KR20220047639A - 세포 치료 방법 - Google Patents

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재스민 라헤르트
크리스토프 헤스
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유니버시타트 바셀
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Abstract

본 발명은 세포 요법 분야에 관한 것으로서, 환자의 암 및/또는 바이러스 감염을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명은 적어도 하나의 철 조절 단백질을 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드, 및 선택적으로 키메라 항원 수용체를 포함하는 림프구를 제공한다. 본 발명은 추가로 이들 림프구를 제조하고, 이를 환자에게 투여하는 방법을 제공한다.

Description

세포 치료 방법
본 발명은 세포 요법 (cell therapy) 분야에 관한 것으로서, 환자의 암 및/또는 바이러스 감염을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명은 적어도 하나의 철 조절 단백질 (iron regulatory protein)을 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드, 및 선택적으로 키메라 항원 수용체 (chimeric antigen receptor)를 포함하는 림프구 (lymphocytes)를 제공한다. 본 발명은 추가로 이들 림프구를 제조하고, 이를 환자에게 투여하는 방법을 제공한다.
지난 수십 년 동안, 암의 발생 및 치료에 있어서 면역계의 잠재력은 연구의 주요 중점이 되었다. 면역 체크포인트 차단을 사용한 면역요법 및 표적 요법은 많은 암 환자들의 생존율을 크게 향상시켰지만, 여전히 이들 요법에 대해 환자들의 높은 비율에서 질병 진행이 발생하였다. 입양 세포 요법 (Adoptive cell therapy: ACT)은 이러한 환자들에게 추가적인 치료 옵션을 제공할 수 있으며, 항-종양 기능을 매개하기 위해 종양-상주 (tumor-resident) 또는 말초 혈액 변형된 면역 세포를 암 환자에게 정맥내 전달하는 것을 포함한다. 현재, ACT는 고유의 작용 기전에 따라 3가지 상이한 타입으로 분류될 수 있으며, 즉 종양-침윤 림프구 (tumor-infiltrating lymphocytes: TIL)를 사용하는 ACT, T 세포 수용체 (T cell receptor: TCR) 유전자 요법을 사용하는 ACT, 및 키메라 항원 수용체 (chimeric antigen receptor: CAR) 변형된 T 세포를 사용하는 ACT가 있다. 다른 면역 세포 타입 예컨대 자연 살해 세포 (natural killer cells)의 세포 요법에 대한 기초로서의 사용이 또한 현재 연구 영역이다.
TIL을 사용한 첫 연구는 미국 국립보건원 외과 분과 (SB, NIH, Bethesda, Maryland, US)의 Rosenberg와 동료들에 의해 수행되었으며, 여기서 TIL은 다양한 뮤린 (murine) 종양으로부터 성장하였고, 인 비보에서 항-종양 활성을 보였다. 현재 TIL 요법은 절제된 종양 물질 유래 TIL의 엑스 비보 증식, 림프고갈성 예비 요법 (lymphodepleting preparative regimen) 후에 환자로의 입양 전달 및 후속하는 인터루킨-2 (IL-2)의 지원으로 구성된다. 이러한 요법을 통해, 몇몇 I/II상 임상 시험에서 전이성 흑색종 환자에서 약 50%의 현저한 객관적인 종양 반응이 달성되었다. 흑색종 환자에서 TIL을 사용한 성공 후에, 다른 고형 종양 타입 유래의 TIL 생성이 또한 연구되었다. 지금까지, 비-흑색종 종양 타입 예컨대 자궁경부암, 신세포암, 유방암 및 비-소세포 폐암 유래의 TIL을 다양한 비율의 종양 반응성으로 성장시키는 것이 가능하였다.
종양에서 자연 발생하는 TIL 및 이에-기반한 치료 옵션에 이어, ACT 사용을 위한 특정 종양 항원을 표적으로 하는 TCR을 발현하도록, 말초 혈액 T 세포를 단리하고, 인 비트로에서 유전자 변형시킬 수 있다. 이러한 방법을 사용하면, 종양 특이적 T 세포의 대규모 풀 (pool)을 생성할 수 있으며, 치료된 환자의 최대 30%에서 강력한 항-종양 활성 및 객관적 임상 반응이 관찰되었다. 변형된 TCR에 의한 인식을 위해서는 주조직 적합성 복합체 (major histocompatibility complex: MHC)를 통한 항원 제시가 필요하다. 그러나, 많은 암 타입이 이의 MHC 발현의 하향 조절 또는 소실에 의해 T 세포-매개 면역 반응을 회피할 수 있다는 것이 잘 알려져 있다. 종양-특이적 T 세포에 의한 인식을 위해 종양 세포에 MHC가 존재해야 할 필요성을 피하기 위해, 인공 수용체 예컨대 CAR 분자가 개발되었다. CAR-변형된 T 세포를 사용한 ACT는 TCR-변형된 T 세포와 동일한 이펙터 기능의 능력을 보유하지만, MHC 발현과는 무관하다. 단백질 항원의 사용 외에도, 탄수화물 또는 당지질 항원과 같은 다른 항원이 또한 탐색되었다. 혈액 악성 종양에서 CD19-특이적 CAR T 세포를 사용한 인상적인 임상 반응이 이미 확인되었고, 이는 고형 종양에서도 CAR 요법을 사용하는 연구로 이어졌다.
조혈 줄기세포 이식 (hematopoietic stem cell transplant: HSCT)은 많은 고위험 암 또는 원발성 면역결핍 증후군 환자에게 치료 기회를 제공하지만, 이식 수혜자는 장기간의 심각한 면역억제로 인해 감염 합병증에 취약하다. 이러한 위험들은 예비 요법, 이식 타입 및 골수억제 기간에 따라 변형된다. 컨디셔닝 요법 (conditioning regimens)의 진보 및 이식후 관리의 개선으로 인해, 불일치, 비-관련 또는 반수체 공여자 HSCT를 받을 자격을 가진 환자의 수가 증가하고 있다. 중증 또는 치료 불가능한 질병을 가진 환자에 대한 결과가 크게 개선되었지만, 이식 (engraftment) 및 적응되는 경우 이식편대 숙주 질환 (graft versus host disease: GVHD)을 치료하는데 필요한 면역억제는 감염을 발생시킬 수 있다. 구체적으로, 바이러스 감염은 상당한 이환율 및 사망률을 유발하며, T 세포 면역 재구성이 지연되면 위험은 증가한다. 면역억제, 면역 재구성, 및 GVHD의 영향, 및 감염 간의 관계는 복잡하게 얽혀 있다. 바이러스 감염에 대한 약리학적 치료 및 예방적 옵션은 제한적이며, 종종 비효과적이고, 특히 급성 신장 손상 및 골수억제의 이환율과 관련이 있다. 치료는 또한 저항성을 발생시킬 수 있으며, 연장된 보호를 제공하지 않으면 환자들은 바이러스 재활성화의 위험에 놓일 수 있다. T 세포 면역 회복의 지연 및 바이러스 질환 간의 상관 관계를 고려하여, 입양 세포 요법은 약물 요법에 대한 논리적 대안이다. 혈청양성 공여자 (seropositive donors)로부터의 비-조작된 림프구 주입은 EBV-관련 림프종과 같은 생명을 위협하는 질병을 가진 환자에게 주입되어, 주로 GVHD와 관련된 위험에서 임상 효능을 보여주었다. 이러한 전략은 지난 20년에 걸쳐 발전하였고, 공여자 림프구 산물은 바이러스 질환 (재활성화, 새로운 노출 및 림프종 포함)에 대한 치료 및 예방으로서 숙주에서 바이러스 면역을 재구성하는데 성공하였다. 이들 초기 연구 이후에, 바이러스-특이적 T 세포 (virus-specific T cell: VST) 선택 및/또는 확장은 바이러스 세포독성을 최대화하고, 동종이식편반응 (alloreactivity)을 최소화하여, GVHD의 위험을 감소 및 대부분 제거하도록 개선되었다. 현재 연구에서, VST는 표적 요법을 제공하며, 현재까지 매우 우수한 안전성 프로파일을 나타내었다.
자연 살해 세포 (NK 세포)는 이의 ACT에서의 잠재력에 대해 T 세포와 비교하여 더 적게 연구되었다. 그러나, NK 세포의 몇 가지 특성으로 인해 입양 세포 요법에 대한 이상적인 후보가 되었다. NK 세포는 높은 세포독성 이펙터인 것에 추가하여, 항원 특이성에 의해 제한되지 않으며, 적응 면역 반응을 강화하는 전염증성 사이토카인을 빠르게 생성한다.
암 환자 유래의 NK 세포는 종종 기능장애가 있어서, 증식 속도의 감소, 사이토카인 자극에 대한 반응의 감소, 및 이펙터 기능의 감소를 나타낸다. 따라서 초기 면역요법 전략은 내인성 NK 세포의 기능을 증진 또는 회복시키는 것을 목표로 하였다. 이러한 전략은 엑스 비보에서 자가 NK 세포의 IL-2-유도 활성화 다음에, 치료 과정 중에 조합된 IL-2 치료와 함께 환자에게의 재주입을 포함하였다. 불행하게도, IL-2-활성화 NK 세포는 종양 성장에 영향을 주지 않았고, 치료 요법은 심각한 부작용이 있었다. 암 환자 치료를 위한 동종 (allogeneic) NK 세포의 사용은 환자 NK 세포와 비교하여 더 유망하며, 이는 동종 NK 세포가 완전히 기능하기 때문이다. 또한, 동종 NK 세포는 이식편대 숙주 질환 (GvHD)을 일으키지 않고 이식편대 백혈병/종양 (GvL/GvT) 효과를 가지므로, 면역병리 (immunopathology)를 덜 유발한다.
특히 혈액 악성 종양, 예컨대 급성 골수성 림프종 (acute myeloid lymphoma: AML) 및 비-호지킨 림프종 (non-Hodgkin lymphoma: NHL)의 치료에서 임상 관련된 반응이 달성되었다. 그러나, NK 세포 단독의 활성으로는 종종 종양 성장을 완전히 제어하기에 충분하지 않으며; 고형 종양의 치료는 제한적 종양 미세환경 (restrictive tumor microenvironment)으로 인해 특히 어렵다. 따라서, NK 세포 기능을 증진시키는 전략이 광범위하게 연구되었다. NK 세포 항-종양 활성을 증진시키는 한 가지 접근법으로는 사이토카인의 활용이다. 입양 전달 전에 NK 세포의 인 비트로 확장 및 활성화를 위해 다양한 사이토카인 (IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21 및 타입 I 인터페론)이 사용되었다.
NK 세포 기능을 최대화하기 위한 한 가지 유망한 사이토카인 조합은 IL-12, IL-18 및 IL-15의 조합 사용이다. 이러한 조합을 사용한 자극으로 생존 연장 및 이펙터 기능 증진과 같은 "기억-유사 (memory-like)" 특성을 가진 NK 세포 집단을 유도하였다. 전임상 연구에 따르면, 사이토카인-강화 (cytokine-enhanced: CE) NK 세포는 항-백혈병 세포 요법으로서 상당한 잠재력을 갖는 것으로 나타났다. 림프종 또는 흑색종의 인 비보 종양 모델에서, CE NK 세포는 이펙터 기능 (IFN-γ 생성 및 세포독성)이 증진되었다. 또한, 면역결핍 NOD-SCID-γc -/- 마우스 (NSG)로의 입양 전달 후에, IL-2-강화된 CE NK 세포는 대조군 NK 세포와 비교하여 더 오래 지속되었다. 마지막으로, AML 이종이식된 NSG 마우스에서, CE NK 세포는 AML 부담을 실질적으로 감소시키고, 전체 생존율을 향상시켰다.
CE NK 세포의 이펙터 기능을 증가시키는 분자 기전은 현재 알려져 있지 않다. T 세포의 경우, 예컨대 나이브 CD8+ T 세포 대 기억 CD8+ T 세포 (naive CD8+ T cells vs. memory CD8+ T cell)와 같은 소정의 서브세트의 기능이 대사 조절의 상이한 기전과 연관된다는 것이 잘 확립되어 있다. 따라서, CE NK 세포의 변경된 대사 패턴은 기능 향상을 뒷받침할 수 있다. CE NK 세포의 분화 및 이의 우수한 이펙터 기능을 뒷받침하는 분자 기전을 규명하는 것은 임상 효능을 개선하기 위한 중요한 전제 조건이다.
일반적으로, 고도로 증식하는 세포는 에너지 대사작용/호흡, DNA 합성 및 복구, 세포 주기 조절과 같은 기저 과정을 지원하기 위해 철 (iron)에 엄격하게 의존한다. 림프구를 포함하여 세포를 증식시키는데 필요로 하는 다량의 철은 트란스페린 (transferrin)에 의해 제공되며, 이는 세포 표면 수용체 CD71을 통해 흡수된다. CD71은 통상 림프구 활성 마커로 사용되며, 활성화된 NK 세포에서 발현된다. 지금까지 림프구 기능에 대한 철 대사작용의 중요성을 조사한 연구는 거의 없었다. 최근에 CD71 수용체의 돌연변이 (TFRCY20H/Y20H)가 증식 장애로 인해 T 및 B 세포 기능을 손상시키는 것으로 밝혀졌다.
NK 세포 세포독성 및 기능장애 NK 세포를 손상시키기 위해 철 수준을 감소시키는 것이 제안되었으며, 이러한 환경은 래트 (rats)의 암 발병에 기여할 수 있다. 또한, 낮은 혈청 페리틴 (serum ferritin) 수준은 인간에서 NK 세포 활성 감소와 관련이 있었다. 그러나, NK 세포-매개 면역에 대한 철의 구체적인 영향은 아직 규정하기 어렵다.
세포의 철 항상성은 철 흡수, 활용 및 저장의 조정을 포함하는 엄격하게 조절되는 과정이다. 이는 주로 철 조절 단백질/철-반응성 요소 (iron regulatory protein/iron-responsive element: IRP/IRE) 조절 시스템에 의해 전사 후 수준으로 조절된다. IRP1 및 IRP2는 별개의 mRNA에서 IRE를 인식하고, 이에 의해 이들의 안정성 및 단백질로의 번역을 제어하는, RNA 결합 단백질이다. IRP1 및 IRP2의 활성은 세포의 철 수준에 대한 반응으로 조절된다. 표준 IRE (Canonical IRE)는 철 획득, 철 저장, 철 활용, ATP 생성 및 철 외수송을 코딩하는 mRNA의 5'UTR 또는 3'UTR에 존재한다.
철-결핍 조건하에, IRP 활성이 높고, IRP는 해당 mRNA의 5' 또는 3'UTR에 있는 IRE에 결합한다. IRE의 국재화에 따라, IRP는 단백질 발현에 상이하게 영향을 줄 수 있다. 5'UTR에 IRE를 보유하는 mRNA (예: FTH1 mRNA, 페리틴 경쇄 1)의 번역은 IRP 결합에 의해 억제된다. 대조적으로, IRP가 3'UTR IRE (예: TFRC mRNA, CD71)에 결합하면 mRNA가 안정화되고 번역이 향상된다. 따라서, IRP/IRE 조절 네트워크는 세포의 철 상태와 관련하여 소정의 mRNA의 번역을 선택적으로 조절함으로써 세포의 철 항상성을 조정한다.
최근 입양 세포 요법의 성공에도 불구하고, 이들 요법을 더 많은 환자가 이용할 수 있도록 이를 개선할 필요가 있다. 성공적인 입양 세포 요법의 일반적인 요건들 중 하나는 면역 세포가 주입된 후에 환자내에서 상기 면역 세포가 강력하게 확장되도록 하는 것이다. 이는 한편으로는 주입 횟수를 감소시키고, 다른 한편으로는 요법의 효능을 더 높일 수 있을 것이다. 따라서, 세포 요법과 관련된 개선된 수단 및 방법이 당해 분야에서 요구된다. 보다 구체적으로, 면역 세포가 대상체에게 투여된 후에 인 비보에서 강력하게 증식되는 면역 세포가 요구된다.
기술적 과제는 청구범위에 제공된 구체예에 의해 해결된다. 즉, 본 발명은 하기 항목에 관한 것이다:
1. 적어도 하나의 철 조절 단백질 (iron regulatory protein)을 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 림프구 (lymphocyte).
2. 항목 1에 있어서, 상기 림프구는 T 세포 또는 자연 살해 세포 (natural killer cell)인 것인 림프구.
3. 항목 1 또는 2에 있어서, 상기 적어도 하나의 철 조절 단백질은 항시적으로 (constitutively) 발현되는 것인 림프구.
4. 항목 1 내지 3 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 적어도 하나의 철 조절 단백질은 IRP1 (서열번호: 1) 및/또는 IRP2 (서열번호: 2-6)인 것인 림프구.
5. 항목 1 내지 4 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 림프구는 키메라 항원 수용체를 추가로 포함하는 것인 림프구.
6. 항목 5에 있어서, 상기 키메라 항원 수용체는 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인, 공동-자극 신호전달 영역 및 신호전달 도메인을 포함하는 것인 림프구.
7. 항목 6에 있어서, 상기 항원 결합 도메인은 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고, 구체적으로 상기 항원-결합 단편은 Fab 또는 scFv인 것인 림프구.
8. 항목 6 또는 7에 있어서, 상기 항원 결합 도메인은 종양 항원에 특이적으로 결합하는 것인 림프구.
9. 항목 8에 있어서, 상기 종양 항원은 표적 세포 집단 또는 조직의 세포 표면에 제시되는 것인 림프구.
10. 항목 1 내지 9 중 어느 한 항목에 따른 림프구 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
11. 치료 (therapy)에 사용하기 위한, 항목 1 내지 9 중 어느 한 항목에 따른 림프구 또는 항목 10에 따른 약학 조성물.
12. 암 치료에 사용하기 위한, 항목 1 내지 9 중 어느 한 항목에 따른 림프구 또는 항목 10에 따른 약학 조성물.
13. 항목 12에 있어서, 상기 암은 혈액암 또는 고형 종양이고, 구체적으로 상기 혈액암은 급성 림프모구 백혈병, 미만성 거대 B-세포 림프종, 호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병 또는 다발성 골수종이고, 상기 고형 종양은 결장암, 유방암, 췌장암, 난소암, 간세포 암종, 폐암, 신경모세포종, 교모세포종 또는 육종인 것인 림프구 또는 약학 조성물.
14. 바이러스 감염을 예방 및/또는 치료하는데 사용하기 위한, 항목 1 내지 9 중 어느 한 항목에 따른 림프구 또는 항목 10에 따른 약학 조성물.
15. 항목 14에 있어서, 상기 바이러스 감염은 인간 면역결핍 바이러스 (human immunodeficiency virus: HIV), 아데노바이러스 (adenoviruses), 폴리오마바이러스 (polyomaviruses), 인플루엔자 바이러스 (influenza virus) 또는 인간 헤르페스바이러스 (human herpesvirus)에 의해 유발되고, 구체적으로 상기 인간 헤르페스바이러스는 거대세포바이러스 (cytomegalovirus: CMV), 엡스타인-바 바이러스 (Epstein-Barr virus: EBV), 단순 헤르페스 바이러스 (herpes simplex virus: HSV), 바리젤라-조스터 바이러스 (Varizella-Zoster virus: VZV) 또는 인간 헤르페스바이러스 8 (human herpesvirus 8: HHV8)인 것인 림프구 또는 약학 조성물.
16. 암을 가진 대상체를 치료하는 방법, 또는 대상체에서 바이러스 감염을 예방 및/또는 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 대상체에게 항목 1 내지 7 중 어느 한 항목에 따른 림프구 또는 항목 10에 따른 약학 조성물을 치료적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하는 방법.
17. 항목 16에 있어서, 상기 암은 혈액암 또는 고형 종양이고, 구체적으로 상기 혈액암은 급성 림프모구 백혈병, 미만성 거대 B-세포 림프종, 호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병 또는 다발성 골수종이고, 상기 고형 종양은 결장암, 유방암, 췌장암, 난소암, 간세포 암종, 폐암, 신경모세포종, 교모세포종 또는 육종인 것인 방법.
18. 항목 16에 있어서, 상기 바이러스 감염은 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 아데노바이러스, 폴리오마바이러스, 인플루엔자 바이러스 또는 인간 헤르페스바이러스에 의해 유발되고, 구체적으로 상기 인간 헤르페스바이러스는 거대세포바이러스 (CMV), 엡스타인-바 바이러스 (EBV), 단순 헤르페스 바이러스 (HSV), 바리젤라-조스터 바이러스 (VZV) 또는 인간 헤르페스바이러스 8 (HHV8)인 것인 방법.
19. 항목 1 내지 9 중 어느 한 항목에 따른 림프구를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은:
a) 대상체로부터 수득된 림프구를 제공하는 단계;
b) 적어도 하나의 철 조절 단백질을 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드를 림프구로 도입하는 단계; 및
c) 상기 합성 폴리뉴클레오티드에 코딩된 유전자(들)를 발현시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
20. 항목 19에 있어서, 키메라 항원 수용체를 코딩하는 제2 합성 폴리뉴클레오티드가 단계 (b)에서 도입되는 것인 방법.
21. 항목 20에 있어서, 상기 키메라 항원 수용체를 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드가 적어도 하나의 철 조절 단백질을 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드와 조합되는 것인 방법.
22. 항목 19 내지 21 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 림프구의 활성화는 적어도 하나의 합성 폴리뉴클레오티드가 상기 림프구로 도입되기 전 또는 후에 수행되는 것인 방법.
23. 항목 19 내지 22 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 적어도 하나의 합성 폴리뉴클레오티드는 상기 림프구로, 바이러스 형질도입, 구체적으로 레트로바이러스 형질도입에 의해 도입되는 것인 방법.
따라서, 일 구체예에서, 본 발명은 적어도 하나의 철 조절 단백질을 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 림프구에 관한 것이다.
즉, 본 발명은 CD71-매개 철 흡수가 활성화된 NK 세포에 대한 주요 대사 체크포인트로, 세포 증식과 관련하여 go/no-go 게이트키퍼 (go/no-go gatekeeper)로서 작용한다는 놀라운 발견에 기반한다. 사이토카인-강화 (CE) NK 세포에서, 과잉 수준의 철 조절 단백질은 예기치 않게 가성 철 결핍 상태 (pseudo iron deficient state)를 형성하여, 이에 의해 CD71의 번역을 선택적으로 향상시키므로, 상기 세포의 증식을 증가시킨다.
CE NK 세포의 증진된 이펙터 기능을 담당하는 분자 기전은 지금까지 알려져 있지 않다. 실시예 2에서 CD71의 발현이 나이브 (naive: NV) NK 세포와 비교할 때, IL-12 및 IL-18 및 종양 표적 세포에 의한 자극에 반응하여 CE NK 세포에서 유의미하게 더 높은 것을 구체적으로 보여주었다 (도 2B, 2C 및 2D). 실시예 5에서, CD71을 코딩하는 TFRC 유전자의 전사는 NV NK 세포 및 CE NK 세포 모두의 사이토카인에 의한 활성화 시에, CE NK 세포에서 더 높은 정도로 유도되는 것을 추가로 보여주었다 (도 5B). TFRC mRNA 발현이 더 높으면 NV NK 세포와 비교하여, CE NK 세포에서 단백질 발현 증가로 직접 번역된다 (도 2B 및 C). 따라서, 실시예 6에서 철 조절 단백질 (IRP)인 IRP1 및 IRP2의 발현 수준은 NV NK 세포와 비교하여 CE NK 세포에서 더 높은 것을 보여주었다 (도 6A). IRP는 후자의 안정화를 통해 TFRC mRNA의 번역을 조절하는데 관여하는 것으로 알려져 있으므로, NV NK 세포와 비교하여 CE NK 세포에서 CD71 단백질의 더 많은 양은 이들 세포에서 더 많은 양의 IRP에 의해 유발된다는 결론을 내릴 수 있었다. IRP의 발현은 세포의 철 수준에 반응하여 조절되는 것으로 알려져 있기 때문에 이러한 발견은 놀라운 것이다. 그러나, CE NK 세포에서 IRP의 발현은 주변 배지 중에 철이 풍부함에도 불구하고 상향 조절되고, 이에 의해 가성 철 결핍 상태를 형성한다. 자극 시에, 이러한 가성 철 결핍 상태는 CD71 mRNA의 안정화를 증가시켜서 CD71 단백질 발현을 증가시키고, 그러므로 증식을 유도한다.
이러한 발견에 기반하여, 본 발명자들은 림프구 예컨대 NK 세포 또는 T 세포에서 가성 철 결핍 상태를 유도함으로써 증식을 증가시키고, 따라서 대상체에게 투여한 후에 결과로 발생하는 이펙터 집단이 더 크다는 결론을 내렸다. 인 비보 적용에서 종종 제어하기 어렵거나 또는 심지어 제어가 불가능한 사이토카인 및/또는 피더 세포주 (feeder cell lines)로 림프구를 필수적으로 처리하는 대신에, 본 발명은 적어도 하나의 IRP를 상기 림프구에서 과발현시킴으로써 림프구에서 가성 철 결핍 상태를 유도하는 독창적인 해결책을 제공한다. 따라서, 본 발명에 따른 IRP-과발현하는 가성 철 결핍 림프구는 IRP를 과발현하지 않는 림프구와 비교하여, 기능 증진, 구체적으로 증식이 증진되었다. 따라서, 대안의 구체예에서, 본 발명은 적어도 하나의 철-조절 단백질을 과발현하는 림프구에 관한 것이다.
본 발명자들은 IRP의 강제 발현이 상이한 타입의 림프구의 증식을 증가시킨다는 것을 입증하였다. 예를 들어, 본 발명자들은 IRP2 (서열번호: 2; NCBI RefSeq: NM_004136.4)의 렌티바이러스 과발현이 CD71의 발현을 증가시키고, 더 중요하게는 Jurkat T 세포의 증식을 증가시켰음을 보여주었다 (도 8F). 또한, 본 발명자들은 렌티바이러스 과발현이 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 CD71의 발현을 유도하였음을 보여주었다 (도 8G 및 H). 더욱이, 본 발명자들은 CAR T 세포에서 IRP2의 렌티바이러스 과발현이 항원으로 자극 시에 CAR T 세포의 증식을 증가시키는 반면에, IRP2의 과발현은 미자극된 CAR T 세포의 증식에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여주었다 (도 8K).
따라서, 본 발명자들은 CD71 발현에 대한 IRP의 조절 효과, 및 CD71 발현과 세포 증식 사이의 상관관계가 상이한 타입의 림프구, 구체적으로 T 세포 및 NK 세포 사이에서 잘 보존된다는 것을 설득력 있게 입증하였다. 이러한 발견의 관점에서, 림프구에서 IRP의 과발현은 상기 림프구의 증식 증가를 초래한다는 결론을 내렸다. 따라서, IRP의 강제 과발현은 림프구-기반 치료 과정에서 환자에게 주입된 림프구의 강력한 인 비보 증식을 달성하는 매력적인 전략인 것으로 보인다.
철-반응성 요소-결합 단백질 (iron-responsive element-binding proteins)로서 알려진 IRP는 철-반응성 요소 (IRE)에 결합하고, 이에 의해 인간의 철 대사작용을 조절하는 단백질이다. 인간에서는 IRP1 및 IRP2라는 2가지 상이한 IRP들이 서술되었다. IRP1 대 IRP2의 활성은 별개의 방식으로 조절된다. IRP1은 철-황 클러스터 (iron-sulfur cluster)를 함유하고, 철이 풍부한 조건에서 세포질 아코니타제 (cytosolic aconitase)로 기능한다. 철이 부족하면, 철-황 클러스터는 철이 결핍되고, IRP1은 이의 입체형태를 변경하여, mRNA의 IRE에 결합할 수 있게 된다. 대조적으로, IRP2는 상대적 철 과잉 시에 유비퀴틴 프로테아좀 시스템 (ubiquitin proteasome system)에 의해 빠르게 분해된다. 철-고갈 상태에서, 어댑터 단백질 FBXL5가 분해되어 IRP2 수준이 증가한다. 따라서, 상기 유비퀴틴 리가제 (ubiquitin ligase)는 철 센서 및 철 항상성의 조절인자로서 기능한다. IRP1 및 IRP2의 활성에 있어서 조직 특이적 변이가 설명되었으며, IRP1 및 IRP2 녹아웃 마우스는 별개의 표현형을 갖는다.
본원에서 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드 (polynucleotide)"는 포스포디에스테르 결합에 의해 연결된 뉴클레오티드들의 서열을 지칭한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보핵산 (DNA) 분자 또는 리보핵산 (RNA) 분자일 수 있다. 뉴클레오티드 염기는 본원에서 단문자 코드로, 아데닌 (A), 구아닌 (G), 티민 (T), 시토신 (C), 이노신 (I) 및 우라실 (U)로 표시된다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려진 표준 기술을 사용하여 제조될 수 있다.
본원에서 사용된 "합성 폴리뉴클레오티드 (synthetic polynucleotide)"는 비-천연 기원 (non-natural origin)으로, 림프구에 통합되는 폴리뉴클레오티드이다. 합성 폴리뉴클레오티드는 중합효소 연쇄 반응을 포함한 재조합 기술, 또는 화학 합성에 의해 제조될 수 있다. 당업자라면 특정 폴리뉴클레오티드 서열을 가진 합성 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방법을 알고 있다. 또한, 당업자는 합성 폴리뉴클레오티드를 림프구에 통합하는 방법을 알고 있다. 본 발명 내에서, 상기 합성 폴리뉴클레오티드는 IRP를 코딩하는 적어도 하나의 유전자 또는 코딩 서열을 포함하는 것이 바람직하며, 여기서 상기 적어도 하나의 유전자 또는 코딩 서열은 적어도 하나의 조절 요소, 예를 들어 프로모터에 작동 가능하게 연결되며, 이는 적어도 하나의 IRP를 코딩하는 내인성 유전자와 자연적으로 회합되지 않는다. 이러한 합성 폴리뉴클레오티드는 여러 전략에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어, IRP를 코딩하는 내인성 유전자와 자연적으로 회합되지 않는 다른 조절 요소 또는 프로모터의 제어하에 있는 IRP를 코딩하는 유전자 또는 코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 림프구로 통합될 수 있다. 대안으로서, IRP를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 림프구의 게놈 내로 통합될 수 있어서, 이는 IRP를 코딩하는 내인성 유전자와 자연적으로 회합되지 않는 조절 요소에 작동 가능하게 연결되도록 한다. 추가로, 본 발명의 합성 폴리뉴클레오티드는 또한 IRP를 코딩하는 내인성 유전자와 자연적으로 회합되지 않는 조절 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 림프구로 통합하여 수득될 수 있으며, 이로써 이러한 조절 요소는 IRP를 코딩하는 림프구의 내인성 유전자에 작동 가능하게 연결될 것이다. 대안으로서, 본 발명의 합성 폴리뉴클레오티드는 또한 림프구의 내인성 IRP 유전자의 발현이 변경되도록, 유전 공학 또는 게놈 편집 방법에 의해 IRP를 코딩하는 유전자의 내인성 조절 요소를 변형시킴으로써 수득될 수 있다. 예를 들어, IRP를 코딩하는 내인성 유전자의 조절 요소, 예를 들어 프로모터는 IRP를 코딩하는 유전자가 림프구에서 항시적으로 발현되도록 변형될 수 있다. 유전 공학 방법이 당해 분야에 잘 알려져 있으며, CRISPR/Cas9, 또는 조작된 뉴클레아제, 예컨대 메가뉴클레아제 (meganucleases), 징크 핑거 뉴클레아제 (zinc finger nucleases) 또는 TALEN의 사용을 포함한다.
용어 "작동 가능하게 연결된 (operably linked)"은 조절 서열 및 이종 핵산 서열 간에 기능적으로 연결되어 상기 이종 핵산 서열의 발현을 초래하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 관계에 있는 경우 상기 제1 핵산 서열은 상기 제2 핵산 서열과 작동 가능하게 연결된다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미치는 경우 상기 프로모터는 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일반적으로, 작동 가능하게 연결된 DNA 서열은 연속적이며, 2개의 단백질 코딩 영역을 결합하는데 필요한 경우, 동일한 리딩 프레임내에 있다. 본원에서 사용된 용어 "프로모터 (promoter)"는 폴리뉴클레오티드 서열의 특정 전사를 개시하는데 필요한, 세포의 합성 기구, 또는 도입된 합성 기구에 의해 인식되는 DNA 서열로 정의된다.
세포, 예를 들어 림프구는 합성 폴리뉴클레오티드가 세포 내부에 존재하는, 즉 세포의 세포질막에 의해 봉입된 경우 합성 폴리뉴클레오티드를 포함한다고 한다. 상기 합성 폴리뉴클레오티드는 당해 분야에 알려진 임의의 형태로 및 임의의 방법에 의해 세포로 전달될 수 있다. 예를 들어, 상기 합성 폴리뉴클레오티드는 원형 DNA 벡터의 일부, 예컨대 플라스미드로서, 선형 DNA의 형태 또는 이의 일부로서, 또는 mRNA의 형태 또는 이의 일부로서 세포 내부에 존재할 수 있다. 그러나, 상기 합성 폴리뉴클레오티드가 DNA로서 림프구의 게놈에 통합되는 것이 바람직하다.
용어 "코딩 (encoding)"은 생물학적 과정에서 정의된 뉴클레오티드 서열 (즉, rRNA, tRNA 및 mRNA) 또는 정의된 아미노산 서열을 갖는 다른 폴리머 및 거대분자의 합성을 위해 주형으로서 제공되는, 코딩 서열, 유전자, cDNA 또는 RNA와 같은 폴리뉴클레오티드 중 뉴클레오티드의 특정 서열의 고유한 특성 및 이로부터 생성되는 생물학적 특성을 지칭한다. 따라서, 코딩 서열 또는 유전자의 mRNA로의 전사, 및 해당 코딩 서열 또는 유전자에 상응하는 mRNA의 번역이 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질을 생성하는 경우, 상기 코딩 서열 또는 유전자는 단백질을 코딩한다. mRNA 서열과 동일하고 통상 서열 목록에 제공되는 뉴클레오티드 서열인 코딩 가닥 (coding strand), 및 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로서 사용되는 비-코딩 가닥 (non-coding strand) 모두는 단백질 또는 이의 다른 산물, 코딩 서열, 유전자 또는 cDNA를 코딩하는 것으로 지칭될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "코딩 서열 (coding sequence)"은 적절한 조절 또는 발현 조절 서열의 제어하에 있는 경우 전사되고 폴리펩티드로 번역되는 핵산 서열을 지칭한다. 본원에서 사용된 용어 "유전자 (gene)"는 DNA 서열을 지칭하고, 이는 mRNA로 전사될 수 있고 폴리펩티드 사슬로 번역될 수 있거나, rRNA 또는 tRNA로 전사되거나, 또는 DNA 복제, 전사 및 조절에 관여하는 효소 및 기타 단백질에 대한 인식 부위로 제공될 수 있는 DNA 서열을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 용어 "유전자 (gene)"는 통상 mRNA 전사체로부터 스플라이싱된 모든 인트론 및 다른 DNA 서열을, 내인성 맥락에서 사용되는 경우 대체 스플라이스 부위로부터 유래하는 변이체와 함께 포함하는 것으로 이해된다. 그러나, 용어 "유전자"가 합성 폴리뉴클레오티드의 맥락에서 사용되는 경우, 해당 용어는 유전자의 스플라이싱된 mRNA 변이체 또는 유전자의 스플라이싱된 mRNA로부터 유래된 cDNA와 서열이 일치하는 코딩 서열을 추가로 포함하는 것으로 광의적으로 이해된다.
본원에서 사용된 용어 "림프구 (lymphocyte)"는 림프성 줄기세포 (lymphoid stem cells)로부터 유래되는 혈액, 림프 및 림프 조직에서 발견되는 임의의 단핵 비-포식세포성 백혈구 (mononuclear non-phagocytic leukocytes)를 지칭하고; 림프구는 자연 살해 세포 (NK 세포; 세포-매개되어 기능하는 경우, 세포독성 선천성 면역), T 세포 (세포-매개되는 경우, 세포독성 적응 면역), 및 B 세포 (체액의 경우, 항체-유도 적응 면역)를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 림프구는 NK 세포 또는 T 세포이다. 따라서, 바람직한 일 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 림프구에 관한 것으로서, 상기 림프구는 T 세포 또는 자연 살해 세포이다.
T 세포는 흉선에서 발달하고 면역 반응에서 중심적인 역할을 하는 일종의 림프구이다. T 세포는 다른 림프구와, 세포 표면에 T 세포 수용체의 존재에 의해 구별될 수 있다. 이들 면역 세포는 골수로부터 유래한 전구 세포로서 기원하여 흉선으로 이동한 후에 여러 별개의 T 세포 타입으로 발전한다. T 세포 분화는 흉선을 떠난 후에도 계속된다. 본 발명의 림프구는 임의의 T 세포, 예를 들어 헬퍼 CD4+ T 세포, 세포독성 CD8+ T 세포, 기억 T 세포, 조절 CD4+ T 세포, 자연 살해 T 세포 또는 감마 델타 T 세포일 수 있다. 소정의 구체예에서, 본 발명에 따른 T 세포는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포이고, 선택적으로 상기 CD4+ 또는 CD8+ T 세포는 키메라 항원 수용체를 포함한다.
자연 살해 세포 또는 NK 세포는 선천 면역계에 중요한 세포독성 림프구 타입이다. 상기 NK 세포의 역할은 척추동물의 적응 면역 반응에서 세포독성 T 세포의 역할과 유사하다. NK 세포는 바이러스-감염된 세포에 대해 신속하게 반응하여, 감염 후 약 3일차에 작용하며, 종양 형성에 반응한다. 이들은 사전 감작화 (sensitization) 없이 종양 세포를 용해하는 능력의 초기 개념 때문에 "자연 살해자 (natural killers)"로 명명되었다. NK 세포의 억제 수용체는 유핵 세포의 표면에서 편재적으로 발현되는 대부분의 주조직 적합성 클래스 I (MHC 클래스 I) 분자와 결합한다. MHC 클래스 I을 높은 수준으로 발현하는 건강한 세포는 자가-내성 (self-tolerance)을 유지하여, NK 세포 사멸로부터 보호된다. 대조적으로, 바이러스 감염 또는 악성 형질전환은 억제 신호를 제거함으로써 NK 세포 활성화를 유발한다. NK 세포 수용체를 활성화시키면 바이러스-감염된 세포 또는 악성 세포에서 스트레스-유도 리간드 (stress-induced ligands)를 인식하였다. 이들 자극 리간드의 표적 세포에서의 발현은 억제 수용체에 의해 전달되는 항시적 억제를 극복하여 NK 세포를 활성화시킬 수 있다.
본 발명 내에서, 상기 림프구는 임의의 림프구일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 림프구는 T 세포 또는 NK 세포이다. 따라서, 일 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 림프구에 관한 것으로서, 상기 림프구는 T 세포 또는 NK 세포이다. 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 림프구에 관한 것으로서, 상기 림프구는 세포독성 CD8+ T 세포, 헬퍼 CD4+ T 세포 또는 NK 세포이다. 추가 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 림프구에 관한 것으로서, 상기 림프구는 세포독성 CD8+ T 세포 또는 NK 세포이다. 추가 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 림프구에 관한 것으로서, 상기 림프구는 세포독성 CD8+ T 세포이다. 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 림프구에 관한 것으로서, 상기 림프구는 헬퍼 CD4+ T 세포이다.
일 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 림프구에 관한 것으로서, 상기 림프구는 종양 침윤 림프구, 변형된 TCR을 포함하는 T 세포 또는 바이러스-특이적 T 세포이다.
