CN114269907A - 细胞治疗方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于细胞治疗领域并且提供了用于治疗患者的癌症和/或病毒感染的组合物和方法。本发明提供了包含编码至少一种铁调节蛋白和任选的嵌合抗原受体的合成多核苷酸的淋巴细胞。本发明还提供了用于产生这些淋巴细胞并将它们施用给患者的方法。

Description

细胞治疗方法
摘要
本发明属于细胞治疗领域并且提供了用于治疗患者的癌症和/或病毒感染的组合物和方法。本发明提供了包含编码至少一种铁调节蛋白和任选的嵌合抗原受体的合成多核苷酸的淋巴细胞。本发明还提供了用于产生这些淋巴细胞并将它们施用给患者的方法。
介绍
在过去的几十年中，免疫系统在癌症发展和治疗中的潜能一直是研究的主要焦点。尽管靶向治疗和利用免疫检查点阻断的免疫治疗已大大提高了许多癌症患者的存活率，但很大一部分患者在接受这些治疗后仍出现疾病进展。过继性细胞治疗(ACT)可为这些患者提供另一治疗选择，包括将肿瘤驻留或外周血修饰的免疫细胞静脉内转移到癌症患者体内，以调节抗肿瘤功能。目前，ACT可以根据其各自的作用机制分为三种不同的类型，即使用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的ACT、使用T细胞受体(TCR)基因治疗的ACT，以及使用嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞的ACT。使用其他免疫细胞类型诸如自然杀伤细胞作为细胞治疗的基础也是当前研究的一个领域。
美国国立卫生研究院外科分部(SB，NIH，Bethesda,Maryland,US)的Rosenberg及其同事对TIL进行了首次研究，其中TIL是从不同的鼠肿瘤中培养的并表现出体内抗肿瘤活性。目前的TIL治疗由以下组成：从切除的肿瘤材料中离体扩增TIL，以及在淋巴清除准备方案后过继性转移到患者体内并随后支持白细胞介素2(IL-2)。使用这种方案，在若干I/II期临床试验中，在患有转移性黑色素瘤的患者中实现了大约50％的明显的客观肿瘤应答。在使用TIL在黑色素瘤患者中取得成功后，还研究了由其他实体肿瘤类型产生TIL。到目前为止，已经可以从具有不同肿瘤反应率的非黑色素瘤肿瘤类型(诸如宫颈癌、肾细胞癌、乳腺癌和非小细胞肺癌)中培养出TIL。
除了肿瘤中天然存在的TIL和基于此的治疗选择外，可以分离外周血T细胞并在体外进行基因修饰以表达靶向特定肿瘤抗原的TCR，以供ACT使用。使用这种方法，可以产生大量肿瘤特异性T细胞，其中在最多至30％的治疗患者中观察到有效的抗肿瘤活性和客观临床应答。对于通过修饰TCR实现的识别，需要通过主要组织相容性复合物(MHC)进行抗原呈递。然而，众所周知，许多癌症类型可以通过其MHC表达的下调或丧失来逃避T细胞介导的免疫应答。为了避免在肿瘤细胞上存在MHC以供肿瘤特异性T细胞识别的需要，已经开发了人工受体，诸如CAR分子。使用CAR修饰的T细胞的ACT具有与TCR修饰的T细胞相同的效应子功能的能力，但独立于MHC表达。除了使用蛋白质抗原外，还探索了其他抗原，诸如碳水化合物或糖脂抗原。利用CD19特异性CAR T细胞在血液系统恶性肿瘤中已经观察到令人印象深刻的临床应答，这也导致了在实体肿瘤中使用CAR治疗的探索。
虽然造血干细胞移植(HSCT)为患有许多高危癌症或原发性免疫缺陷综合征的患者提供了治愈机会，但由于长期且严重的免疫抑制，移植受者仍然容易受到感染并发症的影响。这些风险因准备方案、移植类型和骨髓抑制的持续时间而有所改变。随着预处理方案的进步和移植后管理的改进，越来越多的患者有资格接受不匹配、不相关或半相合的供体HSCT。虽然患有严重或其他无法治疗的疾病的患者的结果有了很大改善，但移植所需的免疫抑制以及在有指征时治疗移植物抗宿主病(GVHD)为感染打开了大门。具体地说，病毒感染导致显著的发病率和死亡率，并且在T细胞免疫重建延迟时风险增加。免疫抑制、免疫重建和GVHD的影响与感染之间的关系是复杂且相互交织的。病毒感染的药物治疗和预防选择仍然有限且通常无效，并伴有相关的发病率，尤其是来自急性肾损伤和骨髓抑制。治疗也可能产生耐药性，并且不提供延长保护，从而使患者面临病毒再激活的风险。鉴于T细胞免疫恢复延迟与病毒性疾病之间的相关性，过继性细胞治疗是药物治疗的合理替代方案。已将来自血清阳性供体的未经处理的淋巴细胞输注液输注到患有威及生命的疾病(诸如EBV相关淋巴瘤)的患者体内，展示了临床功效和主要与GVHD相关的风险。这一策略在过去的二十年中不断发展，并且供体淋巴细胞产品已成功地作为病毒性疾病(包括再激活、新暴露和淋巴瘤)的治疗和作为预防在宿主体内重建病毒免疫。在这些初步研究之后，对病毒特异性T细胞(VST)的选择和/或扩增进行了精细改进，以最大限度地提高病毒细胞毒性并最大限度地降低同种异体反应性，以降低并在很大程度上消除GVHD的风险。在目前的研究中，VST提供了靶向治疗并且迄今为止已经证明了非常好的安全性特征。
与T细胞相比，自然杀伤细胞(NK细胞)在ACT中的潜力研究较少。然而，NK细胞的若干属性使其成为过继性细胞治疗的理想候选者。除了是高度细胞毒性的效应子外，NK细胞不受抗原特异性的限制，并且它们快速产生增强适应性免疫应答的促炎性细胞因子。
来自癌症患者的NK细胞通常功能失调，表现为增殖速率降低、对细胞因子刺激的应答降低以及效应子功能降低。因此，早期的免疫治疗策略旨在增强或恢复内源NK细胞的功能。这些策略涉及自体NK细胞的离体IL-2诱导的激活，然后在治疗过程中与组合的IL-2治疗一起回输到患者体内。不幸的是，IL-2激活的NK细胞不影响肿瘤生长，并且治疗方案有严重的副作用。使用同种异体NK细胞治疗癌症患者更有希望，因为与患者NK细胞相比，同种异体NK细胞功能完全。此外，同种异体NK细胞具有移植物抗白血病/肿瘤(GvL/GvT)作用，而不引起移植物抗宿主病(GvHD)，因此引起的免疫病理学较少。
已经实现了临床相关应答，特别是在血液系统恶性肿瘤(诸如急性骨髓性淋巴瘤(AML)和非霍奇金淋巴瘤(NHL))的治疗中。然而，单独NK细胞的活性往往不足以完全控制肿瘤生长；并且由于肿瘤微环境的限制，实体肿瘤的治疗尤其具有挑战性。因此，已经广泛研究了增强NK细胞功能的策略。一种增强NK细胞抗肿瘤活性的方法是利用细胞因子。已经使用各种细胞因子(IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和I型干扰素)在过继性转移之前在体外扩增和激活NK细胞。
一种使NK细胞功能最大化的有希望的细胞因子组合是IL-12、IL-18和IL-15的组合使用。这种组合的刺激诱导了具有“记忆样”特征(诸如延长的存活和增强的效应子功能)的NK细胞群。临床前研究表明，细胞因子增强的(CE)NK细胞具有作为抗白血病细胞治疗的巨大潜力。在淋巴瘤或黑色素瘤的体内肿瘤模型中，CE NK细胞具有增强的效应子功能(IFN-γ产生和细胞毒性)。此外，在过继性转移到免疫缺陷NOD-SCID-γc-/-小鼠(NSG)中之后，与对照NK细胞相比，IL-2增强的CE NK细胞持续时间更长。最后，在AML异种移植的NSG小鼠中，CE NK细胞显著降低AML负担并提高总体存活率。
驱动CE NK细胞的效应子功能增加的分子机制目前尚不清楚。对于T细胞，非常确定的是，某个亚群(例如幼稚CD8+T细胞与记忆CD8+T细胞)的功能与不同的代谢调节机制有关。因此，CE NK细胞中改变的代谢模式可以支持增强的功能。阐明构成CE NK细胞分化基础的分子机制及其优异的效应子功能性是提高临床功效的重要先决条件。
一般来说，高度增殖细胞严格依赖铁来支持基本过程，诸如能量代谢/呼吸、DNA合成和修复以及细胞周期控制。包括淋巴细胞在内的增殖细胞所需的大量铁由转铁蛋白提供，所述转铁蛋白通过细胞表面受体CD71吸收。CD71通常用作淋巴细胞活化标志物并在活化的NK细胞上表达。迄今为止只有少数研究调查了铁代谢对淋巴细胞功能的重要性。最近已证明CD71受体中的突变(TFRCY20H/Y20H)由于增殖受损而损害T和B细胞功能。
已经提出降低的铁水平有损NK细胞的细胞毒性和功能失调的NK细胞，并且在这种情况下，可能促进大鼠的癌症发展。此外，已将低血清铁蛋白水平与人NK细胞活性降低相关联。然而，铁对NK细胞介导的免疫的具体影响仍不清楚。
细胞铁稳态是一个严格调节的过程，其涉及铁的摄取、利用和储存的协调。它主要在转录后水平上受到铁调节蛋白/铁反应元件(IRP/IRE)调节系统的调节。IRP1和IRP2是RNA结合蛋白，其识别不同mRNA中的IRE，从而控制其稳定性和蛋白质翻译。IRP1和IRP2的活性响应于细胞铁水平而受到调节。经典IRE存在于编码用于铁获取、铁储存、铁利用、ATP产生和铁输出的mRNA的5'UTR或3'UTR中。
在缺铁情况下，IRP活性很高并且IRP与相应mRNA的5'UTR或3'UTR中的IRE结合。根据IRE的定位，IRP可以不同地影响蛋白质表达。在5'UTR中携带IRE的mRNA(例如FTH1 mRNA，铁蛋白轻链1)的翻译受到IRP结合的抑制。相比之下，IRP与3'UTR IRE(例如TFRC mRNA、CD71)的结合使mRNA稳定并导致翻译增强。因此，IRP/IRE调节网络通过相对于细胞铁状态选择性地调节某些mRNA的翻译来协调细胞铁稳态。
尽管近来在过继性细胞治疗中取得了成功，但仍然需要改进这些治疗以使它们可用于更多患者。成功的过继性细胞治疗的一个一般要求是确保免疫细胞在细胞被输注后在患者体内稳健扩增。一方面，这将导致输注次数减少，并且另一方面，将导致治疗的功效更高。因此，本领域需要与细胞治疗相关的改进手段和方法。更具体地，需要在将细胞施用给受试者之后在体内稳健扩增的免疫细胞。
该技术问题通过权利要求中提供的实施方案来解决。即，本发明涉及以下项目：
1.一种淋巴细胞，其包含编码至少一种铁调节蛋白的合成多核苷酸。
2.根据项目1所述的淋巴细胞，其中所述淋巴细胞是T细胞或自然杀伤细胞。
3.根据项目1或2中任一项所述的淋巴细胞，其中所述至少一种铁调节蛋白是组成型表达的。
4.根据项目1至3中任一项所述的淋巴细胞，其中所述至少一种铁调节蛋白是IRP1(SEQ ID NO:1)和/或IRP2(SEQ ID NO:2-6)。
5.根据项目1至4中任一项所述的淋巴细胞，其中所述淋巴细胞还包含嵌合抗原受体。
6.根据项目5所述的淋巴细胞，其中所述嵌合抗原受体包含抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区域以及信号传导结构域。
7.根据项目6所述的淋巴细胞，其中所述抗原结合结构域是抗体或其抗原结合片段，具体地，其中所述抗原结合片段是Fab或scFv。
8.根据项目6或7中任一项所述的淋巴细胞，其中所述抗原结合结构域特异性地结合肿瘤抗原。
9.根据项目8所述的淋巴细胞，其中所述肿瘤抗原存在于靶细胞群或组织的细胞表面上。
10.一种药物组合物，其包含根据项目1至9中任一项所述的淋巴细胞和药学上可接受的载剂。
11.根据项目1至9中任一项所述的淋巴细胞或根据项目10所述的药物组合物，其用于在治疗中使用。
12.根据项目1至9中任一项所述的淋巴细胞或根据项目10所述的药物组合物，其用于治疗癌症。
13.根据项目12所述所述用途的淋巴细胞或药物组合物，其中所述癌症是血液系统癌症或实体肿瘤，具体地，其中所述血液系统癌症是急性成淋巴细胞性白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血病或多发性骨髓瘤，并且其中所述实体肿瘤是结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、肝细胞癌、肺癌、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤或肉瘤。
14.根据项目1至9中任一项所述的淋巴细胞或根据项目10所述的药物组合物，其用于预防和/或治疗病毒感染。
15.根据项目14所述所述用途的淋巴细胞或药物组合物，其中所述病毒感染是由人免疫缺陷病毒(HIV)、腺病毒、多瘤病毒、流感病毒或人疱疹病毒引起的，具体地，其中所述人疱疹病毒是巨细胞病毒(CMV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、单纯疱疹病毒(HSV)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)或人疱疹病毒8(HHV8)。
16.一种用于治疗患有癌症的受试者或用于预防和/或治疗受试者的病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据项目1至7中任一项所述的淋巴细胞或根据项目10所述的药物组合物。
17.根据项目16所述的方法，其中所述癌症是血液系统癌症或实体肿瘤，具体地，其中所述血液系统癌症是急性成淋巴细胞性白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血病或多发性骨髓瘤，并且其中所述实体肿瘤是结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、肝细胞癌、肺癌、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤或肉瘤。
18.根据项目16所述的方法，其中所述病毒感染是由人免疫缺陷病毒(HIV)、腺病毒、多瘤病毒、流感病毒或人疱疹病毒引起的，具体地，其中所述人疱疹病毒是巨细胞病毒(CMV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、单纯疱疹病毒(HSV)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)或人疱疹病毒8(HHV8)。
19.一种用于产生根据项目1至9中任一项所述的淋巴细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供从受试者获得的淋巴细胞；
b)将编码至少一种铁调节蛋白的合成多核苷酸引入所述淋巴细胞中；以及
c)表达在所述合成多核苷酸中编码的一种或多种基因。
20.根据项目19所述的方法，其中在步骤(b)中引入编码嵌合抗原受体的第二合成多核苷酸。
21.根据项目20所述的方法，其中将所述编码所述嵌合抗原受体的合成多核苷酸与所述编码所述至少一种铁调节蛋白的合成多核苷酸组合。
22.根据项目19至21中任一项所述的方法，其中在将所述至少一个合成多核苷酸引入所述淋巴细胞中之前或之后激活所述淋巴细胞。
23.根据项目19至22中任一项所述的方法，其中通过病毒转导，特别是通过逆转录病毒转导，将所述至少一个合成多核苷酸引入所述淋巴细胞中。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及一种淋巴细胞，其包含编码至少一种铁调节蛋白的合成多核苷酸。
也就是说，本发明是基于以下令人惊讶的发现：CD71介导的铁摄取是活化的NK细胞的关键代谢检查点，在细胞增殖方面充当通过/不通过的看门人。在细胞因子增强的(CE)NK细胞中，过量的铁调节蛋白出乎意料地产生假性缺铁状态，从而选择性地增强CD71的翻译并因此增加细胞的增殖。
迄今为止，导致CE NK细胞的效应子功能增强的分子机制仍然未知。实施例2具体示出，与幼稚(NV)NK细胞相比，CD71在CE NK细胞中的表达响应于IL-12和IL-18以及肿瘤靶细胞的刺激而显著较高(图2B、2C和2D)。在实施例5中，进一步显示编码CD71的TFRC基因的转录在用细胞因子激活NV和CE NK细胞后被诱导，然而，在CE NK细胞中程度更高(图5B)。与NV NK细胞相比，更高的TFRC mRNA表达直接转化为CE NK细胞中增加的蛋白质表达(图2B和C)。因此，在实施例6中示出，与NV NK细胞相比，CE NK细胞中的铁调节蛋白(IRP)IRP1和IRP2的表达水平更高(图6A)。由于已知IRP通过稳定后者参与调节TFRC mRNA的翻译，因此可以得出结论，与NV NK细胞相比，CE NK中较高的CD71蛋白量是由这些细胞中较高的IRP量引起的。这些发现令人惊讶，因为已知IRP的表达响应于细胞铁水平而受到调节。然而，在CENK细胞中，尽管周围介质中铁含量丰富，但IRP的表达却上调，从而产生假性缺铁状态。在刺激后，这种假性缺铁状态允许CD71 mRNA的稳定性增加，从而导致CD71蛋白表达以及因此增殖增加。
基于这些发现，发明人已得出结论，在诸如NK细胞或T细胞的淋巴细胞中诱导假性缺铁状态导致增殖增加，因此在施用给受试者后随之产生更大的效应子群。代替必须用细胞因子和/或饲养细胞系处理淋巴细胞，这在体内应用中通常难以或甚至不可能控制，本发明提供了一种创造性的解决方案，用于通过在淋巴细胞中过表达至少一种IRP而在所述淋巴细胞中诱导假性缺铁状态。因此，与不过表达IRP的淋巴细胞相比，根据本发明的过表达IRP的假性缺铁淋巴细胞具有增强的功能，特别是增强的增殖。因此，在替代性实施方案中，本发明涉及过表达至少一种铁调节蛋白的淋巴细胞。
发明人已经证明IRP的强制表达导致不同类型淋巴细胞的增殖增加。例如，发明人表明，IRP2(SEQ ID NO:2；NCBI RefSeq:NM_004136.4)的慢病毒过表达导致CD71的表达增加，并且更重要的是，导致Jurkat T细胞的增殖增加(图8F)。此外，发明人表明，慢病毒过表达诱导CD4+和CD8+T细胞中CD71的表达(图8G和H)。此外，发明人表明，在CAR T细胞中IRP2的慢病毒过表达导致抗原刺激后CAR T细胞的增殖增加，而IRP2的过表达对未刺激的CAR T细胞的增殖没有影响(图8K)。
因此，本发明人令人信服地证明，IRP对CD71表达的调节作用以及CD71表达与细胞增殖之间的相关性在不同类型的淋巴细胞之间，特别是在T细胞与NK细胞之间是非常保守的。鉴于这些发现，得出结论：淋巴细胞中IRP的过表达导致所述淋巴细胞的增殖增加。因此，在基于淋巴细胞的治疗的过程中，IRP的强制过表达代表一种有吸引力的策略，以用于实现已注入患者体内的淋巴细胞的稳健体内增殖是合理的。
IRP，也称为铁反应元件结合蛋白，是与铁反应元件(IRE)结合并从而调节人铁代谢的蛋白质。在人中，已经描述了两种不同的IRP，名为IRP1和IRP2。IRP1与IRP2的活性以不同的方式进行调节。IRP1含有铁硫簇，并且在铁充足的条件下起胞质顺乌头酸酶的作用。当铁匮乏时，铁硫簇变得缺乏铁，并且IRP1改变其构型，从而能够与mRNA的IRE结合。相比之下，IRP2在相对铁过量的情况下被泛素蛋白酶体系统迅速降解。在缺铁条件下，衔接蛋白FBXL5被降解，导致IRP2水平增加。因此，泛素连接酶起到铁感受器和铁稳态调节剂的作用。已经描述了IRP1和IRP2活性的组织特异性变化，并且IRP1和IRP2敲除小鼠具有不同的表型。
如本文所用，术语“多核苷酸”是指通过磷酸二酯键连接的核苷酸的序列。本发明的多核苷酸可以是单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)分子或核糖核酸(RNA)分子。核苷酸碱基在本文中用单字母代码表示：腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、肌苷(I)和尿嘧啶(U)。本发明的多核苷酸可使用本领域普通技术人员熟知的标准技术制备。
如本文所用，“合成多核苷酸”是非天然来源并已整合到淋巴细胞中的多核苷酸。合成多核苷酸可通过包括聚合酶链式反应的重组技术产生，或通过化学合成产生。技术人员知道产生具有特定多核苷酸序列的合成多核苷酸的方法。此外，技术人员知道将合成多核苷酸整合到淋巴细胞中的方法。在本发明中，优选的是，合成多核苷酸包含至少一个编码IRP的基因或编码序列，其中至少一个基因或编码序列可操作地连接到至少一个与编码至少一种IRP的内源性基因不天然相关的调节元件，例如启动子。这样的合成多核苷酸可通过多种策略获得。例如，可将包含编码IRP的基因或编码序列的多核苷酸整合到淋巴细胞中，所述基因或编码序列处于启动子或与编码IRP的内源性基因不天然相关的另一调节元件的控制下。可替代地，可将编码IRP的多核苷酸整合到淋巴细胞的基因组中，使得其与不与编码IRP的内源性基因天然相关的调节元件可操作地连接。此外，本发明的合成多核苷酸也可通过将包含与编码IRP的内源性基因不天然相关的调节元件的多核苷酸整合到淋巴细胞中，使得该调节元件将可操作地连接至淋巴细胞的编码IRP的内源性基因而获得。可替代地，本发明的合成多核苷酸也可通过利用基因工程或基因组编辑的方法修饰编码IRP的基因的内源性调节元件，使得改变淋巴细胞的内源性IRP基因的表达而获得。例如，可修饰编码IRP的内源性基因的调节元件，例如启动子，使得编码IRP的基因在淋巴细胞中组成型地表达。用于基因工程化的方法在本领域是众所周知的并且包括CRISPR/Cas9，或使用工程化的核酸酶，诸如大范围核酸酶、锌指核酸酶或TALEN。
术语“可操作地连接”是指调节序列与异源核酸序列之间功能连接，从而导致后者的表达。例如，当第一核酸序列被布置成与第二核酸序列处于功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，那么启动子可操作地连接至编码序列。通常，可操作地连接的DNA序列是连续的，并且在需要连结两个蛋白编码区时，处于同一阅读框中。如本文所用，术语“启动子”定义为由细胞的合成机器或引入的合成机器识别的、启动多核苷酸序列的特异性转录所需的DNA序列。
如果合成多核苷酸存在于细胞内部，即被细胞的细胞质膜包围，那么细胞，例如淋巴细胞，被称为包含合成多核苷酸。合成多核苷酸可以任何形式并通过本领域已知的任何方法递送到细胞中。例如，合成多核苷酸可作为环状DNA载体(例如质粒)的一部分以线性DNA的形式或作为其一部分，或以mRNA的形式或作为其一部分存在于细胞内部。然而，优选的是，将合成多核苷酸作为DNA整合到淋巴细胞的基因组中。
术语“编码”是指多核苷酸中特定核苷酸序列(诸如编码序列、基因、cDNA或RNA)用作在生物过程中合成具有限定的核苷酸序列(即，rRNA、tRNA和mRNA)或限定的氨基酸序列的其他聚合物和大分子的模板的固有特性以及由此产生的生物学特性。因此，在细胞或其他生物系统中，如果编码序列或基因转录成mRNA并且与所述编码序列或基因相对应的mRNA的翻译产生蛋白质，则所述编码序列或基因编码所述蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常在序列表中提供)和非编码链(用作基因或cDNA转录的模板)都可以被称为编码所述编码序列、基因或cDNA的蛋白质或其他产物。
如本文所用，术语“编码序列”是指当置于适当的调节或表达控制序列的控制下时被转录和翻译成多肽的核酸序列。如本文所用，术语“基因”是指DNA序列，包括但不限于可以转录成mRNA(其可以翻译成多肽链)、转录成rRNA或tRNA或用作酶和其他参与DNA复制、转录和调节的蛋白质的识别位点的DNA序列。术语“基因”通常被理解为包括所有内含子和其他从mRNA转录物剪接的DNA序列，以及当在其内源性环境中使用时由替代性剪接位点产生的变体。然而，当在合成多核苷酸的环境中使用术语“基因”时，该术语被广泛理解为进一步包括在序列上与基因的剪接mRNA变体或源自基因的剪接mRNA的cDNA相对应的编码序列。
如本文所用，术语“淋巴细胞”是指在血液、淋巴和淋巴组织中发现的源自淋巴干细胞的任何单核非吞噬性白细胞；淋巴细胞包括自然杀伤细胞(NK细胞；其在细胞介导的细胞毒性先天免疫中起作用)、T细胞(用于细胞介导的细胞毒性适应性免疫)和B细胞(用于体液、抗体驱动的适应性免疫)。优选地，本发明的淋巴细胞是NK细胞或T细胞。因此，在一个优选实施方案中，本发明涉及根据本发明的淋巴细胞，其中淋巴细胞是T细胞或自然杀伤细胞。
T细胞是一类在胸腺中发育并在免疫应答中起关键作用的淋巴细胞。通过T细胞受体在细胞表面上的存在，可以将T细胞与其他淋巴细胞区分开来。这些免疫细胞作为源自骨髓的前体细胞起源，并且一旦它们迁移到胸腺，就会发育成几种不同类型的T细胞。即使在离开胸腺后，T细胞分化也会继续。本发明的淋巴细胞可以是任何T细胞，例如辅助CD4+T细胞、细胞毒性CD8+T细胞、记忆T细胞、调节性CD4+T细胞、自然杀伤T细胞或γδT细胞。在某些实施方案中，根据本发明的T细胞是CD4+或CD8+T细胞，任选地其中CD4+或CD8+T细胞包括嵌合抗原受体。
自然杀伤细胞或NK细胞是一类对先天免疫系统至关重要的细胞毒性淋巴细胞。NK细胞在脊椎动物适应性免疫应答中所起的作用类似于细胞毒性T细胞。NK细胞提供对病毒感染的细胞的快速应答，在感染后大约3天起作用，并对肿瘤形成产生应答。它们被命名为“自然杀伤细胞”，因为最初的概念是在没有事先敏化的情况下裂解肿瘤细胞的能力。NK细胞的抑制性受体接合在有核细胞表面上普遍表达的大多数主要组织相容性I类(MHC I类)分子。表达高水平MHC I类的健康细胞维持自我耐受性并免受NK细胞的杀伤。相比之下，病毒感染或恶性转化通过去除抑制性信号触发NK细胞活化。活化NK细胞受体识别病毒感染细胞或恶性细胞上的应激诱导配体。这些刺激性配体在靶细胞上的表达可以克服抑制性受体递送的组成型抑制，从而激活NK细胞。
在本发明中，淋巴细胞可以是任何淋巴细胞。优选地，本发明的淋巴细胞是T细胞或NK细胞。因此，在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的淋巴细胞，其中淋巴细胞是T细胞或NK细胞。在另一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的淋巴细胞，其中淋巴细胞是细胞毒性CD8+T细胞、辅助CD4+T细胞或NK细胞。在另一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的淋巴细胞，其中淋巴细胞是细胞毒性CD8+T细胞或NK细胞。在另一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的淋巴细胞，其中淋巴细胞是细胞毒性CD8+T细胞。在另一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的淋巴细胞，其中淋巴细胞是辅助CD4+T细胞。
