一种人类脐带血造血干细胞高效扩增NK细胞的方法
技术领域
本发明涉及细胞生物学领域,具体地说,涉及一种人类脐带血 造血干细胞(Umbilical cord blood hematopoietic stem cells, UCB-HSC)高效扩增自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)的方法。
背景技术
自然杀伤细胞(natural killer cell,NK),是机体内天然免疫第一 道防线,其在外周血中含量仅为10%-20%。它具有高效抗肿瘤、抗 病毒感染和免疫调节功能,在防御机体疾病中发挥着重要作用。自然 杀伤细胞具有不受组织兼容性抗原限制,即杀伤活性无MHC限制。 细胞具有广谱杀毒性,且不需要抗原递呈细胞启动即可直接进攻癌细 胞。自然杀伤细胞通过直接溶解、释放穿孔素和分泌细胞因子两个方 面进行杀瘤。细胞可以分泌TNF-ɑ、IFN-γ和IL-1细胞因子。这些细 胞因子在调节淋巴细胞发挥免疫功能起着重要作用。科学研究表明, 自然杀伤细胞具有调节免疫功能和神经系统相互作用能力。理论上这种细胞可以成为高效治疗癌症免疫疗法。
人体每天有数十亿细胞死亡和再生,由于外界污染等因素,细胞 复制时产生错误的概率非常高,因此免疫系统对各种错误监控十分重 要。随着年龄增高,免疫力逐渐下降。当年龄25岁时,细胞活力和 数量达到最大值。当年龄25-55之间时,细胞活力和数量处于最优, 当年龄超过55岁时,细胞活性和数量呈现下降趋势。当机体免疫力 低下时,细胞数量和活性随之降低,可能直接或间接导致疾病和肿瘤 发生。
肿瘤生物治疗是继三大传统治疗手段(放射治疗、化学治疗、手 术治疗)之后出现的一种新兴肿瘤治疗模式,在肿瘤治疗中发挥了重 要作用。晚期肿瘤患者各项生理指标均较差,不宜进行手术,放射治 疗、化学治疗会给患者带来较大的不良反应,增加患者痛苦。肿瘤生 物治疗作为常规肿瘤治疗手段的补充,为晚期肿瘤患者提供了更好的 治疗选择。
肿瘤生物治疗是抽取患者体内外周血,运用细胞生物学方法体外 进行增值后回输到患者体内的方法。回输后细胞可以激发,增强机体 自身免疫功能,从而达到治疗肿瘤的目的。但研究发现,有些早期自 体NK细胞输注并没有起到理想的治疗疾病效果,可能是由于NK细 胞通过识别自身抑制性NK细胞受体而出现免疫耐受,因此异源性 NK细胞输注越来越多地尝试作为一个新的免疫治疗受到各界关注, 因此,研究中找到异体高活性免疫细胞,并建立质量稳定、足够数量、 高纯度和杀瘤活性强培养方法成为亟待解决问题。
脐带血(UCB)中富含造血干细胞(HSCs),是除骨髓和外周血 之外的第3种HSCS的重要来源,其来源广泛,操作方便,免疫原 性低,在适宜条件下,HSCs可以在体内和体外分化为自然杀伤(NK) 细胞。所以,在患者自身免疫低下,不适宜提供细胞种子来源的情况下,脐带血来源成为了首选。
目前国内体外培养脐带血来源NK细胞方法主要有以下几种方 法:一种是采用滋养层细胞扩增NK细胞方法,即将单个核细胞与肿 瘤细胞株HFWT混合培养诱导扩增NK细胞,此方法虽然可以大大 增强NK细胞杀瘤性和增值率,但由于在培养过程中引入了肿瘤细胞,虽经过致死剂量的γ-射线照射,如果发生存活的滋养层细胞随细 胞一起进入人体,就会存在安全隐患。另一种采用免疫磁珠对脐带血 中单个核细胞进行细胞分选后再扩增的方法,这种方法分离出的细胞 虽然纯度较高,但大大增加了研究成本,而且因为缺乏成熟的分选后 体外培养工艺,所以很难在体外扩增,无法满足临床回输所需的细胞 数量。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题,本发明的目的是提供一种人类 脐带血造血干细胞高效扩增NK细胞的方法。
为了实现本发明目的,本发明的技术方案如下:
