CN107541490A - 一种增强型cik细胞的培养液及其培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种增强型CIK细胞的培养液及培养方法，所述培养液包括基础培养液和营养物质，其中营养物质由自体血清、人血白蛋白和三磷酸腺苷组成。本发明避免了胎牛血清的应用，减少外源致热源、致敏原污染几率。一方面三磷酸腺苷在水解时，给细胞提供生长能量，另一方面自体血清中含有大量细胞生长需要的营养物质，而且可以提供游离的铁离子，与三磷酸腺苷一起协同调节CIK细胞的增殖效率。而白蛋白可以保持CIK细胞的活性，提高培养细胞的存活率，适合临床治疗应用。本发明方法简单，成本低，具有很强的实用性。
Description
技术领域
本发明涉及细胞免疫治疗领域，具体地说是一种增强型CIK细胞的培养液及其培养方法。
背景技术
细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer，CIK)，是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子(如抗CD3单克隆抗体、IL-2和IFN-γ等)共同培养一段时间后获得的一群异质细胞。由于该种细胞同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子，故又被称为NK细胞样T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点，可用于任何一期的肿瘤患者，是一种广泛应用的肿瘤免疫治疗手段。这种细胞对肿瘤细胞的精确识别杀伤能力很强(不损伤正常的细胞)，尤其对手术后或放化疗后的患者治疗效果显著，能消除残留微小的转移病灶，防止肿瘤细胞扩散和复发，并能提高机体免疫力。CIK细胞能通过体外诱导而得以扩增，常规的CIK制备方法是将分离的外周血单个核细胞(PBMC)用含有IFN-γ的培养液预处理后，再加入CD3mAb(CD3单克隆抗体)、IL-1α和IL-2因子进行刺激诱导，最终获得一定数量的CIK细胞。但最终获得的CIK细胞的增殖倍数和细胞毒活性都不是很理想。同时，所用的培养液主要利用胎牛血清或者小牛血清作为细胞培养的营养物，虽然有足够的供应量、价格便宜，但是有潜在传播传染病的风险，以及由于异种蛋白导致过敏症的发生，给CIK临床治疗埋下安全隐患，并且动物血清并不能很好的支持CIK免疫细胞的生长。
发明内容
本发明的主要目的是针对上述背景技术存在的不足提供一种增强型CIK细胞的培养液及其培养方法，该培养液不含有动物血清，适合于CIK细胞的生长，且该方法培养得到的CIK细胞能保证良好的增殖率，而且细胞毒活性高、杀伤活性高。
本发明是通过如下技术方案实现的：一种增强型CIK细胞的培养液，其特征在于：所述培养液包括基础培养液和营养物质，其中营养物质由自体血清、人血白蛋白和三磷酸腺苷组成。
优选的，所述营养物质中，自体血清占培养液的体积百分数为5-10％，人血白蛋白占培养液的体积百分数为5-10％，三磷酸腺苷的浓度为10-1000U/ml。更优选三磷酸腺苷的浓度为100-500U/ml。
优选的，所述基础培养液为GT-T551无血清培养基。
本发明的另一个目的是通过如下技术方案实现的：一种利用上述培养液的增强型CIK细胞培养方法，其步骤包括：
(1)提取并分离单个核细胞；
(2)将单个核细胞用培养液进行诱导培养，并加入细胞因子得到诱导液，诱导液中细胞密度为(2-8)×106个/ml；
(3)每隔3-5天向诱导液中补充培养液和细胞因子，使诱导液中细胞密度维持在(1-4)×106个/ml；
(4)7-21天后收集CIK细胞。
优选的，所述步骤(2)中按照50-2000U/ml加入细胞因子IFN-γ进行预处理。
更优选的，所述预处理后间隔16-36小时，再向培养液中添加细胞因子CD3mAb、IL-1α和IL-2进行诱导培养，其中CD3mAb的添加量为10-100ng/ml，IL-1α的添加量为50-2000U/ml，IL-2的添加量为100-2000U/ml。