즉, 상기 림프구는 세포 요법 적용에 적합한 림프구, 예컨대 TIL, 변형된 TCR을 포함하는 T 세포 또는 바이러스-특이적 T 세포이다. 바람직하게는, 상기 TIL, 변형된 TCR을 포함하는 T 세포 또는 바이러스-특이적 T 세포는 적어도 하나의 철 조절 단백질을 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 바람직하게는 상기 철 조절 단백질은 IRP1 및/또는 IRP2이며, 더 바람직하게는 상기 철 조절 단백질은 IRP2이고, 더욱 바람직하게는 상기 철 조절 단백질은 서열번호: 2에 제시된 바와 같은 IRP2이다.
소정의 구체예에서, 본 발명의 림프구는 종양-침윤 림프구 (TIL)일 수 있다. TIL은 혈류를 떠나 종양을 향해 이동하는 백혈구이다. 이들은 T 세포 및 B 세포를 포함하며, 단핵 및 다형핵 면역 세포들 (예: T 세포, B 세포, 자연 살해 세포, 마크로파지, 호중구, 수지상 세포, 비만 세포, 호산구, 호염기구 등)을 다양한 비율로 구성하는 '종양-침윤 면역 세포'의 더 큰 카테고리의 일부이다. 이들의 풍도 (abundance)는 종양 타입 및 병기에 따라 다르며, 일부 사례에서 질병 예후와 관련이 있다. TIL은 세포 요법에 사용될 수 있으며, 여기서 TIL은 환자의 종양으로부터 단리되고, 엑스 비보 확장된다. 그 다음에 확장된 TIL은 특이적 종양 인식에 대해 분석될 수 있고, 그 다음에 종양 특이적 TIL은 선택적으로 추가 확장 단계 후에, 환자에게 재주입될 수 있다.
본 발명 내에서, 적어도 하나의 철 조절 단백질을 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드는 환자, 구체적으로 환자 종양으로부터 입수된 TIL 내로 엑스 비보 도입될 수 있다. IRP 과발현 TIL은 암 치료 과정에서, 바람직하게는 1회 이상의 추가 확장 및/또는 선택 단계들 후에 환자에게 주입될 수 있다.
본 발명의 소정의 구체예에서, 본 발명의 림프구는 변형된 T 세포 수용체 (TCR)를 포함하는 T 세포일 수 있다. 용어 "변형된 T 세포 수용체를 포함하는 T 세포 (T cell comprising a modified T cell receptor)" 또는 "TCR-변형된 T 세포 (TCR-modified T cell)"는 특정 TCR을 발현하도록 유전자 변형된 T 세포를 지칭한다. TCR-변형된 T 세포는 대상체로부터 T 세포의 집단을 수득하고, 상기 T 세포의 집단에 T 세포 수용체를 코딩하는 유전 요소를 도입함으로써 생성될 수 있다. 상기 TCR은 자연 발생하는 TCR 또는 조작된 TCR일 수 있다.
TCR-변형된 T 세포는 세포 요법에 사용되어, 특정 항원, 예를 들어 환자의 종양이 생성하는 것으로 확인된 항원에 대한 환자의 면역 반응을 증가시킬 수 있다. TCR-변형된 T 세포의 집단에서 철 조절 단백질, 바람직하게는 IPR1 및/또는 IPR2, 더 바람직하게는 IPR2를 과발현시키면, 환자에게 주입되는 경우 이들 T 세포의 보다 강력한 인 비보 증식을 초래할 수 있고, 따라서 상기 환자에서 TCR에 의해 인식되는 항원에 대한 면역 반응을 더 강하게 유발할 수 있다. 본 발명의 TCR-변형된 T 세포는 임의의 T 세포 타입일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 TCR-변형된 T 세포는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포이다.
본 발명의 소정의 구체예에서, 본 발명에 따른 림프구는 바이러스-특이적 T 세포이다. "바이러스-특이적 T 세포 (virus-specific T cell)"는 바이러스 항원으로 자극된 T 세포, 예를 들어 CD4+ 또는 CD8+ T 세포이다. 환자에게 투여되는 경우, 바이러스-특이적 T 세포를 사용하여 환자의 바이러스 감염을 치료할 수 있다. 바이러스-특이적 T 세포의 집단에서 철 조절 단백질, 바람직하게는 IRP1 및/또는 IRP2, 더 바람직하게는 IRP2를 과발현시키면, 환자에게 주입되는 경우 이들 T 세포의 더 강력한 인 비보 증식을 초래할 수 있고, 따라서 상기 환자에서 TCR에 의해 인식되는 항원에 대한 면역 반응을 더 강하게 유발할 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 림프구에 관한 것으로서, 상기 적어도 하나의 철 조절 단백질은 항시적으로 발현된다.
합성 폴리뉴클레오티드에 코딩되고 본 발명에 따른 세포에 포함되는 적어도 하나의 IRP는 임의의 프로모터 또는 당해 분야에 알려져 있는 임의의 조절 요소에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 따라서, 상기 적어도 하나의 IRP는 항시적으로 발현, 즉 대부분의 경우 대부분의 세포 타입에서 발현될 수 있거나, 또는 유도적으로 발현, 즉 소정의 생리학적 조건하에 및/또는 특정 신호 및/또는 인듀서 분자 (inducer molecule)에 대한 반응으로만 발현될 수 있다. 그러나, 본 발명 내에서, 상기 적어도 하나의 IRP는 항시적으로 발현되는 것이 바람직하다. 대안으로서, 상기 적어도 하나의 IRP는 세포 요법 적용에서 자주 겪게되는 조건하에, 예를 들어 림프구의 활성화와 관련된 신호, 분자 및/또는 과정에 의해 유도적으로 발현될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "발현 (expression)"은 표적 세포에서 원하는 최종-산물 분자의 생성을 지칭한다. 상기 최종-산물 분자는 예를 들어 RNA 분자, 펩티드, 단백질 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 본 발명 내에서, 상기 최종-산물은 바람직하게는 철 조절 단백질이다.
"항시성 (constitutive)" 프로모터는 유전자 산물을 코딩하거나 또는 특정하는 폴리뉴클레오티드와 작동 가능하게 연결되는 경우, 세포의 대부분 또는 모든 생리학적 조건하에 유전자 산물이 세포에서 생성되도록 하는 뉴클레오티드 서열이다.
적합한 프로모터의 일례로는 급초기 (immediate early) 거대세포바이러스 (CMV) 프로모터 서열이다. 이러한 프로모터 서열은 작동 가능하게 연결된 임의의 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 높은 수준으로 유도할 수 있는 강력한 항시성 프로모터 서열이다. 적합한 프로모터의 다른 예로는 신장 성장 인자-1a (Elongation Growth Factor-1a: EF-1a)이다. 그러나, 유인원 바이러스 40 (simian virus 40: SV40) 초기 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 (mouse mammary tumor virus: MMTV), 인간 면역결핍 바이러스 (human immunodeficiency virus: HIV) 긴 말단 반복 (long terminal repeat: LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, 엡스타인-바 (Epstein-Barr) 바이러스 급초기 프로모터, 라우스 육종 (Rous sarcoma) 바이러스 프로모터를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다른 항시성 프로모터 서열 뿐만 아니라, 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 헤모글로빈 프로모터 및 크레아틴 키나제 프로모터를 포함하지만 이에 한정되지 않는 인간 유전자 프로모터가 또한 사용될 수 있다.
따라서, 소정의 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 림프구에 관한 것으로서, 상기 적어도 하나의 철 조절 단백질을 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드는 항시성 프로모터의 제어하에 있다.
단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시하는데 항시성 프로모터가 역할을 하는 경우, 상기 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 "항시성 프로모터의 제어하에 (under control of a constitutive promoter)" 있다. 당업자는 예를 들어 분자 클로닝 (molecular cloning) 방법에 의해, 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 프로모터의 제어하에 두는 방법을 알고 있다.
상기 항시성 프로모터는 당해 분야에 알려진 임의의 항시성 프로모터, 바람직하게는 포유동물 세포, 더 바람직하게는 인간 세포에서 전사를 개시하는 항시성 프로모터일 수 있다. 예를 들어, 상기 항시성 프로모터는 상기 열거된 항시성 프로모터들 중 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 소정의 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 림프구에 관한 것으로서, 상기 항시성 프로모터는 EF-1α 프로모터이다.
인간 신장 인자-1 알파 (elongation factor-1 alpha: EF-1 alpha)는 다양한 인 비트로 및 인 비보 맥락에서 이소성 유전자 발현 (ectopic gene expression)을 유도하는데 사용될 수 있는 인간 기원의 항시성 프로모터이다. 이론에 얽매이지 않고, EF-1 알파는 다른 프로모터 (예: CMV)가 감소된 활성을 갖거나 또는 침묵되는 (배아 줄기 세포에서와 같이) 조건에서 종종 유용하다.
"유도성 (inducible)" 프로모터는 유전자 산물을 코딩하거나 또는 특정하는 폴리뉴클레오티드와 작동 가능하게 연결되는 경우 실질적으로 프로모터에 상응하는 인듀서가 세포에 존재하는 경우에만 세포에서 유전자 산물이 생성되도록 하는 뉴클레오티드 서열이다. 유도성 프로모터의 예로는 메탈로티오닌 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 프로게스테론 프로모터 및 테트라사이클린 프로모터를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 림프구에 관한 것으로서, 상기 적어도 하나의 철 조절 단백질은 IRP1 (서열번호: 1) 및/또는 IRP2 (서열번호: 2-6)이다.
즉, 본 발명에 따른 림프구에 포함된 합성 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 적어도 하나의 IRP는 당해 분야에 알려져 있는 임의의 IRP일 수 있다. 그러나, 상기 IRP는 인간 IRP1 및/또는 인간 IRP2인 것이 바람직하다. 인간에서는 IRP2의 4가지 상이한 이소형이 개시되었으며, 여기서 이소형 3 (서열번호: 2-6)에 대해 2개의 상이한 서열이 개시되었다. 따라서, 본 발명의 소정의 구체예에서, 본 발명에 따른 림프구는 서열번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 림프구는 서열번호: 2-6의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 하나 이상의 합성 폴리뉴클레오티드(들)를 포함할 수 있다. 본 발명의 추가 구체예에서, 본 발명에 따른 림프구는 서열번호: 1 및 서열번호: 2-6 중 하나 이상의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 림프구는 또한 2개 이상의 합성 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 여기서 제1 합성 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하고, 제2 또는 임의의 추가 합성 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 2-6의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩한다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 림프구에 관한 것으로서, 상기 적어도 하나의 철 조절 단백질은 IRP1 (서열번호: 1)이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 림프구에 관한 것으로서, 상기 적어도 하나의 철 조절 단백질은 IRP2 (서열번호: 2)이다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 림프구에 관한 것으로서, 상기 적어도 하나의 철 조절 단백질은 IRP2 (서열번호: 3)이다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 림프구에 관한 것으로서, 상기 적어도 하나의 철 조절 단백질은 IRP2 (서열번호: 4)이다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 림프구에 관한 것으로서, 상기 적어도 하나의 철 조절 단백질은 IRP2 (서열번호: 5)이다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 림프구에 관한 것으로서, 상기 적어도 하나의 철 조절 단백질은 IRP2 (서열번호: 6)이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 림프구에 관한 것으로서, 상기 적어도 하나의 철 조절 단백질은 IRP1 (서열번호: 1) 및 IRP2 (서열번호: 2)이다. 본 발명의 바람직한 일 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 림프구에 관한 것으로서, 상기 적어도 하나의 철 조절 단백질은 IRP2 (서열번호: 2)이다.
본 발명자들은 림프구에서 IRP2를 과발현시키면 이들 림프구의 보다 강력한 증식이 초래된다는 것을 입증하였다. 본 발명자들은 림프구에서 IRP1을 침묵시키는 경우의 효과가 IRP2를 침묵시키는 경우의 효과보다 덜 유의미할지라도, IRP1을 침묵시키는 것은 IRP2를 침묵시키는 것과 유사한 효과를 갖는다는 것을 추가로 보여주었다 (도 8C 및 D). 그러나, IRP1의 침묵은 IRP2의 침묵보다 덜 효과적임에 유의해야 한다 (도 8A). 따라서, IRP1의 과발현은 또한 림프구의 증식을 증가시킬 수 있다. 또한, IRP1 및 IRP2의 동시 과발현은 림프구의 증식을 증가시킬 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 림프구에 관한 것으로서, 상기 림프구는 키메라 항원 수용체를 추가로 포함한다.
본원에서 사용된, 용어 "키메라 항원 수용체 (chimeric antigen receptor)" 또는 "CAR" 또는 "CARs"는 항원 특이성을 림프구, 예를 들어 T 세포 및 NK 세포에 이식한, 조작된 수용체를 지칭한다. 본 발명의 CAR는 당해 분야에 알려져 있는 임의의 CAR일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 CAR는 적어도 하나의 세포외 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인, 하나 이상의 공동-자극 신호전달 영역, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 본 발명의 소정의 구체예에서, 상기 CAR는 2개의 상이한 항원 또는 에피토프에 특이적인, 이중특이성 CAR일 수 있다. 항원 결합 도메인이 표적 항원에 특이적으로 결합한 후에, 상기 신호전달 도메인은 세포내 신호전달을 활성화시킨다. 예를 들어, 상기 신호전달 도메인은 항체의 항원-결합 특성을 이용하는, 비-MHC-제한된 방식으로 선택된 표적에 대한 T 세포 특이성 및 반응성을 재유도할 수 있다. 상기 비-MHC-제한된 항원 인식은 CAR를 발현하는 T 세포에 항원 처리와 무관하게 항원을 인식하는 능력을 부여하여, 종양 회피 (tumor escape)의 주요 기전을 우회한다. 더욱이, T 세포에서 발현되는 경우, CAR는 유리하게는 내인성 T 세포 수용체 (TCR) 알파 및 베타 사슬과 이량체를 형성하지 않는다. NK 세포의 경우, CAR의 발현은 NK 세포를 표적 항원으로 유도하는 것을 촉진할 수 있다. 그러나, CAR T 세포와 달리, CAR NK 세포는 이들의 활성화 및 억제 수용체의 발현을 유지할 수 있다. 따라서, CAR-T 세포와 달리, CAR-NK 세포는 CAR가 표적으로 하는 항원이 하향 조절되는 경우에도 여전히 이들의 "본래" 기능을 발휘할 수 있다.
본 발명 내에서, 림프구가 CAR를 코딩하는 코딩 서열을 포함하고 상기 CAR가 림프구의 막에 고정되도록 이들 코딩 서열을 발현하는 경우, 상기 림프구는 키메라 항원 수용체를 포함하는 것으로 언급된다. 상기 CAR의 성분을 코딩하는 코딩 서열은 하나 이상의 합성 폴리뉴클레오티드 상에 위치할 수 있다. 본 발명의 소정의 구체예에서, 상기 CAR의 성분을 코딩하는 코딩 서열 및 IRP를 코딩하는 하나 이상의 코딩 서열은 단일 합성 폴리뉴클레오티드 상에 위치할 수 있다. 대안으로서, 상기 CAR의 성분을 코딩하는 코딩 서열 및 하나 이상의 IRP를 코딩하는 코딩 서열(들)은 2개 이상의 별개의 폴리뉴클레오티드 상에 위치할 수 있다. 예를 들어, 상기 CAR를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 하나 이상의 IRP를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 세포내로 2개의 독립적인 바이러스 형질도입 이벤트에 의해 도입될 수 있고, 따라서 게놈의 상이한 부분에 통합될 수 있다. CAR 코딩 서열, 및 선택적으로 IRP 코딩 서열(들)을 포함하는 하나 이상의 합성 폴리뉴클레오티드는 림프구에 임의의 형태로 포함될 수 있고, 상기 림프구로 당해 분야에 알려진 임의의 방법에 의해 도입될 수 있다. 예를 들어, CAR 및/또는 하나 이상의 철 조절 단백질을 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드는 원형 DNA 벡터의 일부, 예를 들어 플라스미드로서, 선형 DNA의 형태 또는 이의 일부로서, 또는 mRNA의 형태 또는 이의 일부로서 세포 내부에 존재할 수 있다. 그러나, CAR 코딩 서열, 및 선택적으로 IRP 코딩 서열(들)을 포함하는 하나 이상의 합성 폴리뉴클레오티드가 림프구의 게놈 내로 DNA로서 통합되는 것이 바람직하다. 당업자는 림프구의 게놈 내로 DNA를 도입하는 방법을 알고 있다. IRP1 및/또는 IRP2, 및 선택적으로 CAR를 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드는 게놈 내로 당해 분야에 알려진 임의의 방법에 의해 도입될 수 있다. 소정의 구체예에서, IRP1 및/또는 IRP2, 및 선택적으로 CAR를 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드는 림프구의 게놈 내로 바이러스 형질도입에 의해 도입될 수 있다. 그러나, 합성 DNA를 림프구의 게놈에 도입하는 다른 방법, 예컨대 CRISPR/Cas9가 또한 본원에 포함된다.
다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 림프구에 관한 것으로서, 상기 키메라 항원 수용체는 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인, 공동-자극 신호전달 영역 및 신호전달 도메인을 포함한다.
본 발명에 따른 림프구는 세포외 및 세포내 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 포함할 수 있다. 상기 세포외 도메인은 달리 항원 결합 모이어티로 지칭되는, 하나 이상의 표적-특이적 결합 요소를 포함할 수 있다. 상기 세포내 도메인 또는 세포질 도메인은 하나 이상의 공동-자극 신호전달 영역 및 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 상기 공동-자극 신호전달 영역은 공동-자극 분자의 세포내 도메인을 포함하는 CAR의 일부를 지칭한다. 공동-자극 분자는 항원에 대한 림프구의 효과적인 반응에 필요한 항원 수용체 또는 이들의 리간드 이외의 세포 표면 분자이다.
상기 CAR의 세포외 도메인 및 막횡단 도메인 사이, 또는 상기 CAR의 세포질 도메인 및 막횡단 도메인 사이에, 스페이서 도메인이 포함될 수 있다. 본원에서 사용된, 용어 "스페이서 도메인 (spacer domain)"은 일반적으로 폴리펩티드 사슬내 세포외 도메인 또는 세포질 도메인에 막횡단 도메인을 연결하는 기능을 하는 임의의 올리고- 또는 폴리펩티드를 의미한다. 스페이서 도메인은 최대 300개의 아미노산, 바람직하게는 10 내지 100개의 아미노산, 가장 바람직하게는 25 내지 50개의 아미노산을 포함할 수 있다.
본 발명의 CAR는 달리 항원 결합 모이어티로 지칭되는, 하나 이상의 표적-특이적 결합 요소(들)를 포함할 수 있다. 모이어티의 선택은 표적 세포의 표면을 정의하는 리간드의 타입 및 수에 따라 좌우된다. 예를 들어, 상기 항원 결합 도메인은 특정 질병 상태와 관련된 표적 세포에서 세포 표면 마커로서 작용하는 리간드를 인식하도록 선택될 수 있다. 따라서, 본 발명의 CAR에서 항원 모이어티 도메인에 대한 리간드로서 작용할 수 있는 세포 표면 마커의 예는 바이러스, 박테리아 및 기생충 감염, 자가면역 질환 및 암 세포와 관련된 세포 표면 마커들을 포함한다.
표적화될 원하는 항원에 따라, 본 발명의 CAR는 원하는 항원 표적에 특이적인 적절한 항원 결합 모이어티를 포함하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, CD19가 표적화될 원하는 항원인 경우, CD19에 대한 항체가 본 발명의 CAR 내로 통합하기 위한 항원 결합 모이어티로서 사용될 수 있다.
막횡단 도메인과 관련하여, 상기 CAR는 CAR의 세포외 도메인에 융합되는 막횡단 도메인을 포함하도록 디자인될 수 있다. 소정의 구체예에서, CAR의 세포외 또는 세포질 도메인과 자연적으로 회합되는 막횡단 도메인이 사용될 수 있다. 일부 경우에, 상기 막횡단 도메인은 동일하거나 또는 상이한 표면 막 단백질의 막횡단 도메인에 이러한 도메인들이 결합하는 것을 방지하여 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호작용을 최소화하기 위해, 아미노산 치환에 의해 변형되거나 또는 선택될 수 있다.
상기 막횡단 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 공급원이 천연인 경우, 상기 도메인은 임의의 막-결합 또는 막횡단 단백질로부터 유래될 수 있다. 본 발명에서 특별히 사용되는 막횡단 영역은 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 사슬, CD28, CD8, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154로부터 유래될 수 있다 (즉 이의 막횡단 영역(들)을 적어도 포함할 수 있다). 대안으로서, 상기 막횡단 도메인은 합성일 수 있으며, 이러한 경우에 이는 소수성 잔기 예컨대 류신 및 발린을 주로 포함할 것이다. 바람직하게는, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼중체 (triplet)가 합성 막횡단 도메인의 각 말단에서 발견될 것이다.
선택적으로, 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커, 바람직하게는 2 내지 10개의 아미노산 길이를 갖는 링커가 CAR의 막횡단 도메인 및 세포질 신호전달 도메인 사이에 연결을 형성할 수 있다. 글리신-세린 이중체 (doublet)는 특히 적합한 링커를 제공한다.
본 발명의 CAR의 세포질 도메인 또는 세포내 신호전달 도메인은 CAR가 위치하는 림프구의 정상 이펙터 기능들 중 적어도 하나의 이펙터 기능의 활성화를 담당한다. 용어 "이펙터 기능 (effector function)"은 세포의 특수 기능을 의미한다. 예를 들어, T 세포의 이펙터 기능은 세포용해 활성 또는 사이토카인의 분비를 포함하는 헬퍼 활성일 수 있다. 따라서, 용어 "세포내 신호전달 도메인 (intracellular signaling domain)"은 이펙터 기능 신호를 변환하고 세포가 특수 기능을 수행하도록 지시하는 단백질의 일부를 지칭한다. 통상 전체 세포내 신호전달 도메인이 사용될 수 있지만, 많은 경우에 전체 사슬을 사용할 필요는 없다. 세포내 신호전달 도메인의 절단된 부분이 사용되는 정도로, 이러한 절단된 부분이 이펙터 기능 신호를 변환하는 한, 온전한 사슬 대신에 이를 사용할 수 있다. 따라서, 용어 세포내 신호전달 도메인은 이펙터 기능 신호를 변환하기에 충분한 세포내 신호전달 도메인의 임의의 절단된 부분을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 CAR에 사용하기 위한 세포내 신호전달 도메인의 바람직한 예는 항원 수용체 결합 후에 신호 변환을 개시하도록 협력하여 작용하는 T 세포 수용체 (TCR) 및 보조-수용체의 세포질 서열 뿐만 아니라, 이들 서열의 임의의 유도체 또는 변이체, 및 동일한 기능적 능력을 갖는 임의의 합성 서열을 포함한다.
TCR을 통해 생성된 신호만으로는 T 세포를 완전히 활성화시키기에는 충분하지 않으며, 2차 또는 공동-자극 신호가 또한 필요하다고 알려져 있다. 따라서, T 세포 활성화는 세포질 신호전달 서열의 하기 2가지 별개의 부류에 의해 매개된다고 할 수 있다: TCR을 통해 항원-의존성 1차 활성화를 개시하는 서열 (1차 세포질 신호전달 서열), 및 2차 또는 공동-자극 신호를 제공하기 위해 항원-비의존성 방식으로 작용하는 서열 (2차 세포질 신호전달 서열).
1차 세포질 신호전달 서열은 TCR 복합체의 1차 활성화를 자극 방식 또는 억제 방식으로 조절한다. 자극 방식으로 작용하는 1차 세포질 신호전달 서열은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (immunoreceptor tyrosine-based activation motif: ITAM)로 알려진 신호전달 모티프를 함유할 수 있다.
본 발명에서 특별히 사용되는 1차 세포질 신호전달 서열을 함유하는 ITAM의 예는 TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d로부터 유래된 것을 포함한다. 본 발명의 CAR내 세포질 신호전달 분자가 CD3 제타로부터 유래된 세포질 신호전달 서열을 포함하는 것이 특히 바람직하다.
상기 CAR의 세포질 도메인은 CD3-제타 신호전달 도메인을 자체적으로 포함하도록 디자인되거나 또는 본 발명의 CAR의 맥락에서 유용한 임의의 다른 원하는 세포질 도메인(들)과 조합될 수 있다. 예를 들어, 상기 CAR의 세포질 도메인은 CD3 제타 사슬 부분 및 공동-자극 신호전달 영역을 포함할 수 있다. 상기 공동-자극 신호전달 영역은 공동-자극 분자의 세포내 도메인을 포함하는 CAR의 일부를 지칭한다. 공동-자극 분자는 항원에 대한 림프구의 효과적인 반응에 필요한 항원 수용체 또는 이들의 리간드 이외의 세포 표면 분자이다. 이러한 분자의 예는 CD27, CD28, 4-1BB (CD 137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1 (lymphocyte function-associated antigen-1: LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, 및 유사물을 포함한다.
본 발명의 CAR의 세포질 신호전달 부분 내의 세포질 신호전달 서열들은 서로 무작위로 또는 명시된 순서로 연결될 수 있다. 선택적으로, 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커, 바람직하게는 2 내지 10개의 아미노산 길이를 갖는 링커가 연결을 형성할 수 있다. 글리신-세린 이중체는 특히 적합한 링커를 제공한다.
소정의 구체예에서, 상기 세포질 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인, 및 CD28 및/또는 4-1BB의 신호전달 도메인을 포함하도록 디자인될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 림프구에 관한 것으로서, 상기 항원 결합 도메인은 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고, 구체적으로 상기 항원-결합 단편은 Fab 또는 scFv이다.
즉, 상기 CAR의 항원 결합 도메인은 특정 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 당해 분야에 알려진 임의의 도메인일 수 있다. 그러나, 상기 CAR의 항원 결합 도메인은 항체 또는 항체의 항원-결합 단편인 것이 바람직하다.
본원에서 사용된, 용어 "항체 (antibody)"는 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 지칭한다. 항체는 천연 공급원 또는 재조합 공급원으로부터 유래된 온전한 면역글로불린일 수 있거나, 또는 온전한 면역글로불린의 면역반응성 부분일 수 있다. 항체는 전형적으로 면역글로불린 분자의 4량체이다. 본 발명에서 항체는 예를 들어 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, Fv, Fab 및 F(ab)2 뿐만 아니라 단일 사슬 항체 및 인간화 항체를 포함하는, 다양한 형태로 존재할 수 있다 (Harlow et al., 1999, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston, et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 85:5879-5883; Bird, et al., 1988, Science; 242:423-426).
본원에서 사용된, 용어 "면역글로불린 (immunoglobulin)" 또는 "Ig"는 항체로서 기능하는, 단백질의 부류로서 정의된다. B 세포에 의해 발현되는 항체는 때때로 BCR (B 세포 수용체) 또는 항원 수용체로 지칭된다. 이러한 단백질 부류에 포함되는 5가지 구성원으로는 IgA, IgG, IgM, IgD 및 IgE가 있다. IgA는 신체 분비물 예컨대 타액, 눈물, 모유, 위장관 분비물, 호흡기 및 비뇨생식기의 점액 분비물에 존재하는 1차 항체이다. IgG는 가장 흔한 순환 항체 (circulating antibody)이다. IgM은 대부분의 대상체에서 1차 면역 반응에서 생성되는 주요 면역글로불린으로, 응집, 보체 고정 및 기타 항체 반응에서 가장 효과적인 면역글로불린이며, 박테리아 및 바이러스에 대한 방어에 중요하다. IgD는 알려진 항체 기능은 없지만 항원 수용체로서 역할을 할 수 있는 면역글로불린이다. IgE는 알레르겐 (allergen)에 노출 시에 비만 세포 및 호염기구로부터 매개체를 방출하여 즉시 과민성을 매개하는 면역글로불린이다.
용어 "항체 단편 (antibody fragment)"은 온전한 항체의 일부를 지칭하며, 온전한 항체의 항원성 결정 가변 영역 (antigenic determining variable regions)을 지칭한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편, 선형 항체, scFv 항체, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용된, 용어 "Fab"는 중쇄 및 경쇄 (1가 항원-결합 단편) 각각의 하나의 불변 및 하나의 가변 도메인으로 이루어진 항체의 영역을 지칭하도록 의도되지만, 여기서 상기 중쇄는 CH2 및 CH3 도메인이 결여되고, 힌지 영역의 일부 또는 전부가 결여될 수 있도록 상기 중쇄 영역이 절단된다. Fab 단편은 전체 항체를 효소 파파인 (papain)으로 소화하여 생성될 수 있다. Fab는 단리 시에 상기 영역, 또는 전장 항체, 면역글로불린 구조체 또는 Fab 융합 단백질의 맥락에서 이러한 영역을 지칭할 수 있다.
"scFv"는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 항체 단편을 의미하며, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬내에 존재한다. 예를 들어, 미국특허 번호 제4,946,778호, 제5,260,203호, 제5,455,030호 및 제5,856,456호를 참조한다. 일반적으로, 상기 Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위해 원하는 구조를 형성할 수 있게 하는 VH 및 VL 도메인들 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv에 대한 검토는 Pluckthun (1994) The Pharmacology of Monoclonal Antibodies vol 113 ed. Rosenburg and Moore (Springer-Verlag, New York) pp 269-315를 참조한다. Fv 단편의 VH 및 VL 도메인 복합체는 또한 이황화 결합에 의해 안정화될 수 있다 (미국특허 제5,747,654호).
본원에서 사용된 "항체 중쇄 (antibody heavy chain)"는 모든 항체 분자 중에 이들의 자연 발생 입체형태로 존재하는 2가지 타입의 폴리펩티드 사슬들 중 더 큰 폴리펩티드 사슬을 지칭한다. 본원에서 사용된, "항체 경쇄 (antibody light chain)"는 모든 항체 분자 중에 이들의 자연 발생 입체형태로 존재하는 2가지 타입의 폴리펩티드 사슬들 중 더 작은 폴리펩티드 사슬을 지칭하며, λ 경쇄는 2가지 주요 항체 경쇄 이소타입을 지칭한다.
본원에서 사용된, 용어 "합성 항체 (synthetic antibody)"는 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성된 항체, 가령 예를 들어 박테리오파지에 의해 발현되는 항체를 의미한다. 상기 용어는 또한 항체를 코딩하는 DNA 분자의 합성에 의해 생성되고, DNA 분자가 항체 단백질, 또는 항체를 특정하는 아미노산 서열을 발현하는 항체를 의미하는 것으로 해석되어야 하며, 여기서 DNA 또는 아미노산 서열은 당해 분야에서 이용 가능하고 잘 알려져 있는 합성 DNA 또는 아미노산 서열 기술을 사용하여 수득된다.
당업자는 다양한 항원-결합 도메인, 막횡단 도메인, 공동-자극 신호전달 영역 및/또는 신호전달 도메인을 갖는 CAR를 생성하는 방법을 알고 있다. 추가로, 당업자는 이러한 CAR를 림프구 예컨대 T 세포 또는 NK 세포내로 도입하는 방법을 알고 있다.
일 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 림프구에 관한 것으로서, 상기 항원 결합 도메인이 종양 항원에 특이적으로 결합한다.
즉, 상기 CAR의 항원 결합 도메인은 당해 분야에 알려진 임의의 항원에 결합할 수 있다. 그러나, 상기 CAR의 항원 결합 도메인이 종양 항원에 특이적으로 결합하는 것이 바람직하다. 본원에서 사용된, 용어 "항원 (antigen)" 또는 "Ag"는 면역 반응을 유발하는 분자로 정의된다. 이러한 면역 반응은 항체 생성 또는 특정 면역학적으로-적합한 세포의 활성화, 또는 이들 모두를 포함할 수 있다. 당업자는 사실상 모든 단백질 또는 펩티드를 포함하는 임의의 거대분자가 항원으로 작용할 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 항원은 재조합 또는 게놈 DNA로부터 유래될 수 있다. 당업자는 면역 반응을 유발하는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 일부 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 DNA가 그러므로 해당 용어가 본원에서 사용될 때 "항원"을 코딩한다는 것을 이해할 것이다. 또한, 당업자는 항원이 유전자의 전장 뉴클레오티드 서열에 의해서만 코딩될 필요는 없다는 것을 이해할 것이다. 본 발명은 하나 초과의 유전자의 일부 뉴클레오티드 서열의 사용을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 이들 뉴클레오티드 서열은 원하는 면역 반응을 유도하기 위해 다양한 조합으로 배열된다는 것이 명백하다. 더욱이, 숙련된 기술자는 항원이 "유전자"에 의해 코딩될 필요가 전혀 없다는 것을 이해할 것이다. 항원은 생성, 합성될 수 있거나, 또는 생물학적 샘플로부터 유래될 수 있다는 것이 명백하다. 이러한 생물학적 샘플에는 조직 샘플, 종양 샘플, 세포 또는 생물학적 유체가 포함될 수 있지만 이에 한정되지 않는다.
종양 항원은 면역 반응, 구체적으로 T 세포-매개 면역 반응을 유도하는 종양 세포에 의해 생성되는 단백질이다. 상기 CAR의 항원 결합 모이어티의 선택은 치료할 암의 특정 타입에 따라 달라질 것이다. 종양 항원은 당해 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 신경아교종-관련 항원 (glioma-associated antigen), 암배아 항원 (carcinoembryonic antigen: CEA), β-인간 융모 생식선 자극 호르몬 (β-human chorionic gonadotropin), 알파태아단백 (alphafetoprotein: AFP), 렉틴-반응성 AFP, 갑상선 글로불린 (thyroglobulm), RAGE-1, MN-CA IX, 인간 텔로머라제 역전사효소, RU1, RU2(AS), 장 카복실에스테라제 (intestinal carboxylesterase), mut hsp70-2, M-CSF, 프로스타제 (prostase), 전립선-특이적 항원 (prostate-specific antigen: PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGE-1a, p53, 프로스테인 (prostein), PSMA, Her2/neu, 서바이빈 (survivin) 및 텔로머라제, 전립선-암종 종양 항원-1 (prostate-carcinoma tumor antigen-1: PCTA-1), MAGE, ELF2M, 호중구 엘라스타제, 에프린B2 (ephrinB2), CD22, 인슐린 성장 인자 (insulin growth factor: IGF)-I, IGF-II, IGF-I 수용체 및 메소텔린 (mesothelin)을 포함한다.
상기 종양 항원은 악성 종양과 관련된 하나 이상의 항원성 암 에피토프를 포함할 수 있다. 악성 종양은 면역 공격에 대한 표적 항원으로 작용할 수 있는 다수의 단백질을 발현한다. 이들 분자에는 조직-특이적 항원 예컨대 흑색종에서 MART-1, 티로시나제 및 GP 100, 및 전립선암에서 PAP (prostatic acid phosphatase) 및 PSA (prostate-specific antigen)를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 다른 표적 분자는 형질전환-관련 분자 그룹 예컨대 종양유전자 HER-2/Neu/ErbB-2에 속한다. 표적 항원의 또 다른 그룹으로는 종양-태아성 항원 (onco-fetal antigens) 예컨대 암배아 항원 (CEA)이다. B-세포 림프종에서, 상기 종양-특이적 이디오타입 면역글로불린 (tumor-specific idiotype immunoglobulin)은 개별 종양에 고유한 진정한 종양-특이적 면역글로불린 항원을 구성한다. B-세포 분화 항원 예컨대 CD 19, CD20 및 CD37은 B-세포 림프종의 표적 항원에 대한 다른 후보이다. 이들 항원 중 일부 (CEA, HER-2, CD19, CD20, 이디오타입)는 모노클로날 항체를 사용한 수동 면역요법에 대한 표적으로 사용되었고, 제한된 성공을 이루었다.
본 발명에서 언급된 종양 항원의 타입은 또한 종양-특이적 항원 (TSA) 또는 종양-관련 항원 (TAA)일 수 있다. TSA는 종양 세포에 고유하며, 신체의 다른 세포에서는 발생하지 않는다. TAA 관련 항원은 종양 세포에 고유하지 않으며, 대신에 항원에 대한 면역 관용 상태를 유도하지 못하는 조건하에 정상 세포에서 발현된다. 상기 항원의 종양에서의 발현은 면역계가 항원에 반응할 수 있는 조건하에 발생할 수 있다. TAA는 면역계가 미성숙하여 반응할 수 없는 태아 발달 중에 정상 세포에서 발현되는 항원일 수 있거나, 또는 이들은 통상 정상 세포에서는 매우 낮은 수준으로 제시되지만, 종양 세포에서는 훨씬 더 높은 수준으로 발현되는 항원일 수 있다.
TSA 또는 TAA 항원의 비-제한적인 예는 하기를 포함한다: 분화 항원 (differentiation antigens) 예컨대 MART-l/MelanA (MART-1), gp100 (Pmel 17), 티로시나제, TRP-1, TRP-2 및 종양-특이적 다계통 항원 (tumor-specific multilineage antigens) 예컨대 MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, p15; 과발현된 배아 항원 (overexpressed embryonic antigens) 예컨대 CEA; 과발현된 종양유전자 (overexpressed oncogenes) 및 돌연변이된 종양-억제인자 유전자 (mutated tumor-suppressor genes) 예컨대 p53, Ras, HER-2/neu; 염색체 전위로 인한 고유 종양 항원 (unique tumor antigens resulting from chromosomal translocations); 예컨대 BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR; 및 바이러스 항원 (viral antigens), 예컨대 엡스타인 바 바이러스 항원 (Epstein Barr virus antigens: EBVA) 및 인간 파필로마바이러스 (human papillomavirus: HPV) 항원 E6 및 E7. 다른 거대, 단백질-기반 항원으로는 TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, pl85erbB2, pl80erb-B3, c-met, nm23_H1, PSA, TAG-72, CA 19-9, CA 72-4, CAM17.1, NuMa, K-ras, beta-Catenin, CDK4, Mum-1, p15, p16, 43-9F, 5T4 (791Tgp72), 알파-태아단백질 (alpha-fetoprotein), 베타-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3＼CA 27.29＼BCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68＼ I, CO-029, FGF-5, G250, Ga733＼EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV 18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS-1, SDCCAG16, TA-90＼Mac-2 결합 단백질, 사이클로필린 C-관련 단백질, TAAL6, TAG72, TLP, 및 TPS를 포함한다.
상기 CAR의 항원 결합 모이어티 부분은 CD19, CD20, CD22, CD30, CD123, CD171, CS-1, ROR1, 메소텔린, CD33, lL3Ra, c-Met, PSMA, 당지질 F77, EGFRvIII, GD-2, CD7, NY-ESO-1 TCR, MAGE-A3 TCR, CLL-1, GD3, BCMA, Tn Ag, PSMA, FLT3, FAP, TAG72, CD38, CD44v6, CEA, EPCAM, B7H3, KIT, IL-13Ra2, IL-lRa, PSCA, PRSS21, VEGFR2, LewisY, CD24, PDGFR-베타, SSEA-4, 폴레이트 수용체 알파 (Folate receptor alpha), ErbB2 (Her2/neu), MUC1, EGFR, NCAM, 프로스타제, PAP, ELF2M, 에프린 B2, IGF-I 수용체, CAIX, LMP2, gp100, bcr-abl, 티로시나제, EphA2, 푸코실 GMl, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-아세틸-GD2, 폴레이트 수용체 베타, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, 폴리시알산, PLAC1, Globo H, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WT1, LAGE-la, 레구마인 (legumain), HPV E6, E7, ETV6-AML, 정자 단백질 (sperm protein) 17, XAGE1, Tie 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos-관련 항원 1, p53, p53 돌연변이체, 프로스테인, 서바이빈 및 텔로머라제, PCTA-l/갈렉틴 8, 멜란A/MARTl, Ras 돌연변이체, hTERT, 육종 전위 돌파점 (sarcoma translocation breakpoints), ML-IAP, ERG (TMPRSS2 ETS 융합 유전자), NA17, PAX3, 안드로겐 수용체 (Androgen receptor), 사이클린 Bl, MYCN, RhoC, TRP-2, CYP1B1, BORIS, SART3, PAX5, OY-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, RAGE-1, 인간 텔로머라제 역전사효소, RUl, RU2, 장 카복실 에스테라제, mut hsp70-2, CD79a, CD79b, CD72, LAIRl, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, 및 IGLL1 및 유사물을 포함하지만 이에 한정되지 않는 항원을 추가로 표적화할 수 있다.
