CN105418765B - Cd19靶向性的嵌合抗原受体和nkt细胞及其制法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、工程化CD19靶向性的NKT细胞及其应用，所述嵌合抗原受体为CD19ScFv‑CD8‑CD137‑CD3ζ，由CD19ScFv、CD8的铰链区和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域串联构成。采用本发明的嵌合抗原受体CD19ScFv‑CD8‑CD137‑CD3ζ修饰的NKT细胞治疗进展期CD19阳性的急性B淋巴细胞白血病时，对白血病细胞具有很好的特异杀伤活性，且对已经过多次治疗(如放疗、化疗及其他药物对症治疗等)但均无明显疗效的进展期CD19阳性的急性B淋巴细胞白血病患者有一定的治疗效果。

Description

CD19靶向性的嵌合抗原受体和NKT细胞及其制法和应用

技术领域

本发明属于用于肿瘤治疗的生物制品领域，具体地，涉及CD19靶向性的嵌合抗原受体和NKT细胞及其制法和应用。更具体地，涉及过继免疫治疗中的嵌合抗原受体CD19ScFv-CD8-CD137-CD3ζ及其基因和重组表达载体、工程化CD19靶向性的NKT细胞(CAR19-NKT细胞)及其应用。

背景技术

自然杀伤细胞(NKT)是一种特殊类型的T淋巴细胞亚群，具有T细胞和NK细胞细胞两重性质。NKT细胞能表达T细胞的TCR与NK细胞的NKR-P1两种受体，在TCR和NKR介导下，NKT细胞能够产生大量的IL-4及INFγ。。

通常情况下，输注的NKT细胞在患者体内半衰期为2周左右，有效期短暂，需要反复多次输注。另外，NKT细胞本身缺少特异性抗体，不足以在肿瘤周围或者瘤巢中富集，制约了NKT细胞对恶性肿瘤的靶向治疗。

CD19分子是B淋巴细胞表面发挥特异性信号转导的受体，存在于B细胞成熟的各个阶段，在B祖细胞阶段出现并稳定持续地表达。CD19作为B细胞系特异的细胞表面分化抗原，仅表达于前B细胞和成熟B细胞表面，而在造血干细胞、浆细胞和其他正常组织细胞中不表达。而且，CD19分子在膜上比较暴露，容易接近，与单克隆抗体结合后无显著内化及脱落，也不会因为与抗体的结合而发生抗原调变。此外，近期关于癌基因MYC基因如何推动B淋巴细胞恶性肿瘤的发生与发展的研究，发现CD19对稳定Myc蛋白来说是绝对必要的，当Myc基因是稳定的，并处于较高水平时，Myc基因会促使癌症发展，并且，Myc蛋白水平高的患者更可能死于淋巴瘤。CD19可能是控制Myc基因通路上的开关，而控制通断开关可能代表了治疗淋巴细胞肿瘤的有力工具。基于以上现象，故CD19成为治疗CD19阳性的急性B淋巴细胞白血病的一个重要靶点。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术中NKT细胞对肿瘤的杀伤作用比较弱、特异杀伤活性有待提高的缺陷，提供一种嵌合抗原受体CD19ScFv-CD8-CD137-CD3ζ及其基因和重组表达载体、工程化CD19靶向性的NKT细胞(CAR19-NKT细胞)及其应用。

本发明的第一方面，提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体以CD8的绞链区和跨膜区及CD137和CD3ζ的胞内信号结构域串联而成的结构为信号传导结构域。

在另一优选例中，所述嵌合抗原受体为CD19ScFv-CD8-CD137-CD3ζ，由CD19ScFv、CD8的铰链区和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域串联构成。

在另一优选例中，所述嵌合抗原受体的胞外结合区为抗CD19的单链抗体。

在另一优选例中，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在另一优选例中，所述CD8的铰链区和跨膜区选自下组：

(A)具有SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的多肽；

(B)具有与SEQ ID NO:17所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性)的多肽；(C)将SEQ ID NO:17中任一所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽。

在另一优选例中，所述CD137的胞内信号结构域选自下组：

(A)具有SEQ ID NO:18所示氨基酸序列的多肽；

(B)具有与SEQ ID NO:18所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同源性；优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性)，并且能够转导效应子功能信号的多肽；

(C)将SEQ ID NO:18中任一所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽。

在另一优选例中，所述CD3ζ的胞内信号结构域选自下组：

(A)具有SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的多肽；

(B)具有与SEQ ID NO:19所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性)，并且能够转导效应子功能信号的多肽；

(C)将SEQ ID NO:19中任一所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽。

在另一优选例中，所述CAR包括SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述嵌合抗原受体(CAR)还包括抗原结合结构域。

在另一优选例中，所述抗原结合结构域为抗体或其抗原结合片段。

在另一优选例中，所述抗原结合片段为Fab或scFv。

在另一优选例中，所述抗原包括肿瘤抗原。

在另一优选例中，所述肿瘤抗原与血液恶性肿瘤相关。

在另一优选例中，所述肿瘤抗原与实体瘤相关。

在另一优选例中，所述肿瘤抗原选自下组：CD19、CD20、CD30、Her1。

在另一优选例中，所述嵌合抗原受体(CAR)为分离的。

在另一优选例中，所述嵌合抗原受体(CAR)的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示。

本发明的第二方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码本发明第一方面所述的嵌合抗原受体(CAR)。

在另一优选例中，所述核酸分子包含选自下组的编码所述CD8的铰链区和跨膜区的核酸序列：

(a)编码如SEQ ID NO.:17所示多肽的多核苷酸；

(b)序列如SEQ ID NO.:3所示的多核苷酸；

(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.:3所示序列的同源性≥90％(较佳地≥95％)，并且编码SEQ ID NO.:17所示氨基酸序列的多核苷酸；

(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，所述核酸分子包含选自下组的编码所述CD137的胞内信号结构域的核酸序列：

(a)编码如SEQ ID NO.:18所示多肽的多核苷酸；

(b)序列如SEQ ID NO.:4所示的多核苷酸；

(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.:4所示序列的同源性≥90％(较佳地≥95％)，并且编码SEQ ID NO.:18所示氨基酸序列的多核苷酸；

(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，所述核酸分子包含选自下组的编码所述CD3ζ的胞内信号结构域的核酸序列：

(a)编码如SEQ ID NO.:19所示多肽的多核苷酸；

(b)序列如SEQ ID NO.:5所示的多核苷酸；

(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.:5所示序列的同源性≥90％(较佳地≥95％)，并且编码SEQ ID NO.:19所示氨基酸序列的多核苷酸；

(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，所述核酸分子包含选自下组的核酸序列：

(a)编码如SEQ ID NO.:9所示多肽的多核苷酸；

(b)序列如SEQ ID NO.:10所示的多核苷酸；

(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.:10所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)，并且编码SEQ ID NO.:9所示氨基酸序列的多核苷酸；

(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，所述核酸分子为分离的。

在另一优选例中，所述核酸分子还包括编码前导序列(信号肽)的多核苷酸，所述前导序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.:21所示：

在另一优选例中，所述核酸分子的序列如SEQ ID NO.:2所示。

本发明的第三方面，提供了一种载体，所述的载体含有本发明第一方面所述的核酸分子。

在另一优选例中，所述载体为慢病毒载体。

本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞中含有本发明第三方面所述的所述的载体或染色体中整合有外源的本发明第二方面所述的核酸分子。

在另一优选例中，所述细胞为分离的细胞，和/或所述细胞为基因工程化的细胞。

在另一优选例中，所述细胞为哺乳动物细胞。

在另一优选例中，所述细胞为NKT细胞、或T细胞。

在另一优选例中，所述T细胞为NKT细胞。

本发明的第五方面，提供了一种药物组合物，所述组合物含有药学上可接受的载体以及本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、或本发明第四方面所述的细胞。

本发明的第六方面，提供了本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、或本发明第四方面所述的细胞的用途，用于制备治疗肿瘤的药物或制剂。

在另一优选例中，所述的肿瘤包括白血病。

在另一优选例中，所述白血病是指进展期CD19阳性的急性B淋巴细胞白血病。

本发明的第七方面，提供了一种治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用适量的本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、或本发明第四方面所述的细胞、或本发明第五方面所述的药物组合物。

在另一优选例中，所述疾病为肿瘤。

本发明的第八方面，提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体以CD8的hinge区和跨膜区及CD137和CD3ζ的胞内信号结构域串联而成的结构为信号传导结构域，所述信号传导结构域氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。

本发明的第九方面，提供了一种NKT细胞群，所述NKT细胞群中：

CD3⁺CD8⁺NKT细胞/CD3⁺CD4⁺NKT细胞的比率为10/1～4/1(优选为9/1～6/1)；并且CD3⁺CD56⁺NKT细胞/CD3⁺CD8⁺NKT细胞的比率为1/18～10/18(优选为5/18～10/18，如可以为1/8、1/6、1/4、1/3)。