优选的，进行诱导培养时，还添加有细胞因子IL-15，其添加量为100-2000U/ml。
更优选的，所述步骤(3)中，补充的细胞因子为IL-2和IL-15，所述IL-2的添加量为100-2000U/ml，所述IL-15的添加量为100-2000U/ml。
本发明的增强型CIK细胞的培养液及其培养方法在基础培养液的基础上，采用自体血清、人血白蛋白和三磷酸腺苷作为营养物质，避免了胎牛血清的应用，减少外源致热源、致敏原污染几率。一方面三磷酸腺苷在水解时，给细胞提供生长能量，另一方面自体血清中含有大量细胞生长需要的营养物质，而且可以提供游离的铁离子，与三磷酸腺苷一起协同调节CIK细胞的增殖效率。而白蛋白可以保持CIK细胞的活性，提高培养细胞的存活率，适合临床治疗应用。同时，本发明的CIK细胞培养方法除了按照常规培养方法进行之外，还在诱导培养时，以及每隔3-5天均加入了细胞因子IL-15，IL-15与IL-2和培养液协同效应，使本发明方法培养7-21天后得到的CIK细胞中有效细胞含量(即CD3+、CD56+的表达量)是传统CIK细胞的两倍以上，并且杀伤活性较传统CIK提高可达20％。本发明方法简单，成本低，具有很强的实用性。
附图说明
图1为本发明CIK细胞抗体表达的流式细胞检测图；
图2为对照组CIK细胞抗体表达的流式细胞检测图。
具体实施方式
以下通过具体实施例来进一步说明本发明：下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
本实施例的目的是通过与现有技术实施方案的对比，使本领域技术人员充分的了解本发明的技术方案及相应的技术效果，至于本实施例所用到的各种试剂均在市场上能够买到，不同厂家生产的试剂按照本领域常规处理后，不会造成本实施例实验结果的不同。
本实施例中所用的基础培养液为Takara公司生产的GT-T551培养基。
本实施例中所用的IFN-γ为200万U/支，批号20130609，上海凯茂生物医药有限公司；
本实施例中所用的IL-1α为DL-105，北京同立海源生物科技有限公司；
本实施例中所用的IL-2为100万IU/0.9ml/瓶；批号20140420b；
北京四环生物制药有限公司；
本实施例中所用的IL-15为100万IU/支，梅天妮生物科技有限公司；
本实施例中所用的CD3mAb为500ug/瓶，TL-101，货号20140118，北京同立海源生物科技有限公司；
本实施例中所用的人血白蛋白为10g(20％，50ml)/瓶,注册证号S20130030,奥克特珐玛药剂生产有限公司；
本实施例中所用的三磷酸腺苷为100单位/支，批号15140510，湖南恒生制药股份有限公司；
实施例1增强型CIK细胞的培养
(1)利用血细胞分离机采集患者的单个核细胞(PBMC)。同时采集自体血浆约80ml，分装冻存于-80℃冰箱，以备配置培养液用。按照常规方法配置培养液，所述培养液中包括体积百分数为10％的自体血清，体积百分数为8％的人血白蛋白，余量为基础培养液GT-T551无血清培养基，并且加入浓度为10U/ml的三磷酸腺苷。
(2)将单个核细胞用培养液诱导培养并按照50U/ml加入细胞因子IFN-γ进行预处理，得到诱导液，诱导液中细胞密度为2×106个/ml；
(3)预处理后间隔24小时，再添加细胞因子CD3mAb、IL-1α、IL-2和IL-15进行诱导培养，其中CD3mAb的添加量为10ng/ml，IL-1α的添加量为2000U/ml，IL-2的添加量为2000U/ml，IL-15的添加量为2000U/ml。
(4)然后每隔3-5天向诱导液中补充培养液和细胞因子，使诱导液中细胞密度维持在1×106个/ml；补充的细胞因子为IL-2和IL-15，所述IL-2的添加量为2000U/ml，所述IL-15的添加量为2000U/ml的IL-15。
(4)15天后收集CIK细胞，得到增强型CIK细胞1。
实施例2增强型CIK细胞的培养