在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的淋巴细胞，其中淋巴细胞是肿瘤浸润性淋巴细胞、包含修饰TCR的T细胞或病毒特异性T细胞。
也就是说，淋巴细胞是适用于细胞治疗应用的淋巴细胞，诸如TIL、包含修饰TCR的T细胞或病毒特异性T细胞。优选地，TIL、包含修饰TCR的T细胞或病毒特异性T细胞包含编码至少一种铁调节蛋白的合成多核苷酸，优选地，其中铁调节蛋白是IRP1和/或IRP2，更优选地，其中铁调节蛋白是蛋白是IRP2，甚至更优选地，其中铁调节蛋白是如SEQ ID NO:2所示的IRP2。
在某些实施方案中，本发明的淋巴细胞可以是肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。TIL是已离开血流并向肿瘤迁移的白血细胞。它们包括T细胞和B细胞，并且是更大类别的“肿瘤浸润性免疫细胞”的一部分，所述肿瘤浸润性免疫细胞由不同比例的单核和多形核免疫细胞组成(例如，T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞等)。它们的丰度因肿瘤类型和阶段而异，并且在一些情况下与疾病预后有关。TIL可用于细胞治疗，其中TIL从患者的肿瘤中分离并离体扩增。接着可测定扩增的TIL的特异性肿瘤识别，并且然后可将肿瘤特异性TIL回输到患者体内，任选地在另一扩增步骤之后。
在本发明中，可将编码至少一种铁调节蛋白的合成多核苷酸离体引入已从患者，特别是患者的肿瘤中获得的TIL中。然后可在癌症治疗过程中将过表达IRP的TIL输注到患者体内，优选地在一个或多个另外的扩增和/或选择步骤之后。
在本发明的某些实施方案中，本发明的淋巴细胞可以是包含修饰T细胞受体(TCR)的T细胞。术语“包含修饰T细胞受体的T细胞”或“TCR修饰的T细胞”是指经过基因修饰以使其表达特定TCR的T细胞。TCR修饰的T细胞可通过以下方式产生：从受试者获得T细胞群并在所述T细胞群中引入编码T细胞受体的遗传元件。TCR可以是天然存在的TCR或工程化的TCR。
TCR修饰的T细胞可用于细胞治疗，以增加患者对特定抗原(例如已证实由所述患者的肿瘤产生的抗原)的免疫应答。在TCR修饰的T细胞群中过表达铁调节蛋白，优选地IPR1和/或IPR2，更优选地IPR2，可导致在输注到患者体内时，这些T细胞在体内更稳健地增殖，因此可在所述患者中引发对由TCR识别的抗原的更强免疫应答。本发明的TCR修饰的T细胞可以是任何类型的T细胞。优选地，本发明的TCR修饰的T细胞是CD4+或CD8+T细胞。
在本发明的某些实施方案中，根据本发明的淋巴细胞是病毒特异性T细胞。“病毒特异性T细胞”是已经用病毒抗原刺激的T细胞，例如CD4+或CD8+T细胞。当向患者施用时，病毒特异性T细胞可用于治疗患者的病毒感染。在病毒特异性T细胞群中过表达铁调节蛋白，优选地IRP1和/或IRP2，更优选地IRP2，可导致在输注到患者体内时，这些T细胞在体内更稳健地增殖，因此可在所述患者中引发对由TCR识别的抗原的更强免疫应答。
在另一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的淋巴细胞，其中至少一种铁调节蛋白是组成型地表达的。
在根据本发明的合成多核苷酸中编码并包含在细胞中的至少一种IRP可与任何启动子或本领域已知的任何调节元件可操作地连接。因此，至少一种IRP可组成型地表达，即大多数时候在大多数细胞类型中表达，或可诱导型地表达，即仅在某些生理条件下和/或响应于特定信号和/或诱导物分子而表达。然而，在本发明中，优选的是，至少一种IRP是组成型地表达的。可替代地，至少一种IRP可在细胞治疗应用中经常遇到的条件下诱导型地表达，例如通过与淋巴细胞的激活相关的信号、分子和/或过程诱导型地表达。
如本文所用，术语“表达”是指在靶细胞中产生期望的最终产物分子。最终产物分子可包括，例如，RNA分子、肽、蛋白质或其组合。在本发明中，最终产物优选是铁调节蛋白。
“组成型”启动子是核苷酸序列，当这种核苷酸序列与编码基因产物或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，导致基因产物在细胞的大部分或所有生理条件下在细胞中产生
合适的启动子的一个实例是立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是强组成型启动子序列，能够驱动与其可操作地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达。合适的启动子的另一个实例是延伸生长因子-1a(EF-1a)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽类白血病病毒启动子、爱泼斯坦-巴尔病毒立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子，以及人基因启动子诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。
因此，在某些实施方案中，本发明涉及根据本发明的淋巴细胞，其中编码至少一种铁调节蛋白的合成多核苷酸处于组成型启动子的控制下。
如果组成型启动子负责起始编码蛋白质或多肽的多核苷酸的转录，则编码所述蛋白质或多肽的多核苷酸“处于组成型启动子的控制下”。技术人员知道将编码蛋白质或多肽的多核苷酸置于启动子控制下的方法，例如通过分子克隆的方法。
组成型启动子可以是本领域已知的任何组成型启动子，优选地在哺乳动物细胞中并且更优选地在人细胞中起始转录的组成型启动子。例如，组成型启动子可以是上文列出的组成型启动子中的任一种。
在本发明的某些实施方案中，本发明涉及根据本发明的淋巴细胞，其中组成型启动子是EF-1α启动子。
人延伸因子-1α(EF-1α)是人来源的组成型启动子，其可以用于在各种体外和体内环境中驱动异位基因表达。不受理论的束缚，EF-1α通常可用于其他启动子(诸如CMV)活性降低或已被沉默(如在胚胎干细胞中)的情况下。
“诱导型”启动子是核苷酸序列，当这种核苷酸序列与编码基因产物或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，基本上仅当与启动子相对应的诱导物存在于细胞中时才导致基因产物在细胞中产生。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白(metallothionine)启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
在另一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的淋巴细胞，其中至少一种铁调节蛋白是IRP1(SEQ ID NO:1)和/或IRP2(SEQ ID NO:2-6)。
也就是说，由包含在根据本发明的淋巴细胞中的合成多核苷酸编码的至少一种IRP可以是本领域已知的IRP。然而，优选的是，IRP是人IRP1和/或人IRP2。在人中，已经描述了IRP2的四种不同的同工型，其中已经描述了同工型3的两个不同的序列(SEQ ID NO:2-6)。因此，在本发明的某些实施方案中，根据本发明的淋巴细胞可包含编码具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质的合成多核苷酸。在本发明的其他实施方案中，根据本发明的淋巴细胞可包含一个或多个编码具有SEQ ID NO:2-6的氨基酸序列的蛋白质的合成多核苷酸。在本发明的另外实施方案中，根据本发明的淋巴细胞可包含编码具有SEQ ID NO:2-6中的一个或多个和SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质的合成多核苷酸。根据本发明的淋巴细胞还可包含两个或更多个合成多核苷酸，其中第一合成多核苷酸编码具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质，并且其中第二或任何另外的合成多核苷酸编码具有SEQ ID NO:2-6的氨基酸序列的蛋白质。
在本发明的一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的淋巴细胞，其中至少一种铁调节蛋白是IRP1(SEQ ID NO:1)。在本发明的另一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的淋巴细胞，其中至少一种铁调节蛋白是IRP2(SEQ ID NO:2)。在本发明的另一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的淋巴细胞，其中至少一种铁调节蛋白是IRP2(SEQ ID NO:3)。在本发明的另一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的淋巴细胞，其中至少一种铁调节蛋白是IRP2(SEQ ID NO:4)。在本发明的另一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的淋巴细胞，其中至少一种铁调节蛋白是IRP2(SEQ ID NO:5)。在本发明的另一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的淋巴细胞，其中至少一种铁调节蛋白是IRP2(SEQ ID NO:6)。在本发明的另一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的淋巴细胞，其中至少一种铁调节蛋白是IRP1(SEQ ID NO:1)和IRP2(SEQ ID NO:2)。在本发明的一个优选实施方案中，本发明涉及根据本发明的淋巴细胞，其中至少一种铁调节蛋白是IRP2(SEQ ID NO:2)。
发明人已经证明，在淋巴细胞中过表达IRP2导致这些淋巴细胞的更稳健增殖。发明人进一步表明，使淋巴细胞中的IRP1沉默具有与使IRP2沉默类似的效果，虽然该效果不如IRP2的情况显著(图8C和D)。然而，必须注意，IRP1的沉默不如IRP2的沉默有效(图8A)。因此，IRP1的过表达也可能导致淋巴细胞的增殖增加是合理的。此外，IRP1和IRP2同时过表达可能导致淋巴细胞的增殖增加是合理的。
在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的淋巴细胞，其中淋巴细胞还包含嵌合抗原受体。
如本文所用，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”或“CARs”是指工程化受体，其将抗原特异性移植到淋巴细胞例如T细胞和NK细胞上。本发明的CAR可以是本领域已知的任何CAR。优选地，本发明的CAR包含至少一个细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域、一个或多个共刺激信号传导区域以及细胞内信号传导结构域。在本发明的某些实施方案中，CAR可以是双特异性CAR，其对两种不同的抗原或表位具有特异性。在抗原结合结构域与靶抗原特异性结合后，信号传导结构域激活细胞内信号传导。例如，信号传导结构域可利用抗体的抗原结合特性，以非MHC限制性方式将T细胞特异性和反应性重定向至选定的靶标。非MHC限制性抗原识别使表达CAR的T细胞能够独立于抗原加工而识别抗原，从而绕过肿瘤逃逸的主要机制。此外，当在T细胞中表达时，CAR有利地不与内源T细胞受体(TCR)α和β链二聚化。在NK细胞的情况下，CAR的表达可有助于将NK细胞引导至靶抗原。然而，与CAR T细胞相比，CAR NK细胞可保留其活化和抑制性受体的表达。因此，与CAR-T细胞不同，在CAR靶向的抗原被下调的情况下，CAR-NK细胞仍可发挥其“天然”功能。
在本发明中，如果淋巴细胞包含编码CAR的编码序列并表达这些编码序列使得CAR锚定在淋巴细胞的膜上，则称淋巴细胞包含嵌合抗原受体。编码CAR的组分的编码序列可位于一个或多个合成多核苷酸上。在本发明的某些实施方案中，编码CAR的组分的编码序列和编码IRP的一个或多个编码序列可位于单个合成多核苷酸上。可替代地，编码CAR的组分的编码序列和编码一种或多种IRP的一个或多个编码序列可位于两个或更多个单独的多核苷酸上。例如，编码CAR的多核苷酸和编码一种或多种IRP的多核苷酸可通过两个独立的病毒转导事件引入细胞中并且因此可整合到基因组的不同部分中。包含CAR编码序列和任选的一个或多个IRP编码序列的一个或多个合成多核苷酸可以任何形式包含在淋巴细胞中，并且可已通过本领域已知的任何方法引入淋巴细胞中。例如，编码CAR和/或一种或多种铁调节蛋白的合成多核苷酸可作为环状DNA载体(例如质粒)的一部分、以线性DNA的形式或作为其一部分，或以mRNA的形式或作为其一部分存在于细胞内部。然而，优选的是，将包含CAR编码序列和任选的一个或多个IRP编码序列的一个或多个合成多核苷酸作为DNA整合到淋巴细胞的基因组中。技术人员了解将DNA引入淋巴细胞基因组中的方法。可通过本领域已知的任何方法将编码IRP1和/或IRP2以及任选的CAR的合成多核苷酸引入基因组中。在某些实施方案中，可通过病毒转导将编码IRP1和/或IRP2以及任选的CAR的合成多核苷酸引入淋巴细胞的基因组中。然而，本文还涵盖将合成DNA引入淋巴细胞的基因组中的其他方法，诸如CRISPR/Cas9。
在另一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的淋巴细胞，其中嵌合抗原受体包含抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区域以及信号传导结构域。
根据本发明的淋巴细胞可包含嵌合抗原受体(CAR)，其包含细胞外和细胞内结构域。细胞外结构域可包括另外称为抗原结合部分的一种或多种靶特异性结合元件。细胞内结构域或者细胞质结构域可包括一个或多个共刺激信号传导区域和信号传导结构域。共刺激信号传导区域是指CAR的一部分，其包括共刺激分子的细胞内结构域。共刺激分子是淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的除抗原受体或其配体以外的细胞表面分子。
在CAR的细胞外结构域与跨膜结构域之间，或在CAR的细胞质结构域与跨膜结构域之间，可掺入间隔结构域。如本文所用，术语“间隔结构域”通常是指在多肽链中用于将跨膜结构域与细胞外结构域或细胞质结构域相连接的任何寡肽或多肽。间隔结构域可包含最多至300个氨基酸，优选地10至100个氨基酸并且最优选地25至50个氨基酸。
本发明的CAR可包括另外称为抗原结合部分的一种或多种靶特异性结合元件。部分的选择取决于限定靶细胞表面的配体的类型和数量。例如，抗原结合结构域可经过选择以识别用作与特定疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标志物的配体。因此，可充当本发明的CAR中的抗原部分结构域的配体的细胞表面标志物的实例包括与病毒、细菌和寄生虫感染、自身免疫疾病和癌细胞相关的那些。
取决于待靶向的期望抗原，本发明的CAR可被工程化为包括对期望的抗原靶标具有特异性的适当抗原结合部分。例如，如果CD19是要靶向的期望抗原，那么CD19的抗体可用作抗原结合部分而掺入本发明的CAR中。
关于跨膜结构域，CAR可设计成包括与CAR的细胞外结构域融合的跨膜结构域。在某些实施方案中，可使用与CAR的细胞外或细胞质结构域天然相关的跨膜结构域。在一些情况下，可通过氨基酸取代选择或修饰跨膜结构域以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以使与受体复合物的其他成员的相互作用最小化。
跨膜结构域可来源于天然来源或合成来源。在来源是天然的情况下，结构域可来源于任何膜结合或跨膜蛋白。在本发明中尤其有用的跨膜区可来源于(即，至少包括其一个或多个跨膜区)T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD8、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154。可替代地，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下，它将主要包括疏水性残基，诸如亮氨酸和缬氨酸。优选地，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体将存在于合成的跨膜结构域的每个末端。
任选地，优选地长度介于2与10个氨基酸之间的短的寡肽或多肽接头可形成CAR的跨膜结构域与细胞质信号传导结构域之间的连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了特别合适的接头。
本发明的CAR的细胞质结构域或者细胞内信号传导结构域负责激活已放置CAR的淋巴细胞的至少一种正常效应子功能。术语“效应子功能”是指细胞的特化功能。T细胞的效应子功能例如可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“细胞内信号传导结构域”是指蛋白质的一部分，其转导效应子功能信号并且引导细胞执行特化功能。尽管通常可以使用完整细胞内信号传导结构域，但在许多情况下，不必使用完整链。在使用细胞内信号传导结构域的截短部分的情况下，只要所述截短部分转导效应子功能信号，其即可用于替代完整链。因此，术语细胞内信号传导结构域意在包括细胞内信号传导结构域的足以转导效应子功能信号的任何截短部分。用于本发明的CAR中的细胞内信号传导结构域的优选实例包括T细胞受体(TCR)和共受体的配合作用来起始抗原受体接合之后的信号转导的细胞质序列，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能性能力的任何合成序列。
已知仅通过TCR产生的信号不足以完全激活T细胞，还需要次级或共刺激信号。因此，可以说T细胞活化是由两类不同的细胞质信号传导序列介导的：通过TCR(初级细胞质信号传导序列)启动抗原依赖性初级激活的那些和以抗原非依赖性方式发挥作用以提供次级或共刺激信号(次级细胞质信号传导序列)的那些。
初级细胞质信号传导序列以刺激方式或抑制方式调节TCR复合物的初级激活。以刺激性方式起作用的初级细胞质信号传导序列可包含信号传导基序，所述信号传导基序被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。
在本发明中尤其有用的含有初级细胞质信号传导序列的ITAM的实例包括衍生自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。特别优选的是，本发明的CAR中的细胞质信号传导分子包含衍生自CD3ζ的细胞质信号传导序列。
CAR的细胞质结构域可设计成包含单独的CD3ζ信号传导结构域或其与在本发明的CAR的环境中有用的任何一个或多个其他期望的细胞质结构域的组合。例如，CAR的细胞质结构域可包含CD3ζ链部分和共刺激信号传导区域。共刺激信号传导区域是指CAR的一部分，其包括共刺激分子的细胞内结构域。共刺激分子是淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的除抗原受体或其配体以外的细胞表面分子。此类分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD 137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3以及与CD83特异性结合的配体等。
本发明的CAR的细胞质信号传导部分内的细胞质信号传导序列可以随机或指定顺序相互连接。任选地，优选地长度介于2与10个氨基酸之间的短的寡肽或多肽接头可形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了特别合适的接头。
在某些实施方案中，细胞质结构域可设计成包含CD3ζ的信号传导结构域和CD28和/或4-1BB的信号传导结构域。
在另一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的淋巴细胞，其中抗原结合结构域是抗体或其抗原结合片段，具体地，其中抗原结合片段是Fab或scFv。
也就是说，CAR的抗原结合结构域可以是本领域已知的能够特异性结合特定抗原的任何结构域。然而，优选的是，CAR的抗原结合结构域是抗体或抗体的抗原结合片段。
如本文所用，术语“抗体”是指特异性结合抗原的免疫球蛋白分子。抗体可以是源自天然来源或重组来源的完整免疫球蛋白，或可以是完整免疫球蛋白的免疫反应部分。抗体通常是免疫球蛋白分子的四聚体。本发明中的抗体可以多种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab)2，以及单链抗体和人源化抗体(Harlow等人,1999,UsingAntibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Houston等人,1989,Proc.A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York；Houston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA；85:5879-5883；Bird等人,1988,Science；242:423-426)。
如本文所用，术语“免疫球蛋白”或“Ig”被定义为具有抗体功能的一类蛋白质。B细胞表达的抗体有时称为BCR(B细胞受体)或抗原受体。此类蛋白质中包括的五个成员是IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。IgA是存在于身体分泌物诸如唾液、泪液、母乳、胃肠道分泌物以及呼吸道和泌尿生殖道的粘液分泌物中的初级抗体。IgG是最常见的循环抗体。IgM是大多数受试者在初级免疫应答中产生的主要免疫球蛋白，它是凝集、补体结合和其他抗体应答中最有效的免疫球蛋白，并且对防御细菌和病毒很重要。IgD是不具有已知的抗体功能，但可用作抗原受体的免疫球蛋白。IgE是通过在暴露于过敏原时致使肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放介质来介导速发型超敏反应的免疫球蛋白。
术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分并且是指完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、线性抗体、scFv抗体，以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
如本文所用，术语“Fab”旨在指由重链和轻链中的每一个的一个恒定结构域和一个可变结构域组成的抗体区域(单价抗原结合片段)，但其中重链被截短，使得其缺少CH2和CH3结构域并且还可能缺少一些或全部铰链区。Fab片段可通过用木瓜蛋白酶消化整个抗体来产生。Fab可指处于分离形式的这一区域，或处于全长抗体、免疫球蛋白构建体或Fab融合蛋白的环境中的这一区域。
“scFv”是指包括抗体的VH和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单个多肽链中。参见，例如，美国专利号4,946,778、5,260,203、5,455,030和5,856,456。通常，Fv多肽还包含介于VH结构域与VL结构域之间的多肽接头，其使得scFv能够形成用于抗原结合的期望结构。对于sFv的综述，参见Pluckthun(1994)The Pharmacology of MonoclonalAntibodies第113卷Rosenburg和Moore编辑(Springer-Verlag,New York)第269-315页。Fv片段的VH和VL结构域复合物也可通过二硫键来稳定(美国专利号5,747,654)。
如本文所用，“抗体重链”是指以其天然存在的构象存在于所有抗体分子中的两种类型的多肽链中较大的一种。如本文所用，“抗体轻链”是指以其天然存在的构象存在于所有抗体分子中的两种类型的多肽链中较小的一种，并且λ轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。
如本文所用，术语“合成抗体”是指使用重组DNA技术产生的抗体，例如通过噬菌体表达的抗体。该术语还应解释为表示通过合成编码抗体的DNA分子产生的抗体，并且所述DNA分子表达抗体蛋白或指定抗体的氨基酸序列，其中DNA或氨基酸序列使用本领域可利用且众所周知的合成DNA或氨基酸序列技术获得。
本领域技术人员知道用于产生具有不同抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区域和/或信号传导结构域的CAR的方法。此外，本领域技术人员知道将此类CAR引入淋巴细胞诸如T细胞或NK细胞中的方法。
在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的淋巴细胞，其中抗原结合结构域特异性结合肿瘤抗原。
也就是说，CAR的抗原结合结构域可结合本领域已知的任何抗原。然而，优选的是，CAR的抗原结合结构域特异性结合肿瘤抗原。如本文所用，术语“抗原”或“Ag”被定义为引起免疫应答的分子。此免疫应答可涉及抗体产生或特定免疫感受态细胞的活化，或两者。熟练技术人员将理解，任何大分子，包括几乎所有的蛋白质或肽，都可用作抗原。此外，抗原可来源于重组或基因组DNA。本领域技术人员将理解，包含编码引发免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA因此编码“抗原”，如所述术语在本文所使用的。此外，本领域技术人员将理解，抗原不必仅由基因的全长核苷酸序列编码。很明显，本发明包括但不限于使用多于一种基因的部分核苷酸序列并且这些核苷酸序列以各种组合排列以引发期望的免疫应答。此外，技术人员将理解，抗原根本不必由“基因”编码。很明显，抗原可产生、合成或可来源于生物样品。这种生物样品可包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或生物流体。