소정의 구체예에서, CAR를 포함하는 본 발명의 림프구는 혈액암의 치료, 구체적으로 급성 림프모구 백혈병 및/또는 미만성 거대 B-세포 림프종의 치료에 사용될 수 있다. 이들 구체예에서, 상기 CAR의 항원 결합 모이어티 부분은 CD19를 특이적으로 표적화할 수 있다.
소정의 구체예에서, CAR를 포함하는 본 발명의 림프구는 혈액암의 치료, 구체적으로 불응성 호지킨 림프종 (refractory Hodgkin's lymphoma)의 치료에 사용될 수 있다. 이들 구체예에서, 상기 CAR의 항원 결합 모이어티 부분은 CD30을 특이적으로 표적화할 수 있다.
소정의 구체예에서, CAR를 포함하는 본 발명의 림프구는 혈액암의 치료, 구체적으로 급성 골수성 백혈병의 치료에 사용될 수 있다. 이들 구체예에서, 상기 CAR의 항원 결합 모이어티 부분은 CD33, CD123 또는 FLT3을 특이적으로 표적화할 수 있다.
소정의 구체예에서, CAR를 포함하는 본 발명의 림프구는 혈액암의 치료, 구체적으로 다발성 골수종의 치료에 사용될 수 있다. 이들 구체예에서, 상기 CAR의 항원 결합 모이어티 부분은 BCMA를 특이적으로 표적화할 수 있다.
소정의 구체예에서, 본 발명의 림프구에 포함된 CAR는 2개의 항원에 결합할 수 있다. 소정의 구체예에서, 상기 이중-특이적 CAR는 CD19 및 CD22, 또는 CD19 및 CD20에 결합할 수 있다.
일반적으로, CAR는 표적 세포 표면 상의 MHC 분자에 의한 종양 항원 제시에 의존하지 않는 이점을 갖는다. 대신에, CAR의 항원-결합 도메인이 항원에 특이적으로 결합하는 한, 이론상 CAR는 종양 세포 표면 상의 CAR에 접근할 수 있는 임의의 분자에 결합할 수 있다. 따라서, 상기 종양 항원은 종양 또는 악성 세포의 표면에 제시되는 항원인 것이 바람직하다. 더 바람직하게는, 상기 종양 항원은 건강한 세포 또는 비-종양 세포의 표면에 존재하는 것보다 종양 또는 악성 세포의 표면에 더 풍부하게 제시되는 항원이다. 더욱 바람직하게는, 상기 종양 항원은 종양 세포 또는 악성 세포의 표면에 제시되지만, 건강한 세포 또는 비-종양 세포의 표면에는 제시되지 않는 항원이다.
항원 결합 도메인 또는 항체와 관련하여, 본원에서 사용된 용어 "특이적으로 결합하는 (specifically binds)"은 항원 결합 도메인 또는 항체가 특정 항원을 인식하지만, 샘플내 다른 분자를 실질적으로 인식하거나 또는 이에 결합하지 않는 것을 의미한다. 예를 들어, 하나의 종 유래의 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인 또는 항체는 또한 하나 이상의 다른 종 유래의 해당 항원에 결합할 수 있다. 그러나, 이러한 종간 반응성 (cross-species reactivity) 자체는 항원 결합 도메인 또는 항체의 분류를 특이적인 것으로 변경하지 않는다. 다른 예에서, 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인 또는 항체는 또한 항원의 상이한 대립형질 형태에 결합할 수 있다. 그러나, 이러한 교차 반응성 자체는 항체의 분류를 특이적인 것으로 변경하지 않는다. 일부 경우에, 용어 "특이적 결합 (specific binding)" 또는 "특이적으로 결합하는 (specifically binding)"은 항원 결합 도메인, 항체, 단백질 또는 펩티드와 제2 화학종의 상호작용과 관련하여 사용될 수 있으며, 이러한 상호작용은 화학종 상의 특정 구조 (예컨대 항원성 결정인자 또는 에피토프)의 존재 여부에 따라 달라지며; 예를 들어, 항원 결합 도메인 또는 항체는 일반적으로 단백질보다는 특정 단백질 구조를 인식하고, 이에 결합하는 것을 의미한다. 항원 결합 도메인 또는 항체가 에피토프 "A"에 특이적인 경우, 표지된 "A" 및 항원 결합 도메인 또는 항체를 함유하는 반응에서 에피토프 A (또는 유리, 표지되지 않은 A)를 함유하는 분자의 존재는 항원 결합 도메인 또는 항체에 결합되어 표지된 A의 양을 감소시킬 것이다.
다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 림프구에 관한 것으로서, 상기 종양 항원은 표적 세포 집단 또는 조직의 세포 표면에 제시된다.
CAR를 포함하는 본 발명에 따른 림프구는 표적 세포의 세포 표면 상에 제시되는 종양 항원에 결합할 수 있다. 상기 표적 세포는 세포 집단 또는 조직의 일부일 수 있다. 일반적으로, 종양 항원이 CAR의 항원 결합 도메인에 접근 가능하도록 상기 종양 항원이 표적 세포에 의해 노출되는 경우, 상기 종양 항원은 "세포 표면 상에 제시"된다고 한다.
상기 종양 항원은 종양 세포에 의해 생성되는 임의의 단백질일 수 있거나, 더 바람직하게는 종양 세포에 의해 생성되고 상기 종양 세포의 세포 표면 상에서 발현되는 단백질의 임의의 부분일 수 있다. 상기 종양 항원은 CAR의 항원 결합 도메인에 접근 가능한 막-고정 단백질 (membrane-anchored protein)의 세포외 도메인의 일부인 것이 바람직하다.
그러나, 본 발명은 또한 표적 세포의 표면 상에 다른 분자, 구체적으로 MHC 분자에 의해 제시되는 종양 항원을 포함한다. 이러한 경우, 상기 종양 항원은 단백질 유래의 펩티드인 것이 바람직하다. 상기 종양 항원은 예를 들어 종양 세포에 의해 생성되는 단백질로부터 유래될 수 있다. 대안으로서, 상기 종양 항원은 예를 들어 세포내이입 (endocytosis)에 의해 종양 세포에 의해 이전에 흡수된 세포외 단백질로부터 유래될 수 있다. 두 경우 모두에서, 상기 단백질은 표적 세포에 의해 펩티드로 처리될 수 있고, 그 다음에 이는 표적 세포의 표면에 예를 들어 MHC 분자에 의해 제시될 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 림프구에 관한 것으로서, 상기 항원 결합 도메인은 바이러스 항원에 특이적으로 결합한다.
즉, 본 발명에 따른 림프구는 대상체에서 바이러스 감염의 치료에 사용될 수 있다. 본 발명의 림프구에 포함된 CAR는 바이러스 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다. 상기 바이러스 항원은 CAR에 접근 가능한 바이러스 입자의 임의의 성분, 예를 들어 바이러스의 표면 및/또는 이의 단백질 코트의 일부를 형성하는 항원일 수 있다. 바람직하게는, 상기 CAR에 의해 인식되는 바이러스 항원은 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 아데노바이러스, 폴리오마바이러스, 인플루엔자 바이러스 또는 인간 헤르페스바이러스로부터 유래되는 항원이고, 구체적으로 상기 인간 헤르페스바이러스는 거대세포바이러스 (CMV), 엡스타인-바 바이러스 (EBV), 단순 헤르페스 바이러스 (HSV), 바리젤라-조스터 바이러스 (VZV) 또는 인간 헤르페스바이러스 8 (HHV8)이다.
일 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 림프구에 관한 것으로서, 상기 CAR는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고, CAR를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 IRP1 및/또는 IRP2를 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드에 전사로 (transcriptionally) 연결된다.
본 발명 내에서, 상기 CAR는 림프구의 게놈 내로 통합되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것이 바람직하다. 더 바람직하게는, 상기 CAR를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 IRP1 및/또는 IRP2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 림프구 게놈의 동일한 유전자좌에 통합된다. 더 바람직하게는, 상기 CAR를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 IRP1 및/또는 IRP2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 림프구 게놈의 동일한 유전자좌에 통합되어 2개 이상의 폴리뉴클레오티드가 전사로 연결된다. 2개 이상의 폴리뉴클레오티드에 포함된 코딩 서열의 전사가 단일 프로모터로부터 유도되어, 2개 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 단일 전사체가 수득되는 경우, 상기 2개 이상의 폴리뉴클레오티드는 전사로 연결되었다고 한다. 바람직하게는, 프로모터는 전사로 연결된 코딩 서열 또는 폴리뉴클레오티드의 업스트림 (5')에 위치한다. 즉, CAR를 코딩하는 코딩 서열, 및 IRP1 및/또는 IRP2를 코딩하는 코딩 서열(들)은 단일 프로모터로부터 전사될 수 있다.
기능성 단백질의 합성을 가능하게 하기 위해, CAR를 코딩하는 코딩 서열, 및 IRP1 및/또는 IRP2를 코딩하는 코딩 서열(들)은 내부 리보솜 진입 부위 (internal ribosome entry site: IRES)에 의해 분리될 수 있거나, 또는 자가-절단 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 의해 연결될 수 있다.
CAR를 코딩하는 코딩 서열, 및 IRP1 및/또는 IRP2를 코딩하는 코딩 서열(들)이 IRES에 의해 분리되는 경우, 전사체에 포함된 각 코딩 서열은 독립적으로 번역된다. 그러나, CAR를 코딩하는 코딩 서열, 및 IRP1 및/또는 IRP2를 코딩하는 코딩 서열(들)이 자가-절단 펩티드에 의해 연결되는 경우, 전체 전사체는 다단백질 (polyprotein)로 번역되고, 그 다음에 이는 번역 중에 또는 이에 후속하여 자동 절단에 의해 단일 단백질로 절단된다.
일 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 림프구에 관한 것으로서, 상기 CAR를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 IRP1 및/또는 IRP2를 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드는 자가-절단 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 의해 연결된다.
본원에서 사용된 용어 "자가-절단 펩티드 (self-cleaving peptide)"는 펩티드 서열 자체 내의 2개의 아미노산 잔기들 사이에서 발생하는 절단 활성과 관련된 펩티드 서열을 지칭한다. 예를 들어, 2A/2B 펩티드 또는 2A/2B-유사 펩티드에서, 2A 펩티드 상의 글리신 잔기 및 2B 펩티드 상의 프롤린 잔기 사이에 절단이 발생한다. 이는 2A/2B 펩티드의 2A 글리신 잔기 및 2B 프롤린 잔기 사이의 정상적인 펩티드 결합 형성이 손상되는, 번역 중 '리보솜 스킵 기전 (ribosomal skip mechanism)'을 통해 발생하며, 상기 2B 펩티드의 나머지의 번역에는 영향을 미치지 않는다. 이러한 리보솜 스킵 기전은 당해 분야에 잘 알려져 있고, 단일 메신저 RNA에 의해 코딩되는 몇몇 단백질들의 발현을 위해 여러 바이러스에 의해 사용되는 것으로 알려져 있다.
따라서, 일 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 림프구에 관한 것으로서, 상기 자가-절단 펩티드는 2A 자가-절단 펩티드이다.
바람직한 일 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 림프구에 관한 것으로서, 상기 자가-절단 펩티드는 T2A이다. T2A는 펩티드 서열 EGRGSLLTCGDVEENPGP (서열번호: 7)를 포함하는 자가-절단 펩티드이다.
2개의 코딩 서열이 자가-절단 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 의해 연결되는 경우, 제1 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 서열, 자가-절단 펩티드를 코딩하는 코딩 서열 및 제2 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 서열이 동일한 리딩 프레임 내에 코딩되는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명 내에서, CAR를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 IRP1 및/또는 IRP2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(들)가 동일한 합성 폴리뉴클레오티드 상에 코딩되는 것이 바람직하다. 소정의 구체예에서, CAR, IRP1 및/또는 IRP2를 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드는 림프구의 게놈 내로 바이러스 형질도입에 의해 통합되었다. 소정의 구체예에서, 합성 폴리뉴클레오티드에 포함된 IRP1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 CAR를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 IRES에 의해 분리된다. 다른 구체예에서, 합성 폴리뉴클레오티드에 포함된 IRP2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 CAR를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 IRES에 의해 분리된다. 다른 구체예에서, 합성 폴리뉴클레오티드에 포함된 IRP1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 CAR를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 자가-절단 펩티드, 구체적으로 2A 자가-절단 펩티드, 구체적으로 T2A를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 의해 연결된다. 다른 구체예에서, 합성 폴리뉴클레오티드에 포함된 IRP2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 CAR를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 자가-절단 펩티드, 구체적으로 2A 자가-절단 펩티드, 구체적으로 T2A를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 의해 연결된다.
소정의 구체예에서, CAR, IRP1 및/또는 IRP2를 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드는 항시성 프로모터의 제어하에 있다. 소정의 구체예에서, 상기 프로모터는 합성 폴리뉴클레오티드의 일부이다. 소정의 구체예에서, 상기 항시성 프로모터는 EF-1α 프로모터이다. 그러나, 당업자는 프로모터 EF-1α 대신에 사용될 수 있는 광범위한 프로모터를 알고 있음을 이해해야 한다. 또한, 실시예 10은 단지 개념 증명을 나타내고, 림프구에서 CAR 및/또는 IRP1/2의 발현을 최적화함으로써 림프구의 보다 효과적인 인 비보 증식이 달성될 수 있음을 이해해야 한다.
소정의 구체예에서, 상기 합성 폴리뉴클레오티드는 5'-CAR-자가-절단 펩티드-IRP1-3'의 구조를 갖는다. 다른 구체예에서, 상기 합성 폴리뉴클레오티드는 5'-CAR-자가-절단 펩티드-IRP2-3'의 구조를 갖는다. 다른 구체예에서, 상기 합성 폴리뉴클레오티드는 5'-항시성 프로모터-CAR-자가-절단 펩티드-IRP1-3'의 구조를 갖는다. 다른 구체예에서, 상기 합성 폴리뉴클레오티드는 5'-항시성 프로모터-CAR-자가-절단 펩티드-IRP2-3'의 구조를 갖는다. 다른 구체예에서, 상기 합성 폴리뉴클레오티드는 5'-항시성 프로모터-CAR-T2A-IRP1-3'의 구조를 갖는다. 다른 구체예에서, 상기 합성 폴리뉴클레오티드는 5'-항시성 프로모터-CAR-T2A-IRP2-3'의 구조를 갖는다.
소정의 구체예에서, 상기 합성 폴리뉴클레오티드는 5'-IRP1-자가-절단 펩티드-CAR-3'의 구조를 갖는다. 다른 구체예에서, 상기 합성 폴리뉴클레오티드는 5'-IRP2-자가-절단 펩티드-CAR-3'의 구조를 갖는다. 다른 구체예에서, 상기 합성 폴리뉴클레오티드는 5'-항시성 프로모터-IRP1-자가-절단 펩티드-CAR-3'의 구조를 갖는다. 다른 구체예에서, 상기 합성 폴리뉴클레오티드는 5'-항시성 프로모터-IRP2-자가-절단 펩티드-CAR-3'의 구조를 갖는다. 다른 구체예에서, 상기 합성 폴리뉴클레오티드는 5'-항시성 프로모터-IRP1-T2A-CAR-3'의 구조를 갖는다. 다른 구체예에서, 상기 합성 폴리뉴클레오티드는 5'-항시성 프로모터-IRP2-T2A-CAR-3'의 구조를 갖는다. 다른 구체예에서, 상기 합성 폴리뉴클레오티드는 5'-항시성 프로모터-IRP1-P2A-CAR-3'의 구조를 갖는다. 다른 구체예에서, 상기 합성 폴리뉴클레오티드는 5'-항시성 프로모터-IRP2-P2A-CAR-3'의 구조를 갖는다. 다른 구체예에서, 상기 합성 폴리뉴클레오티드는 5'-항시성 프로모터-IRP1-E2A-CAR-3'의 구조를 갖는다. 다른 구체예에서, 상기 합성 폴리뉴클레오티드는 5'-항시성 프로모터-IRP2-E2A-CAR-3'의 구조를 갖는다. 다른 구체예에서, 상기 합성 폴리뉴클레오티드는 5'-항시성 프로모터-IRP1-F2A-CAR-3'의 구조를 갖는다. 다른 구체예에서, 상기 합성 폴리뉴클레오티드는 5'-항시성 프로모터-IRP2-F2A-CAR-3'의 구조를 갖는다.
그러나, 본 발명은 IRP1 및/또는 IRP2를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 CAR를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드가 림프구 게놈의 상이한 위치에 통합되고 독립적으로 발현되는 림프구를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 바람직하게는, IRP1 및/또는 IRP2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 CAR를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 림프구의 게놈 내로 2개의 독립적인 바이러스 형질도입 이벤트에 의해 통합된다. 상기 2개의 독립적인 바이러스 형질도입 이벤트는 동시에 발생할 수 있거나, 또는 단계적 방식으로 발생할 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명은 IRP1 (서열번호: 1) 및/또는 IRP2 (서열번호: 2-6)를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터 (viral vector)에 관한 것이다.
즉, 본 발명은 또한 철 조절 단백질을 세포, 바람직하게는 림프구에 통합시키는데 사용될 수 있는 바이러스 벡터에 관한 것이다. 상기 바이러스 벡터는 폴리뉴클레오티드의 세포, 바람직하게는 림프구로의 통합에 적합한 임의의 바이러스 벡터일 수 있다. 따라서, 소정의 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 바이러스 벡터에 관한 것으로서, 상기 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 아데노-관련 바이러스 (AAV), 아데노바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 레트로바이러스, 알파바이러스, 플라비바이러스, 랍도바이러스, 홍역 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스 또는 폭스바이러스로부터 유래된다. 바람직한 일 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 바이러스 벡터에 관한 것으로서, 상기 바이러스 벡터는 렌티바이러스 또는 아데노-관련 바이러스 (AAV)로부터 유래된다. 더 바람직한 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 바이러스 벡터에 관한 것으로서, 상기 바이러스 벡터는 렌티바이러스로부터 유래된다.
상기 바이러스 벡터는 하나 이상의 이식유전자를 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "이식유전자 (transgene)"는 핵산 서열이 삽입되는 세포에서 발현될, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 일부를 코딩하는 특정 핵산 서열을 지칭한다. 용어 이식유전자는 (1) 세포내에서 자연적으로 발견되지 않는 핵산 서열 (즉, 이종 핵산 서열, 예컨대 CAR를 코딩하는 핵산); (2) 핵산 서열이 도입된 세포내에서 자연적으로 발견되는 핵산 서열의 돌연변이체 형태인 핵산 서열; (3) 핵산 서열이 도입된 세포내에서 자연적으로 발생하는 동일 (즉, 상동) 또는 유사한 핵산 서열의 추가 카피를 부가하는 역할을 하는 핵산 서열 (예컨대 IRP1 및/또는 IRP2); 또는 (4) 핵산 서열이 도입된 세포내에서 이의 발현이 유도되는 침묵의 자연 발생 또는 상동 핵산 서열. 돌연변이체 형태는 야생형 또는 자연 발생 서열과 상이한 하나 이상의 뉴클레오티드를 함유하는 핵산 서열을 의미하며, 즉 돌연변이체 핵산 서열은 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 결실 및/또는 삽입을 함유한다. 일부 경우에, 상기 이식유전자는 또한 이식유전자 산물이 세포로부터 분비되도록 선도 펩티드 (leader peptide) 또는 신호 서열 (signal sequence)을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 림프구에 포함되는, IRP1 및/또는 IRP2, 및 선택적으로 프로모터 및/또는 CAR를 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 림프구 내로 바이러스 형질도입에 의해 통합될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 림프구에 대해 개시된 합성 폴리뉴클레오티드가 또한 본 발명에 따른 바이러스 벡터에 포함될 수 있다는 것을 이해해야 한다.
소정의 구체예에서, 상기 바이러스 벡터는 단일 이식유전자를 포함한다. 예를 들어, 소정의 구체예에서, 상기 바이러스 벡터는 IRP1 (서열번호: 1)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 바이러스 벡터는 IRP2 (서열번호: 2)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 바이러스 벡터는 IRP2 (서열번호: 3)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 바이러스 벡터는 IRP2 (서열번호: 4)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 바이러스 벡터는 IRP2 (서열번호: 5)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 바이러스 벡터는 IRP2 (서열번호: 6)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 바람직하게는, 상기 바이러스 벡터는 IRP2 (서열번호: 2)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
소정의 구체예에서, 상기 바이러스 벡터는 1개 초과의 이식유전자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 바이러스 벡터는 IRP1 (서열번호: 1) 및 IRP2 (서열번호: 2-6)의 1개 이상의 이소타입을 코딩하는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 바이러스 벡터는 IRP2 (서열번호: 2-6)의 2개 이상의 이소타입을 코딩하는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
추가로, 상기 바이러스 벡터는 IRP1 및/또는 IRP2를 코딩하는 1개 이상의 폴리뉴클레오티드 및 CAR를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 일 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 바이러스 벡터에 관한 것으로서, 상기 바이러스 벡터는 CAR를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 따라서, 상기 바이러스 벡터는 CAR를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 IRP1 및/또는 IRP2를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 세포, 바람직하게는 림프구에, 동시에 통합하는데 사용될 수 있다.
소정의 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 바이러스 벡터에 관한 것으로서, 상기 CAR를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 IRP1 및/또는 IRP2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(들)에 전사로 연결된다. CAR를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 IRP1 및/또는 IRP2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(들)는 전술한 바와 같이 전사로 연결될 수 있다. 즉, CAR를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 IRP1 및/또는 IRP2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(들)는 공통 프로모터의 제어하에 있을 수 있다.
CAR를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 IRP1 및/또는 IRP2를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 IRES에 의해 분리될 수 있거나, 또는 본원에 기재된 자가-절단 펩티드를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 연결될 수 있다.
소정의 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 바이러스 벡터에 관한 것으로서, 상기 CAR를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 IRP1 및/또는 IRP2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(들)는 자가-절단 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 의해 연결된다.
소정의 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 바이러스 벡터에 관한 것으로서, 상기 자가-절단 펩티드는 2A 자가-절단 펩티드이다.
소정의 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 바이러스 벡터에 관한 것으로서, 상기 자가-절단 펩티드는 T2A이다.
다른 구체예에서, 상기 바이러스 벡터는 CAR 및 IRP1 및/또는 IRP2를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 발현을 제어하는 프로모터를 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 바이러스 벡터에 관한 것으로서, 상기 IRP1 및/또는 IRP2, 및 선택적으로 CAR를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드는 프로모터의 제어하에 있다. 상기 프로모터는 항시성 프로모터 또는 유도성 프로모터, 예를 들어 본원에 명시된 항시성 또는 유도성 프로모터들 중 하나일 수 있다. 바람직하게는, 상기 프로모터는 항시성 프로모터 예컨대 프로모터 EF-1α이다. 따라서, 소정의 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 바이러스 벡터에 관한 것으로서, 상기 항시성 프로모터는 EF-1α 프로모터이다.
소정의 구체예에서, 상기 바이러스 벡터는 5'-CAR-자가-절단 펩티드-IRP1-3'의 구조를 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 바이러스 벡터는 5'-CAR-자가-절단 펩티드-IRP2-3'의 구조를 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 바이러스 벡터는 5'-항시성 프로모터-CAR-자가-절단 펩티드-IRP1-3'의 구조를 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 바이러스 벡터는 5'-항시성 프로모터-CAR-자가-절단 펩티드-IRP2-3'의 구조를 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 바이러스 벡터는 5'-항시성 프로모터-CAR-T2A-IRP1-3'의 구조를 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 바이러스 벡터는 5'-항시성 프로모터-CAR-T2A-IRP2-3'의 구조를 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 바이러스 벡터는 5'-항시성 프로모터-CAR-P2A-IRP1-3'의 구조를 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 바이러스 벡터는 5'-항시성 프로모터-CAR-P2A-IRP2-3'의 구조를 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 바이러스 벡터는 5'-항시성 프로모터-CAR-E2A-IRP1-3'의 구조를 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 바이러스 벡터는 5'-항시성 프로모터-CAR-E2A-IRP2-3'의 구조를 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 바이러스 벡터는 5'-항시성 프로모터-CAR-F2A-IRP1-3'의 구조를 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 바이러스 벡터는 5'-항시성 프로모터-CAR-F2A-IRP2-3'의 구조를 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
소정의 구체예에서, 상기 바이러스 벡터는 5'-IRP1-자가-절단 펩티드-CAR-3'의 구조를 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 바이러스 벡터는 5'-IRP2-자가-절단 펩티드-CAR-3'의 구조를 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 바이러스 벡터는 5'-항시성 프로모터-IRP1-자가-절단 펩티드-CAR-3'의 구조를 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 바이러스 벡터는 5'-항시성 프로모터-IRP2-자가-절단 펩티드-CAR-3'의 구조를 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 바이러스 벡터는 5'-항시성 프로모터-IRP1-T2A-CAR-3'의 구조를 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 바이러스 벡터는 5'-항시성 프로모터-IRP2-T2A-CAR-3'의 구조를 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 바이러스 벡터는 5'-항시성 프로모터-IRP1-P2A-CAR-3'의 구조를 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 바이러스 벡터는 5'-항시성 프로모터-IRP2-P2A-CAR-3'의 구조를 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 바이러스 벡터는 5'-항시성 프로모터-IRP1-E2A-CAR-3'의 구조를 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 바이러스 벡터는 5'-항시성 프로모터-IRP2-E2A-CAR-3'의 구조를 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 바이러스 벡터는 5'-항시성 프로모터-IRP1-F2A-CAR-3'의 구조를 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 바이러스 벡터는 5'-항시성 프로모터-IRP2-F2A-CAR-3'의 구조를 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
당업자는 이식유전자 및/또는 조절 요소 예컨대 프로모터를 바이러스 벡터에 도입하기 위한 분자 생물학 방법을 알고 있다.
일 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 림프구 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물 (pharmaceutical composition)에 관한 것이다.
본 발명의 림프구는 단독으로, 또는 본 발명의 림프구를 포함하는 약학 조성물로서 투여될 수 있다. 간략하게는, 본 발명의 약학 조성물은 본원에 기재된 림프구 또는 림프구 집단을, 하나 이상의 약학적으로 또는 생리학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 조합하여 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 버퍼 (buffers) 예컨대 중성 완충 식염수, 포스페이트 완충 식염수 및 유사물; 탄수화물 예컨대 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란, 만니톨; 단백질; 폴리펩티드 또는 아미노산 예컨대 글리신; 산화방지제; 킬레이트화제 (chelating agents) 예컨대 EDTA 또는 글루타티온; 아쥬반트 (예컨대, 수산화알루미늄); 및 보존제를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 희석제 및/또는 다른 성분 예컨대 IL-2 또는 다른 사이토카인 또는 세포 집단과 조합하여 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 바람직하게는 정맥내 투여를 위해 제제화된다.
다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 바이러스 벡터 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
소정의 구체예에서, 벡터의 직접 도입에 의한 대상체의 직접 치료가 고려된다. 상기 바이러스 벡터 조성물은 비경구 (예컨대, 정맥내), 피부내, 피하, 경구 (예컨대, 흡입), 경피 (국소), 경점막, 직장 및 질을 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 이용 가능한 경로로 전달하기 위해 제제화될 수 있다. 통상 사용되는 전달 경로에는 흡입, 비경구 및 경점막을 포함한다.
소정의 구체예에서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 적어도 하나의 철 조절 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 본 발명에 따른 바이러스 벡터 및 CAR를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 즉, 상기 하나 이상의 철 조절 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(들) 및 CAR를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 2개의 개별 바이러스 벡터에 위치할 수 있지만, 동일한 약학 조성물에 포함될 수 있다.
다양한 구체예에서, 약학 조성물은 바이러스 벡터를 약학적으로 허용 가능한 담체와 조합하여 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체 (pharmaceutically acceptable carrier)"는 의약품 투여에 적합한, 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제, 및 유사물을 포함한다. 보충 활성 화합물이 또한 조성물에 혼입될 수 있다.
일부 구체예에서, 활성제, 즉 본원에 기재된 바이러스 벡터 및/또는 상기 벡터와 함께 투여할 다른 활성제는 상기 화합물이 체내에서 빠르게 제거되는 것을 보호할 담체, 예컨대 임플란트 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 제어 방출 제제를 사용하여 제조된다. 생분해성, 생체적합성 폴리머 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물 (polyanhydrides), 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 조성물의 제조 방법은 당업자에게 명백할 것이다. 적합한 물질은 또한 Alza Corporation 및 Nova Pharmaceuticals, Inc.로부터 상업적으로 입수될 수 있다. 리포솜은 또한 약학적으로 허용 가능한 담체로서 사용될 수 있다. 이들은 예를 들어 미국특허 제4,522,811호에 기재된 바와 같이 당업자에게 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 조성물은 바이러스에 의해 감염된 세포 또는 특정 세포 타입을 표적으로 한다. 예를 들어, 조성물은 모노클로날 항체를 사용하여 세포 표면 마커, 예컨대 감염된 세포의 표면 상에서 발현되는 내인성 마커 또는 바이러스 항원을 표적으로 할 수 있다.
투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 조성물을 투여 유닛 형태 (dosage unit form)로 제제화하는 것이 유리하다. 본원에서 사용된 투여 유닛 형태 (dosage unit form)는 치료할 대상체에 대한 단일 투여량으로 적합한 물리적으로 별개의 유닛을 지칭하고; 각 유닛은 원하는 치료 효과를 발휘하도록 계산된 미리 결정된 양의 바이러스 벡터를 약학적 담체와 회합하여 포함한다.
유닛 용량 (unit dose)은 단일 주사로 투여될 필요는 없지만, 설정된 기간에 걸쳐 연속 주입을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 바이러스 벡터의 유닛 용량은 HeLa 또는 293과 같은 세포주에 대해 벡터를 적정함으로써 정의되는 바와 같이, 바이러스 벡터의 형질도입 유닛 (transducing units: T.U.)의 측면에서 편리하게 서술될 수 있다. 소정의 구체예에서, 유닛 용량은 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013 T.U. 및 초과의 범위일 수 있다.
약학 조성물은 필요에 따라 다양한 간격으로 및 상이한 기간에 걸쳐, 예를 들어 약 1 내지 약 10주; 약 2 내지 약 8주; 약 3 내지 약 7주; 약 4주; 약 5주; 약 6주 등 동안 주당 1회로 투여될 수 있다. 이는 치료 조성물을 무기한 (indefinite basis)으로 투여하는 것이 필요할 수 있다. 숙련된 기술자는 질병 또는 장애의 중증도, 이전 치료, 대상체의 일반적인 건강 및/또는 연령, 및 존재하는 다른 질병을 포함하지만 이에 한정되지 않는 소정의 요인이 대상체를 효과적으로 치료하는데 필요한 투여량 및 시기에 영향을 줄 수 있음을 이해할 것이다. 대상체의 바이러스 벡터를 사용한 치료는 단일 치료를 포함할 수 있거나, 또는 많은 경우에 일련의 치료를 포함할 수 있다.
바이러스 벡터의 투여를 위한 예시되는 용량 및 적합한 용량을 결정하는 방법이 당해 분야에 알려져 있다. 또한 바이러스 벡터의 적절한 용량은 특정 수혜자 및 투여 방식에 따라 달라질 수 있음을 이해한다. 임의의 특정 대상체에 대한 적절한 용량 수준은 대상체의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로, 배출율, 투여되는 다른 치료제 등을 포함하는 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다.
소정의 구체예에서, 바이러스 벡터는 대상체에게 예를 들어 정맥내 주사, 국소 투여 또는 정위 주사 (stereotactic injection)에 의해 전달될 수 있다 (예를 들어, Chen et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 3054 참조). 소정의 구체예에서, 벡터는 경구 또는 흡입에 의해 전달될 수 있고, 이들을 분해로부터 보호하고, 조직 또는 세포로의 흡수를 향상시키기 위해 캡슐화하거나 또는 달리 조작될 수 있다. 약학적 제제는 허용 가능한 희석제 중에 바이러스 벡터를 포함할 수 있거나, 또는 바이러스 벡터가 내재된 서방성 매트릭스 (slow release matrix)를 포함할 수 있다. 대안으로서 또는 추가적으로, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터의 경우와 같이, 벡터가 재조합 세포로부터 온전하게 생성될 수 있는 경우, 약학적 제제는 벡터를 생성하는 하나 이상의 세포를 포함할 수 있다. 본원에 기재된 바이러스 벡터를 포함하는 약학 조성물은 선택적으로 투여 지침과 함께, 용기, 팩 또는 디스펜서에 포함될 수 있다.
전술한 조성물, 방법 및 용도는 예시를 위한 것이며, 제한하려는 의도는 아니다. 본원에 제공된 교시를 사용함으로써, 조성물, 방법 및 용도에 대한 다른 변형을 당업자는 용이하게 이용 가능할 것이다.
다른 구체예에서, 본 발명은 치료에 사용하기 위한, 본 발명에 따른 림프구, 본 발명에 따른 바이러스 벡터 또는 본 발명에 따른 약학 조성물에 관한 것이다.
즉, 본 발명에 따른 림프구, 본 발명에 따른 바이러스 벡터, 또는 본 발명에 따른 림프구 및/또는 바이러스 벡터를 포함하는 약학 조성물이 치료에 사용될 수 있다.
소정의 구체예에서, 본 발명은 암 치료에 사용하기 위한, 본 발명에 따른 림프구, 본 발명에 따른 바이러스 벡터 또는 본 발명에 따른 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 림프구, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포의 특이성을 종양 항원으로 재유도 (redirect)하기 위해, 본 발명에 정의된 CAR의 용도를 제공한다. 본원에는 림프구를 적어도 하나의 IRP 및 CAR를 발현하도록 유전자 변형하고, 생성된 세포를 이를 필요로 하는 수혜자에게 주입하는, 일종의 세포 요법이 개시되어 있다. 상기 주입된 세포는 수혜자의 종양 세포를 사멸시킬 수 있다. 항체 요법과 달리, 본 발명에 따른 림프구는 인 비보 복제될 수 있어서, 장기간 지속을 초래하여 지속적인 종양 제어를 유도할 수 있다.
적어도 하나의 IRP의 과발현으로 인해, 본원에 기재된 림프구는 강력한 인 비보 확장을 겪을 수 있고, 연장된 시간 동안 지속될 수 있다. 임의의 특정 이론에 얽매이지 않고, 본 발명의 림프구에 의해 유발되는 항-종양 면역 반응은 능동 (active) 또는 수동 (passive) 면역 반응일 수 있다. 또한, CAR 매개 면역 반응은 CAR-변형된 림프구가 CAR의 항원 결합 모이어티에 특이적인 면역 반응을 유도하는 입양 면역요법 접근법의 일부일 수 있다.
적어도 하나의 IRP 및 CAR를 발현하는 림프구가 암 치료에 바람직하지만, 이는 또한 적어도 하나의 IRP만을 발현하고, CAR는 발현하지 않는 림프구에 의해 구상될 수 있다. 이 경우에, 적어도 하나의 IRP를 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드는 림프구로 엑스 비보 도입될 수 있고, 그 다음에 유전자 조작된 림프구가 암에 걸린 대상체에게 투여될 수 있다. 선택적으로, 상기 림프구는 종양 항원으로 엑스 비보 자극되어 특정 타입의 암 또는 종양에 대한 특이성을 증가시킬 수 있다. 소정의 구체예에서, 적어도 하나의 IRP를 발현하는 유전자 조작된 림프구가 종양 내로 직접 주사될 수 있다.
그러나, 본 발명은 또한 암 치료에서 IRP1 및/또는 IRP2를 과발현하지만 CAR를 발현하지 않는 림프구의 용도를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
예를 들어, IRP1 및/또는 IRP2는 TIL 또는 TCR-변형된 T 세포에서 과발현될 수 있으며, 이는 후속하여 세포 요법에 사용된다. 본 발명자들은 림프구에서 IRP의 과발현이 림프구의 보다 강력한 증식을 초래한다는 것을 입증하였다. 따라서, TIL 또는 TCR-변형된 T 세포에서 IRP를 과발현하면 보다 효과적인 세포 요법이 유도될 수 있다.
또한, IRP1 및/또는 IRP2는 NK 세포에서 과발현될 수 있으며, 이는 후속하여 세포 요법에 사용된다. 소정의 구체예에서, 상기 NK 세포는 동종 NK 세포이다.
본원에서 사용된, 질병을 "치료 (treat)"한다는 용어는 대상체가 경험하는 질병 또는 장애 중 적어도 하나의 징후 또는 증상의 빈도 또는 중증도를 감소시키는 것을 의미한다.
"질병 (disease)"은 동물 (인간 포함)이 항상성을 유지할 수 없고, 상기 질병이 개선되지 않는 경우, 상기 동물의 건강이 계속 악화되는, 동물 (인간 포함)의 건강 상태이다. 대조적으로, 동물의 "장애 (disorder)"는 동물이 항상성을 유지할 수 있지만, 동물의 건강 상태가 장애가 없을 때보다 덜 유리한 상태인, 동물의 건강 상태이다. 치료하지 않고 방치하면, 장애는 동물의 건강 상태의 추가적 감소를 반드시 야기하는 것은 아니다.
용어 "환자 (patient)", "대상체 (subject)", "개체 (individual)" 및 유사어는 본원에서 상호교환 가능하게 사용되며, 본원에 기재된 방법에 따라 인 비트로 또는 인 시추로 수정 가능한 임의의 동물 또는 이의 세포를 지칭한다. 소정의 비-제한적인 구체예에서, 상기 환자, 대상체 또는 개체는 인간이다.
본원에서 사용된 용어 "암 (cancer)"은 비정상적인 세포의 빠르고 제어되지 않는 성장을 특징으로 하는 질병으로 정의된다. 암세포는 국소적으로, 또는 혈류 및 림프계를 통해 신체의 다른 부분으로 확산될 수 있다.
본 발명에 따른 림프구로 치료될 수 있는 암은 혈관이 형성되지 않았거나 또는 아직 실질적으로 혈관이 형성되지 않은 종양 뿐만 아니라 혈관이 형성된 종양 (vascularized tumors)을 포함한다. 상기 암은 비-고형 종양 (예컨대 혈액 종양, 예를 들어 백혈병 및 림프종)을 포함할 수 있거나, 또는 고형 종양을 포함할 수 있다. 본 발명의 림프구로 치료할 암의 타입은 암종, 모세포종 및 육종, 및 소정의 백혈병 또는 림프성 악성종양, 양성 및 악성 종양, 및 악성종양, 예컨대 육종, 암종 및 흑색종을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 성인 종양/암 및 소아 종양/암이 또한 포함된다.
