CN101037668A - 淋巴细胞培养液及培养淋巴细胞的方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种淋巴细胞培养液及培养淋巴细胞的方法和应用，该培养液是在完全培养液中加入ATP和辅酶A；所述完全培养液包括基础培养液RPMI－1640、白蛋白、L－谷氨酰胺、葡萄糖、碳酸氢钠和HEPES。该培养方法，具有以下步骤：①制备培养液；②用步骤①制备的培养液悬浮细胞；③激活细胞；④用步骤①制备的培养液洗涤激活后的细胞；⑤收集细胞。采用本发明的培养液培养细胞具有较高扩增倍数和较长传代时间。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种淋巴细胞培养液及培养淋巴细胞的方法和应用。
背景技术
淋巴细胞是一种具有重要用途的免疫活性细胞，通过在癌症患者体内提取淋巴细胞进行体外诱导培养，可以获得大量的具有抗肿瘤细胞能力的活性细胞。
细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cells)，简称CIK细胞。它是自体的外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子共同培养一段时间后获得的一群异质细胞，将这类细胞大量回输后，可提供对肿瘤细胞的杀伤活性，还能使机体免疫能力提高，从而对肿瘤治疗施以双重的作用。由于CIK细胞是活化的自体细胞，安全性好，无明显副作用。目前，CIK细胞被认为是新一代抗肿瘤细胞免疫治疗的首选方案，该细胞在防止肿瘤复发和抑制肿瘤转移方面具有重要的作用。
目前淋巴细胞培养液中的主要能源物质是多种氨基酸、L-谷氨酰胺和葡萄糖。
L-谷氨酰胺作为能源物质之一对细胞的生长具有特殊的作用，能促进各种氨基酸进入细胞膜；它所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶的来源，还是合成一磷酸腺苷、二磷酸腺苷和三磷酸腺苷的原料。细胞需要L-谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，L-谷氨酰胺缺乏可导致细胞生长不良甚至死亡。但过量追加L-谷氨酰胺也会造成代谢废物氨以及一些非必需氨基酸的产生，造成培养基中细胞生长抑制。
葡萄糖作为另一能源物质在代谢过程中有95％的都生产乳酸，因此代谢废物产生多，影响细胞的扩增和传代。而且过多的乳酸也会降低培养液的pH值，增加渗透压。
因此只能根据细胞的生长特性来调整培养液中L-谷氨酰胺和葡萄糖的使用量。这样在细胞培养过程中能量提供就受到了限制。从而大大影响了细胞的扩增和传代。
中国专利CN1245504C公开了一种CIK细胞体外培养方法，该方法所采用的培养液是在RPMI-1640基础培养基中添加10％胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100ug/mL链霉素和50umol/L二巯基乙醇。其能量物质仅仅是谷氨酰胺，因此同样存在不能为细胞培养提供足够的能量，从而影响细胞扩增和传代的问题。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种具有较高扩增倍数，较长传代时间的淋巴细胞培养液。
本发明的目的之二在于提供一种培养淋巴细胞的方法。
本发明的目的之三在于提供这种培养液的应用。
实现本发明第一个目的的技术方案是：一种淋巴细胞培养液，在完全培养液中加入ATP和辅酶A；所述完全培养液包括基础培养液RPMI-1640、白蛋白、L-谷氨酰胺、葡萄糖、碳酸氢钠和HEPES。
各组分的用量如下：
基础培养液RPMI-1640 5～15g/L
白蛋白 5～15wt％
L-谷氨酰胺 0.1～0.5g/L
葡萄糖 1～5g/L
碳酸氢钠 1～5g/L
HEPES 2～10g/L
ATP 6～15mg/L
辅酶A 30～50U/L。
上述用量优选：
基础培养液RPMI-1640 10.4g/L
白蛋白 10wt％
L-谷氨酰胺 0.3g/L
葡萄糖 2g/L
碳酸氢钠 2g/L
HEPES 6g/L
ATP 10mg/L
辅酶A 40U/L。
所述基础培养液RPMI-1640含10mmol/L的HEPES、0.02mmol/L的2-巯基乙醇、100U/ml的IL-2、100U/ml的IL-1和1wt％的丙酮酸钠。