肿瘤抗原是由肿瘤细胞产生的引发免疫应答，尤其是T细胞介导的免疫应答的蛋白质。CAR的抗原结合部分的选择将取决于待治疗的特定癌症类型。肿瘤抗原是本领域众所周知的并且包括，例如，神经胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(CEA)、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧基酯酶、muthsp70-2、M-CSF、前列腺酶(prostase)、前列腺特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53、prostein、PSMA、Her2/neu、生存素和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白B2(ephrinB2)、CD22、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体和间皮素。
肿瘤抗原可包括一个或多个与恶性肿瘤相关的抗原性癌症表位。恶性肿瘤表达多种可以用作免疫攻击的靶抗原的蛋白质。这些分子包括但不限于组织特异性抗原，诸如黑色素瘤中的MART-1、酪氨酸酶和GP 100，以及前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶(PAP)和前列腺特异性抗原(PSA)。其他靶分子属于转化相关分子组，诸如致癌基因HER-2/Neu/ErbB-2。另一组靶抗原是癌-胚胎抗原(onco-fetal antigen)，诸如癌胚抗原(CEA)。在B细胞淋巴瘤中，肿瘤特异性独特型免疫球蛋白构成个体肿瘤特有的真正肿瘤特异性免疫球蛋白抗原。B细胞分化抗原诸如CD 19、CD20和CD37是B细胞淋巴瘤中靶抗原的其他候选物。这些抗原(CEA、HER-2、CD19、CD20、独特型)中的一些已被用作单克隆抗体被动免疫治疗的靶标，但成功率有限。
本发明中提及的肿瘤抗原的类型也可以是肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)。TSA是肿瘤细胞所独有的，并且不存在于体内其他细胞上。TAA相关抗原不是肿瘤细胞所独有的，而是在不能诱导对所述抗原的免疫耐受状态的条件下还在正常细胞上表达。抗原在肿瘤上的表达可在使免疫系统对抗原作出应答的条件下发生。TAA可以是在胎儿发育期间在免疫系统不成熟并且不能应答时在正常细胞上表达的抗原，或其可以是通常在正常细胞上以极低水平存在，但在肿瘤细胞上以高得多的水平表达的抗原。
TSA或TAA抗原的非限制性实例包括以下：分化抗原，诸如MART-1/MelanA(MART-1)、gp 100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2，以及肿瘤特异性多谱系抗原，诸如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15；过度表达的胚胎抗原，诸如CEA；过度表达的致癌基因和突变的肿瘤抑制基因，诸如p53、Ras、HER-2/neu；因染色体易位产生的独特肿瘤抗原，诸如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR；以及病毒抗原，诸如EB病毒(Epstein Barrvirus)抗原EBVA和人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。其他基于蛋白质的大型抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、pl85erbB2、pl80erb-B3、c-met、nm23_H1、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM17.1、NuMa、K-ras、β-连环蛋白、CDK4、Mum-1、p15、p16、43-9F、5T4(791Tgp72)、甲胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA15-3\CA 27.29\BCAA、CA195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\I、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV 18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS-1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2结合蛋白、亲环蛋白C相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP以及TPS。
CAR的抗原结合部分还可靶向包括但不限于以下的抗原：CD19、CD20、CD22、CD30、CD123、CD171、CS-1、ROR1、间皮素、CD33、lL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、CD7、NY-ESO-1TCR、MAGE-A3 TCR、CLL-1、GD3、BCMA、Tn Ag、PSMA、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、IL-1Ra、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、叶酸受体α、ErbB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、前列腺酶(Prostase)、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、多唾液酸、PLAC1、Globo H、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、LAGE-la、豆荚蛋白(legumain)、HPV E6、E7、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、prostein、生存素和端粒酶、PCTA-1/半乳糖凝集素8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断裂点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5以及IGLL1等。
在某些实施方案中，包含CAR的本发明的淋巴细胞可用于治疗血液癌症，尤其是用于治疗急性成淋巴细胞性白血病和/或弥漫性大B细胞淋巴瘤。在这些实施方案中，CAR的抗原结合部分可特异性地靶向CD19。
在某些实施方案中，包含CAR的本发明的淋巴细胞可用于治疗血液癌症，尤其是用于治疗难治性霍奇金淋巴瘤。在这些实施方案中，CAR的抗原结合部分可特异性地靶向CD30。
在某些实施方案中，包含CAR的本发明的淋巴细胞可用于治疗血液癌症，尤其是用于治疗急性骨髓性白血病。在这些实施方案中，CAR的抗原结合部分可特异性地靶向CD33、CD123或FLT3。
在某些实施方案中，包含CAR的本发明的淋巴细胞可用于治疗血液癌症，尤其是用于治疗多发性骨髓瘤。在这些实施方案中，CAR的抗原结合部分可特异性地靶向BCMA。
在某些实施方案中，包含在本发明的淋巴细胞中的CAR可结合两种抗原。在某些实施方案中，双特异性CAR可结合CD19和CD22或结合CD19和CD20。
通常，CAR具有不依赖靶细胞表面上的MHC分子呈递肿瘤抗原的优点。相反，在理论上，CAR可以与肿瘤细胞表面上CAR可接近的任何分子结合，前提是CAR的抗原结合结构域特异性结合抗原。因此，肿瘤抗原优选是存在于肿瘤或恶性细胞表面上的抗原。更优选地，肿瘤抗原是在肿瘤或恶性细胞表面上比在健康或非肿瘤细胞表面上丰度更大的抗原。甚至更优选地，肿瘤抗原是存在于肿瘤细胞或恶性细胞表面上但不存在于健康或非肿瘤细胞表面上的抗原。
如本文所用，关于抗原结合结构域或抗体的术语“特异性结合”是指抗原结合结构域或抗体识别特定抗原但基本上不识别或结合样品中的其他分子。例如，特异性结合来自一种物种的抗原的抗原结合结构域或抗体也可结合来自一种或多种其他物种的抗原。但是，这种跨物种反应性本身并不改变抗原结合结构域或抗体的特异性分类。在另一个实例中，特异性结合抗原的抗原结合结构域或抗体也可结合不同等位基因形式的抗原。然而，这种交叉反应性本身并不改变抗体的特异性分类。在一些情况下，术语“特异性结合”或“特异性地结合”可在提及抗原结合结构域、抗体、蛋白质或肽与第二化学物质的相互作用时用于指相互作用取决于化学物质上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗原结合结构域或抗体识别并结合特定蛋白质结构而不是一般蛋白质。如果抗原结合结构域或抗体对表位“A”具有特异性，则在含有标记的“A”和抗原结合结构域或抗体的反应中，含有表位A(或游离的未标记的A)的分子的存在将减少与抗原结合结构域或抗体结合的标记的A的量。
在另一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的淋巴细胞，其中肿瘤抗原存在于靶细胞群或组织的细胞表面上。
包含CAR的根据本发明的淋巴细胞可结合存在于靶细胞的细胞表面上的肿瘤抗原。靶细胞可以是细胞群或组织的一部分。一般来说，如果肿瘤抗原被靶细胞暴露，使得肿瘤抗原可接近CAR的抗原结合结构域，则肿瘤抗原被称为“存在于细胞表面上”。
肿瘤抗原可以是由肿瘤细胞产生的任何蛋白质，或更优选地，由肿瘤细胞产生并在所述肿瘤细胞的细胞表面上表达的蛋白质的任何部分。优选的是，肿瘤抗原是CAR的抗原结合结构域可接近的膜锚定蛋白的细胞外结构域的一部分。
然而，本发明还涵盖由另一分子特别是MHC分子呈递在靶细胞表面上的肿瘤抗原。在这种情况下，肿瘤抗原优选是衍生自蛋白质的肽。肿瘤抗原可例如衍生自由肿瘤细胞产生的蛋白质。可替代地，肿瘤抗原可衍生自先前已被肿瘤细胞(例如通过内吞作用)摄取的细胞外蛋白质。在这两种情况下，蛋白质可被靶细胞加工成肽，然后所述肽可例如被MHC分子呈递在靶细胞的表面上。
在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的淋巴细胞，其中抗原结合结构域特异性结合病毒抗原。
也就是说，根据本发明的淋巴细胞可用于治疗受试者的病毒感染。包含在本发明的淋巴细胞中的CAR可包含特异性结合病毒抗原的抗原结合结构域。病毒抗原可以是CAR可接近的病毒颗粒的任何组分，例如形成病毒的表面和/或蛋白质外壳的一部分的抗原。优选地，CAR识别的病毒抗原是来源于人免疫缺陷病毒(HIV)、腺病毒、多瘤病毒、流感病毒或人疱疹病毒的抗原，具体地，其中所述人疱疹病毒是巨细胞病毒(CMV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、单纯疱疹病毒(HSV)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)或人疱疹病毒8(HHV8)。
在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的淋巴细胞，其中CAR由多核苷酸编码并且其中编码CAR的多核苷酸与编码IRP1和/或IRP2的合成多核苷酸转录连接。
在本发明中，优选的是，CAR由整合到淋巴细胞基因组中的多核苷酸编码。更优选地，编码CAR的多核苷酸和编码IRP1和/或IRP2的多核苷酸被整合到淋巴细胞基因组的相同基因座中。更优选地，编码CAR的多核苷酸和编码IRP1和/或IRP2的多核苷酸被整合到淋巴细胞基因组的相同基因座中，使得两个或更多个多核苷酸转录连接。如果包含在两个或更多个多核苷酸中的编码序列的转录是由单个启动子驱动的，使得获得编码两种或更多种多肽的单个转录物，则两个或更多个多核苷酸被称为是转录连接的。优选地，启动子位于转录连接的编码序列或多核苷酸的上游(5’)。也就是说，编码CAR的编码序列和一个或多个编码IRP1和/或IRP2的编码序列可由单个启动子转录。
为了能够合成功能性蛋白质，编码CAR的编码序列和一个或多个编码IRP1和/或IRP2的编码序列可通过内部核糖体进入位点(IRES)分开，或可通过编码自切割肽的多核苷酸连接。
当编码CAR的编码序列和一个或多个编码IRP1和/或IRP2的编码序列通过IRES分开时，转录物中包含的每个编码序列被独立地翻译。然而，如果编码CAR的编码序列和一个或多个编码IRP1和/或IRP2的编码序列通过自切割肽连接，则整个转录物被翻译成多蛋白，其接着在翻译期间或之后通过自动切割而切割成单一蛋白质。
在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的淋巴细胞，其中编码CAR的多核苷酸和编码IRP1和/或IRP2的合成多核苷酸通过编码自切割肽的多核苷酸连接。
如本文所用，术语“自切割肽”是指与在肽序列本身内的两个氨基酸残基之间发生的切割活动相关的肽序列。例如，在2A/2B肽或2A/2B样肽中，切割发生在2A肽上的甘氨酸残基与2B肽上的脯氨酸残基之间。这通过翻译过程中的“核糖体跳跃机制”发生，其中2A/2B肽的2A甘氨酸残基与2B脯氨酸残基之间的正常肽键形成受损，而不影响2B肽的其余部分的翻译。此类核糖体跳跃机制在本领域中是众所周知的并且已知被若干病毒用于表达由单个信使RNA编码的若干蛋白质。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的淋巴细胞，其中自切割肽是2A自切割肽。
在一个优选实施方案中，本发明涉及根据本发明的淋巴细胞，其中自切割肽是T2A。T2A是一种自切割肽，其包含肽序列EGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO:7)。
当两个编码序列通过编码自切割肽的多核苷酸连接时，应理解，编码第一多肽的编码序列、编码自切割肽的编码序列和编码第二多肽的编码序列在同一阅读框中编码。
在本发明中，优选的是，编码CAR的多核苷酸和一个或多个编码IRP1和/或IRP2的多核苷酸在相同的合成多核苷酸上编码。在某些实施方案中，编码CAR、IRP1和/或IRP2的合成多核苷酸已通过病毒转导整合到淋巴细胞的基因组中。在某些实施方案中，合成多核苷酸中包含的编码CAR的多核苷酸和编码IRP1的多核苷酸通过IRES分开。在另一个实施方案中，合成多核苷酸中包含的编码CAR的多核苷酸和编码IRP2的多核苷酸通过IRES分开。在其他实施方案中，包含在合成多核苷酸中的编码CAR的多核苷酸和编码IRP1的多核苷酸通过编码自切割肽，特别是2A自切割肽，特别是T2A的多核苷酸连接。在其他实施方案中，包含在合成多核苷酸中的编码CAR的多核苷酸和编码IRP2的多核苷酸通过编码自切割肽，特别是2A自切割肽，特别是T2A的多核苷酸连接。
在某些实施方案中，编码CAR、IRP1和/或IRP2的合成多核苷酸处于组成型启动子的控制下。在某些实施方案中，启动子是合成多核苷酸的一部分。在某些实施方案中，组成型启动子是EF-1α启动子。然而，应当理解，本领域技术人员知道可代替启动子EF-1α使用的广泛多种启动子。此外，应当理解，实施例10仅代表概念证明并且可通过优化CAR和/或IRP1/2在淋巴细胞中的表达来实现淋巴细胞更有效的体内增殖。
在某些实施方案中，合成多核苷酸具有以下结构：5’-CAR-自切割肽-IRP1-3’。在其他实施方案中，合成多核苷酸具有以下结构：5'-CAR-自切割肽-IRP2-3'。在其他实施方案中，合成多核苷酸具有以下结构：5'-组成型启动子-CAR-自切割肽-IRP1-3'。在其他实施方案中，合成多核苷酸具有以下结构：5'-组成型启动子-CAR-自切割肽-IRP2-3'。在其他实施方案中，合成多核苷酸具有以下结构：5'-组成型启动子-CAR-T2A-IRP1-3'。在其他实施方案中，合成多核苷酸具有以下结构：5’-组成型启动子-CAR-T2A-IRP2-3’。
在某些实施方案中，合成多核苷酸具有以下结构：5’-IRP1-自切割肽-CAR-3’。在其他实施方案中，合成多核苷酸具有以下结构：5’-IRP2-自切割肽-CAR-3’。在其他实施方案中，合成多核苷酸具有以下结构：5’-组成型启动子-IRP1-自切割肽-CAR-3’。在其他实施方案中，合成多核苷酸具有以下结构：5’-组成型启动子-IRP2-自切割肽-CAR-3’。在其他实施方案中，合成多核苷酸具有以下结构：5’-组成型启动子-IRP1-T2A-CAR-3’。在其他实施方案中，合成多核苷酸具有以下结构：5’-组成型启动子-IRP2-T2A-CAR-3’。在其他实施方案中，合成多核苷酸具有以下结构：5’-组成型启动子-IRP1-P2A-CAR-3’。在其他实施方案中，合成多核苷酸具有以下结构：5’-组成型启动子-IRP2-P2A-CAR-3’。在其他实施方案中，合成多核苷酸具有以下结构：5’-组成型启动子-IRP1-E2A-CAR-3’。在其他实施方案中，合成多核苷酸具有以下结构：5’-组成型启动子-IRP2-E2A-CAR-3’。在其他实施方案中，合成多核苷酸具有以下结构：5’-组成型启动子-IRP1-F2A-CAR-3’。在其他实施方案中，合成多核苷酸具有以下结构：5’-组成型启动子-IRP2-F2A-CAR-3’。
然而，应当理解，本发明还涵盖淋巴细胞，其中编码IRP1和/或IRP2的第一多核苷酸和编码CAR的第二多核苷酸整合到淋巴细胞基因组的不同位置并独立表达。优选地，编码IRP1和/或IRP2的多核苷酸和编码CAR的多核苷酸通过两个独立的病毒转导事件整合到淋巴细胞的基因组中。两个独立的病毒转导事件可同时发生或可以逐步方式发生。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种病毒载体，其包含编码IRP1(SEQ ID NO:1)和/或IRP2(SEQ ID NO:2-6)的至少一个多核苷酸。
也就是说，本发明还涉及可用于将铁调节蛋白整合到细胞，优选淋巴细胞中的病毒载体。病毒载体可以是适合将多核苷酸整合到细胞，优选淋巴细胞中的任何病毒载体。因此，在某些实施方案中，本发明涉及根据本发明的病毒载体，其中病毒载体来源于慢病毒、腺相关病毒(AAV)、腺病毒、单纯疱疹病毒、逆转录病毒、甲病毒、黄病毒、弹状病毒、麻疹病毒、新城疫病毒或痘病毒。在一个优选实施方案中，本发明涉及根据本发明的病毒载体，其中病毒载体来源于慢病毒或腺相关病毒(AAV)。在一个更优选的实施方案中，本发明涉及根据本发明的病毒载体，其中病毒载体来源于慢病毒。
病毒载体可包含一种或多种转基因。如本文所用，术语“转基因”是指编码待在细胞中表达的多肽或多肽的一部分的特定核酸序列，所述核酸序列插入所述细胞中。术语转基因意在包括(1)非天然存在于细胞中的核酸序列(即，异源核酸序列，诸如编码CAR的核酸)；(2)核酸序列，其为在其已被引入的细胞中天然存在的核酸序列的突变形式；(3)用于添加另外拷贝的其自身(即，同源)或在其已被引入的细胞中天然存在的类似核酸序列的核酸序列(诸如IRP1和/或IRP2；或(4)沉默的天然存在的或同源的核酸序列，其表达在其已被引入的细胞中被诱导。突变形式是指含有一个或多个不同于野生型或天然存在的序列的核苷酸的核酸序列，即突变核酸序列含有一个或多个核苷酸取代、缺失和/或插入。在一些情况下，转基因还可包括编码前导肽或信号序列的序列，使得转基因产物将从细胞中分泌出来。
包含在根据本发明的淋巴细胞中的编码IRP1和/或IRP2以及任选的启动子和/或CAR的合成多核苷酸可优选地通过病毒转导整合到淋巴细胞中。因此，应当理解，已经公开用于根据本发明的淋巴细胞的合成多核苷酸也可包含在根据本发明的病毒载体中。
在某些实施方案中，病毒载体包含单个转基因。例如，在某些实施方案中，病毒载体包含编码IRP1(SEQ ID NO:1)的多核苷酸。在其他实施方案中，病毒载体包含编码IRP2(SEQ ID NO:2)的多核苷酸。在其他实施方案中，病毒载体包含编码IRP2(SEQ ID NO:3)的多核苷酸。在其他实施方案中，病毒载体包含编码IRP2(SEQ ID NO:4)的多核苷酸。在其他实施方案中，病毒载体包含编码IRP2(SEQ ID NO:5)的多核苷酸。在其他实施方案中，病毒载体包含编码IRP2(SEQ ID NO:6)的多核苷酸。优选地，病毒载体包含编码IRP2(SEQ IDNO:2)的多核苷酸。
在某些实施方案中，病毒载体可包含多于一种转基因。例如，病毒载体可包含两个或更多个编码IRP1(SEQ ID NO:1)以及IRP2(SEQ ID NOs:2-6)的一种或多种同种型的多核苷酸。在另一个实施方案中，病毒载体可包含两个或多个编码IRP2(SEQ ID NOs:2-6)的两种或更多种同种型的多核苷酸。
此外，病毒载体可包含一个或多个编码IRP1和/或IRP2的多核苷酸以及另一编码CAR的多核苷酸。因此，在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的病毒载体，其中病毒载体包含另一编码CAR的多核苷酸。因此，病毒载体可用于将编码CAR的多核苷酸和至少一个编码IRP1和/或IRP2的多核苷酸同时整合到细胞，优选淋巴细胞中。
在某些实施方案中，本发明涉及根据本发明的病毒载体，其中编码CAR的多核苷酸与一个或多个编码IRP1和/或IRP2的多核苷酸转录连接。编码CAR的多核苷酸和一个或多个多编码IRP1和/或IRP2的核苷酸可如上所述转录连接。也就是说，编码CAR的多核苷酸和一个或多个编码IRP1和/或IRP2的多核苷酸可处于共同启动子的控制下。
如本文所述，编码CAR的多核苷酸和一个或多个编码IRP1和/或IRP2的多核苷酸可通过一种或多种IRES分开，或可通过一个或多个编码自切割肽的多核苷酸连接。
在某些实施方案中，本发明涉及根据本发明的病毒载体，其中编码CAR的多核苷酸和一个或多个编码IRP1和/或IRP2的多核苷酸通过编码自切割肽的多核苷酸连接。
在某些实施方案中，本发明涉及根据本发明的病毒载体，其中自切割肽是2A自切割肽。
在某些实施方案中，本发明涉及根据本发明的病毒载体，其中自切割肽是T2A。
在另一个实施方案中，病毒载体还可包含控制一个或多个编码CAR和IRP1和/或IRP2的多核苷酸的表达的启动子。因此，在另一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的病毒载体，其中至少一个编码IRP1和/或IRP2以及任选地CAR的多核苷酸处于启动子的控制下。启动子可以是组成型启动子或诱导型启动子，例如本文别处指定的组成型或诱导型启动子中的一种。优选地，启动子是组成型启动子，诸如启动子EF-1α。因此，在某个实施方案中，本发明涉及根据本发明的病毒载体，其中组成型启动子是EF-1α启动子。
在某些实施方案中，病毒载体可包含具有以下结构的多核苷酸：5’-CAR-自切割肽-IRP1-3’。在其他实施方案中，病毒载体可包含具有以下结构的多核苷酸：5'-CAR-自切割肽-IRP2-3'。在其他实施方案中，病毒载体可包含具有以下结构的多核苷酸：5'-组成型启动子-CAR-自切割肽-IRP1-3'。在其他实施方案中，病毒载体可包含具有以下结构的多核苷酸：5'-组成型启动子-CAR-自切割肽-IRP2-3'。在其他实施方案中，病毒载体可包含具有以下结构的多核苷酸：5'-组成型启动子-CAR-T2A-IRP1-3'。在其他实施方案中，病毒载体可包含具有以下结构的多核苷酸：5’-组成型启动子-CAR-T2A-IRP2-3’。在其他实施方案中，病毒载体可包含具有以下结构的多核苷酸：5’-组成型启动子-CAR-P2A-IRP1-3’。在其他实施方案中，病毒载体可包含具有以下结构的多核苷酸：5’-组成型启动子-CAR-P2A-IRP2-3’。在其他实施方案中，病毒载体可包含具有以下结构的多核苷酸：5’-组成型启动子-CAR-E2A-IRP1-3’。在其他实施方案中，病毒载体可包含具有以下结构的多核苷酸：5’-组成型启动子-CAR-E2A-IRP2-3’。在其他实施方案中，病毒载体可包含具有以下结构的多核苷酸：5’-组成型启动子-CAR-F2A-IRP1-3’。在其他实施方案中，病毒载体可包含具有以下结构的多核苷酸：5’-组成型启动子-CAR-F2A-IRP2-3’。
在某些实施方案中，病毒载体可包含具有以下结构的多核苷酸：5’-IRP1-自切割肽-CAR-3’。在其他实施方案中，病毒载体可包含具有以下结构的多核苷酸：5’-IRP2-自切割肽-CAR-3’。在其他实施方案中，病毒载体可包含具有以下结构的多核苷酸：5’-组成型启动子-IRP1-自切割肽-CAR-3’。在其他实施方案中，病毒载体可包含具有以下结构的多核苷酸：5’-组成型启动子-IRP2-自切割肽-CAR-3’。在其他实施方案中，病毒载体可包含具有以下结构的多核苷酸：5’-组成型启动子-IRP1-T2A-CAR-3’。在其他实施方案中，病毒载体可包含具有以下结构的多核苷酸：5’-组成型启动子-IRP2-T2A-CAR-3’。在其他实施方案中，病毒载体可包含具有以下结构的多核苷酸：5’-组成型启动子-IRP1-P2A-CAR-3’。在其他实施方案中，病毒载体可包含具有以下结构的多核苷酸：5’-组成型启动子-IRP2-P2A-CAR-3’。在其他实施方案中，病毒载体可包含具有以下结构的多核苷酸：5’-组成型启动子-IRP1-E2A-CAR-3’。在其他实施方案中，病毒载体可包含具有以下结构的多核苷酸：5’-组成型启动子-IRP2-E2A-CAR-3’。在其他实施方案中，病毒载体可包含具有以下结构的多核苷酸：5’-组成型启动子-IRP1-F2A-CAR-3’。在其他实施方案中，病毒载体可包含具有以下结构的多核苷酸：5’-组成型启动子-IRP2-F2A-CAR-3’。