일 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따라 사용하기 위한 림프구, 바이러스 벡터 또는 약학 조성물에 관한 것으로서, 상기 암은 혈액암 또는 고형 종양이다. 특정 일 구체예에서, 상기 혈액암은 급성 림프모구 백혈병, 미만성 거대 B-세포 림프종, 호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병 또는 다발성 골수종이고, 상기 고형 종양은 결장암, 유방암, 췌장암, 난소암, 간세포 암종, 폐암, 신경모세포종, 교모세포종 또는 육종이다.
혈액암은 혈액 또는 골수의 암이다. 혈액학적 (또는 혈행성) 암의 예로는 백혈병으로, 급성 백혈병 (예컨대 급성 림프구성 백혈병 (acute lymphocytic leukemia), 급성 골수구성 백혈병 (acute myelocytic leukemia), 급성 골수성 백혈병 (acute myelogenous leukemia) 및 골수모구성 (myeloblastic), 전골수구성 (promyelocytic), 골수단핵구 (myelomonocytic), 단핵구 및 적혈구백혈병), 만성 백혈병 (예컨대 만성 골수구성 (과립구) 백혈병, 만성 골수성 백혈병 및 만성 림프구성 백혈병), 진성 적혈구 증가증 (polycythemia vera), 림프종, 호지킨병, 비-호지킨 림프종 (무통성 (indolent) 및 고등급 형태 (high grade forms)), 다발성 골수종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 (Waldenstrom's macroglobulinemia), 중쇄병 (heavy chain disease), 골수이형성 증후군 (myelodysplastic syndrome), 털세포 백혈병 (hairy cell leukemia) 및 척수형성 이상증 (myelodysplasia)을 포함한다.
고형 종양은 통상 낭종 또는 액체 영역을 함유하지 않는 비정상적인 조직 덩어리이다. 고형 종양은 양성 또는 악성일 수 있다. 다양한 타입의 고형 종양은 이를 형성하는 세포 타입에 따라 명명된다 (예컨대 육종, 암종 및 림프종). 고형 종양 예컨대 육종 및 암종의 예로는 섬유육종, 근육종, 지방육종, 연골육종, 골육종 및 기타 육종, 활액종, 중피종, 유잉 종양 (Ewing's tumor), 평활근육종, 횡문근육종, 결장 암종, 림프계 악성 종양, 췌장암, 유방암, 폐암, 난소암, 전립선암, 간세포 암종, 편평세포 암종, 기저세포 암종, 선암종, 땀샘 암종, 갑상선수질 암종, 유두 갑상선 암종, 갈색세포종 피지선 암종 (pheochromocytomas sebaceous gland carcinoma), 유두 암종, 유두 선암종, 수질 암종, 기관지 암종, 신장 세포 암종, 간암종, 담도 암종, 융모 암종, 윌름스 종양 (Wilms' tumor), 자궁경부암, 고환 종양, 정상피종 (seminoma), 방광 암종, 흑색종, 및 CNS 종양 (예컨대 신경아교종 (glioma) (예컨대 뇌간 신경아교종 (brainstem glioma) 및 혼합 신경아교종 (mixed gliomas)), 교모세포종 (glioblastoma) (또한, 다형 신경교종 (glioblastoma multiforme)으로 알려짐), 별아교세포종 (astrocytoma), CNS 림프종, 종자세포종 (germinoma), 수모세포종 (medulloblastoma), 신경집종 (Schwannoma), 두개 인두종 (craniopharyogioma), 뇌실막 세포종 (ependymoma), 솔방울 샘종 (pinealoma), 혈관모세포종 (hemangioblastoma), 청신경 종양 (acoustic neuroma), 희소돌기아교세포종 (oligodendroglioma), 수막종 (menangioma), 신경모세포종 (neuroblastoma), 망막모세포종 (retinoblastoma) 및 뇌 전이 (brain metastases))을 포함한다.
본 발명의 림프구는 CD19를 표적으로 하도록 디자인될 수 있고, pre-B ALL (소아 적응증), 성인 ALL, 외투 세포 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, 동종 골수 이식 후 구제 (salvage post allogenic bone marrow transplantation) 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 암 및 장애를 치료하는데 사용될 수 있다.
본원에 기재된 CAR-변형된 림프구는 또한 대상체에서 엑스 비보 면역화 및/또는 인 비보 요법을 위한 일종의 백신으로서 작용할 수 있다. 바람직하게는, 상기 대상체는 인간이다.
엑스 비보 면역화와 관련하여, 상기 림프구를 대상체에게 투여하기 전에 하기들 중 적어도 하나가 인 비트로에서 발생한다: i) 세포의 확장, ii) 적어도 하나의 IRP 및/또는 CAR를 코딩하는 적어도 하나의 합성 뉴클레오티드의 세포로의 도입, 및/또는 iii) 상기 세포의 냉동보존.
엑스 비보 절차는 당해 분야에 잘 알려져 있다. 간략하게는, 림프구는 대상체 (바람직하게는 인간)로부터 단리되고, 본원에 개시된 적어도 하나의 IRP 및/또는 CAR를 발현하는 적어도 하나의 벡터로 유전자 변형 (즉, 인 비트로 형질도입 또는 형질감염)된다. 적어도 하나의 IRP를 발현하는 CAR-변형된 세포를 수혜자에게 투여하여 치료적 유익을 제공할 수 있다. 상기 수혜자는 인간일 수 있고, 변형된 림프구는 수혜자와 관련하여 자가 (autologous)일 수 있다. 대안으로서, 상기 림프구는 수혜자에 대해 동종 (allogeneic), 동계 (syngeneic) 또는 이종 (xenogeneic)일 수 있다.
미국특허 제5,199,942호에 기재된 조혈 줄기세포 및 전구 세포의 엑스 비보 확장을 위한 절차는 본 발명의 세포에 적용될 수 있다. 다른 적절한 방법이 당해 분야에 알려져 있으며, 그러므로 본 발명은 세포의 엑스 비보 확장의 임의의 특정 방법으로 제한되지 않는다. 간략하게는, 림프구의 엑스 비보 배양 및 확장은 하기 단계를 포함한다: (1) 말초 혈액 수확물 또는 골수 외식편으로부터 포유동물 유래의 CD34+ 조혈 줄기 세포 및 전구 세포를 수집하는 단계; 및 (2) 이러한 세포를 엑스 비보 확장시키는 단계. 미국특허 제5,199,942호에 기재된 세포 성장 인자에 추가하여, 다른 인자 예컨대 flt3-L, IL-1, IL-3 및 c-kit 리간드가 세포의 배양 및 확장을 위해 사용될 수 있다.
엑스 비보 면역화의 측면에서 세포-기반 백신을 사용하는 것에 추가하여, 본 개시내용은 또한 환자에서 항원에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 인 비보 면역화를 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
일반적으로, 본원에 기재된 바와 같이 활성화되고 확장된 림프구는 면역손상된 개체에서 발생하는 질병의 치료 및 예방에 이용될 수 있다. 구체적으로, 본원에 기재된 CAR-변형된 림프구는 만성 림프구성 백혈병 (CCL)의 치료에 사용될 수 있다. 소정의 구체예에서, 본원에 기재된 림프구는 CCL 발병 위험이 있는 환자의 치료에 사용될 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 본 발명의 림프구를 치료적으로 유효한 양으로 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, CCL의 치료 또는 예방을 제공한다.
대안으로서, 암 치료에 사용하기 위한 림프구는 NK 세포, TIL 또는 TCR-변형된 림프구일 수 있다. NK 세포, TIL 또는 TCR-변형된 T 세포는 IRP1 및/또는 IRP2를 과발현하도록 본 발명의 방법으로 변형될 수 있으며, 이는 NK 세포, TIL 또는 TCR-변형된 T-세포의 보다 효과적인 인 비보 증식을 초래할 수 있다.
암 치료에 사용되는 NK 세포는 동종 NK 세포일 수 있으며, 이는 동종 NK 세포가 이식편대 숙주 질환 (GvHD)을 일으키지 않고 이식편대 백혈병/종양 (GvL/GvT) 효과를 가지므로, 면역병리를 덜 유발하기 때문이다.
암 치료에 사용하기 위한 TIL은 WO 2018/182817에 기재된 바와 같이 수득될 수 있고, 적어도 하나의 IRP를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 도입함으로써 추가로 변형될 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명은 바이러스 감염을 예방 및/또는 치료하는데 사용하기 위한, 본 발명에 따른 림프구, 본 발명에 따른 바이러스 벡터 또는 본 발명에 따른 약학 조성물에 관한 것이다.
즉, 본 발명에 따른 림프구는 또한 바이러스 감염의 예방 및 치료에 사용될 수 있다. 바이러스-특이적 T 세포는 예를 들어 조혈 줄기세포 이식을 받은 대상체에서 바이러스 감염을 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있지만 이에 국한되지 않는 것으로 알려져 있다. 바이러스-특이적 T 세포는 바이러스 항원, 예를 들어 바이러스 항원성 펩티드, 전체 바이러스 입자, 바이러스 용해물, 전체 바이러스 단백질 또는 바이러스 벡터를 표시하는 항원-제시 세포로 T 세포를 자극하고 확장시킴으로써 생성될 수 있다. 대안으로서, 바이러스-특이적 T 세포는 특정 바이러스 항원에 결합하는 것으로 알려진 천연 또는 조작된 T 세포 수용체를 발현함으로써 생성될 수 있다. 그 다음에 생성된 바이러스-특이적 T 세포는 바이러스 감염을 앓고 있거나 또는 바이러스 감염을 획득할 위험이 있는 대상체에게 투여될 수 있다.
바이러스-특이적 T 세포에서 적어도 하나의 IRP를 발현시킴으로써 가성 철-결핍 상태를 형성하면 바이러스-특이적 T 세포가 유도될 수 있고, 이는 상기 바이러스-특이적 T 세포가 대상체에게 투여된 후에 더 강력하게 증식할 수 있다. 결과적으로, 적어도 하나의 IRP를 발현하도록 유전자 조작된 바이러스-특이적 T 세포는 유전자 조작되지 않은 바이러스 특이적 T 세포와 비교하여, 바이러스 감염을 예방 또는 치료하는데 더 효과적일 수 있다. 적어도 하나의 IRP를 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드는 바이러스 항원으로 T 세포를 자극하기 전, 자극하는 동안 또는 자극한 후에, T 세포내로 도입될 수 있다.
상기에 기재된 바이러스 감염의 예방 및 치료에는 CAR의 존재를 반드시 필요로 하는 것은 아니다. 그러나, CAR를 추가로 포함하는 본 발명에 따른 림프구를 사용하면, 적어도 일부 경우에 바이러스의 림프구에 의한 인식을 향상시킬 수 있다. 이러한 경우에, 상기 CAR는 바람직하게는 바이러스 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따라 사용하기 위한 림프구, 바이러스 벡터 또는 약학 조성물에 관한 것으로서, 상기 바이러스 감염은 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 아데노바이러스, 폴리오마바이러스, 인플루엔자 바이러스 또는 인간 헤르페스바이러스에 의해 유발되며, 구체적으로 상기 인간 헤르페스바이러스는 거대세포바이러스 (CMV), 엡스타인-바 바이러스 (EBV), 단순 헤르페스 바이러스 (HSV), 바리젤라-조스터 바이러스 (VZV) 또는 인간 헤르페스바이러스 8 (HHV8)이다.
인간 거대세포바이러스는 일반 인구에서 유병률 (prevalence rates)이 50-100 %인 전반적 β-헤르페스 바이러스이다. 면역적격 숙주 (immunocompetent host)에서 경증의 자가-제한 질병 (self-limiting disease)으로 나타날 수 있지만, CMV는 면역손상된 숙주 (immunocompromised host)에서 생명을 위협하는 심각한 질병을 유발할 수 있다. CMV는 급성 감염 후에 잠복 형태로 지속되기 때문에, CMV-특이적 CD4+ 및 CD8+ T 세포가 바이러스 휴지 (viral quiescence)를 유지하는데 필요하다. HSCT 후 환자에서, 공여자 면역이 부재하고, 다른 면역결핍 상태에서, CMV는 망막염, 폐렴, 간염 또는 장염의 형태로 재활성화될 수 있다. CMV-특이적 T 세포의 입양 전달은 이러한 개체에서 CMV 재활성화를 치료 및 예방하기 위한 논리적 전략이며, 수많은 임상 시험으로부터 바이러스 특이적 T 세포의 전반적으로 우수한 효능을 확인하였다. 제대혈 (umbilical cord blood: UCB)의 나이브 T 세포로부터 생성된 CMV-특이적 VST가 또한 효과적인 것으로 입증되었다. 이러한 VST는 기능을 유지하면서 비정형 에피토프에 대한 특이성을 나타낸다.
EBV는 이식 후에 독특한 합병증을 유발할 수 있는 편재하는, 고도의 면역원성 γ-헤르페스바이러스이다. 일반 인구의 90% 이상이 감염되었고, 평생 혈청양성 (seropositivity)을 유지한다. 1차 EBV 감염의 징후는 무증상 감염으로부터 쇠약성 바이러스 질병에 이르기까지 다양하다. 그 후에 대부분의 경우, EBV는 지속적인 T 세포 면역 감시하에 B 세포 및 점막 상피 저장소 (mucosal epithelial reservoir)에 평생 잠복 상태로 남아 있다. 이들 건강한 개체에서, 순환 T 세포의 최대 2%가 EBV 특이적이다. HSCT 후 면역 결핍 기간에, EBV 재활성화는 바이러스혈증 (viremia) 및 생명을 위협하는 이식후 림프구증식 질환 (post transplant lymphoproliferative disease: PTLD)을 유발할 수 있다. 모노클로날 항체인 리툭시맙 (rituximab)은 EBV 바이러스가 존재하는 B 세포를 제거하여 많은 환자의 중증 EBV 질환을 성공적으로 치료하였지만, 이는 장기적으로 항체 생성을 감소시키고, PTLD를 제어하는데 항상 성공적인 것은 아니다.
아데노바이러스 감염은 경증 상기도 감염으로부터 생명을 위협하는 폐렴, 위장, 간, 신장 및 신경학적 합병증에 이르기까지 다양할 수 있다. 감염 후에, 림프 조직에서 잠복기가 유지되지만, T 세포 면역이 장기 부재하는 기간 동안 바이러스가 재활성화될 수 있다. 아데노바이러스는 HSCT 후 수혜자에서 잠재적으로 치명적인 바이러스 합병증을 유발한다. 항바이러스제 예컨대 리바비린 (ribavirin)은 대체로 효과가 없다. 그러나, 건강한 공여자로부터 생성된 아데노바이러스-특이적 T 세포는 진행성 질환의 치료에도 효과적인 것으로 입증되었다. 이러한 이유로, 아데노바이러스 항원은 종종 다중바이러스-특이적 T 세포 산물의 생성에 포함된다.
통상 대부분의 성인 개체의 건강한 조직에 잠복해 있는 BK 및 JC 폴리오마바이러스는 HSCT 후에 및 면역결핍 개체에서 재활성화된다. BK 바이러스는 신장병증 (nephropathy) 및 생명을 위협하는 출혈성 방광염 (hemorrhagic cystitis: HC)으로 나타날 수 있다. 드물게, 밀접하게 연관된 JC 바이러스는 진행성 다초점 백질뇌병증 (progressive multifocal leukoencephalopathy)으로 인한 치명적인 뇌 손상을 유발한다. 폴리오마-특이적 VST는 이들 바이러스를 퇴치하기 위해 개발되고 있다. 단일 사례 보고에서 BK VST의 성공적인 사용을 기재하였고, 그 후에 환자는 방관자 장기 독성 (bystander organ toxicity), GVHD 또는 이식 거부 없이 HC를 완전히 해결하였다. VST의 엑스 비보 선택 및 확장을 위해 개발된 플랫폼은 면역 결핍 상태를 복잡하게 만드는 다른 많은 바이러스에 쉽게 적응될 수 있으며, 향후 개발에는 VZV, HHV, 심지어 HIV 또는 인플루엔자를 포함한 일련의 바이러스를 표적으로 하는 VST 개발을 포함한다.
일 구체예에서, 본 발명은 암에 걸린 대상체를 치료하는 방법, 또는 대상체에서 바이러스 감염을 예방 및/또는 치료하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 본 발명에 따른 림프구, 본 발명에 따른 바이러스 벡터 또는 본 발명에 따른 약학 조성물을 치료적으로 유효한 양으로 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본원에 기재된 림프구 또는 약학 조성물은 치료 (또는 예방)할 질환에 적절한 방식으로 투여될 수 있다. 투여의 양 및 빈도는 환자의 병태, 환자 질병의 타입 및 중증도와 같은 요인에 의해 결정될 것이며, 적절한 투여량은 임상 시험에 의해 결정될 수 있다.
본원에서 사용된 "유효량 (effective amount)"은 치료적 또는 예방적 유익을 제공하는 양을 의미한다. 용어 "치료적으로 유효한 양 (therapeutically effective amount)"은 대상 화합물이 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의가 추구하는 조직, 시스템 또는 대상체의 생물학적 또는 의학적 반응을 유발하는, 이의 양을 지칭한다. 용어 "치료적으로 유효한 양"은 화합물이 투여되는 경우 치료되는 장애 또는 질병의 징후들 또는 증상들 중 하나 이상의 발병을 예방하거나, 또는 이를 어느 정도 완화시키기에 충분한, 상기 화합물의 양을 포함한다. 치료적으로 유효한 양은 화합물, 질병 및 이의 중증도, 및 치료할 대상체의 연령, 체중 등에 따라 달라질 것이다.
"면역학적으로 유효한 양 (an immunologically effective amount)", "항-종양 유효량 (an anti-tumor effective amount)", "종양-억제 유효량 (a tumor-inhibiting effective amount)" 또는 "치료량 (therapeutic amount)"이 표시되는 경우, 투여할 본 발명의 림프구 또는 조성물의 정확한 양은 연령, 체중, 종양 크기, 감염 또는 전이의 정도, 바이러스 감염 타입, 바이러스 감염의 중증도 및/또는 환자 (대상체) 병태에 있어서 개인차를 고려하여 의사가 결정할 수 있다. 일반적으로 본원에 기재된 림프구를 포함하는 약학 조성물은 체중 1 kg 당 104 내지 109 세포/kg, 바람직하게는 체중 1 kg 당 105 내지 106 세포/kg의 투여량으로 투여될 수 있으며, 이들 범위들 내의 모든 정수 값을 포함한다고 할 수 있다. 림프구 조성물은 또한 이들 투여량으로 여러 번 투여될 수 있다. 상기 림프구는 면역요법에서 통상 알려진 주입 기술 (infusion techniques)을 사용하여 투여될 수 있다 (Rosenberg, et al., 1988, New Eng. J. of Med; 319:1676.). 특정 환자에 대한 최적의 투여량 및 치료 용법은 환자를 질병의 징후에 대해 모니터링하고 그에 따라 치료를 조정함으로써, 의약 분야의 숙련자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
활성화된 림프구를 대상체에게 투여한 다음에, 후속하여 혈액을 다시 채취하고 (또는 성분채집술 (apheresis)을 수행하고), 본 발명에 따라 유래된 림프구를 활성화시키고, 이들 활성화 및 확장된 림프구를 환자에게 재주입하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 과정은 몇 주마다 여러 번 수행될 수 있다. 림프구는 10 mL 내지 400 mL의 채취된 혈액으로부터 활성화될 수 있으며, 예를 들어 림프구는 20 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL, 60 mL, 70 mL, 80 mL, 90 mL, 또는 100 mL의 채취된 혈액으로부터 활성화될 수 있다. 이론에 얽매이지 않고, 이러한 다중 채혈/다중 재주입 프로토콜을 사용하여, 림프구의 소정의 집단을 선택하는데 제공될 수 있다.
상기 림프구 또는 조성물의 투여는 에어로졸 흡입, 주사, 섭취, 수혈, 삽입 (implantation) 또는 이식 (transplantation)을 포함하는, 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 본원에 기재된 림프구 또는 조성물은 대상체에게 피하, 피부내, 종양내, 결절내, 골수내, 근육내, 정맥내 (i.v.) 주사에 의해, 또는 복강내로 투여될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 림프구 또는 조성물은 환자에게 피부내 또는 피하 주사에 의해 투여될 수 있다. 다른 예에서, 본원에 기재된 림프구 또는 조성물은 바람직하게는 i.v. 주입에 의해 투여될 수 있다. 상기 림프구 또는 조성물은 종양, 림프절 또는 감염 부위에 직접 주사될 수 있다.
소정의 예에서, 본원에 기재된 방법, 또는 림프구가 치료 수준으로 확장되는 당해 분야에 알려진 다른 방법을 사용하여 활성화 및 확장된 림프구를 환자에게, 항바이러스 요법과 같은 제제를 사용한 치료, MS 환자의 경우 시도포비르 및 인터루킨-2, 리바비린, 리툭시맙, 시타라빈 (또한, ARA-C로 알려짐) 또는 나탈리주맙 치료, 또는 건선 환자의 경우 에팔리주맙 치료, 또는 PML 환자의 경우 다른 치료를 포함하지만 이에 한정되지 않는, 임의의 수의 관련 치료 양상과 함께 (예컨대, 이들 전에, 이와 동시에, 또는 이후에) 투여된다. 또한, 본원에 개시되어 있는 바와 같이, 본 발명의 림프구는 화학요법, 방사선, 면역억제제, 예컨대 사이클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 미코페놀레이트, 및 FK506, 항체, 또는 기타 면역절제제 (immunoablative agents) 예컨대 CAMPATH, 항-CD3 항체 또는 기타 항체 요법, 사이톡신, 플루다리빈, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 미코페놀산, 스테로이드, FR901228, 사이토카인 및 방사선 조사와 조합하여 사용될 수 있다. 이러한 약물은 칼슘 의존성 포스파타제 칼시뉴린 (사이클로스포린 및 FK506)을 억제하거나, 또는 성장 인자 유도 신호전달에 중요한 p70S6 키나제 (라파마이신)를 억제한다 (Liu, et al., 1991, Cell; 66:807-815; Henderson et al., 1991, Immun; 73:316-321; Bierer et al., 1993, Curr. Opin. Immun; 5:763-773). 또한, 본원에 개시되어 있는 바와 같이, 본 발명의 림프구 또는 조성물은 환자에게, 골수 이식, 플루다라빈과 같은 화학요법제를 사용하는 T 세포 절제 요법, 외부-빔 방사선 요법 (XRT), 사이클로포스파미드, 또는 OKT3 또는 CAMPATH와 같은 항체와 함께 (예컨대, 이들 전에, 이와 동시에 또는 이후에) 투여될 수 있다. 또한 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 림프구 또는 조성물은 CD20과 반응하는 제제, 예컨대 리툭산 (Rituxan)과 같은 B-세포 절제 요법 후에 투여될 수 있다. 예를 들어, 대상체는 고용량 화학요법에 이어 말초혈액 줄기세포 이식으로 표준 치료를 받을 수 있다. 소정의 예에서, 이식 후에, 대상체는 본 발명의 확장된 면역 세포의 주입을 받을 수 있거나, 또는 확장된 세포는 수술 전 또는 수술 후에 투여된다.
대상체에게 투여할 상기 치료의 투여량은 치료되는 병태의 정확한 특성 및 치료의 수혜자에 따라 달라질 것이다. 인간 투여를 위한 투여량의 스케일링 (scaling)은 당해 분야에서 허용되는 관행에 따라 수행될 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 방법에 관한 것으로서, 상기 암은 혈액암 또는 고형 종양이고, 구체적으로 상기 혈액암은 급성 림프모구 백혈병, 미만성 거대 B-세포 림프종, 호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병 및 다발성 골수종이거나, 또는 상기 고형 종양은 결장암, 유방암, 췌장암, 난소암, 간세포 암종, 폐암, 신경모세포종, 교모세포종 및 육종이다.
일 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 방법에 관한 것으로서, 상기 바이러스 감염은 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 아데노바이러스, 폴리오마바이러스, 인플루엔자 바이러스 또는 인간 헤르페스바이러스에 의해 유발되고, 구체적으로 상기 인간 헤르페스바이러스는 거대세포바이러스 (CMV), 엡스타인-바 바이러스 (EBV), 단순 헤르페스 바이러스 (HSV), 바리젤라-조스터 바이러스 (VZV) 또는 인간 헤르페스바이러스 8 (HHV8)이다.
일 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 림프구를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 대상체로부터 수득된 림프구를 제공하는 단계; b) 적어도 하나의 철 조절 단백질을 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드를 상기 단계 (a)의 림프구로 도입하는 단계로서, 상기 철 조절 단백질은 IRP1 (서열번호: 1) 및/또는 IRP2 (서열번호: 2-6)인 것인 단계; 및 c) 상기 단계 (b)에서 림프구 내로 도입된 합성 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 적어도 하나의 철 조절 단백질을 발현시키는 단계. 상기 림프구는 본원에 개시된 임의의 림프구일 수 있다는 것을 이해해야 한다.
선택적으로, 본 발명은 추가로 본 발명에 따른 방법에 관한 것으로서, 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 제2 합성 폴리뉴클레오티드가 단계 (b)에서 림프구 내로 도입된다.
즉, 본 발명에 따른 방법은 IRP1 및/또는 IRP2를 과발현하는 림프구를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 추가로, 본 발명에 따른 방법은 2개의 합성 폴리뉴클레오티드인, IRP1 및/또는 IRP2를 코딩하는 제1 합성 폴리뉴클레오티드 및 CAR를 코딩하는 제2 합성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 림프구를 제조하는데 사용될 수 있다. 후자의 경우에, IRP1 및/또는 IRP2를 코딩하는 제1 합성 폴리뉴클레오티드 및 CAR를 코딩하는 제2 합성 폴리뉴클레오티드가 본원에 기재된 바와 같이 서로 융합될 수 있음을 이해해야 한다. 대안으로서, IRP1 및/또는 IRP2를 코딩하는 제1 합성 폴리뉴클레오티드 및 CAR를 코딩하는 제2 합성 폴리뉴클레오티드는 관련이 없을 수 있다. 즉, IRP1 및/또는 IRP2를 코딩하는 제1 합성 폴리뉴클레오티드 및 CAR를 코딩하는 제2 합성 폴리펩티드는 독립적으로 림프구 내로 도입될 수 있다. 바람직하게는, 상기 합성 폴리뉴클레오티드는 림프구 내로 바이러스 형질도입에 의해 도입되고, 림프구의 게놈 내로 통합된다. 따라서, IRP1 및/또는 IRP2를 코딩하는 제1 합성 폴리뉴클레오티드 및 CAR를 코딩하는 제2 합성 폴리펩티드는 상이한 바이러스 벡터내에 포함될 수 있다. IRP1 및/또는 IRP2를 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 바이러스 벡터 및 CAR를 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 바이러스 벡터는 단일 형질도입 실험에서 림프구 내로 도입될 수 있다. 대안으로서, 상기 림프구는 IRP1 및/또는 IRP2를 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 바이러스 벡터 및 CAR를 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 바이러스 벡터로 단계적 방식으로 형질도입될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 림프구는 CAR를 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터로 먼저 형질도입되어 CAR T 세포 또는 CAR NK 세포를 생성할 수 있고 (이에 제한되지 않음), 두 번째 단계에서 IRP1 및/또는 IRP2를 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터로 형질도입될 수 있다. 대안으로서, 상기 림프구는 먼저 IRP1 및/또는 IRP2를 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터로 형질도입될 수 있고, 두 번째 단계에서 CAR를 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터로 형질도입될 수 있다.
본 발명의 림프구의 유전자 변형 이전에, 림프구의 공급원은 대상체로부터 입수될 수 있다. 림프구는 말초 혈액, 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 혈액, 흉선 조직, 감염 부위의 조직, 복수 (ascites), 흉막 삼출액 (pleural effusion), 비장 조직, 및 종양을 포함하는, 여러 공급원으로부터 입수될 수 있다. 본 발명 내에서, 당해 분야에서 이용 가능한 임의의 타입의 림프구가 사용될 수 있다. 일반적으로, 당업자는 적절한 공급원으로부터 소정의 타입의 림프구를 단리하는 방법을 알고 있다.
소정의 타입의 림프구, 구체적으로 말초혈액 단핵 세포 (peripheral blood mononuclear cell: PBMC)는 Ficoll™ 분리와 같은 숙련된 기술자에게 알려진 임의의 수의 기술을 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액 유닛로부터 수득될 수 있다. 또한, 개체의 순환 혈액으로부터 세포를 성분채집술로 수득할 수 있다. 상기 성분채집 산물은 전형적으로 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 기타 유핵 백혈구, 적혈구 및 혈소판을 포함하는, 림프구를 포함한다. 성분채집술에 의해 수집된 세포를 세척하여 혈장 분획을 제거하고 후속 처리 단계를 위해 상기 세포를 적절한 버퍼 또는 배지 중에 배치할 수 있다. 예를 들어, 상기 세포는 포스페이트 완충 식염수 (phosphate buffered saline: PBS)로 세척될 수 있다. 대안으로서, 세척 용액은 칼슘이 결여될 수 있고, 마그네슘이 결여될 수 있거나, 또는 2가 양이온이 전부는 아니지만 많이 결여될 수 있다. 당업자가 쉽게 이해할 수 있는 바와 같이, 세척 단계는 반-자동화 "플로우스루 (flowthrough)" 원심분리기 (예를 들어, Cobe 29 세포 처리기, Baxter CytoMate, 또는 Haemonetics Cell Saver 5)를 제조자의 지침에 따라 사용하는, 당해 분야에 알려진 방법에 의해 수행될 수 있다. 세척 후에, 상기 세포는 다양한 생체적합성 버퍼, 예를 들어 Ca+-무함유, Mg+-무함유 PBS, PlasmaLyte A, 또는 버퍼를 함유하거나 또는 함유하지 않는 기타 식염수 용액 중에 재현탁될 수 있다. 대안으로서, 성분채집 샘플의 바람직하지 않은 성분은 제거될 수 있고, 세포는 배양 배지에 직접 재현탁될 수 있다. 대안으로서, 소정의 타입의 림프구는 예를 들어 PERCOLL™ 구배를 통한 원심분리 또는 역류 원심분리 세정 (counterflow centrifugal elutriation)에 의해 적혈구를 용해하고 단핵구를 고갈시켜 단리될 수 있다.
림프구의 특정 하위집단 예컨대 CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+, 및 CD45RO+ T 세포, CD16+ 및 CD56+ NK 세포 또는 CD3+, CD56+ 및 CD161+ NKT 세포는 양성 또는 음성 선별 기술에 의해 추가로 단리될 수 있다. 표면 항원이 림프구의 각 타입에 대해 제시되는 것이 당해 분야에 알려져 있다. 따라서, 당업자는 특정 타입의 림프구의 농축 또는 단리를 허용하는 양성 또는 음성 선별을 위한 조건을 선택할 수 있다. 또한, 당업자는 소정의 타입의 림프구의 농축 및/또는 단리를 위한 상업용 키트를 알고 있다.
소정의 구체예에서, T 세포는 원하는 T 세포의 양성 선별을 위해 충분한 기간 동안, 항-CD3/항-CD28-접합 비드, 예컨대 DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T와 함께 인큐베이션함으로써 단리될 수 있다. 상기 기간 (time period) 범위는 30분 내지 36시간 또는 그 이상일 수 있으며, 그 사이의 모든 정수 값을 포함할 수 있다. 소정의 구체예에서, 상기 기간은 적어도 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6시간이다. 대안으로서, 상기 기간은 10 내지 24시간이다. 백혈병 환자로부터 T 세포를 단리하기 위해, 24시간과 같이 더 긴 인큐베이션 시간을 사용하면 세포 수율을 증가시킬 수 있다. 더 긴 인큐베이션 시간을 사용하면, 종양 조직 또는 면역손상된 개체로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)를 단리하는 것과 같이, 다른 세포 타입과 비교하여 T 세포가 더 적은 임의의 상황에서 T 세포를 단리할 수 있다. 또한, 더 긴 인큐베이션 시간을 사용하면, CD8+ T 세포의 포획 효율을 증가시킬 수 있다. 따라서, T 세포가 CD3/CD28 비드에 결합하도록 하는 시간을 단순히 단축 또는 연장시킴으로써 및/또는 비드 대 T 세포의 비율을 증가 또는 감소시킴으로써, T 세포의 하위집단은 배양 개시 시에 또는 공정 중 다른 시점에서 우선적으로 선별될 수 있고, 추가적으로, 비드 또는 다른 표면 상의 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체의 비율을 증가 또는 감소시킴으로써, T 세포의 하위집단은 배양 개시 또는 다른 원하는 시점에서 우선적으로 선별될 수 있다. 당업자는 본 발명의 맥락에서 다회의 선별 라운드가 또한 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 소정의 구체예에서, 선별 절차를 수행하고, 활성화 및 확장 과정에서 "선별되지 않은" 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. "선별되지 않은" 세포는 또한 추가의 선별 라운드가 수행될 수 있다.
림프구 집단의 음성 선별에 의한 농축은 음성 선별된 세포에 고유한 표면 마커에 대한 항체의 조합을 사용하여 달성될 수 있다. 일 방법으로는 음성 선별된 세포에 존재하는 세포 표면 마커에 대한 모노클로날 항체들의 칵테일을 사용하는 음성 자기 면역부착 (negative magnetic immunoadherence) 또는 유세포 분석 (flow cytometry)을 통한 세포 분류 및/또는 선별이다. 예를 들어, CD4+ 세포를 음성 선별에 의해 농축하기 위해, 모노클로날 항체 칵테일에는 전형적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR 및 CD8에 대한 항체들을 포함한다. 소정의 구체예에서, 전형적으로 CD4+ CD25+, CD62L, GITR+ 및 FoxP3+를 발현하는 조절 T 세포를 농축하거나 또는 양성으로 선별하는 것이 바람직할 수 있다. 대안으로서, 소정의 구체예에서, T 조절 세포는 항-CD25 접합 비드 또는 다른 유사한 선별 방법에 의해 고갈될 수 있다.
소정의 구체예에서, 건강한 공여자 또는 환자로부터의 NK 세포는 인간 NK 세포 음성 선별 단리 키트 (Miltenyi Biotec 또는 STEMCELL Technologies)를 제조자의 지침에 따라 사용하여 자기 비드와 함께 인큐베이션함으로써 PBMC로부터 또는 혈액으로부터 직접 농축될 수 있다. 예를 들어, Miltenyi Biotec의 단리 키트를 사용하는 경우, 원치 않는 세포 (즉, T 세포, B 세포, 마크로파지 및 단핵구)는 25억개의 세포/mL의 PBMC 농도로 NK 세포에 의해 발현되지 않는 항원에 대한 바이오틴-접합된 모노클로날 항-인간 항체들의 칵테일을 사용하여 제거될 수 있다. 그 다음에 바이오틴-접합된 항체로 표지된 원하지 않는 세포는 NK 세포 MicroBead 칵테일을 사용하여 자기적으로 (magnetically) 표지되고, MACS 컬럼을 사용하여 제거될 수 있다. 예를 들어, STEMCELL Technologies의 단리 키트를 사용하는 경우, 원치 않는 세포 (즉, T 세포, B 세포, 마크로파지 및 단핵구)는 5천만 개의 세포/mL의 PBMC 농도로 NK 세포에 의해 발현되지 않는 항원에 대한 4량체 항-인간 항체 복합체를 사용하여 제거될 수 있다. 4량체 항체 복합체로 표지된 원치 않는 세포는 덱스트란-코팅된 자기 입자로 자기적으로 표지되고, 자석을 사용하여 제거될 수 있다.
원하는 림프구 집단의 양성 또는 음성 선별에 의한 단리를 위해, 세포 및 표면 (예컨대, 입자 예컨대 비드)의 농도가 가변될 수 있다. 소정의 구체예에서, 세포 및 비드의 최대 접촉을 보장하기 위해, 비드 및 세포가 함께 혼합되는 부피를 유의미하게 감소시키는 (즉, 세포의 농도를 증가시키는) 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 일 구체예에서, 20억개의 세포/mL의 농도가 사용될 수 있다. 일 구체예에서, 10억개의 세포/mL의 농도가 사용될 수 있다. 추가의 구체예에서, 1억개 초과의 세포/mL이 사용될 수 있다. 추가의 일 구체예에서, 0, 15,000,000, 20,000,000, 25,000,000, 30,000,000, 35,000,000, 40,000,000, 45,000,000, 또는 50,000,000개의 세포/mL의 세포 농도가 사용될 수 있다. 다른 구체예에서, 75,000,000, 80,000,000, 85,000,000, 90,000,000, 95,000,000, 또는 100,000,000개의 세포/mL의 세포 농도가 사용될 수 있다. 추가의 구체예에서, 125,000,000 또는 150,000,000개의 세포/mL의 농도가 사용될 수 있다. 고농도를 사용하면 세포 수율, 세포 활성화 및 세포 확장의 증가를 초래할 수 있다. 또한, 높은 세포 농도를 사용하면 CD28-음성 T 세포와 같은 관심 표적 항원을 약하게 발현할 수 있는 세포, 또는 많은 종양 세포가 존재하는 샘플 (즉, 백혈병 혈액, 종양 조직 등)로부터 보다 효과적인 포획을 허용할 수 있다. 이러한 세포 집단은 치료적 가치를 가질 수 있고, 수득하는 것이 바람직할 것이다. 예를 들어, 고농도의 세포를 사용하면, 통상 더 약한 CD28 발현을 갖는 CD8+ T 세포를 보다 효과적으로 선택할 수 있다.
관련된 구체예에서, 더 낮은 농도의 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 세포 및 표면 (예컨대, 입자 예컨대 비드)의 혼합물을 유의미하게 희석함으로써, 입자 및 세포 사이의 상호작용을 최소화할 수 있다. 이는 입자에 결합할 원하는 항원을 다량으로 발현하는 세포를 선별할 수 있다. 예를 들어, CD4+ T 세포는 더 높은 수준의 CD28을 발현할 수 있으며, 희석 농도의 CD8+ T 세포보다 더 효과적으로 포획된다.
상기 림프구는 2-10 ℃ 또는 실온에서 다양한 속도로 다양한 시간 동안 회전 장치 (rotator)에서 인큐베이션될 수 있다. 자극을 위한 세포는 또한 세척 단계 후에 동결될 수 있다. 이론에 얽매이지 않고, 동결 및 후속하는 해동 단계는 세포 집단에서 과립구 및 어느 정도의 단핵구를 제거함으로써 보다 균일한 산물을 제공할 수 있다. 혈장 및 혈소판을 제거하는 세척 단계 후에, 세포를 동결 용액에 현탁시킬 수 있다. 많은 동결 용액 및 파라미터가 당해 분야에 알려져 있고, 이러한 맥락에서 유용할 것이지만, 일 방법으로는 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민을 함유하는 PBS, 또는 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민 및 7.5% DMSO, 또는 1.25% 플라스마라이트-A (Plasmalyte-A), 3.25% 덱스트로스 5%, 0.45% NaCl, 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민, 및 7.5% DMSO를 함유하는 배양 배지, 또는 예를 들어, 헤스판 (Hespan) 및 플라스마라이트-A (PlasmaLyte-A)를 함유하는 다른 적절한 세포 동결 배지를 사용하는 것을 포함한다. 그 다음에 상기 세포를 분당 1℃의 속도로 -80℃까지 동결시키고, 액체 질소 저장 탱크의 증기상 (vapor phase)에 저장할 수 있다. -20℃ 또는 액체 질소에서 즉시 비-제어된 동결 방법 뿐만 아니라 제어된 동결의 다른 방법이 사용될 수 있다.
냉동보존된 세포는 본원에 기재된 바와 같이 해동 및 세척될 수 있고, 본 발명의 방법을 사용하여 활성화시키기 전에 실온에서 1시간 동안 휴지되도록 할 수 있다.
