CN102676453A - 一种nk和/或nkt细胞的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种培养NK和/或NKT细胞的方法。本发明提供了一种培养NK和/或NKT细胞的方法，包括如下步骤：将离体的NK和/或NKT细胞接种到如下培养体系A中培养，即得到增殖的NK和/或NKT细胞；所述培养体系A由含有抗CD3抗体和/或Retronectin的缓冲液和诱导因子组成。本发明的实验证明，将提取自外周血的PBMC经过磁珠分离富集后，获得高纯度的CD56+细胞，在体外培养体系中加入Retronectin和CD3mAb两种蛋白共同刺激，同时辅以IL-2和IL-15两种因子诱导，建立一个可获得大量具有高杀伤活力的NK和NKT细胞的培养方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种NK和/或NKT细胞的培养方法。
背景技术
NK细胞，是骨髓来源的淋巴细胞，可以识别并杀死病毒感染的细胞或转化的恶性细胞。NK细胞是体内快速反应细胞，能迅速被募集至损伤部位，在体外1小时、体内4小时即可见到杀伤效应。NK细胞的功能是其他免疫细胞无法替代的，其杀伤肿瘤细胞的效应无MHC限制，因此称为自然杀伤活性；而且，NK细胞通过分泌IFN-gamma以及与DC相互作用促进Th1型T细胞活化。体外培养的NK细胞包括CD56弱表达和CD56强表达伴随CD16表达或不表达细胞群。CD56强表达细胞群通过非MHC限制途径杀伤肿瘤细胞；而CD56弱表达且CD16+细胞群则通过CD16-Fc途径直接产生ADCC，且肿瘤相关抗原的刺激能进一步促进ADCC。鉴于NK细胞在抗肿瘤免疫中的重要功能，有必要开发一种有效的体外培养并大量扩增具有肿瘤杀伤活性的NK细胞的方法。
现有的NK细胞体外培养方法尽管已比较成熟，能够培养出对肿瘤细胞杀伤性很高的NK细胞，但增殖数量还不够满意。IL-2、IL-15和IL-7可以通过与NK细胞表面的多聚蛋白体受体的结合而刺激细胞活化、增殖。此外，一些研究还发现这三种细胞因子与NK细胞的分化相关。然而，在培养基中仅添加IL-2、IL-15只能使NK细胞扩增10倍左右，并且通常需要饲养层细胞共同培养，操作复杂，细胞得率低。
RetroNecinn是TAKARA Bio Inc的专利产品，属于重组人纤维连接蛋白片段，它含有人纤维连接蛋白CS-1位点和central cell-binding domain，分子量约为63K，其生理活性为参与细胞的附着、伸展、分化和增殖。RetroNectin的CS-1site及central cell-binding domain可与T细胞表面的VLA结合，从而刺激细胞大量繁殖。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种培养NK和/或NKT细胞的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
将离体的NK和/或NKT细胞接种到如下培养体系A中培养，即得到增殖的NK和/或NKT细胞；
所述培养体系A为如下1)或2)：
1)所示培养体系A由抗CD3抗体、Retronectin、培养基和诱导因子组成；
2)所示培养体系A由抗CD3抗体、培养基和诱导因子组成。
所述抗CD3抗体与所述培养基的配比为5μg∶5ml；
所述Retronectin与所述培养基的配比为25μg∶5ml；
所述诱导因子为IL-2和IL-15；
所述IL-2在所述培养体系A中的浓度为800-1200IU/ml，所述IL-2在所述培养体系A中的浓度具体为1000IU/ml；
所述IL-15在所述培养体系A中的浓度为18ng/ml-22ng/ml，所述IL-15在所述培养体系A中的浓度具体为20ng/ml。
1)所示培养体系A中的所述抗CD3抗体和Retronectin由缓冲液A提供：
每2ml所述缓冲液A按照如下方法制备：将25μg Retronectin、5μg抗CD3抗体和浓度为0.01M、PH值为7.2的PBS缓冲液混合，用所述PBS缓冲液补至2ml；