技术人员知道将转基因和/或调节元件诸如启动子引入病毒载体中的分子生物学方法。
在一个实施方案中，本发明涉及一种药物组合物，其包含根据本发明的淋巴细胞和药学上可接受的载剂。
本发明的淋巴细胞可单独施用，或作为包含本发明的淋巴细胞的药物组合物施用。简单来说，本发明的药物组合物可包含如本文所述的淋巴细胞或淋巴细胞群与一种或多种药学上或生理学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂组合。此类组合物可包含缓冲液，诸如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露糖醇；蛋白质；多肽或氨基酸，诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；以及防腐剂。根据本发明的药物组合物可与稀释剂和/或其他组分诸如IL-2或其他细胞因子或细胞群组合施用。本发明的组合物优选配制用于静脉内施用。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种药物组合物，其包含根据本发明的病毒载体和药学上可接受的载剂。
在某些实施方案中，考虑通过直接引入载体来直接治疗受试者。病毒载体组合物可配制用于通过任何可用途径递送，包括但不限于肠胃外(例如静脉内)、皮内、皮下、口服(例如，吸入)、透皮(局部)、经粘膜、直肠和阴道。常用的递送途径包括吸入、肠胃外和经粘膜。
在某些实施方案中，根据本发明的药物组合物可包含根据本发明的包含编码至少一种铁调节蛋白的多核苷酸的病毒载体和包含编码CAR的多核苷酸的第二病毒载体。也就是说，编码一种或多种铁调节蛋白的一个或多个多核苷酸和编码CAR的多核苷酸可位于两个单独的病毒载体上，但可包含在相同的药物组合物中。
在各种实施方案中，药物组合物可以包含病毒载体与药学上可接受的载剂组合。如本文所用，语言“药学上可接受的载剂”包括与药物施用相容的溶剂、分散介质、涂层、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。补充的活性化合物也可以掺入组合物中。
在一些实施方案中，活性剂，即本文所述的病毒载体和/或将与载体一起施用的其他剂，与将保护化合物免于从体内快速消除的载剂一起制备，诸如控释制剂，包括植入物和微胶囊化递送系统。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，诸如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备此类组合物的方法对本领域技术人员来说将是显而易见的。合适的材料也可以从Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals,Inc.商购获得。脂质体也可以用作药学上可接受的载剂。这些可以根据本领域技术人员已知的方法来制备，例如，如美国专利号4,522,811中所描述。在一些实施方案中，组合物靶向特定细胞类型或被病毒感染的细胞。例如，可以使用针对细胞表面标志物(例如，在感染细胞的表面上表达的内源性标志物或病毒抗原)的单克隆抗体靶向组合物。
以易于施用和实现剂量均匀性的剂量单位形式配制组合物是有利的。如本文所用的剂量单位形式是指适合用作用于待治疗受试者的单位剂量的物理离散单位；每个单位包含计算用于产生期望治疗效果的预先确定量的病毒载体以及药物载剂。
单位剂量不必须作为单次注射施用，但可包含经设定时间段的连续输注。本文所述的病毒载体的单位剂量可便利地以病毒载体的转导单位(T.U.)进行描述，如通过在细胞系诸如HeLa或293上滴定载体所定义的。在某些实施方案中，单位剂量可以在103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013T.U.和更高的范围内。
药物组合物可以根据需要以不同的间隔并在不同的时间段内施用，例如每周一次，持续约1至约10周之间；约2至约8周之间；约3至约7周之间；约4周；约5周；约6周等。可能需要无限期地施用治疗组合物。技术人员将认识到，某些因素可以影响有效治疗受试者所需的剂量和时间，包括但不限于疾病或病症的严重程度、先前的治疗、受试者的一般健康状况和/或年龄，以及存在的其他疾病。用病毒载体治疗受试者可以包括单一治疗，或在许多情况下可以包括一系列治疗。
用于施用病毒载体的示例性剂量和用于确定合适剂量的方法是本领域已知的。还应理解，病毒载体的适当剂量可取决于特定的受者和施用方式。针对任何特定受试者的适当剂量水平可取决于多种因素，包括受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食、施用时间、施用途径、排泄率、其他施用的治疗剂等。
在某些实施方案中，病毒载体可以通过例如静脉内注射、局部施用或通过立体定向注射递送给受试者(参见，例如，Chen等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:3054)。在某些实施方案中，载体可口服或通过吸入递送，并且可被封装或以其他方式操纵以保护其免于降解、增强组织或细胞的摄取等。药物制剂可以包括处于可接受的稀释剂中的病毒载体，或可以包括其中嵌入病毒载体的缓释基质。可替代地或另外地，当载体可以从重组细胞完整产生时，如逆转录病毒或慢病毒载体的情况，药物制剂可以包括一种或多种产生载体的细胞。包含本文所述的病毒载体的药物组合物可以包括在容器、包装或分配器中，任选地与施用说明书一起。
前述组合物、方法和用途旨在为例示性而非限制性的。通过使用本文提供的教导，本领域技术人员将容易获得关于组合物、方法和用途的其他变型。
在另一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的淋巴细胞、根据本发明的病毒载体或根据本发明的药物组合物，其用于在治疗中使用。
也就是说，根据本发明的淋巴细胞、根据本发明的病毒载体或根据本发明的包含淋巴细胞和/或病毒载体的药物组合物可用于治疗。
在某些实施方案中，本发明涉及根据本发明的淋巴细胞、根据本发明的病毒载体或根据本发明的药物组合物，其用于治疗癌症。
本发明提供了如本发明所定义的CAR将淋巴细胞(例如T细胞或NK细胞)的特异性重定向至肿瘤抗原的用途。本文公开了一种类型的细胞治疗，其中淋巴细胞被遗传修饰以表达至少一种IRP和CAR，其中将所得细胞输注到有需要的受者体内。输注的细胞能够杀伤受者体内的肿瘤细胞。与抗体治疗不同，根据本发明的淋巴细胞能够在体内复制，从而造成长期持续性，这可以导致持续的肿瘤控制。
由于至少一种IRP的过表达，本文所述的淋巴细胞可以经历稳健的体内扩增，并且可以持续延长的时间。不受任何特定理论的束缚，由本发明的淋巴细胞引发的抗肿瘤免疫应答可以是主动或被动的免疫应答。此外，CAR介导的免疫应答可以是过继性免疫治疗方法的一部分，其中CAR修饰的淋巴细胞诱导对CAR中的抗原结合部分具有特异性的免疫应答。
虽然表达至少一种IRP和CAR的淋巴细胞优选用于治疗癌症，但也可通过仅表达至少一种IRP但不表达CAR的淋巴细胞来设想。在这种情况下，可将编码至少一种IRP的合成多核苷酸离体引入淋巴细胞中，并且接着可将基因工程化的淋巴细胞施用于患有癌症的受试者。任选地，可用肿瘤抗原离体刺激淋巴细胞以增加对某种类型的癌症或肿瘤的特异性。在某些实施方案中，可将表达至少一种IRP的基因工程化的淋巴细胞直接注射到肿瘤中。
然而，应当理解，本发明还涵盖过表达IRP1和/或IRP2但不过表达CAR的淋巴细胞在癌症治疗中的用途。
例如，可在TIL或TCR修饰的T细胞中过表达IRP1和/或IRP2，所述细胞随后用于细胞治疗。发明人已经证明，IRP在淋巴细胞中的过表达导致淋巴细胞更稳健的增殖。因此，在TIL或TCR修饰的T细胞中过表达IRP产生更有效的细胞治疗是合理的。
此外，可在NK细胞中过表达IRP1和/或IRP2，所述细胞随后用于细胞治疗。在某些实施方案中，NK细胞是同种异体NK细胞。
“治疗”疾病，如该术语在本文所用，是指降低受试者所经历的疾病或病症的至少一种体征或症状的频率或严重程度。
“疾病”是动物(包括人)的健康状态，其中动物不能维持内稳态，并且其中如果疾病没有得到改善，那么动物的健康会继续恶化。相反，动物中的“病症”是这样一种健康状态：其中动物能够维持内稳态，但动物的健康状态没有不存在该病症时的健康状态好。如果不进行治疗，病症不一定导致动物的健康状态进一步下降。
术语“患者”、“受试者”、“个体”等在本文中可互换使用，并且是指适用于本文所述方法的任何动物或其细胞，无论是体外还是原位。在某些非限制性实施方案中，患者、受试者或个体是人。
如本文所用，术语“癌症”定义为通过异常细胞的快速且不受控制的生长进行表征的疾病。癌细胞可以在局部或通过血流和淋巴系统扩散到身体的其他部位。
可使用根据本发明的淋巴细胞治疗的癌症包括没有血管化或基本上尚未血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。癌症可包括非实体肿瘤(诸如血液系统肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括实体肿瘤。待使用本发明的淋巴细胞治疗的癌症类型包括但不限于癌、母细胞瘤和肉瘤，以及某些白血病或淋巴系统恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤，以及恶性肿瘤，例如肉瘤、癌和黑色素瘤。成人肿瘤/癌症和小儿肿瘤/癌症也包括在内。
在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明所述所使用的淋巴细胞、病毒载体或药物组合物，其中癌症是血液系统癌症或实体肿瘤。在一个具体实施方案中，血液系统癌症是急性成淋巴细胞性白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血病或多发性骨髓瘤并且实体肿瘤是结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、肝细胞癌、肺癌、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤或肉瘤。
血液系统癌症是血液或骨髓的癌症。血液系统(或血源性)癌症的实例包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、急性髓性白血病以及成髓细胞性、早幼粒细胞性、粒单核细胞性、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病、慢性髓性白血病和慢性淋巴细胞性白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤(惰性和高级形式)、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症、重链病、骨髓增生异常综合征、毛细胞白血病以及骨髓发育不良。
实体肿瘤是组织的异常包块，通常不包含囊肿或液体区域。实体肿瘤可以是良性的或恶性的。不同类型的实体肿瘤以形成它们的细胞类型命名(诸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体肿瘤(诸如肉瘤和癌)的实例包括纤维肉瘤、肌肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤和其他肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、甲状腺乳头状癌、嗜铬细胞瘤、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、维尔姆斯瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑色素瘤和CNS肿瘤(诸如胶质瘤(诸如脑干胶质瘤和混合胶质瘤)、胶质母细胞瘤(也称为多形性胶质母细胞瘤)星形细胞瘤、CNS淋巴瘤、生殖细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经鞘瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤(menangioma)、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤和脑转移瘤)。
本发明的淋巴细胞可设计成靶向CD19并可用于治疗癌症和病症，包括但不限于pre-B ALL(小儿适应症)、成人ALL、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、抢救后同种异体骨髓移植等。
本文所述的CAR修饰的淋巴细胞也可用作一种疫苗，以用于受试者的离体免疫和/或体内治疗。优选地，受试者是人。
关于离体免疫，在将淋巴细胞施用给受试者之前在体外发生以下各项中的至少一种：i)细胞的扩增，ii)将至少一个编码至少一种IRP和/或CAR的合成核苷酸引入细胞中，和/或iii)细胞的冷冻保存。
离体程序在本领域中是众所周知的。简单来说，从受试者(优选人)中分离淋巴细胞并用本文公开的表达至少一种IRP和/或CAR的至少一种载体进行基因修饰(即，体外转导或转染)。可将表达至少一种IRP的CAR修饰的细胞施用给受者以提供治疗益处。受者可以是人并且修饰的淋巴细胞相对于受者来说可以是自体的。可替代地，淋巴细胞相对于受者来说可以是同种异体的、同系的或异种的。
可将美国专利号5,199,942中描述的造血干细胞和祖细胞的离体扩增程序应用于本发明的细胞。其他合适的方法是本领域已知的，因此本发明不限于任何特定的细胞离体扩增方法。简单来说，淋巴细胞的离体培养和扩增包括：(1)从哺乳动物的外周血收获物或骨髓外植物中收集CD34+造血干细胞和祖细胞；以及(2)离体扩增此类细胞。除了美国专利号5,199,942中描述的细胞生长因子之外，诸如flt3-L、IL-1、IL-3和c-kit配体的其他因子可用于细胞的培养和扩增。
除了在离体免疫方面使用基于细胞的疫苗之外，本公开还提供了用于体内免疫以在患者体内引发针对抗原的免疫应答的组合物和方法。
通常，如本文所述活化和扩增的淋巴细胞可用于治疗和预防在免疫功能不全的个体中出现的疾病。具体地，本文所述的CAR修饰的淋巴细胞可用于治疗慢性淋巴细胞性白血病(CCL)。在某些实施方案中，本文所述的淋巴细胞可用于治疗有发展CCL风险的患者。因此，本公开提供了CCL的治疗或预防，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本发明的淋巴细胞。
可替代地，用于治疗癌症的淋巴细胞可以是NK细胞、TIL或TCR修饰的淋巴细胞。NK细胞、TIL或TCR修饰的T细胞可使用本发明的方法进行修饰，使得它们过表达IRP1和/或IRP2，这可导致NK细胞、TIL或TCR修饰的T细胞在体内更有效地增殖。
在癌症治疗中使用的NK细胞可以是同种异体的NK细胞，因为同种异体NK细胞具有移植物抗白血病/肿瘤(GvL/GvT)作用，而不引起移植物抗宿主病(GvHD)，因此引起的免疫病理学较少。
用于癌症治疗的TIL可如WO 2018/182817中所述获得，并且可通过引入编码至少一种IRP的至少一个多核苷酸进一步修饰。
在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的淋巴细胞、根据本发明的病毒载体或根据本发明的药物组合物，其用于预防和/或治疗病毒感染。
也就是说，根据本发明的淋巴细胞也可用于预防和治疗病毒感染。已知病毒特异性T细胞可以用于预防或治疗病毒感染，例如但不限于在接受造血干细胞移植的受试者中。病毒特异性T细胞可通过用病毒抗原刺激和扩增T细胞来产生，例如展示病毒抗原肽、完整病毒颗粒、病毒裂解物、完整病毒蛋白或病毒载体的抗原呈递细胞。可替代地，可通过表达已知结合特定病毒抗原的天然或工程化的T细胞受体来产生病毒特异性T细胞。然后可将得到的病毒特异性T细胞施用给患有病毒感染或有获得病毒感染风险的受试者。
在病毒特异性T细胞中表达至少一种IRP，从而产生假性缺铁状态，可得到在将病毒特异性T细胞施用给受试者后更稳健地增殖的病毒特异性T细胞。因此，与非基因工程化的病毒特异性T细胞相比，经过基因工程化以表达至少一种IRP的病毒特异性T细胞在预防或治疗病毒感染方面可能更有效。可在用病毒抗原刺激T细胞之前、期间或之后将编码至少一种IRP的合成多核苷酸引入T细胞中。
如上所述的病毒感染的预防和治疗不一定需要CAR的存在。然而，使用根据本发明的还包含CAR的淋巴细胞至少在一些情况下可改善淋巴细胞对病毒的识别。在这种情况下，CAR可优选地包含特异性结合病毒抗原的抗原结合结构域。
在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明所述用途的淋巴细胞、病毒载体或药物组合物，其中病毒感染是由人免疫缺陷病毒(HIV)、腺病毒、多瘤病毒、流感病毒或人疱疹病毒引起的，具体地，其中人疱疹病毒是巨细胞病毒(CMV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、单纯疱疹病毒(HSV)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)或人疱疹病毒8(HHV8)。
人巨细胞病毒是普遍存在的β疱疹病毒，在一般人群中的流行率为50-100％。虽然它在免疫功能正常的宿主中可能表现为轻微的自限性疾病，但CMV在免疫功能不全的宿主中可引起严重的危及生命的疾病。由于CMV在急性感染后以潜伏形式持续存在，因此CMV特异性CD4+和CD8+T细胞是维持病毒静止所必需的。在HSCT后患者中，在缺乏供体免疫情况下和在其他免疫缺陷状态下，CMV可以视网膜炎、局限性肺炎(pneumonitis)、肝炎或小肠结肠炎的形式再激活。CMV特异性T细胞的过继性转移是用于治疗和预防此类个体的CMV再激活的合理策略，并且许多临床试验证实了病毒特异性T细胞的总体优异功效。由脐带血(UCB)中的幼稚T细胞产生的CMV特异性VST也已被证明是有效的。这些VST在保持功能性的同时显示出对非典型表位的特异性。
EBV是普遍存在的、高度免疫原性的γ-疱疹病毒，其可以在移植后引起独特的并发症。超过90％的一般人群已被感染并保持终生血清阳性。原发性EBV感染的表现差别很大，从无症状感染到使人虚弱的病毒性疾病。此后，在大多数情况下，EBV在持续的T细胞免疫监视下终生潜伏在B细胞和粘膜上皮贮库中。在这些健康个体中，最多至2％的循环T细胞是EBV特异性的。在HSCT之后的免疫缺陷期，EBV再激活可导致病毒血症和危及生命的移植后淋巴组织增生性疾病(PTLD)。虽然单克隆抗体利妥昔单抗通过消除其中驻留EBV病毒的B细胞成功地治疗了许多患者的严重EBV疾病，但它导致抗体产生长期减少，并且在控制PTLD方面并不总是成功。
腺病毒感染范围可以从轻度上呼吸道感染到一连串危及生命的肺炎、胃肠、肝、肾和神经系统并发症。感染后，在淋巴组织中保持潜伏，但病毒可以在长期缺乏T细胞免疫期间再激活。腺病毒在HSCT后的受者中导致可能致命的病毒并发症。诸如利巴韦林的抗病毒药物在很大程度上是无效的。然而，从健康供体产生的腺病毒特异性T细胞已被证明有效治疗甚至晚期疾病。出于这个原因，腺病毒抗原通常被结合到多病毒特异性T细胞产物的产生中。
在大多数成人个体的健康组织中通常潜伏的BK和JC多瘤病毒在HSCT后和在免疫缺陷个体中再激活。BK病毒可表现为肾病和危及生命的出血性膀胱炎(HC)。在极少数情况下，密切相关的JC病毒导致由进行性多灶性脑白质病造成的致命脑损伤。正在开发多瘤病毒特异性VST来对抗这些病毒。一个病例报告描述了BK VST的成功使用，在其之后患者的HC完全消退，没有旁器官毒性(bystander organ toxicity)、GVHD或移植物排斥。很明显，针对离体选择和扩增的VST开发的平台很容易地适应于许多其他使免疫缺陷状态复杂化的病毒，并且未来的开发包括开发VST以靶向包括VZV、HHV以及甚至HIV或流感在内的一系列病毒。
在一个实施方案中，本发明涉及一种用于治疗患有癌症的受试者或用于预防和/或治疗受试者的病毒感染的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的根据本发明的淋巴细胞、根据本发明的病毒载体或根据本发明的药物组合物。
本文所述的淋巴细胞或药物组合物可以适合待治疗(或预防)疾病的方式施用。施用的量和频率将通过诸如患者的病状以及患者疾病的类型和严重程度等因素进行确定，但适当的剂量可通过临床试验确定。
如本文所用，“有效量”是指提供治疗或预防有益效果的量。术语“治疗有效量”是指由研究人员、兽医、医生或其他临床医生所寻求的将引发组织、系统或受试者的生物学或医学应答的主题化合物的量。术语“治疗有效量”包括在施用时足以防止正在治疗的病症或疾病的一种或多种体征或症状的发展或在一定程度上减轻所述体征或症状的化合物的量。治疗有效量将根据化合物、疾病及其严重程度以及待治疗的受试者的年龄、体重等而变化。
当指明“免疫有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明的淋巴细胞或组合物的精确量可由医生在考虑到患者(受试者)的年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移的程度、病毒感染的类型、病毒感染的严重程度和/或状况方面的个体差异的情况下确定。一般来说，可以104至109个细胞/kg体重，优选地105至106个细胞/kg体重(包括那些范围内的所有整数值)的剂量施用包含本文所述的淋巴细胞的药物组合物。淋巴细胞组合物也可以这些剂量多次施用。淋巴细胞可通过使用免疫治疗中通常已知的输注技术来施用(Rosenberg等人,1988,New Eng.J.of Med；319:1676.)。医学领域的熟练技术人员可通过监测患者的病征并且相应地调整治疗容易地确定针对特定患者的最佳剂量和治疗方案。
可能期望将活化的淋巴细胞施用给受试者，然后再抽血(或进行单采术)，根据本发明活化来自其中的淋巴细胞，并将这些活化并扩增的淋巴细胞回输给患者。这个过程可以每隔几周多次进行。可从10mL至400mL的抽血中活化淋巴细胞，例如，可从20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL或100mL的抽血中活化淋巴细胞。不受理论的束缚，使用这种多次抽血/多次回输方案可用于选择某些淋巴细胞群。
淋巴细胞或组合物的施用可以任何便利的方式进行，包括通过气溶胶吸入、注射、摄入、输液、植入或移植。本文所述的淋巴细胞或组合物可皮下、皮内、肿瘤内、结节内、髓内、肌内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给受试者。例如，本文所述的淋巴细胞或组合物可通过皮内或皮下注射施用给患者。在另一个实例中，本文所述的淋巴细胞或组合物可优选通过静脉内注射施用。淋巴细胞或组合物可直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位。
在某些情况下，使用本文所述的方法或本领域已知的将淋巴细胞扩增至治疗水平的其他方法激活和扩增的淋巴细胞与任何数量的相关治疗方式一起(例如，在其之前、同时或之后)施用给患者，所述相关治疗方式包括但不限于使用诸如抗病毒治疗、西多福韦(cidofovir)和白细胞介素2、利巴韦林、利妥昔单抗、阿糖胞苷(也称为ARA-C)的药剂进行的治疗或用于MS患者的那他珠单抗治疗或用于银屑病患者的依法利珠单抗(efalizumab)治疗或用于PML患者的其他治疗。本文还公开了，本发明的淋巴细胞可与以下各项组合使用：化学治疗、放射、免疫抑制剂诸如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和FK506、抗体或其他免疫消融剂诸如CAMPATH、抗CD3抗体或其他抗体治疗、细胞毒素、氟达利滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228、细胞因子和辐照。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调磷酸酶(环孢霉素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导很重要的p70S6激酶(雷帕霉素)(Liu等人,1991,Cell；66:807-815；Henderson等人,1991,Immun；73:316-321；Bierer等人,1993,Curr.Opin.Immun；5:763-773)。本文还公开，本发明的淋巴细胞或组合物可与以下各项结合(例如，在其之前、同时或之后)施用给患者：骨髓移植、使用化疗剂(诸如氟达拉滨(fludarabine)、外束放射治疗(XRT)、环磷酰胺)或抗体(诸如OKT3或CAMPATH)的T细胞消融治疗。本文还描述了本发明的淋巴细胞或组合物可在B细胞消融治疗诸如与CD20反应的药剂(例如美罗华(Rituxan))之后施用。例如，受试者可进行高剂量化疗的标准治疗，然后进行外周血干细胞移植。在某些情况下，在移植后，受试者可接受本发明的扩增免疫细胞的输注，或在手术之前或之后施用扩增的细胞。
待施用给受试者的以上治疗的剂量将随所治疗病状的确切性质和治疗的受者而变化。可根据本领域公认的实践来进行人施用剂量的调整。
在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的方法，其中癌症是血液系统癌症或实体肿瘤，具体地，其中血液系统癌症是急性成淋巴细胞性白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血病和多发性骨髓瘤，或其中实体肿瘤是结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、肝细胞癌、肺癌、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤和肉瘤。