또한 본 발명의 맥락에서 본원에 기재된 바와 같은 확장된 세포를 필요로 하기 전의 기간에 대상체로부터 혈액 샘플 또는 성분채집 산물의 수집이 고려된다. 이와 같이, 확장될 세포의 공급원은 필요한 임의의 시점에 수집될 수 있고, 원하는 세포 예컨대 림프구가 단리되고, 본원에 기재된 바와 같은 세포 요법으로부터 유익할 수 있는 임의의 여러 질병 또는 병태에 대한 세포 요법에서 이후에 사용하기 위해 동결된다. 혈액 샘플 또는 성분채집술은 일반적으로 건강한 대상체로부터 채취할 수 있다. 소정의 구체예에서, 혈액 샘플 또는 성분채집술은 질병이 발병할 위험이 있지만 아직 질병이 발병하지 않은 일반적으로 건강한 대상체로부터 채취될 수 있으며, 관심 세포는 단리되고, 이후 사용하기 위해 동결될 수 있다. 소정의 구체예에서, 상기 세포는 확장되고, 동결되고, 이후에 사용될 수 있다. 소정의 구체예에서, 샘플은 본원에 기재된 바와 같은 특정 질병의 진단 직후 그러나 임의의 치료 전에 환자로부터 수집될 수 있다. 또한, 상기 세포는 제제 예컨대 나탈리주맙, 에팔리주맙, 항바이러스제, 화학요법, 방사선, 면역억제제, 예컨대 사이클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 미코페놀레이트, 및 FK506, 항체, 또는 다른 면역절제제 예컨대 CAMPATH, 항-CD3 항체, 사이톡산, 플루다라빈, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 미코페놀산, 스테로이드, FR901228, 및 방사선 조사를 사용하는 치료를 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 수의 관련 치료 양상 전에, 대상체 유래의 혈액 샘플 또는 성분채집술로부터 단리될 수 있다. 이러한 약물들은 칼슘 의존성 포스파타제 칼시뉴린 (사이클로스포린 및 FK506)을 억제하거나 또는 성장 인자 유도 신호전달에 중요한 p70S6 키나제 (라파마이신)를 억제한다 (99-101). 소정의 구체예에서, 상기 세포는 환자로부터 단리되고, 골수 또는 줄기세포 이식, 플루다라빈과 같은 화학요법제를 사용하는 T 세포 절제 요법, 외부-빔 방사선 요법 (XRT), 사이클로포스파미드, 또는 OKT3 또는 CAMPATH에 대한 항체와 함께 (예컨대, 이들 전에, 이와 동시에, 또는 이후에) 이후 사용을 위해 동결될 수 있다. 소정의 구체예에서, 상기 세포는 치료 전에 단리되고, CD20과 반응하는 제제, 예컨대 리툭산과 같은 B-세포 절제 요법 후에 치료를 위해 이후 사용하기 위해 동결될 수 있다.
본 발명의 소정의 구체예에서, 림프구는 치료 직후 환자로부터 수득될 수 있다. 이와 관련하여, 특정 암 치료, 구체적으로 면역계를 손상시키는 약물로 치료한 후에, 환자가 치료로부터 정상적으로 회복되는 기간 동안 치료 직후에, 수득된 림프구의 품질은 이들의 엑스 비보 확장 능력이 최적이거나 또는 향상될 수 있음이 관찰되었다. 마찬가지로, 본원에 기재된 방법을 사용한 엑스 비보 조작한 후에, 이들 세포는 향상된 생착 및 인 비보 확장을 위한 바람직한 상태에 있을 수 있다. 따라서, 이러한 회복 단계 중에 림프구, 수지상 세포, 또는 조혈 계통의 다른 세포를 포함하는 혈액 세포를 수집하는 것이 본 발명의 맥락 내에서 고려된다. 또한, 소정의 구체예에서, 동원 (예를 들어, GM-CSF를 사용한 동원) 및 컨디셔닝 요법 (conditioning regimens)을 사용하여 특정 세포 타입의 재증식, 재순환, 재생 및/또는 확장이 특히 치료 후 정의된 시간 범위 동안 선호되는, 대상체에서 조건을 형성할 수 있다. 예시되는 세포 타입은 T 세포, NK 세포, B 세포, 수지상 세포, 및 면역계의 다른 세포를 포함한다.
본 발명은 하나 이상의 IRP, 및 선택적으로 CAR를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 이상의 합성 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 원하는 분자를 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드는 당해 분야에 알려진 재조합 방법으로, 가령 예를 들어 유전자를 발현하는 세포 유래의 라이브러리를 스크리닝함으로써, 이를 포함하는 것으로 알려진 벡터로부터 유전자를 유도함으로써, 또는 표준 기술을 사용하여 이를 함유하는 세포 및 조직으로부터 직접 단리함으로써, 수득될 수 있다. 대안으로서, 관심 유전자는 복제되기 보다는 합성으로 생성될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 합성 폴리뉴클레오티드가 삽입될 수 있는 벡터를 제공한다. 레트로바이러스 예컨대 렌티바이러스로부터 유래되는 벡터는 이식유전자의 장기적이고 안정적인 통합 및 이의 딸 세포에서의 전파를 허용하기 때문에 장기 유전자 전달을 달성하는데 적합한 수단이다. 렌티바이러스 벡터는 비-증식성 세포, 예컨대 간세포를 형질도입할 수 있다는 점에서 뮤린 백혈병 바이러스와 같은 종양-레트로바이러스로부터 유래된 벡터에 비해 추가적인 이점을 갖는다. 이들은 또한 낮은 면역원성의 추가 이점을 갖는다.
"벡터 (vector)"는 단리된 핵산을 포함하고, 상기 단리된 핵산을 세포 내부로 전달하는데 사용할 수 있는 물질의 구성이다. 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 양친매성 화합물과 회합된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드 및 바이러스를 포함하지만 이에 한정되지 않는 수많은 벡터가 당해 분야에 알려져 있다. 따라서, 용어 "벡터 (vector)"는 자가 복제 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 상기 용어는 또한 예를 들어 폴리리신 화합물, 리포솜 등과 같은, 핵산의 세포내로의 전달을 촉진하는 비-플라스미드 및 비-바이러스 화합물을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 바이러스 벡터의 예는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 및 유사물을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
간략히 요약하면, IRP, 및 선택적으로 CAR를 코딩하는 천연 또는 합성 폴리뉴클레오티드의 발현은 전형적으로 IRP, 또는 선택적으로 CAR 폴리펩티드 또는 이의 일부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 프로모터에 작동 가능하게 연결하고, 구조체를 발현 벡터에 통합시킴으로써 달성된다. 상기 벡터는 진핵생물에서 복제 및/또는 통합에 적합할 수 있다. 전형적인 클로닝 벡터는 원하는 폴리뉴클레오티드의 발현 조절에 유용한 전사 및 번역 종결인자, 개시 서열 및 프로모터를 함유한다.
"발현 벡터 (expression vector)"는 발현될 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 조절 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 발현을 위한 충분한 시스-작용 요소 (cis-acting elements)를 포함하고; 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포에 의해 또는 인 비트로 발현 시스템에서 공급될 수 있다. 발현 벡터는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코스미드, 플라스미드 (예컨대 네이키드 또는 리포솜에 함유됨) 및 바이러스 (예컨대 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)와 같은 당해 분야에 알려진 모두를 포함한다.
본 발명의 발현 구조체는 또한 표준 유전자 전달 프로토콜을 사용하여, 핵산 면역화 및 유전자 요법에 사용될 수 있다. 유전자 전달 방법은 당해 분야에 알려져 있다.
IRP, 및 선택적으로 CAR를 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드는 다수의 벡터 타입으로 클로닝될 수 있다. 예를 들어, 상기 폴리뉴클레오티드는 플라스미드, 파지미드, 파지 유도체, 동물 바이러스 및 코스미드를 포함하지만 이에 한정되지 않는 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 특히 관심 있는 벡터에는 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 생성 벡터 및 시퀀싱 벡터를 포함한다.
또한, 상기 발현 벡터는 바이러스 벡터의 형태로 세포에 제공될 수 있다. 바이러스 벡터 기술은 당해 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 Sambrook et al, (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York), 및 기타 바이러스학 및 분자 생물학 매뉴얼에 기재되어 있다. 벡터로서 유용한 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스 및 렌티바이러스를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 일반적으로, 적합한 벡터는 적어도 하나의 유기체에서 기능하는 복제 기원, 프로모터 서열, 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위, 및 하나 이상의 선택 가능한 마커를 함유한다 (예컨대, WO 01/96584; WO 01/29058; 및 미국특허 제6,326,193호).
많은 바이러스 기반 시스템이 포유동물 세포로의 유전자 전달을 위해 개발되었다. 예를 들어, 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템을 위한 편리한 플랫폼을 제공한다. 선택된 유전자는 당해 분야에 알려진 기술을 사용하여 벡터로 삽입되고, 레트로바이러스 입자에 패키징될 수 있다. 그 다음에, 재조합 바이러스를 단리하고, 대상체의 세포에 인 비보 또는 엑스 비보 전달할 수 있다. 다수의 레트로바이러스 시스템이 당해 분야에 알려져 있다. 본 발명 내에서, 아데노바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터를 사용하는 것이 바람직하다.
추가 프로모터 요소, 예컨대 인핸서는 전사 개시의 빈도를 조절하는데 사용될 수 있다. 전형적으로, 이들은 시작 부위의 업스트림 30-110 bp 영역에 위치하지만, 최근에 많은 프로모터가 시작 부위의 다운스트림에도 기능적 요소를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 프로모터 요소들 간의 간격은 유연하므로, 요소들이 서로에 대해 반전되거나 또는 이동하는 경우 프로모터 기능이 보존될 수 있다. 티미딘 키나제 (tk) 프로모터에서, 프로모터 요소들 간의 간격은 활성 감소 시작 전 50 bp 간격까지 증가될 수 있다. 프로모터에 따라, 개별 요소들은 협력적으로 또는 독립적으로 기능하여 전사를 활성화시킬 수 있는 것으로 나타났다.
적합한 프로모터의 일례로는 급초기 거대세포바이러스 (CMV) 프로모터 서열이다. 이러한 프로모터 서열은 작동 가능하게 연결된 임의의 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 높은 수준으로 유도할 수 있는 강력한 항시성 프로모터 서열이다. 적합한 프로모터의 다른 예는 신장 성장 인자-1a (EF-1a)이다. 그러나, 유인원 바이러스 40 (SV40) 초기 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 긴 말단 반복 (LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, 엡스타인-바 바이러스 급초기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다른 항시성 프로모터 서열 뿐만 아니라, 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 헤모글로빈 프로모터, 및 크레아틴 키나제 프로모터를 포함하지만 이에 한정되지 않는 인간 유전자 프로모터가 또한 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 항시성 프로모터의 사용으로 제한되어서는 안되며, 유도성 프로모터가 또한 본 발명의 일부로 고려된다. 유도성 프로모터의 사용은 이러한 발현이 요구되는 경우 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 작동시킬 수 있거나, 또는 발현이 요구되지 않는 경우 발현을 작동시키지 않는 분자 스위치 (molecular switch)를 제공한다. 유도성 프로모터의 예는 메탈로티오닌 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 프로게스테론 프로모터 및 테트라사이클린 프로모터를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
IRP, 또는 선택적으로 CAR 폴리펩티드 또는 이의 일부의 발현을 평가하기 위해, 세포내로 도입될 발현 벡터는 또한 바이러스 벡터를 통해 형질감염 또는 감염시키고자 하는 세포 집단으로부터 발현 세포의 동정 및 선택을 용이하게 하기 위해, 선택 가능한 마커 유전자 또는 리포터 유전자 또는 이들 모두를 함유할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 선택 가능한 마커는 DNA의 개별 조각에 운반될 수 있고, 공동-형질감염 절차에 사용될 수 있다. 선택 가능한 마커 및 리포터 유전자 모두는 숙주 세포에서 발현을 가능하게 하는 적절한 조절 서열에 플랭킹될 수 있다. 유용한 선택 가능한 마커는 예를 들어 항생제-내성 유전자, 예컨대 neo 및 유사물을 포함한다.
리포터 유전자는 잠재적으로 형질감염된 세포를 동정하고, 조절 서열의 기능을 평가하는데 사용된다. 일반적으로, 리포터 유전자는 수용 유기체 또는 조직에 존재하지 않거나 또는 이에 의해 발현되지 않고, 발현이 효소 활성과 같은 일부 용이하게 검출 가능한 특성에 의해 나타나는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자이다. 리포터 유전자의 발현은 DNA가 수용 세포에 도입된 후 적절한 시간에 분석될 수 있다. 적합한 리포터 유전자는 루시퍼라제, 베타-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트란스퍼라제, 분비된 알칼리 포스파타제 또는 녹색 형광 단백질 유전자를 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다 (Ui-Tei et al., 2000, FEBS Letters; 479: 79-82). 적합한 발현 시스템이 잘 알려져 있으며, 알려진 기술을 사용하여 제조하거나 또는 상업적으로 입수할 수 있다.
유전자를 세포내로 도입하고 발현시키는 방법은 당해 분야에 알려져 있다. 발현 벡터와 관련하여, 상기 벡터는 당해 분야의 임의의 방법에 의해 숙주 세포, 예를 들어 포유동물, 박테리아, 효모 또는 곤충 세포내로 용이하게 도입될 수 있다. 예를 들어, 상기 발현 벡터는 물리적, 화학적 또는 생물학적 수단에 의해 숙주 세포로 전달될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하기 위한 물리적 방법에는 인산칼슘 침전, 리포펙션, 입자 충격, 미세주입, 전기천공법 및 유사 방법을 포함한다. 벡터 및/또는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 제조하는 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어 Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)를 참조한다. 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하기 위한 바람직한 방법은 인산칼슘 형질감염이다.
관심 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하기 위한 생물학적 방법에는 DNA 및 RNA 벡터의 사용을 포함한다. 바이러스 벡터, 특히 레트로바이러스 벡터는 유전자를 포유동물, 예컨대 인간 세포에 삽입하는데 가장 널리 사용되는 방법이 되었다. 다른 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 폭스바이러스, 단순 헤르페스 바이러스 I, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스 및 유사물로부터 유래될 수 있다. 예를 들어 미국특허 제5,350,674호 및 제5,585,362호를 참조한다.
폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하기 위한 화학적 수단에는 콜로이드 분산 시스템 예컨대 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미소구체, 비드, 및 지질-기반 시스템을 포함하고, 이는 수중유 에멀젼, 미셀, 혼합형 미셀 및 리포솜을 포함한다. 전달 비히클로서 인 비트로 및 인 비보 사용하기 위해 예시되는 콜로이드성 시스템은 리포솜 (예컨대 인공 막 소포)이다. 비-바이러스 전달 시스템이 사용되는 경우, 예시되는 전달 비히클은 리포솜일 수 있다. 지질 제제의 사용이 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포내로 (인 비트로, 엑스 비보 또는 인 비보) 도입하기 위해 고려된다. 다른 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 지질과 회합될 수 있다. 지질과 회합된 폴리뉴클레오티드는 리포솜의 수성 내부에 캡슐화되고, 리포솜의 지질 이중층 내에 산재되고, 리포솜 및 폴리뉴클레오티드 모두와 회합된 연결 분자를 통해 리포솜에 부착되고, 리포솜에 포획되고, 리포솜과 복합체를 형성하고, 지질을 함유하는 용액에 분산되고, 지질과 혼합되고, 지질과 조합되고, 지질내에 현탁액으로서 함유되고, 미셀에 함유되거나 또는 이와 복합체를 형성하거나, 또는 지질과 회합될 수 있다. 지질, 지질/DNA 또는 지질/발현 벡터가 회합된 조성물은 용액 내 임의의 특정 구조로 제한되지 않는다. 예를 들어, 이들은 미셀로서 이중층 구조로, 또는 "붕괴된 (collapsed)" 구조로 존재할 수 있다. 이들은 또한 용액에 단순히 산재되어, 가능하게는 크기 또는 형태가 균일하지 않은 응집체를 형성할 수 있다. 지질은 자연 발생 또는 합성 지질일 수 있는 지방 물질이다. 예를 들어, 지질에는 세포질에서 자연 발생하는 지방 액적 뿐만 아니라 장쇄 지방족 탄화수소 및 이의 유도체 예컨대 지방산, 알코올, 아민, 아미노 알코올 및 알데히드를 함유하는 화합물의 부류를 포함한다.
사용에 적합한 지질은 상업적 공급원으로부터 입수될 수 있다. 예를 들어, 디미리스틸 포스파티딜콜린 ("DMPC")은 Sigma, St. Louis, MO로부터 입수될 수 있고; 디세틸 포스페이트 ("DCP")는 K & K Laboratories (Plainview, NY)로부터 입수될 수 있으며; 콜레스테롤 ("Choi")은 Calbiochem-Behring으로부터 입수될 수 있고; 디미리스틸 포스파티딜글리세롤 ("DMPG") 및 다른 지질은 Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, AL)로부터 입수될 수 있다. 클로로포름 또는 클로로포름/메탄올 중 지질의 스톡 용액은 약 -20℃에서 저장될 수 있다. 클로로포름은 메탄올보다 더 쉽게 증발하기 때문에 단독 용매로서 사용될 수 있다. "리포솜 (liposome)"은 봉입된 지질 이중층 또는 응집체의 생성에 의해 형성된 다양한 단일 및 다중층 지질 비히클을 포함하는 포괄적인 용어이다. 리포솜은 인지질 이중층 막 및 내부 수성 매질을 갖는 소포 구조를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 다중층 리포솜은 수성 매질에 의해 분리된 다중 지질층들을 가질 수 있다. 이들은 인지질이 과량의 수용액에 현탁되는 경우 자발적으로 형성될 수 있다. 지질 성분은 폐쇄 구조의 형성 전에 자가-재배열을 겪을 수 있고, 지질 이중층들 사이에 물 및 용해된 용질을 포획할 수 있다 (Ghosh et al., 1991, Glycobiology; 5; 505-10). 그러나, 용액 중에 정상 소포 구조와 다른 구조를 갖는 조성물이 또한 포함된다. 예를 들어, 상기 지질은 미셀 구조를 가정하거나, 또는 단순히 지질 분자의 불균일한 응집체로 존재할 수 있다. 또한 리포펙타민-핵산 복합체가 고려된다.
본원에서 사용된 용어 "형질감염된 (transfected)" 또는 "형질전환된 (transformed)" 또는 "형질도입된 (transduced)"은 외인성 핵산이 숙주 세포내로 전달 또는 도입되는 과정을 지칭한다. "형질감염된 (transfected)" 또는 "형질전환된 (transformed)" 또는 "형질도입된 (transduced)" 세포는 외인성 핵산으로 형질감염, 형질전환 또는 형질도입된 세포이다. 상기 세포는 1차 대상체 세포 및 이의 자손을 포함한다.
외인성 합성 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하는데 사용된 방법에 관계없이, 숙주 세포에서 재조합 DNA 서열의 존재를 확인하기 위해, 다양한 분석이 수행될 수 있다. 이러한 분석에는 예를 들어 당업자에게 잘 알려진 "분자 생물학적" 분석 예컨대 서던 및 노던 블롯팅 (Southern and Northern blotting), RT-PCR 및 PCR; 면역학적 수단 (ELISA, 웨스턴 블롯, 유세포 분석)에 의해 또는 본 발명의 범위내에 속하는 제제를 확인하기 위해 본원에 기재된 분석에 의해 특정 펩티드의 존재 또는 부재를 검출하는 "생화학적" 분석을 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 방법에 관한 것으로서, 상기 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 철 조절 단백질을 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드와 조합되고, 구체적으로 상기 적어도 하나의 철 조절 단백질은 IRP1 및/또는 IRP2이다.
키메라 항원 수용체 및 적어도 하나의 IRP는 서로 인접하지 않거나 또는 직접 연결되지 않는 개별 합성 폴리뉴클레오티드들 상에 코딩될 수 있다. 이 경우에, 상기 적어도 하나의 IRP를 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드 및 CAR를 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드는 동일하거나 또는 상이한 방법을 사용하여 개별적으로 세포내로 도입될 수 있다. 대안으로서, 적어도 하나의 IRP를 코딩하는 유전자(들) 및 CAR를 코딩하는 유전자는 단일 합성 폴리뉴클레오티드 내에 조합될 수 있다. 조합된 합성 폴리뉴클레오티드가 2개의 개별 합성 폴리펩티드 내에 코딩된 모든 유전자를 포함하는 경우, 2개의 합성 폴리뉴클레오티드들은 조합되었다라고 한다.
예를 들어, 적어도 하나의 IRP 및 CAR를 코딩하는 유전자를 림프구에 바이러스 형질도입에 의해 통합할 계획인 경우, 적어도 하나의 IRP를 코딩하는 유전자(들) 및 CAR를 코딩하는 유전자는 개별 바이러스 벡터들내에 포함될 수 있거나 또는 단일 바이러스 벡터 내에 조합될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 방법에 관한 것으로서, 상기 림프구의 활성화는 하나 이상의 합성 폴리뉴클레오티드가 상기 림프구 내로 도입되기 전 또는 후에 수행된다.
림프구가 적어도 하나의 IRP, 또는 선택적으로 바람직한 CAR를 발현하도록 유전자 변형되기 전 또는 후에 관계없이, 림프구가 대상체에게 투여되기 전에 상기 림프구는 활성화되고 확장될 수 있다. 당업자는 다양한 타입의 림프구를 활성화시키는데 요구되는 특정 조건을 알고 있다.
당업자는 NK 세포를 활성화시키는 방법을 알고 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 NK 세포는 IL-15 및/또는 IL-12 및/또는 IL-18이 보충된 혈청 (예컨대 우태아, 인간 또는 말 혈청)을 포함하는, 증식 및 생존에 필요한 인자를 함유할 수 있는 적절한 배지 (예컨대 최소 필수 배지 (Minimal Essential Media) 또는 RPMI 배지 1640 또는, X-vivo 15, (Lonza), CellGro 배지 (Cellgenix), IMDM (Gibco))에서 세포를 배양함으로써 활성화될 수 있다. NK 세포의 활성화는 또한 IL-2를 배지에 보충하여 달성될 수 있다. NK 세포의 활성화는 배양물에 피더 세포주 (feeder cell line)를 부가하여 향상될 수 있다. NK 세포의 활성화를 위한 적절한 피더 세포주는 암 세포주, 유전자 변형된 K562 세포, 또는 EBV-형질전환된 림프모구 세포주 또는 자가 말초 혈액 단핵 세포 (방사선 조사됨)이다.
일반적으로, 본원에 기재된 T 세포는 CD3/TCR 복합체 관련 신호를 자극하는 작용제 및 T 세포의 표면 상의 공동-자극 분자를 자극하는 리간드가 부착된 표면과의 접촉에 의해 활성화될 수 있다. 구체적으로, T 세포 집단은 항-CD3 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 표면에 고정된 항-CD2 항체와의 접촉에 의해, 또는 칼슘 이온운반체 (calcium ionophore)와 함께 단백질 키나제 C 활성화제 (예컨대 브리오스타틴)와의 접촉에 의해 자극될 수 있다. T 세포의 표면 상에 보조 분자의 공동-자극을 위해, 보조 분자에 결합하는 리간드가 사용될 수 있다. 예를 들어, T 세포의 집단은 T 세포의 증식을 자극하는데 적절한 조건하에, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉될 수 있다. CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 증식을 자극하기 위해, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체를 사용할 수 있다. 항-CD28 항체 9.3, B-T3, XR-CD28 (Diaclone, Besancon, France)을 사용할 수 있으며, 당해 분야에 통상적으로 알려진 다른 방법이 사용될 수 있다 (Berg et al., 1998, Transplant Proc; 30(8):3975-3977; Haanen et al., 1999, J. Exp. Med; 190:13191328; Garland et al., 1999, J. Immunol Meth. 227:53-63).
T 세포에 대한 1차 자극 신호 및 공동-자극 신호가 상이한 프로토콜에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 각 신호를 제공하는 작용제가 용액 중에 존재할 수 있거나, 또는 표면에 커플링될 수 있다. 표면에 커플링되는 경우, 상기 작용제는 동일한 표면에 (즉, "시스 (cis)" 형성으로) 또는 개별 표면에 (즉, "트란스 (trans)" 형성으로) 커플링될 수 있다. 대안으로서, 하나의 작용제는 표면에 커플링되고, 다른 하나의 작용제는 용액 중에 존재할 수 있다. 예를 들어, 공동-자극 신호를 제공하는 작용제는 표면에 결합될 수 있고, 1차 활성화 신호를 제공하는 작용제는 용액 중에 존재하거나 또는 표면에 커플링될 수 있거나, 또는 작용제들 모두가 용액 중에 존재할 수 있다. 대안으로서, 상기 작용제는 가용성 형태로 존재할 수 있고, 그 다음에 Fc 수용체 또는 항체 또는 작용제에 결합할 다른 결합제를 발현하는 세포와 같은 표면에 가교-결합될 수 있다. 이와 관련하여, 예를 들어 T 세포 활성화 및 확장에 사용하기 위해 고려되는 인공 항원 제시 세포 (artificial antigen presenting cell: aAPC)에 대한 미국특허출원 공개 번호 제20040101519호 및 제20060034810호를 참조한다.
2개의 작용제가 동일한 비드, 즉 "시스" 또는 개별 비드, 즉 "트란스"로, 비드 상에 고정된다. 예로서, 1차 활성화 신호를 제공하는 작용제는 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편일 수 있고, 공동-자극 신호를 제공하는 작용제는 항-CD28 항체 또는 이의 항원-결합 단편일 수 있으며; 작용제들 모두는 동일한 분자량으로 동일한 비드에 동시-고정될 수 있다. 예를 들어, CD4+ T 세포 확장 및 T 세포 성장을 위해 비드에 결합된 각 항체의 1:1 비율이 사용될 수 있다. 소정의 예에서, 1:1의 비율을 사용하여 관찰된 확장과 비교하여 T 세포 확장의 증가가 관찰되도록, 비드에 결합된 항 CD3:CD28 항체의 비율을 사용할 수 있다. 1:1의 비율을 사용하여 관찰된 확장과 비교하여, 약 1 내지 약 3배의 증가가 관찰될 수 있다. 비드에 결합된 CD3:CD28 항체의 비율은 100:1 내지 1:100의 범위이고, 그 사이의 모든 정수 값일 수 있다. 일례에서, 항-CD3 항체보다 항-CD28 항체가 입자에 더 많이 결합될 수 있으며, 즉, CD3:CD28의 비율은 1 미만일 수 있다. 소정의 예에서, 비드에 결합되는 항 CD28 항체 대 항 CD3 항체의 비율은 2:1 초과일 수 있다. 예를 들어, 비드에 결합된 항체의 CD3:CD28의 비율은 1:100으로 사용될 수 있고, 비드에 결합된 항체의 CD3:CD28의 비율은 1:75로 사용될 수 있으며, 비드에 결합된 항체의 CD3:CD28의 비율은 1:50으로 사용될 수 있고, 비드에 결합된 항체의 CD3:CD28의 비율은 1:30으로 사용될 수 있으며, 비드에 결합된 항체의 CD3:CD28의 비율은 1:10으로 사용될 수 있거나, 또는 비드에 결합된 항체의 CD3:CD28의 비율은 1:3으로 사용될 수 있다. 대안으로서, 비드에 결합된 항체의 CD3:CD28의 비율은 3:1로 사용될 수 있다.
입자 대 세포의 비율은 1:500 내지 500:1의 범위일 수 있고, 그 사이의 임의의 정수 값일 수 있으며, 이는 T 세포 또는 다른 표적 세포를 자극하는데 사용될 수 있다. 당업자가 용이하게 이해할 수 있는 바와 같이, 입자 대 세포의 비율은 표적 세포에 대한 입자 크기에 좌우될 수 있다. 예를 들어, 작은 크기의 비드는 소수의 세포에만 결합할 수 있는 반면에, 더 큰 비드는 다수의 세포에 결합할 수 있다. T 세포 자극을 초래하는 항-CD3- 및 항-CD28-커플링된 입자 대 T 세포의 비율은 상기에 언급된 바와 같이 다양할 수 있지만, 그러나 소정의 바람직한 값은 1:100, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 및 15:1을 포함하고, 여기서 바람직한 하나의 비율은 T 세포당 적어도 1:1 입자이다. 대안으로서, 1:1 또는 미만의 입자 대 세포의 비율이 사용될 수 있다. 바람직한 입자:세포 비율은 1:5일 수 있다. 입자 대 세포의 비율은 자극 당일에 따라 가변될 수 있다. 예를 들어, 입자 대 세포의 비율은 제1 일에 1:1 내지 10:1일 수 있고, 추가 입자는 그후 최대 10일 동안 매일 또는 격일로, 1:1 내지 1:10의 최종 비율로 (부가 당일 세포 계수 기준) 세포에 부가될 수 있다. 대안으로서, 입자 대 세포의 비율은 자극 제1 일에 1:1일 수 있고, 자극 제3 및 제5 일에 1:5로 조정될 수 있다. 다른 예에서, 입자는 자극 제1 일에는 1:1, 자극 제3 및 제5 일에는 1:5의 최종 비율로, 매일 또는 격일로 부가될 수 있다. 다른 예에서, 입자 대 세포의 비율은 자극 제1 일에 2:1이고, 자극 제3 및 제5 일에 1:10으로 조정될 수 있다. 다른 예에서, 입자는 자극 제1 일에 1:1, 자극 제3 및 제5 일에 1:10의 최종 비율로, 매일 또는 격일로 부가될 수 있다. 당업자는 다양한 다른 비율이 본 발명에 사용하기에 적합할 수 있음을 이해할 것이다. 구체적으로, 비율은 입자 크기 및 세포 크기 및 타입에 따라 달라질 것이다.
상기 T 세포는 제제-코팅된 비드와 조합될 수 있고, 상기 비드 및 세포는 후속하여 분리될 수 있으며, 그 다음에 상기 세포가 배양될 수 있다. 대안으로서, 배양 전에, 제제-코팅된 비드 및 세포를 분리하지 않고, 함께 배양할 수 있다. 추가 예에서, 상기 비드 및 세포는 먼저 자력 (magnetic force)과 같은 힘의 적용에 의해 농축되어, 세포 표면 마커의 결찰을 증가시켜서 세포 자극을 유도할 수 있다.
세포 (예를 들어, 104 내지 109개의 T 세포) 및 비드 (예를 들어, DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T 상자성 비드 (paramagnetic beads), 1:1의 비율)가 버퍼, 바람직하게는 PBS (2가 양이온 예컨대 칼슘 및 마그네슘 불포함) 중에 조합될 수 있다. 다시, 당업자는 사용될 수 있는 임의의 세포 농도를 용이하게 이해할 수 있다. 세포 및 입자의 최대 접촉을 보장하기 위해, 입자 및 세포가 함께 혼합되는 부피를 유의미하게 감소 (즉, 세포 농도를 증가)시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 약 20억개의 세포/mL의 농도가 사용될 수 있다. 다른 예에서, 1억개 초과의 세포/mL의 농도가 사용될 수 있다. 추가의 예에서, 10,000,000, 15,000,000, 20,000,000, 25,000,000, 30,000,000, 35,000,000, 40,000,000, 45,000,000, 또는 50,000,000개의 세포/mL의 세포 농도가 사용될 수 있다. 또 다른 예에서, 75,000,000, 80,000,000, 85,000,000, 90,000,000, 95,000,000, 또는 100,000,000개의 세포/mL의 세포 농도가 사용될 수 있다. 추가의 예에서, 125,000,000, 또는 150,000,000개의 세포/mL의 농도가 사용될 수 있다. 고농도를 사용하면 세포 수율, 세포 활성화 및 세포 확장이 증가될 수 있다. 또한, 높은 세포 농도를 사용하면 CD28-음성 T 세포와 같이, 관심 표적 항원을 약하게 발현할 수 있는 세포를 보다 효과적으로 포획할 수 있다. 이러한 세포 집단은 치료적 가치를 가질 수 있고, 소정의 구체예에서 수득되는 것이 바람직할 것이다. 예를 들어, 고농도의 세포를 사용하면, 통상적으로 더 약한 CD28 발현을 갖는 CD8+ T 세포를 보다 효과적으로 선택할 수 있다.
상기 혼합물은 몇 시간 (약 3시간) 내지 약 14일 동안, 또는 그 사이의 임의의 매시간 정수 값의 시간 동안 배양될 수 있다. 상기 혼합물은 21일 동안 배양될 수 있다. 일례에서, 상기 비드 및 T 세포는 약 8일 동안 함께 배양될 수 있다. 다른 예에서, 상기 비드 및 T 세포는 2-3일 동안 함께 배양될 수 있다. T 세포의 배양 시간이 60일 이상일 수 있도록 여러 자극 주기가 또한 요구될 수 있다.
다양한 자극 시간에 노출된 T 세포는 다른 특성을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 전형적인 혈액 또는 성분채집된 말초 혈액 단핵 세포 산물은 세포독성 또는 억제인자 T 세포 집단 (TC, CD8+)보다 더 많은 헬퍼 T 세포 집단 (TH, CD4+)을 갖는다. CD3 및 CD28 수용체의 자극에 의한 T 세포의 엑스 비보 확장은, 약 8-9일 전에 주로 TH 세포로 구성된 T 세포 집단을 생성하는 반면에, 약 8-9일 후에는 TC 세포 집단이 점점 더 많아진 T 세포 집단이 생성된다. 따라서, 치료 목적에 따라, TH 세포를 주로 포함하는 T 세포 집단을 대상체에게 주입하는 것이 유리할 수 있다. 유사하게는, TC 세포의 항원-특이적 서브세트가 단리된 경우, 이러한 서브세트를 더 큰 정도로 확장하는 것이 유리할 수 있다.
또한, CD4 및 CD8 마커에 추가하여, 다른 표현형 마커는 유의미하게 가변되지만, 대부분은 세포 확장 과정 중에 재현 가능하다. 따라서, 이러한 재현성은 활성화된 T 세포 산물을 특정 목적에 맞게 조정할 수 있는 능력을 가능하게 한다.
림프구 배양에 적합한 조건에는 혈청 (예컨대 우태아, 인간 또는 말 혈청), 인터루킨-2 (IL-2), 인슐린, IFN-γ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, TGFβ, 및 TNF-α 또는 당업자에게 알려진 세포 성장을 위한 임의의 다른 첨가제를 포함하는, 증식 및 생존에 필요한 인자를 함유할 수 있는 적절한 배지 (예: 최소 필수 배지 또는 RPMI 배지 1640 또는, X-vivo 15, (Lonza), CellGro 배지 (Cellgenix), IMDM (Gibco))를 포함한다. 세포 성장을 위한 다른 첨가제는 계면활성제, 플라스마네이트 (plasmanate), 및 환원제 예컨대 N-아세틸-시스테인 및 2-머캅토에탄올을 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 배지에는 RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-Vivo 15, X-Vivo 20, IMDM 및 CellGro, Optimizer를 포함할 수 있고, 아미노산, 피루브산나트륨 및 비타민이 부가되며, 무-혈청이거나 또는 적절한 양의 혈청 (또는 혈장) 또는 정의된 호르몬 세트, 및/또는 NK 세포 및 T 세포의 성장 및 확장에 충분한 양의 사이토카인(들)이 보충된다. 항생제 예컨대 페니실린 및 스트렙토마이신은 대상체에게 주입할 세포 배양물에는 포함되지 않지만, 실험 배양물에만 포함될 수 있다. 상기 림프구는 성장을 지원하는데 필요한 조건, 예를 들어 적절한 온도 (예컨대 37℃) 및 대기 (예컨대 공기 + 5% CO2) 하에 유지될 수 있다.
추가 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 방법에 관한 것으로서, 상기 적어도 하나의 합성 폴리뉴클레오티드가 림프구 내로 바이러스 형질도입, 구체적으로 렌티바이러스 형질도입에 의해 도입된다.
상기 기재된 바와 같이, 적어도 하나의 IRP, 및 선택적으로 CAR를 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드(들)는 림프구 내로 당해 분야에 알려진 임의의 방법에 의해 도입될 수 있다. 그러나, 상기 합성 폴리뉴클레오티드(들)는 전술한 바와 같이, 림프구 내로 바이러스 형질도입에 의해 도입하는 것이 바람직하다. 더 바람직하게는, 합성 폴리뉴클레오티드를 림프구에 도입하는데 사용되는 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 바이러스 벡터는 통상 숙주 세포 게놈의 무작위한 위치로 통합되기 때문에, 합성 폴리뉴클레오티드는 IRP를 코딩하는 적어도 하나의 유전자 및 숙주 세포에서 IRP를 코딩하는 적어도 하나의 유전자를 발현하는데 필요한 조절 요소를 포함하는 것이 바람직하다.
본원에서 사용된, "렌티바이러스 (lentivirus)"는 레트로바이러스과 (Retroviridae family)의 속 (genus)을 지칭한다. 렌티바이러스는 비-분열 세포 (non-dividing cells)를 감염시킬 수 있다는 점에서 레트로바이러스 중에서 독특하며; 이들은 상당한 양의 유전 정보를 숙주 세포의 DNA에 전달할 수 있으므로, 이는 유전자 전달 벡터의 가장 효과적인 방법들 중 하나이다. HIV, SIV 및 FIV는 모두 렌티바이러스의 예이다. 렌티바이러스로부터 유래된 벡터는 인 비보에서 상당한 수준의 유전자 전달을 달성하는 수단을 제공한다.
일 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 방법에 관한 것으로서, CAR를 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드는 IRP1 및/또는 IRP2를 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드에 전사로 연결된다.
일 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 방법에 관한 것으로서, 상기 CAR를 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드, 및 IRP1 및/또는 IRP2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 자가-절단 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 의해 연결된다.
일 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 방법에 관한 것으로서, 상기 자가-절단 펩티드는 2A 자가-절단 펩티드이다.
일 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 방법에 관한 것으로서, 상기 자가-절단 펩티드는 T2A이다.
일 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 방법에 관한 것으로서, 상기 하나 이상의 합성 폴리뉴클레오티드가 림프구 내로 바이러스 형질도입에 의해 도입된다.
일 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 방법에 관한 것으로서, 상기 바이러스 형질도입은 본원에 제공된 임의의 구체예에 따른 바이러스 벡터로 수행된다.
IRP1 및/또는 IRP2, 및 선택적으로 CAR, 프로모터 및/또는 추가 조절 요소 (예컨대 IRES 또는 자가-절단 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드)를 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드의 예가 본원에 개시되어 있으며, 청구된 방법에 준용하여 적용된다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 바이러스 벡터는 본 발명에 따른 방법에 사용된다.
도 1: 나이브 (naive) 및 사이토카인-강화 (cytokine-enhanced) NK 세포는 IFN-γ 생성을 위한 해당작용 (glycolysis)에 유사하게 의존한다.