2)所示培养体系B中的所述抗CD3抗体由缓冲液B提供：
每2ml所述缓冲液B按照如下方法制备：将25μg Retronectin和浓度为0.01M、PH值为7.2的PBS缓冲液混合，用所述PBS缓冲液补至2ml；
所述培养时间为70小时-74小时，所述培养时间具体为72小时，所述培养温度为35℃-38℃，所述培养温度具体为37℃，所述培养所需CO2的浓度为4.5％-5.5％(体积百分含量)，所述培养所需CO2的浓度具体为5％(体积百分含量)。
在所述培养步骤后，还包括如下步骤：
将所述培养得到的细胞移入不含有抗CD3抗体和Retronectin的培养体系B中继续培养，得到增殖的NK和/或NKT细胞；
所述培养体系B和所述培养体系A的区别为不含有抗CD3抗体和Retronectin，其它组分和各组分浓度均相同。
所述缓冲液A、所述缓冲液B和所述诱导因子均为独立包装。
所述培养基为10％(体积百分含量)离体血浆的T503培养基，即为10％(体积百分含量)自体血浆的T503培养基；
所述抗CD3抗体为单抗或者多抗；
所述抗CD3抗体具体为Anti-CD3(单抗)。
所述离体的血浆与所述离体的NK和/或NKT细胞来源于同一物种；
所述物种具体为人或动物；
所述离体的血浆与所述离体的NK和/或NKT细胞来源于同一个体。
本发明的另一个目的是提供一种用于培养NK和/或NKT细胞的培养体系。
本发明提供的用于培养NK和/或NKT细胞的培养体系，所述培养体系A为如下1)或2)：
1)所示培养体系A由抗CD3抗体、Retronectin、培养基和诱导因子组成；
2)所示培养体系A由抗CD3抗体、培养基和诱导因子组成。
所述抗CD3抗体与所述培养基的配比为5μg∶5ml；
所述Retronectin与所述培养基的配比为25μg∶5ml；
所述诱导因子为IL-2和IL-15；
所述IL-2在所述培养体系A中的浓度为800-1200IU/ml，所述IL-2在所述培养体系A中的浓度具体为1000IU/ml；
所述IL-15在所述培养体系A中的浓度为18ng/ml-22ng/ml，所述IL-15在所述培养体系A中的浓度具体为20ng/ml。
1)所示培养体系A中的所述抗CD3抗体和Retronectin由缓冲液A提供：
每2ml所述缓冲液A按照如下方法制备：将25μg Retronectin、5μg抗CD3抗体和浓度为0.01M、PH值为7.2的PBS缓冲液混合，用所述PBS缓冲液补至2ml；
2)所示培养体系B中的所述抗CD3抗体由缓冲液B提供：
每2ml所述缓冲液B按照如下方法制备：将25μg Retronectin和浓度为0.01M、PH值为7.2的PBS缓冲液混合，用所述PBS缓冲液补至2ml；
所述培养基为含10％(体积百分含量)离体血浆的T503培养基；
所述抗CD3抗体为单抗或者多抗；
所述抗CD3抗体具体为Anti-CD3。
所述缓冲液A、所述缓冲液B和所述诱导因子均为独立包装。
所述抗CD3抗体具体为Anti-CD3。Anti-CD3为抗CD3抗体，为单克隆抗体，购自宝日医生物技术(北京)有限公司进口产品，原产地：古巴分子免疫学中心，商品名：爱欧山，进口药品注册证号：S20030084。
所述离体的血浆与所述离体的NK和/或NKT细胞来源于同一物种；
所述物种具体为人或动物；
所述离体的血浆与所述离体的NK和/或NKT细胞来源于同一个体。
本发明的实验证明，本发明的方法中，将RetroNectin引入NK细胞的培养体系，利用NK和NKT细胞同样表达VLA的特点，通过Retronectin的刺激达到细胞大量增殖的效果，CD3mAb可通过与T细胞表面的TCR结合刺激细胞增殖，由于NKT细胞表面也表达TCR分子，因此在培养体系中，还加入了CD3mAb刺激细胞增殖。Retronectin和CD3mAb还可以共同作用激活酪氨酸激酶pp125FAK，通过Ras途径刺激细胞的增殖和分化。因此，将提取自外周血的PBMC经过磁珠分离富集后，获得高纯度的CD56+细胞，在体外培养体系中加入Retronectin和CD3mAb两种蛋白共同刺激，同时辅以IL-2和IL-15两种因子诱导，建立一个可获得大量具有高杀伤活力的NK和NKT细胞的培养方法。
