CN107164321A - 一种人类冻存单个核细胞高效扩增nk细胞的方法 - Google Patents

一种人类冻存单个核细胞高效扩增nk细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及细胞生物学领域，具体公开了一种人类冻存单个核细胞(PBMC)高效扩增自然杀伤(NK)细胞的方法。抽取外周血利用密度梯度分离法提取出单个核细胞，冻存后单个核细胞按照本发明方法体外诱导增殖成CD3‑CD56+型自然杀伤细胞，其细胞扩增数量可以达到诱导前的1000多倍，细胞比例高达90％，细胞杀瘤性高达87％。冻存单个核细胞与新鲜血液提取出单个核细胞在诱导成杀伤细胞数量、杀瘤性、活性均无显著性差异。本发明为老年人健康保健和肿瘤患者过继免疫治疗提供了一个切实可行方法。

Description

一种人类冻存单个核细胞高效扩增NK细胞的方法
技术领域
本发明涉及细胞生物学领域，具体地说，涉及一种人类冻存单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC)高效扩增自然杀伤细胞(natural killercell，NK)的方法。
背景技术
自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)，是机体内天然免疫第一道防线。它具有高效抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节功能，在防御机体疾病中发挥着重要作用。自然杀伤细胞具有不受组织兼容性抗原限制，即杀伤活性无MHC限制。细胞具有广谱杀毒性，且不需要抗原递呈细胞启动即可直接进攻癌细胞。自然杀伤细胞通过直接溶解、释放穿孔素和分泌细胞因子两个方面进行杀瘤。细胞可以分泌TNF-ɑ、IFN-γ和IL-1细胞因子。这些细胞因子在调节淋巴细胞发挥免疫功能起着重要作用。科学研究表明，自然杀伤细胞具有调节免疫功能和神经系统相互作用能力。理论上这种细胞可以成为高效治疗癌症免疫疗法。然而，自然杀伤细胞在外周血中含量仅为5％-10％，随着年龄增长，免疫器官衰老，细胞活性和数量随之降低。免疫功能降低，直接或间接导致疾病和恶性肿瘤发生。
过继免疫细胞疗法是抽取癌症患者外周血，在体外增殖免疫细胞并回输到体内。在此状态下制备免疫细胞具有较小杀瘤能力，临床上不能达到满意疗效，因此，研究中找到高活性免疫细胞，并建立质量稳定、足够数量、高纯度和杀瘤活性强培养方法成为亟待解决问题。
通过对不同年龄段人群分析发现，随着年龄增高，免疫力逐渐下降。当年龄25岁时，细胞活力和数量达到最大值。当年龄25-55之间时，细胞活力和数量处于最优，当年龄超过55岁时，细胞活性和数量呈现下降趋势。为了提供健康保障，我们在年轻健康时将免疫细胞即外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC)存储下来，未来待需要时通过免疫治疗方法，可以及时为我们补充健康免疫细胞，抗衰保健，提高免疫力，预防疾病发生和肿瘤免疫治疗。因此，体外建立冻存PBMC高效增殖自然杀伤细胞培养方法是细胞过继免疫治疗肿瘤关键。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种人类冻存单个核细胞高效扩增NK细胞的方法。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种人类冻存单个核细胞高效扩增NK细胞的方法，包括如下步骤：