(A) CE NK 세포를 생성하는데 사용된 실험의 개략도. (B) 비-자극되거나 (no stim) 또는 IL-12/IL-18로 자극된 NV NK 세포 및 CE NK 세포에 의한 IFN-γ 생성 (평균 ± SEM, n=18 공여자). (C) 비-자극되거나 (no stim) 또는 IL-12/IL-18로 자극된 NV NK 세포 및 CE NK 세포에서 CD69 발현의 GMFI (평균 ± SEM, n=13 공여자). (D) 비-자극되거나 (no stim) 또는 IL-12/IL-18로 자극된 NV NK 세포 및 CE NK 세포에서 그룹 관계 (group relationships)를 나타내는 전사체 데이터 (transcriptome data)의 PCA. 성분 편차의 비율은 퍼센트로 표시된다 (n=5 공여자). (E) 전사체 데이터 (n=5 공여자)의 비-자극되거나 (no stim) 또는 IL-12/IL-18로 자극된 NV NK 세포 및 CE NK 세포로부터 해당작용 유전자를 코딩하는 mRNA의 상대적 발현의 히트맵 (Heatmap). (F) 상단 패널: 비-자극되거나 (no stim) 또는 IL-12/IL-18로 자극된 NV NK 세포 및 CE NK 세포의 대표적인 미토콘드리아 교란 분석 (mitochondrial perturbation assay). 해당작용 (세포외 산성화 비율 (extracellular acidification rate) - ECAR)은 올리고마이신 (oligomycin), FCCP 및 로테논 (rotenone) 주사 후에 "Seahorse에서 (in Seahorse)" 측정되었다. 하단 패널: 미토콘드리아 교란 분석에 의해 분석되는, 비-자극되거나 (no stim) 또는 IL-12/IL-18로 자극된 NV NK 세포 및 CE NK 세포에서 ECAR의 기저 및 최대 비율 (평균 ± SEM, n=12 공여자). (G) 상단 패널: 비-자극되거나 (no stim) 또는 IL-12/IL-18로 자극된 NV NK 세포 및 CE NK 세포에서 NBDG 흡수의 대표적인 히스토그램. 하단 패널: 비-자극되거나 (no stim) 또는 IL-12/IL-18로 자극된 NV NK 세포 및 CE NK 세포에서 NBDG 흡수의 GMFI (평균 ± SEM, n=15 공여자). (H) 비-자극되거나 (no stim) 또는 IL-12/ IL-18, IL-12/ IL-18 + 2-DG로 자극된 NV NK 세포 및 CE NK 세포에서 IFNG mRNA의 발현. 전사체 수준은 18S mRNA 수준에 대해 결정되었고, 비-자극된 (no stim) NV NK 세포에 대해 정규화되었다 (평균 ± SEM, n=6 공여자). (I) 상단 패널: 비-자극되거나 (no stim) 또는 IL-12/ IL-18, IL-12/ IL-18 + 2-DG로 자극된 NV NK 세포 및 CE NK 세포에 의한 IFN-γ 생성 (평균 ± SEM, n= 6 공여자). 하단 패널: 10 mM 글루코스 및 2 mM 글루코스에서 비-자극되거나 (no stim) 또는 IL-12/ IL-18로 자극된 NV NK 세포 및 CE NK 세포에 의한 IFN-γ 생성 (평균 ± SEM, n=5 공여자). 통계적 유의성 (Statistical significance)은 paired two-tailed Student's t-테스트 (C, F, H, I) 또는 선형-회귀 분석 (B, G, H, I)으로 평가하였다. *p < 0.05, **p < 0.01, *** p < 0.001, ns, 유의미하지 않음.
도 2: 활성화된 CE NK 세포는 높은 수준의 세포-표면 CD71 및 빠른 세포 증식을 특징으로 한다.
(A) 상단 패널: 비-자극되거나 (no stim) 또는 IL-12/ IL-18로 자극된 NV NK 세포 및 CE NK 세포에서 CD98 발현의 대표적인 히스토그램. 하단 패널: 비-자극되거나 (no stim) 또는 IL-12/ IL-18로 자극된 NV NK 세포 및 CE NK 세포에서 CD98 발현의 MFI (평균 ± SEM, n=8 공여자). (B) 상단 패널: 비-자극되거나 (no stim) 또는 IL-12/ IL-18로 자극된 NV NK 세포 및 CE NK 세포에서 CD71 발현의 대표적인 히스토그램. 하단 패널: 비-자극되거나 (no stim) 또는 IL-12/ IL-18로 자극된 NV NK 세포 및 CE NK 세포에서 CD71 발현의 퍼센트 및 GMFI (평균 ± SEM, n=14 공여자). (C) 좌측 패널: 비-자극되거나 (no stim) 또는 IL-12/ IL-18로 자극된 NV NK 세포 및 CE NK 세포에서 전체 CD71 발현의 대표적인 웨스턴 블롯. 우측 패널: 비-자극되거나 (no stim) 또는 IL-12/ IL-18로 자극된 NV NK 세포 및 CE NK 세포에서 액틴에 대해 정규화된 전체 CD71 발현 (평균 ± SEM, n=13 공여자). (D) 좌측 패널: 비-자극되거나 (no stim) 또는 K562로 자극된 NV NK 세포 및 CE NK 세포에서 CD71 발현의 GMFI (평균 ± SEM, n=6 공여자). 우측 패널: 비-자극되거나 (no stim) 또는 K562로 자극된 NV NK 세포 및 CE NK 세포에 대한 CD71+ NK 세포의 퍼센트 (평균 ± SEM, n=6 공여자). (E) 상단 패널: 비-자극되거나 (no stim) 또는 IL-12/ IL-18로 자극된 NV NK 세포 및 CE NK 세포에서 Tf-488 흡수의 대표적인 히스토그램. 하단 패널: 비-자극되거나 (no stim) 또는 IL-12/ IL-18로 자극된 NV NK 세포 및 CE NK 세포에서 Tf-488 흡수의 GMFI (평균 ± SEM, n=10 공여자). (F) 상단 패널: NV NK 세포 및 CE NK 세포에서 CFSE 희석을 분석하는데 사용되는 실험의 개략도. 중간 패널: 비-자극되거나 (no stim) 또는 IL-12/ IL-18로 자극된 NV NK 세포 및 CE NK 세포에서 CFSE 희석의 대표적인 히스토그램. 하단 패널: CFSE 희석에 의해 분석된, 비-자극되거나 (no stim) 또는 IL-12/ IL-18로 자극된 증식된 NV NK 세포 및 CE NK 세포의 퍼센트 (평균 ± SEM, n=13 공여자). (G) 비-자극되거나 (no stim) 또는 IL-12/ IL-18로 자극된 NV NK 세포 및 CE NK 세포에서 세포 주기 유전자 (GO:0006098)를 코딩하는 mRNA의 상대적 발현의 히트맵 (n=5 공여자). (H) CFSE 희석에 의해 분석된, 비-자극되거나 (no stim), 또는 IL-12/ IL-18, IL-12/ IL-18 + BIP (1, 10 및 50 μM)로 자극된 증식된 NV NK 세포 및 CE NK 세포의 퍼센트 (평균 ± SEM, 비-자극, IL-12/ IL-18 및 IL-12/ IL-18 + BIP 10 μM 자극의 경우 n=11 공여자, IL-12/IL-18 + BIP 1 μM 자극의 경우 n=8 공여자, IL-12/ IL-18 + BIP 50 μM 자극의 경우 n=3 공여자). (I) 비-자극되거나 (no stim) 또는 IL-12/ IL-18, IL-12/ IL-18 + BIP 100 μM로 자극된 NV NK 세포 및 CE NK 세포에서 CD69 발현의 GMFI (평균 ± SEM, n=5 공여자). (J) 상단 패널: 비-자극되거나 (no stim) 또는 IL-12/ IL-18로 자극된 NV NK 세포 및 CE NK 세포에서 PPP 유전자 (GO:0006098)를 코딩하는 mRNA의 상대적 발현의 히트맵 (n=5 공여자). 하단 패널: CFSE 희석에 의해 분석된, 비-자극되거나 (no stim) 또는 IL-12/ IL-18, IL-12/ IL-18 + 6AN 50 μM로 자극된 NV NK 세포 및 CE NK 세포에서 증식된 세포의 퍼센트 (평균 ± SEM, n=6 공여자). 통계적 유의성은 paired two-tailed Student's t-테스트 (F, H, I, J) 또는 선형-회귀 분석 (A, B, C, E)으로 평가하였다. *p < 0.05, **p < 0.01, *** p < 0.001, ns, 유의미하지 않음.
도 3: CD71-매개 철 흡수 및 식이 철 이용 가능성 (dietary iron availability)은 NK 세포 기능에 영향을 준다.
(A) 상단 패널: 비장 유래의 WT 및 TfrcY20H/Y20H NK 세포에서 CFSE 희석을 분석하는데 사용되는 실험의 개략도. 하단 좌측 패널: IL-12/IL-18로 자극된 비장 유래의 WT 및 TfrcY20H/Y20H NK1.1+ NK 세포에서 CFSE 희석의 대표적인 히스토그램. 하단 우측 패널: CFSE 희석에 의해 분석된, IL-15 LD에서 또는 IL-12/IL-18로 자극된 비장 유래의 증식된 WT 및 TfrcY20H/Y20H NK1.1+ NK 세포의 퍼센트 (평균 ± SEM, WT NK 세포의 경우 n=5, TfrcY20H/Y20H NK 세포의 경우 n=6). (B) 상단 패널: 6주 동안 +/- 철 공급물이 공급된 마우스의 MCMV 감염 실험의 개략도. 하단 패널: 6주 동안 +/- 철 공급물이 공급된 마우스로부터 철 (iron), 페리틴 (ferritin), UIBC, TIBC 및 헤마토크리트 (hematocrit)의 혈청 수준 (평균 ± SEM, 철, 페리틴, UIBC 및 TIBC의 경우 n=8-18, 및 헤마토크리트의 경우 n=3). (C) 좌측 패널: 6주 동안 +/- 철 공급물이 공급된 마우스의 비장에서 NK1.1+ NK 세포의 퍼센트 (평균 ± SEM, n=5). 우측 패널: 6주 동안 +/- 철 공급물이 공급된 마우스의 비장에서 CD8+, CD4+, CD19+ 세포의 퍼센트 (평균 ± SEM, n=5). (D) 좌측 패널: 6주 동안 +/- 철 공급물이 공급된 마우스의 비장에서 NK1.1 + NK 세포에 대한 CD27+CD11b-, CD27+CD11b+, CD27-CD11b+의 퍼센트 (평균 ± SEM, n=5). 우측 패널: 6주 동안 +/- 철 공급물이 공급된 마우스의 비장에서 NK1.1+ NK 세포에 대한 KLRG1+ 및 CD62L+의 퍼센트 (평균 ± SEM, n=5). (E) 좌측 패널: 3 dpi 6주 동안 +/- 철 공급물이 공급된 WT MCMV-감염된 마우스의 간 및 비장에서의 바이러스 역가 (각 점은 1마리의 마우스로부터 단리된 세포의 데이터를 나타내며, 데이터는 + 철 공급물이 공급된 마우스에 대해 정규화된 배수 변화 차이로 표시되며, 수평선은 중앙값 (median)을 나타내고, n=10). 우측 패널: 3 dpi 6주 동안 +/- 철 공급물이 공급된 Δm157 MCMV 감염된-마우스의 간 및 비장에서의 바이러스 역가. (각 점은 1마리의 마우스로부터 단리된 세포의 데이터를 나타내고, 데이터는 + 철 공급물이 공급된 마우스에 대해 정규화된 배수 변화 차이로 표시되며, 수평선은 중앙값을 나타내고, n=9-10). (F) 1.5 dpi 6주 동안 +/- 철 공급물이 공급된 WT MCMV-감염된 마우스의 간 및 비장에서 NK1.1+ NK 세포에서 IFN-γ+의 퍼센트 (평균 ± SEM, n=4-5). 통계적 유의성은 unpaired two-tailed Student's t-테스트 (A, B, C, D, E, F)로 평가하였다. *p < 0.05, **p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001, ns, 유의미하지 않음.
도 4: CD71은 바이러스 감염 중에 NK 세포 증식 및 최적 이펙터 기능을 지원한다.
(A) 좌측 패널: Tfrcfl/fl 및 Tfrcfl/flNcr1Cre 마우스의 간에서 NK1.1+ NK 세포의 퍼센트 및 절대 수 (평균 ± SEM, n=10). 우측 패널: Tfrcfl/fl 및 Tfrcfl/flNcr1Cre 마우스의 비장에서 NK1.1+ NK 세포의 퍼센트 및 절대 수 (평균 ± SEM, n=17-22). (B) 상단 좌측 패널: Tfrcfl/fl 및 Tfrcfl/flNcr1Cre 마우스의 간에서 CD8+ 세포의 퍼센트 및 절대 수 (평균 ± SEM, n=10). 상단 우측 패널: Tfrcfl/fl 및 Tfrcfl/flNcr1Cre 마우스의 간에서 CD4+ 세포의 퍼센트 및 절대 수 (평균 ± SEM, n=4). 하단 패널: Tfrcfl/fl 및 Tfrcfl/flNcr1Cre 마우스의 간에서 CD19+ 세포의 퍼센트 및 절대 수 (평균 ± SEM, n=10). (C) 상단 좌측 패널: Tfrcfl/fl 및 Tfrcfl/flNcr1Cre 마우스의 비장에서 CD8+ 세포의 퍼센트 및 절대 수 (평균 ± SEM, n=9-19). 상단 우측 패널: Tfrcfl/fl 및 Tfrcfl/flNcr1Cre 마우스의 비장에서 CD4+ 세포의 퍼센트 및 절대 수 (평균 ± SEM, n=11-22). 하단 패널: Tfrcfl/fl 및 Tfrcfl/flNcr1Cre 마우스의 비장에서 CD19+ 세포의 퍼센트 및 절대 수 (평균 ± SEM, n=12-22). (D) 상단 패널: Tfrcfl/fl 및 Tfrcfl/flNcr1Cre 마우스의 간에서 NK1.1+ NK 세포에 대한 CD27+CD11b-, CD27+CD11b+, CD27-CD11b+의 퍼센트 (평균 ± SEM, n=10). 하단 패널: Tfrcfl/fl 및 Tfrcfl/flNcr1Cre 마우스의 간에서 NK1.1+ NK 세포에 대한 CD62L+ 및 Ly6C+의 퍼센트 (평균 ± SEM, n=6). (E) 상단 패널: Tfrcfl/fl 및 Tfrcfl/flNcr1Cre 마우스의 비장에서 NK1.1+ NK 세포에 대한 CD27+CD11b-, CD27+CD11b+, CD27-CD11b+의 퍼센트 (평균 ± SEM, n=5). 하단 패널: Tfrcfl/fl 및 Tfrcfl/flNcr1Cre 마우스의 비장에서 NK1.1+ NK 세포에 대한 KLRG1+, CD62L+ 및 Ly6C+의 퍼센트 (평균 ± SEM, n=5). (F) Tfrcfl/fl 및 Tfrcfl/flNcr1Cre 마우스의 간 및 비장에서 NK1.1+ NK 세포에 대한 Ly49H+의 퍼센트 (평균 ± SEM, n=5-6). (G) 상단 좌측 패널: MCMV 감염 시에 WT 및 Tfrcfl/fl NK 세포의 확장을 추적하기 위한 Klra8-/- 수혜자에게의 입양 전달 실험의 계략도. 상단 우측 패널: 7 dpi, WT MCMV-감염된 수혜자의 간에서 입양 전달된 CD45.1+ 및 CD45.2+ (Ly49H+NK1.1+) NK 세포에 게이트된 대표적인 흐름도. 하단 패널: 7 및 30 dpi, WT MCMV-감염된 수혜자의 간, 비장, 폐 및 혈액에서 입양 전달된 WT (Ly49H+NK1.1+CD45.1+) 및 Tfrcfl/flNcr1Cre (Ly49H+NK1.1+CD45.2+) NK 세포의 퍼센트 (각 점은 1마리의 마우스로부터 단리된 세포의 데이터를 나타내고, 막대는 ± SEM을 나타내며, 2개의 독립적인 실험, 첫번째 7 dpi의 경우 n=5 및 30 dpi의 경우 n=3-5, 두 번째 7 dpi의 경우 n=4 및 30 dpi의 경우 n=2). (H) 좌측 패널: WT 및 Tfrcf1/fl NK 세포의 확장을 추적하기 위해, Rag2-/-IL2rg-/- 수혜자에게의 입양 전달 실험의 개략도. 우측 패널: 6 dpt, 간, 비장, 폐 및 혈액에서 입양 전달된 WT (Ly49H+NK1.1+CD45.1+) 및 Tfrcfl/flNcr1Cre (Ly49H+NK1.1+CD45.2+) NK 세포의 퍼센트 (각 점은 1마리의 마우스로부터 단리된 세포의 데이터를 나타내고, 막대는 ± SEM을 나타내며, n= 3-4). (I) 상단 좌측 패널: WT MCMV 감염 시에 WT 및 Tfrcfl/fl NK 세포에서 CFSE 희석을 분석하기 위해 Klra8-/- 수혜자에게의 입양 전달 실험의 개략도. 상단 우측 패널: 3.5 dpi, WT MCMV-감염된 수혜자의 간에서 입양 전달된 WT 및 Tfrcfl/flNcr1Cre NK1.1+ NK 세포에서 CFSE 희석의 대표적인 히스토그램. 하단 패널: 3.5 dpi, WT MCMV-감염된 수혜자의 간 및 비장에서 입양 전달된 WT (Ly49H+NK1.1+CD45.1+) 및 Tfrcfl/flNcr1Cre (Ly49H+NK1.1+CD45.2+) NK 세포의 CFSE의 GMFI (평균 ± SEM, 2개의 독립적인 실험, 첫 번째 n=5, 두 번째 n=4). (J) CFSE 희석에 의해 분석된, IL-15 LD에서 또는 IL-12/IL-18로 자극된 비장으로부터 증식된 Tfrcfl/fl 및 Tfrcfl/flNcr1Cre NK1.1+ NK 세포의 퍼센트 (평균 ± SEM, n=3-4). (K) 상단 패널: Tfrcfl/fl 및 Tfrcfl/flNcr1cre 마우스의 MCMV 감염 실험의 개략도. 중간 패널: 3.5 및 5.5 dpi, WT MCMV-감염된 Tfrcfl/fl 및 Tfrcfl/flNcr1cre 마우스의 간에서 NK1.1+ NK 세포의 퍼센트 및 절대 수 (평균 ± SEM, n=4-6). 하단 패널: 3.5 및 5.5 dpi, WT MCMV-감염된 Tfrcfl/fl 및 Tfrcfl/flNcr1cre 마우스의 비장에서 NK1.1+ NK 세포의 퍼센트 및 절대 수 (평균 ± SEM, n=3-6). (L) 3.5 dpi, WT MCMV-감염된 Tfrcfl/fl 및 Tfrcfl/flNcr1cre 마우스의 간 및 비장에서의 바이러스 역가 (각 점은 1마리의 마우스로부터 단리된 세포의 데이터를 나타내고, 수평선은 중앙값을 나타내며, n=5). (M) 1.5 dpi, WT MCMV-감염된 Tfrcfl/fl 및 Tfrcfl/flNcr1cre 마우스의 간 및 비장에서 NK1.1+ NK 세포에서 IFN-γ+의 퍼센트 (평균 ± SEM, n=4). (N) 좌측 패널: 5.5 dpi, WT MCMV-감염된 Tfrcfl/fl 및 Tfrcfl/flNcr1Cre 마우스의 비장에서 NK1.1+ NK 세포에 대한 CD27+CD11b-, CD27+CD11b+, CD27-CD11b+의 퍼센트 (평균 ± SEM, n=3-5). 우측 패널: 5.5 dpi, WT MCMV-감염된 Tfrcfl/fl 및 Tfrcfl/flNcr1Cre 마우스의 비장에서 NK1.1+ NK 세포에 대한 KLRG1+의 퍼센트 (평균 ± SEM, n=3-5). 통계적 유의성은 unpaired two-tailed Student's t-테스트 (A, B, C, D, E, F, I, J, K, L, M, N)로 평가하였다. *p < 0.05, **p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001, ns, 유의미하지 않음.
도 5: 활성화된 NK 세포에서 CD71의 유도를 위해 해당작용이 필요하다.
(A) 상단 패널: 비-자극되거나 (no stim) 또는 IL-12/ IL-18, IL-12/ IL-18 + ActD (1 및 10 μM) 및 IL-12/ IL-18 + CHX (10 및 100 μg/ ml)로 자극된 NV NK 세포 및 CE NK 세포에서 전체 CD71 발현의 대표적인 웨스턴 블롯. 하단 좌측 패널: 비-자극되거나 (no stim) 또는 IL-12/ IL-18, IL-12/ IL-18 + ActD 10 μM로 자극된 NV NK 세포 및 CE NK 세포에서 액틴에 대해 정규화된 전체 CD71 발현 (평균 ± SEM, n=3 공여자). 하단 우측 패널: 비-자극되거나 (no stim) 또는 IL-12/ IL-18, IL-12/ IL-18 + CHX 100 μg/ml로 자극된 NV NK 세포 및 CE NK 세포에서 액틴에 대해 정규화된 전체 CD71 발현 (평균 ± SEM, n=2 공여자). (B) 비-자극되거나 (no stim) 또는 IL-12/ IL-18, IL-12/ IL-18 + 2-DG로 자극된 NV NK 세포 및 CE NK 세포에서 TFRC mRNA의 발현. 전사체 수준은 18S mRNA 수준에 대해 결정되었고, 비-자극된 (no stim) NV NK 세포에 대해 정규화되었다 (평균 ± SEM, n=6 공여자). (C) 상단 좌측 패널: 비-자극되거나 (no stim) 또는 IL-12/ IL-18, IL-12/ IL-18 + 2-DG로 자극된 NV NK 세포 및 CE NK 세포에서 CD71 발현의 GMFI (평균 ± SEM, n=6 공여자). 상단 우측 패널: 비-자극되거나 (no stim) 또는 IL-12/ IL-18, IL-12/ IL-18 + 2-DG로 자극된 NV NK 세포 및 CE NK 세포에서 전체 CD71 발현의 대표적인 웨스턴 블롯. 하단 패널: 비-자극되거나 (no stim) 또는 IL-12/ IL-18, IL-12/ IL-18 + 2-DG로 자극된 NV NK 세포 및 CE NK 세포에서 액틴에 대해 정규화된 전체 CD71 발현 (평균 ± SEM, n=5 공여자). (D) 10 mM 글루코스 및 2 mM 글루코스 중에 비-자극되거나 (no stim) 또는 IL-12/ IL-18로 자극된 NV NK 세포 및 CE NK 세포에 대한 CD71 발현의 GMFI (평균 ± SEM, n=5 공여자). (E) 비-자극되거나 (no stim) 또는 IL-12/ IL-18, IL-12/ IL-18 + 2-DG로 자극된 NV NK 세포 및 CE NK 세포에서 Tf-488 흡수의 GMFI (평균 ± SEM, n=5 공여자). (F) 상단 패널: 비-자극되거나 (no stim) 또는 IL-12/ IL-18로 자극된 NV NK 세포 및 CE NK 세포에서 전체 c-Myc 발현의 대표적인 웨스턴 블롯. 하단 패널: 비-자극되거나 (no stim) 또는 IL-12/ IL-18로 자극된 NV NK 세포 및 CE NK 세포에서 액틴에 대해 정규화된 전체 c-Myc 발현 (평균 ± SEM, n=6 공여자). 통계적 유의성은 paired two-tailed Student's t-테스트 (A, B, C, D, E, F) 또는 선형-회귀 분석 (B, C, E)으로 평가하였다. *p < 0.05, **p < 0.01, *** p < 0.001, ns, 유의미하지 않음.
도 6: 사이토카인 프라이밍 (cytokine priming)은 IRP/IRE 조절 시스템을 유도한다.
(A) 상단 패널: 전사체 데이터의 비-자극되거나 (no stim) 또는 IL-12/ IL-18로 자극된 NV NK 세포 및 CE NK 세포에서 ACO1 및 IREB2 mRNA의 발현 (n=5 공여자). 중간 패널: 비-자극되거나 (no stim) 또는 IL-12/ IL-18로 자극된 NV NK 세포 및 CE NK 세포에서 전체 IRP1 및 IRP2 발현의 대표적인 웨스턴 블롯. 하단 패널: 비-자극되거나 (no stim) 또는 IL-12/ IL-18로 자극된 NV NK 세포 및 CE NK 세포에서 액틴에 대해 정규화된 전체 IRP1 및 IRP2 발현 (평균 ± SEM, IRP1의 경우 n=7 공여자, IRP2의 경우 n=6 공여자). (B) 비-자극되거나 (no stim) 또는 IL-12/ IL-18로 자극된 NV NK 세포 및 CE NK 세포에서 IRE를 보유하는 유전자를 코딩하는 mRNA의 상대적 발현의 히트맵 (n=5 공여자). (C) 상단 좌측 패널: 전사체 데이터의 비-자극되거나 (no stim) 또는 IL-12/ IL-18로 자극된 NV NK 세포 및 CE NK 세포에서 EIF4E mRNA의 발현 (n=5 공여자). 상단 우측 패널: 비-자극되거나 (no stim) 또는 IL-12/ IL-18로 자극된 NV NK 세포 및 CE NK 세포에서 전체 eIF4E 발현의 대표적인 웨스턴 블롯. 하단 패널: 비-자극되거나 (no stim) 또는 IL-12/ IL-18로 자극된 NV NK 세포 및 CE NK 세포에서 액틴에 대해 정규화된 전체 eIF4E 발현 (평균 ± SEM, n=6 공여자). (D) 상단 패널: 비-자극되거나 (no stim) 또는 IL-12/ IL-18로 자극된 NV NK 세포 및 CE NK 세포에서 HPG 혼입의 대표적인 히스토그램. 하단 패널: 비-자극되거나 (no stim) 또는 IL-12/ IL-18로 자극된 NV NK 세포 및 CE NK 세포에서 HPG 혼입의 GMFI (평균 ± SEM, n=5 공여자). (E) 좌측 패널: 비-자극되거나 (no stim) 또는 IL-12/ IL-18로 자극된 NV NK 세포 및 CE NK 세포에서 전체 페리틴 중쇄 1 발현의 대표적인 웨스턴 블롯. 우측 패널: 비-자극되거나 (no stim) 또는 IL-12/ IL-18로 자극된 NV NK 세포 및 CE NK 세포에서 액틴에 대해 정규화된 전체 페리틴 중쇄 1 발현 (평균 ± SEM, n=4 공여자). 통계적 유의성은 paired two-tailed Student's t-테스트 (A, C, E) 또는 선형-회귀 분석 (D)으로 평가하였다. *p < 0.05, **p < 0.01, ns, 유의미하지 않음.
도 7: IRP/IRE 조절 시스템은 NK 세포에서 CD71 발현을 조정한다.
(A) 전사체 데이터로부터 유래된 데이터, no stim 대 IL-12/IL-18로, NV NK 세포 및 CE NK 세포에서 TFRC mRNA의 발현 (n=5). (B) 전사체 데이터의 no stim 대 IL-12/IL-18로, NV NK 세포 및 CE NK 세포에서 FTH1 mRNA의 발현 (n=5). (C) 대조군 또는 Aco1 siRNA로 형질감염된 NK92 세포에서 전체 IRP1 발현의 대표적인 웨스턴 블롯. 대조군 또는 Aco1 siRNA로 형질감염된 NK92 세포에서 전체 IRP1 발현 (n=7). (D) 대조군 또는 IREB2 siRNA로 형질감염된 NK92 세포에서 전체 IRP2 발현의 대표적인 웨스턴 블롯. 대조군 또는 IREB2 siRNA로 형질감염된 NK92 세포에서 전체 IRP2 발현 (n=6). (E) 좌측 패널: 대조군, ACO1 또는 IREB2 siRNA로 형질감염된 NK92 세포에서 CD71 발현의 대표적인 히스토그램. 우측 패널: 대조군, ACO1 또는 IREB2 siRNA로 형질감염된 NK92 세포에서 CD71 발현의 GMFI (n=4-5). (F) 좌측 패널: 대조군, Aco1 및 IREB2 siRNA로 형질감염된 NK92 세포에서 전체 FTH1 발현의 대표적인 웨스턴 블롯. 우측 패널: 대조군, Aco1 및 IREB2 siRNA로 형질감염된 NK92 세포의 전체 FTH1 발현 (n=5). (G) 좌측 패널: 대조군 또는 Aco1 siRNA로 형질감염된 NKL 세포에서 전체 IRP1 발현의 대표적인 웨스턴 블롯. 우측 패널: 대조군 또는 Aco1 siRNA로 형질감염된 NKL 세포에서 전체 IRP1 발현 (n=6). (H) 좌측 패널: 대조군 또는 IREB2 siRNA로 형질감염된 NKL 세포에서 전체 IRP2 발현의 대표적인 웨스턴 블롯. 우측 패널: 대조군 또는 IREB2 siRNA로 형질감염된 NKL 세포에서 전체 IRP2 발현 (n=7). (I) 좌측 패널: 대조군, ACO1 또는 IREB2 siRNA로 형질감염된 NKL 세포에서 CD71 발현의 대표적인 히스토그램. 우측 패널: 대조군, ACO1 또는 IREB2 siRNA로 형질감염된 NKL 세포에서 CD71 발현의 GMFI (n=5). (J) 좌측 패널: 대조군 및 Aco1 siRNA로 형질감염된 NKL 세포에서 전체 FTH1 발현의 대표적인 웨스턴 블롯. 우측 패널: 대조군 및 Aco1 siRNA로 형질감염된 NKL 세포에서 전체 FTH1 발현 (n=6). (K) 좌측 패널: 대조군 및 IREB2 siRNA로 형질감염된 NKL 세포에서 전체 FTH1 발현의 대표적인 웨스턴 블롯. 우측 패널: 대조군 및 IREB2 siRNA로 형질감염된 NKL 세포에서 전체 FTH1 발현 (n=5). 모든 평균 데이터는 평균 ± s.e.m.으로 제시되고, unpaired two-tailed Student's t-테스트 (a,b,d,e) 또는 ANOWA (c)를 사용하여 분석되었다. 별표 (asterisks)는 그룹들 간의 유의성을 나타낸다. *p < 0.05, **p < 0.01, ns, 유의미하지 않음. (L) 좌측 패널: 대조군 또는 IREB2 sgRNA로 형질감염된 NK92 세포에서 전체 IRP2 발현의 대표적인 웨스턴 블롯. 우측 패널: 대조군 또는 IREB2 sgRNA로 형질감염된 NK92 세포에서 전체 IRP2 발현 (n=3). (M) 좌측 패널: 대조군 또는 IREB2 sgRNA로 형질감염된 NK92 세포에서 CD71 발현의 GMFI (n=5). 우측 패널: 대조군 또는 IREB2 sgRNA로 형질감염된 NK92 세포의 수 (n=4). 모든 평균 데이터는 평균 ± s.e.m.으로 제시되고, two-tailed Student's t-테스트 (A-B), unpaired two-tailed Student's t-테스트 (C, D, G, H, J, K, L, M) 또는 ANOWA (E, F, I)를 사용하여 분석되었다. 별표는 그룹들 간의 유의성을 나타낸다. *p < 0.05, **p < 0.01, *** p < 0.001, ns, 유의미하지 않음.
도 8: 강제 IRP 발현은 또한 T 세포 증식을 지원하는 분자 모듈이다.
(A) 좌측 패널: 대조군 또는 Aco1 siRNA로 형질감염된 Jurkat 세포에서 전체 IRP1 발현의 대표적인 웨스턴 블롯. 우측 패널: 대조군 또는 Aco1 siRNA로 형질감염된 Jurkat 세포에서 전체 IRP1 발현 (n=5). (B) 좌측 패널: 대조군 또는 IREB2 siRNA로 형질감염된 Jurkat 세포에서 전체 IRP2 발현의 대표적인 웨스턴 블롯. 우측 패널: 대조군 또는 IREB2 siRNA로 형질감염된 Jurkat 세포에서 전체 IRP2 발현 (n=4). (C) 좌측 패널: 대조군, ACO1 또는 IREB2 siRNA로 형질감염된 Jurkat 세포에서 CD71 발현의 대표적인 히스토그램. 우측 패널: 대조군, ACO1 또는 IREB2 siRNA로 형질감염된 Jurkat 세포에서 CD71 발현의 GMFI (n=7). (D) 좌측 패널: 대조군, Aco1 또는 IREB2 siRNA로 형질감염된 Jurkat 세포에서 전체 FTH1 발현의 대표적인 웨스턴 블롯. 우측 패널: 대조군, Aco1 및 IREB2 siRNA로 형질감염된 Jurkat 세포의 전체 FTH1 발현 (n=5). (E) mCherry (LV-mCherry) 또는 IREB2 (LV-IREB2)를 코딩하는 제어 벡터로 형질도입된 IRP2 녹아웃 (ko) Jurkat 세포에서 전체 IRP2 발현의 대표적인 웨스턴 블롯. (F) 상단 패널: LV-mCherry 또는 LV-IREB2로 형질도입된 IRP2 ko Jurkat 세포에서 CD71 발현의 대표적인 히스토그램. 하단 좌측 패널: LV-mCherry 대 LV-IREB2로 형질도입된 IRP2 ko Jurkat 세포에서 CD71 발현의 GMFI (n=4). 하단 우측 패널: LV-mCherry 대 LV-IREB2로 형질도입된 IRP2 ko Jurkat 세포의 수 (n=3). (G) 좌측 패널: LV-mCherry 대 LV-IREB2로 형질도입된 1차 CD4+ T 세포에서 CD71 발현의 대표적인 히스토그램. 우측 패널: LV-mCherry 대 LV-IREB2로 형질도입된 1차 CD4+ T 세포에서 CD71 발현의 GMFI (n=2). (H) 좌측 패널: LV-mCherry 대 LV-IREB2로 형질도입된 1차 CD8+ T 세포에서 CD71 발현의 대표적인 히스토그램. 우측 패널: LV-mCherry 대 IREB2 (LV-IREB2)로 형질도입된 1차 CD8+ T 세포에서 CD71 발현의 GMFI (n=2). (I) 비-형질도입된 (untransduced) CD4+ T 세포 (UTD), PSMA-특이적 CAR CD4+ T 세포 (CAR) 및 PSMA-특이적 CAR CD4+ T 세포 공동-발현 IRP2 (CAR-IREB2)에서 전체 IRP2 발현의 대표적인 웨스턴 블롯. (J) 상단 패널: 비-자극된 UTD, CAR 및 CAR-IREB2 형질도입된 CD4+ T 세포에서 CD71 발현의 대표적인 히스토그램. 비-자극된 UTD, CAR 및 CAR-IREB2 형질도입된 CD4+ T 세포에서 CD71 발현의 MFI (n=3). 하단 패널: Fab-자극된 UTD, CAR 및 CAR-IREB2 형질도입된 CD4+ T 세포에서 CD71 발현의 대표적인 히스토그램. Fab-자극된 UTD, CAR 및 CAR-IREB2 형질도입된 CD4+ T 세포에서 CD71 발현의 MFI (n=3). (K) 상단 패널: 세포 증식의 0, 1 및 2 주기에 들어간, 비-자극된 UTD, CAR 및 CAR-IREB2 형질도입된 CD4+ T 세포의 퍼센트 (n=3). 하단 패널: 세포 증식의 0, 1 및 2 주기에 들어간, Fab-자극된 UTD, CAR 및 CAR-IREB2 형질도입된 CD4+ T 세포의 퍼센트 (n=3). 모든 평균 데이터는 평균 ± s.e.m.으로 제시되고, unpaired two-tailed Student's t-테스트 (a,b,f) 또는 ANOWA (c,d)를 사용하여 분석되었다. 별표는 그룹들 간의 유의성을 나타낸다. *p < 0.05, **p < 0.01, ns, 유의미하지 않음.
실시예
실시예 1: 나이브 (naive) 및 사이토카인-강화 (cytokine-enhanced) NK 세포는 IFN-γ 생성을 위한 해당작용 (glycolysis)에 유사하게 의존한다.
사이토카인-강화 (CE) NK 세포의 증강된 리콜 반응 (recall responses)은 암에 대한 면역 세포 요법의 유망한 특징을 반영한다. CE NK 세포 대사작용이 사이토카인 생성을 뒷받침하는 경우 및 방법에서, 표적 세포 제거 및 증식은 여전히 알려져 있지 않다. CE NK 세포의 이러한 주요 특징들을 설명하기 위해, 본 발명자들은 나이브 (NV) 대 CE NK 세포의 비교를 허용하는 확립된 인 비트로 CE NK 세포 모델을 사용하였다. 간략하게는, 본 발명자들은 IL-12 및 IL-18 (IL-12/ IL-18)을 사용하여 새로 단리된 인간 NK 세포를 16시간 동안 프라이밍 (priming)한 후에, 생존을 지원하기 위해 저용량의 IL-15 (IL-15 LD)에서 휴지 기간을 가졌다. 휴지 7일 후에, NV NK 세포 대 CE NK 세포의 특징을 자극 시에 비교하였다 (도 1A). 이전 데이터와 일치하는, IL-12/IL-18로 NK 세포를 프라이밍하면, 재-자극 시에 IFN-γ를 생성하는 이들의 능력이 증가하였다 (도 1B). 중요하게는, NK 세포는 CD69 발현에 의해 나타내는 바와 같이, 자극 시에 유사하게 활성화되었다 (도 1C). 세포 대사작용이 전사 수준에서 NV NK 세포 대 CE NK 세포의 기능과 관련되는 방식을 탐색하기 위해, 비-자극된 세포 및 사이토카인-자극된 세포를 사용하여 RNA 시퀀싱 (RNA-seq)을 수행하였다. 비-자극된 및 활성화된, NV NK 세포 및 CE NK 세포 모두는 주성분 분석 (principal component analysis: PCA)에서 별도로 클러스터링되었다. 그러나, 활성화는 훨씬 더 강력한 전체 식별 인자 (discriminating factor)이었고, 이는 NV NK 세포 및 CE NK 세포의 전사체들 간의 상대적 유사성을 나타내었다 (도 1D).
호기성 해당작용의 빠른 상향조절은 NK 세포를 포함한 활성화된 림프구의 대사 특징이다. 예상치 않게, NV NK 세포 및 CE NK 세포 모두는 자극 시에 해당작용 효소 (glycolytic enzymes)를 코딩하는 유전자 전사체를 유사하게 상향조절하였고, 예외적으로 HK2는 NV NK 세포에서보다 CE NK 세포에서 더 높았다 (도 1E). 전사체 데이터와 일치하는, 대사 플럭스 분석 (metabolic flux assay)은 비-자극된 세포와 비교하여 활성화된 세포에서 기저 (basal) 및 최대 (maximal) 해당작용 속도 (glycolytic rates)의 증가를 나타내었지만, NV NK 세포 및 CE NK 세포 간의 차이는 관찰되지 않았다 (도 1F).
마찬가지로, 글루코스 유사체 2-NBDG의 흡수는 비-자극된 및 활성화된, NV NK 세포 및 CE NK 세포 간에 상이하지 않았다 (도 1G). 해당 대사작용 (glycolytic metabolism)의 증가가 IFN-γ를 생성하는 NV NK 세포 및 CE NK 세포의 능력과 관련되어 있는지 여부를 평가하기 위해, 본 발명자들은 헥소키나제 억제제 (hexokinase inhibitor)인 2-데옥시-d-글루코스 (2-DG)의 존재하에 IL-12/ IL-18로 NV NK 세포 및 CE NK 세포를 자극하였다. 사이토카인 자극 중에 해당작용의 억제는 NV NK 세포 및 CE NK 세포에서 IFNG mRNA 풍도 및 IFN-γ 분비를 유사하게 감소시켰다 (도 1H 및 1I, 좌측 패널). 마찬가지로, 저농도의 글루코스에서 NK 세포를 배양하면 서브세트 모두에서 IFN-γ의 생성이 감소하였다 (도 1I, 상단 패널). 이들 데이터와 함께, NV NK 세포 및 CE NK 세포의 활성화 시에 기저 및 최대 해당작용 활성의 유사한 증가를 확인하였으며, 이는 상기 서브세트 모두에서 주요 염증성 사이토카인 IFN-γ의 효과적인 생성을 위해 요구되었다.