(1)利用血细胞分离机采集患者的单个核细胞(PBMC)。同时采集自体血浆约80ml，分装冻存于-80℃冰箱，以备配置培养液用。按照常规方法配置培养液，所述培养液中包括体积百分数为5％的自体血清，体积百分数为10％的人血白蛋白，余量为基础培养液GT-T551无血清培养基，并且加入浓度为100U/ml的三磷酸腺苷。
(2)将单个核细胞用培养液诱导培养并按照1000U/ml加入细胞因子IFN-γ进行预处理，得到诱导液，诱导液中细胞密度为5×106个/ml；
(3)预处理后间隔16小时，再添加细胞因子CD3mAb、IL-1α、IL-2和IL-15进行诱导培养，其中CD3mAb的添加量为50ng/ml，IL-1α的添加量为50U/ml，IL-2的添加量为500U/ml，IL-15的添加量为500U/ml。
(4)然后每隔3-5天向诱导液中补充培养液和细胞因子，使诱导液中细胞密度维持在2×106个/ml；补充的细胞因子为IL-2和IL-15，所述IL-2的添加量为500U/ml，所述IL-15的添加量为500U/ml的IL-15。
(4)7天后收集CIK细胞，得到增强型CIK细胞2。
实施例3增强型CIK细胞的培养
(1)利用血细胞分离机采集患者的单个核细胞(PBMC)。同时采集自体血浆约80ml，分装冻存于-80℃冰箱，以备配置培养液用。按照常规方法配置培养液，所述培养液中包括体积百分数为8％的自体血清，体积百分数为5％的人血白蛋白，余量为基础培养液GT-T551无血清培养基，并且加入浓度为1000U/ml的三磷酸腺苷。
(2)将单个核细胞用培养液诱导培养并按照2000U/ml加入细胞因子IFN-γ进行预处理，得到诱导液，诱导液中细胞密度为8×106个/ml；
(3)预处理后间隔36小时，再添加细胞因子CD3mAb、IL-1α、IL-2和IL-15进行诱导培养，其中CD3mAb的添加量为100ng/ml，IL-1α的添加量为500U/ml，IL-2的添加量为100U/ml，IL-15的添加量为100U/ml。
(4)然后每隔3-5天向诱导液中补充培养液和细胞因子，使诱导液中细胞密度维持在4×106个/ml；补充的细胞因子为IL-2和IL-15，所述IL-2的添加量为100U/ml，所述IL-15的添加量为100U/ml的IL-15。
(4)21天后收集CIK细胞，得到增强型CIK细胞3。
实施例4对照组CIK细胞的培养
(1)利用血细胞分离机采集患者的单个核细胞(PBMC)。按照常规方法配置培养液，所述培养液中包括体积百分数为10％的胎牛血清，余量为基础培养液GT-T551无血清培养基。
(2)将单个核细胞用培养液诱导培养并按照2000U/ml加入细胞因子IFN-γ进行预处理，得到诱导液，诱导液中细胞密度为8×106个/ml；
(3)预处理后间隔24小时，再添加细胞因子CD3mAb、IL-1α和IL-2进行诱导培养，其中CD3mAb的添加量为100ng/ml，IL-1α的添加量为500U/ml，IL-2的添加量为100U/ml。
(4)然后每隔3-5天向诱导液中补充培养液和细胞因子，使诱导液中细胞密度维持在4×106个/ml；补充的细胞因子为IL-2，所述IL-2的添加量为100U/ml。
(4)15天后收集CIK细胞，得到对照组CIK细胞4。
实施例5 CIK细胞的表型检测
在培养至第15天的时候分别取本发明实施例1中的增强型CIK细胞和实施例4中的对照组CIK细胞，制成细胞悬液，洗涤后调整细胞浓度为106个/ml，各自分别加入鼠抗人CD3、CD4、CD8、CD56抗体及同型对照IgG1单抗各5uL，在4℃下避光孵育30分钟，经PBS缓冲液洗涤2次后，悬浮细胞在500uL缓冲液PBS中，进行流式细胞检测，检测结果如图1、图2和表1所示。其中，NKT为自然杀伤细胞样T细胞，Th为辅助性T细胞，Ts为杀伤性T细胞。
| 细胞种类 | 表型 | 对照组CIK百分含量 | 增强型CIK百分含量 |
| NKT细胞 | CD3+CD56+ | 23.6％ | 51.0％ |
| Th细胞 | CD3+CD4+ | 7.6％ | 30.8％ |
| Ts细胞 | CD3+CD8+ | 90.1％ | 73.6％ |
表1 CIK细胞的表型对比