本发明提供了一种人类脐带血中造血干细胞高效扩增NK细胞的 方法,包括如下步骤:
(1)采集新鲜人脐带血80mL置于50mL离心管中,按照脐带 血∶HES=4∶1的比例加入HES,充分混匀,400rpm/5min离心,离 心结束后,将上层白细胞和血浆转移到新离心管中,弃掉红细胞;另 一新离心管中预置15mL淋巴细胞分离液,缓慢加入2倍体积去除红细胞后的脐带血,20℃,1600rpm/30min离心(升5降3)。离心结束后 取出离心管,将血浆转移至另一个50mL离心管,56℃灭活30~60min, 灭活结束,3000rpm/10min离心,过70um膜,备用;将中间单个核细 胞层转移至新50mL离心管,用PBS定容到45mL,1200rpm/8min离心 2次,收集沉淀,得到造血干细胞;将造血干细胞接种至包被CD3/CD28T 细胞激活剂的培养瓶中,加入刺激液和血浆于培养瓶中,使培养体系 中的细胞密度达到2.0×106个/mL、血浆的体积浓度达到5%,记为D0天。
(2)D2天,向培养瓶中补加1mL人血白蛋白为细胞生长提供营 养,经研究发现,此操作可提高所培养细胞的纯度。
(3)D3天解除刺激,将培养瓶中的细胞悬液离心,弃上清,将 沉淀细胞打散,将细胞接种至新的培养瓶中,加入扩增培养基和血浆 于培养瓶中,使培养体系中的细胞密度达到2.0×106个/mL、血浆的体 积浓度达到10%。
(4)在D5天和D7天分别向细胞悬液中补加扩增培养基和血浆, 使培养瓶中的细胞密度达到2.0×106个/mL、血浆的体积浓度维持在 10%。
(5)在D9天向细胞悬液中补加扩增培养基和血浆/人血白蛋白, 使体系中的细胞密度达到2.0×106个/mL、血浆的体积浓度维持在 10%。
(6)在D11天及之后的每隔一天,向培养的细胞悬液中补加扩 增培养基和血浆/人血白蛋白,使体系中的细胞密度达到2.0×106个 /mL、血浆的体积浓度维持在5%。
(7)在D14天后对细胞悬液进行采样细胞计数,当连续两天计 数结果变化不大于10%时,可以进行细胞收集。
期间,可依据补液量选择更换更大规格的细胞培养瓶或细胞培养 袋,可选地,例如T175细胞培养瓶或1000mL细胞培养袋。
进一步地,本发明经试验发现,步骤(1)诱导细胞时的培养温 度对细胞增殖存在影响。经试验探究后,本发明提供一种优选的细 胞诱导条件,即步骤(1)中将培养瓶先置于39℃、5%CO2的条件下 培养18小时,再置于37℃、5%CO2的条件下继续培养。
进一步地,D1天及之后,培养条件均为37℃、5%CO2。
其中,步骤(1)中所述的刺激液为含有26mL/L T细胞扩增添加 剂、20mL/L L-谷氨酰胺和100U/mLOK-432的T细胞扩增基础培养 基。所述T细胞扩增基础培养基为市售可得商品,例如,可购自STL 公司。
本发明所述的HES为羟乙基淀粉,市售可得;所述淋巴细胞分离 液市售可得;所述血浆为自体血浆。
本发明所述的包被CD3/CD28T细胞激活剂的培养瓶为:用PBS稀 释CD3/CD28T细胞激活剂,包被T75培养瓶,CD3/CD28T细胞激活剂 浓度为15-25μg/mL(优选为20μg/mL),4℃过夜,吸弃培养瓶中 PBS,4℃冰箱放置3个月可用。所述培养瓶优选为T75培养瓶。进一 步地,所述CD3/CD28T细胞激活剂为市售可得商品,例如, STEMCELL公司。
作为优选,本发明所述的扩增培养基的配制为:在EALI 515-NK 培养基中添加IL-2浓度700U/mL、IL-15浓度25ng/mL、COA(辅酶A) 浓度100单位/L和ATP浓度2mg/L。
其中,所涉及到的EALI 515-NK培养基为市售可得商品,例如, CSI公司。
进一步优选,在步骤(3)及其以后,补加扩增培养基和血浆的 同时,还补加人血白蛋白,使其体积浓度维持为15mL/L。该操作可 以保持NK细胞比例不会有较大改变。