在另一优选例中，所述NKT细胞群中：

CD3⁺细胞比率≥95％；CD3⁺CD8⁺细胞比率≥90.99％；CD3⁺CD56⁺细胞比率≥15％(优选地，≥18％；更优选地≥20％；最优选地≥22％，如≥24％、≥26％、≥28％、≥30％)；CD8⁺CD56⁺细胞比率≥15％(优选地，≥18％；更优选地≥20％；最优选地≥22％，如≥24％、≥26％、≥28％、≥30％)。

在另一优选例中，所述NKT细胞为表达嵌合抗原受体的NKT细胞。

在另一优选例中，所述NKT细胞为本发明第四方面所述的细胞。

本发明的第十方面，提供了一种制备本发明第九方面所述的NKT细胞群的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(a)将单个核细胞(PBMCs)培养于NKT细胞培养基中，所述NKT细胞培养基含有抗CD3单克隆抗体、白介素-2、和白介素-15，进行第一阶段培养。

在另一优选例中，通过所述第一阶段培养，从而分离单个核细胞中原始的NKT细胞并刺激其增殖。

在另一优选例中，所述第一阶段培养所用的细胞培养容器是经RetroNectin包被的。

在另一优选例中，所述抗CD3单克隆抗体的浓度为20ng/ml-80ng/ml(优选为30ng/ml-70ng/ml，更优选为40ng/ml-60ng/ml，最优选为约50ng/ml)；和/或

所述白介素-2的浓度为200U/mL-800U/mL(优选为300U/mL-700U/mL，更优选为400U/mL-600U/mL，最优选为约500U/mL)；和/或

所述白介素-15的浓度为20ng/mL-80ng/mL(优选为30ng/mL-70ng/mL，更优选为40ng/mL-60ng/mL，最优选为约50ng/mL)。

在另一优选例中，所述第一阶段的培养时间为2天-6天；优选为3天-5天；更优选为4天。

在另一优选例中，所述NKT细胞培养基为GT-T551培养基。

在另一优选例中，所述NKT细胞培养基中还包含血清；优选地所述血清为自体血清或胎牛血清；更优地所述血清为自体血清。

在另一优选例中，所述血清含量为0.4％(v/v)-0.8％(v/v)；优选为0.6％(v/v)。

在另一优选例中，所述单个核细胞(PBMCs)来源于哺乳动物，更优选地来源于人。

在另一优选例中，所述方法包括步骤：

(b)将所述第一阶段培养的细胞转移到培养瓶中，加入NKT细胞培养基，进行第二阶段培养，其中，所述NKT细胞培养基中含有白介素-2；优选地，所述白介素-2的浓度为200U/mL-800U/mL(优选为300U/mL-700U/mL，更优选为400U/mL-600U/mL，最优选为约500U/mL)。

在另一优选例中，通过所述第二阶段培养从而实现NKT细胞体外的扩增。

在另一优选例中，用于所述第二阶段培养的培养瓶是未包被的。

在另一优选例中，用于所述第二阶段培养的所述NKT细胞培养基中还包含血清；优选地所述血清为自体血清或胎牛血清；更优地所述血清为自体血清。

在另一优选例中，所述血清含量为0.4％(v/v)-0.8％(v/v)；优选为0.6％(v/v)。

在另一优选例中，所述第二阶段的培养时间为8天-20天；优选为10天-18天；更优选为为12天-16天。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤；

(c)将嵌合抗原受体(CAR)基因整合于所述NKT细胞中，从而制备表达嵌合抗原受体的NKT细胞。

在本发明的一个优选的实施方式中，根据本发明的嵌合抗原受体，为CD19ScFv-CD8-CD137-CD3ζ，由CD19ScFv、CD8的铰链区和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域串联构成。

优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了编码根据本发明的嵌合抗原受体的基因。

优选地，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了含有编码根据本发明的嵌合抗原受体的基因的重组表达载体。

优选地，所述重组表达载体为慢病毒表达载体。

优选地，所述慢病毒表达载体为pWPT-CD19ScFv-CD8-CD137-CD3ζ。

本发明还提供了一种工程化CD19靶向性的NKT细胞，所述NKT细胞是由根据本发明的嵌合抗原受体修饰的NKT细胞。

本发明还提供了所述的工程化CD19靶向性的NKT细胞在制备用于治疗白血病的制剂中的应用。

优选地，所述白血病是指进展期CD19阳性的急性B淋巴细胞白血病。

本发明还提供了一种信号传导结构域序列，所述信号传导结构域由CD8的绞链区和跨膜区及CD137和CD3ζ的胞内信号结构域串联而成，优选地，各结构单元如上所述。

本发明的发明人在研究中意外发现，采用嵌合抗原受体CD19ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的NKT细胞治疗进展期CD19阳性的急性B淋巴细胞白血病时，对白血病细胞具有很好的特异杀伤活性，且对已经过多次治疗(如放疗、化疗及其他药物对症治疗等)但均无明显疗效的进展期CD19阳性的急性B淋巴细胞白血病患者有较好的治疗效果。

因此，为了实现上述目的，本发明提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体为CD19ScFv-CD8-CD137-CD3ζ，由CD19ScFv、CD8的铰链区(hinge区)和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域串联构成。

本发明还提供了编码上述嵌合抗原受体的基因。

本发明还提供了含有上述基因的重组表达载体。

本发明还提供了一种工程化CD19靶向性的NKT细胞，所述NKT细胞是上述嵌合抗原受体CD19ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的NKT细胞。

本发明还提供了上述工程化CD19靶向性的NKT细胞在制备用于治疗白血病的制剂中的应用。

在治疗进展期CD19阳性的急性B淋巴细胞白血病时，本发明的嵌合抗原受体CD19ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的NKT细胞，即工程化CD19靶向性的NKT细胞能够特异性结合CD19抗原，明显延长免疫细胞在患者体内的存活时间，增强免疫细胞靶向识别B淋巴细胞白血病CD19抗原的能力，加强对白血病细胞的特异杀伤活性，而且对已经过多次治疗(如放疗、化疗及其他药物对症治疗等)但均无明显疗效的进展期CD19阳性的急性B淋巴细胞白血病患者有一定的治疗效果。本发明的工程化CD19靶向性的NKT细胞为治疗进展期CD19阳性的急性B淋巴细胞白血病提供了一种新的选择，具有良好的产业应用前景。

本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为流式细胞术对分离培养的NKT细胞表型分析的结果。

图2为本发明的慢病毒表达载体pWPT-CD8-CD137-CD3ζ的限制性内切酶MluI/SalI双酶切片段的电泳鉴定图。

图3为本发明的慢病毒表达载体pWPT-CD19ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的限制性内切酶BamHI/SalI双酶切片段的电泳鉴定图。

图4为本发明的慢病毒表达载体pWPT-CD19ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的结构示意图，其中，逆时针序列为正向基因片度，顺时针为反向基因片段。

图5为流式细胞术检测含有嵌合抗原受体CD19ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的病毒浓缩液对NKT细胞的感染效率。

图6为流式细胞术检测嵌合抗原受体CD19ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的NKT细胞(CAR19-NKT细胞)表型鉴定的结果。

图7为本发明的CAR19-NKT细胞对人B淋巴白血病细胞杀伤作用的细胞毒性分析图。

图8为本发明的CAR19-NKT细胞对进展期CD19阳性的急性B淋巴细胞白血病患者治疗过程中CAR19-NKT细胞的拷贝数变化趋势图。

图9为本发明的CAR19-NKT细胞对进展期CD19阳性的急性B淋巴细胞白血病患者的治疗过程中白细胞总数及原幼细胞的比例变化趋势图。

图10为本发明的CAR19-NKT细胞对进展期CD19阳性的急性B淋巴细胞白血病患者的治疗过程中乳酸脱氢酶的变化趋势图。

图11为采用本发明的CAR19-NKT细胞治疗前后患者外周血中CD19阳性细胞数目的变化趋势图。

图12为采用本发明的CAR19-NKT细胞治疗前(左图)与治疗1月后(右图)的骨髓中CD19阳性细胞数目的变化图。

图13为采用ELISA试剂盒分析细胞分泌白介素2的水平。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

本发明提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体为CD19ScFv-CD8-CD137-CD3ζ，由CD19ScFv、CD8的铰链区和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域串联构成。优选情况下，嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供了编码上述嵌合抗原受体的基因。优选情况下，编码上述嵌合抗原受体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明提供了含有上述基因的重组表达载体。优选情况下，重组表达载体为慢病毒表达载体。对于慢病毒表达载体没有特别的限定，只要能够与辅助载体共转染包装细胞如293T包装细胞，获得病毒浓缩液及嵌合抗原受体CD19ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的NTK细胞即可，优选情况下，慢病毒表达载体为pWPT-CD19ScFv-CD8-CD137-CD3ζ。

对于慢病毒表达载体pWPT-CD19ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的制备方法没有特别的限定，可以为本领域技术人员能够想到的各种方法，优选情况下，慢病毒表达载体pWPT-CD19ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的制备方法包括以下步骤：