附图说明
图1为磁珠富集前外周血CD3和CD56细胞表型分析
图2为磁珠富集后将用于培养的细胞CD3和CD56表型结果
图3为细胞培养14天的增值倍数
图4为细胞培养14天各组细胞CD3，CD16，CD56表型
图5为细胞培养14天各组细胞中NK、NKT、T细胞的比例
图6为细胞培养14天各组细胞杀伤实验结果
图7为细胞培养14天总细胞的杀伤效率
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、NK细胞的分离和培养
1、蛋白包被：
Retronectin购自宝日医生物技术(北京)有限公司，目录号：T200H；
Anti-CD3为抗CD3抗体，为单克隆抗体，购自宝日医生物技术(北京)有限公司进口产品，原产地：古巴分子免疫学中心，商品名：爱欧山，进口药品注册证号：S20030084；
浓度为0.01M、PH值为7.2的PBS缓冲液按照如下方法配制：将8gNaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4溶于1000ml去离子水中。
每2ml包被液A按照如下方法制备：将25μg Retronectin、5μg Anti-CD3和浓度为0.01M、PH值为7.2的PBS缓冲液，用PBS缓冲液补至2ml；
每2ml包被液B按照如下方法制备：将25μg Retronectin和浓度为0.01M、PH值为7.2的PBS缓冲液，用PBS缓冲液补至2ml。
在培养前一天分别用包被液A和包被液B包被培养瓶，4℃包被过夜(12h)，得到培养瓶1和培养瓶2。
2、PBMCs的分离：
1)注射器预吸入1ml肝素，抽取人外周血30ml，得到离体的人外周血。
2)将离体的人外周血，用水平转子离心，2000rpm，20分钟，得到下层的血细胞和上层的血浆，吸取上层血浆，56℃灭活30min，保存于4℃待用，得到自体血浆。
用等体积浓度为0.01M、PH值为7.2的PBS缓冲液重悬下层的血细胞，得到血细胞悬液。
3)在50ml离心管中预先加入人淋巴细胞分离液(Ficoll)(购自天津血液研究所，TBD200ml)，按照血细胞悬液：Ficoll为2∶1(体积比)的比例将25ml血细胞悬液缓慢加在ficoll上层，保持两种液体之间存在清晰的液面。水平离心，2000rpm，20分钟，吸取中间白色层面的细胞，加入10ml浓度为0.01M、PH值为7.2的PBS中，1200rpm离心10分钟，弃去上清。浓度为0.01M、PH值为7.2的PBS重复洗涤细胞2次，计数，得到3.3×107个PBMCs。
将PBMCs细胞标记CD3和CD56抗体(产品均来自美国贝克曼库尔特公司。CD3即为CD3-ECD目录号：IM2705U，单克隆抗体，克隆号：UCHT1；CD56即为CD56-PECY5目录号：IM2654U，单克隆抗体，克隆号：N901(NHK-1))，4℃避光孵育30min。每管加入4ml PBS，1000RPM离心5min，弃上清，细胞用400μl PBS重悬，上机流式细胞检测，结果如图1所示，CD56+细胞占11.1％。
3.磁珠分选CD56+细胞：
1)将上述获得的PBMC按每107个细胞加入80μl磁珠buffer和20μl标记CD56磁珠(标记CD56磁珠及磁珠buffer购自德国美天旖公司。标记CD56磁珠目录号：130-050-401；磁珠buffer由MACS BSA Stock Solution(目录号：130-0910376)与MACSRinsing Solution(目录号：130-091-222)1∶20混合配得)，4℃孵育15分钟。
2)加入2ml磁珠buffer，1000rpm离心10分钟，弃去上清，调整细胞浓度为2×108/ml。
3)将磁珠吸附柱(磁珠吸附柱购自德国美天旖公司，目录号：130-041-401)置于磁场中，加入1ml磁珠buffer润透吸附柱，缓慢将细胞滴入柱中，加入3ml磁珠buffer洗去未标记CD56磁珠的细胞。