其中，NaHCO3是细胞培养的缓冲剂，与气相中的CO2组成缓冲体系。HEPES(中文名为N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸)是一种非离子缓冲液，用于稳定培养液的pH值。ATP作为能量物质，在分解时放出大量的能量，可以为细胞培养的各个过程都提供充足的能量，改善和提高细胞酶的代谢功能，促进细胞的扩增和传代。辅酶A能够促进三羧酸的循环，为细胞的扩增与传代提供能量。
实现本发明另一目的的技术方案是：一种培养淋巴细胞的方法，具有以下步骤：①制备培养液；②用步骤①制备的培养液悬浮细胞；③激活细胞；④用步骤①制备的培养液洗涤激活后的细胞；⑤收集细胞。
步骤①中制备培养液的方法如下：在双蒸水中分别加入基础培养液RPMI-1640、L-谷氨酰胺、葡萄糖、碳酸氢钠、HEPES，搅拌使之完全溶解，过滤除菌并保存，使用前再加入ATP和辅酶A。
步骤②中的悬浮细胞是指将细胞浓度调整至2.0×106个/L，再接种于细胞培养瓶中。
步骤③中激活细胞的方法如下：第1天加入1.5×106U/L的IFN-γ，放置在37℃、5％的CO2的培养箱中培养，24小时后加入100μg/L的anti-CD3 McAb、5.0×105U/L的IL-2和1.0×105U/L的IL-1，刺激3天。
步骤④的洗涤是指用含有100μg/L的anti-CD3McAb、5.0×105U/L的IL-2和1.0×105U/L的IL-1的培养液进行培养，以后每3天添加该培养液。
步骤⑤中所述的收集细胞是指在细胞数量和细胞毒活性达到预期要求后收集细胞。
实现本发明的第三个目的的技术方案是，本发明的淋巴细胞培养液用于CIK细胞的培养。
本发明的积极效果是：(1)具有较高的扩增倍数，通过实验数据可知，使用本发明的培养液可使细胞的扩增倍数达到520±102倍，这就是由于ATP和辅酶A为细胞培养提供的足够的能量，促进了细胞的扩增。(2)具有较长的传代时间，使用本发明的培养液后，细胞在第14～21天仍然具有较高的增值量。(3)具有较高的特定生物学活性，在加入相同种类相同剂量细胞因子的前提之下，本发明所述培养液所培养的细胞具有较好的细胞表型，在第14～21天时细胞表型达最佳状态，此时细胞具有最高的抗肿瘤活性。(4)本发明的培养液用于CIK细胞的效果要好于用于TIL细胞、LAK细胞以及CD3AK细胞。
具体实施方式
(实施例1)
本实施例的培养液的组分及用量见表1
表1
| 组分 | 用量 |
| 基础培养液RPMI-1640 | 10.4g/L |
| 白蛋白 | 10wt％ |
| L-谷氨酰胺 | 0.3g/L |
| 葡萄糖 | 2g/L |
| 碳酸氢钠 | 2g/L |
| HEPES | 6g/L |
| ATP | 10mg/L |
| 辅酶A | 40U/L |
上述培养液的制备方法如下：在1L双蒸水中分别加入10.4g基础培养液RPMI-1640(一包)、10wt％的白蛋白、0.3g L-谷氨酰胺、2g葡萄糖、2g碳酸氢钠、6gHEPES。同时还可以加入4万U的硫酸庆大霉素以及10mg的氟康唑。搅拌使之完全溶解，经微孔滤膜过滤除菌，并与-20℃保存，使用前再加入10mg的ATP以及40U的辅酶A。
上述一包基础培养液RPMI-1640中含有10mmol/L的HEPES、0.02mmol/L的2-巯基乙醇、100U/ml的IL-2、100U/ml的IL-1和1wt％的丙酮酸钠。
(应用例)
用实施例1制备的培养液培养CIK细胞。
用ficoll密度梯度分离人外周血单个核细胞(PBMC)，用实施例1制备的培养液悬浮细胞，调整细胞浓度至2.0×106个/L接种于细胞培养瓶中，置于5％的CO2培养箱中激活。
激活时，第1天加入1.5×106U/L的IFN-γ，然后放置于37℃、5％的CO2培养箱中培养24h，再加入100μg/L的anti-CD3McAb、5.0×105U/L的IL-2和1.0×105U/L的IL-1，刺激3天。
第4天用上述培养液洗涤激活后的细胞，并添加含有100μg/L的anti-CD3McAb、5.0×105U/L的IL-2和1.0×105U/L的IL-1的培养液进行培养，以后每3天添加该培养液。
1、动态分析CIK细胞表型发现(见表2)：应用本发明的培养液诱导培养CIK细胞，在不同培养时间的CIK细胞CD3 +CD16+56 +双阳性细胞的百分含量大幅度上升，由起初(0.70±0.4)％上升到第14天的(31.6±5.5)％和第21天的(35.8±9.7)％。此外，总CD3 +、CD3 +CD4 +和CD3 +CD8 +细胞比例均较培养前显著升高，其中CD3 +CD8 +细胞增加更为明显，此期CD8 +T细胞和CD4 +T细胞也达到增殖高峰。表型研究也证实：在第14～21天时效应细胞呈高表达平台期，显示此期间CIK细胞具有较强的抗肿瘤能力。