在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的方法，其中病毒感染是由人免疫缺陷病毒(HIV)、腺病毒、多瘤病毒、流感病毒或人疱疹病毒引起的，具体地，其中人疱疹病毒是巨细胞病毒(CMV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、单纯疱疹病毒(HSV)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)或人疱疹病毒8(HHV8)。
在一个实施方案中，本发明涉及一种用于产生根据本发明的淋巴细胞的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供从受试者获得的淋巴细胞；b)将编码至少一种铁调节蛋白的合成多核苷酸引入步骤(a)的淋巴细胞中，其中铁调节蛋白是IRP1(SEQ ID NO:1)和/或IRP2(SEQ ID NO:2-6)以及c)表达由已在步骤(b)中引入淋巴细胞中的合成多核苷酸编码的至少一种铁调节蛋白。应当理解，淋巴细胞可以是本文公开的任何淋巴细胞。
任选地，本发明还涉及根据本发明的方法，其中在步骤(b)中将编码嵌合抗原受体(CAR)的第二合成多核苷酸引入淋巴细胞中。
也就是说，根据本发明的方法可用于产生过表达IRP1和/或IRP2的淋巴细胞。此外，根据本发明的方法可用于产生包含两种合成多核苷酸(即编码IRP1和/或IRP2的第一合成多核苷酸和编码CAR的第二合成多核苷酸)的淋巴细胞。在后一种情况下，应理解，编码IRP1和/或IRP2的第一合成多核苷酸和编码CAR的第二合成多核苷酸可如本文所述彼此融合。可替代地，编码IRP1和/或IRP2的第一合成多核苷酸和编码CAR的第二合成多核苷酸可以是无关的。也就是说，编码IRP1和/或IRP2的第一合成多核苷酸和编码CAR的第二合成多肽可独立地引入淋巴细胞中。优选地，合成多核苷酸通过病毒转导引入淋巴细胞中并且掺入淋巴细胞的基因组中。因此，编码IRP1和/或IRP2的第一合成多核苷酸和编码CAR的第二合成多肽可包含在不同的病毒载体中。可在单个转导实验中将包含编码IRP1和/或IRP2的合成多核苷酸的第一病毒载体和包含编码CAR的合成多核苷酸的第二病毒载体引入淋巴细胞中。可替代地，可使用包含编码IRP1和/或IRP2的合成多核苷酸的第一病毒载体和包含编码CAR的合成多核苷酸的第二病毒载体以逐步方式转导淋巴细胞。例如，根据本发明的淋巴细胞可首先用包含编码CAR的合成多核苷酸的病毒载体转导以非限制地产生CAR T细胞或CAR NK细胞，并且可在第二步骤中用包含编码IRP1和/或IRP2的合成多核苷酸的病毒载体转导所述淋巴细胞。可替代地，可首先用包含编码IRP1和/或IRP2的合成多核苷酸的病毒载体转导淋巴细胞，并且可在第二步骤中用包含编码CAR的合成多核苷酸的病毒载体转导所述淋巴细胞。
在对本发明的淋巴细胞进行基因修饰之前，可从受试者获得淋巴细胞源。淋巴细胞可从多种来源获得，包括外周血、单核细胞、骨髓、淋巴结组织、血液、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织和肿瘤。在本发明中，可使用本领域可获得的任何类型的淋巴细胞。一般来说，技术人员知道从合适的来源分离某种类型的淋巴细胞的方法。
某些类型的淋巴细胞，特别是外周血单核细胞(PBMC)，可使用技术人员已知的许多技术(诸如FicollTM分离)从收集自受试者的血液单位中获得。此外，来自个体的循环血液的细胞可通过单采术获得。单采术产品通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白血细胞、红血细胞和血小板。可洗涤通过单采术收集的细胞以移除血浆级分并且将细胞置于适当缓冲液或培养基中以用于后续处理步骤。例如，可用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。可替代地，洗涤溶液可缺乏钙并且可缺乏镁或可缺乏多种(如果并非全部)二价阳离子。如本领域普通技术人员将容易理解的，洗涤步骤可通过本领域技术人员已知的方法完成，诸如通过使用半自动化“流通式(flowthrough)”离心机(例如Cobe 29细胞处理器、Baxter CytoMate或Haemonetics Cell Saver 5)根据制造商的说明完成。在洗涤后，可将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液中，诸如无Ca+、无Mg+的PBS、PlasmaLyte A或具有或不具有缓冲液的其他盐水溶液。可替代地，可移除单采术样品的非期望组分，并且可将细胞直接重悬于培养基中。可替代地，可例如借助于通过PERCOLLTM梯度的离心或通过逆流离心淘析(counterflow centrifugal elutriation)来裂解红血细胞并且清除单核细胞，从而分离某些类型的淋巴细胞。
淋巴细胞的特定亚群，诸如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和CD45RO+T细胞、CD16+和CD56+NK细胞或CD3+、CD56+和CD161+NKT细胞，可通过正选或负选技术进一步分离。本领域已知哪些表面抗原存在于相应类型的淋巴细胞上。因此，技术人员能够选择允许富集或分离特定类型淋巴细胞的正选或负选条件。此外，技术人员知道用于富集和/或分离某些类型的淋巴细胞的商业试剂盒。
在某些实施方案中，T细胞可通过与抗CD3/抗CD28缀合的珠粒(诸如
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M-450CD3/CD28T)一起孵育一段时间来分离，这段时间足以正选期望T细胞。时间段的范围可为30分钟至36小时或更长，并且可包括其间的所有整数值。在某些实施方案中，时间段是至少0.5、1、2、3、4、5或6小时。可替代地，时间段是10至24小时。对于从白血病患者中分离T细胞，使用更长的孵育时间(诸如24小时)可提高细胞产量。在与其他细胞类型相比存在较少T细胞的任何情形下，诸如在从肿瘤组织或从免疫受损个体中分离肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)时，可使用更长的孵育时间分离T细胞。此外，使用更长的孵育时间可提高捕获CD8+T细胞的效率。因此，通过简单地缩短或延长允许T细胞与CD3/CD28珠粒结合的时间和/或通过增加或降低珠粒与T细胞的比率，可在培养起始时或在过程中的其他时间点优先选择或针对T细胞的亚群。此外，通过增加或减少珠粒或其他表面上抗CD3和/或抗CD28抗体的比率，可在培养起始时或在其他时间点优先选择或针对T细胞的亚群。技术人员将认识到在本发明的上下文中还可使用多轮选择。在某些实施方案中，可期望执行选择程序并且在激活和扩增过程中使用“未选择”的细胞。“未选择”的细胞还可进行其他轮次的选择。
通过负选富集淋巴细胞群可用针对负选细胞独有的表面标志物的抗体的组合完成。一种方法是通过负磁性免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，所述方法使用针对负选细胞上存在的细胞表面标志物的单克隆抗体的混合物。例如，为了通过负选富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在某些实施方案中，可期望富集或正选通常表达CD4+、CD25+、CD62L、GITR+和FoxP3+的调节型T细胞。可替代地，在某些实施方案中，可通过抗C25缀合的珠粒或其他类似的选择方法来清除T调节型细胞。
在某些实施方案中，来自健康供体或患者的NK细胞可使用人NK细胞负选分离试剂盒(Miltenyi Biotec或STEMCELL Technologies)根据制造商的说明通过与磁珠一起孵育而从PBMC或直接从血液中富集。例如，当使用来自Miltenyi Biotec的分离试剂盒时，不想要的细胞(即T细胞、B细胞、巨噬细胞和单核细胞)可用针对NK细胞不表达的抗原的生物素缀合的单克隆抗人抗体的混合物去除，PBMC浓度为25亿个细胞/mL。然后可使用NK细胞MicroBead Cocktail对用生物素缀合的抗体标记的不想要的细胞进行磁性标记，并使用MACS柱去除。例如，当使用来自STEMCELL Technologies的分离试剂盒时，不想要的细胞(即T细胞、B细胞、巨噬细胞和单核细胞)可用针对NK细胞不表达的抗原的四聚体抗人抗体复合物去除，PBMC浓度为5千万个细胞/mL。然后可用葡聚糖包被的磁性颗粒对用四聚体抗体复合物标记的不想要的细胞进行磁性标记，并使用磁铁将其去除。
为了通过正选或负选分离期望的淋巴细胞群，可改变细胞的浓度和表面(例如颗粒，诸如珠粒)。在某些实施方案中，可期望显著减小珠粒与细胞混合在一起的体积(即增加细胞的浓度)，以确保细胞与珠粒的最大接触。例如，在一个实施方案中，可使用20亿个细胞/mL的浓度。在一个实施方案中，可使用10亿个细胞/mL的浓度。在另一个实施方案中，可使用大于1亿个细胞/mL。在另一个实施方案中，可使用0、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45或0.5亿个细胞/mL的细胞浓度。在另一个实施方案中，可使用0.75、0.8、0.85、0.9、0.95或1亿个细胞/mL的细胞浓度。在其他实施方案中，可使用1.25或1.5亿个细胞/mL的浓度。使用高浓度可产生增加的细胞产量、细胞活化和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度可使得可更有效地捕获可弱表达目标靶抗原的细胞(诸如CD28阴性T细胞)，或来自存在许多肿瘤细胞的样品(即白血病血液、肿瘤组织等)的细胞。此类细胞群可具有治疗价值，并且将期望获得。例如，使用高浓度细胞可使得可更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。
在一个相关实施方案中，可期望使用较低浓度的细胞。可通过显著稀释细胞和表面(例如颗粒，诸如珠粒)的混合物，使颗粒与细胞之间的相互作用最小化。这可选择表达大量待与颗粒结合的期望抗原的细胞。例如，在稀浓度下，与CD8+T细胞相比，CD4+T细胞可表达更高水平的CD28，并且更有效地被捕获。
可使淋巴细胞在2-10℃下或在室温下在旋转器上以不同速度孵育不同时间长度。用于刺激的细胞也可在洗涤步骤后冷冻。不受理论的束缚，冷冻和后续解冻步骤可通过去除细胞群中的粒细胞和在某种程度上去除单核细胞而提供更均匀的产物。在去除血浆和血小板的洗涤步骤之后，可将细胞悬浮于冷冻溶液中。尽管许多冷冻溶液和参数是本领域已知的并且将可用于本发明中，但一种方法涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或含有10％葡聚糖40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO或1.25％Plasmalyte-A、3.25％右旋糖5％、0.45％NaCl、10％葡聚糖40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基，或其他合适的含有例如Hespan和PlasmaLyte-A的细胞冷冻培养基。随后可使细胞以每分钟1℃的速率冷冻至-80℃，并且储存在液氮储罐的气相中。除了在-20℃下或在液氮中立即进行不受控冷冻之外，还可使用其他受控冷冻方法。
冷冻保存的细胞可如本文所述解冻和洗涤，并在使用本发明的方法激活之前使其在室温下静置一小时。
在本发明的上下文中还涵盖在可能需要如本文所述的扩增细胞之前的时间段从受试者中收集血液样品或单采术产物。因此，可在任何必需时间点收集待扩增细胞的来源，并且将期望细胞(诸如淋巴细胞)分离并且冷冻以供后期用于任何数量的将受益于细胞治疗的疾病或病状(诸如本文所述的那些疾病或病状)的细胞治疗中。血液样品或单采术样品可以是从一般健康受试者获得的。在某些实施方案中，血液样品或单采术样品可以是从具有发展疾病的风险，但尚未发展疾病的一般健康受试者获得的，并且可将目标细胞分离并冷冻以供后期使用。在某些实施方案中，可将细胞扩增、冷冻并且在后续时间使用。在某些实施方案中，可在诊断如本文所述的特定疾病之后不久但在任何治疗之前从患者中收集样品。此外，细胞可在任何数量的相关治疗方式之前从受试者的血液样品或单采术样品中分离，所述治疗方式包括但不限于使用以下各项进行的治疗：药剂诸如那他珠单抗、依法利珠单抗、抗病毒剂、化疗、放射、免疫抑制剂诸如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和FK506、抗体或其他免疫消融剂诸如CAMPATH、抗CD3抗体、环磷酰胺(cytoxan)、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228以及辐照。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调磷酸酶(环孢霉素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导很重要的p70S6激酶(雷帕霉素)(99-101)。在某些实施方案中，可从患者中分离细胞并且冷冻以供后期与骨髓或干细胞移植、使用化学治疗剂(诸如氟达拉滨(fludarabine)、外束放射治疗(XRT)、环磷酰胺)或抗体(针对OKT3或CAMPATH)的T细胞消融治疗结合使用(例如在其之前、同时或之后)。在某些实施方案中，可将细胞在B细胞消融治疗(诸如与CD20反应的药剂，例如美罗华)后的治疗之前分离，并且可冷冻以供后期用于所述治疗。
在本发明的某些实施方案中，可在治疗后直接从患者获得淋巴细胞。在这方面，已观察到，在某些癌症治疗，尤其是用损伤免疫系统的药物治疗之后，在治疗后不久在患者通常将从治疗中恢复的时间段期间，所获得的淋巴细胞在其离体扩增能力方面的品质可以是最佳或改善的。同样，在使用本文所述的方法离体操纵之后，这些细胞可呈优选状态以供增强的移植和体内扩增。因此，在本发明中预期在此恢复阶段期间收集血细胞，包括淋巴细胞、树突状细胞或造血谱系的其他细胞。此外，在某些实施方案中，可使用动员(例如用GM-CSF动员)和调理方案在受试者中产生如下状态，其中特定细胞类型的再增殖、再循环、再生和/或扩增是有利的，尤其在治疗后的限定时间窗口期间。例示性细胞类型包括T细胞、NK细胞、B细胞、树突状细胞和其他的免疫系统细胞。
本发明涵盖一种或多种合成多核苷酸，其包含编码一种或多种IRP和任选的CAR的多核苷酸序列。编码期望分子的合成多核苷酸可使用本领域已知的重组方法获得，例如，通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中获得所述基因，或通过使用标准技术从含有该基因的细胞和组织中直接分离。可替代地，目标基因可通过合成而不是克隆产生。
本发明还提供了其中可插入本发明的合成多核苷酸的载体。来源于逆转录病毒(诸如慢病毒)的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为所述载体使得转基因可长期稳定地整合并且其可在子细胞中繁殖。慢病毒载体与衍生自致癌-逆转录病毒(诸如鼠白血病病毒)的载体相比具有额外的优势，因为它们可以转导非增殖细胞，诸如肝细胞。它们还具有低免疫原性的额外优势。
“载体”是包含分离的核酸并且可以用于将分离的核酸递送至细胞内部的物质组合物。许多载体是本领域已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲性化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还应该被解释为包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。
简而言之，编码IRP和任选的CAR的天然或合成多核苷酸的表达通常通过将编码IRP或任选的CAR多肽或其部分的多核苷酸可操作地连接至启动子并将构建体掺入表达载体中来实现。载体可适合在真核生物中复制和/或整合。典型的克隆载体含有转录和翻译终止子、起始序列以及可用于调节期望多核苷酸的表达的启动子。
“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；其他用于表达的元件可以由宿主细胞或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有那些，诸如掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中)和病毒(例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
使用标准基因递送方案，本发明的表达构建体也可用于核酸免疫和基因治疗。用于基因递送的方法是本领域已知的。
可将编码IRP和任选的CAR的合成多核苷酸克隆到多种类型的载体中。例如，可将多核苷酸克隆到载体中，载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。
此外，表达载体可以病毒载体的形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是众所周知的，并且例如描述于Sambrook等人(2001,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)和其他病毒学和分子生物学手册中。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种生物体中具有功能的复制起点、启动子序列、便利的限制性内切核酸酶位点和一种或多种选择性标志物(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；以及美国专利号6,326,193)。
已开发多种基于病毒的系统，以用于基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供方便的平台。可使用本领域已知的技术将选定基因插入载体中并且包装在逆转录病毒颗粒中。随后可分离重组病毒，并且在体内或离体递送至受试者的细胞。本领域已知多种逆转录病毒系统。在本发明中，优选使用腺病毒载体或慢病毒载体。
另外的启动子元件，例如增强子，可用于调节转录起始的频率。通常，这些元件位于起始位点上游30-110bp的区域，但是近期已表明许多启动子也含有起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间距通常是灵活的，因此当元件相对于彼此倒置或移动时，启动子功能可得以保留。在胸苷激酶(tk)启动子中，在活性开始下降之前，启动子元件之间的间距可增加至相隔50bp。取决于启动子，似乎各个元件可协同或独立地起作用以激活转录。
合适的启动子的一个实例是立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是强组成型启动子序列，能够驱动与其可操作地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达。合适的启动子的另一个实例是延伸生长因子-1a(EF-1a)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽类白血病病毒启动子、爱泼斯坦-巴尔病毒立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子，以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。此外，本发明应不限于使用组成型启动子，诱导型启动子也被预期为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了能够在期望表达时打开与其可操作地连接的多核苷酸序列的所述表达或在不期望表达时关闭表达的分子开关。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白(metallothionine)启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
为了评估IRP或任选的CAR多肽或其部分的表达，待引入细胞中的表达载体还可包含选择性标志物基因或报告基因或两者，以有利于从试图通过病毒载体转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他实施方案中，选择性标志物可携带在单独的DNA片段上并用于共转染程序。选择性标志物和报告基因均可侧接适当的调节序列以使得其能够在宿主细胞中表达。可用的选择性标志物包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等。
报告基因用于鉴定潜在转染细胞和评价调节序列的功能性。通常，报告基因是如下基因，其不存在于受者生物体或组织中或不由受者生物体或组织表达，并且编码表达通过一些易于检测的特性(例如酶促活性)显现的多肽。可在将DNA引入受者细胞后的合适时间测定报告基因的表达。合适的报告基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白基因的基因(Ui-Tei等人,2000,FEBS Letters；479:79-82)。合适的表达系统是众所周知的，并且可使用已知技术制备或商购获得。
将基因引入细胞并在其中表达的方法是本领域已知的。在表达载体的环境中，可通过本领域中的任何方法将载体容易地引入宿主细胞，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞中。例如，可通过物理、化学或生物学手段将表达载体转移到宿主细胞中。
用于将多核苷酸引入宿主细胞中的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂转染、颗粒轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包含载体和/或外源多核苷酸的细胞的方法是本领域众所周知的。参见，例如，Sambrook等人(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)。用于将多核苷酸引入宿主细胞中的优选方法是磷酸钙转染。
用于将目标多核苷酸引入宿主细胞中的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体并且尤其是逆转录病毒载体已成为将基因插入哺乳动物(例如人)细胞中最广泛使用的方法。其他病毒载体可以来源于慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒等。参见，例如，美国专利号5,350,674和5,585,362。
用于将多核苷酸引入宿主细胞中的化学手段包括胶态分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球体、珠粒和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送媒介物的示例性胶态系统是脂质体(例如，人工膜囊)。在使用非病毒递送系统的情况下，示例性递送媒介物可以是脂质体。设想使用脂质制剂将多核苷酸引入宿主细胞(体外、离体或体内)中。在另一个实施方案中，多核苷酸可与脂质相关。与脂质相关的多核苷酸可包封在脂质体的水性内部、散布在脂质体的脂质双层中、通过与脂质体和多核苷酸两者相关的连接分子连接至脂质体、包埋在脂质体中、与脂质体复合、分散在含有脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质组合、作为悬浮液包含在脂质中、包含胶束或与其复合，或以其他方式与脂质相关。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体相关组合物不限于处于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以双层结构、胶束存在或具有“塌陷”结构。它们也可简单地散布在溶液中，可能形成大小或形状不均匀的聚集体。脂质是可以是天然存在的的额脂肪物质或合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴以及含有长链脂肪烃及其衍生物的一类化合物，诸如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛。
适合使用的脂质可从商业来源获得。例如，二肉豆蔻基磷脂酰胆碱(“DMPC”)可以获自Sigma,St.Louis,MO；磷酸二鲸蜡基酯(“DCP”)可以获自K&K Laboratories(Plainview,NY)；胆固醇(“Choi”)可以获自Calbiochem-Behring；二肉豆蔻基磷脂酰甘油(“DMPG”)和其他脂质可获自Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham,AL)。脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的储备溶液可储存在约-20℃。氯仿可用作唯一溶剂，因为它比甲醇更易蒸发。“脂质体”是通用术语，包括通过产生包封的脂质双层或聚集体而形成的多种单层和多层脂质媒介物。脂质体可表征为具有囊泡结构，所述囊泡结构具有磷脂双层膜和内部含水介质。多层脂质体可具有被含水介质分开的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量水溶液中时，它们可自发形成。脂质组分可在形成封闭结构之前发生自我重排，并将水和溶解的溶质夹带在脂质双层之间(Ghosh等人,1991,Glycobiology；5；505-10)。然而，也包括在溶液中具有的结构不同于正常囊泡结构的组合物。例如，脂质可呈现胶束结构或仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。还设想了脂质转染胺-核酸复合物(lipofectamine-nucleic acid complex)。