4)吸附柱脱离磁场，加入1ml磁珠buffer，快速推动助推器收集CD56+细胞。
5)经过CD56磁珠阳选后，获得细胞4.6×106个，占总PBMC的13.9％，CD56+细胞计数为1.25×107。
将管中收集的细胞标记CD3和CD56抗体，4℃避光孵育30min。每管加入4ml PBS，1000RPM离心5min，弃上清，细胞用400μl PBS重悬，上机流式细胞检测，结果显示，CD56+的细胞占到了99％，其中NK细胞占21％，NKT细胞占78％(图2)。
4、接种细胞：
1)蛋白包被的培养瓶1和培养瓶2分别用PBS小心冲洗3次。
2)将步骤3获得的CD56+细胞分为三组，
A组细胞：加入未包被的培养瓶3中，加入5ml含10％(体积百分含量)自体血浆的T503培养基(购自宝日医生物技术(北京)有限公司，目录号：GT-T503)，调整细胞浓度为5×105/ml，再加入IL-2(购自北京四环生物制药有限公司，终浓度为1000IU/ml)和IL-15(购自美国Santa Cruz公司，目录号：sc-4607，终浓度为20ng/ml)；
B组细胞：加入蛋白包被的培养瓶2(接受Retronectin单一蛋白刺激)中，加入5ml含10％(体积百分含量)自体血浆的T503培养基，调整细胞浓度为5×105/ml，再加入IL-2(终浓度为1000IU/ml)和IL-15(终浓度为20ng/ml)；
C组细胞：加入蛋白包被的培养瓶1(接受Retronectin和Anti-CD3两种蛋白刺激)中，加入5ml含10％(体积百分含量)自体血浆的T503培养基，调整细胞浓度为5×105/ml，再加入IL-2(终浓度为1000IU/ml)和IL-15(终浓度为20ng/ml)；
以上3组细胞均放入37℃，5％CO2细胞培养箱中。
5、细胞脱瓶
1)将上述3组细胞于刺激72小时后反复冲洗培养瓶底将细胞充分吹散成分散状态，并分别计数；
2)将3组刺激后的细胞均分别移入无蛋白包被培养瓶中继续培养，37℃，5％CO2细胞培养箱中培养，加入含10％(体积百分含量)自体血浆的T503培养基，调整细胞数为2.5×105/ml，再加入IL-2(终浓度为1000IU/ml)和IL-15(终浓度为20ng/ml)；
3)每两天细胞计数并调浓度为2.5×105/ml、补液、补因子。
经过14天的培养，台盼蓝计数法检测A、B和C三组细胞的扩增倍数，结果如图3所示，培养4、6、8、10、12、14天A组细胞扩增倍数分别为1、2.14、2.68、6.43、10.57、17.86；培养4、6、8、10、12、14天B组细胞的扩增倍数分别为1、3.8、17、55、74、97；培养4、6、8、10、12、14天C组细胞的扩增倍数分别为1、3.1、11.9、47.62、190、371.43；A、B、C组经过14天的培养的扩增细胞倍数分别为18倍、97倍和371倍。可以看出，B组细胞由于增加了Retronectin的刺激，增殖效果有了明显的提高。C组细胞在接受两种蛋白刺激后，增殖效果较仅接受Retronectin刺激B组又有了较大的提高。
将经过14天的培养得到的A、B、C三组细胞分别标记CD3、CD16(即为CD16-FITC目录号：6604894，单克隆抗体，克隆号：3G8)和CD56抗体，4℃避光孵育30min。每管加入4ml PBS，1000RPM离心5min，弃上清，细胞用400μl PBS重悬，上机流式细胞检测，结果如图4和图5所示，图4看出，三组细胞培养后绝大多数细胞为NK细胞和NKT细胞。
图5看出，A组细胞的NK细胞、NKT和T细胞(非NK样的T细胞群)比例分别为15.6％、84.8％、0.5％；B组细胞的NK细胞、NKT和T细胞(非NK样的T细胞群)比例分别为27.5％、71.7％、0.6％；C组细胞的NK细胞、NKT和T细胞(非NK样的T细胞群)比例分别为5.4％、89.9％、4.5％；