(1)从NKT细胞cDNA中分别扩增CD8的hinge区和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域，并克隆至载体pWPT-GFP中，构建得到pWPT-CD8-CD137-CD3ζ；

(2)合成编码大鼠生长激素信号肽和CD19ScFv的核苷酸序列，并克隆至pWPT-CD8-CD137-CD3ζ中，经测序验证后得到序列正确的pWPT-CD19ScFv-CD8-CD137-CD3ζ。

步骤(1)中，对于从NKT细胞cDNA中分别扩增CD8的hinge区和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域的方法没有特别的限定，可以为本领域常用的各种方法，例如可以为RT-PCR法。其中，NKT细胞可以通过分离人静脉血中的单个核细胞，然后进行培养获得。

具体地，得到pWPT-CD8-CD137-CD3ζ的方法可以包括：提取NKT细胞的总RNA，逆转录获得NKT细胞cDNA，以得到的NKT细胞cDNA为模板，利用引物P1(SEQ ID NO：11)和P2(SEQID NO：12)进行PCR扩增获得CD8基因的hinge区和跨膜区(SEQ ID NO：3)；利用引物P3(SEQID NO：13)和P4(SEQ ID NO：14)进行PCR扩增获得CD137基因的胞内信号结构域(SEQ IDNO：4)；利用引物P5(SEQ ID NO：15)和P6(SEQ ID NO：16)进行PCR扩增获得CD3ζ基因的胞内信号结构域(SEQ ID NO：5)，将获得的PCR产物分别进行双酶切，然后与MluI/SalI双酶切后的慢病毒表达载体pWPT-GFP连接。

步骤(2)中，对于合成编码大鼠生长激素信号肽和CD19ScFv的核苷酸序列的方法没有特别的限定，可以为本领域常用的各种方法，例如可以通过全基因合成技术合成。

具体地，得到序列正确的pWPT-CD19ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的方法可以包括：通过全基因合成技术合成编码大鼠生长激素信号肽和CD19ScFv融合基因的核苷酸序列(SEQ IDNO：8)，克隆至载体pGSI中，得到pGSI-CD19ScFv；然后将pGSI-CD19ScFv进行BamHI/MluI双酶切，与BamHI/MluI双酶切后的步骤(1)得到的重组质粒pWPT-CD8-CD137-CD3ζ连接，经测序鉴定，得到序列正确的pWPT-CD19ScFv-CD8-CD137-CD3ζ。其中，大鼠生长激素信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，CD19ScFv核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。

本发明还提供了一种工程化CD19靶向性的NKT细胞，所述NKT细胞是由上述嵌合抗原受体CD19ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的NKT细胞(即CAR19-NKT细胞)。

对于工程化CD19靶向性的NKT细胞的制备方法没有特别的限定，可以为本领域技术人员能够想到的任何方法，优选情况下，该方法包括：包装携带pWPT-CD19ScFv-CD8-CD137-CD3ζ编码基因的慢病毒；利用得到的慢病毒感染NKT细胞，使NKT细胞表达嵌合抗原受体CD19ScFv-CD8-CD137-CD3ζ。

对于包装携带pWPT-CD19ScFv-CD8-CD137-CD3ζ编码基因的慢病毒的方法没有特别的限定，可以为本领域技术人员常用的各种方法，优选情况下，将慢病毒表达载体pWPT-CD19ScFv-CD8-CD137-CD3ζ与辅助质粒(如psPAX2、pMD2.G)共转染293T包装细胞，转染48-72h时收集病毒上清，离心、过滤，在滤液中添加5×PEG6000-NaCl进行混匀，离心后弃上清，沉淀用0-4℃预冷的无菌PBS溶解，获得病毒浓缩液。

对于慢病毒感染NKT细胞的方法没有特别限定，可以为本领域常用的各种方法，优选情况下，该方法包括：取1×10⁷-5×10⁷个NKT细胞，弃掉旧的培养液，加入2-4mL新鲜GT-T551培养液，再加入200-400μL病毒浓缩液、2-4μL1×10^-6mg/mL鱼精蛋白和终浓度为800-1200U/mL的IL-2，置于30-37℃、饱和湿度为3-6％的CO₂培养箱中感染12-16h后，弃培养液，将细胞转至未包被的培养瓶中，加入20-50mL的GT-T551培养基，再加入终浓度为800-1200U/mL的IL-2，于30-37℃、饱和湿度为3-6％的CO₂培养箱中培养12-18h，获得嵌合抗原受体CD19ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的NKT细胞。

进一步优选地，慢病毒感染NKT细胞的方法还包括：将上述培养后获得的慢病毒感染的NKT细胞用IL-2的终浓度为800-1200U/mL的GT-T551培养液进行体外诱导，待细胞的密度为80-90％时将细胞转入细胞培养袋中，隔1.5-2.5天加入IL-2的终浓度为800-1200U/mL的新鲜GT-T551培养液进行扩增培养并将细胞扩增至总量为1×10⁹-2×10⁹个细胞。

嵌合抗原受体CD19ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的NKT细胞表达的嵌合抗原受体的成熟蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。其中，本领域技术人员应该理解的是，嵌合抗原受体前体蛋白由信号肽、CD19ScFv、CD8的hinge区和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域串联构成，蛋白质翻译后在细胞内粗面型内质网切除信号肽后成为成熟嵌合抗原受体蛋白，分泌输出后并定位于NKT细胞的细胞膜上。该嵌合抗原受体的成熟蛋白氨基酸序列对应的基因编码序列如SEQ ID NO：2所示。该嵌合抗原受体以基因CD8的hinge区和跨膜区及CD137和CD3ζ的胞内信号结构域串联而成的结构为信号传导结构域，其氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，对应的基因编码序列如SEQ ID NO：10所示。

本发明还提供了上述方法制备得到的工程化CD19靶向性的NKT细胞。

本发明还提供了工程化CD19靶向性的NKT细胞在制备用于治疗白血病的制剂中的应用。优选情况下，白血病是指进展期CD19阳性的急性B淋巴细胞白血病。

本发明提供了治疗癌症等疾病的组合物和方法。该癌症可为血液学恶性肿瘤、实体瘤、原发肿瘤或转移性肿瘤。优选地，该癌症为血液学恶性肿瘤，和更优选地，该癌症为急性B淋巴细胞白血病。利用本发明的组合物和方法可治疗的其他疾病包括病毒、细菌和寄生虫感染以及自身免疫疾病。

NKT细胞

自然杀伤细胞(NKT)是一种特殊类型的T淋巴细胞亚群，具有T细胞和NK细胞两重性质。NKT细胞能表达T细胞的TCR与NK细胞的NKR-P1两种受体，在TCR和NKR介导下，NKT细胞能够产生大量的IL-4及INFγ，对肿瘤细胞发挥细胞杀伤作用。NKT细胞通过自身表面的CD16与特异性抗体的Fc段结合，发挥ADCC(antibody-dependent cell-mediatedcytotoxicity)作用。

NKT细胞的功能主要包括免疫调节和细胞毒作用，NKT细胞受到刺激后，可以分泌大量的IL-4,IFN-γ，GM-CSF,IL-13和其它细胞因子和趋化因子，发挥免疫调节作用，NKT细胞是联系固有免疫和获得性免疫的桥梁之一。NKT细胞活化后具有NK细胞样细胞毒活性，可溶解NK细胞敏感的靶细胞，主要效应分子为穿孔素，Fas配体以及IFN-γ。

但在抗体依赖的细胞介导的杀伤作用过程中，由于抗体能与靶细胞上的相应抗原表位特异性结合，NKT细胞可杀伤任何已与抗体结合的靶细胞，因此抗体与靶细胞上的抗原结合是特异性的，但NKT细胞对靶细胞的杀伤作用是非特异性的。

NKT细胞的制备方法

本领域中已存在已知的NKT细胞、T细胞的制备方法，以及活化和扩增方法，例如可以分别参考文献：Motohashi,S.,Nagato,K.,Kuni i,N.,Yamamoto,H.,Yamasaki,K.,Okita,K.,Hanaoka,H.,Shimizu,N.,Suzuki,M.,Yoshino,I.,Taniguchi,M.,Fujisawa,T.and Nakayama,T.,A phase I-II study of alpha-galactosylceramide-pulsed IL-2/GM-CSF-cul tured peripheral blood mononuclear cells in patients with advancedand recurrent non-small cell lung cancer.J Immunol 2009.182:2492-2501；D.L.Porter,B.L.Levine,M.Kalos,A.Bagg,C.H.June,Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia,The New England journal ofmedicine,2011.365:725-733.

