CN106085958A - 一种nk细胞的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种NK细胞的制备方法，该方法利用聚肌胞可诱导免疫细胞的分化、成熟或者分泌细胞因子，如IL‑12、IL‑15、TNFa、IFN‑r等，促进免疫细胞的活化增殖的能力。利用聚肌胞还可以促进膜结合型IL‑15Ra表达的能力，IL‑15Ra可与IL‑15紧密结合，这种结合状态的IL‑15对NK细胞有更强烈的促活化和促增殖的效应，将聚肌胞用于诱导培养NK细胞。本发明诱导培养的NK细胞满足了临床应用对细胞数量和细胞活性的要求。

Description

一种NK细胞的制备方法
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，涉及一种NK细胞的制备方法。
背景技术
自然杀伤细胞(Natural Killer cell,NK)是机体重要的免疫细胞，在机体抗肿瘤、抗病毒等过程中发挥重要作用。NK细胞通过非特异性识别靶细胞，通过分泌颗粒酶、穿孔素、细胞因子等途径杀伤靶细胞。同时NK细胞表达FcγRⅢA，与抗体分子的Fc段结合，通过抗体实现对靶细胞的特异性识别和杀伤。因此，NK细胞在肿瘤或者病毒性疾病的治疗上有很大的应用价值。
直接从体内分离出来的NK细胞往往面临数量上和功能上的不足，需要在体外进行大量的扩增和活化才能回输到体内去，达到治疗的效果。NK细胞的扩增和活化主要是通过以下几个途径实现的：
1、ζ链活化途径。NK细胞虽不表达TCR-CD3复合物，但部分NK细胞表达ζ链。ζ链和NK表面的IgGFc受体FcγRⅢ(CDl6)形成复合体。Ig分子和FcγRⅢ结合时，ζ链胞内段上的ITAM即可发生酪氨酸磷酸化，通过信号转导通路引起胞质内Ca2+浓度和IP3水平升高，促进细胞因子合成和ADCC效应。外周血中的NK细胞几乎均可通过此途径活化。部分NK细胞表达CD2分子，还有可能通过CD2与CD58相互作用可使ζ链发生酪氨酸磷酸化，使NK细胞活化。
2、IL-2R激活途径。NK细胞表面表达IL-2Rβγ链，在IL-2的诱导下，NK细胞开始大量表达IL-2Rα链，βγ链与α链的结合有利于形成高亲和力IL-2受体，从而使NK细胞在IL-2的刺激下进一步发生增殖。在IL 2刺激下NK细胞表达黏附分子，使NK胞质中的颗粒增加并促进丝氨酸酯酶mRNA的表达，从而提高NK细胞的细胞毒活性。
3、IL-18和Il-12激活途径。ILl8和IL12共同作用，通过胞内的ITAM而达到促进NK细胞活化的作用。
4、IL-15激活途径。IL-15与IL-2有相似的结构，对NK细胞的活化和增殖有促进作用。
5、IL-21激活途径。IL21分子结构与IL-15相似，协同IL-15促进NK细胞增殖、分化和细胞毒活性。
6、除了上述外加的细胞因子外，一些Tall样受体(TLR)激动剂如OK432、Poly(i:c)、LPS等作用于树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞或NK细胞本身，诱导这些细胞的分化、成熟或者分泌细胞因子，如IL-12、IL-15、TNFa、IFN-r等，促进NK细胞的活化增殖。Poly(i:c)还可以促进膜结合型IL-15Ra表达，IL-15Ra可与IL-15紧密结合，这种结合状态的IL-15对NK细胞有更强烈的促活化和促增殖的效应。
现有的NK细胞扩增和活化培养体系诱导培养的NK细胞扩增倍数低、存活时间短、活性低，不能满足临床应用。
发明内容
本发明的目的在于针对现有NK细胞扩增和活化培养体系诱导培养的NK细胞扩增倍数低、存活时间短、活性低，不能满足临床应用的问题，提供了一种NK细胞的分离培养方法，该方法利用聚肌胞[Poly(I:C)]可诱导免疫细胞的分化、成熟或者分泌细胞因子，如IL-12、IL-15、TNFa、IFN-r等，促进免疫细胞的活化增殖的能力。利用聚肌胞还可以促进膜结合型IL-15Ra表达的能力，IL-15Ra可与IL-15紧密结合，这种结合状态的IL-15对NK细胞有更强烈的促活化和促增殖的效应，将聚肌胞用于诱导培养NK细胞。利用该方法诱导培养的NK细胞满足了临床应用对细胞数量和细胞活性的要求。
本发明的技术方案是：
步骤一，采集患者外周血，分离并收集外周血单个核细胞并用NK细胞无血清培养基接种于培养瓶中，并加入2％热灭活自体血浆；