B组细胞与A组细胞相比，NK细胞比例提高，提示Retronectin蛋白具有刺激NK细胞的增殖的作用。促进增殖的机制可能是Retronectin通过结合NK细胞表面的VLA从而刺激其增殖。C组细胞与B组细胞相比，NKT的比例更高，因为Anti-CD3是通过CD3-TCR复合物起到协同刺激作用的，因此NKT的增殖更为明显。同时，C组细胞相比较于其他两组。CD3表达阳性的细胞比例明显提高，其中还出现了4.5％的非NK样的T细胞群。这部分细胞可能是在利用磁珠进行分选时掺杂进来的T细胞，在接受了CD3mAb的刺激后细胞数量被放大产生的。
将培养14天得到的A、B、C组细胞分别记作NK-A、NK-B、NK-C细胞。
实施例2、NK细胞体外杀伤实验
1、准备工作：
1)提前培养人胰腺癌JF305细胞(可从上海复祥生物科技有限公司购买)和人结肠癌HCT116细胞；
2)配置含5％(体积百分比)FBS的无酚红1640培养基；
2、调整细胞浓度并加入96孔板中：
1)PBS洗涤细胞3次，每次1000rpm离心5分钟，弃去上清。用含5％(体积百分比)FBS的无酚红1640培养基调整肿瘤细胞JF305浓度为2×105/ml；
2)PBS洗涤细胞3次，每次1200rpm离心5分钟，弃去上清。依照效靶比为10∶1，20∶1，40∶1的比例用含5％FBS的无酚红1640培养基调整由实施例1得到的NK-A、NK-B、NK-C细胞浓度均分别为2×106/ml，4×106/ml，8×106/ml；
3)板中加入不同浓度的NK-A、NK-B、NK-C细胞，每孔50ul。
4)在已加入NK-A、NK-B、NK-C细胞的孔中分别加入人胰腺癌JF305，每孔50ul。
5)加入空白背景对照(加入的是5％FBS无酚红1640)每孔50μl。
6)补齐体积，不足100μl的孔补入50μl含5％FBS1640培养基。
肿瘤细胞和NK细胞共孵育4小时。每孔加入20μlMTS标记染色。等待4小时，等颜色有明显梯度差别时酶标仪检测，检测波长为490nm。细胞杀伤率＝(OD混合孔OD效应 细胞)/OD靶细胞×100％，OD为吸光值。
结果如图6所示，在效靶比为10/1，20/1和40/1时，针对JF-305细胞的杀伤率A组细胞(NK-A)为14.6％，29.6％和54.5％；B组细胞(NK-B)为48.5％，55.8％，63.6％；C组细胞(NK-C)为22.9％，47.5％，62.6％。14天的细胞表型显示，B组的NK细胞含量较高，因而产生的杀伤效果较明显；另一方面，C组的NK细胞比例低于B组，而NKT比例较高，但NKT的直接杀伤效果不及NK，因此B组能够产生更明显的效果。以上两个因素使体外4小时的杀伤结果为相同数量效应细胞情况下，B组细胞具有最好的杀伤结果。
比较总杀伤效率(总杀伤效率＝相同细胞时的杀伤效率×扩增倍数)，结果如图7所示，针对JF-305细胞的总杀伤效率A组细胞(NK-A)为14.64％、29.63％、54.47％；B组为48.54％、55.75％、63.6％；B组细胞(NK-B)为14.64％、29.63％、54.47％；B组为48.54％、55.75％、63.6％；C组的总杀伤效率要远远好于其他两组，扩增倍数的优势在这里得到了体现。
采用同样的方法检测对HCT116细胞杀伤力，结果与对JF-305细胞的趋势相同。
Claims (10)
1.一种培养NK和/或NKT细胞的方法，包括如下步骤：
将离体的NK和/或NKT细胞接种到如下培养体系A中，培养，即得到增殖的NK和/或NKT细胞；
所述培养体系A为如下1)或2)：
1)所示培养体系A由抗CD3抗体、Retronectin、培养基和诱导因子组成；
2)所示培养体系A由抗CD3抗体、培养基和诱导因子组成。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述抗CD3抗体与所述培养基的配比为5μg∶5ml；
所述Retronectin与所述培养基的配比为25μg∶5ml；
所述诱导因子为IL-2和IL-15；
所述IL-2在所述培养体系A中的浓度为800-1200IU/ml，所述IL-2在所述培养体系A中的浓度具体为1000IU/ml；