(1)将冻存的单个核细胞融化，将融化后细胞悬液迅速转移到NK-EX培养液中，离心，弃上清，将沉淀细胞打散，将细胞接种至包被CD3/CD28T细胞激活剂的培养瓶中，加入刺激液和AB血浆于培养瓶中，使培养体系中的细胞密度达到(1～1.5)×106个/mL、AB血浆的体积浓度达到5％，记为D0天；
(2)D3天解除刺激，将培养瓶中的细胞悬液离心，弃上清，将沉淀细胞打散，将细胞接种至新的培养瓶中，加入扩增培养基和AB血浆于培养瓶中，使培养体系中的细胞密度达到(1～1.5)×106个/mL、AB血浆的体积浓度达到10％；
(3)在D5天和D7天向培养的细胞悬液中补加扩增培养基和AB血浆，使体系中的细胞密度维持在(1～1.5)×106个/mL、AB血浆的体积浓度维持在15％；
(4)在D9天向培养的细胞悬液中补加扩增培养基和AB血浆，使体系中的细胞密度维持在(1～1.5)×106个/mL、AB血浆的体积浓度维持在10％；
(5)在D11天及之后的每隔一天，向培养的细胞悬液中补加扩增培养基和AB血浆，使体系中的细胞密度维持在(1～1.5)×106个/mL、AB血浆的体积浓度维持在2～3％；
(6)在D14天后对细胞悬液进行采样细胞计数，当连续两天计数结果变化不大于10％时，可以进行细胞收集。
期间，可依据补液量选择更换更大规格的细胞培养瓶或细胞培养带，可选地，例如T175细胞培养瓶或1000mL细胞培养袋。
进一步地，本发明经研究发现，步骤(1)刺激细胞时的培养条件对细胞诱导存在影响。经试验探究后，本发明提供一种优选的细胞刺激培养条件，即步骤(1)配制好培养体系后，将培养瓶先置于39℃、5％CO2的条件下培养20小时，再置于37℃、5％CO2的条件下继续培养。
进一步地，D1天及之后，培养条件均为37℃、5％CO2。
进一步地，步骤(1)中的融化具体为将冻存的单个核细胞于37℃水浴中1min内融化。
其中，所述刺激液为含有26mL/L T细胞扩增添加剂、20mL/L L-谷氨酰胺和500-1000U/mL白细胞介素2的T细胞扩增基础培养基。所述T细胞扩增基础培养基为市售可得商品，例如，可购自STL公司。
所述扩增培养基为添加有500-1000U/mL白细胞介素2和10-30ng/mL白细胞介素18的NK-EX培养基。所述NK-EX培养基为市售可得商品，例如，可购自STL公司。
所述包被CD3/CD28T细胞激活剂的培养瓶，用PBS稀释CD3/CD28T细胞激活剂，包被T75培养瓶，CD3/CD28T细胞激活剂浓度为(5-20)μg/mL，37℃过夜，吸弃培养瓶中PBS，4℃冰箱放置3个月可用。所述培养瓶优选为T75培养瓶。
上述所叙述中CD3/CD28T细胞激活剂浓度为20μg/mL。
所述AB血浆为市售可得商品，例如，可购自采血中心，经检验合格后可以使用。
进一步地，在实际应用时，还需对步骤(6)所得的细胞悬液进行后续处理，具体为，将所述细胞悬液离心，弃上清，将沉淀细胞打散，用PBS定容后离心，重复操作一次；用生理盐水定容后再次离心，对沉淀细胞进行分散和生理盐水重悬；过70um细胞筛，将过筛后的细胞悬液打入到生理盐水中，即可用于实际应用。
进一步地，所述冻存的单个核细胞为利用密度梯度离心法从外周血中分离出单个核细胞，并采用10％DMSO和90％自体血浆逐级降温方式冻存单个核细胞。
在本发明的一个具体实施方式中，提供了所述冻存的单个核细胞的制备方法，具体为：收集受试者50mL外周血样，室温下混匀，转移至离心管中，留取2mL外周血做流式；3000rpm/10min，温度20℃，上下加速度调成5/5；离心结束后取出离心管，将血浆转移至另一个50mL离心管，余下血浆56℃灭活30～40min，灭活结束，过70um膜，3000rpm/10min离心；用PBS将血液定容，混匀，将血慢慢打到淋巴细胞分离液中，温度室温，转速1600rpm，离心30min，上下加速度分别调为5；