在本发明的一个较佳的实施方式中，改良的制备NKT细胞的方法如下。

(1)取人静脉血于含肝素的真空管中。采用淋巴细胞分离液，通过密度梯度离心方法分离获得单个核细胞(PBMCs)。

(2)PBMCs洗三次后，采用含有0.6体积％的人自体血清的NKT细胞培养基GT-T551调整细胞终浓度为2×10⁶个细胞/mL；将细胞接种于预先经过终浓度为10μg/mL的retronectin包被的75cm²细胞培养瓶中。然后在培养基里加入终浓度为500U/mL的重组人白介素2，50ng/ml CD3单克隆抗体，50ng/mL的重组人白介素-15，在37℃、饱和湿度为5％的CO₂培养箱中培养。

(3)培养第4天，将细胞转移至未包被的培养瓶中，并每2-3天按照细胞生长状况加入培养液，及人重组IL-2浓度为500U/ml；第12-16天，得到NKT细胞，流式细胞术对NKT细胞表型进行分析。

采用本发明方法制得的NKT细胞群中，CD3⁺CD8⁺NKT细胞/CD3⁺CD4⁺NKT细胞的比率为10/1～4/1(优选为9/1～6/1)；并且CD3⁺CD56⁺NKT细胞/CD3⁺CD8⁺NKT细胞的比率为1/18～10/18(优选为5/18～10/18)。

并且NKT细胞群中，CD3⁺细胞比率≥95％；CD3⁺CD8⁺细胞比率≥90.99％；CD3⁺CD56⁺细胞比率≥15％(优选地，≥18％；更优选地≥20％；最优选地≥22％，如≥24％、≥26％、≥28％、≥30％)；CD8⁺CD56⁺细胞比率≥15％(优选地，≥18％；更优选地≥20％；最优选地≥22％，如≥24％、≥26％、≥28％、≥30％)。

NKT细胞的细胞表型为CD3⁺和CD56⁺，表达T细胞受体(TCR)的可变区基因和天然杀伤(NK)细胞表面标记NK1·1(NKR-P1C)，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点。在杀伤发面，弥补了T细胞MHC限制性的局限性，杀瘤谱、杀伤能力都大大优于T细胞。

与传统T细胞不同，NKT细胞是一群兼具NK功能和T细胞特点的特殊免疫细胞。NKT细胞具有高度保守的TCR表型(TCRVα24/Vβ11-人),同时共表达NK细胞特有标志CD161，它不识别由经典的MHC-Ⅰ或Ⅱ类分子递呈的肽类抗原,而是识别由非经典的MHC-Ⅰ类分子呈递的糖脂类分子抗原。NKT细胞识别由CD1d分子提呈的特异糖脂分子,并能够分泌大量细胞因子,参与机体的先天性免疫和获得性免疫反应。目前，多项研究证实NKT细胞在抗肿瘤免疫、抗感染免疫、自身免疫病、免疫调节中发挥了重要作用，许多生理病理过程均有NKT细胞的参与。

传统的T细胞在体外存活时间比较短暂，而根据本发明的NKT细胞在体外存活时间较久，能够贴壁感染，感染率高。而T细胞感染效率低，而且感染后的T细胞死亡率也高。

嵌合抗原受体

本发明提供了包括细胞外结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域的嵌合抗原受体(CAR)。胞外结构域包括靶-特异性结合元件(也称为抗原结合结构域)。细胞内结构域包括共刺激信号传导区和ζ链部分。共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分。共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。

在CAR的胞外结构域和跨膜结构域之间，或在CAR的胞浆结构域和跨膜结构域之间，可并入接头。如本文所用的，术语“接头”通常指起到将跨膜结构域连接至多肽链的胞外结构域或胞浆结构域作用的任何寡肽或多肽。接头可包括0-300个氨基酸，优选地2至100个氨基酸和最优选地3至50个氨基酸。

在本发明的一个较佳的实施方式中，本发明提供了经过基因工程改造以表达CAR的细胞(例如，T细胞、NKT细胞)，其显示显著的抗肿瘤性质。本发明的CAR还可以包括胞外结构域，所述胞外结构域具有融合至T细胞抗原受体复合物ζ链(例如，CD3ζ)的细胞内信号传导结构域的抗原结合结构域。本发明的CAR当在NKT细胞中表达时，能够基于抗原结合特异性改变抗原识别。示例性抗原为CD19，因为该抗原在恶性B细胞上表达。然而，本发明不限于靶向CD19。相反地，本发明包括任何抗原结合结构域，当其结合其关联抗原时，影响肿瘤细胞，导致肿瘤细胞不生长、被促使死亡或以其他方式被影响，并导致患者的肿瘤负荷缩小或消除。抗原结合结构域优选与来自共刺激分子和ζ链中的一个或多个的细胞内结构域融合。优选地，抗原结合结构域与CD137(4-1BB)信号传导结构域、和CD3ζ信号结构域组合的细胞内结构域融合。

在一个实施方式中，本发明的CAR包括包含本发明特定信号传导结构域(CD8的hinge区和跨膜区、CD137和CD3ζ的胞内信号结构域串联而成)。，与其他方式的CAR相比，本发明的信号传导结构域显著增加了抗肿瘤活性和CART细胞的体内持久性。

抗原结合结构域

在一个实施方式中，本发明的CAR包括被称为抗原结合结构域的靶-特异性结合元件。抗原结合结构域的选择取决于限定靶细胞表面的配体的类型和数目。例如，可选择抗原结合结构域，以识别用作与具体疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标记的配体。因此，细胞表面标记的例子包括与病毒、细菌和寄生虫感染，自身免疫疾病和癌细胞相关的那些标记。

在本发明的内容中，“肿瘤抗原”指由引起免疫应答特别是T-细胞介导的免疫应答的肿瘤细胞产生的蛋白质。本发明的抗原结合结构域的选择将取决于待治疗癌症的具体类型。肿瘤抗原在本领域中是公知的，并包括但并不限于：CD19、神经胶质瘤相关的抗原、癌胚抗原(CEA)、β-人绒毛膜促性腺素、α-胎蛋白(AFP)、凝集素-反应的AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人端粒酶反转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧酸酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺-特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-la、p53、prostein、PSMA、Her2/neu、存活素和端粒酶、前列腺-癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、中性白细胞弹性蛋白酶、ephrinB2、CD22、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体和间皮素。

在一个实施方式中，肿瘤抗原包括与恶性肿瘤相关的一个或多个抗原癌症表位。恶性肿瘤表达可用作免疫攻击的靶抗原的许多蛋白。这些分子包括但不限于组织-特异性抗原诸如MART-1、黑素瘤中的酪氨酸酶和GP100、和前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶(PAP)和前列腺-特异性抗原(PSA)。其他靶分子属于转化相关分子诸如致癌基因HER-2/Neu/ErbB-2。而另一组的靶抗原为胎性癌抗原诸如癌胚抗原(CEA)。在B-细胞淋巴瘤中，肿瘤-特异性个体基因型免疫球蛋白构成对个体肿瘤唯一的真正的肿瘤-特异性免疫球蛋白抗原。B-细胞分化抗原诸如CD19、CD20和CD37是B-细胞淋巴瘤中靶抗原的其他候选物。这些抗原中的一些(CEA、HER-2、CD19、CD20、个体基因型)已经有限成功地用作利用单克隆抗体的被动免疫疗法的标靶。

在本发明优选的实施方式中，所述抗原包括：CD19、CD20、CD30、HER1等。

本发明中提及的该类型肿瘤抗原也可为肿瘤-特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)。TSA为对肿瘤细胞唯一的，并不发生在身体的其他细胞上。TAA相关的抗原不是对肿瘤细胞唯一的，并且相反，其在不能诱导对抗原的免疫耐受状态的病症下，也在正常细胞上进行表达。肿瘤上的抗原表达可在使免疫系统能够响应抗原的病症下发生。TAA可为在胚胎发育期间，当免疫系统不成熟并且不能响应时，在正常细胞上表达的抗原，或它们可为在正常细胞上以极低的水平正常存在的抗原，但其在肿瘤细胞上以高得多的水平进行表达。

TSA或TAA抗原的非限制性例子包括以下：分化抗原诸如MART-l/MelanA(MART-1)、gp100(Pmel17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2和肿瘤-特异性多谱系抗原诸如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15；过表达的胚胎抗原诸如CEA；过表达的致癌基因和突变的肿瘤-抑制基因诸如p53、Ras、HER-2/neu；由染色体易位产生的独特的肿瘤抗原诸如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、1GH-IGK、MYL-RAR；和病毒抗原，诸如Epstein

Barr病毒抗原EBVA和人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。其他大的、基于蛋白的抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA19-9、CA72-4、CAM17.1、NuMa、K-ras、β-联蛋白、CDK4、Mum-1、p15、p16、43-9F、5T4、791Tgp72、α-胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA125、CA15-3\CA27.29\BCAA、CA195、CA242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP和TPS。

在优选的实施方式中，CAR的抗原结合结构域靶向某一抗原，所述抗原包括但不限于CD19、CD20、CD22、CD30、HER1、RORl、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、MY-ESO-1TCR、MAGE A3TCR等等。

取决于待靶向的期望抗原，本发明的CAR可被工程改造以包括对期望抗原靶特异性的适当的抗原结合结构域。例如，如果CD19是待靶向的期望抗原，则CD19的抗体可用作抗原结合结构域，并入本发明的CAR。