如本文所用，术语“转染”或“转化”或“转导”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞中的过程。“转染”或“转化”或“转导”的细胞是已用外源核酸转染、转化或转导的细胞。所述细胞包括原代主题细胞及其子代。
不管用于将外源合成多核苷酸引入宿主细胞中的方法如何，为了确认宿主细胞中重组DNA序列的存在，可进行多种测定。此类测定包括，例如，本领域技术人员熟知的“分子生物学”测定，诸如Southern和Northern印迹、RT-PCR和PCR；“生化”测定，诸如检测特定肽的存在或不存在，例如通过免疫学手段(ELISA、蛋白质印迹、流式细胞术)或通过本文所述的测定来鉴定落入本发明范围内的试剂。
在另一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的方法，其中编码嵌合抗原受体(CAR)的合成多核苷酸与编码至少一种铁调节蛋白的合成多核苷酸组合，具体地，其中至少一种铁调节蛋白是IRP1和/或IRP2。
嵌合抗原受体和至少一种IRP可在单独的合成多核苷酸上编码，所述多核苷酸彼此不连续或不直接连接。在这种情况下，可使用相同或不同的方法将编码至少一种IRP的合成多核苷酸和编码CAR的合成多核苷酸单独引入细胞中。可替代地，编码至少一种IRP的一种或多种基因和编码CAR的基因可组合在单个合成多核苷酸中。如果组合的合成多核苷酸包含在两个单独的合成多肽中编码的所有基因，则称两个合成多核苷酸是组合的。
例如，如果计划通过病毒转导将编码至少一种IRP和CAR的基因整合到淋巴细胞中，则编码至少一种IRP的一种或多种基因和编码CAR的基因可包含在单独的病毒载体中或可组合于单个病毒载体中。
在另一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的方法，其中在将一个或多个合成多核苷酸引入淋巴细胞之前或之后激活淋巴细胞。
无论是在对淋巴细胞进行基因修饰以表达至少一种IRP或任选的期望的CAR之前或之后，都可在将淋巴细胞施用给受试者之前激活和扩增所述淋巴细胞。技术人员知道激活不同类型的淋巴细胞需要特定条件。
技术人员知道激活NK细胞的方法。例如，本文所述的NK细胞可通过在适当的培养基(例如，最低必需培养基或RPMI培养基1640或X-vivo 15(Lonza)、CellGro培养基(Cellgenix)、IMDM(Gibco))中培养来激活，所述培养基可含有增殖和生存所必需的因子，包括补充有IL-15和/或IL-12和/或IL-18的血清(例如，胎牛、人或马血清)。NK细胞的激活也可以通过向培养基中补充IL-2来实现。通过向培养物中添加饲养细胞系可提高NK细胞的活化。用于激活NK细胞的适当饲养细胞系是癌细胞系、基因修饰的K562细胞或EBV转化的类淋巴母细胞系或自体外周血单核细胞(辐照)。
通常，本文所述的T细胞可通过与连接有刺激CD3/TCR复合物相关信号的试剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体的表面接触而被激活。具体地，可通过与抗CD3抗体或其抗原结合片段或固定在表面上的抗CD2抗体接触，或通过与蛋白激酶C活化剂(例如苔藓抑素)以及钙离子载体接触来刺激T细胞群。为了共刺激T细胞表面上的辅助分子，可使用结合辅助分子的配体。例如，可在适于刺激T细胞增殖的条件下使T细胞群与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖，可使用抗CD3抗体和抗CD28抗体。可使用抗CD28抗体9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone,
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France)，也可以使用本领域公知的其他方法(Berg等人,1998,Transplant Proc；30(8):3975-3977；Haanen等人,1999,J.Exp.Med；190:13191328；Garland等人,1999,J.Immunol Meth.227:53-63)。
可通过不同方案提供T细胞的主要刺激信号和共刺激信号。例如，提供各信号的试剂可以是溶液形式或与表面偶合。当与表面偶合时，所述试剂可与相同表面(即，以“顺式”形式)偶合或与单独表面(即，以“反式”形式)偶合。可替代地，一种试剂可与表面偶合，并且另一试剂可以是溶液形式。例如，提供共刺激信号的试剂可与表面结合，并且提供主要激活信号的试剂可以是溶液形式或与表面偶合，或两种试剂均可以是溶液形式。可替代地，试剂可以是可溶形式，随后与表面交联，诸如表达Fc受体的细胞或抗体或将结合所述试剂的其他结合剂。在此方面，参见例如美国专利申请公布20040101519和20060034810中的人工抗原呈递细胞(aAPC)，预期所述细胞可用于激活和扩增T细胞。
这两种试剂固定在珠粒上，处于同一珠粒上，即“顺式”，或单独珠粒上，即“反式”。以举例的方式，提供主要激活信号的试剂可以是抗CD3抗体或其抗原结合片段，并且提供共刺激信号的试剂可以是抗CD28抗体或其抗原结合片段；并且两种试剂可以相等的分子量共同固定到同一珠粒上。例如，可使用结合到珠粒上以用于CD4+T细胞扩增和T细胞生长的1:1的比率每种抗体。在某些情况下，可使用结合到珠粒上的一定的抗CD3:CD28抗体比率，使得与使用1:1的比率观察到的扩增相比，观察到T细胞扩增的增加。与使用1:1的比率观察到的扩增相比，可观察到约1至约3倍的增加。结合到珠粒上的CD3:CD28抗体的比率可在100:1至1:100的范围内以及其间的所有整数值。在一种情况下，结合到颗粒上的抗CD28抗体可多于抗CD3抗体，即CD3:CD28的比率可小于1。在某些情况下，与珠粒结合的抗CD28抗体与抗CD3抗体的比率可大于2:1。例如，可使用1:100CD3:CD28比率的与珠粒结合的抗体，可使用1:75CD3:CD28比率的与珠粒结合的抗体，可使用1:50CD3:CD28比率的与珠粒结合的抗体，可使用1:30CD3:CD28比率的与珠粒结合的抗体，可使用1:10CD3:CD28比率的与珠粒结合的抗体，或可使用1:3CD3:CD28比率的与珠粒结合的抗体。可替代地，可使用3:1CD3:CD28比率的与珠粒结合的抗体。
颗粒与细胞的比率可在1:500至500:1的范围内，并且其间的任何整数值可用于刺激T细胞或其他靶细胞。如本领域普通技术人员可以容易地理解的，颗粒与细胞的比率可取决于相对于靶细胞而言的颗粒尺寸。例如，小尺寸的珠粒可仅结合几个细胞，而较大的珠粒可结合许多细胞。如上所述，导致T细胞刺激的抗CD3和抗CD28偶合颗粒与T细胞的比率可变化，但某些优选值包括1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1和15:1，其中一个优选比率是至少1:1颗粒/T细胞。可替代地，可使用1:1或更小的颗粒与细胞比。优选的颗粒:细胞比可以是1:5。颗粒与细胞比可根据刺激的天数而变化。例如，在第一天，颗粒与细胞比可为1:1至10:1，并且之后可每天或每隔一天将另外的颗粒添加到细胞中，持续最多10天，最终比率为1:1至1:10(基于添加当天的细胞计数)。可替代地，颗粒与细胞比可在刺激的第一天为1:1，并且在刺激的第三天和第五天调整至1:5。在另一种情况下，可每天或每隔一天添加颗粒，以在刺激的第一天达到1:1的最终比率，并且在刺激的第三天和第五天达到1:5。在另一种情况下，颗粒与细胞比可在刺激的第一天为2:1，并且在刺激的第三天和第五天调整至1:10。在另一种情况下，可每天或每隔一天添加颗粒，以在刺激的第一天达到1:1的最终比率，并且在刺激的第三天和第五天达到1:10。本领域技术人员将会知道，多种其他比率可适用于本发明。具体地，比率将根据颗粒尺寸以及细胞尺寸和类型而变化。
可将T细胞与试剂包被的珠粒组合，随后可将珠粒和细胞分离，然后可培养细胞。可替代地，在培养之前，可不分离试剂包被的珠粒和细胞，而是可在一起培养。在另一种情况下，首先可通过施加力(诸如磁力)浓缩珠粒和细胞以使细胞表面标志物的连接增加，从而诱导细胞刺激。
可将细胞(例如104至109个T细胞)与珠粒(例如1:1比率的
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M-450CD3/CD28T顺磁珠粒)在缓冲液，优选PBS(没有二价阳离子，诸如钙和镁)中组合。再次，普通技术人员可容易地理解可使用任何细胞浓度。可期望显著减小颗粒和细胞混合在一起的体积(即提高细胞的浓度)，以确保细胞与颗粒的最大接触。例如，可使用约20亿个细胞/mL的浓度。在另一种情况下，可使用超过1亿个细胞/mL的浓度。在另一种情况下，可使用0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45或0.5亿个细胞/mL的细胞浓度。在另一种情况下，可使用0.75、0.8、0.85、0.9、0.95或1亿个细胞/mL的细胞浓度。在另外的情况下，可使用1.25或1.5亿个细胞/mL的浓度。使用高浓度可产生增加的细胞产量、细胞活化和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度可使得更有效地捕获可能弱表达目标靶抗原的细胞，诸如CD28阴性T细胞。此类细胞群可具有治疗价值，并且在某些实施方案中将期望获得。例如，使用高浓度细胞可使得可更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。
可将混合物培养若干小时(约3小时)至约14天或其间的任何小时整数值。可将混合物培养21天。在一种情况下，珠粒和T细胞可一起培养约八天。在另一种情况下，珠粒和T细胞可一起培养2-3天。还可期望若干刺激周期以使得T细胞的培养时间可以是60天或更久。
暴露于不同刺激时间的T细胞可表现出不同特征。例如，典型血液或单采术获得的外周血单核细胞产物的辅助性T细胞群(TH，CD4+)多于细胞毒性或抑制性T细胞群(TC，CD8)。通过刺激CD3和CD28受体离体扩增T细胞产生T细胞群，所述细胞群在约8-9天之前主要由TH细胞组成，而在约8-9天之后，所述T细胞群包含越来越大的TC细胞群。因此，取决于治疗目的，向受试者输注主要包含TH细胞的T细胞群可以是有利的。类似地，如果已分离TC细胞的抗原特异性亚群，则在更大程度上扩增此亚群可以是有益的。
此外，除CD4和CD8标志物外，其他表型标志物在细胞扩增过程中也显著变化，大部分是可再现的。因此，这种可再现性使得能够针对特定目的定制活化T细胞产物。
适用于淋巴细胞培养的条件包括适当的培养基(例如最低必需培养基或RPMI培养基1640或X-vivo 15(Lonza)、CellGro培养基(Cellgenix)、IMDM(Gibco))，其可含有增殖和生存所需的因子，包括血清(例如胎牛、人或马血清)、白细胞介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ和TNF-α或熟练技术人员已知用于细胞生长的任何其他添加剂。用于细胞生长的其他添加剂可包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白粉(plasmanate)和还原剂，诸如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可包括RPMI1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15、X-Vivo 20、IMDM和CellGro、Optimizer，其添加有氨基酸、丙酮酸钠和维生素，不含血清或补充有适量血清(或血浆)或限定激素组，和/或添加有足以使NK细胞和T细胞生长和扩增的量的细胞因子。抗生素(例如青霉素和链霉素)可仅包括在实验培养物中，而不包括在待输注到受试者体内的细胞的培养物中。可将淋巴细胞维持在支持生长所必需的条件(例如，适当的温度(例如37℃)和气氛(例如，空气加5％CO2))下。
在另一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的方法，其中通过病毒转导，特别是通过慢病毒转导，将至少一个合成多核苷酸引入淋巴细胞中。
如上所述，可通过本领域已知的任何方法将编码至少一种IRP1和任选的CAR的一个或多个合成多核苷酸引入淋巴细胞中。然而，如上所述，优选的是通过病毒转导将一个或多个合成多核苷酸引入淋巴细胞中。更优选地，用于将合成多核苷酸引入淋巴细胞中的病毒载体是慢病毒载体。由于病毒载体通常在随机位置整合到宿主细胞基因组中，优选的是，合成多核苷酸包含至少一种编码IRP的基因和在宿主细胞中表达至少一种编码IRP的基因所需要的调节元件。
如本文所用，“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属。慢病毒在逆转录病毒中是独一无二的，因为它能够感染非分裂细胞；它们可以将大量遗传信息递送到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因递送载体的最有效方法之一。HIV、SIV和FIV都是慢病毒的实例。源自慢病毒的载体提供了在体内实现显著水平的基因转移的手段。
在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的方法，其中编码CAR的合成多核苷酸与编码IRP1和/或IRP2的合成多核苷酸转录连接。
在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的方法，其中编码CAR的合成多核苷酸和编码IRP1和/或IRP2的多核苷酸通过编码自切割肽的多核苷酸连接。
在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的方法，其中自切割肽是2A自切割肽。
在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的方法，其中自切割肽是T2A。
在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的方法，其中通过病毒转导将一个或多个合成多核苷酸引入淋巴细胞中。
在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的方法，其中使用根据本文提供的任何实施方案的病毒载体进行病毒转导。
编码IRP1和/或IRP2以及任选的CAR的合成多核苷酸、启动子和/或其他调节元件(诸如IRES或编码自切割肽的多核苷酸)的实例在本文其他地方公开，并且比照适用于要求保护的方法。优选地，根据本发明的病毒载体在根据本发明的方法中使用。
附图说明
图1：幼稚和细胞因子增强的NK细胞类似地依赖糖酵解用于产生IFN-γ
(A)用于产生CE NK细胞的实验的示意图。(B)未刺激(无刺激)或用IL-12/IL-18刺激的NV和CE NK细胞的IFN-γ产生(平均值±SEM，n＝18个供体)。(C)未刺激(无刺激)或用IL-12/IL-18刺激的NV和CE NK细胞上的CD69表达的GMFI(平均值±SEM，n＝13个供体)。(D)转录组数据的PCA，其描绘了未刺激(无刺激)或用IL-12/IL-18刺激的NV和CE NK细胞中的组关系。成分变异数(component variance)的比例以百分比表示(n＝5个供体)。(E)转录组数据的来自未刺激(无刺激)或用IL-12/IL-18刺激的NV和CE NK细胞的编码糖酵解基因的mRNA的相对表达的热图(n＝5个供体)。(F)上图：未刺激(无刺激)或用IL-12/IL-18刺激的NV和CE NK细胞的代表性线粒体扰动测定。在注射寡霉素、FCCP和鱼藤酮后，“在海马中(inSeahorse)”测量糖酵解(细胞外酸化率-ECAR)。下图：通过线粒体扰动测定分析的未刺激(无刺激)或用IL-12/IL-18刺激的NV和CE NK细胞中ECAR的基础和最大速率(平均值±SEM，n＝12个供体)。(G)上图：未刺激(无刺激)或用IL-12/IL-18刺激的NV和CE NK细胞中的NBDG摄取的代表性直方图。下图：未刺激(无刺激)或用IL-12/IL-18刺激的NV和CE NK细胞中的NBDG摄取的GMFI(平均值±SEM，n＝15个供体)。(H)未刺激(无刺激)或用IL-12/IL-18、IL-12/IL-18+2-DG刺激的NV和CE NK细胞中的IFNG mRNA的表达。转录水平相对于18S mRNA水平确定并针对未刺激(无刺激)的NV NK细胞归一化(平均值±SEM，n＝6个供体)。(I)上图：未刺激(无刺激)或用IL-12/IL-18、IL-12/IL-18+2-DG刺激的NV和CE NK细胞的IFN-γ产生(平均值±SEM，n＝6个供体)。下图：未刺激(无刺激)或用在10mM葡萄糖和在2mM葡萄糖中的IL-12/IL-18刺激的NV和CE NK细胞的IFN-γ产生(平均值±SEM，n＝5个供体)。通过配对双尾学生t检验(C、F、H、I)或线性回归分析(B、G、H、I)评估统计学显著性。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；ns，不显著。
图2：活化的CE NK细胞通过高水平的细胞表面CD71和快速细胞增殖进行表征
(A)上图：未刺激(无刺激)或用IL-12/IL-18刺激的NV和CE NK细胞上的CD98表达的代表性直方图。下图：未刺激(无刺激)或用IL-12/IL-18刺激的NV和CE NK细胞上的CD98表达的MFI(平均值±SEM，n＝8个供体)。(B)上图：未刺激(无刺激)或用IL-12/IL-18刺激的NV和CE NK细胞上的CD71表达的代表性直方图。下图：未刺激(无刺激)或用IL-12/IL-18刺激的NV和CE NK细胞上的CD71表达的GMFI和百分比(平均值±SEM，n＝14个供体)。(C)左图：未刺激(无刺激)或用IL-12/IL-18刺激的NV和CE NK细胞中的总CD71表达的代表性蛋白质印迹。右图：未刺激(无刺激)或用IL-12/IL-18刺激的NV和CE NK细胞中针对肌动蛋白归一化的总CD71表达(平均值±SEM，n＝13个供体)。(D)左图：未刺激(无刺激)或用K562刺激的NV和CE NK细胞上的CD71表达的GMFI(平均值±SEM，n＝6)。右图：未刺激(无刺激)或用K562刺激的NV和CE NK细胞上的CD71+NK细胞的百分比(平均值±SEM，n＝6个供体)。(E)上图：未刺激(无刺激)或用IL-12/IL-18刺激的NV和CE NK细胞中的Tf-488摄取的代表性直方图。下图：未刺激(无刺激)或用IL-12/IL-18刺激的NV和CE NK细胞中的Tf-488摄取的GMFI(平均值±SEM，n＝10个供体)。(F)上图：用于分析NV和CE NK细胞中的CFSE稀释度的实验的示意图。中图：未刺激(无刺激)或用IL-12/IL-18刺激的NV和CE NK细胞中的CFSE稀释度的代表性直方图。下图：通过CFSE稀释度分析的未刺激(无刺激)或用IL-12/IL-18刺激的增殖NV和CE NK细胞的百分比(平均值±SEM，n＝13个供体)。(G)未刺激(无刺激)或用IL-12/IL-18刺激的NV和CE NK细胞中的编码细胞周期基因(GO:0006098)的mRNA的相对表达的热图(n＝5个供体)。(H)通过CFSE稀释度分析的未刺激(无刺激)或用IL-12/IL-18、IL-12/IL-18+BIP(1、10和50μM)刺激的增殖NV和CE NK细胞的百分比(平均值±SEM；对于未刺激、IL-12/IL-18和IL-12/IL-18+BIP 10μM刺激，n＝11个供体；对于IL-12/IL-18+BIP 1μM刺激，n＝8个供体；对于IL-12/IL-18+BIP 50μM刺激，n＝3个供体)。(I)未刺激(无刺激)或用IL-12/IL-18、IL-12/IL-18+BIP 100μM刺激的NV和CE NK细胞上的CD69表达的GMFI(平均值±SEM，n＝5个供体)。(J)上图：未刺激(无刺激)或用IL-12/IL-18刺激的NV和CE NK细胞中的编码PPP基因(GO:0006098)的mRNA的相对表达的热图(n＝5个供体)。下图：通过CFSE稀释度分析的未刺激(无刺激)或用IL-12/IL-18、IL-12/IL-18+6AN 50μM刺激的NV和CE NK细胞中的增殖细胞的百分比(平均值±SEM，n＝6个供体)。通过配对双尾学生t检验(F、H、I、J)或线性回归分析(A、B、C、E)评估统计学显著性。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；ns，不显著。
图3：CD71介导的铁摄取和膳食铁可获得性影响NK细胞功能
(A)上图：用于分析来自脾脏的WT和TfrcY20H/Y20H NK细胞中的CFSE稀释度的实验的示意图。左下图：在IL-12/IL-18刺激下，来自脾脏的WT和TfrcY20H/Y20H NK1.1+NK细胞中的CFSE稀释度的代表性直方图。右下图：通过CFSE稀释度分析的IL-15LD中的或用IL-12/IL-18刺激的来自脾脏的增殖WT和TfrcY20H/Y20H NK1.1+NK细胞的百分比(平均值±SEM；对于WT NK细胞，n＝5；对于TfrcY20H/Y20H NK细胞，n＝6)。(B)上图：喂饲+/–铁饲料6周的小鼠的MCMV感染实验的示意图。下图：来自喂饲+/-铁饲料6周的小鼠的铁、铁蛋白、UIBC、TIBC的血清水平；以及血细胞比容(平均值±SEM；对于铁、铁蛋白、UIBC和TIBC，n＝8-18；并且对于血细胞比容，n＝3)。(C)左图：喂饲+/-铁饲料6周的小鼠的脾脏中NK1.1+NK细胞的百分比(平均值±SEM，n＝5)。右图：喂饲+/-铁饲料6周的小鼠的脾脏中CD8+、CD4+、CD19+细胞的百分比(平均值±SEM，n＝5)。(D)左图：喂饲+/-铁饲料6周的小鼠的脾脏中NK1.1+NK细胞上的CD27+CD11b–、CD27+CD11b+、CD27–CD11b+的百分比(平均值±SEM，n＝5)。右图：喂饲+/-铁饲料6周的小鼠的脾脏中NK1.1+NK细胞上的KLRG1+和CD62L+的百分比(平均值±SEM，n＝5)。(E)左图：喂饲+/-铁饲料6周的WT MCMV感染小鼠3dpi的肝脏和脾脏中的病毒滴度(每个点代表从一只小鼠中分离的细胞的数据，数据表示为针对喂饲+铁饲料的小鼠归一化的倍数变化差异，水平线表示中值，n＝10)。右图：喂饲+/-铁饲料6周的Δm157 MCMV感染小鼠3dpi的肝脏和脾脏中的病毒滴度(每个点代表从一只小鼠中分离的细胞的数据，数据表示为针对喂饲+铁饲料的小鼠归一化的倍数变化差异，水平线表示中值，n＝9-10)。(F)喂饲+/-饲料6周的WT MCMV感染小鼠1.5dpi的肝脏和脾脏中的NK1.1+NK细胞中IFN-γ+的百分比(平均值±SEM，n＝4-5)。通过未配对的双尾学生t检验(A、B、C、D、E、F)评估统计学显著性。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001；ns，不显著。
图4：CD71支持病毒感染期间的NK细胞增殖和最佳效应子功能