所述IL-15在所述培养体系A中的浓度为18ng/ml-22ng/ml，所述IL-15在所述培养体系A中的浓度具体为20ng/ml。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
1)所示培养体系A中的所述抗CD3抗体和Retronectin由缓冲液A提供：
每2ml所述缓冲液A按照如下方法制备：将25μg Retronectin、5μg抗CD3抗体和浓度为0.01M、PH值为7.2的PBS缓冲液混合，用所述PBS缓冲液补至2ml；
2)所示培养体系B中的所述抗CD3抗体由缓冲液B提供：
每2ml所述缓冲液B按照如下方法制备：将25μg Retronectin和浓度为0.01M、PH值为7.2的PBS缓冲液混合，用所述PBS缓冲液补至2ml；
所述培养时间为70小时-74小时，所述培养时间具体为72小时，所述培养温度为35℃-38℃，所述培养温度具体为37℃，所述培养所需CO2的浓度为4.5％-5.5％(体积百分含量)，所述培养所需CO2的浓度具体为5％(体积百分含量)。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：
在所述培养步骤后，还包括如下步骤：
将所述培养得到的细胞移入不含有抗CD3抗体和Retronectin的培养体系B中继续培养，得到增殖的NK和/或NKT细胞；
所述培养体系B和所述培养体系A的区别为不含有抗CD3抗体和Retronectin，其它组分和各组分浓度均相同。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：
所述缓冲液A、所述缓冲液B和所述诱导因子均为独立包装。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：
所述培养基为含10％(体积百分含量)离体血浆的T503培养基；
所述抗CD3抗体为单抗或者多抗；
所述抗CD3抗体具体为Anti-CD3；
所述离体的血浆与所述离体的NK和/或NKT细胞来源于同一物种；
所述物种具体为人或动物。
7.一种用于培养NK和/或NKT细胞的培养体系，所述培养体系A为如下1)或2)：
1)所示培养体系A由抗CD3抗体、Retronectin、培养基和诱导因子组成；
2)所示培养体系A由抗CD3抗体、培养基和诱导因子组成。
8.根据权利要求7所述的培养体系，其特征在于：
所述抗CD3抗体与所述培养基的配比为5μg∶5ml；
所述Retronectin与所述培养基的配比为25μg∶5ml；
所述诱导因子为IL-2和IL-15；
所述IL-2在所述培养体系A中的浓度为800-1200IU/ml，所述IL-2在所述培养体系A中的浓度具体为1000IU/ml；
所述IL-15在所述培养体系A中的浓度为18ng/ml-22ng/ml，所述IL-15在所述培养体系A中的浓度具体为20ng/ml。
9.根据权利要求7或8所述的培养体系，其特征在于：
1)所示培养体系A中的所述抗CD3抗体和Retronectin由缓冲液A提供：
每2ml所述缓冲液A按照如下方法制备：将25μg Retronectin、5μg抗CD3抗体和浓度为0.01M、PH值为7.2的PBS缓冲液混合，用所述PBS缓冲液补至2ml；
2)所示培养体系B中的所述抗CD3抗体由缓冲液B提供：
每2ml所述缓冲液B按照如下方法制备：将25μg Retronectin和浓度为0.01M、PH值为7.2的PBS缓冲液混合，用所述PBS缓冲液补至2ml；
所述培养基为含10％(体积百分含量)离体血浆的T503培养基；
所述抗CD3抗体为单抗或者多抗；
所述抗CD3抗体具体为Anti-CD3。
10.根据权利要求7-9中任一所述的培养体系，其特征在于：
所述离体的血浆与所述离体的NK和/或NKT细胞来源于同一物种；
所述物种具体为人或动物。
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