在一个实施方式中，本发明的CAR的抗原结合结构域靶向CD19。优选地，本发明的CAR中的抗原结合结构域为抗-CD19scFV，其中抗-CD19scFV的核酸序列包括SEQ ID NO:7中提出的序列。在一个实施方式中，抗-CD19scFV包括编码SEQ ID NO:20的氨基酸序列的核酸序列。在另一个实施方式中，本发明的CAR的抗-CD19scFV如SEQ ID NO:20所示。

EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLT IIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTS SLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIAT YFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT(SEQ ID NO.:20)。

绞链区和跨膜区

对于绞链区和跨膜区(跨膜结构域)，CAR可被设计以包括融合至CAR的胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用天然与CAR中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸置换进行修饰，以避免将这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。

跨膜结构域可源于天然来源或合成来源。在天然来源中，该结构域可源于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。具体用于本发明的跨膜区可源于T-细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154(即至少包括上述中的跨膜区(一个或多个))。

优选地，本发明的CAR中的绞链区和跨膜区为CD8的绞链区和跨膜区。在一个实施方式中，编码CD8的绞链区和跨膜区的核苷酸序列包括SEQ ID NO:3的核酸序列。在本发明的一个优选的实施方式中，CD8的绞链区和跨膜区包括以下氨基酸序列：

LSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(SEQ ID NO.:17)

胞内结构域

本发明的CAR的胞内结构域或另外的细胞内信号传导结构域是造成其中已放置CAR的免疫细胞的至少一种正常效应子功能的活化的原因。术语“效应子功能”指的是细胞的专有功能。例如，T细胞的效应子功能可为包括细胞因子分泌的细胞溶解活性或辅助活性。因此术语“细胞内信号传导结构域”指的是转导效应子功能信号并指导细胞实施专有功能的蛋白部分。尽管通常可使用整个细胞内信号传导结构域，但在很多例子中，不必使用整个链。就使用细胞内信号传导结构域的截短部分而言，这种截短部分可用于代替完整的链，只要它转导效应子功能信号。术语细胞内信号传导结构域因此指包括足以转导效应子功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。

用于本发明的CAR的细胞内信号传导结构域的优选例子包括T细胞受体(TCR)的胞浆序列和协同行动以在抗原受体结合后开始信号转导的共受体，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同的功能能力的任何合成序列。

已知通过TCR单独产生的信号不足以完全活化T细胞，并且也需要次级或共刺激信号。因此，T细胞活化可被认为由两个不同类的胞浆信号传导序列介导：通过TCR(初级胞浆信号传导序列)开始抗原-依赖性初级活化的那些和以抗原-非依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号(次级胞浆信号传导序列)的那些。

初级胞浆信号传导序列以刺激方式或以抑制方式调节TCR复合物的初级活化。以刺激方式起作用的初级胞浆信号传导序列可包含信号传导基序，其已知为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM。

包含在本发明中具有具体用途的初级胞浆信号传导序列的ITAM的例子包括源于TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。特别优选地，本发明的CAR中的胞浆信号传导分子包括源于CD3ζ的胞浆信号传导序列。

在优选的实施方式中，CAR的胞浆结构域可被设计以本身包括CD3-ζ信号传导结构域，或可与在本发明的CAR的内容中有用的任何其他期望的胞浆结构域(一个或多个)联合。例如，CAR的胞浆结构域可包括CD3ζ链部分和共刺激信号传导区。共刺激信号传导区指的是包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分CAR。共刺激分子是淋巴细胞对抗原的有效应答所需的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。这种分子的例子包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、

NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体等等。因此，尽管本发明主要以4-1BB作为共刺激信号传导元件的例子，但其他共刺激元件也位于本发明的范围内。

本发明的CAR的胞浆信号传导部分内的胞浆信号传导序列可以随机或以规定的顺序相互连接。任选地，短的寡肽或多肽连接体，优选长度在2和10个氨基酸，可形成该连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了特别合适的连接体。

在一个实施方式中，胞浆结构域被设计以包括CD3ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在另一个实施方式中，胞浆结构域被设计以包括CD3ζ的信号传导结构域和CD137的信号传导结构域。

在一个实施方式中，本发明的CAR中的胞浆结构域被设计以包括CD137的信号传导结构域和CD3ζ的信号传导结构域，其中CD137的信号传导结构域包括SEQ ID NO:4中提出的核酸序列和CD3-ζ的信号传导结构域包括SEQ ID NO:5中提出的核酸序列。

在一个实施方式中，本发明的CAR中的胞浆结构域被设计以包括CD137的信号传导结构域和CD3ζ的信号传导结构域，其中CD137的信号传导结构域包括编码SEQ ID NO:18的氨基酸序列的核酸序列，和CD3ζ的信号传导结构域包括编码SEQ ID NO:19的氨基酸序列的核酸序列。

在一个实施方式中，本发明的CAR中的胞浆结构域被设计以包括CD137的信号传导结构域和CD3ζ的信号传导结构域，其中CD137的信号传导结构域包括SEQ ID NO:18中提出的氨基酸序列，和CD3ζ的信号传导结构域包括SEQ ID NO:19中提出的氨基酸序列。

优选地，CD137的胞内信号结构域包含如下氨基酸序列：

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO.:18)

优选地，CD3ζ的胞内信号结构域包含如下氨基酸序列：

RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO.:19)

载体

本发明包括包含CAR序列的DNA构建体，其中该序列包括可操作地连接至信号传导结构域的核酸序列的抗原结合结构域的核酸序列。可用于本发明的CAR的示例性的信号传导结构域包括抗-CD19scFv、CD8铰链和跨膜区、和CD137和CD3ζ胞内信号传导结构域。在一个实施方式中，本发明的CAR包括SEQ ID NO:10中提出的核酸序列。在另一个实施方式中，本发明的CAR包括编码SEQ ID NO:9的氨基酸序列的核酸序列。在另一个实施方式中，本发明的CAR包括SEQ ID NO:9中提出的氨基酸序列。

编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产。

本发明也提供了其中插入本发明的DNA的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合并且其在子细胞中增殖。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的优点。

简单概括，通常通过可操作地连接编码CAR多肽或其部分的核酸至启动子，并将构建体并入表达载体，实现编码CAR的天然或合成核酸的表达。该载体适合于复制和整合真核细胞。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。

本发明的表达构建体也可利用标准的基因传递方案，用于核酸免疫和基因疗法。基因传递的方法在本领域中是已知的。见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，在此通过引用全文并入。在另一个实施方式中，本发明提供了基因疗法载体。

该核酸可被克隆入许多类型的载体。例如，该核酸可被克隆入如此载体，其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。

进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193)。

已经开发许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方式中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方式中，使用慢病毒载体。

额外的启动子元件，例如增强子，可以调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可被增加隔开50bp，活性才开始下降。取决于启动子，表现出单个元件可合作或独立地起作用，以起动转录。

合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

为了评估CAR多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。

报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。通常地，报道基因为以下基因：其不存在于受体有机体或组织或由受体有机体或组织进行表达，并且其编码多肽，该多肽的表达由一些可容易检测的性质例如酶活性清楚表示。在DNA已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白基因的基因(例如，Ui-Tei等，2000FEBS Letters479:79-82)。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。通常，显示最高水平的报道基因表达的具有最少5个侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可被连接至报道基因并用于评价试剂调节启动子-驱动转录的能力。

将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。

将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,New York)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为磷酸钙转染。

将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。

将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内传递工具(delivery vehicle)的示例性胶体系统为脂质体(例如，人造膜囊)。

在使用非病毒传递系统的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂质制剂，以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(ex vivo)或体内)。在另一方面，该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可存在于双分子层结构中，作为胶束或具有“坍缩的(collapsed)”结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。

在本发明的一个优选地实施方式中，所述载体为慢病毒载体，更优选地为pWPT-GFP慢病毒载体。本发明人研究证实，使用该慢病毒载体构建本发明CAR，对NKT细胞的转染效率较高，且具有高度的可重复性。

在本发明的一个优选地实施方式中，所述载体中还包括信号肽序列。优选地，所述信号肽序列连接在所述抗原结核结构域核酸序列的上游。

优选地，所述信号肽为大鼠生长激素信号肽；更优选的，所述大鼠生长激素信号肽的核酸序列如SEQ ID NO.:6所示。本发明人在研究中，意外地发现，在本发明的载体为慢病毒载体时，使用大鼠生长激素信号肽能够显著提高包含本发明CAR的慢病毒载体对NKT细胞的转染效率。

治疗性应用

本发明包括用慢病毒载体(LV)转导的细胞(例如，NKT细胞、T细胞)。例如，LV编码将特异性抗体的抗原结合结构域与CD3-ζ、CD137组合的细胞内结构域联合的CAR。因此，在一些例子中，转导的NKT细胞可引起CAR-介导的NKT-细胞应答。

因此，本发明也提供了刺激对哺乳动物的靶细胞群或组织的NKT细胞-介导的免疫应答的方法，其包括以下步骤：施用给哺乳动物表达CAR的NKT细胞，其中CAR包括特异性地与预定标靶相互作用的结合部分，包括例如人CD3ζ的细胞内结构域的ζ链部分，和共刺激信号传导区。

