇的扩增培养基中白皮杉醇的浓度为5～15μmol/L。
3.根据权利要求2所述的提高脐带血红系祖细胞定向分化效果的方法，其特征在于：
所述的含有白皮杉醇的扩增培养基中白皮杉醇的浓度为5μmol/L。
4.根据权利要求1所述的提高脐带血红系祖细胞定向分化效果的方法，其特征在于：
所述的含有白皮杉醇的扩增培养基为：以基本扩增培养基为基础加入白皮杉醇，其中，基本扩增培养基为含有细胞因子IL-3、EPO、SCF和DEX的Stemspan培养基。
5.根据权利要求4所述的提高脐带血红系祖细胞定向分化效果的方法，其特征在于：
所述的细胞因子IL-3的终浓度为20ng/mL、EPO的终浓度为1.5U/mL、SCF的终浓度为100ng/mL、DEX的终浓度为1nM。
6.根据权利要求1～5任一项所述的提高脐带血红系祖细胞定向分化效果的方法，其特征在于包括如下具体步骤：
(1)白皮杉醇溶解于细胞保护剂中，得到白皮杉醇储存溶液；
(2)将步骤(1)得到的白皮杉醇储存溶液添加到基本扩增培养基中，得到含有白皮杉醇的扩增培养基；
(3)将脐带血造血干细胞接种至步骤(2)得到的含有白皮杉醇的扩增培养基中进行定向分化培养，得到红系祖细胞。
7.根据权利要求6所述的提高脐带血红系祖细胞定向分化效果的方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的细胞保护剂为二甲基亚砜与低分子右旋糖酐按体积比1:1混合得到的混合液。
8.根据权利要求6所述的提高脐带血红系祖细胞定向分化效果的方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的脐带血造血干细胞的制备方法为：采集的新鲜脐带血，通过Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞，经过离心后，收集白膜层，加生理盐水重悬再离心；加入细胞保护剂后程控降温，储存于液氮中；诱导分化前，脐带血造血干细胞解冻，加生理盐水重悬洗涤再离心，收集得到脐带血造血干细胞。
9.根据权利要求6所述的提高脐带血红系祖细胞定向分化效果的方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的定向分化培养的时间为1～21天。
10.一种红系祖细胞，其特征在于通过权利要求1～9任一项所述的方法制备得到。
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