실시예 2: 활성화된 CE NK 세포는 높은 수준의 세포-표면 CD71 및 빠른 세포 증식을 특징으로 한다.
NV NK 세포 대 CE NK 세포의 대사작용 프로파일을 추가로 특성 규명하기 위해, 본 발명자들은 활성화된 NK 세포에서 상향조절되는 것으로 보고된 영양소 수송체 (nutrient transporters) CD98 및 CD71의 표면 발현을 분석하였다. 자극 시에, NK 세포 서브세트들 모두에서 CD98 발현의 약간의 필적할만한 증가를 관찰하였다 (도 2A). 대조적으로, 트란스페린 수용체 (transferrin receptor) CD71의 상향조절은 GMFI 및 양성 세포의 퍼센트로 표시되는 경우, NV NK 세포에 비해 CE NK 세포에서 훨씬 더 컸다 (도 2B). CD71의 세포 표면 발현 증가는 전체 세포 용해물의 면역블롯 분석에 의해 평가되는 바와 같이 CD71 단백질의 전반적으로 더 큰 세포 풍도가 반영되었다 (도 2C). CD71의 차등 세포 표면 발현이 수용체 활성화를 통한 NK 세포 자극에 의해 유도될 수 있는지 여부를 테스트하기 위해, 두 서브세트를 모두 HLA-결핍 표적 세포 (K562 세포주)로 자극하였다. 사이토카인 자극과 유사하게, CD71의 상향조절은 NV NK 세포보다 K562-노출된 CE NK 세포에서 더 현저하였다 (도 2D). 증가된 CD71 발현의 기능적 능력을 평가하기 위해, 본 발명자들은 형광 표지된 트란스페린을 사용하여, NV NK 세포 및 CE NK 세포에서 트란스페린 흡수를 모니터링하였다. 이들 실험에서 NV NK 세포와 비교하여 활성화된 CE NK 세포에서 트란스페린 흡수 증가를 나타내었다 (도 2E).
CD71의 발현 및 증식 속도는 이전에 신생물 세포에서 관련이 있었다. 이러한 연관성이 또한 NK 세포에 적용되는지 여부를 테스트하기 위해, CFSE 희석 분석 (CFSE dilution assays)을 사용하여 NV NK 세포 및 CE NK 세포의 증식을 모니터링하였다. 정상-상태 조건들 모두에서 및 자극 시에, CE NK 세포는 이의 NV 대응물보다 더 큰 정도로 증식하였다 (도 2F). 차등 증식 속도와 일치하는, 세포-주기 진행 유전자를 코딩하는 전사체의 풍도를 테스트하는 경우 자극된 CE NK 세포를 클러스터링하였다 (도 2G). 트란스페린 흡수 증가가 세포 증식 증가와 관련이 있는지를 설명하기 위해, 본 발명자들은 세포내 철 킬레이터 (intracellular iron chelator) 2,2'-비피리딜 (BIP)을 사용하였다. 이들 실험에서 BIP는 NV NK 세포 및 CE NK 세포 모두에서 용량-의존적 방식으로 NK 세포 증식을 억제하였음을 보여주었다 (도 2H). 중요하게는, BIP는 세포 생존력에 최소한의 영향을 주었고 (데이터가 개시되지 않음), CD69 발현에 의해 평가된 바와 같이 NK 세포 활성화에는 영향을 주지 않았다 (도 2I).
5탄당 포스페이트 경로 (pentose phosphate pathway: PPP)는 뉴클레오티드 합성을 위한 리보스 5-포스페이트 및 NADPH를 제공하고 등가물을 환원시켜서, 세포 증식을 지원한다. CE NK 세포에서 관찰된 증식 증가와 일치하는, 사이토카인 자극은 NV NK 세포보다 CE NK 세포에서 여러 PPP-관련 유전자의 mRNA 풍도를 더 현저하게 증가시켰다 (도 2J, 상단 패널). 상기 PPP 억제제인 6-아미노니코틴아미드 (6AN)는 사이토카인-자극된 NK 세포의 확장을 방지하여, NV NK 세포 및 CE NK 세포 모두의 증식을 촉진하는데 PPP의 관련성을 추가로 뒷받침하였다 (도 2J, 하단 패널). 또한, 이들 실험으로부터, (i) 활성화된 CE NK 세포 대 NV NK 세포에 대한 CD71의 우선적인 상향조절, 및 (ii) NV NK 세포에 비해 활성화된 CE NK 세포의 증식 증가를 확인하였고, 이는 PPP 활성에 의존한다.
실시예 3: CD71-매개 철 흡수 및 식이 철 이용 가능성 (dietary iron availability)은 NK 세포 기능에 영향을 준다.
최근에, TFRC 유전자 (TFRCY20H/Y20H)의 돌연변이가 B 및 T 세포 기능을 손상시켜서 원발성 면역결핍 (primary immunodeficiency: PID)을 유발하는 것으로 밝혀졌다. 상기 돌연변이는 수용체-매개 세포내이입에 영향을 주고, 인간 세포에서 및 마우스에 도입되는 경우 CD71-매개 철 흡수를 손상시켰다. 이러한 돌연변이를 보유하는 환자에서 NK 세포의 수는 정상이지만, 기능적 특성은 이전에 평가되지 않았다. CD71 기능 및 NK 세포 증식이 연관되어 있는지 여부를 테스트하기 위해, 본 발명자들은 엑스 비보에서 IL-15 LD, 및 IL-12/IL-18-자극된 야생형 (WT) 및 TfrcY20H/Y20H 뮤린 NK 세포에서 CFSE 희석을 평가하였다. 이들 실험에서 Tfrc 돌연변이를 보유하는 NK 세포들 사이에서 IL-15 LD 및 IL-12/ IL-18-유도 증식의 현저한 결여를 나타내었다 (도 3A).
이러한 강력한 표현형을 고려하여, 본 발명자들은 약한 철 결핍이 NK 세포 기능장애를 유발하기에 충분한지 여부가 궁금하였다. 이러한 개념을 탐구하기 위해, 본 발명자들은 먼저 마우스 모델에서 전신 철 결핍을 확립하였다 (도 3B, 상단 패널). 예상한 바와 같이, 6주 동안 철분-결핍 식이를 유지한 마우스는 말초 혈액 중에 철, 페리틴 및 헤마토크리트 수준이 감소한 반면에, 불포화된 철-결합 능력 (unsaturated iron-binding capacity: UIBC) 및 전체 철-결합 능력 (total iron-binding capacity: TIBC)은 대조군 식이를 유지한 마우스와 비교하여 증가한 것으로 나타났다 (도 3B, 하단 패널). 비장 T 및 B 세포 수는 철 결핍이 있는 마우스에서 정상인 반면에, NK 세포 수는 더 낮아지는 경향이 있었고, 이는 전신 철 풍도에 대한 이들 세포의 선택적 민감성을 나타내었다 (도 3C). NK 세포 성숙 표현형에 대한 철 결핍의 영향은 관찰되지 않았다 (도 3D). 그러나, MCMV 감염 시에, NK 세포에 의한 IFN-γ 생성 및 비장 NK 세포-매개 바이러스 제어는 철-결핍 식이를 유지한 마우스에서 감소하는 경향이 있었고, 이는 NK 세포 기능이 손상되었음을 나타낸다 (도 3E, 좌측 패널 및 8F). 주목할만한 것은, NK 세포-매개 제어를 회피하는 Δm157 MCMV의 복제는 감소된 철 수준에 의해 영향을 받지 않았다는 점이다 (도 3E, 우측 패널). 또한, 이들 데이터로부터 CD71-매개 철 흡수는 NK 세포 증식을 조절하는데 중요한 역할을 한다는 것을 입증하였다. 또한, 전신 철 수준 감소는 아마도 NK-세포 기능을 감소시킴으로써 인 비보 MCMV 감염의 면역 제어를 유의미하게 손상시켰다. 손상된 NK 세포-매개 면역이 NK 세포 내인성 또는 외인성 요인으로부터 기인한 것인지 여부는 아직 밝혀지지 않았다.
실시예 4: CD71은 바이러스 감염 중에 NK 세포 증식 및 최적 이펙터 기능을 지원한다.
NK 세포에 대한 CD71-매개 철 흡수의 기능적 중요성을 테스트하기 위해, 본 발명자들은 Ncr1Cre 마우스를 Tfrcfl/fl 마우스와 교배 (Tfrcfl/flNcr1Cre)함으로써, NK 세포에서 CD71이 특이적으로 결여된 마우스를 생성하였다. 항상성 조건하에, Tfrcfl/flNcr1Cre 마우스에서 NK 세포의 퍼센트 및 절대 수는 Tfrcfl/fl 한배 새끼 대조군 (littermate controls)과 비교하여 간 및 비장 모두에서 약간 감소하였다 (도 4A). CD19+ B 세포 뿐만 아니라, CD8+ 및 CD4+ T 세포의 퍼센트 및 절대 수는 CD71의 NK 세포 특이적 결실에 의해 영향을 받지 않았다 (도 4B 및 4C). 또한, 말단 NK 세포 성숙 마커의 발현은 Tfrcfl/flNcr1Cre 및 Tfrcf1/fl 마우스들 간에 유사하였다 (CD27, CD11b, KLRG1, CD62L 및 Ly6C) (도 4D 및 4E). 마찬가지로, MCMV 감염 제어에 중요한 NK 세포 활성화 수용체인 Ly49H가 Tfrcfl/flNcr1Cre 및 Tfrcfl/fl NK 세포에서 동일하게 발현되었다 (도 4F).
MCMV에 의한 NK 세포 활성화는 Ly49H+ NK 세포의 증식을 유도한다. CD71의 결실이 인 비보 항원-특이적 NK 세포 확장에 영향을 주는지 여부를 조사하기 위해, 본 발명자들은 유사유전자형 (congenic) Ly49H+ WT 및 Tfrcfl/flNcr1Cre NK 세포를 Ly49H-결핍 (Klra8-/-) 수혜자에게 동시-전달하였다 (도 4G, 상단 패널). 그 다음에, 본 발명자들은 수혜자 마우스를 MCMV로 감염시키고, 전달된 NK 세포의 확장을 추적하였다. WT NK 세포는 7 및 30 dpi (days post-infection)에 Tfrcfl/flNcr1Cre NK 세포와 비교하여, Ly49H+ NK 세포 풀의 80-90%를 구성하는, 간, 비장, 폐 및 혈액에서 강력하게 확장되었다 (도 4G, 하단 패널). 다음으로, 본 발명자들은 공통-g-사슬-의존성 사이토카인의 이용가능성에 의해 유도되는 림프구감소성 숙주에서 NK 세포의 확장이 또한 CD71에 의존하는지 여부를 다루었다. 이를 위해, 본 발명자들은 WT 및 Tfrcfl/flNcr1Cre NK 세포를 동일한 비율로 Rag2-/-IL2rg-/- 수혜자 마우스에게 전달하였다 (도 4H, 좌측 패널). 감염 실험과 유사하게, 6 dpi에서 Tfrcfl/flNcr1Cre NK 세포의 빈도는 WT 세포의 빈도보다 훨씬 더 낮았다 (도 4H, 우측 패널). 두 입양 전달 실험 모두에서 Tfrcfl/flNcr1Cre NK 세포 수의 감소는 확장 결여, 세포 사멸 증가 또는 이들 모두의 조합으로부터 기인하였다. NK 세포에서 CD71의 결실이 이들의 인 비보 증식과 관련된 방식을 평가하기 위해, WT 및 Tfrcfl/flNcr1Cre NK 세포를 CFSE로 표지하고, 동일한 비율로 수혜자 마우스에게 전달하였다 (도 4I, 상단 패널). 그 다음에 수혜자를 MCMV로 감염시키고, 공여자 세포를 3.5 dpi에서 수확하였다. 간 및 비장에서 입양 전달된 Tfrcfl/flNcr1Cre NK 세포의 CFSE 희석 및 이에 따른 증식은 WT 세포의 것보다 유의미하게 더 낮았다 (도 4I, 하단 패널). 이러한 발견은 인 비트로 증식 연구에서 추가로 확인되었으며, 여기서 IL-15 LD 및 IL-12/IL-18-자극된 Tfrcfl/flNcr1Cre NK 세포는 대조군 세포와 비교하여 증식이 감소하였음을 보여주었다 (도 4J).
CD71의 결실이 NK 세포-매개 바이러스 제어에 영향을 주는지 여부를 다루기 위해, 본 발명자들은 Tfrcfl/fl 및 Tfrcfl/flNcr1Cre 마우스를 MCMV로 챌린지 (challenge)하였다 (도 4K, 상단 패널). 상기에 기재된 경쟁적 전달 분석과 일치하는, 3.5 및 5.5 dpi에서 NK 세포의 퍼센트 및 절대 수 모두에서의 유의미한 감소가 Tfrcfl/flNcr1Cre 마우스의 간 및 비장 모두에서 관찰되었다 (도 4K, 중간 및 하단 패널). NK 세포의 불충분한 확장은 3.5 dpi에서 Tfrcfl/flNcr1Cre 마우스에서 더 높은 비장 바이러스 역가와 연관되었으며, 간에서 유사한 경향이 관찰되었다 (도 4L). 또한, 비장 및 간 침윤 Tfrcfl/flNcr1Cre NK 세포의 IFN-γ 생성은 MCMV 감염 시에 감소되었다 (도 4M). 중요하게는, 낮은 확장 및 감소된 이펙터 용량에도 불구하고, CD27, CD11b 및 KLRG1 발현에 의해 나타낸 바와 같이, CD71 결핍은 MCMV-챌린지된 CD71 결핍 NK 세포의 말단 성숙을 손상시키지 않았다 (도 4N). 종합하면, 이들 데이터는 감염 중에 및 림프구감소 환경 모두에서 NK 세포 증식에서 CD71의 중요한 역할을 나타낸다.
실시예 5: 활성화된 NK 세포에서 CD71의 유도를 위해 해당작용이 필요하다.
본 발명의 실험으로 (i) NK 세포 증식을 제어하는 중요한 대사작용 체크포인트로서 CD71을 통한 철 흡수; 및 (ii) 활성화된 CE NK 세포 대 NV NK 세포에 대한 CD71의 매우 우선적인 상향조절을 확립하였다. 이러한 발견으로 본 발명자들은 CD71 자체가 NV NK 세포 및 CE NK 세포에서 조절되는 방식에 대한 의문을 갖게 되었다. 이러한 의문을 해결하기 위해, 본 발명자들은 먼저 CD71의 유도가 NK 세포 전사 활성에 의존하는지 여부를 평가하였다. 이전 실험에서와 같이, CD71은 NV NK 세포보다 사이토카인-자극된 CE NK 세포에서 더 큰 정도로 유도되었다 (도 5A). 두 서브세트 모두에서 전사의 억제 (악티노마이신 D (Actinomcyin D) 사용)는 번역의 차단 (사이클로헥시미드 사용)과 마찬가지로, CD71의 자극-유도 상향조절을 완전히 방지하였다 (도 5A). 따라서, 전사 및 번역은 세포 서브세트 모두에서 유사하게 요구되었다. 해당작용 재프로그래밍 (glycolytic reprogramming)은 활성화된 NK 세포에서 전사를 유도하는 것으로 이전에 입증되었다 (72). 해당작용이 활성화된 NV NK 세포 및 CE NK 세포에서 유사하게 유발되었기 때문에 (도 1F), 본 발명자들은 해당 대사작용이 NV NK 세포 및 CE NK 세포 간의 TFRC (CD71을 코딩함) 전사에 차등적으로 영향을 줄 수 있는 가능성을 조사하였다. TFRC mRNA 풍도는 NV NK 세포보다 활성화된 CE NK 세포에서 실제로 더 높았지만, 2-DG로 해당작용을 억제하는 경우 유사하게 감소하였다 (도 5B). CD71 및 전체 CD71 수준의 세포 표면 발현은 세포를 2-DG에 노출시키는 경우 동일한 패턴을 따랐다 (도 5C). CD71 발현을 유도하기 위한 글루코스에 대한 의존성을 저농도의 글루코스 배지에서 NK 세포의 활성화 시에 재현하였고, 2-DG 처리된 NK 세포에서 트란스페린 흡수 감소로 번역되었다 (도 5D 및 5E). 따라서 해당작용은 CD71의 전사 및 번역을 가능하게 하였다. 그러나, 해당작용이 활성화된 CE NK 세포 대 NV NK 세포에서 CD71의 차등적 풍도를 조절하였다는 증거는 발견되지 않았다.
c-Myc를 다양한 면역 세포들에서 TFRC 전사의 핵심 조절인자로 확립하였다. NV NK 세포에 비해 활성화된 CE NK 세포 중에서 TFRC mRNA의 증가된 풍도를 고려하여 (도 5B), CE NK 세포에서 우선적인 c-Myc 유도는 활성화된 CE NK 세포 및 NV NK 세포 간의 CD71의 차등적 조절을 설명할 수 있었다. 그러나, c-Myc는 두 NK 세포 서브세트 모두에서 강력하지만 동등하게 유도되었다 (도 5F). 이들 데이터로부터 활성화된 NV NK 세포 및 CE NK 세포에서 (i) CD71의 발현을 지원하기 위한 연속적인 전사 및 번역 및 (ii) CD71 발현을 위한 대사작용 요건으로서 해당작용 재프로그래밍에 대한 대칭적 필요성을 확립하였다.
실시예 6: 사이토카인 프라이밍 (cytokine priming)은 IRP/IRE 조절 시스템을 유도한다.
세포 철 항상성 (cellular iron homeostasis)에 관여된 많은 유전자는 이들의 mRNA의 5' 또는 3' UTR에 철 반응성 요소 (iron responsive element: IRE)를 포함한다. 철 조절 단백질 1 및 2 (IRP1 및 IRP2)는 IRE에 결합하고, 이에 의해 mRNA 안정성 및 번역을 제어한다. TFRC mRNA는 3'UTR에 5개의 IRE를 포함하고; IRP의 결합은 mRNA를 안정화시키고, 번역을 촉진한다. 기재된 바와 같이, 이는 철-결핍 조건에서 발생할 수 있다. 그러므로, 본 발명자들은 CE NK 세포들에서 선택적으로, IRP의 풍도 증가는 활성화된 CE NK 세포에서 CD71 발현 증가를 조절하는 가능한 기전일 수 있다는 가설을 설정하였다. mRNA 수준에서, 두 IRP 전사체들인, ACO1 및 IREB2 모두의 풍도는 NV NK 세포 및 CE NK 세포에서 유사하였다 (도 6A, 상단 패널). 그러나, IRP1 및 IRP2의 단백질 풍도는 정지 및 활성화된 CE NK 세포에서 더 높았다 (도 6A, 하단 패널). 이러한 발견은 세포 서브세트-특이적 방식으로 가성 철 결핍 상태 (pseudo iron deficient state)를 발생시키고, 이에 의해 개별 단백질 세트의 풍도를 전사 후에 제어 (post-transcriptionally controlling)할 수 있는, IRP의 새로운 역할과 양립할 수 있었다.
이러한 관찰을 확장하기 위해, 본 발명자들은 NK 세포에서 발현되는 mRNA를 함유하는 알려진 IRE의 전사체 풍도를 분석하였다 (도 6B). 본 발명자들은 SIRE (searching for ironresponsive elements) 알고리즘으로 EIF4E mRNA의 3'UTR에서 IRE-유사 모티프를 밝혔기 때문에, IRE 함유 mRNA의 목록에 중요한 진핵생물 번역 개시 인자 4E (eIF4E)를 포함하였다 (데이터는 개시되지 않음). 이러한 분석으로 본 발명자들에게 EIF4E에 대한 전사 및 번역 패턴을 평가하도록 하였다. CD71에 대해 관찰된 패턴이 재현되었고, 활성화된 CE NK 세포는 더 많은 EIF4E 전사체 및 분명히 더 많은 eIF4E 단백질을 발현하였다 (도 6C). 그러나 이미 정지된 CE NK 세포들은 NV NK 세포와 비교하여 eIF4E를 증가된 수준으로 발현하였다. 중요하게는, eIF4E의 더 높은 풍도에도 불구하고, 전체 단백질 번역은 L-호모프로파길글리신 (HPG) 혼입 분석을 사용하여 평가한 바와 같이, 활성화된 NV NK 세포 및 CE NK 세포 간에 식별할 수 있는 차이가 없었다 (도 6D). 또한, 본 발명자들은 활성화된 CE NK 세포에서 증가된 FTH1 mRNA 풍도를 주목하였다 (도 6B). FTH1 mRNA는 5'UTR에 IRE를 함유하고, IRP의 5'UTRs IREs에의 결합은 번역을 억제한다. 이러한 배열을 통해 본 발명자들은 CE NK 세포에서 IRP 풍도의 선택적 증가에 의해 유도된 가성 철 결핍의 가설을 테스트할 수 있었다. 실제로, 더 높은 전사체 수준에도 불구하고, 페리틴 중쇄 1 (FTH1의 유전자 산물)의 단백질 풍도는 비-자극된 CE NK 세포 및 활성화된 CE NK 세포 모두에서 어떠한 경우에도 더 낮았다 (도 6E). 이러한 발견은 IRP가 이들의 CE NK 세포 및 NV NK 세포 특이적 풍도와 함께, FTH1 mRNA 번역 조절에 관여하는 것을 시사하였다. 이들 데이터로부터 CE NK 세포들에서 선택적으로 유도되는 조절 축 (regulatory axis)을 설정하였고, 여기에서 가성 철 결핍은 활성화된 CE NK 세포의 CD71의 번역 증가 및 이에 따른 증식을 가능하게 한다.
실시예 7: CAR T 세포에서 IRP의 발현
CAR T 세포 생성
CAR 및 IRP1 및/또는 IRP2의 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인, CD3ζ 도메인, 및 CD28 공동자극 도메인의 서열을 해당하는 렌티바이러스 벡터로 클로닝하였다. 필요한 경우, 상기 IRP 및 CAR 서열을 개별 렌티바이러스 패키징 벡터로 복제하였다. 렌티바이러스 생성은 적절한 세포주에서 수행하였다.
CD8+ 및/또는 CD4+ T 세포를 환자 또는 건강한 공여자 유래의 말초 혈액 단핵 세포로부터 단리하고, IL-2의 존재하에 항-CD3 및 항-CD28 (가용성 또는 비드-결합)로 활성화시켰다. 활성화시키고 1-2일 후에, 가용성 항체 또는 비드를 제거하고, 세포를 약 18시간 동안 렌티바이러스로 형질도입하고, 배지를 IL-2가 보충된 새로운 배지로 교체하였다. CAR 및 IRP 발현은 지시된 시점에서 유세포 분석으로 확인할 것이다.
선택 사항:
CD8+ 및/또는 CD4+ T 세포를 환자 또는 건강한 공여자 유래의 말초 혈액 단핵 세포로부터 단리하고, IL-2의 존재하에 항-CD3 및 항-CD28 (가용성 또는 비드-결합)으로 활성화시켰다. 활성화시키고 1일 후에, 세포를 약 48시간 동안 렌티바이러스로 형질도입하고, 배지는 IL-2가 보충된 새로운 배지로 교체하였다. 활성화시키고 5일 후에, 비드를 제거하고, IL-15 및 IL-7을 함유하는 배지로 교체하였다. CAR 및 IRP 발현은 지시된 시점에서 유세포 분석으로 확인할 것이다.
CAR T 세포의 인 비트로 증식
CAR T 세포의 세포 증식을 분석하기 위해, 세포-증식 염료인 카복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 (carboxyfluorescein succinimidyl ester: CFSE, 1 μM, Molecular probes, USA)로 활성화시키기 전에 세포를 로딩하고, 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 고정 가능한 live-dead 세포 염색 (Fixable Viability Dye, eBioscience or Zombie Aqua, Biolegend)을 사용하여 샘플 수집 전에 사멸 세포를 배제하였다. CFSE 희석은 유세포 분석으로 자극 후 다양한 시점에서 분석하였다.
CAR T 세포의 인 비보 증식
CAR T 세포의 인 비보 세포 증식을 분석하기 위해, 적어도 하나의 IRP를 과발현하는 CAR T 세포 및 어떠한 IRP도 과발현하지 않는 CAR T 세포를 해당하는 뮤린 종양 모델에 입양 전달하고, 전달된 세포의 빈도 및 수를 다양한 시점에서 분석하였다. 소정의 실험에서, 적어도 하나의 IRP를 과발현하는 CAR T 세포 및 어떠한 IRP도 과발현하지 않는 CAR T 세포를 전달 전에 세포 증식 염료 CFSE에 로딩하여 인 비보 증식을 분석하였다.
마우스 종양 모델
적어도 하나의 IRP를 과발현하는 CAR T 세포 및 어떠한 IRP도 과발현하지 않는 CAR T 세포를 해당하는 뮤린 종양 모델로 입양 전달하였다. 종양 모델에 따라, 소정의 실험에서 종양 직경을 측정하였다. 종양 모델에 따라, 소정의 실험에서 폐를 절개하고, 해당 버퍼 중에 고정하고, 현미경을 사용하여 결절 (nodules)의 수를 계수하였다. 종양 모델에 따라, 소정의 실험에서 생존율을 분석하였다.
실시예 8: 물질 및 방법
마우스
University of Rijeka, Faculty of Medicine에서 동물 실험을 수행하였고, 이는 Ethical Committee of the Faculty of Medicine, University of Rijeka, 및 Ethical Committee at the Croatian Ministry of Agriculture, Veterinary and Food Safety Directorate (UP/I-322-01/18-01/44)의 승인을 받았다. 마우스는 실험들 내에서 연령 및 성별을 엄격하게 일치시켰고, SPF 조건을 유지하였다. 동물 취급은 International Guiding Principles for Biomedical Research Involving Animals에 포함된 지침에 따랐다.
야생형 C57BL/6J (B6, 균주 000664), B6 Ly5.1 (균주 002014), Tfrcfl/fl (균주 028363) 및 Rag2-/-γc-/- (균주 014593) 마우스는 Jackson laboratory로부터 구입하였다. Ncr1Cre 마우스는 V. Sexl (Vienna, Austria)이 친절하게 제공하였고, B6.Ly49h-/-는 Silvia M. Vidal (Montreal, Canada)이 친절하게 제공하였다. 일부 실험에서, 마우스에게 6주 동안 철분-결핍 식이 및 상응하는 대조군 식이 (C1038 및 C1000, Altromin)를 제공하였다.
University of Basel의 동물 실험은 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 현지 규칙에 따라 수행하였다. 마우스는 실험들 내에서 연령 및 성별을 엄격하게 일치시켰고, SPF 조건을 유지하였다. 야생형 C57BL/6J (B6, 균주 000664) 마우스는 Jackson Laboratories (USA)로부터 구입하였고, TfrcY20H/Y20H 마우스는 R. Geha (Boston, USA)가 친절하게 제공하였다.
혈액학적 분석
혈청 중 철, 페리틴, 불포화된 철 결합 능력 (unsaturated iron binding capacity: UIBC) 및 전체 철 결합 능력 (total iron binding capacity: TIBC)은 AU5800 분석기 (Beckman Coulter)를 사용하여 결정하였다. 헤마토크리트는 혈액 분석기 (hematology analyzer) DxH500 (Beckman Coulter)을 사용하여 결정하였다. 측정은 Clinical Institute of Laboratory Diagnostics (Clinical Hospital Center, Rijeka, Croatia)에서 수행하였다.
바이러스
박테리아 인공 염색체-유래 뮤린 거대세포바이러스 (bacterial artificial chromosome-derived murine cytomegalovirus: BAC-MCMV) 균주 pSM3fr-MCK-2fl 클론 3.3은 이전에 MCMV Smith 균주 (VR-1399; ATCC)와 생물학적으로 동등한 것으로 밝혀졌으며, 본원에서 이후에 야생형 (WT) MCMV231이라고 한다. pSM3fr-MCK-2fl 클론 3.3 및 Δm157을 마우스 배아 섬유모세포 (MEFs)232 상에 증식시켰다. 동물을 2x105 PFU (plaque forming units)로 정맥내로 (i.v.) 감염시켰다. 바이러스 역가 (viral titers)는 표준 플라크 분석 (standard plaque assay)에 의해 MEF에서 결정하였다.
입양 전달 실험
입양 공동-전달 연구 (adoptive co-transfer studies)는, MCMV 감염 1일 전에, WT B6 (CD45.1) 및 Tfrcfl/flNcr1Cre (CD45.2) 마우스 유래의 비장세포 (splenocytes)를 동일한 비율로 B6.Ly49h-/- 및, 각각 Rag2-/-γc-/- 수혜자에게 전달함으로써 수행하였다. 인 비보 세포 증식 분석을 위해, 전달 전에, 비장세포를 세포 증식 염료인 카복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 (5 μM CFSE, Molecular probes, USA)에 로딩하였다.
인간 NK 세포 단리 및 세포 배양
혈액 샘플은 건강한 공여자로부터 서면 동의를 받은 후에 입수하였다. 말초 혈액 단핵 세포를 표준 밀도-구배 원심분리 프로토콜 (Lymphoprep; Fresenius Kabi)에 의해 단리하였다. NK 세포는 EasySep 음성 NK 세포 단리 키트 (Stemcell)를 사용하여 음성으로 선택하였다. 인간 NK 세포를, 10% 열-불활성화된 인간 AB 혈청, 50 U/ml의 페니실린 (Invitrogen) 및 50 μg/ml의 스트렙토마이신 (Invitrogen) (R10AB)이 보충된 RPMI-1640 배지 (Invitrogen)에서 유지하였다. CE NK 세포를 생성하기 위해, 단리된 NK 세포를 IL-12 (10 ng/ml, R&D systems), IL-15 (1 ng/ml, PeproTech) 및 IL-18 (50 ng/ml, R&D systems)을 함유하는 R10AB에서 밤새 프라이밍하였다. 다음날 세포를 PBS로 2회 세척하고, IL-15 (1 ng/ml)를 함유하는 R10AB에서 자극될 때까지 유지하였다. 2-3일마다 배지의 50%를 새로운 IL-15 (1 ng/ml)로 교체하였다. 7일 후에, 세포를 IL-12 (10 ng/ml), IL-15 (1 ng/ml) 및 IL-18 (50 ng/ml)을 함유하는 R10AB에서 또는 K562 백혈병 표적 (이펙터: 표적 비율, 5:1)으로 6시간 동안 자극하였다. 표시된 경우, 세포를 2-데옥시-D-글루코스 (10 mM, Sigma-Aldrich), 악티노마이신 D (1 및 10 μM, Sigma-Aldrich), 사이클로헥시미드 (10 및 100 μg/ml, Sigma-Aldrich), 2,2'-비피리딜 (1, 10, 50 및 100 μM, Sigma-Aldrich) 또는 6-아미노니코틴아미드 (50 μM, Sigma-Aldrich)와 30분 동안 사전 인큐베이션한 다음에, IL-12 (10 ng/ml), IL-15 (1 ng/ml) 및 IL-18 (50 ng/ml)를 함유하는 R10AB에서 6시간 동안 자극하였다.
NK 세포주, NK92 및 NKL은 IL-2 (50 U/ml)가 보충된 R10AB에서 유지하였다. Jurkat 및 K562 세포주는 10% 열-불활성화된 인간 우태아 혈청 (FBS), 50 U/ml의 페니실린 (Invitrogen) 및 50 μg/ml의 스트렙토마이신 (Invitrogen) (R10FBS)이 보충된 RPMI-1640 배지 (Invitrogen)에서 유지하였다. 293T 인간 배아 신장 (HEK-293T) 세포는 10% 열-불활성화된 인간 우태아 혈청 (FBS), 50 U/ml의 페니실린 (Invitrogen) 및 50 μg/ml의 스트렙토마이신 (Invitrogen)이 보충된 DMEM 배지 (Invitrogen)에서 유지하였다.
인간 세포의 유세포 분석
표면 염색을 위해, NK 세포를 포화 농도의 항체와 4℃에서 30분 동안 염색하였다. 하기 항체를 사용하였다: 항-인간 CD71 (클론 CY1G4, Biolegend), 항인간 CD69 (클론 FN50, Immunotools), 항-인간 CD98 (클론 MEM-108, Biolegend). 샘플은 BD AccuriC6 또는 CytoFLEX 유세포분석기 (Beckman Coulter)를 사용하여 수득하였다. 데이터는 Flowjo®_V10.5 (Tree Star, USA)로 분석하였다.
세포 증식 분석을 위해, NK 세포를 활성화 전에 세포-증식 염료 CFSE (1 μM, Molecular probes, USA)로 로딩하였고, 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 세포를 2회 세척하고, 억제제의 존재하에 지시되는 경우, IL-15 (1 ng/ml)가 함유된 R10AB에서 유지하였다. 고정 가능한 live-dead 세포 염색 (Fixable Viability Dye, eBioscience or Zombie Aqua, Biolegend)을 사용하여, 샘플 수집 전에 사멸 세포를 배제하였다. CFSE 희석은 자극 후 65시간에 유세포 분석법으로 분석하였다. 샘플은 BD AccuriC6 또는 CytoFLEX 유세포 분석기 (Beckman Coulter)를 사용하여 수득하였다. 데이터는 Flowjo®_V10.5 (Tree Star, USA)로 분석하였다.
뮤린 세포의 유세포 분석
비장 유래의 림프구는 장기를 맞물리고 (meshing), 100-μm 스트레이너 (strainer)를 통해 여과하여 단리하였다. 간 유래의 림프구를 단리하기 위해, 조직을 맞물리고, 100 μm 스트레이너를 통해 여과하고, 80% Percoll에 대해 40%의 불연속 구배를 사용하여 정제하였다. 비장 및 간에서의 적혈구는 적혈구 용해 버퍼를 사용하여 용해시켰다. 세포를 Fc 블록 (클론 2.4G2)으로 전처리하고, 고정 가능한 live-dead 세포 염색 (Fixable Viability Dye, eBioscience)을 사용하여 사멸 세포를 배제하였다. 세포를 포화 농도의 항체로 4℃에서 30분 동안 염색하였다. Thermo Fisher Scientific으로부터 구입한 하기 항체를 사용하였다: 항-마우스 CD8α (클론 53-6.7), 항-마우스 CD45.2 (클론 104), 항-마우스 CD4 (클론 RM4-5), 항-마우스 CD69 (클론 H1.2F3), 항-마우스 CD45.1 (클론 A20), 항-마우스 CD3ε (클론 145-2C11), 항-마우스 CD19 (클론 1D3), 항-마우스 NK1.1 (클론 PK136), 항-마우스 NKp46 (클론 29A1.4), 항-마우스 CD62L (클론 MEL-14), 항-마우스 Ly6c (클론 HK1.4), 항-마우스 KLRG1 (클론 2F1), 항-마우스 Ly49H (클론 3D10), 항-마우스 CD11b (클론 M1/70) 및 항-마우스 CD27 (클론 O323). 샘플은 BD FACSAria를 사용하여 수득하였다. 데이터는 Flowjo®_V10.5 (Tree Star, USA)로 분석하였다.
MCMV 감염 시에 세포내 사이토카인 염색을 위해, MCMV-감염된 마우스의 비장 및 간 유래의 림프구를 상기 지시된 바와 같이 단리하였다. 세포를 10% 우태아 혈청 (Thermo Fisher Scientific), 50 U/ml의 페니실린 (Invitrogen), 50 μg/ml의 스트렙토마이신 (Invitrogen) 및 50 μM 2-머캅토에탄올 (Thermo Fisher Scientific) (R10FBS)이 보충된 RPMI-1640 배지에서 IL-2 (500 IU/ml)의 존재하에 재현탁하였다. 세포를 브레펠딘 A (brefeldin A) (eBioscience)의 존재하에 37℃에서 5시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 표면-염색한 다음에, 제조자의 프로토콜 (BD Biosciences)에 따라 고정 및 투과하였다. 세포내 사이토카인은 마우스-항 IFN-γ (클론 XMG1.2, Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 염색하였다. 샘플은 BD FACSAria를 사용하여 수득하였다. 데이터는 Flowjo®_V10.5 (Tree Star, USA)로 분석하였다.
세포 증식 분석을 위해, 림프구를 활성화 전에 세포 증식 염료 CFSE (1 μM, Molecular probes, USA)로 로딩하고, U-바닥 96-웰 플레이트에 시딩하였다 (5x105 세포/웰). 세포를 IL-12 (10 ng/ml, PeproTech), IL-15 (10 ng/ml, PeproTech) 및 IL-18 (50 ng/ml, R&D Systems)을 함유하는 R10FBS에서 16시간 동안 자극하였다. 세포를 2회 세척하고, IL-15 (10 ng/ml)를 함유하는 R10FBS에서 유지하였다. CFSE 희석은 자극 후 65시간에 유세포 분석법으로 분석하였다. 고정 가능한 live-dead 세포 염색 (Fixable Viability Dye, eBioscience or Zombie Aqua, Biolegend)을 사용하여 사멸 세포를 배제하였다. 샘플은 BD FACSAria 또는 CytoFLEX 유세포 분석기 (Beckman Coulter)를 사용하여 수득하였다. 데이터는 Flowjo®_V10.5 (Tree Star, USA)로 분석하였다.
Seahorse 대사작용 플럭스 분석기
Seahorse XF-96e 세포외 플럭스 분석기 (Seahorse Bioscience, Agilent)를 사용하여 세포의 대사작용 프로파일을 결정하였다. NK 세포를 Celltak (Corning, USA) 코팅된 세포 플레이트 상에 플레이팅하였다 (3x105 세포/웰). 미토콘드리아 교란 실험 (Mitochondrial perturbation experiments)은 올리고마이신 (1 μM, Sigma), FCCP (2 μM, 카보닐 시아나이드 4-(트리플루오로메톡시) 페닐하이드라존, Sigma), 및 로테논 (1 μM, Sigma)을 순차적으로 부가하여 수행하였다. 산소 소모율 (Oxygen consumption rates: OCR, pmol/min) 및 세포외 산성화율 (extracellular acidification rates: ECAR, mpH/min)은 각 화합물의 주입 후에 실시간으로 모니터링하였다.
2-NBDG 흡수
NK 세포를 U-바닥 96-웰 플레이트에 시딩하였다 (2x105 세포/웰). 지시된 경우, 세포를 억제제와 함께 30분 동안 사전-인큐베이션하고, IL-12 (10 ng/ml), IL-15 (1 ng/ml) 및 IL-18 (50 ng/ml)을 함유하는 R10AB에서 6시간 동안 자극하였다. 그 다음에 세포를 20 μM 2-NBDG (Invitrogen)를 함유하는 배지에서 15분 동안 인큐베이션하고, 유세포 분석법으로 분석하였다. 샘플은 BD AccuriC6 유세포 분석기를 사용하여 수득하였다. 데이터는 Flowjo®_V10.5 (Tree Star, USA)로 분석하였다.
인간 NK 세포에서 IFN-γ 측정
NK 세포는 R10AB를 사용하여 U-바닥 96 웰 플레이트에 시딩하였다 (2x105 세포/웰). 지시된 경우, 세포를 억제제와 함께 30분 동안 사전-인큐베이션하고, IL-12 (10 ng/ml), IL-15 (1 ng/ml) 및 IL-18 (50 ng/ml)을 함유하는 R10AB에서 6시간 동안 자극하였다. 세포 상등액을 자극 후에 수확하고, IFN-γ는 제조자의 프로토콜에 따라 인간 Th1 사이토카인 비드-기반 면역분석 (Legendplex, Biolegend)을 사용하여 측정하였다.