步骤二：培养第1天加入0.1-1000μg/ml聚肌胞；培养第2天加入CD16单抗1-200ng/ml、10-5000IU/ml IL-2、0.1-100ng/ml IL-18、0.1-100ng/ml IL-15；第5天根据细胞增殖情况，调整细胞密度，加入2％热灭活自体血浆、10-5000IU/ml IL-2、0.1-100ng/ml IL-18、0.1-100ng/ml IL-15、0.01-100ng/ml IL-12；
步骤三：以后每2-3天补液一次，根据细胞增殖情况，调整细胞密度，加入2％热灭活自体血浆、10-5000IU/ml IL-2、0.1-100ng/ml IL-18、0.1-100ng/ml IL-15、0.01-100ng/ml IL-12；
步骤四：培养至15-20天，回收细胞。
优选的，步骤一至步骤三添加的聚肌胞的浓度为10μg/ml，CD16单抗的浓度为20ng/ml，IL-2的浓度为500IU/ml、IL-18的浓度为10ng/ml、IL-15的浓度为10ng/ml、IL-12的浓度为1ng/ml。
优选的，培养过程中调整细胞密度为1×106/ml。
优选的，利用本发明的技术方案培养的NK细胞用于恶性肿瘤的治疗。
与现有技术相比，本发明具有有益效果为：本发明诱导培养的NK细胞满足了临床应用对细胞数量和细胞活性的要求。
附图说明
图1为实施例1-3与对比例1-3NK细胞第5-20天的增殖曲线的结果；
图2为实施例1-3与对比例1-3得到的NK细胞杀瘤实验的结果；
图3为实施例1-3与对比例1-3得到的NK细胞比例的结果；
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的说明，但本发明并不限于这些具体实施方式。
实施例1
步骤一：用ficoll淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(PBMC)，收集分离液上层血浆，56℃灭活30分钟，离心后取上清得到热灭活自体血浆；中间层单个核细胞用生理盐水洗2次后得到外周血单个核细胞(PBMC)。取PBMC用NK细胞无血清培养基(购自英普乐孚生物技术(上海)有限公司)调整细胞浓度为2×106/ml，加入2％热灭活自体血浆，接种到培养瓶中培养。
步骤二：
培养第1天加入10μg/ml Poly(I:C)(Sigmaaldrich，P9582-50MG)；
培养第2天加入20ng/ml CD16单抗(ebioscience,16-0167-85)、500IU/ml IL-2、10ng/mlIL-18(R&D systems,B001-5)、10ng/ml IL-15(R&D systems，247-ILB-025)；
培养第5天根据细胞增殖情况，用含2％自体血浆NK细胞无血清培养基调整细胞密度为1×106/ml，加入500IU/ml IL-2、10ng/mlIL-18、10ng/ml IL-15；1ng/ml IL-12(R&Dsystems,219-IL-025)
步骤三：每2-3天补液一次，根据细胞增殖情况，用含2％自体血浆NK细胞无血清培养基调整细胞密度为1×106/ml，加入500IU/ml IL-2、10ng/mlIL-18、10ng/ml IL-15、1ng/ml IL-12；
步骤四：细胞培养至15-20天，收集细胞，生理盐水洗2次，用于回输患者体内或者冻存。
实施例2～3
NK细胞诱导培养的操作过程同实施例1的，不同之处在于：Poly(I:C)、CD16单抗、IL-2、IL-18、IL-15、IL-12的浓度不同。
实施例2：Poly(I:C)的浓度为0.1μg/ml、CD16单抗的浓度为1.0ng/ml、IL-2的浓度为10IU/ml、IL-18的浓度为0.1ng/ml、IL-15的浓度为0.1ng/ml、IL-12的浓度为0.01ng/ml。
实施例3：Poly(I:C)的浓度为1000μg/ml、CD16单抗的浓度为200ng/ml、IL-2的浓度为5000IU/ml、IL-18的浓度为100ng/ml、IL-15的浓度为100ng/ml、IL-12的浓度为100ng/ml。
对比例1
步骤一：用ficoll淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(PBMC)，收集分离液上层血浆，56℃灭活30分钟，离心后取上清得到热灭活自体血浆；中间层单个核细胞用生理盐水洗2次后得到外周血单个核细胞(PBMC)。取PBMC用NK细胞无血清培养基(购自英普乐孚生物技术(上海)有限公司)调整细胞浓度为2×106/ml，加入2％热灭活自体血浆，接种到培养瓶中培养。
