CN105154398A

CN105154398A - Cik及其制备方法

Info

Publication number: CN105154398A
Application number: CN201510425461.8A
Authority: CN
Inventors: 曾宪卓; 成杰
Original assignee: ISTEM REGENERATIVE MEDICINE SCI-TECH Co Ltd
Current assignee: ISTEM REGENERATIVE MEDICINE SCI-TECH Co Ltd
Priority date: 2015-07-17
Filing date: 2015-07-17
Publication date: 2015-12-16

Abstract

本发明提供一种CIK制备方法及由该方法制备的CIK，方法包括：获取单个核细胞，并用400～600U/mL的r-干扰素进行初次诱导培养后、继续第二次诱导培养和第三次诱导培养；其中，第二次诱导培养于200～300U/mL的r-干扰素、90～110ng/mL的CD3单抗、90～110ng/mL的CD28单抗、8～12ng/mL的IL-1a和450～550U/mL的IL-2条件进行；第三次诱导培养于40～60U/mL的r-干扰素、15～25ng/mL的CD3单抗、15～25ng/mL的CD28单抗、3.2～4.8ng/mL的IL-1a、450～550U/mL的IL-2和450～550U/mL的IL-15条件进行。本发明用不同条件进行分步诱导，使细胞性状稳定，从而最终收获到增值倍数较高的性状多样稳定的CIK细胞。

Description

CIK及其制备方法

技术领域

本发明属于细胞免疫技术领域，具体涉及一种CIK及其制备方法。

背景技术

过继免疫是将自身或异体的抗肿瘤效应细胞的前体细胞，在体外采用IL-2、抗CD3单抗，特异性多肽等激活剂进行诱导、激活和扩增后，再转输给肿瘤患者，从而提高患者抗肿瘤免疫力，以达到治疗的目的。目前在临床中使用最多的过继细胞免疫治疗主要是DC(dendriticcell，树突状细胞)治疗、CIK(Cytokine-InducedKiller，细胞因子诱导的杀伤细胞)治疗。其中，CIK是人外周血中单个核细胞在体外经多种细胞因子刺激后获得的一群异质细胞，它具有增殖能力强、杀瘤活性高和杀瘤谱广、临床应用不良反应小的特点，是肿瘤过继免疫治疗中更为有效的杀瘤效应细胞。

目前，对于CIK制备的方法都是采用多种细胞因子(IFN-α、IL-1α、IL-2和抗人CD3单克隆抗体)在体外联合诱导，较为经典和成熟的步骤可以参见CN102827808A号专利的描述和记载。其培养的过程中，首先按照常规方法将T淋巴细胞制备成CIK细胞，当细胞扩增至能满足临床治疗的细胞量时，加入IFN-α继续培养，既可以保证CIK细胞的数量，又可以提高其杀伤活性，MTT法检测表明利用CN102827808A号专利的方法培养的细胞较不加IFN-α培养的细胞对肿瘤细胞的杀伤性能高50％～1000％。经过对100多例临床恶性肿瘤患者治疗，有效率(PR+CR+MR+SD)达到76％，其中PR+CR+MR达50％，提升了CIK的能效。

但是上述通常采用的经典培养方法，其在实施过程中，诱导的时机是当细胞扩增至能满足临床治疗的细胞量时进行，已经得到的CIK细胞自身的形状和表面形态已经较为稳定，加入IFN-α继续培养提高其杀伤活性时，自身表面的结合簇的捕获能力并未增强，进行CD3CD56表型检测双阳性细胞比例约15％；由于其培养得到的CIK的产量本身是基于已经将细胞扩增至能满足临床治疗的细胞量，之后诱导过程继续扩增的倍数其实不高，而后续诱导扩增产生的形状变化的细胞才具有最佳的免疫性效果，而后续细胞扩增倍数较低，约100倍不足，高杀伤力的CIK的数量并不很高；而且CIK对于肿瘤细胞的识别捕获能力偏单一，使得过继免疫治疗效果上，仍然无法达到较理想的预期。

发明内容

本发明实施的目的在于克服现有CIK诱导扩增倍数、以及肿瘤识别捕获能力不足影响CIK杀伤力的缺陷，提供一种具有多种肿瘤捕获能力、且有效增殖倍数更多的CIK及其制备方法。

为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：

一种CIK制备方法，包括如下步骤：

获取单个核细胞；

将所述单个核细胞用400～600U/mL的r-干扰素进行初次诱导培养；

将所述初次诱导培养后的细胞进行第二次诱导培养；其中，该第二次诱导培养于200～300U/mL的r-干扰素、90～110ng/mL的CD3单抗、90～110ng/mL的CD28单抗、8～12ng/mL的IL-1a和450～550U/mL的IL-2条件下进行；