在一个实施方式中，本发明包括一类细胞疗法，其中NKT细胞被基因修饰以表达CAR，和CAR-NKT细胞被注入需要其的接受者中。注入的细胞能够杀死接受者的肿瘤细胞。不像抗体疗法，CAR-NKT细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。

在一个实施方式中，本发明的CAR-NKT细胞可经历稳固的体内NKT细胞扩展并可持续延长的时间量。另外，CAR介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中CAR-修饰NKT细胞诱导对CAR中的抗原结合结构域特异性的免疫应答。例如，抗CD19CAR-NKT细胞引起抗表达CD19的细胞的特异性免疫应答。

尽管本文公开的数据具体公开了包括抗-CD19scFv、CD8铰链和跨膜区、和CD137和CD3ζ信号传导结构域的慢病毒载体，但本发明应被解释为包括对构建体组成部分中的每一个的任何数量的变化。

可治疗的癌症包括没有被血管化或基本上还没有被血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。癌症可包括非实体瘤(诸如血液学肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括实体瘤。用本发明的CAR治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，和某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、和恶性瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。

血液学癌症为血液或骨髓的癌症。血液学(或血原性)癌症的例子包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性、前髓细胞性、粒-单核细胞型、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤(无痛和高等级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良。

实体瘤为通常不包含囊肿或液体区的组织的异常肿块。实体瘤可为良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(诸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤诸如肉瘤和癌的例子包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤间皮瘤、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌卵巢癌、。

在一个实施方式中，本发明的CAR的抗原结合结构域被设计以治疗具体的癌症。例如，被设计以靶向CD19的CAR可用于治疗癌症和紊乱，包括但不限于前-BALL(儿童指征)、成人ALL、套细胞淋巴瘤、扩散大B-细胞淋巴瘤，同种骨髓移植后的补救等等。

在一个实施方式中，癌症和紊乱包括但不限于前-BALL(儿童指征)，成人ALL、套细胞淋巴瘤、扩散大B-细胞淋巴瘤、同种骨髓移植后的补救等等，其可利用靶向CD19、CD20、CD22和ROR1的CAR的组合进行治疗。

在一个实施方式中，CAR可被设计以靶向间皮素，来治疗间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌等等。

在一个实施方式中，CAR可被设计以靶向CD33/IL3Ra，来治疗急性骨髓性白血病等等。

然而，本发明不应被解释为仅限于本文公开的抗原标靶和疾病。相反地，本发明应被解释为包括任何与可使用CAR治疗的疾病相关的抗原标靶。

本发明的CAR-修饰T细胞也可用作对哺乳动物离体免疫和/或体内疗法的疫苗类型。优选地，哺乳动物为人。

对于离体免疫，以下中的至少一项在将细胞施用进入哺乳动物前在体外发生：i)扩展细胞，ii)将编码CAR的核酸引入细胞，和/或iii)冷冻保存细胞。

离体程序在本领域中是公知的，并在以下更完全地进行讨论。简单地说，细胞从哺乳动物(优选人)中分离并用表达本文公开的CAR的载体进行基因修饰(即，体外转导或转染)。CAR-修饰的细胞可被施用给哺乳动物接受者，以提供治疗益处。哺乳动物接受者可为人，和CAR-修饰的细胞可相对于接受者为自体的。可选地，细胞可相对于接受者为同种异基因的、同基因的(syngeneic)或异种的。

在此通过引用并入的在美国专利号5,199,942中描述的造血干细胞和祖细胞的离体扩展程序，可被应用至本发明的细胞。其他合适的方法在本领域中是已知的，因此本发明不限于细胞离体扩展的任何具体方法。简单地说，T细胞的离体培养和扩展包括：(1)从外周血收获物或骨髓外植体收集来自哺乳动物的CD34+造血干细胞和祖细胞；和(2)离体扩展这样的细胞。除了美国专利号5,199,942中描述的细胞生长因子，其他因子诸如flt3-L、IL-1、IL-3和c-kit配体，也可用于培养和扩展细胞。

除了就离体免疫而言使用基于细胞的疫苗之外，本发明也提供了体内免疫以引起针对患者中抗原的免疫应答的组合物和方法。

通常地，如本文所述活化和扩展的细胞可用于治疗和预防无免疫应答的个体中产生的疾病。特别地，本发明的CAR-修饰的T细胞用于治疗CCL。在某些实施方式中，本发明的细胞用于治疗处于形成CCL风险中的患者。因此，本发明提供了治疗或预防CCL的方法，其包括施用给需要其的对象治疗有效量的本发明的CAR-修饰的T细胞。

本发明的CAR-修饰的T细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如IL-2或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内施用。

本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度——尽管适当的剂量可由临床试验确定。

当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以10⁴至10⁹个细胞/kg体重的剂量，优选10⁵至10⁶个细胞/kg体重的剂量(包括那些范围内的所有整数值)施用。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，NewEng.J.of Med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。

对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方式中，本发明的NKT细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的NKT细胞组合物优选通过i.v.注射施用。NKT细胞的组合物可被直接注入肿瘤，淋巴结或感染位置。

在本发明的某些实施方式中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将NKT细胞扩展至治疗性水平的方法活化和扩展的细胞，与任何数量的有关治疗形式结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用以下试剂进行治疗：所述试剂诸如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也已知为ARA-C)或对MS患者的那他珠单抗治疗或对牛皮癣患者的厄法珠单抗治疗或对PML患者的其他治疗。在进一步的实施方式中，本发明的NKT细胞可与以下结合使用：化疗、辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和FK506，抗体或其他免疫治疗剂。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺结合(例如，之前、同时或之后)而施用给患者。例如，在一个实施方式中，对象可经历高剂量化疗的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在一些实施方式中，在移植后，对象接受本发明的扩展的免疫细胞的注入。在一个额外的实施方式中，扩展的细胞在外科手术前或外科手术后施用。

施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。通常，每次治疗或每个疗程，可将1×10⁶个至1×10¹⁰个本发明经修饰的NKT细胞(如，CAR19-NKT细胞)，通过例如静脉回输的方式，施用于患者。

本发明的优点包括：

1、本发明首次构建了一种对肿瘤具有显著杀伤效果的表达嵌合抗原受体的NKT细胞，并且该NKT细胞具有调节Car-T细胞群内的免疫平衡状态的功能；

2、传统的表达嵌合抗原受体的T细胞在体外存活时间比较短暂，而本发明的表达嵌合抗原受体的NKT细胞在体外存活时间较久，而且能够贴壁感染，感染效率高。而T细胞感染效率低，而且感染后的T细胞死亡率也高。

3、本发明的嵌合抗原受体，以CD8的绞链区和跨膜区及CD137和CD3ζ的胞内信号结构域串联而成的结构为信号传导结构域，能够保持对NKT细胞的高效转染，并且在NKT细胞内能够高效表达；

4、与传统的表达嵌合抗原受体的T细胞相比，本发明的表达嵌合抗原受体的NKT细胞具有显著更高的体外溶瘤活性；

5、本发明的表达嵌合抗原受体的NKT细胞回输至患者体内，在外周血和骨髓中可以大量扩增，并且可以不依赖于白介素2而持续长久的存在。

实施例

以下的实施例将对本发明作进一步的说明，但并不因此限制本发明。

以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到，其中：

NKT细胞培养基GT-T551购自TaKaRa公司。

淋巴细胞分离液购自TBD公司。

CD3单克隆抗体、重组纤维连接蛋白(retronectin)均购自TaKaRa公司。

重组人蛋白干扰素-γ、重组人白介素2购自protech公司。

总RNA提取试剂盒RNAiso Reagent、高保真DNA聚合酶(HS DNAPolymerase)、T4DNA连接酶购自TaKaRa公司。

RevertAid^TMFirst Strand cDNA Synthesis Kit购自Fermentas公司。

BglⅡ、EcoRI、MluI、BamHI、SalI购自Fermentas公司。

琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、普通DNA产物纯化试剂盒、质粒小提试剂盒均购自天根生化科技有限公司。

pWPT-GFP、psPAX2、pMD2.G均购自Addgene公司。

pGSI购自北京天一辉远生物科技有限公司。

Trans1-T1 Phage Resistant化学感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。

Lipofectamine^TM2000 Transfection Reagent转染试剂购自Invitrogen公司。

293T包装细胞购自美国ATCC。

B淋巴白血病细胞Nalm-6、Daudi购自美国ATCC。

慢性粒细胞白血病细胞K562购自美国ATCC。

PEG6000-NaCl中PEG6000终浓度为25.5质量％，NaCl终浓度为1.2M，PEG6000和NaCl均购自上海索莱宝生物科技有限公司。

胎牛血清购自德国PAA公司。

5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯购自上海谱振生物科技有限公司。

膜联蛋白V-RPE试剂盒购自美国BD公司。

所有引物均由北京天一辉远生物科技有限公司合成。

实施例1 NKT细胞的制备

1.1制备NKT细胞

(1)取人静脉血于含肝素的真空管中。采用淋巴细胞分离液，通过密度梯度离心方法分离获得单个核细胞(PBMCs)。

(2)PBMCs洗三次后，采用含有0.6体积％的胎牛血清的NKT细胞培养基GT-T551调整细胞终浓度为2×10⁶个细胞/mL；将细胞接种于预先经过终浓度为5μg/mL抗CD3单克隆抗体及终浓度为10μg/mL的retronectin包被的75cm²细胞培养瓶中。然后在培养基里加入终浓度为1000U/mL的重组人蛋白干扰素-γ和1000U/mL的重组人白介素2，在37℃、饱和湿度为5％的CO₂培养箱中培养。