트란스페린 흡수 분석
NK 세포를 U-바닥 96-웰 플레이트에 시딩하였다 (2x105 세포/웰). 지시된 경우, 세포를 억제제와 함께 30분 동안 사전-인큐베이션하고, IL-12 (10 ng/ml), IL-15 (1 ng/ml) 및 IL-18 (50 ng/ml)을 함유하는 R10AB에서 4시간 동안 자극하였다. 그 다음에 세포를 5% BSA 및 IL-12 (10 ng/ml), IL-15 (1 ng/ml) 및 IL-18 (50 ng/ml)을 함유하는 RPMI-1640 배지에서 2시간 동안 자극하였다. 자극 후에 세포를 트란스페린-알렉사488 접합체 (Tf-488, 10 μg/ml, Thermo Fisher Scientific)와 함께 15분 동안 인큐베이션하기 전에, 0.5% BSA를 함유하는 RPMI-1640으로 세척하였다. 트란스페린 흡수는 빙냉한 산성 버퍼 (150 mM NaCl, 20 mM 시트르산 및 pH 5)에서 세포를 세척하여 중단시켰다. 세포를 FACS 버퍼 중에 재현탁시키고, 유세포 분석법으로 분석하였다. 샘플은 BD AccuriC6 유세포 분석기를 사용하여 수득하였다. 데이터는 Flowjo®_V10.5 (Tree Star, USA)로 분석하였다.
HPG 혼입 분석
NK 세포는 96-웰 플레이트에 시딩하였다 (2x105 세포/웰). 세포를 IL-12 (10 ng/ml), IL-15 (1 ng/ml) 및 IL-18 (50 ng/ml)을 함유하는 R10AB에서 4.5시간 동안 자극한 후에, 10% 투석된 FBS 및 IL-12 (10 ng/ml), IL-15 (1 ng/ml) 및 IL-18 (50 ng/ml)을 함유하는 메티오닌-무함유 RPMI-1640 배지에서 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. Click-IT®HPG (50 μM, Life Technologies)를 인큐베이션 중 마지막 30분 동안 부가하였다. HPG 혼입된 NK 세포를 Click-iT® 반응 칵테일 (Thermo Fisher Scientific)로 염색하고, 유세포 분석법으로 검출하였다. 샘플은 BD AccuriC6 플로우를 사용하여 수득하였다. 데이터는 Flowjo®_V10.5 (Tree Star, USA)로 분석하였다.
면역블롯 분석
단백질 농도는 BCA 단백질 분석 키트 (Thermo Fisher Scientific)로 결정하였다. 전체 세포 용해물은 4%-15% Mini Protean TGX Gel (Bio-Rad, Hercules CA, USA)을 사용하여 분리하고, Trans-Blot Turbo Transfer (Bio-Rad, Hercules CA, USA)를 사용하여 니트로셀룰로스 막으로 전달하였다. 멤브레인은 하기 항체로 프로브하였다: 항-인간 CD71 mAb (13113), 항-인간 IRP1 mAb (20272), 항-인간 IRP2 mAb (37135), 항-인간 FTH1 mAb (4393), 항-인간 eIF4E mAb (2067), 항-인간 c-Myc mAb (5605) 및 항-인간 β-액틴 mAb (3700) (모두 Cell Signaling제, USA). 블롯은 적절한 2차 항체로 염색하였고, 육안 분석 (visualization)을 위해 odyssey imaging system (LICOR, Lincoln NE, USA)을 사용하고, 정량 분석 (quantification)을 위해 ImageJ 소프트웨어 (1.48v)를 사용하였다.
RNA 서열분석
RNA-seq는 Admera Health (USA)에서 수행하였다. 간략하게는, 샘플은 에탄올 침전을 사용하여 단리되었다. 품질 검사 (Quality check)는 Tapestation RNA HS 분석 (Agilent Technologies, USA)을 사용하여 수행하고, Qubit RNA HS 분석 (Thermo Fisher Scientific)으로 정량분석하였다. 리보솜 RNA 고갈은 Ribo-zero Magnetic Gold 키트 (MRZG12324, Illumina Inc., USA)를 사용하여 수행하였다. 샘플은 제조자의 권장 사항 (NEBNext® UltraTM RNA Library Prep Kit for Illumina®)에 기반하여 무작위로 프라이밍하고, 단편화하였다. 제1 가닥은 Protoscript II 역전사효소를 사용하여 더 긴 연장 기간 (42℃에서 40분)으로 합성하였다. 라이브러리 제작을 위한 나머지 모든 단계는 Illumina®의 NEBNext® UltraTM RNA Library Prep 키트에 따라 사용하였다. Illumina 8-nt 이중-인덱스를 사용하였다. 샘플들을 풀링 (pooling)하고, 150개의 paired-end의 리드 길이 구성 (read length configuration)으로 HiSeq에서 서열 분석하였다.
리드 (reads)는 다중-매핑 설정 (multi-mapping settings) '--outFilterMultimapNmax 10 --outSAMmultNmax 1'을 사용하여 STAR (버전 2.5.24)로 인간 게놈 (UCSC version hg38AnalysisSet)에 대해 정렬하였다. 출력값을 samtools (버전 1.7)을 사용하여 정렬 및 인덱싱하였고, Picard markDuplicates (버전 2.9.2)는 다른 시퀀싱 레인에서 실행되는 샘플을 무력화하는데 사용하였다. QuasR (버전 1.20.05)의 qCount 기능을 사용하여 엑손 유니온 모델 (exon union model) (2017-09-01에 UCSC로부터 다운로드한 RefSeq 유전자)을 가정하는 각 유전자의 엑손과 중첩되는 리드 (5'말단)의 수를 계수하였다. 모든 후속 유전자 발현 데이터 분석은 R 소프트웨어 (R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria) 내에서 수행하였다. 차등적으로 발현된 유전자는 edgeR 패키지 (버전 3.22.5)를 사용하여 확인하였다.
정량적 실시간 PCR
RNA를 제조자의 프로토콜에 따라 Trizol (Thermo Fisher Scientific) 및 클로로포름 (Sigma-Aldrich)을 사용하여 NK 세포로부터 단리한 다음에, RNeasy RNA 정제 미니 키트 (QIAGEN, Germany)로 정제하였다. RNA 농도는 NanoDrop 2000C (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 결정하였다. 정제된 RNA로부터, 역전사효소 키트 GoScriptTM Reverse Transcriptase (Promega)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. IFNG, TFRC 및 18S mRNA에 대한 정량적 PCR은 Life Technologies의 상업적으로 디자인된 프라이머 (Hs00989291_m1, Hs00951083_m1, Hs03003631_g1)를 사용하여 3중으로 수행하였다. PCR 반응은 제조자의 프로토콜에 따라 Go Tag G2 DNA Polymerase (Promega)를 사용하여 수행하였다.
RNA-매개 간섭
NK92, NKL 또는 Jurkat 세포 (2x106)는 AMAXA 세포주 V 뉴클레오펙션 키트 (Lonza)를 사용하여 ACO1, IREB2 또는 대조군-스크램블된 siRNA (각 10 pmoles) (QIAGEN)를 표적으로 하는 siRNA 풀 (pool)로 형질감염하였다. 그 후에, 세포를 72시간 동안 휴지시키고, 표현형 (phenotypically) 및 기능형 (functionally)으로 분석하였다. 녹다운 효율 (knockdown efficiency)은 각 단백질의 면역블롯 분석으로 평가하였다.
CRISPR 편집
IL-2 (50 U/ml; NK92 세포) 또는 R10FBS (Jurkat 세포)를 함유하는 R10AB 1 ml이 포함된 24-웰 세포 배양 플레이트를 준비하고, 37℃로 예열하였다. CRISPR-Cas9 매개 IREB2 유전자 녹아웃의 경우, IDT 유래의 sgRNA를 사용하였다: Hs.Cas9.IREB2.1 AA (Ref no. 220257866) 또는 Alt-R CRISPR-Cas9 음성 대조군 (Ref no. 224163224). 가이드 RNA 복합체는, 올리고 (oligos)를 95℃에서 5분 동안 가열하고 천천히 실온으로 냉각시킴으로써, 20 μM 농도의 IDT Duplex 버퍼 (30 mM HEPES, pH 4.5, 100 mM 포타슘 아세테이트)에서 crRNA 및 tracrRNA를 동일 몰량으로 조합하여 형성하였다. 동일한 부피의 CAS9 뉴클레아제 (QB3 MacroLab, University of California, Berkeley)를 부가하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. NK92 또는 Jurkat 세포 (2 x 106)를 PBS에서 세척하고, 전기천공 용액 (AMAXA cell line V nucleofection kit, Lonza) 중에 재현탁하였다. RNP 용액 (3 μM 최종 RNP 농도)을 부가하고, 권장 프로그램을 사용하여 전기천공하였다. 세포를 예열된 배지로 전달하고, 지시된 시점 동안 세포를 휴지시켰다. NK92 세포를 5일 동안 휴지시킨 후에, 표현형 및 기능형으로 분석하였다. IRP2의 녹다운 효율은 면역블롯으로 평가하였다. Jurkat 세포를 2일 동안 휴지시킨 후에, 96-웰 플레이트로 단일 세포 분류 (single cell sorting)를 수행하였다. 클론을 확장시키고, IRP2의 녹아웃 효율 (knockout efficiency)을 면역블롯 분석으로 평가하고, 양성 클론을 확장시켜서 IRP2의 표현형 및 기능형 분석 및 렌티바이러스 형질도입을 수행하였다.
IRP2 CAR 작제
인간 IRP2는 유전자 스트링 (GeneArt, Thermo Fischer Scientific)으로 합성하였다. 그 다음에, IRP2 (NM_004136.4)를, T2A 및 제2 세대 항-PSMA CAR를 가진 프레임 내에 제3 세대 자가-불활성화 렌티바이러스 발현 벡터인 pELNS로 클로닝하였고, 신장 인자-1α (EF-1α) 프로모터에 의해 발현을 유도하였다. 모노클로날 항체 J591로부터 유래된 항-PSMA CAR에 대한 scfv를 종양-표적 모이어티로 사용하였고, 반면에 세포내 도메인은 CD28 공동자극 도메인 및 CD3제타 사슬로 구성된다. 대조군 벡터에서 IRP2는 리포터 유전자 eGFP로 대체되었다.
재조합 렌티바이러스 생성
형질감염 24시간 전에, HEK-293 세포를 시딩하였다 (5x106 세포/5 ml 배지). 모든 플라스미드 DNA는 내독소-무함유 Plasmid Maxiprep 키트 (Sigma)를 사용하여 정제하였다. HEK-293T 세포를 리포펙타민 2000 (Invitrogen) 및 최적 배지 (Invitrogen, Life Technologies)를 사용하여, 1.3 pmole의 psPAX2 (렌티바이러스 패키징 플라스미드) 및 0.72 pmole의 pMD2G (VSV-G 외피 발현 플라스미드) 및 1.64 pmole의 pLV-EF1A>mCherry(ns):P2A:EGF 또는 PLV-EIF1A>hIREB2:P2A:EGFP (Vector Builder)로 형질감염시켰다. 바이러스 상등액을 형질도입 48시간 및 72시간 후에 수집하였다. 바이러스 입자는 VIVASPIN 20 (Sartorius)을 사용하여 농축하였고, 바이러스 상등액은 -80℃에서 저장하였다.
CAR 구조체의 렌티바이러스 입자는 Giordano-Attianese et al., Nat Biotechnol, 2020, 38, 426-432)에 기재된 바와 같이 생성하였다.
Jurkat 세포의 렌티바이러스 형질도입
Jurkat 세포는 R10FBS를 사용하여 U-바닥 96 웰 플레이트에 시딩하였다 (5x105 세포/웰). 바이러스 상등액을 해동하고, Jurkat 세포를 1:16 내지 1:1,160,000 범위의 다양한 바이러스 희석액으로 형질도입하였다. 플레이트를 400 xg로 3분 동안 원심분리하고, 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후에 배지를 교체하고, 세포를 2일 더 휴지시켰다. 형질도입 효율 (transduction efficiency)은 유세포 분석법으로 GFP 발현을 분석함으로써 평가하였다. GFP+ 세포를 플로우-분류 (flow-sorted) (빈도 10-30% 양성 세포)하고, 표현형 분석을 위해 확장하였다. IRP2의 렌티바이러스 과발현은 면역블롯 분석으로 평가하였다.
1차 T 세포의 렌티바이러스 형질도입
혈액 샘플은 건강한 공여자로부터 서면 동의 후에 입수하였다. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)는 표준 밀도-구배 원심분리 프로토콜 (Lymphoprep; Fresenius Kabi)에 의해 단리하였다. CD4+ 및 CD8+ T 세포는 자기 (magnetic) CD4+ 및 CD8+ 비드 (Miltenyi Biotec)를 사용하여 양성으로 선택하였다. 정제된 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 R10AB에서 배양하였다. CD4+ 및 CD8+ T 세포를 24-웰 세포 배양 플레이트에 플레이팅하고, IL-2 (150 U/ml)를 함유하는 R10AB 중 1:1 비율의 항-CD3 및 항-CD28 모노클로날 항체-코팅된 비드 (Invitrogen, Life Technologies)로 자극하였다. T 세포는 레트로넥틴 (Retronectin) (Takara Bio)으로 코팅된 세포 배양 플레이트에서 활성화시키고 18-22시간 후에 렌티바이러스 입자로 형질도입되었다. 24시간마다 배지를 새로운 IL-2 (150 U/ml)로 교체하였다. 형질도입 5일 후에, 세포를 CD71 발현에 대해 유세포 분석법으로 분석하였다. 샘플은 CytoFLEX 유세포 분석기 (Beckman Coulter)를 사용하여 수득하였다. 데이터는 Flowjo®_V10.5 (Tree Star, USA)로 분석하였다. 1차 T 세포의 CAR 구조체를 사용한 렌티바이러스 형질도입은 기재된 바와 같이 수행하였다7.
형질도입된 1차 CAR T 세포의 활성화 및 증식
CAR 또는 CAR_IREB2를 발현하는 형질도입된 T 세포를 동등한 CAR 발현을 위해 조정하였다. CAR를 자극하기 위해, 폴리클로날 항-Fab 항체 (Jackson Immuno Research)를 사용하였다. 간략하게는, 96-웰 플레이트를 37℃에서 PBS 중 항-Fab 20 μg/ml로 4시간 동안 코팅하였다. 1차 T 세포를 활성화 전에 세포-증식 염료 Cell Trace violet (CTV; 1 μM, Thermo Fisher Scientific)에 로딩하였다. 플레이트를 2회 세척하고, 염색된 T 세포를 시딩하고 (1x105/웰), 5일 동안 자극하였다. CTV 희석 및 CD71 발현은 유세포 분석법으로 분석하였다. 샘플은 BD FACS LSR II 유세포 분석기 (BD Bioscience)를 사용하여 수득하였다. 데이터는 Flowjo®_V10.5 (Tree Star, USA)로 분석하였다.
통계 분석
데이터는 평균 ± SEM으로 제시된다. 통계적 유의성은 GraphPad Prism 8.00 (GraphPad Software)를 사용하는 paired two-tailed Student's t 테스트 또는 unpaired two-tailed Student's t 테스트를 사용하여 결정하였다. 샘플 쌍 (paired samples)에서의 증가 비교 (이전 대 이후)를 위해, 간단한 선형-회귀 모델을 사용하였다. 0.05 미만의 P 값은 통계적으로 유의미한 것으로 간주하였다.
실시예 9: IRP/IRE 조절 시스템은 NK 세포에서 CD71 발현을 조정한다.
지금까지, 본 발명의 실험으로 (i) NK 세포 증식을 제어하는 중요한 대사작용 체크포인트로서 CD71을 통한 철 흡수; 및 (ii) NV NK 세포와 비교하여 활성화된 CE NK 세포에 대한 CD71의 우선적인 상향조절을 확립하였다. 다음에, 본 발명자들은 CD71 자체가 NV NK 세포 및 CE NK 세포에서 조절되는 방식에 대한 의문을 갖게 되었다. 이러한 의문을 해결하기 위해, 본 발명자들은 먼저 CD71의 유도가 NK 세포 전사 활성에 의존하는지 여부를 평가하였다. 이전 실험에서와 같이, CD71은 NV NK 세포보다 사이토카인-자극된 CE NK 세포에서 더 큰 정도로 유도되었다 (도 5A, 상단 패널). 두 서브세트 모두에서, 전사의 억제 - 악티노마이신 사용 -는 사이클로헥시미드를 사용한 번역 차단과 마찬가지로, CD71의 자극-유도 상향조절을 방지하였다 (도 5A, 하단 패널). 따라서, 전사 및 번역은 두 세포 세브세트 모두에서 유사하게 요구되었다. 다음에, 본 발명자들은 TFRC의 전사가 NV NK 세포 및 CE NK 세포 간에 차등적으로 조절될 수 있을지에 대한 가능성을 조사하였다. 이를 수행하기 위해, 본 발명자들은 TFRC의 전사체 풍도를 분석하였다. 실제로, TFRC mRNA 수준은 NV NK 세포보다 활성화된 CE NK 세포에서 더 높았지만, 두 서브세트 모두에서 자극 시에 추가로 유도되었다 (도 7A). c-Myc는 다양한 면역 세포들에서 TFRC를 조절하는 핵심 전사 인자이다. NV NK 세포보다 활성화된 CE NK 세포에서 TFRC mRNA의 풍도 증가를 고려하여, CE NK 세포에서 우선적인 c-Myc 유도는 활성화된 CE NK 세포 및 NV NK 세포간 CD71의 차등 조절을 설명할 수 있었다. 그러나, c-Myc는 두 NK 세포 서브세트 모두에서 동일하게 유도되었다 (도 5F). 이들 데이터로부터 활성화된 NV NK 세포 및 CE NK 세포에서 CD71의 발현을 지원하기 위한 연속적인 전사 및 번역에 대한 대칭적 필요성을 확립하였다.
세포 철 항상성에 관여된 많은 유전자는 이들의 mRNA의 5' 또는 3' UTR에 철 반응성 요소 (IRE)를 함유한다. 철 조절 단백질 1 및 2 (IRP1 및 IRP2)는 IRE에 결합하고, 이에 의해 mRNA 안정성 및 번역을 제어한다. TFRC mRNA는 3'UTR에 5개의 IRE를 함유하고, 여기서 IRP의 결합은 mRNA를 안정화시키고, 번역을 촉진한다. 교과서에 따르면, 이는 철분-결핍 조건에서 발생한다. 본 발명자들은 세포 철 풍도와 무관하게, CE NK 세포에서 선택적으로 IRP 발현 증가가 이들 세포에서 더 높은 TFRC 전사체 풍도 및 강화된 활성화-의존성 CD71 발현을 설명할 수 있다고 추론하였다. 이러한 아이디어를 뒷받침하는, IRP1 및 IRP2 모두의 단백질 풍도는 정지 및 활성화된 CE NK 세포에서 더 높았다 (도 6A 중간 및 하단 패널). 이들 데이터는 세포 서브세트-특이적 방식으로, 즉 CE NK 세포에서 가성 철 결핍 상태를 발생시키고, 이에 의해 개별 단백질 세트의 풍도를 전사후 수준으로 선택적으로 제어할 수 있는, IRP와 양립할 수 있었다. 이러한 개념을 더 조사하기 위해, 본 발명자들은 5'UTR에 IRE를 함유하는 FTH1 (페리틴 중쇄 코딩)의 전사체 및 단백질 풍도를 분석하였고, 여기서 IRP의 결합은 번역을 억제한다. FTH1 mRNA는 활성화된 CE NK 세포에서 증가하였고 (도 7B), 그러나 이러한 더 높은 전사 수준에도 불구하고, 페리틴 중쇄의 단백질 풍도는 비-자극된 및 활성화된 CE NK 세포 모두에서 어떠한 경우에도 더 낮았다 (도 6E). 이러한 발견은 IRP가 이들의 CE NK 세포 대 NV NK 세포 특이적 풍도와 함께, 이들 세포에서 IRE 함유 mRNA의 번역을 조절하는데 관여한다는 것을 시사한다.
NK 세포의 CD71 및 이에 따른 증식을 조절하는 IRP의 역할을 유전적으로 조사하기 위해, 본 발명자들은 계속해서 NK 세포주인 NK92를 이용하였다. 이들 세포에서, IRP1 및 IRP2 수준은 siRNA 접근법을 사용하여 각각 선택적으로 감소되었다 (도 7C-D). 특히, CD71 단백질 발현의 일관된 변화가 IRP1의 침묵 시에는 관찰되지 않는 반면에, CD71 풍도는 IRP2-침묵된 세포에서 유의미하게 저하되었다 (도 7E). 따라서, 페리틴 중쇄 발현의 증가는 또한 IRP2를 침묵시키는 경우 발견되었지만, IRP1을 침묵시킨 경우에는 그렇지 않았다 (도 7F). 이러한 발견의 견고성을 확인하기 위해, 본 발명자들은 제2 NK 세포주 (NKL 세포)를 사용하여 이들 실험을 반복하였다. NK92 세포와 유사하게, IRP2의 침묵은 이러한 세포주에서 CD71을 유의미하게 낮추고, 페리틴 중쇄 발현을 증가시켰다 (도 7G-K). 마지막으로, CRISPR/Cas9 기술을 사용하여 IRP2를 녹아웃시킴으로써 (도 7L), NK92 세포들 사이에서 CD71 발현을 감소시켰으며, 이는 증식율 감소로 직접 번역되었다 (도 7M). 따라서 이들 데이터는 유전자 조작을 통해 CE NK 세포 대 NV NK 세포에서 이루어진 발견을 재현하였고, IRE/IRP 조절 축 - 구체적으로 IRE/IRP2 -를 확립하였으며, CD71의 발현을 제어함으로써 NK 세포/NK 세포주에서의 증식을 조절하는 중요한 시스템이다.
실시예 10: 강제 IRP 발현은 또한 T 세포 증식을 지원하는 분자 모듈이다.
조작된 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포를 사용하는 입양 세포 요법은 다양한 악성 종양의 제어, 구체적으로 혈액 악성 종양의 치료를 위한 유망한 접근법이다. 그러나, 모든 환자가 CAR T 세포 요법에 반응하는 것은 아니며, 일부는 재발하였고, 고형암 치료는 여전히 특별한 도전 과제이다. NK 세포의 연구 결과를 바탕으로, 본 발명자들은 가성 철 결핍을 유전적으로 강제하여 (CAR) T 세포의 활성화-유도 (즉, 상황 의존적 (context dependent)) 증식을 개선할 수 있고, 따라서 치료 가능성도 개선할 수 있다고 추론하였다. T 세포에서 CD71의 발현 및 상호 연관된 증식을 조절하는데 IRP의 역할을 조사하기 위해, 본 발명자들은 먼저 siRNA 기술을 사용하여 Jurkat T 세포에서 IRP1 및 IRP2의 풍도를 억제하였다 (도 8A-B). NK 세포주와 유사하게, IRP2의 감소는 CD71의 발현을 감소시키고 페리틴 중쇄의 단백질 풍도를 증가시키는 지배적인 요인이었다 (도 8C-D). 역으로, IRP2 녹아웃 (ko) Jurkat 세포에서 IRP2 (LV-IREB2)의 렌티바이러스 과발현은 mCherry (LV-mCherry)를 코딩하는 제어 벡터로 형질도입된 세포와 비교하여 CD71 발현을 증가시켰다 (도 8 E-F, 상단 및 하단 좌측 패널). CD71의 LV-IREB2 의존성 세포 표면 발현 증가는 보다 신속한 Jurkat T 세포 증식과 연관되었다 (도 8F, 하단 우측 패널). 중요하게는, CD71의 발현은 인간 1차 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서도 LV-IREB2의 렌티바이러스 형질도입에 의해 조절되었다 (도 8G-H).
이러한 관찰에 힘입어, 본 발명자들은 IREB2의 발현을 통해 강제된 가성 철 결핍이 CAR를 발현하는 1차 인간 T 세포에서 CD71의 조절 및 상호 연관된 증식에 영향을 주는 방식을 테스트하였다. 이러한 개념 입증 실험을 위해, 인간 전립선-특이적 막 항원 (hPSMA)을 표적으로 하는 CAR T 세포 모델을 사용하였다. CD4+ T 세포는 CAR를 코딩하는 벡터 (CAR), 또는 CAR 및 IRP2 둘 모두를 코딩하는 벡터 (CAR_IREB2)를 사용하여 렌티바이러스로 형질도입하였다. CAR_IREB2 T 세포에서 IRP2의 과발현은 웨스턴 블롯 분석으로 확인하였다 (도 8I). 비-활성화 조건하에 평가하는 경우, IRP2의 과발현은 CD71의 세포-표면 발현에 영향을 주지 않았다 (도 8J, 상단 패널). 그러나, CD71의 발현은 CAR를 α-Fab 항체와 가교할 때 CAR T 세포와 비교하여 CAR_IREB2에서 일관되게 더 높았다 (도 8J, 하단 패널). CAR_IREB2 T 세포는 자발적으로 증식되지 않았지만 (도 8K, 상단 패널), IRP2-유도를 증가시켰고, 그러므로 CD71의 엄격한 활성화-의존적 발현은 우수한 증식을 유도하기에 충분하였다 (도 8K, 하단 패널). 종합하면, 이들 데이터로부터 IRP2는 T 세포, 구체적으로 CAR T 세포에서 CD71의 발현 및 상호연관된 세포 증식을 조절한다는 것을 입증하였다. 중요하게는, CAR T 세포에서 IRP2의 과발현을 통해 가성 철 결핍을 유도하여 엄격하게 활성화, 즉 상황 의존적 방식 (context dependent manner)으로 증식을 향상시켰다.
SEQUENCE LISTING <110> Universit채t Basel <120> CELL THERAPY METHODS <130> AC2078 PCT BS <150> EP 19 19 2299.6 <151> 2019-08-19 <160> 7 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 889 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> IRP1 <400> 1 Met Ser Asn Pro Phe Ala His Leu Ala Glu Pro Leu Asp Pro Val Gln 1 5 10 15 Pro Gly Lys Lys Phe Phe Asn Leu Asn Lys Leu Glu Asp Ser Arg Tyr 20 25 30 Gly Arg Leu Pro Phe Ser Ile Arg Val Leu Leu Glu Ala Ala Ile Arg 35 40 45 Asn Cys Asp Glu Phe Leu Val Lys Lys Gln Asp Ile Glu Asn Ile Leu 50 55 60 His Trp Asn Val Thr Gln His Lys Asn Ile Glu Val Pro Phe Lys Pro 65 70 75 80 Ala Arg Val Ile Leu Gln Asp Phe Thr Gly Val Pro Ala Val Val Asp 85 90 95 Phe Ala Ala Met Arg Asp Ala Val Lys Lys Leu Gly Gly Asp Pro Glu 100 105 110 Lys Ile Asn Pro Val Cys Pro Ala Asp Leu Val Ile Asp His Ser Ile 115 120 125 Gln Val Asp Phe Asn Arg Arg Ala Asp Ser Leu Gln Lys Asn Gln Asp 130 135 140 Leu Glu Phe Glu Arg Asn Arg Glu Arg Phe Glu Phe Leu Lys Trp Gly 145 150 155 160 Ser Gln Ala Phe His Asn 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Met 85 90 95 Val Asp Phe Ala Ala Met Arg Glu Ala Val Lys Thr Leu Gly Gly Asp 100 105 110 Pro Glu Lys Val His Pro Ala Cys Pro Thr Asp Leu Thr Val Asp His 115 120 125 Ser Leu Gln Ile Asp Phe Ser Lys Cys Ala Ile Gln Asn Ala Pro Asn 130 135 140 Pro Gly Gly Gly Asp Leu Gln Lys Ala Gly Lys Leu Ser Pro Leu Lys 145 150 155 160 Val Gln Pro Lys Lys Leu Pro Cys Arg Gly Gln Thr Thr Cys Arg Gly 165 170 175 Ser Cys Asp Ser Gly Glu Leu Gly Arg Asn Ser Gly Thr Phe Ser Ser 180 185 190 Gln Ile Glu Asn Thr Pro Ile Leu Cys Pro Phe His Leu Gln Pro Val 195 200 205 Pro Glu Pro Glu Thr Val Leu Lys Asn Gln Glu Val Glu Phe Gly Arg 210 215 220 Asn Arg Glu Arg Leu Gln Phe Phe Lys Trp Ser Ser Arg Val Phe Lys 225 230 235 240 Asn Val Ala Val Ile Pro Pro Gly Thr Gly Met Ala His Gln Ile Asn 245 250 255 Leu Glu Tyr Leu Ser Arg Val Val Phe Glu Glu Lys Asp Leu Leu Phe 260 265 270 Pro Asp Ser Val Val Gly Thr Asp Ser His Ile Thr Met Val Asn Gly 275 280 285 Leu Gly Ile Leu Gly Trp Gly Val Gly Gly Ile Glu Thr Glu Ala Val 290 295 300 Met Leu Gly Leu Pro Val Ser Leu Thr Leu Pro Glu Val Val Gly Cys 305 310 315 320 Glu Leu Thr Gly Ser Ser Asn Pro Phe Val Thr Ser Ile Asp Val Val 325 330 335 Leu Gly Ile Thr Lys Val Ser 340 <210> 7 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T2A peptide <400> 7 Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro 1 5 10 15 Gly Pro

Claims (48)

  1. 적어도 하나의 철 조절 단백질 (iron regulatory protein: IRP)을 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 림프구 (lymphocyte)로서, 상기 적어도 하나의 철 조절 단백질은 IRP1 (서열번호: 1) 및/또는 IRP2 (서열번호: 2-6)인, 림프구.
  2. 청구항 1에 있어서, 합성 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 2에 제시된 IRP2를 코딩하는, 림프구.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 림프구는 T 세포 또는 자연 살해 (natural killer: NK) 세포인, 림프구.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 림프구는 종양 침윤 림프구, 변형된 T 세포 또는 바이러스 특이적 T 세포인, 림프구.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 철 조절 단백질은 항시적으로 (constitutively) 발현되는, 림프구.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 철 조절 단백질을 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드는 항시성(constitutive) 프로모터의 제어하에 있는, 림프구.
  7. 청구항 6에 있어서, 항시성 프로모터는 EF-1α 프로모터인, 림프구.
  8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 림프구는 키메라 항원 수용체 (chimeric antigen receptor: CAR)를 추가로 포함하는, 림프구.
  9. 청구항 8에 있어서, CAR는 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인, 공동-자극 신호전달 영역 및 신호전달 도메인을 포함하는, 림프구.
  10. 청구항 9에 있어서, 항원 결합 도메인은 항체 또는 이의 항원-결합 단편인, 림프구.
  11. 청구항 10에 있어서, 항원-결합 단편은 Fab 또는 scFv인, 림프구.
  12. 청구항 9 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 도메인은 종양 항원 또는 바이러스 항원에 특이적으로 결합하는, 림프구.
  13. 청구항 12에 있어서, 종양 항원은 표적 세포 집단 또는 조직의 세포 표면에 제시되는, 림프구.
  14. 청구항 8 내지 13 중 어느 한 항에 있어서, CAR는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고, 상기 CAR를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 IRP1 및/또는 IRP2를 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드에 전사로 연결되는 (transcriptionally linked) 것인 림프구.
  15. 청구항 14에 있어서, CAR를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 IRP1 및/또는 IRP2를 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드는 자가-절단 펩티드 (self-cleaving peptide)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 의해 연결되는, 림프구.
  16. 청구항 15에 있어서, 자가-절단 펩티드는 2A 자가-절단 펩티드인, 림프구.
  17. 청구항 15 또는 16에 있어서, 자가-절단 펩티드는 T2A인, 림프구.
  18. IRP1 (서열번호: 1) 및/또는 IRP2 (서열번호: 2-6)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 적어도 하나 포함하는 바이러스 벡터 (viral vector).
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 서열번호: 2에 제시된 IRP2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 바이러스 벡터.
  20. 청구항 18 또는 19에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 렌티바이러스 (lentivirus), 아데노-관련 바이러스 (adeno-associated virus: AAV), 아데노바이러스 (adenovirus), 단순 헤르페스 바이러스 (herpes simplex virus), 레트로바이러스 (retrovirus), 알파바이러스 (alphavirus), 플라비바이러스 (flavivirus), 랍도바이러스 (rhabdovirus), 홍역 바이러스 (measles virus), 뉴캐슬병 바이러스 (Newcastle disease virus) 또는 폭스바이러스 (poxvirus)로부터 유래되는, 바이러스 벡터.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 렌티바이러스로부터 유래되는, 바이러스 벡터.
  22. 청구항 18 내지 22 중 어느 한 항에 있어서, IRP1 및/또는 IRP2를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드는 항시성 프로모터의 제어하에 있는, 바이러스 벡터.
  23. 청구항 22에 있어서, 항시성 프로모터는 EF-1α 프로모터인, 바이러스 벡터.
  24. 청구항 18 내지 23 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 CAR를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 바이러스 벡터.
  25. 청구항 24에 있어서, CAR를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 IRP1 및/또는 IRP2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 전사로 연결되는, 바이러스 벡터.
  26. 청구항 25에 있어서, CAR를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 IRP1 및/또는 IRP2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 자가-절단 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 의해 연결되는, 바이러스 벡터.
  27. 청구항 26에 있어서, 자가-절단 펩티드는 2A 자가-절단 펩티드인, 바이러스 벡터.
  28. 청구항 26 또는 27에 있어서, 자가-절단 펩티드는 T2A인, 바이러스 벡터.
  29. 청구항 1 내지 17 중 어느 한 항에 따른 림프구 또는 청구항 18 내지 28 중 어느 한 항에 따른 바이러스 벡터, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 약학 조성물.
  30. 치료 (therapy)에 사용하기 위한, 청구항 1 내지 17 중 어느 한 항에 따른 림프구, 청구항 18 내지 28 중 어느 한 항에 따른 바이러스 벡터, 또는 청구항 29에 따른 약학 조성물.
  31. 암 치료에 사용하기 위한, 청구항 1 내지 17 중 어느 한 항에 따른 림프구, 청구항 18 내지 28 중 어느 한 항에 따른 바이러스 벡터, 또는 청구항 29에 따른 약학 조성물.
  32. 청구항 31에 있어서, 암은 혈액암 (hematologic cancer) 또는 고형 종양 (solid tumor)인, 림프구, 바이러스 벡터 또는 약학 조성물.
  33. 청구항 32에 있어서, 혈액암은 급성 림프모구 백혈병 (acute lymphoblastic leukemia), 미만성 거대 B-세포 림프종 (diffuse large B-cell lymphoma), 호지킨 림프종 (Hodgkin's lymphoma), 급성 골수성 백혈병 (acute myeloid leukemia) 또는 다발성 골수종 (multiple myeloma)이고, 고형 종양은 결장암 (colon cancer), 유방암 (breast cancer), 췌장암 (pancreatic cancer), 난소암 (ovarian cancer), 간세포 암종 (hepatocellular carcinoma), 폐암 (lung cancer), 신경모세포종 (neuroblastoma), 교모세포종 (glioblastoma) 또는 육종 (sarcoma)인, 림프구, 바이러스 벡터 또는 약학 조성물.
  34. 바이러스 감염을 예방 및/또는 치료하는데 사용하기 위한, 청구항 1 내지 17 중 어느 한 항에 따른 림프구, 청구항 18 내지 28 중 어느 한 항에 따른 바이러스 벡터, 또는 청구항 29에 따른 약학 조성물.
  35. 청구항 34에 있어서, 바이러스 감염은 인간 면역결핍 바이러스 (human immunodeficiency virus: HIV), 아데노바이러스, 폴리오마바이러스, 인플루엔자 바이러스 또는 인간 헤르페스바이러스에 의해 유발되고, 구체적으로 상기 인간 헤르페스바이러스는 거대세포바이러스 (CMV), 엡스타인-바 바이러스 (Epstein-Barr virus: EBV), 단순 헤르페스 바이러스 (HSV), 바리젤라-조스터 바이러스 (Varizella-Zoster virus: VZV) 또는 인간 헤르페스바이러스 8 (human herpesvirus 8: HHV8)인, 림프구, 바이러스 벡터 또는 약학 조성물.
  36. 대상체에게 청구항 1 내지 17 중 어느 한 항에 따른 림프구, 청구항 18 내지 28 중 어느 한 항에 따른 바이러스 벡터, 또는 청구항 29에 따른 약학 조성물을 치료적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 암을 가진 대상체를 치료하는 방법, 또는 대상체에서 바이러스 감염을 예방 및/또는 치료하는 방법.
  37. 청구항 36에 있어서, 암은 혈액암 또는 고형 종양이고, 구체적으로 상기 혈액암은 급성 림프모구 백혈병, 미만성 거대 B-세포 림프종, 호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병 또는 다발성 골수종이고, 상기 고형 종양은 결장암, 유방암, 췌장암, 난소암, 간세포 암종, 폐암, 신경모세포종, 교모세포종 또는 육종인, 방법.
  38. 청구항 36에 있어서, 바이러스 감염은 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 아데노바이러스, 폴리오마바이러스, 인플루엔자 바이러스 또는 인간 헤르페스바이러스에 의해 유발되고, 구체적으로 상기 인간 헤르페스바이러스는 거대세포바이러스 (CMV), 엡스타인-바 바이러스 (EBV), 단순 헤르페스 바이러스 (HSV), 바리젤라-조스터 바이러스 (VZV) 또는 인간 헤르페스바이러스 8 (HHV8)인, 방법.
  39. 하기 단계를 포함하는 청구항 1 내지 17 중 어느 한 항에 따른 림프구를 제조하는 방법:
    a) 대상체로부터 수득된 림프구를 제공하는 단계;
    b) 적어도 하나의 철 조절 단백질을 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드를 상기 단계 (a)의 림프구로 도입하는 단계로서, 상기 철 조절 단백질은 IRP1 (서열번호: 1) 및/또는 IRP2 (서열번호: 2-6)인, 단계; 및
    c) 상기 단계 (b)에서 림프구로 도입된 합성 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 적어도 하나의 철 조절 단백질을 발현시키는 단계.
  40. 청구항 39에 있어서, 단계 (b)에서 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 제2 합성 폴리뉴클레오티드를 림프구에 도입하는, 방법.
  41. 청구항 40에 있어서, CAR를 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드를 IRP1 및/또는 IRP2를 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드와 조합하는, 방법.
  42. 청구항 40 또는 41에 있어서, CAR를 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드를 IRP1 및/또는 IRP2를 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드와 전사로 연결하는, 방법.
  43. 청구항 40 내지 42 중 어느 한 항에 있어서, CAR를 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드와 IRP1 및/또는 IRP2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 자가-절단 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 의해 연결하는, 방법.
  44. 청구항 43에 있어서, 자가-절단 펩티드는 2A 자가-절단 펩티드인, 방법.
  45. 청구항 43 또는 44에 있어서, 자가-절단 펩티드는 T2A인, 방법.
  46. 청구항 39 내지 45 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 합성 폴리뉴클레오티드를 바이러스 형질도입에 의해 림프구에 도입하는, 방법.
  47. 청구항 46에 있어서, 바이러스 형질도입은 청구항 18 내지 28 중 어느 한 항에 따른 바이러스 벡터로 수행하는, 방법.
  48. 청구항 39 내지 47 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 합성 폴리뉴클레오티드를 림프구로 도입하기 전 또는 후에 림프구의 활성화를 수행하는, 방법.
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