表2 CIK细胞在不同时间的细胞免疫表型(
x±s，％，n＝16)
| 表面抗原 | 第1天 | 第3天 | 第5天 | 第7天 | 第14天 | 第21天 | 第28天 | 第35天 |
| CD3 + | 64.3±12.2 | 51.4±10.1 | 78.1±14.6 | 83.7±15.6 | 89.6±16.3 | 84.9±15.7 | 72.5±13.5 | 65.8±11.9 |
| CD4 + | 45.2±10.0 | 37.7±9.8 | 62.3±11.3 | 67.5±12.1 | 74.7±13.7 | 68.8±11.9 | 53.6±11.2 | 42.2±8.9 |
| CD8 + | 27.6±4.6 | 20.6±3.9 | 18.5±7.8 | 37.8±3.5 | 46.3±10.5 | 56.8±11.5 | 48.5±11.6 | 37.2±9.4 |
| CD3 +CD4 + | 45.1±10.1 | 37.5±9.3 | 61.8±10.5 | 67.0±12.0 | 73.4±12.6 | 74.0±13.0 | 41.1±9.4 | 39.6±8.9 |
| CD3 +CD8 + | 18.8±3.1 | 12.7±2.7 | 15.7±2.9 | 16.2±3.0 | 19.5±3.7 | 24.9±4.4 | 20.5±3.4 | 17.6±2.5 |
| CD3 -CD16+56 + | 20.7±3.5 | 7.49±2.2 | 1.98±0.9 | 1.41±0.5 | 3.45±1.1 | 36.2±8.3 | 41.3±9.7 | 29.1±5.6 |
| CD3 +CD16+56 + | 0.70±0.4 | 0.49±0.2 | 0.36±0.1 | 12.3±2.3 | 31.6±5.5 | 35.8±9.7 | 25.7±4.5 | 22.1±3.9 |
| CD16+56 + | 21.0±4.0 | 8.05±1.8 | 2.33±0.9 | 15.79±2.6 | 34.48±7.4 | 73.0±13.0 | 67.1±12.6 | 50.5±10.2 |
2、在第7、14、21、28和35天时进行细胞毒活性实验，当效应细胞与靶细胞比为10∶1时，CIK细胞对K562细胞和Raji细胞的细胞活毒性(见表3)：应用本发明的培养液研究CIK细胞毒活性发现：第14天时对K562细胞的细胞毒活性达峰值(76.65±16.78)％，第14天时对Raji细胞的细胞毒活性达峰值(75.32±15.61)％。
表3：CIK细胞在不同时间的细胞毒活性(n＝12，％)
| 组别 | 第7天 | 第14天 | 第21天 | 第28天 | 第35天 |
| K562细胞 | 59.11±10.44 | 76.65±16.78 | 70.53±15.12 | 69.66±12.34 | 67.11±11.81 |
| Raji细胞 | 57.32±9.78 | 75.32±15.61 | 71.39±16.13 | 67.37±11.84 | 64.95±10.78 |
3、CIK细胞和TIL细胞在不同时间细胞量的变化(见表4)。
由表4可知，CIK细胞在第14天增殖活性为最高，扩增数量是原来的520±102倍。而TIL细胞在第14天时的扩增数量仅为原来的182±78倍。
表4 CIK细胞和TIL细胞在不同时间细胞增殖量的变化(n＝12，×108/L)
| 组别 | 第0天 | 第7天 | 第14天 | 第21天 | 第28天 | 第35天 |
| CIK细胞 | 0.02 | 4.25±0.73 | 13.15±1.33 | 12.61±1.12* | 11.35±1.02 | 10.32±0.93 |
| TIL细胞 | 0.02 | 1.55±0.32 | 3.68±0.66 | 10.85±1.06 | 12.5±1.28△ | 11.6±1.13 |
注：*与0d、7d、14d、28d和35d比较，P＜0.01；△与0d、7d、14d、21d和35d比较，P＜0.01
4、CIK细胞、CD3AK细胞和LAK细胞对K562的细胞毒活性的比较(见表5)。
由表5可知，LAK细胞在第7天杀伤活性最高，CD3AK细胞在第14天杀伤活性最高，CIK细胞在第14天杀伤活性最高。在峰值期CIK细胞杀伤活性显著高于CD3AK细胞和LAK细胞。