进一步地,在实际收集细胞时,还需对步骤(7)所述的细胞悬 液进行收集,具体步骤为:将上述细胞悬液1200rpm/6min离心,离 心结束后弃上清,将沉淀细胞打散,用PBS定容后1200rpm/6min离 心洗细胞,重复操作一次;用生理盐水定容后再次1200rpm/6min离心,离心结束后,沉淀细胞用生理盐水重悬。过70um滤膜,将过滤 后的细胞悬液打入到生理盐水中,待用。
本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品,涉及到的操作如 无特殊说明均为本领域常规操作。
在符合本领域常识的基础上,上述各优选条件,可以相互组合, 得到具体实施方式。
本发明的有益效果在于:
本发明建立了人类脐带血中造血干细胞高效扩增NK细胞制备 方法。并通过采用不同培养基类型和血浆浓度对脐带血中NK细胞进 行培养,筛选出了最佳的培养基种类和最佳的血浆浓度培养方案,通 过本发明研究方法使体外扩增得到的NK细胞在细胞活性、细胞数 量、纯度和杀伤活性等方面具有显著优势。
本发明培养得到的NK细胞质量稳定、增殖率高、纯度高、杀瘤 活性强。所述方法具有易于操作、质量可控、成本低特点。
应用本发明提供的制备方法对脐带血中NK细胞进行体外大规 模培养,细胞数量、纯度、杀瘤性均可以满足临床需求,为肿瘤患者 和亚健康患者过继免疫治疗提供了异体回输切实可行方法。
本发明利用从脐带血中富集到的CD34+HSCs进行体外培养,加 入相应细胞因子诱导其分化为NK细胞,并对诱导分化的NK细胞 免疫表型及杀伤功能进行检测,为研究不同发育阶段的NK细胞的 相应功能及其临床应用提供实验参考。
本发明不仅具有较好的安全性,而且操作简单、质量稳定、技术 成本低廉,适用于大规模培养和肿瘤临床治疗。本发明还确定脐带血 体外诱导增殖NK细胞最优培养基和培养方法,为细胞过继免疫治疗 提供了较优方案。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要 理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的,并不是用于对 本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和 精神的情况下,可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方 法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商 业途径得到。
实施例1不同诱导温度对体外NK细胞扩增影响
(1)采集新鲜人脐带血80mL置于50mL离心管中,按照脐带 血∶HES=4∶1的比例加入HES,充分混匀,400rpm/5min离心,离 心结束后,将上层白细胞和血浆转移到新离心管中,弃掉红细胞;另 一新离心管中预置15mL淋巴细胞分离液,缓慢加入2倍体积去除红细胞后的脐带血,20℃,1600rpm/30min离心(升5降3)。离心结束后 取出离心管,将血浆转移至另一个50mL离心管,56℃灭活30~60min, 灭活结束,3000rpm/10min离心,过70um膜,备用;将中间单个核细 胞层转移至新50mL离心管,用PBS定容到45mL,1200rpm/8min离心 2次,收集沉淀,得到造血干细胞;将造血干细胞接种至包被CD3/CD28T 细胞激活剂的培养瓶中,加入刺激液和血浆于培养瓶中,使培养体系 中的细胞密度达到2.0×106个/mL、血浆的体积浓度达到5%,记为D0天。
(2)D2天用移液管抽取1mL人血白蛋白于培养瓶中。