离心结束后，将离心管白细胞层上方8-12cm处液体弃掉，将白细胞层细胞转移至新离心管，用PBS定容到45mL，温度20℃，转速1200rpm，离心5min，弃上清，将沉淀打散，再次用PBS定容，混匀，取出部分细胞悬液进行计数，余下细胞悬液以1200rpm，温度20℃，离心5min，弃上清，将沉淀打散，配制含有10％二甲基亚砜和自体血浆混合液，按着1×107个/mL密度冻存细胞，将冻存终细胞悬液分装到冻存管中，放入4℃平衡过的冻存盒中，放于-80℃冰箱内24小时，后放入液氮罐中。将余下血浆直接冻于-20℃。
本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。
本发明的有益效果在于：
本发明建立了人类冻存单个核细胞体外高效扩增NK细胞的方法。并通过采用不同血浆类型和浓度对体外NK细胞进行培养，筛选出了最佳的血浆种类和最佳的血浆浓度培养方案，使扩增得到的NK细胞在细胞活性、细胞数量、纯度和杀伤活性等方面具有显著优势。
通过本发明提供的方法对冻存PBMC进行体外诱导增殖NK细胞，与新鲜血液直接诱导扩增NK细胞无显著性差异。本发明培养得到的NK细胞质量稳定、增殖率高、纯度高、杀瘤活性强。所述方法具有易于操作、质量可控、成本低特点。
应用本发明提供的方法对NK细胞进行体外大规模培养，细胞数量、纯度、杀瘤性均可以满足临床需求，为老年人健康保健和肿瘤患者过继免疫治疗提供了一个切实可行方法。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1人类冻存单个核细胞体外高效扩增NK细胞
采集150mL外周血样，室温下混匀，转移至50mL离心管中，留取2mL外周血做流式。3000rpm/10min，温度20℃，上下加速度调成5/5。离心结束后取出离心管，将血浆转移至另一个50mL离心管，余下血浆56℃灭活(30-40)min，灭活结束，过70um膜，3000rpm/10min离心。用PBS将血液定容到30mL混匀，将血慢慢打到15mL淋巴细胞分离液中，温度室温，转速1600rpm，离心30min，上下加速度分别调为5。
离心结束后小心取出离心管，将离心管白细胞层上方约10cm处液体弃掉。将白细胞层细胞转移至新离心管，用PBS定容到45mL，温度20℃，转速1200rpm，离心5min。离心结束后取出离心管，弃掉上清，将沉淀打散，再次用PBS定容到45mL，混匀，取出200ul进行计数。余下细胞悬液以1200rpm，温度20℃，离心5min。离心结束后取出离心管，弃掉上清，将沉淀打散。配制含有10％二甲基亚砜和自体血浆混合液，按着1×107个/mL密度冻存等量细胞，将冻存终细胞悬液分装到2mL冻存管(-20℃平衡过)中，每管1mL，将冻存管立即放入4℃平衡过的冻存盒中，放于-80℃冰箱内24小时，后放入液氮罐中。将余下血浆直接冻于-20℃。
一个月后，从液氮中取出冻存单个核细胞，于37℃水浴中1min内融化，将融化后细胞悬液迅速转移到40mLNK-EX培养液中，1200rpm/6min离心，离心毕，以1.5×106个/mL密度接种。加入40mL刺激液和5％AB血浆于包被好T75培养瓶中开始刺激细胞，记为D0天。
D3天解除刺激，从细胞培养瓶中取出细胞悬液进行计数，余下细胞悬液转移至50mL离心管中。离心结束后取出离心管，弃掉上清，将沉淀打散，按着1.5×106个/mL密度接种，加入适量扩增培养基和10％AB血浆。转移至新75cm2细胞培养瓶。每隔一天计数补液。
D5天补液。从37℃、5％CO2培养箱中取出培养瓶，然后用移液管混匀，从细胞培养瓶中取出细胞悬液进行台盼蓝染色计数，按着(1-1.5)×106个/mL补加扩增培养基和10％AB血浆。依据补液量更换175cm2细胞培养瓶或1000mL细胞培养袋。