(3)第四天，向培养瓶中补加100mL含有0.6体积％的胎牛血清的NKT细胞培养基GT-T551，并加入终浓度为1000U/mL的重组人白介素2。于37℃、饱和湿度为5％的CO₂培养箱中培养4天，得到NKT细胞，流式细胞术对NKT细胞表型进行分析。结果表明，其中CD3⁺：99.57％；CD3⁺CD4⁺：26.03％；CD3⁺CD8⁺：88.26％；CD3⁺CD56⁺：8.93％；CD8⁺CD56⁺：8.35％。

1.2改良的制备NKT细胞方法

(1)取人静脉血于含肝素的真空管中。采用淋巴细胞分离液，通过密度梯度离心方法分离获得单个核细胞(PBMCs)。

(2)PBMCs洗三次后，采用含有0.6体积％的人自体血清的NKT细胞培养基GT-T551调整细胞终浓度为2×10⁶个细胞/mL；将细胞接种于预先经过终浓度为10μg/mL的retronectin包被的75cm²细胞培养瓶中。然后在培养基里加入终浓度为500U/mL的重组人白介素2，50ng/ml CD3单克隆抗体，50ng/mL的重组人白介素-15，在37℃、饱和湿度为5％的CO₂培养箱中培养。

(3)培养第4天，将细胞转移至未包被的培养瓶中，并每2-3天按照细胞生长状况加入培养液，及人重组IL-2浓度为500U/ml；第12-16天，得到NKT细胞，流式细胞术对NKT细胞表型进行分析。

结果见图1，其中，各类型细胞比例如下：

CD3⁺：95.04％；CD3⁺CD8⁺：90.99％；CD3⁺CD56⁺：24.12％；CD8⁺CD56⁺：24.63％。

CD3⁺CD8⁺NKT细胞/CD3⁺CD4⁺NKT细胞的比率为4/1；并且CD3⁺CD56⁺NKT细胞/CD3⁺CD8⁺NKT细胞的比率为约0.27。

本实施例的结果说明，采用本发明的改良的方法制备的NKT细胞，CD3⁺CD8⁺-CAR/CD3⁺CD4⁺-CAR比率较高，以及CD3⁺CD56⁺-CAR/CD3⁺CD8⁺-CAR比率与普通体外扩增的T细胞相比，有明显的提高，有助于提高体外溶瘤和体内杀瘤活性，对调节CART细胞群内的免疫平衡状态，都有显著优势。

实施例2慢病毒表达载体pWPT-CD19ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的构建

(1)NKT细胞cDNA的制备

离心沉淀实施例1培养得到的NKT细胞，用总RNA提取试剂盒RNAiso Reagent提取细胞的总RNA，-80℃保存备用。提取的总RNA用逆转录试剂盒RevertAid^TMFirst StrandcDNA Synthesis Kit逆转录得NKT细胞cDNA，-20℃保存备用。

(2)慢病毒质粒pWPT-CD8-CD137-CD3ζ的制备

设计并合成如下引物序列(其中，下划线标记为保护碱基，方框为酶切位点)：

以步骤(1)中NKT细胞cDNA为模板，用引物P1和P2进行PCR扩增，得到长287bp的CD8的hinge区和跨膜区，核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，两端分别含有MluI和BglⅡ酶切位点和保护碱基；用引物P3和P4进行PCR扩增，得到长146bp的CD137胞内信号结构域，核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，两端分别含有BglⅡ和EcoRI酶切位点及保护碱基；用引物P5和P6进行PCR扩增，得到长359bp的CD3ζ的胞内信号结构域，核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，两端分别含有EcoRI和SalI酶切位点及保护碱基。各步PCR扩增反应体系相同，以扩增CD137胞内信号结构域为例，进行PCR扩增，PCR反应条件参照HS DNA Polymerase的说明书，反应体系(50μL)如下：

双蒸水：32.5μL

5×反应buffer：10μL

dNTP混合物(每种2.5mM)：4μL

P3(10mM):1μL

P4(10mM):1μL

NKT细胞cDNA(200ng/ul)：1μL

HS DNA Polymerase：0.5μL

将上述PCR产物用1％的琼脂糖凝胶进行分离，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行DNA片段回收。得到片段后分别进行双酶切反应，酶切产物用普通DNA产物纯化试剂盒回收备用。

慢病毒表达载体pWPT-GFP用MluI/SalI双酶切，酶切产物经1％的琼脂糖凝胶进行分离，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收大的载体片段，然后与之前回收的CD8、CD137、CD3ζ片段通过T4DNA连接酶连接，连接产物转化Trans1-T1 Phage Resistant化学感受态细胞，37℃培养16h后挑取单克隆，37℃，250rpm培养12h后用质粒小提试剂盒提取质粒。提取的质粒经限制性内切酶MluI和SalI双酶切鉴定，鉴定电泳图见图2，其中，1泳道：DNA分子量标记D2000；2泳道：质粒pWPT-GFP的酶切片段(835bp)；3泳道：质粒pWPT-CD8-CD137-CD3ζ的酶切片段(756bp)。将鉴定正确的质粒送北京天一辉远生物科技有限公司对插入的融合基因片段进行测序。将测序结果正确的重组质粒命名为pWPT-CD8-CD137-CD3ζ。

(3)慢病毒质粒pWPT-CD19ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的制备

全基因合成编码大鼠生长激素信号肽和CD19ScFv融合基因的核苷酸序列，序列如SEQ ID NO：8所示，由北京天一辉远生物科技有限公司合成，其5’端含有BamHI、kozak序列，3’端含有MluI酶切位点，将前述融合基因克隆在质粒pGSI中，命名为pGSI-CD19ScFv。质粒经BamHI/MluI双酶切，酶切产物经1％琼脂糖凝胶进行分离，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的片段备用。

pWPT-CD8-CD137-CD3ζ质粒经限制性内切酶BamHI/MluI酶切，酶切产物经1％琼脂糖凝胶进行分离，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收载体片段备用。然后与回收的含有大鼠生长激素信号肽和CD19 ScFv的DNA片段通过T4 DNA连接酶进行连接，具体方法见说明书。将连接产物转化Trans1-T1 Phage Resistant化学感受态细胞，37℃培养16h后挑取单克隆，37℃，250rpm培养12h后，用质粒小提试剂盒提取质粒。提取的质粒经限制性内切酶BamHI/SalI双酶切鉴定，鉴定结果如图3所示，其中，M1：DNA分子量标记D15000；1泳道：质粒pWPT-CD19ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的酶切片段(1578bp)；2泳道：质粒pWPT-CD8-CD137-CD3ζ的酶切片段(774bp)；3泳道：质粒pWPT-GFP的酶切片段(853bp)；M2：DNA分子量标记D2000。将鉴定正确的质粒送北京天一辉远生物科技有限公司对插入的融合基因片段进行测序。将测序结果正确的重组质粒命名为pWPT-CD19ScFv-CD8-CD137-CD3ζ，其结构示意图如图4所示，其中包括大鼠生长激素信号肽(核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示)、抗CD19单链抗体(核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示)、CD8的hinge区和跨膜区及CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域，其中，该嵌合抗原受体以基因CD8的hinge区和跨膜区及CD137和CD3ζ的胞内信号结构域串联而成的结构为信号传导结构域，其氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，对应的基因编码序列如SEQ ID NO：10所示。

实施例3嵌合抗原受体CD19ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的NKT细胞的制备

(1)慢病毒的包装和浓缩

用分光光度计分别测定慢病毒表达质粒pWPT-CD19ScFv-CD8-CD137-CD3ζ和辅助质粒psPAX2、pMD2.G的浓度，三种质粒以4:2:1的质量比用Lipofectamine^TM2000Transfection Reagent转染试剂共转染293T包装细胞。分别在转染48h、72h时收集病毒上清于50mL EP管中，4℃，2000g离心10min，转移两次得到的上清至新EP管中，用4.5μm滤器过滤病毒上清；过滤的病毒上清与5×PEG6000-NaCl按照4:1的体积比混匀，4℃静置2h，然后4℃，10000g离心20min，弃上清，沉淀用1mL的4℃预冷的无菌PBS溶解，即得嵌合抗原受体的病毒浓缩液，按每管100μL进行分装，-80℃保存备用。