表5 CIK细胞、CD3AK细胞和LAK细胞对K562的细胞毒活性的比较(n＝12，％)
| 组别 | 第7天 | 第14天 | 第21天 | 第28天 | 第35天 |
| CIK细胞 | 59.11±10.44 | 76.65±16.78 | 70.53±15.12 | 69.66±12.34 | 67.11±11.81 |
| CD3AK细胞 | 58.58±13.41 | 70.16±16.64 | 65.48±10.84 | 60.57±17.65 | 50.44±16.41 |
| LAK细胞 | 68.21±14.71 | 56.65±12.64 | 32.36±15.36 | 29.36±10.58 | 26.58±11.12 |
通过对CIK细胞的细胞表型及细胞毒活性分析，证实了应用本发明的培养液培养的CIK细胞具有增殖速度快，杀瘤活性高和抗瘤谱广等特点，并确立了CIK细胞临床应用的最佳时机为CIK诱导培养14～21天。
(实施例2～实施例5)
实施例2～实施例5的培养液的组分和用量见表4
表6
| 组分 | 用量 | |||
| 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例5 | |
| 基础培养液RPMI-1640 | 7g/L | 13g/L | 5g/L | 15g/L |
| 白蛋白 | 7wt％ | 13wt％ | 5wt％ | 15wt％ |
| L-谷氨酰胺 | 0.1g/L | 0.4g/L | 0.2g/L | 0.5g/L |
| 葡萄糖 | 1g/L | 5g/L | 3g/L | 4g/L |
| 碳酸氢钠 | 1g/L | 5g/L | 3g/L | 4g/L |
| HEPES | 2g/L | 8g/L | 5g/L | 10g/L |
| ATP | 8mg/L | 12mg/L | 6mg/L | 15mg/L |
| 辅酶A | 30U/L | 50U/L | 35U/L | 45U/L |
Claims (10)
1、一种淋巴细胞培养液，其特征在于：在完全培养液中加入ATP和辅酶A；所述完全培养液包括基础培养液RPMI-1640、白蛋白、L-谷氨酰胺、葡萄糖、碳酸氢钠和HEPES。
2、根据权利要求1所述的淋巴细胞培养液，其特征在于：各组分的用量如下：
基础培养液RPMI-1640 5～15g/L
白蛋白 5～15wt％
L-谷氨酰胺 0.1～0.5g/L
葡萄糖 1～5g/L
碳酸氢钠 1～5g/L
HEPES 2～10g/L
ATP 6～15mg/L
辅酶A 30～50U/L。
3、根据权利要求2所述的淋巴细胞培养液，其特征在于：各组分的用量如下：
基础培养液RPMI-1640 10.4g/L
白蛋白 10wt％
L-谷氨酰胺 0.3g/L
葡萄糖 2g/L
碳酸氢钠 2g/L
HEPES 6g/L
ATP 10mg/L
辅酶A 40U/L。
4、一种培养淋巴细胞的方法，其特征在于具有以下步骤：
①制备培养液；
②用步骤①制备的培养液悬浮细胞；
③激活细胞；
④用步骤①制备的培养液洗涤激活后的细胞；
⑤收集细胞。
5、根据权利要求4所述的培养淋巴细胞的方法，其特征在于：步骤①中制备培养液的方法如下：在双蒸水中分别加入基础培养液RPMI-1640、L-谷氨酰胺、葡萄糖、碳酸氢钠、HEPES，搅拌使之完全溶解，过滤除菌并保存，使用前再加入ATP和辅酶A。
6、根据权利要求4所述的培养淋巴细胞的方法，其特征在于：步骤②中的悬浮细胞是指将细胞浓度调整至2.0×106个/L，再接种于细胞培养瓶中。
7、根据权利要求4所述的培养淋巴细胞的方法，其特征在于：步骤③中激活细胞的方法如下：第1天加入1.5×106U/L的IFN-γ，放置在37℃、5％的CO2的培养箱中培养，24小时后加入100μg/L的anti-CD3 McAb、5.0×105U/L的IL-2和1.0×105U/L的IL-1，刺激3天。
8、根据权利要求4所述的培养淋巴细胞的方法，其特征在于：步骤④的洗涤是指用含有100μg/L的anti-CD3McAb、5.0×105U/L的IL-2和1.0×105U/L的IL-1的培养液进行培养，以后每3天添加该培养液。
9、根据权利要求4所述的培养淋巴细胞的方法，其特征在于：步骤⑤中所述的收集细胞是指在细胞数量和细胞毒活性达到预期要求后收集细胞。
10、权利要求1至3之一所述的淋巴细胞培养液用于CIK细胞的培养。
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