将所述第二次诱导培养后的细胞进行第三次诱导培养；其中，该第三次诱导培养于40～60U/mL的r-干扰素、15～25ng/mL的CD3单抗、15～25ng/mL的CD28单抗、3.2～4.8ng/mL的IL-1a、450～550U/mL的IL-2和450～550U/mL的IL-15条件下进行。

本发明还提出一种由上述方法制备得到的CIK。

本发明的上述制备方法，采用将单个核细胞在不同的细胞性状阶段，用不同程度的细胞因子进行性状的改变；在逐步诱导培养的过程中，通过分步诱导，逐步改变其形状；而且在分步诱导的过程中逐步降低诱导形状改变的细胞因子(r-干扰素、CD3单抗、CD28单抗、IL-1a等)浓度以逐渐减缓和消除对其生长增殖倍数的抑制；并且逐渐的增加促进性状成熟和稳定的细胞因子的浓度(如IL-2)，使其细胞性状稳定，从而最终收获到增值倍数较高的性状多样稳定的CIK细胞。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实例提出一种用单个核细胞培养制备CIK的方法，包括如下步骤：

S10，获取单个核细胞；

S20，将单个核细胞用400～600U/mL的r-干扰素进行初次诱导培养；

S30，将初次诱导培养后的细胞进行第二次诱导培养；其中，该第二次诱导培养过程于200～300U/mL的r-干扰素、90～110ng/mL的CD3单抗、90～110ng/mL的CD28单抗、8～12ng/mL的IL-1a、450～550U/mL的IL-2条件下进行；

S40，将第二次诱导培养后的细胞进行第三次诱导培养；其中，该第三次诱导培养过程于40～60U/mL的r-干扰素、15～25ng/mL的CD3单抗、15～25ng/mL的CD28单抗、3.2～4.8ng/mL的IL-1a、450～550U/mL的IL-2、450～550U/mL的IL-15条件下进行；

S50，继续培养至细胞成熟，收获CIK。

在本发明的上述实施过程中，步骤S20中先采用400～600U/mL的r-干扰素进行初次诱导，是属于Ⅱ型干扰素类型，进行免疫调节与Ⅰ型干扰素不同；r-干扰素一方面可以增强细胞表面膜的敏感度和通透强度，利于后续对其他细胞因子的诱导功效发挥；而且r-干扰素还与CIK的细胞毒活性密切相关，用r-干扰素对单个核细胞进行第一阶段诱导，可以降低后续IL-2的用量。

进一步，步骤S30将第一次诱导之后的细胞改变诱导条件和环境持续诱导，而条件改变中首先降低r-干扰素的浓度，因为r-干扰素本身的本质仍然是由多种细胞产生的具有广泛的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的可溶性糖蛋白，抑制肿瘤的机理在于抑制细胞的DNA合成，减慢细胞的有丝分裂速度，这一作用效果对于细胞的扩增也是有影响的。所以在作用已经初步达到之后，在该步骤中本发明逐步削弱这一方面的负面效果，增加细胞的诱导过程中的增殖倍数，所以降低r-干扰素至200～300U/mL。同时添加其他细胞因子CD3单抗、CD28单抗、IL-1a、和IL-2，整体对CIK的形成进行全面诱导。其中，

经过各项研究表明，CD3激发型单抗与T细胞表面CD3分子特异性结合后，可引起CD3分子胞浆区ITAM基序中酪氨酸的磷酸化，进而导致T细胞增殖和活化的下游信号的激活，从而使T细胞增殖和活化。所以，CD3激发型单抗能够模拟抗原与TCR/CD3复合物的识别和激活过程，从而引起T细胞的增殖与活化，是CIK细胞培养中不可或缺的刺激因素；基于此本发明也采用细胞因子之中添加该CD3单抗进行。进一步，相比技术人员单独用CD28单抗作为细胞因子诱导CIK的扩增能力的用法，本发明的立意在于，采用CD3单抗替代CD28单抗的增殖活化诱导，而更大化地利用CD28单抗上调活化细胞膜表型分子表达的辅助功效，更大化地促进表型的多样化生成，使其具有更多的表型特征，从而提升CIK的肿瘤识别和捕获能力。