按照上述方法，利用慢病毒表达质粒pWPT-GFP和辅助质粒psPAX2、pMD2.G共转染293T包装细胞，收集病毒上清，浓缩，获得表达GFP绿色荧光蛋白的慢病毒浓缩液。

(2)慢病毒感染NKT细胞及感染后细胞的扩增培养

取实施例1.2的在75cm²培养瓶中培养的1×10⁷个NKT细胞，弃掉旧的培养液，加入2mL新鲜NKT细胞培养基GT-T551、200μL步骤(1)得到的病毒浓缩液、2μL 1×10^-6mg/mL鱼精蛋白，终浓度为1000U/mL的重组人白介素2，置于37℃、饱和湿度为5％的CO₂培养箱中感染12小时后，弃培养液，得到的NKT细胞称为CAR19-NKT细胞。同时用表达GFP绿色荧光蛋白的慢病毒浓缩液对NKT细胞进行同步感染(得到的NKT细胞称为CART-GFP细胞)，用于计算该病毒的感染效率。将感染后的细胞转至未经CD3和retronectin包被的75cm²培养瓶中，加入20mL的NKT细胞培养基GT-T551，再加入终浓度为1000U/mL的重组人白介素2，于37℃、饱和湿度为5％的CO₂培养箱中培养18h。用流式细胞术检测该病毒的感染效率，结果如图5所示，感染效率为57.47％。

而使用实施例1.1中制备的NKT细胞，进行慢病毒感染，感染率约为26.47％。

(3)体外诱导扩增CAR19-NKT细胞群

将上述培养后的NKT细胞(采用实施例1.2方法制备)用重组人白介素2的终浓度为1000U/mL的NKT细胞培养基GT-T551进行体外诱导，待细胞的密度为85％时将细胞转入细胞培养袋中，隔2天加入重组人白介素2的终浓度为1000U/mL的新鲜NKT细胞培养基GT-T551进行扩增培养，待细胞扩增到总量为1.5×10⁹个细胞左右后，采用流式细胞仪对感染的细胞群体进行鉴定，细胞表型一般达到CD3阳性细胞比例＞90％；CD3CD8阳性细胞比例>70％；CD3CD56双阳性细胞比例>15％，结果见图6，CD3⁺:96.40％；CD3⁺CD8⁺:82.16％；CD3⁺CD56⁺:26.44％；CD8⁺CD56⁺:24.09％。

实施例4 CAR19-NKT细胞对人肿瘤细胞杀伤作用的细胞毒性分析

分别取实施例3中制备的CAR19-NKT细胞、CAR19-T细胞(表达相同CAR19的普通T细胞)和实施例1中培养的NKT细胞接种于96孔板，用5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)进行染色，与表达CD19的B淋巴白血病细胞Nalm和Raji以及不表达CD19的慢性粒细胞白血病细胞K562，以效靶比(杀伤细胞：靶细胞,E:T)1:1，5:1，10:1，20:1比率进行共培养，经过24小时的共培养后，将细胞用膜联蛋白V-RPE试剂盒染色，同时设置对照组为不表达CD19的慢性粒细胞白血病细胞K562，并将细胞用膜联蛋白V-RPE试剂盒染色。流式细胞术对细胞凋亡进行检测，细胞凋亡的量根据下面的公式计算：凋亡率＝(对照-样品)/对照×100％，对照为未加免疫细胞杀伤处理的细胞存活数目；样品为加入相对应的效靶比(杀伤细胞：靶细胞)的免疫细胞杀伤处理的细胞存活数目。

结果见图7。嵌合抗原受体CD19ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的NKT细胞对高表达CD19的B淋巴白血病细胞Nalm和Raji具有特异杀伤活性，而对不表达CD19的慢性粒细胞白血病细胞K562无特异的杀伤活性，且CAR19-NKT细胞的特异杀伤活性明显优于嵌合抗原受体CD19ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的普通T细胞。

实施例5 CAR19-NKT细胞对进展期CD19阳性的急性B淋巴细胞白血病患者的治疗效果

取5×10⁸个CD19ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的NKT细胞(即CAR19-NKT细胞)，经过100ml生理盐水稀释后，连续三天静脉回输到进展期CD19阳性的急性B淋巴细胞白血病患者(在进行靶向免疫治疗前，已经过多次治疗(如放疗、化疗及其他药物对症治疗等)，但均无明显疗效)体内，回输后对患者的治疗状况进行评估。

图8为流式细胞术检测CAR19-NKT细胞回输到患者体内的增殖情况，结果显示，经过靶向免疫细胞治疗，从第二周开始CAR19-NKT细胞在外周血中拷贝数逐渐增高，说明CD19靶向性的NKT细胞(CAR19-NKT细胞)能够在进展期CD19阳性的急性B淋巴细胞白血病患者体内大量的增殖来发挥杀伤活性。

图9为血象分析CAR19-NKT细胞治疗进展期CD19阳性的急性B淋巴细胞白血病患者过程中白细胞总数及原幼细胞的比例变化，结果表明，CAR19-NKT细胞治疗后白细胞数目逐渐较少，同时原幼细胞的比例也逐渐降低。说明CAR19-NKT细胞治疗能使进展期CD19阳性的急性B淋巴细胞白血病患者的疾病有一定程度的缓解。

图10为血象分析CAR19-NKT细胞对进展期CD19阳性的急性B淋巴细胞白血病患者的治疗过程中乳酸脱氢酶的变化，结果表明，CAR19-NKT细胞治疗后乳酸脱氢酶的水平逐渐降低，说明CAR19-NKT细胞对进展期CD19阳性的急性B淋巴细胞白血病患者治疗后，患者的疾病有一定程度的缓解。

图11为流式细胞术分析CAR19-NKT细胞治疗前后患者外周血中CD19阳性细胞的数目变化(即CD19阳性细胞占细胞总量的百分比)趋势图(图11中，CD19CD20是白血病细胞的表达抗原，白血病细胞表达CD19的同时可能表达CD20)，结果显示，CAR19-NKT细胞治疗后的一个月开始外周血中CD19阳性细胞的数目恢复到正常水平，并持续大约一个月，说明CAR19-NKT细胞能够对进展期CD19阳性的急性B淋巴细胞白血病患者的外周血中CD19阳性的B淋巴白血病细胞发挥明显的杀伤活性。

图12为流式细胞术分析CAR19-NKT细胞治疗前(左图)与治疗1月后(右图)的骨髓中CD19阳性细胞数目变化，结果显示，与治疗前相比，治疗1月后骨髓中CD19阳性细胞数目明显减少，说明CAR19-NKT细胞能够对进展期CD19阳性的急性B淋巴细胞白血病患者的骨髓中CD19阳性的B淋巴白血病细胞发挥明显的杀伤活性。

另外，与实施例1.1所制备的NKT细胞相比，采用实施例1.2所制备的NKT细胞时，相应的CAR19-NKT细胞的治疗效果显著更佳。这表明，当CD3⁺CD8⁺NKT细胞/CD3⁺CD4⁺NKT细胞的比率和/或CD3⁺CD56⁺NKT细胞/CD3⁺CD8⁺NKT细胞的比率处于根据本发明的优选范围时，对肿瘤细胞的杀伤力显著上升。

实施例6 CAR19-NKT细胞体外释放白介素2的能力分析

取1×10⁶个CD19ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的NKT细胞(即CAR19-NKT细胞)，CD19ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的T细胞(CAR19-T细胞)和实施例1.2中培养的NKT细胞接种于25厘米的细胞培养瓶进行培养，并持续收集细胞上清，采用ELISA试剂盒分析细胞分泌白介素2的水平，见图13。结果显示与普通T细胞制备的CART19相比，CAR19-NKT细胞在体外能持续分泌白介素2细胞因子，具有独特的非依赖IL-2性的扩增能力，避免了临床使用时体外补充IL-2。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (9)

1.一种嵌合抗原受体(CAR)，其特征在于，所述嵌合抗原受体以CD8的绞链区和跨膜区及CD137和CD3ζ的胞内信号结构域串联而成的结构为信号传导结构域；其中所述嵌合抗原受体为CD19ScFv-CD8-CD137-CD3ζ，由CD19ScFv、CD8的铰链区和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域串联构成，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述的嵌合抗原受体(CAR)。

3.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求2中所述的核酸分子。

4.如权利要求3所述的载体，其特征在于，所述载体为慢病毒载体。

5.一种细胞，其特征在于，所述的宿主细胞中含有权利要求3中所述的载体或染色体中整合有外源的权利要求2中所述的核酸分子。

6.一种药物组合物，其特征在于，所述组合物含有药学上可接受的载体以及权利要求1中所述的嵌合抗原受体、权利要求2中所述的核酸分子、权利要求3中所述的载体、或权利要求5中所述的细胞。

7.权利要求1中所述的嵌合抗原受体、权利要求2中所述的核酸分子、权利要求3中所述的载体、或权利要求5中所述的细胞的用途，其特征在于，用于制备治疗肿瘤的药物或制剂。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤包括白血病。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述白血病是指进展期CD19阳性的急性B淋巴细胞白血病。