由图1、图2和表1可以看出，本发明得到的增强型CIK细胞有效细胞(NKT细胞)在15天时可达到51.0％，从而可以保证CIK细胞具有很强的细胞毒活性。
实施例6 CIK细胞的体外杀伤活性检测
取实施例1-3中得到的增强型CIK细胞作为效应细胞，K562肿瘤细胞株为靶细胞。用MTT方法进行杀伤活性的检测实验，效靶比为10:1和20:1，结果如表2所示。
表2 CIK细胞的体外杀伤活性对比
由表2可以看出，无论效靶比为10:1或者20:1，本发明增强型CIK细胞的杀伤活性均优于对照组CIK细胞，并且在效靶比为20:1时，本发明增强型CIK细胞的杀伤活性较对照组CIK细胞提高近50％。
实施例7 CIK细胞的增殖量检测
按照实施例1与实施例4的培养方法进行CIK细胞的培养，在不同的培养天数时，用细胞计数仪进行细胞数量计数，结果如表3所示。
表3 CIK细胞的增殖量及活率对比
从表3可以看出，按照本发明实施例1的方法进行培养的CIK细胞增殖量在7天和14天时均大于实施例4。
通过实施例5-7可以看出，本发明的增强型CIK细胞培养液不含有动物血清，以及选用三磷酸腺苷为营养物质，可以保证增强型CIK细胞具有更好的增殖量和活率。同时本发明的增强型CIK细胞可以培养得到更多的有效细胞，具有更高的杀伤活力，可以应用于临床，实用性强。
需要说明的是：上述实施例仅列举少数方法，其他方法本领域普通技术人员可以采用实施例中方法可以得到，仅有数据上修改，不一一列举。以上未详细描述的技术内容均按照本领域技术人员已知的常规方法得到。
上述本发明实施例序号仅仅为了描述，不代表实施例的优劣。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种增强型CIK细胞的培养液，其特征在于：所述培养液包括基础培养液和营养物质，其中营养物质由自体血清、人血白蛋白和三磷酸腺苷组成。
2.根据权利要求1所述的增强型CIK细胞的培养液，其特征在于：所述营养物质中，自体血清占培养液的体积百分数为5-10％，人血白蛋白占培养液的体积百分数为5-10％，三磷酸腺苷的浓度为10-1000U/ml。
3.根据权利要求1所述的增强型CIK细胞的培养液，其特征在于：所述基础培养液为GT-T551无血清培养基。
4.一种利用权利要求1-3中任一项所述培养液的增强型CIK细胞培养方法，其步骤包括：
(1)提取并分离单个核细胞；
(2)将单个核细胞用培养液进行诱导培养，并加入细胞因子得到诱导液，诱导液中细胞密度为(2-8)×106个/ml；
(3)每隔3-5天向诱导液中补充培养液和细胞因子，使诱导液中细胞密度维持在(1-4)×106个/ml；
(4)7-21天后收集CIK细胞。
5.根据权利要求4所述的增强型CIK细胞培养方法，其特征在于：所述步骤(2)中按照50-2000U/ml加入细胞因子IFN-γ进行预处理。
6.根据权利要求5所述的增强型CIK细胞培养方法，其特征在于：所述预处理后间隔16-36小时，再向培养液中添加细胞因子CD3mAb、IL-1α和IL-2进行诱导培养，其中CD3mAb的添加量为10-100ng/ml，IL-1α的添加量为50-2000U/ml，IL-2的添加量为100-2000U/ml。
7.根据权利要求4所述的增强型CIK细胞培养方法，其特征在于：进行诱导培养时，还添加有细胞因子IL-15，其添加量为100-2000U/ml。
8.根据权利要求4所述的增强型CIK细胞培养方法，其特征在于：所述步骤(3)中，补充的细胞因子为IL-2和IL-15，所述IL-2的添加量为100-2000U/ml，所述IL-15的添加量为100-2000U/ml。
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| CN105602898A (zh) * | 2016-03-31 | 2016-05-25 | 谷超 | 一种能高效扩增人淋巴细胞的无动物源性培养基 |
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