D7天细胞计数补液。从细胞培养瓶中取出200uL细胞悬液计数，按着计数补液。
D9天细胞计数补液。
D11天抽取细胞悬液计数。按着计数结果对其补液。
D13天抽取细胞悬液计数补液。
D14～D20收取细胞。若连续两天抽取细胞悬液进行计数，计数结果不大于10％，则可以收集细胞。将细胞悬液分别加入到4个250mL离心管，然后用移液器混匀细胞悬液，抽取2mL细胞悬液于冻存管中进行流式细胞仪检测和K562杀瘤性检测。再抽取细胞悬液进行计数。余下细胞悬液离心。离心结束后取出离心管，弃掉上清，将沉淀打散，次用PBS定容离心。离心结束后取出离心管，弃掉上清，将沉淀打散，再次用PBS定容离心。离心结束后取出离心管，弃掉上清，将沉淀打散，用生理盐水定容到100mL，离心。离心结束后取出离心管，弃掉上清，将沉淀打散，用生理盐水重悬细胞，过70um细胞筛，将细胞悬液打入到生理盐水中。
实施例2不同血浆类型和浓度对体外NK细胞培养影响
采取周边3名健康人士血液，献血者经临床评估无血液系统疾病和严重自身免疫性疾病。
外周血中单个核细胞提取后液氮保存和复苏后诱导增殖。实验中所有操作均在GMP实验室中完成。
采集150mL外周血样，室温下混匀，转移至50mL离心管中，留取2mL外周血做流式。3000rpm/10min，温度20℃，上下加速度调成5/5。离心结束后取出离心管，将血浆转移至另一个50mL离心管，余下血浆56℃灭活(30-40)min，灭活结束，过70um膜，3000rpm/10min离心。用PBS将血液定容到30mL混匀，将血慢慢打到15mL淋巴细胞分离液中，温度室温，转速1600rpm，离心30min，上下加速度分别调为5。
离心结束后小心取出离心管，将离心管白细胞层上方约10cm处液体弃掉。将白细胞层细胞转移至新离心管，用PBS定容到45mL，温度20℃，转速1200rpm，离心5min。离心结束后取出离心管，弃掉上清，将沉淀打散，再次用PBS定容到45mL，混匀，取出200ul进行计数。余下细胞悬液以1200rpm，温度20℃，离心5min。离心结束后取出离心管，弃掉上清，将沉淀打散。配制含有10％二甲基亚砜和自体血浆混合液，按着1×107个/mL密度冻存等量细胞，将冻存终细胞悬液分装到2mL冻存管(-20℃平衡过)中，每管1mL，将冻存管立即放入4℃平衡过的冻存盒中，放于-80℃冰箱内24小时，后放入液氮罐中。将余下血浆直接冻于-20℃。
一个月后，从液氮中取出3份等量冻存单个核细胞，于37℃水浴中1min内融化，将融化后细胞悬液迅速转移到40mLNK-EX培养液中，1200rpm/6min离心，离心毕，以1.5×106个/mL密度接种。A组加入40mL刺激液和5％自体血浆于包被好T75培养瓶中开始刺激细胞；B组加入40mL刺激液和5％AB血浆于包被好T75培养瓶中开始刺激细胞；C组加入40mL刺激液和5％人血白蛋白于包被好T75培养瓶中开始刺激细胞；记为D0天。
D3天解除刺激，从细胞培养瓶中取出细胞悬液进行计数，余下细胞悬液转移至50mL离心管中。离心结束后取出离心管，弃掉上清，将沉淀打散，按着1.5×106个/mL密度接种，A组加入适量扩增培养基和10％自体血浆；B组加入适量扩增培养基和10％AB血浆；C组加入适量扩增培养基和10％人血白蛋白。转移至新T75细胞培养瓶。每隔一天计数补液。
D5天补液。从37℃、5％CO2培养箱中取出培养瓶，然后用移液管混匀，从细胞培养瓶中取出细胞悬液进行台盼蓝染色计数，按着(1-1.5)×106个/mL补加扩增培养基和10％血浆(A组：自体血浆；B组AB血浆；C组人血白蛋白)。依据补液量更换T175细胞培养瓶或1000mL细胞培养袋。