(3)D3天解除刺激,将培养瓶中的细胞悬液离心,弃上清,将 沉淀细胞打散,将细胞接种至新的包被CD3/CD28T细胞激活剂的培养 瓶中,加入扩增培养基和血浆于培养瓶中,使培养体系中的细胞密度 达到2.0×106个/mL、血浆的体积浓度达到10%;
所述扩增培养基的配制:EALI 515-NK培养基中添加IL-2浓度 700U/mL、IL-15浓度25ng/mL、COA浓度100单位/L和ATP浓度 2mg/L。所涉及到的EALI 515-NK培养基为市售可得商品,例如,可 购自CSI公司。
(4)在D5天和D7天分别向细胞悬液中补加扩增培养基和血浆, 使培养瓶中的细胞密度达到2.0×106个/mL、血浆的体积浓度维持在 10%;
(5)在D9天向细胞悬液中补加扩增培养基和血浆,使体系中的 细胞密度达到2.0×106个/mL、血浆的体积浓度维持在10%;
(6)在D11天及之后的每隔一天,向培养的细胞悬液中补加扩 增培养基和血浆,使体系中的细胞密度达到2.0×106个/mL、血浆的 体积浓度维持在5%;
(7)在D14天后对细胞悬液进行采样计数、流式检测和细胞杀 瘤性测定。当连续两天计数结果变化不大于10%时,可以进行细胞收 集。将各组细胞悬液分别转移到250mL离心桶,然后混匀,抽取2mL 细胞悬液于冻存管中进行计数、流式细胞仪检测和K562杀瘤性检测。 余下细胞悬液1200r/6min离心。离心结束后取出离心管,弃掉上清, 将沉淀打散,再用PBS定容1200r/6min离心。重复清洗细胞一次。 离心结束后取出离心管,弃掉上清,将沉淀打散,用生理盐水定容到 100mL,1200r/6min离心。离心结束后取出离心管,弃掉上清,将沉淀打散,用生理盐水重悬细胞,过70um细胞筛,将细胞悬液打入到 生理盐水中备用。
经3次重复性实验发现,不同诱导温度对脐带血NK细胞纯度存 在影响。研究结果见表1,当D0天进行细胞诱导时,选择39℃、5%CO2 的条件下培养18小时,然后再置于37℃、5%CO2的条件下继续培 养,其细胞纯度、杀瘤性高于细胞培养瓶始终置于37℃、5%CO2的条件下培养。其细胞活性、数量上并无明显差异。其中细胞纯度高达 85.87%、杀瘤性高达85%,这可能是由于39℃、5%CO2的条件下诱 导18小时对细胞进行优选,所以细胞纯度、杀瘤性较高,而其他无 明显差异。所以本发明体外诱导增殖脐带血NK细胞的最优培养条件为将细胞培养瓶先置于39℃、5%CO2的条件下培养18小时,以后 全部置于37℃、5%CO2的条件下继续培养。进一步的,本发明研究 中发现体外增值脐带血NK细胞过程中,不同培养基类型和血浆浓度 对NK细胞状态、活性、数量、纯度和杀瘤性均存在影响。
表1不同诱导温度对体外NK细胞扩增影响
实施例2不同人血白蛋白浓度对体外NK细胞扩增影响
本实施例与实施例1的区别在于,在步骤(3)及以后步骤中, 补加扩增培养基和血浆的同时,还补加人血白蛋白,使其体积浓度维 持为15mL/L。
本研究分别收集D7、D9、D11、D14天细胞悬液进行流式检测, 相比实施例1,本实施例能够保证NK细胞纯度不发生较大改变,结 果见表2。
表2不同人血白蛋白浓度对体外NK细胞扩增影响
对比例1不同培养基类型对体外NK细胞扩增影响
采取12名健康产妇新鲜脐带血,产妇经临床评估无血液系统疾 病和严重自身免疫性疾病。
本对比例与实施例1的区别在于,
使用以下扩增培养基替换实施例1所述的扩增培养基:
扩增培养基A:EALI 515-NK培养基中添加IL-2浓度700U/mL 和IL-15浓度25ng/mL。
扩增培养基B:EALI 515-NK培养基中添加IL-2浓度700U/mL、 IL-15浓度25ng/mL、COA浓度150单位/L和ATP浓度1.5mg/L。
扩增培养基C:EALI 515-NK培养基中添加IL-2浓度700U/mL、 IL-15浓度25ng/mL、COA浓度50单位/L和ATP浓度2.5mg/L。