同时，步骤S30全面诱导的细胞因子中还添加IL-1a(白细胞介素-1a)和IL-2，这两种白细胞介素是比较公认的在CIK诱导中分别促进增殖和细胞毒性的；其中，白细胞介素-1(IL-1)主要有激活的单核巨噬细胞产生，可介导外周血单个核细胞上表达IL-2受体，与干扰素、CD3单抗合用时可明显提高CIK细胞的毒效应，但IL-1对CIK细胞的增殖不起作用；同时，IL-2是T淋巴细胞分泌的一种细胞因子，可以显著促进淋巴细胞的生长和增殖，但对淋巴细胞的毒活性没有作用，所以本发明中在该步骤中全面诱导中，也同时添加这两种白细胞介素进行。

在上述步骤S30之后，步骤S40继续对第二次全面诱导之后的细胞进行第三次缓和诱导培养，将步骤S30用于诱导的细胞因子的浓度进一步降低，同时保持CIK增殖和活化的效率，通过450～550U/mLIL-2、450～550U/mLIL-15实现。在已经进行完全诱导之后，基本上已经具有了CIK的早起雏形，但是其形状和程度上并不稳定，因此在该步骤S40中添加并维持浓度的细胞因子IL-2和IL-15主要的功能是利于CIK的诱导之后的增殖倍数。其中，经过上述可知，IL-2可以显著促进细胞的生长和增殖，对淋巴细胞的毒活性没有作用；IL-15本身具有与IL-2相近似的空间结构，也对于CIK的细胞毒性没有增强作用，但是添加IL-15促进增殖，与IL-2诱导CIK增殖又有所不同，因此最终能够促进产生更多的CIK亚型增殖。具有更多的细胞亚型之后，能够具有更多样的表型分化能力，提升CIK的表面识别的多样性，提升捕获能力。

在步骤S40提升和诱导后的增殖亚型和倍数之后，步骤S50继续培养至细胞成熟收获，既能得到符合要求的CIK细胞。在这一过程中，本身成熟的过程基本上是不再继续进行细胞性状诱导了，只是为了促进大量进一步的分化增殖，所以在这一步骤中可以在900～1100U/mL的IL-2下进行；而不继续采用IL-2和IL-15的共同促进导致不断亚型而无法稳定成熟。

当然，本发明以上的CIK成熟的过程采用分级诱导实现，并且逐步改变诱导过程中的目的，而不是一次培养至比较大的细胞基数时再进行全面诱导；整体上更加利于提升CIK的表型分化的能效，以及诱导之后的增殖倍数。

基于上述目的，避免其他的细胞因子或者成分引起额外的性状诱导，所以本发明中上述诱导培养过程中采用的培养基优选为LONZAX-VIVO15淋巴细胞无血清培养基。无血清培养基不会有任何动物源性物质的重组细胞因子在生产过程中，可以避免动物细胞因子的污染及外源蛋白引起的机体异种排斥和过敏反应，导致产生CIK出现其他性状的变化，因此细胞治疗的体外细胞培养过程中最好使用无动物成分的重组细胞因子的上述LONZAX-VIVO15淋巴细胞无血清培养基。

由于CIK诱导培养过程中，细胞性状的产生和变化与诱导时间相关，在分步诱导的各步骤中，需要对诱导的时间控制；其中，

本发明初次诱导培养过程中，诱导培养的时间为20～28h；初次诱导培养中r-干扰素本身能对细胞的细胞膜产生作用，因此最终能增强细胞表面膜的敏感度和通透强度，但是长时间大量浓度的r-干扰素对细胞膜结构作用，很有可能会破坏膜功能完整性；并且r-干扰素抑制肿瘤的机理在于抑制细胞的DNA合成，减慢细胞的有丝分裂速度；长时间处理也可能会降低之后CIK的增殖活性，所以在该步骤中控制诱导之间20～28h即可，不宜过长。

在后续的第二次诱导和第三次诱导的培养中，这两个过程是全面诱导的主要时期，时间上均可以优选控制20～40h；诱导其性状大量改变，同时要保证增殖的效率，时间上都控制20～40h之内即可。

本发明在上述CIK的制备的方法的基础上，还进一步提出采用上述制备方法直接制备获得的CIK，采用该方法制备得到的CIK，细胞体相比其他方法制备的CIK，具有更多的细胞亚型，具有更丰富和完整的表型结构，而且细胞扩增倍数较传统培养方案成倍提高(约200倍)。

为使本发明的上述实施的技术细节和过程方法能更易于本领域技术人员的理解和实施参考，同时凸显出本发明活性诱导制备的CIK的性能和品质，以下通过具体的实施例进行举例说明。