步骤二：
培养第1天加入20ng/ml CD16单抗(ebioscience,16-0167-85)、500IU/ml IL-2、10ng/mlIL-18(R&D systems,B001-5)、10ng/ml IL-15(R&D systems，247-ILB-025)；
培养第5天根据细胞增殖情况，用含2％自体血浆NK细胞无血清培养基调整细胞密度为1×106/ml，加入500IU/ml IL-2、10ng/mlIL-18、10ng/ml IL-15；1ng/ml IL-12(R&Dsystems,219-IL-025)
步骤三：每2-3天补液一次，根据细胞增殖情况，用含2％自体血浆NK细胞无血清培养基调整细胞密度为1×106/ml，加入500IU/ml IL-2、10ng/mlIL-18、10ng/ml IL-15、1ng/ml IL-12；
步骤四：细胞培养至15-20天，收集细胞，生理盐水洗2次，用于回输患者体内或者冻存。
对比例2
按照专利一种外周血NK细胞的体外诱导扩增培养方法，专利号：201610242598.4公开的培养方法培养NK细胞。
对比例3
按照专利US30030068306A1公开的培养方法培养NK细胞。
增殖实验
分别对实施例1-3和对比例1-3培养第5天、10天、15天、20天的细胞采样计数，绘制细胞增殖曲线，结果见图1。
结论：本发明实施例1的NK细胞培养方法诱导的NK细胞增殖倍数比对比例更高，增殖速度更快。
杀瘤对比实验
将上述细胞增殖实验中培养第15天的淋巴细胞作为效应细胞，以K562细胞为靶细胞。
首先配制效应细胞溶液：取培养至15天的NK细胞，用含2％FBS的RPMI1640培养基洗2次，用含2％FBS的RPMI 1640培养基配成1x106/ml细胞悬液。靶细胞K562细胞用2％FBS的RPMI 1640培养基洗一次，用含2％FBS的RPMI1640培养基配成1x105/ml细胞悬液。按效靶比10:1接种到96孔板内，同时设置效应细胞孔和靶细胞孔，按每种培养基3个复孔，37度5％CO2培养24小时。用MTT法测吸光度值，计算杀瘤率。结果见图2
杀瘤率％＝1-(试验孔-效应细胞孔)/靶细胞孔。
结论：本发明实施例1培养的NK细胞杀伤活性高于对比例各组。
流式表型对比
取实施例1-3，对比例1-3培养至第20天的细胞，每个实施例的细胞分成3管，每管细胞数1×106。按NK细胞检测试剂盒操作(BD bioscience，货号340300)用PBS溶液洗2次。加入300ulPBS溶液重悬细胞，第一管作为空白对照，另外两管按说明书分别加入流式荧光抗体。避光4度孵育20分钟。孵育完后，每管加入1mlPBS溶液，1500转离心5分钟，去上清，重复清洗一次。加入500ulPBS溶液重悬细胞，上机分析，得到NK细胞百分比，结果见图3。
结论：本发明实施例1所培养的细胞NK细胞比例高于对比例各组。
应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种NK细胞的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：
步骤一，采集患者外周血，分离并收集外周血单个核细胞并用NK细胞无血清培养基接种于培养瓶中，并加入2％热灭活自体血浆；
步骤二：
培养第1天加入聚肌胞；
培养第2天加入CD16单抗、IL-2、IL-18、IL-15；
第5天根据细胞增殖情况，调整细胞密度，加入IL-2、IL-18、IL-15、IL-12和2％热灭活自体血浆；
步骤三：以后每2-3天补液一次，根据细胞增殖情况，调整细胞密度，IL-2、IL-18、IL-15、IL-12和2％热灭活自体血浆；
步骤四：培养至15-20天，回收细胞。
2.如权利要求1所述的一种NK细胞的制备方法，其特征在于，培养过程中添加的聚肌胞的浓度为0.1-1000μg/ml，CD16单抗的浓度为1-200ng/ml，IL-2的浓度为10-5000IU/ml、IL-18的浓度为0.1-100ng/ml、IL-15的浓度为0.1-100ng/ml、IL-12的浓度为0.01-100ng/ml。
3.如权利要求2所述的一种NK细胞的制备方法，其特征在于，培养过程中调整细胞密度为1×106/ml。
4.如权利要求3所述的一种NK细胞的制备方法，其特征在于，利用本发明的技术方案培养的NK细胞用于恶性肿瘤的治疗。
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