扩增培养基D:NK-EX培养基中添加IL-2浓度700U/mL、IL-15 浓度25ng/mL、COA浓度100单位/L和ATP浓度2mg/L。
经3次重复性实验发现,不同培养基种类对脐带血NK细胞增殖 成自然杀伤细胞存在影响。研究结果见表3,当D3天解除刺激后, 使用该培养基类型(EALI 515-NK培养基中添加IL-2浓度 700U/mL、IL-15浓度25ng/mL、COA浓度100单位/L和ATP浓度 2mg/L)可以高效扩增脐带血中NK细胞,经过与实施例1的对比可 知,使用本发明所提供扩增培养基高效扩增脐带血中NK细胞时,其 细胞数量、纯度、杀瘤性上远远高于本对比例中的扩增培养基。其中 细胞杀瘤性高达85%、细胞数达到40×108个、细胞比例高达85.87%。 所以本发明体外诱导增殖脐带血NK细胞的最优培养基类型为EALI 515-NK培养基中添加IL-2浓度700U/mL、IL-15浓度25ng/mL、COA 浓度100单位/L和ATP浓度2mg/L。进一步的,本发明研究中发现 体外增值脐带血NK细胞过程中,不同浓度血浆对NK细胞状态、活 性、数量、纯度和杀瘤性存在影响。
表3不同培养基类型对体外NK细胞扩增影响
对比例2不同浓度血浆对NK细胞状态、活性、数量、纯度和杀瘤性 影响
采取9名健康产妇新鲜脐带血,产妇经临床评估无血液系统疾病 和严重自身免疫性疾病。
本对比例与实施例1的区别在于,采用不同浓度血浆对NK细胞 进行扩增,具体如下:
方法一:D3天解除刺激后,血浆浓度为10%,D5天和D7天血 浆浓度为10%,D9天血浆浓度变为10%,D11天后血浆浓度降到5%。
方法二:B组细胞D3天解除刺激后,血浆浓度为20%,D5天和 D7天血浆浓度为20%,D9天血浆浓度为5%,D11天后血浆浓度维持 在5%。
方法三:D3天解除刺激后,血浆浓度为10%,此后血浆浓度均 为10%。
本发明探究了3组对比实验,经3次重复性实验发现,不同浓度 血浆对脐带血NK细胞状态、活性、数量、纯度和杀瘤性存在影响。 研究结果见表4,由表4可以看出,研究中采用方法一培养出NK细 胞的杀瘤性、纯度远远高于其它两种方法。其中杀瘤性高达80%,细 胞比例高达85.37%。本研究得出实验中采用方法一进行脐带血NK 细胞培养可以高效提高细胞杀瘤性和纯度,为异体细胞免疫治疗提供 了理论依据、奠定了实验基础。
表4不同血浆浓度对体外NK细胞扩增影响
前述NK细胞杀瘤活性的检测方法为:
收集对数生长期细胞以K562细胞为靶细胞,调整细胞浓度为 1×105个/mL细胞为效应细胞,根据不同的效靶比分别调整细胞浓度 为1.5×105个/mL、1×106个/mL。按不同效靶比(1:1、5:1、10:1)将 效应细胞和靶细胞混合,同时设相应的靶细胞孔、效应细胞孔和培养 基空白对照孔。每组均设3个平行孔。置于37℃、饱和湿度培养箱 中培养12小时后,每孔加入10ul cellcounting kit8,混匀,于37℃饱 和湿度培养箱中继续培养4小时后用酶标仪测定450nm波长处值。 细胞毒杀活性计算方法求出平行孔的平均值,按以下方法计算各组细 胞毒杀活性,以杀瘤率%表示。
NK细胞杀瘤活性活性=(1-靶细胞孔OD值一效应细胞孔OD值) /靶细胞孔OD值×100%
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详 尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本 领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础 上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。