(A)左图：Tfrcfl/fl和Tfrcfl/flNcr1Cre小鼠的肝脏中NK1.1+NK细胞的百分比和绝对数量(平均值±SEM，n＝10)。右图：Tfrcfl/fl和Tfrcfl/flNcr1Cre小鼠的脾脏中NK1.1+NK细胞的百分比和绝对数量(平均值±SEM，n＝17-22)。(B)左上图：Tfrcfl/fl和Tfrcfl/flNcr1Cre小鼠的肝脏中CD8+细胞的百分比和绝对数量(平均值±SEM，n＝10)。右上图：Tfrcfl/fl和Tfrcfl/flNcr1Cre小鼠的肝脏中CD4+细胞的百分比和绝对数量(平均值±SEM，n＝4)。下图：Tfrcfl/fl和Tfrcfl/flNcr1Cre小鼠的肝脏中CD19+细胞的百分比和绝对数量(平均值±SEM，n＝10)。(C)左上图：Tfrcfl/fl和Tfrcfl/flNcr1Cre小鼠的脾脏中CD8+细胞的百分比和绝对数量(平均值±SEM，n＝9-19)。右上图：Tfrcfl/fl和Tfrcfl/flNcr1Cre小鼠的脾脏中CD4+细胞的百分比和绝对数量(平均值±SEM，n＝11-22)。下图：Tfrcfl/fl和Tfrcfl/flNcr1Cre小鼠的脾脏中CD19+细胞的百分比和绝对数量(平均值±SEM，n＝12-22)。(D)上图：Tfrcfl/fl和Tfrcfl/flNcr1Cre小鼠的肝脏中NK1.1+NK细胞上的CD27+CD11b–、CD27+CD11b+、CD27–CD11b+的百分比(平均值±SEM，n＝10)。下图：Tfrcfl/fl和Tfrcfl/flNcr1Cre小鼠的肝脏中NK1.1+NK细胞上的CD62L+和Ly6C+的百分比(平均值±SEM，n＝6)。(E)上图：Tfrcfl/fl和Tfrcfl/flNcr1Cre小鼠的脾脏中NK1.1+NK细胞上的CD27+CD11b–、CD27+CD11b+、CD27–CD11b+的百分比(平均值±SEM，n＝5)。下图：Tfrcfl/fl和Tfrcfl/flNcr1Cre小鼠的脾脏中NK1.1+NK细胞上的KLRG1+、CD62L+和Ly6C+的百分比(平均值±SEM，n＝5)。(F)Tfrcfl/fl和Tfrcfl/flNcr1Cre小鼠的肝脏和脾脏中NK1.1+NK细胞上的Ly49H+的百分比(平均值±SEM，n＝5-6)。(G)左上图：对Klra8-/-受者进行过继性转移实验，以跟踪MCMV感染后WT和Tfrcfl/fl NK细胞的扩增的示意图。右上图：对WT MCMV感染受者7dpi的肝脏中的过继性转移的CD45.1+和CD45.2+(Ly49H+NK1.1+)NK细胞进行门控的代表性流程图。下图：WT MCMV感染受者7和30dpi的肝脏、脾脏、肺和血液中过继性转移的WT(Ly49H+NK1.1+CD45.1+)和Tfrcfl/flNcr1Cre(Ly49H+NK1.1+CD45.2+)NK细胞的百分比(每个点代表从一只小鼠中分离的细胞的数据；条柱表示±SEM；两个独立实验，第一个对于7dpi，n＝5并且对于30dpi，n＝3-5；第二个对于7dpi，n＝4并且对于30dpi，n＝2)。(H)左图：对Rag2-/-IL2rg-/-受者进行过继性转移实验，以跟踪WT和Tfrcfl/fl NK细胞的扩增的示意图。右图：6dpt肝脏、脾脏、肺和血液中过继性转移的WT(Ly49H+NK1.1+CD45.1+)和Tfrcfl/flNcr1Cre(Ly49H+NK1.1+CD45.2+)NK细胞的百分比(每个点代表从一只小鼠中分离的细胞的数据，条柱表示±SEM，n＝3-4)。(I)左上图：对Klra8-/-受者进行过继性转移实验，以分析WT MCMV感染后WT和Tfrcfl/fl NK细胞中的CFSE稀释度的示意图。右上图：WTMCMV感染受者3.5dpi的肝脏中的过继性转移的WT和Tfrcfl/flNcr1Cre NK1.1+NK细胞中的CFSE稀释度的代表性直方图。下图：WT MCMV感染受者3.5dpi的肝脏和脾脏中的过继性转移的WT(Ly49H+NK1.1+CD45.1+)和Tfrcfl/flNcr1Cre(Ly49H+NK1.1+CD45.2+)NK细胞的CFSE的GMFI(平均值±SEM，两个独立实验，第一个n＝5，第二个n＝4)。(J)通过CFSE稀释度分析的IL-15LD中的或用IL-12/IL-18刺激的来自脾脏的增殖Tfrcfl/fl和Tfrcfl/flNcr1CreNK1.1+NK细胞的百分比(平均值±SEM；n＝3-4)。(K)上图：Tfrcfl/fl和Tfrcfl/flNcr1cre小鼠的MCMV感染实验的示意图。中图：WT MCMV感染的Tfrcfl/fl和Tfrcfl/flNcr1cre小鼠3.5和5.5dpi的肝脏中NK1.1+NK细胞的百分比和绝对数量(平均值±SEM，n＝4-6)。下图：WTMCMV感染的Tfrcfl/fl和Tfrcfl/flNcr1cre小鼠3.5和5.5dpi的脾脏中NK1.1+NK细胞的百分比和绝对数量(平均值±SEM，n＝3-6)。(L)WT MCMV感染的Tfrcfl/fl和Tfrcfl/flNcr1cre小鼠3.5dpi的肝脏和脾脏中的病毒滴度(每个点代表从一只小鼠中分离的细胞的数据，水平线表示中值，n＝5)。(M)WT MCMV感染的Tfrcfl/fl和Tfrcfl/flNcr1cre小鼠1.5dpi的肝脏和脾脏中NK1.1+NK细胞中的IFN-γ+的百分比(平均值±SEM，n＝4)。(N)左图：WT MCMV感染的Tfrcfl/fl和Tfrcfl/flNcr1Cre小鼠5.5dpi的脾脏中NK1.1+NK细胞上的CD27+CD11b–、CD27+CD11b+、CD27–CD11b+的百分比(平均值±SEM，n＝3-5)。右图：WT MCMV感染的Tfrcfl/fl和Tfrcfl/flNcr1Cre小鼠5.5dpi的脾脏中NK1.1+NK细胞上的KLRG1+的百分比(平均值±SEM，n＝3-5)。通过未配对的双尾学生t检验(A、B、C、D、E、F、I、J、K、L、M、N)评估统计学显著性。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001；ns，不显著。
图5：在活化的NK细胞中诱导CD71需要糖酵解(A)上图：未刺激(无刺激)或用IL-12/IL-18、IL-12/IL-18+ActD(1和10μM)和IL-12/IL-18+CHX(10和100μg/ml)刺激的NV和CENK细胞中的总CD71表达的代表性蛋白质印迹。左下图：未刺激(无刺激)或用IL-12/IL-18、IL-12/IL-18+ActD 10μM刺激的NV和CE NK细胞中针对肌动蛋白归一化的总CD71表达(平均值±SEM，n＝3个供体)。右下图：未刺激(无刺激)或用IL-12/IL-18、IL-12/IL-18+CHX 100μg/ml刺激的NV和CE NK细胞中针对肌动蛋白归一化的总CD71表达(平均值±SEM，n＝2个供体)。(B)未刺激(无刺激)或用IL-12/IL-18、IL-12/IL-18+2-DG刺激的NV和CE NK细胞中的TFRC mRNA的表达。转录水平相对于18S mRNA水平确定并针对未刺激(无刺激)的NV NK细胞归一化(平均值±SEM，n＝6个供体)。(C)左上图：未刺激(无刺激)或用IL-12/IL-18、IL-12/IL-18+2-DG刺激的NV和CE NK细胞上的CD71表达的GMFI(平均值±SEM，n＝6个供体)。右上图：未刺激(无刺激)或用IL-12/IL-18、IL-12/IL-18+2-DG刺激的NV和CE NK细胞上的总CD71表达的代表性蛋白质印迹。下图：未刺激(无刺激)或用IL-12/IL-18、IL-12/IL-18+2DG刺激的NV和CE NK细胞中针对肌动蛋白归一化的总CD71表达(平均值±SEM，n＝5个供体)。(D)未刺激(无刺激)或用在10mM葡萄糖和在2mM葡萄糖中的IL-12/IL-18刺激的NV和CE NK细胞上的CD71表达的GMFI(平均值±SEM，n＝5个供体)。(E)未刺激(无刺激)或用IL-12/IL-18、IL-12/IL-18+2-DG刺激的NV和CE NK细胞中的Tf-488摄取的GMFI(平均值±SEM，n＝5个供体)。(F)上图：未刺激(无刺激)或用IL-12/IL-18刺激的NV和CE NK细胞中的总c-Myc表达的代表性蛋白质印迹。下图：未刺激(无刺激)或用IL-12/IL-18刺激的NV和CE NK细胞中针对肌动蛋白归一化的总c-Myc表达(平均值±SEM，n＝6个供体)。通过配对双尾学生t检验(A、B、C、D、E、F)或线性回归分析(B、C、E)评估统计学显著性。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；ns，不显著。
图6：细胞因子致敏(Cytokine priming)诱导IRP/IRE调节系统
(A)上图：转录组数据的未刺激(无刺激)或用IL-12/IL-18刺激的NV和CE NK细胞中的ACO1和IREB2 mRNA的表达(n＝5个供体)。中图：未刺激(无刺激)或用IL-12/IL-18刺激的NV和CE NK细胞中的总IRP1和IRP2表达的代表性蛋白质印迹。下图：未刺激(无刺激)或用IL-12/IL-18刺激的NV和CE NK细胞中针对肌动蛋白归一化的总IRP1和IRP2表达(平均值±SEM；对于IRP1，n＝7个供体；对于IRP2，n＝6个供体)。(B)未刺激(无刺激)或用IL-12/IL-18刺激的NV和CE NK细胞中的编码携带IRE的基因的mRNA的相对表达的热图(n＝5个供体)。(C)左上图：转录组数据的未刺激(无刺激)或用IL-12/IL-18刺激的NV和CE NK细胞中的EIF4E mRNA的表达(n＝5个供体)。右上图：未刺激(无刺激)或用IL-12/IL-18刺激的NV和CENK细胞中的总eIF4E表达的代表性蛋白质印迹。下图：未刺激(无刺激)或用IL-12/IL-18刺激的NV和CE NK细胞中针对肌动蛋白归一化的总eIF4E表达(平均值±SEM，n＝6个供体)。(D)上图：未刺激(无刺激)或用IL-12/IL-18刺激的NV和CE NK细胞中的HPG掺入的代表性直方图。下图：未刺激(无刺激)或用IL-12/IL-18刺激的NV和CE NK细胞中的HPG掺入的GMFI(平均值±SEM，n＝5个供体)。(E)左图：未刺激(无刺激)或用IL-12/IL-18刺激的NV和CE NK细胞中的总铁蛋白重链1表达的代表性蛋白质印迹。右图：未刺激(无刺激)或用IL-12/IL-18刺激的NV和CE NK细胞中针对肌动蛋白归一化的总铁蛋白重链1表达(平均值±SEM，n＝4个供体)。通过配对双尾学生t检验(A、C、E)或线性回归分析(D)评估统计学显著性。*p<0.05，**p<0.01；ns，不显著。
图7：IRP/IRE调节系统协调NK细胞中的CD71表达
(A)无刺激与IL-12/IL-18的NV和CE NK细胞中的TFRC mRNA表达，数据源自转录组数据的(n＝5)。(B)转录组数据的无刺激与IL-12/IL-18的NV和CE NK细胞中的FTH1 mRNA的表达(n＝5)。(C)用对照或Aco1 siRNA转染的NK92细胞中的总IRP1表达的代表性蛋白质印迹。用对照或Aco1 siRNA转染的NK92细胞中的总IRP1表达(n＝7)。(D)用对照或IREB2siRNA转染的NK92细胞中的总IRP2表达的代表性蛋白质印迹。用对照或IREB2 siRNA转染的NK92细胞中的总IRP2表达(n＝6)。(E)左图：用对照、ACO1或IREB2 siRNA转染的NK92细胞上的CD71表达的代表性直方图。右图：用对照、ACO1或IREB2 siRNA转染的NK92细胞上的CD71表达的GMFI(n＝4-5)。(F)左图：用对照、Aco1和IREB2 siRNA转染的NK92细胞中的总FTH1表达的代表性蛋白质印迹。右图：用对照、Aco1和IREB2 siRNA转染的NK92细胞中的总FTH1表达(n＝5)。(G)左图：用对照或Aco1 siRNA转染的NKL细胞中的总IRP1表达的代表性蛋白质印迹。右图：用对照或Aco1 siRNA转染的NKL细胞中的总IRP1表达(n＝6)。(H)左图：用对照或IREB2 siRNA转染的NKL细胞中的总IRP2表达的代表性蛋白质印迹。右图：用对照或IREB2siRNA转染的NKL细胞中的总IRP2表达(n＝7)。(I)左图：用对照、ACO1或IREB2 siRNA转染的NKL细胞上的CD71表达的代表性直方图。右图：用对照、ACO1或IREB2 siRNA转染的NKL细胞上的CD71表达的GMFI(n＝5)。(J)左图：用对照和Aco1 siRNA转染的NKL细胞中的总FTH1表达的代表性蛋白质印迹。右图：用对照和Aco1 siRNA转染的NKL细胞中的总FTH1表达(n＝6)。(K)左图：用对照和IREB2 siRNA转染的NKL细胞中的总FTH1表达的代表性蛋白质印迹。右图：用对照和IREB2 siRNA转染的NKL细胞中的总FTH1表达(n＝5)。所有平均数据均表示为平均值±s.e.m.并使用未配对的双尾学生t检验(a、b、d、e)或ANOWA(c)进行分析。星号表示组间显著性。*p<0.05，**p<0.01；ns，不显著。(L)左图：用对照或IREB2 sgRNA转染的NK92细胞中的总IRP2表达的代表性蛋白质印迹。右图：用对照或IREB2 sgRNA转染的NK92细胞中的总IRP2表达(n＝3)。(M)左图：用对照或IREB2 sgRNA转染的NK92细胞上的CD71表达的GMFI(n＝5)。右图：用对照或IREB2 sgRNA转染的NK92细胞的数量(n＝4)。所有平均数据均表示为平均值±s.e.m.并使用双尾学生t检验(A-B)、未配对的双尾学生t检验(C、D、G、H、J、K、L、M)或ANOWA(E、F、I)进行分析。星号表示组间显著性。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；ns，不显著。
图8：强制IRP表达是同样支持T细胞增殖的分子模块。
(A)左图：用对照或Aco1 siRNA转染的Jurkat细胞中的总IRP1表达的代表性蛋白质印迹。右图：用对照或Aco1 siRNA转染的Jurkat细胞中的总IRP1表达(n＝5)。(B)左图：用对照或IREB2 siRNA转染的Jurkat细胞中的总IRP2表达的代表性蛋白质印迹。右图：用对照或IREB2 siRNA转染的Jurkat细胞中的总IRP2表达(n＝4)。(C)左图：用对照、ACO1或IREB2siRNA转染的Jurkat细胞上的CD71表达的代表性直方图。右图：用对照、ACO1或IREB2 siRNA转染的Jurkat细胞上的CD71表达的GMFI(n＝7)。(D)左图：用对照、Aco1或IREB2 siRNA转染的Jurkat细胞中的总FTH1表达的代表性蛋白质印迹。右图：用对照、Aco1和IREB2 siRNA转染的Jurkat细胞中的总FTH1表达(n＝5)。(E)用编码mCherry(LV-mCherry)或IREB2(LV-IREB2)的对照载体转导的IRP2敲除的(ko)Jurkat细胞中的总IRP2表达的代表性蛋白质印迹。(F)上图：用LV-mCherry或LV-IREB2转导的IRP2 ko Jurkat细胞上的CD71表达的代表性直方图。左下图：用LV-mCherry与LV-IREB2转导的IRP2 ko Jurkat细胞上的CD71表达的GMFI(n＝4)。右下图：用LV-mCherry与LV-IREB2转导的IRP2 ko Jurkat细胞的数量(n＝3)。(G)左图：用LV-mCherry与LV-IREB2转导的原代CD4+T细胞上的CD71表达的代表性直方图。右图：用LV-mCherry与LV-IREB2转导的原代CD4+T细胞上的CD71表达的GMFI(n＝2)。(H)左图：用LV-mCherry与LV-IREB2转导的原代CD8+T细胞上的CD71表达的代表性直方图。右图：用LV-mCherry与IREB2(LV-IREB2)转导的原代CD8+T细胞上的CD71表达的GMFI(n＝2)。(I)未转导的CD4+T细胞(UTD)、PSMA特异性CAR CD4+T细胞(CAR)和共表达IRP2的PSMA特异性CARCD4+T细胞(CAR-IREB2)中的总IRP2表达的代表性蛋白质印迹。(J)上图：未刺激的UTD、CAR和CAR-IREB2转导的CD4+T细胞上的CD71表达的代表性直方图。未刺激的UTD、CAR和CAR-IREB2转导的CD4+T细胞上的CD71表达的MFI(n＝3)。下图：Fab刺激的UTD、CAR和CAR-IREB2转导的CD4+T细胞上的CD71表达的代表性直方图。Fab刺激的UTD、CAR和CAR-IREB2转导的CD4+T细胞上的CD71表达的MFI(n＝3)。(K)上图：已进入0、1和2个细胞增殖周期的未刺激的UTD、CAR和CAR-IREB2转导的CD4+T细胞的百分比(n＝3)。下图：已进入0、1和2个细胞增殖周期的Fab刺激的UTD、CAR和CAR-IREB2转导的CD4+T细胞的百分比(n＝3)。所有平均数据均表示为平均值±s.e.m.并使用未配对的双尾学生t检验(a、b、f)或ANOWA(c、d)进行分析。星号表示组间显著性。*p<0.05，**p<0.01；ns，不显著。
实施例
实施例1：幼稚和细胞因子增强的NK细胞类似地依赖糖酵解用于产生IFN-γ
细胞因子增强的(CE)NK细胞的增强回忆应答反映了对于免疫细胞治疗抗癌症的有希望的特征。CE NK细胞代谢是否以及如何支持细胞因子产生、靶细胞清除和增殖仍然未知。为了阐明CE NK细胞的这些关键特征，发明人使用了已建立的体外CE NK细胞模型，所述模型允许幼稚(NV)与CE NK细胞的比较。简单来说，发明人用IL-12和IL-18(IL-12/IL-18)对新鲜分离的人NK细胞进行16h的致敏(primed)，然后在低剂量IL-15(IL-15LD)中静置一段时间以支持存活。静置7天后，对刺激后NV与CE NK细胞的特征进行比较(图1A)。与先前的数据一致，用IL-12/IL-18致敏NK细胞增强了它们在再刺激后产生IFN-γ的能力(图1B)。值得注意的是，NK细胞在刺激后被类似地激活，如通过CD69表达所指示(图1C)。为了探索细胞代谢如何在转录水平上和NV与CE NK细胞的功能相关，使用未刺激的细胞和细胞因子刺激的细胞进行RNA测序(RNA-seq)。在主成分分析(PCA)中，未刺激的以及活化的NV和CE NK细胞单独聚类。然而，活化是更强的总体区分因素，表明NV和CE NK细胞的转录组之间存在相对相似性(图1D)。
有氧糖酵解的快速上调是活化淋巴细胞(包括NK细胞)的代谢标志。出乎意料的是，NV和CE NK细胞在刺激后类似地上调编码糖酵解酶的基因转录物，HK2除外，其在CE中高于在NV NK细胞中(图1E)。与转录组数据一致，代谢通量测定显示，与未刺激细胞相比，活化细胞的基础和最大糖酵解速率增加，但未观察到NV与CE NK细胞之间的差异(图1F)。
同样，葡萄糖类似物2-NBDG的摄取在未刺激与活化的NV和CE NK细胞之间没有差异(图1G)。为了评估糖酵解代谢的增加是否与NV和CE NK细胞产生IFN-γ的能力有关，发明人在己糖激酶抑制剂2-脱氧-d-葡萄糖(2-DG)的存在下用IL-12/IL-18刺激NV和CE NK细胞。在细胞因子刺激期间糖酵解的抑制类似地降低NV和CE NK细胞中的IFNG mRNA丰度和IFN-γ分泌(图1H和1I，左图)。同样，在低葡萄糖中培养NK细胞减少两个亚群中的IFN-γ产生(图1I，上图)。这些数据一起确定了在激活NV和CE NK细胞后基础和最大糖酵解活性的类似增加，这在两个亚群中是关键炎症性细胞因子IFN-γ的有效产生所需要的。
实施例2：活化的CE NK细胞通过高水平的细胞表面CD71和快速细胞增殖进行表征
为了进一步表征NV与CE NK细胞的代谢特征谱，发明人分析了据报道在活化NK细胞上被上调的营养转运蛋白CD98和CD71的表面表达。在刺激后，在两个NK细胞亚群上观察到CD98表达的微小且相当的增加(图2A)。相比之下，转铁蛋白受体CD71的上调在CE相对于NV NK细胞上大得多，当两者均以阳性细胞的GMFI和百分比表示时(图2B)。如通过全细胞裂解物的免疫印迹分析所评估的，CD71的细胞表面表达的增加反映为CD71蛋白的总体更大的细胞丰度(图2C)。为了测试CD71的差异细胞表面表达是否也可通过激活受体由NK细胞刺激驱动，将两个亚群都用HLA缺陷型靶细胞(K562细胞系)刺激。与细胞因子刺激类似，CD71的上调在暴露于K562的CE上比NV NK细胞上更明显(图2D)。为了评估增加的CD71表达的功能能力，发明人使用荧光标记的转铁蛋白监测NV和CE NK细胞中的转铁蛋白摄取。这些实验揭示，与NV NK细胞相比，活化的CE中的转铁蛋白摄取增加(图2E)。
先前已在赘生性细胞中将CD71的表达与增殖速率相关。为了测试这种关联是否也适用于NK细胞，使用CFSE稀释测定来监测NV和CE NK细胞的增殖。在稳态条件下和在刺激后，CE NK细胞的增殖程度高于其NV对应物(图2F)。根据不同的增殖速率，在测试编码细胞周期进展基因的转录物的丰度时，将经过刺激的CE NK细胞聚类(图2G)。为了阐明增加的转铁蛋白摄取是否与增加的细胞增殖有关，发明人使用了细胞内铁螯合剂2,2′-联吡啶(BIP)。这些实验揭示，BIP在NV和CE NK细胞中均以剂量依赖性方式抑制NK细胞增殖(图2H)。值得注意的是，BIP对细胞活力的影响很小(数据未示出)，并且对NK细胞活化没有影响，如通过CD69表达所评估的(图2I)。
分别为核苷酸合成和还原等价物提供核糖5-磷酸和NADPH的磷酸戊糖途径(PPP)支持细胞增殖。与在CE NK细胞中观察到的增殖增加一致，细胞因子刺激在CE中比NV NK细胞中更明显地增加若干PPP相关基因的mRNA丰度(图2J，上图)。PPP抑制剂6-氨基烟酰胺(6AN)阻止细胞因子刺激的NK细胞的扩增，进一步支持PPP在促进NV和CE NK细胞增殖方面的相关性(图2J，下图)。总之，这些实验确定(i)CD71在活化的CE相对于NV NK细胞上优先上调并且(ii)相对于活化的NV NK细胞，增加了活化的CE NK细胞的增殖，这依赖于PPP活性。
实施例3：CD71介导的铁摄取和膳食铁可获得性影响NK细胞功能
最近，已证明TFRC基因的突变(TFRCY20H/Y20H)损害B和T细胞功能，导致原发性免疫缺陷(PID)。该突变影响受体介导的内吞作用，并在人细胞中和在引入小鼠中时有损CD71介导的铁摄取。携带这种突变的患者的NK细胞数量是正常的，但是，以前没有评估过功能特性。为了测试CD71功能和NK细胞增殖是否有关，发明人评估了离体的IL-15LD和IL-12/IL-18刺激的野生型(WT)和TfrcY20H/Y20H鼠NK细胞中的CFSE稀释度。这些实验揭示，在携带Tfrc突变的NK细胞中明显缺乏IL-15LD和IL-12/IL-18诱导的增殖(图3A)。
鉴于这种强表型，发明人想知道轻度缺铁是否可足以导致NK细胞功能障碍。为了探索这个概念，发明人首先在小鼠模型中建立了全身性缺铁(图3B，上图)。如所预期的那样，与保持对照饮食的小鼠相比，维持缺铁饮食6周的小鼠表现出外周血中的铁、铁蛋白和血细胞比容水平降低，而不饱和铁结合能力(UIBC)和总铁结合能力(TIBC)增加(图3B，下图)。虽然缺铁小鼠的脾T和B细胞数量正常，但NK细胞数量往往较低，这可能表明了这些细胞对全身铁丰度的选择性敏感性(图3C)。没有观察到缺铁对NK细胞成熟表型的影响(图3D)。然而，在MCMV感染后，在维持缺铁饮食的小鼠中，脾NK细胞介导的病毒控制和NK细胞的IFN-γ产生趋于减少，表明NK细胞功能受损(图3E，左图和8F)。值得注意的是，逃避NK细胞介导的控制的Δm157 MCMV的复制不受铁水平降低的影响(图3E，右图)。总之，这些数据确定了CD71介导的铁摄取在调节NK细胞增殖中具有重要作用。此外，全身铁水平降低显著损害体内MCMV感染的免疫控制，可能是通过降低NK细胞功能。NK细胞介导的免疫受损是否由NK细胞内在或外在因素引起仍有待研究。
实施例4：CD71支持病毒感染期间的NK细胞增殖和最佳效应子功能
为了测试NK细胞中CD71介导的铁摄取的功能重要性，发明人通过将Ncr1Cre小鼠与Tfrcfl/fl小鼠杂交(Tfrcfl/flNcr1Cre)产生了在NK细胞中特异性地缺乏CD71的小鼠。在稳态条件下，与Tfrcfl/fl同窝对照相比，Tfrcfl/flNcr1Cre小鼠的肝脏和脾脏中NK细胞的百分比和绝对数量均略有降低(图4A)。CD8+和CD4+T细胞以及CD19+B细胞的百分比和绝对数量不受CD71的NK细胞特异性缺失的影响(图4B和4C)。此外，末端NK细胞成熟标志物的表达在Tfrcfl/flNcr1Cre与Tfrcfl/fl小鼠之间是相当的(CD27、CD11b、KLRG1、CD62L和Ly6C)(图4D和4E)。同样，对控制MCMV感染很重要的NK细胞激活受体Ly49H在Tfrcfl/flNcr1Cre和Tfrcfl/fl NK细胞上同等地表达(图4F)。
MCMV对NK细胞的激活驱动Ly49H+NK细胞的增殖。为了检查CD71的缺失是否影响体内抗原特异性NK细胞扩增，发明人将同类系(congenic)Ly49H+WT和Tfrcfl/flNcr1Cre NK细胞共同转移到Ly49H缺陷型(Klra8-/-)受者中(图4G，上图)。然后，发明人用MCMV感染受者小鼠并跟踪转移的NK细胞的扩增。与Tfrcfl/flNcr1Cre NK细胞相比，WT NK细胞在肝脏、脾脏、肺和血液中稳健扩增，在感染后(dpi)7天和30天构成Ly49H+NK细胞汇集物的80-90％(图4G，下图)。发明人接下来解决了淋巴细胞减少的宿主中由共同g链依赖性细胞因子的可获得性驱动的NK细胞的扩增是否也依赖于CD71的问题。为此，发明人将等比率的WT和Tfrcfl/flNcr1Cre NK细胞转移到Rag2-/-IL2rg-/-受者小鼠中(图4H，左图)。与感染实验类似，在6dpi时，Tfrcfl/flNcr1Cre NK细胞的频率远低于WT细胞(图4H，右图)。两个过继性转移实验中Tfrcfl/flNcr1Cre NK细胞数量的减少可能是由缺乏扩增、细胞死亡增加或两者的组合造成的。为了评估NK细胞中CD71的缺失如何与其在体内的增殖相关，将WT和Tfrcfl/flNcr1Cre NK细胞用CFSE标记并等比率转移到受者小鼠中(图4I，上图)。然后用MCMV感染受者，并在3.5dpi时收获供体细胞。肝脏和脾脏中过继性转移的Tfrcfl/flNcr1Cre NK细胞的CFSE稀释度以及因此增殖显著低于WT细胞(图4I，下图)。这些发现在体外增殖研究中得到进一步证实，其中与对照细胞相比，IL-15LD和IL-12/IL-18刺激的Tfrcfl/flNcr1Cre NK细胞表现出增殖减少(图4J)。
为了解决CD71的缺失是否影响NK细胞介导的病毒控制的问题，发明人用MCMV激发Tfrcfl/fl和Tfrcfl/flNcr1Cre小鼠(图4K，上图)。与上述竞争性转移测定一致，在Tfrcfl/flNcr1Cre小鼠的肝脏和脾脏中观察到在3.5和5.5dpi时NK细胞的百分比和绝对数量均显著降低(图4K，中图和下图)。在3.5dpi时，Tfrcfl/flNcr1Cre小鼠中的NK细胞的不充分扩增与较高的脾病毒滴度相关，在肝脏中观察到类似趋势(图4L)。此外，在MCMV感染后，脾和肝浸润性Tfrcfl/flNcr1Cre NK细胞的IFN-γ产生减少(图4M)。值得注意的是，尽管扩增较差且效应子能力降低，但CD71缺陷并不损害MCMV激发的CD71缺陷型NK细胞的最终成熟，如通过CD27、CD11b和KLRG1表达所指示(图4N)。总之，这些数据表明了CD71在感染期间和在淋巴细胞减少环境中在NK细胞增殖中的关键作用。
实施例5：在活化的NK细胞中诱导CD71需要糖酵解
我们的实验确定(i)通过CD71摄取铁作为控制NK细胞增殖的关键代谢检查点；并且(ii)CD71在活化的CE相对于NV NK细胞上高度优先上调。这些发现促使发明人询问CD71本身是如何在NV和CE NK细胞中被调节的。为了解决这个问题，发明人首先评估了CD71的诱导是否依赖于NK细胞转录活性。与先前的实验一样，CD71在细胞因子刺激的CE中的诱导程度高于NV NK细胞(图5A)。在两个亚群中，转录抑制(使用放线菌素D)完全阻止了刺激诱导的CD71上调，就像阻断翻译(使用放线菌酮)一样(图5A)。因此，在两个细胞亚群中类似地需要转录和翻译。先前已证明糖酵解重编程在活化的NK细胞中驱动转录(72)。由于糖酵解在活化的NV和CE NK细胞中类似地被触发(图1F)，发明人检查了糖酵解代谢可在NV与CE NK细胞之间不同地影响TFRC(其编码CD71)转录的可能性。TFRC mRNA丰度在活化的CE中确实高于NV NK细胞，但在用2-DG抑制糖酵解时类似地降低(图5B)。当将细胞暴露于2-DG时，CD71的细胞表面表达和总CD71水平遵循相同的模式(图5C)。概括了在低葡萄糖培养基中激活NK细胞后诱导CD71表达的葡萄糖依赖性并转化为2-DG处理的NK细胞中转铁蛋白摄取的减少(图5D和5E)。因此，糖酵解使得CD71的转录和翻译成为可能。然而，没有证据表明糖酵解调节活化CE相对于NV NK细胞中CD71的差异丰度。