D7天细胞计数补液
D9天细胞计数补液。
D11天抽取细胞悬液计数。按着计数结果对其补液。
D13天抽取细胞悬液计数补液。
D14～D20收取细胞。若连续两天抽取细胞悬液进行计数，计数结果不大于10％，则可以收集细胞。将细胞悬液分别加入到4个250mL离心管，然后用移液器混匀细胞悬液，抽取2mL细胞悬液于冻存管中进行流式细胞仪检测和K562杀瘤性检测。再抽取细胞悬液进行计数。余下细胞悬液离心。离心结束后取出离心管，弃掉上清，将沉淀打散，次用PBS定容离心。离心结束后取出离心管，弃掉上清，将沉淀打散，再次用PBS定容离心。离心结束后取出离心管，弃掉上清，将沉淀打散，用生理盐水定容到100mL，离心。离心结束后取出离心管，弃掉上清，将沉淀打散，用生理盐水重悬细胞，过70um细胞筛，将细胞悬液打入到生理盐水中。
经3次重复性实验发现，不同血浆类型对冻存单个核细胞诱导增殖成自然杀伤细胞存在影响。研究结果见表1，冻存单个核细胞在体外诱导增殖自然杀伤细胞时使用AB血浆，对细胞增殖率、活性、数量、纯度、杀瘤性上远远高于其它两个血浆类型。其中细胞杀瘤性高达87％、细胞数达到65×108个、细胞比例高达88.18％。所以本发明体外诱导增殖NK细胞的最优血浆类型选择为AB血浆。为了探究AB血浆浓度对体外增殖NK细胞的影响，本发明又验证了不同浓度AB血浆对NK细胞状态、活性、数量、纯度和杀瘤性影响。
表1不同血浆类型对冻存单个核细胞诱导增殖成自然杀伤细胞的影响
实施例3不同浓度AB血浆对NK细胞状态、活性、数量、纯度和杀瘤性影响
采取周边3名健康人士血液，献血者经临床评估无血液系统疾病和严重自身免疫性疾病。
利用密度梯度法从外周血中提取出单个核细胞并冻存于液氮中。一个月后复苏、体外诱导成NK细胞。本发明探究了3组对比实验，方法一，D0天AB血浆浓度为5％，D3解除刺激后，血浆浓度为10％，D5天和D7天血浆浓度为15％，D9天血浆浓度变为10％，D11天后血浆浓度降到(2-3)％。方法二，D0天AB血浆浓度为5％，D3解除刺激后，血浆浓度为10％，D5天和D7天血浆浓度为10％，D9天后血浆浓度为5％，D11天后每次补液血浆加入5mL。方法三，D0天AB血浆浓度为5％，D3解除刺激后，血浆浓度为10％，此后血浆浓度均为10％。
经3次重复性实验发现，不同浓度AB血浆对NK细胞状态、活性、数量、纯度和杀瘤性存在影响。研究结果见表2，由表2可以看出，方法一培养出NK细胞杀瘤性、增殖率、纯度远远高于其它两种方法。其中杀瘤性高达86％，细胞比例高达85.55％。本研究发现可能由于方法三使用血浆比例高，大大促进了免疫细胞生长。结果得出实验中采用方法一进行NK细胞培养不仅可以提高细胞杀瘤性和纯度，还大大降低了实验中AB血浆浓度，节约实验成本，为大规模化生产NK细胞提供了依据。
表2不同浓度AB血浆对NK细胞状态、活性、数量、纯度和杀瘤性影响
前述NK细胞杀瘤活性的检测方法为：
收集对数生长期细胞以K562细胞为靶细胞，调整细胞浓度为1×105个/mL细胞为效应细胞，根据不同的效靶比分别调整细胞浓度为1.5×105个/mL、1×106个/mL。按不同效靶比(1:1、5:1、10:1)将效应细胞和靶细胞混合，同时设相应的靶细胞孔、效应细胞孔和培养基空白对照孔。每组均设3个平行孔。置于37℃、饱和湿度培养箱中培养12小时后，每孔加入10ul cellcounting kit8，混匀，于37℃饱和湿度培养箱中继续培养4小时后用酶标仪测定450nm波长处值。细胞毒杀活性计算方法求出平行孔的平均值，按以下方法计算各组细胞毒杀活性，以杀瘤率％表示。