实施例1

S11，取100ml抗凝处理后的血液，将血液分别加入到4个50ml无菌离心管中；

S12，将离心管于300g离心10min后，上层的血浆单独取出用于制备低血小板血浆(用于制备后续的免疫细胞培养液)；

离心之后的下层含血细胞的沉淀物，用注射用生理盐水重悬至每管30ml悬浊混合液；

S13，再取4支含15ml淋巴细胞分离液的50ml离心管，缓慢的将步骤S12的悬浊混合液用移液器转移到淋巴细胞分离液的上层；400g离心20分钟后将中间白膜层吸入到新的50ml离心管中，所得的白膜层即为单个核细胞；

同时，重复3～4次用注射用生理盐水补液到45ml后，300g离心5分钟，对单个核细胞进行清洗，清洗完之后离心搜集单个核细胞的细胞体。

S20，将步骤S13中分离获得的单个核细胞，按1.0×10⁶/mL接种于一个T-75培养瓶，培养瓶中原始添加10mL培养基；其中培养基中添加r-干扰素至浓度为500U/mL；

接种之后培养24h，之后进行下一步诱导。

S30，向步骤S20接种培养之后的T-75培养瓶中添加等量的10mL培养基，并添加CD3单抗、CD28单抗、IL-1a和IL-2，分别至CD3单抗与CD28单抗的浓度为100ng/mL、IL-1a的浓度为10ng/mL、IL-2的浓度为500U/mL；于100ng/mL的CD3单抗和CD28单抗、10ng/mL的IL-1a和500U/mL的IL-2的条件下进行诱导培养28h；

S40，向步骤S30中培养完成后的T-75培养瓶中向培养瓶中添加30mL培养基，并添加IL-2至浓度为500U/mL、添加IL-15为500U/mL后，诱导培养28h。

S50，将步骤S40培养后的含有细胞的悬液转移至2L的培养袋中培养，添加培养基至400mL，并调整IL-2浓度为1000U/mL；以后每隔72小时，补加培养基400mL，调整IL-2浓度为1000U/mL，直至14天CIK成熟后，收获细胞。

收获细胞后，检测增殖倍数和表型：将步骤S50所收获的细胞用经PBS洗涤2遍后，各取1×10⁶/100μl置于falcon管中，分别加入20μl鼠抗人荧光素标记的CD3、CD16、CD56、CD3/CD56及同型对照IgG1/IgG1，4℃避光孵育30min，PBS洗涤2遍后流式细胞仪上机分析。

用台盼蓝染色检测活细胞在87.8％(重复检测5次的平均结果)；并且计算其增值倍数，CIK增殖倍数的平均结果为4～5x10⁷，相比通常的CIK的2～3x10⁷的增殖能力数字结果上提升不大，但是现有培养是将当细胞扩增至能满足临床治疗的细胞量时进行诱导，诱导后的增值倍数相比下来本发明实质上要高出许多。

进一步用流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表达：重复检测5次，结果表明CD3+CD8+CD56+细胞的比例约35～45％，相比经典培养方法的CD3+CD56+为20％偏上的结果，明显表型更多样和丰富。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种CIK制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

获取单个核细胞；

2.如权利要求1所述的CIK制备方法，其特征在于，将所述第二次诱导培养后的细胞进行第三次诱导培养步骤之后，还包括：

继续培养细胞至成熟，收获CIK。

3.如权利要求2所述的CIK制备方法，其特征在于，所述继续培养细胞至成熟步骤中，培养过程于900～1100U/mL的IL-2条件下进行。

4.如权利要求1至3任一项所述的CIK制备方法，其特征在于，所述初次诱导培养采用的培养基为LONZAX-VIVO15淋巴细胞无血清培养基；

和/或，所述第二次诱导培养采用的培养基为LONZAX-VIVO15淋巴细胞无血清培养基；

和/或，所述第三次诱导培养采用的培养基为LONZAX-VIVO15淋巴细胞无血清培养基。

5.如权利要求1至3任一项所述的CIK制备方法，其特征在于，所述初次诱导培养过程中，诱导培养的时间为20～28h。

6.如权利要求1至3任一项所述的CIK制备方法，其特征在于，所述第二次诱导培养过程中，诱导培养的时间为20～40h。

7.如权利要求1至3任一项所述的CIK制备方法，其特征在于，所述第三次诱导培养过程中，诱导培养的时间为20～40h。

8.一种如权利要求1至7任一项所述的CIK制备方法制备的CIK。