NK细胞杀瘤活性＝(1-靶细胞孔OD值-效应细胞孔OD值)/靶细胞孔OD值×100％
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种人类冻存单个核细胞高效扩增NK细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将冻存的单个核细胞融化，将融化后细胞悬液迅速转移到NK-EX培养液中，离心，弃上清，将沉淀细胞打散，将细胞接种至包被CD3/CD28T细胞激活剂的培养瓶中，加入刺激液和AB血浆于培养瓶中，使培养体系中的细胞密度达到(1～1.5)×106个/mL、AB血浆的体积浓度达到5％，记为D0天；
(2)D3天解除刺激，将培养瓶中的细胞悬液离心，弃上清，将沉淀细胞打散，将细胞接种至新的包被CD3/CD28T细胞激活剂的培养瓶中，加入扩增培养基和AB血浆于培养瓶中，使培养体系中的细胞密度达到(1～1.5)×106个/mL、AB血浆的体积浓度达到10％；
(3)在D5天和D7天向培养的细胞悬液中补加扩增培养基和AB血浆，使体系中的细胞密度维持在(1～1.5)×106个/mL、AB血浆的体积浓度维持在15％；
(4)在D9天向培养的细胞悬液中补加扩增培养基和AB血浆，使体系中的细胞密度维持在(1～1.5)×106个/mL、AB血浆的体积浓度维持在10％；
(5)在D11天及之后的每隔一天，向培养的细胞悬液中补加扩增培养基和AB血浆，使体系中的细胞密度维持在(1～1.5)×106个/mL、AB血浆的体积浓度维持在2～3％；
(6)在D14天后对细胞悬液进行采样细胞计数，当连续两天的细胞计数结果变化不大于10％时，开始收集细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)配制好培养体系后，将培养瓶先置于39℃、5％CO2的条件下培养20小时，再置于37℃、5％CO2的条件下继续培养。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中的融化具体为将冻存的单个核细胞于37℃水浴中1min内融化。
4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述刺激液为含有26mL/L T细胞扩增添加剂、20mL/L L-谷氨酰胺和500-1000U/mL白细胞介素2的T细胞扩增基础培养基。
5.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述扩增培养基为添加有500-1000U/mL白细胞介素2和10-30ng/mL白细胞介素18的NK-EX培养基。
6.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，D1天及之后，均置于37℃、5％CO2的条件下进行培养。
7.根据权利要求1～6任一项所述的方法，其特征在于，对步骤(6)所得的细胞悬液进行后续处理：将所述细胞悬液离心，弃上清，将沉淀细胞打散，用PBS定容后离心，重复操作一次；用生理盐水定容后再次离心，对沉淀细胞进行分散和生理盐水重悬；过70um细胞筛，将过筛后的细胞悬液打入到生理盐水中。
8.根据权利要求1～7任一项所述的方法，其特征在于，所述冻存的单个核细胞为利用密度梯度离心法从外周血中分离出单个核细胞，并采用10％DMSO和90％自体血浆逐级降温方式冻存单个核细胞。
9.权利要求1～8任一项所述的方法在培养NK细胞中的应用，其特征在于，所述NK细胞由冻存的人类单个核细胞扩增培养得到。
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