c-Myc已被确定为各种免疫细胞中TFRC转录的关键调节因子。鉴于活化CE中的TFRC mRNA的丰度增加高于NV NK细胞(图5B)，CE NK细胞中的优先c-Myc诱导可以解释活化的CE与NV NK细胞之间的CD71差异调节。然而，c-Myc在两个NK细胞亚群中稳健但同等地被诱导(图5F)。这些数据共同确定了活化的NV和CE NK细胞对(i)连续转录和翻译以支持CD71的表达和(ii)作为CD71表达的代谢需要的糖酵解重编程的对称需求。
实施例6：细胞因子致敏诱导IRP/IRE调节系统
许多参与细胞铁稳态的基因在其mRNA的5’或3’UTR中含有铁反应元件(IRE)。铁调节蛋白1和2(IRP1和IRP2)结合IRE，从而控制mRNA稳定性和翻译。TFRC mRNA在3’UTR中含有5个IRE；IRP的结合使mRNA稳定并促进翻译。如上所述，这将在缺铁条件下发生。因此，发明人假设选择性地在CE NK细胞中增加IRP的丰度可能是在活化的CE NK细胞中调节增强的CD71表达的可能机制。在mRNA水平上，IRP转录物ACO1和IREB2的丰度在NV和CE NK细胞中是类似的(图6A，上图)。然而，IRP1和IRP2的蛋白质丰度在静止和活化的CE NK细胞中更高(图6A，下图)。这一发现与IRP的新作用相一致，即，以细胞亚群特异性方式产生假性缺铁状态，从而在转录后控制一组不同蛋白质的丰度。
为了扩展这一观察结果，发明人分析了在NK细胞中表达的已知含有IRE的mRNA的转录物丰度(图6B)。发明人将关键的真核翻译起始因子4E(eIF4E)包括在含有IRE的mRNA的列表中，因为搜索铁反应元件(searching for ironresponsive elements，SIRE)算法揭示了EIF4E mRNA的3’UTR中的IRE样基序(数据未示出)。该分析促使发明人评估EIF4E的转录和翻译模式。针对CD71观察到的模式有所概括，活化的CE NK细胞表达更多的EIF4E转录物和明显更多的eIF4E蛋白(图6C)。然而，与NV NK细胞相比，已经静止的CE NK细胞表达增大水平的eIF4E。值得注意的是，尽管eIF4E的丰度较高，但整体蛋白质翻译在活化的NV与CENK细胞之间没有明显差异，如通过使用L-高炔丙基甘氨酸(HPG)掺入测定所评估的(图6D)。此外，发明人注意到活化的CE NK细胞中的FTH1 mRNA丰度增加(图6B)。FTH1 mRNA在5’UTR中含有IRE并且IRP与5’UTRs IRE的结合抑制翻译。这一系列相似情况使得发明人测试了由CE NK细胞中的IRP丰度的选择性增加驱动假性缺铁的假设。事实上，尽管转录水平较高，但在未刺激和活化的CE NK细胞两者中，铁蛋白重链1(FTH1的基因产物)的蛋白质丰度(如果有的话)均较低(图6E)。这一发现高度暗示了IRP以其CE和NV NK细胞特异性丰度参与调节FTH1 mRNA翻译。这些数据一起确定了在CE NK细胞中选择性诱导的调节轴，其中假性缺铁实现活化的CE NK细胞的CD71的翻译增加-以及因此增殖增加。
实施例7：IRP在CAR T细胞中的表达
CAR T细胞产生
将CAR和IRP1和/或IRP2的抗原结合结构域、跨膜结构域、CD3ζ结构域以及CD28共刺激结构域的序列克隆到相应的慢病毒载体中。如有必要，将IRP和CAR序列克隆到单独的慢病毒包装载体中。在合适的细胞系中进行慢病毒产生。
将CD8+和/或CD4+T细胞从来自患者或健康供体的外周血单核细胞中分离出来，并在IL-2的存在下用抗CD3和抗CD28(可溶性或珠粒结合的)激活。激活后一到两天，除去可溶性抗体或珠粒，并且用慢病毒转导细胞大约18小时，并用补充有IL-2的新鲜培养基替换培养基。CAR和IRP表达将在指定时间点通过流式细胞术进行确认。
任选的：
将CD8+和/或CD4+T细胞从来自患者或健康供体的外周血单核细胞中分离出来，并在IL-2的存在下用抗CD3和抗CD28(可溶性或珠粒结合的)激活。激活后一天，用慢病毒转导细胞大约48小时，并用补充有IL-2的新鲜培养基替换培养基。激活后五天，除去珠粒并用含有IL-15和IL-7的培养基替换。CAR和IRP表达将在指定时间点通过流式细胞术进行确认。
CAR T细胞的体外增殖
为了分析CAR T细胞的细胞增殖，在激活之前，向细胞中加载细胞增殖染料羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE，1μM，Molecular probes,USA)并将其接种在96孔板中。在样品采集前，使用可固定活-死细胞染色剂(Fixable Viability Dye，eBioscience或ZombieAqua，Biolegend)排除死细胞。通过流式细胞术在刺激后的不同时间点分析CFSE稀释度。
CAR T细胞的体内增殖
为了分析CAR T细胞的体内细胞增殖，将过表达至少一种IRP的CAR T细胞和不过表达任何IRP的CAR T细胞过继性转移到相应的鼠肿瘤模型中，并在不同时间点分析转移细胞的频率和数量。在某些实验中，在转移之前向过表达至少一种IRP的CAR T细胞和不过表达任何IRP的CAR T细胞中加载细胞增殖染料CFSE，以分析体内增殖。
小鼠肿瘤模型
将过表达至少一种IRP的CAR T细胞和不过表达任何IRP的CAR T细胞过继性转移到相应的鼠肿瘤模型中。取决于肿瘤模型，在某些实验中测量肿瘤直径。取决于肿瘤模型，在某些实验中，将肺解剖并固定在相应的缓冲液中，并且使用显微镜对结节的数量进行计数。取决于肿瘤模型，在某些实验中分析存活率。
实施例8：材料和方法
小鼠
在里耶卡大学医学院(University of Rijeka,Faculty of Medicine)进行的动物实验得到了里耶卡大学医学院伦理委员会(Ethical Committee of the Faculty ofMedicine,University of Rijeka)和克罗地亚农业部、兽医和食品安全局伦理委员会(Ethical Committee at the Croatian Ministry of Agriculture,Veterinary andFood Safety Directorate)的批准(UP/I-322-01/18-01/44)。在实验中，小鼠的年龄和性别严格匹配，并保持在SPF条件下。动物处理符合《涉及动物的生物医学研究国际指导原则》(International Guiding Principles for Biomedical Research Involving Animals)中包含的指导方针。
野生型C57BL/6J(B6，品系000664)、B6 Ly5.1(品系002014)、Tfrcfl/fl(品系028363)和Rag2–/–γc–/–(品系014593)小鼠购自Jackson实验室。Ncr1Cre小鼠由V.Sexl(奥地利维也纳(Vienna,Austria))友情提供并且B6.Ly49h–/–由Silvia M.Vidal(加拿大蒙特利尔(Montreal,Canada))友情提供。在一些实验中，将小鼠置于缺铁饮食和相应的对照饮食中6周(C1038和C1000，Altromin)。
巴塞尔大学(University of Basel)的动物实验是根据当地关于实验动物的护理和使用规定进行的。在实验中，小鼠的年龄和性别严格匹配，并保持在SPF条件下。野生型C57BL/6J(B6，品系000664)小鼠购自Jackson Laboratories(USA)并且TfrcY20H/Y20H小鼠由R.Geha(美国波士顿(Boston,USA))友情提供。
血液学分析
使用AU5800分析仪(Beckman Coulter)确定血清铁、铁蛋白、不饱和铁结合能力(UIBC)和总铁结合能力(TIBC)。使用血液分析仪DxH500(Beckman Coulter)确定血细胞比容。测量在实验室诊断临床研究所(Clinical Institute of Laboratory Diagnostics)(克罗地亚里耶卡临床医院中心(Clinical Hospital Center,Rijeka,Croatia))进行。
病毒
细菌人工染色体衍生的鼠巨细胞病毒(BAC-MCMV)株pSM3fr-MCK-2fl克隆3.3先前已被证明在生物学上等同于MCMV Smith株(VR-1399；ATCC)并且在下文中被称为野生型(WT)MCMV231。在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)232上繁殖pSM3fr-MCK-2fl克隆3.3和Δm157。以2×105个噬斑形成单位(PFU)对动物进行静脉内(i.v.)感染。通过标准噬斑测定在MEF上确定病毒滴度。
过继性转移实验
通过在MCMV感染前1天，将来自WT B6(CD45.1)和Tfrcfl/flNcr1Cre(CD45.2)小鼠的脾细胞以相等的比率分别转移到B6.Ly49h–/–和Rag2–/–γc–/–受者中来进行过继性共同转移研究。对于体内细胞增殖测定，在转移之前，向脾细胞中加载细胞增殖染料羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(5μM CFSE，Molecular probes,USA)。
人NK细胞分离和细胞培养
在书面知情同意后从健康供体中获得血液样品。通过标准密度梯度离心方案(Lymphoprep；Fresenius Kabi)分离外周血单核细胞。使用EasySep负NK细胞分离试剂盒(EasySep negative NK cell isolation kit，Stemcell)对NK细胞进行负选。将人NK细胞维持在补充有10％热灭活的人AB血清、50U/ml青霉素(Invitrogen)和50μg/ml链霉素(Invitrogen)的RPMI-1640培养基(Invitrogen)(R10AB)中。为了产生CE NK细胞，将分离的NK细胞在含有IL-12(10ng/ml，R&D systems)、IL-15(1ng/ml，PeproTech)和IL-18(50ng/ml，R&D systems)的R10AB中致敏过夜。第二天，将细胞用PBS洗涤两次并维持在含有IL-15(1ng/ml)的R10AB中，直到刺激。每2-3天用新鲜的IL-15(1ng/ml)替换50％的培养基。7天后，将细胞在含有IL-12(10ng/ml)、IL-15(1ng/ml)和IL-18(50ng/ml)或具有K562白血病靶标的R10AB中刺激(效应子:靶标比，5:1)6小时。当指明时，将细胞与2-脱氧-D-葡萄糖(10mM，Sigma-Aldrich)、放线菌素D(1和10μM，Sigma-Aldrich)、放线菌酮(10和100μg/ml，Sigma-Aldrich)、2,2′-联吡啶(1、10、50和100μM，Sigma-Aldrich)或6-氨基烟酰胺(50μM，Sigma-Aldrich)一起预孵育30min，然后在含有IL-12(10ng/ml)、IL-15(1ng/ml)和IL-18(50ng/ml)的R10AB中刺激6小时。
将NK细胞系NK92和NKL维持在补充有IL-2(50U/ml)的R10AB中。将Jurkat和K562细胞系维持在补充有10％热灭活的人胎牛血清(FBS)、50U/ml青霉素(Invitrogen)和50μg/ml链霉素(Invitrogen)的RPMI-1640培养基(Invitrogen)(R10FBS)中。将293T人胚胎肾(HEK-293T)细胞维持在补充有10％热灭活的人胎牛血清(FBS)、50U/ml青霉素(Invitrogen)和50μg/ml链霉素(Invitrogen)的DMEM培养基(Invitrogen)中。
人细胞的流式细胞术分析
对于表面染色，将NK细胞在4℃下用饱和浓度的抗体染色30min。使用了以下抗体：抗人CD71(克隆CY1G4，Biolegend)、抗人CD69(克隆FN50，Immunotools)、抗人CD98(克隆MEM-108，Biolegend)。使用BD AccuriC6或CytoFLEX流式细胞仪(Beckman Coulter)采集样品。使用
Figure BDA0003509444050000841
_V10.5(Tree Star,USA)分析数据。
对于细胞增殖测定，在激活之前，向NK细胞中加载细胞增殖染料CFSE(1μM，Molecular probes,USA)并将其接种在96孔板中。当指明存在抑制剂时，将细胞洗涤两次并维持在具有IL-15(1ng/ml)的R10AB中。在样品采集前，使用可固定活-死细胞染色剂(Fixable Viability Dye，eBioscience或Zombie Aqua，Biolegend)排除死细胞。通过流式细胞术在刺激后65小时分析CFSE稀释度。使用BD AccuriC6或CytoFLEX流式细胞仪(Beckman Coulter)采集样品。使用
Figure BDA0003509444050000851
(Tree Star,USA)分析数据。
鼠细胞的流式细胞术分析
通过对器官进行网格分割(meshing)并通过100-μm滤网过滤来分离脾脏中的淋巴细胞。为了从肝脏中分离淋巴细胞，将组织网格分割并通过100μm滤网过滤，并使用40％到80％(40％over 80％)Percoll的不连续梯度进行纯化。使用红细胞裂解缓冲液裂解脾脏和肝脏中的红血细胞。将细胞用Fc封闭试剂(Fc block)(克隆2.4G2)预处理，并使用可固定活-死细胞染色剂(Fixable Viability Dye，eBioscience)排除死细胞。将细胞在4℃下用饱和浓度的抗体染色30min。使用了购自Thermo Fisher Scientific的以下抗体：抗小鼠CD8α(克隆53-6.7)、抗小鼠CD45.2(克隆104)、抗小鼠CD4(克隆RM4-5)、抗小鼠CD69(克隆H1.2F3)、抗小鼠CD45.1(克隆A20)、抗小鼠CD3ε(克隆145-2C11)、抗小鼠CD19(克隆1D3)、抗小鼠NK1.1(克隆PK136)、抗小鼠NKp46(克隆29A1.4)、抗小鼠CD62L(克隆MEL-14)、抗小鼠Ly6c(克隆HK1.4)、抗小鼠KLRG1(克隆2F1)、抗小鼠Ly49H(克隆3D10)、抗小鼠CD11b(克隆M1/70)以及抗小鼠CD27(克隆O323)。使用BD FACSAria采集样品。使用
Figure BDA0003509444050000852
_V10.5(Tree Star,USA)分析数据。
对于MCMV感染后的细胞内细胞因子染色，如上文所指出分离来自MCMV感染小鼠的脾脏和肝脏的淋巴细胞。在IL-2(500IU/ml)的存在下，将细胞重悬于补充有10％胎牛血清(Thermo Fisher Scientific)、50U/ml青霉素(Invitrogen)、50μg/ml链霉素(Invitrogen)和50μM 2-巯基乙醇(Thermo Fisher Scientific)的RPMI-1640培养基(R10FBS)中。在布雷菲德菌素A(eBioscience)的存在下将细胞在37℃下孵育5小时。对细胞进行表面染色，然后根据制造商的方案(BD Biosciences)进行固定和透化。使用小鼠抗IFN-γ(克隆XMG1.2，Thermo Fisher Scientific)对细胞内细胞因子进行染色。使用BD FACSAria采集样品。使用
Figure BDA0003509444050000861
_V10.5(Tree Star,USA)分析数据。
对于细胞增殖测定，在激活之前，向淋巴细胞中加载细胞增殖染料CFSE(1μM，Molecular probes,USA)并将其接种在U形底的96孔板中(5×105个细胞/孔)。将细胞在含有IL-12(10ng/ml，PeproTech)、IL-15(10ng/ml，PeproTech)和IL-18(50ng/ml，R&DSystems)的R10FBS中刺激16小时。将细胞洗涤两次并维持在含有IL-15(10ng/ml)的R10FBS中。通过流式细胞术在刺激后65小时分析CFSE稀释度。使用可固定活-死细胞染色剂(Fixable Viability Dye，eBioscience或Zombie Aqua，Biolegend)排除死细胞。使用BDFACSAria或CytoFLEX流式细胞仪(Beckman Coulter)采集样品。使用
Figure BDA0003509444050000862
_V10.5(Tree Star,USA)分析数据。
Seahorse代谢通量分析仪
使用Seahorse XF-96e细胞外通量分析仪(Seahorse Bioscience，Agilent)确定细胞的代谢特征谱。将NK细胞涂板(3×105个细胞/孔)到Celltak(Corning,USA)包被的细胞板上。通过顺序添加寡霉素(1μM，Sigma)、FCCP(2μM、碳酰氰4-(三氟甲氧基)苯腙，Sigma)和鱼藤酮(1μM，Sigma)进行线粒体扰动实验。在注射每种化合物后实时监测耗氧率(OCR，pmol/min)和细胞外酸化率(ECAR，mpH/min)。
2-NBDG摄取
将NK细胞接种在U形底的96孔板中(2×105个细胞/孔)。在指明时，将细胞与抑制剂一起预孵育30min并在含有IL-12(10ng/ml)、IL-15(1ng/ml)和IL-18(50ng/ml)的R10AB中刺激6小时。然后将细胞在含有20μM 2-NBDG(Invitrogen)的培养基中孵育15min，并通过流式细胞术进行分析。使用BD AccuriC6流式细胞仪采集样品。使用
Figure BDA0003509444050000863
_V10.5(TreeStar,USA)分析数据。
人NK细胞中的IFN-γ测量
使用R10AB将NK细胞接种在U形底的96孔板中(2×105个细胞/孔)。在指明时，将细胞与抑制剂一起预孵育30min并在含有IL-12(10ng/ml)、IL-15(1ng/ml)和IL-18(50ng/ml)的R10AB中刺激6小时。在刺激后收获细胞上清液，并使用基于人Th1细胞因子珠粒的免疫测定(Legendplex，Biolegend)根据制造商的方案测量IFN-γ。
转铁蛋白摄取测定
将NK细胞接种在U形底的96孔板中(2×105个细胞/孔)。在指明时，将细胞与抑制剂一起预孵育30min并在含有IL-12(10ng/ml)、IL-15(1ng/ml)和IL-18(50ng/ml)的R10AB中刺激4小时。将细胞在含有5％BSA以及IL-12(10ng/ml)、IL-15(1ng/ml)和IL-18(50ng/ml)的RPMI-1640培养基中刺激2小时。在刺激后，将细胞用含有0.5％BSA的RPMI-1640洗涤，然后与转铁蛋白-alexa488缀合物(Tf-488，10μg/ml，Thermo Fisher Scientific)一起孵育15min。通过在冰冷的酸性缓冲液(150mM NaCl、20mM柠檬酸且pH：5)中洗涤细胞来停止转铁蛋白摄取。将细胞重悬于FACS缓冲液中并通过流式细胞术进行分析。使用BD AccuriC6流式细胞仪采集样品。使用
Figure BDA0003509444050000874
(Tree Star,USA)分析数据。
HPG掺入测定
将NK细胞接种在96孔板中(2×105个细胞/孔)。将细胞在含有IL-12(10ng/ml)、IL-15(1ng/ml)和IL-18(50ng/ml)的R10AB中刺激4.5h，然后在含有10％的透析FBS以及IL-12(10ng/ml)、IL-15(1ng/ml)和IL-18(50ng/ml)的不含甲硫氨酸的RPMI-1640培养基中孵育1.5h。在孵育的最后30min添加
Figure BDA0003509444050000871
HPG(50μM，Life Technologies)。HPG在NK细胞中的掺入用
Figure BDA0003509444050000872
反应混合物(Thermo Fisher Scientific)染色并通过流式细胞术检测。使用BD AccuriC6 flow采集样品。使用
Figure BDA0003509444050000873
(Tree Star,USA)分析数据。
免疫印迹分析
通过BCA蛋白质测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific)确定蛋白质浓度。使用4％-15％Mini Protean TGX Gel(Bio-Rad，Hercules CA,USA)分离总细胞裂解物，并使用Trans-Blot Turbo Transfer(Bio-Rad，Hercules CA,USA)将其转移到硝酸纤维素膜上。使用以下抗体对膜进行探测：抗人CD71 mAb(13113)、抗人IRP1 mAb(20272)、抗人IRP2 mAb(37135)、抗人FTH1 mAb(4393)、抗人eIF4E mAb(2067)、抗人c-Myc mAb(5605)以及抗人β-肌动蛋白mAb(3700)(全部来自Cell Signaling,USA)。印迹用适当的二抗染色并使用奥德赛成像系统(odyssey imaging system，LICOR，Lincoln NE,USA)进行可视化，并且使用ImageJ软件(1.48v)进行定量。
RNA测序
RNA-seq由Admera Health(USA)进行。简单来说，使用乙醇沉淀分离样品。使用Tapestation RNA HS测定(Agilent Technologies,USA)进行质量检查，并通过Qubit RNAHS测定(Thermo Fisher Scientific)进行定量。使用Ribo-zero Magnetic Gold试剂盒(MRZG12324，Illumina Inc.,USA)进行核糖体RNA清除。基于制造商的建议(
Figure BDA0003509444050000881
UltraTMRNA Library Prep Kit for
Figure BDA0003509444050000882
)对样品进行随机致敏(primed)和片段化。第一链使用Protoscript II逆转录酶以更长的延伸期合成(40min，42℃)。文库构建的所有其余步骤均根据
Figure BDA0003509444050000883
UltraTM RNA Library Prep Kit for
Figure BDA0003509444050000884
使用。使用了Illumina 8-nt双索引。将样品汇集并且以150双端的读段长度配置在HiSeq上测序。
利用STAR(2.5.24版)以多定位设置“--outFilterMultimapNmax 10--outSAMmultNmax 1”将读段与人基因组(UCSC版本hg38AnalysisSet)比对。使用samtools(1.7版)对输出进行排序和索引，并使用picard markDuplicates(2.9.2版)折叠在不同测序通道上运行的样品。假设外显子联合模型(RefSeq基因于2017-09-015从UCSC下载)，使用QuasR(1.20.0版)的qCount函数计算与每个基因的外显子重叠的读段(5'端)数量。所有后续基因表达数据分析均在R软件(R Foundation for Statistical Computing，奥地利维也纳)内完成。使用edgeR包(3.22.5版)鉴定差异表达的基因。
定量实时PCR
使用Trizol(Thermo Fisher Scientific)和氯仿(Sigma-Aldrich)根据制造商的方案从NK细胞中分离RNA，然后用RNeasy RNA纯化迷你试剂盒(QIAGEN，德国)进行纯化。使用NanoDrop 2000C(Thermo Fisher Scientific)确定RNA浓度。由纯化的RNA，使用逆转录酶试剂盒GoScriptTM Reverse Transcriptase(Promega)合成cDNA。使用来自LifeTechnologies的商业设计的引物(Hs00989291_m1、Hs00951083_m1、Hs03003631_g1)重复三次进行IFNG、TFRC和18SmRNA的定量PCR。使用Go Tag G2 DNA聚合酶(Promega)根据制造商的方案进行PCR反应。
RNA介导的干扰
使用AMAXA细胞系V核转染试剂盒(Lonza)，用靶向ACO1、IREB2的siRNA或对照杂混的siRNA(各10pmol)(QIAGEN)的汇集物转染NK92、NKL或Jurkat细胞(2×106)。然后将细胞静置72小时并进行表型和功能分析。通过相应蛋白质的免疫印迹分析评估敲落效率。
CRISPR编辑
制备具有1ml的含有IL-2的R10AB(50U/ml；NK92细胞)或R10FBS(Jurkat细胞)的24孔细胞培养板，并在37℃下预热。对于CRISPR-Cas9介导的IREB2基因敲除，使用来自IDT的以下sgRNA：Hs.Cas9.IREB2.1 AA(参考号220257866)或Alt-R CRISPR-Cas9阴性对照(参考号224163224)。向导RNA复合物通过以下方法形成：以20μM的浓度，将等摩尔量的crRNA和tracrRNA组合于IDT Duplex缓冲液(30mM HEPES，pH 4.5，100mM乙酸钾)中，通过将oligos在95℃下加热5min并缓慢冷却至室温。添加等体积的CAS9核酸酶(QB3 MacroLab，伯克利的加利福尼亚大学(University of California,Berkeley))并在室温下孵育15min。将NK92或Jurkat细胞(2×106)在PBS中洗涤并重悬于电穿孔溶液(AMAXA细胞系V核转染试剂盒，Lonza)中。添加RNP溶液(最终RNP浓度为3μM)并使用推荐的程序进行电穿孔。将细胞转移到预热的培养基中，并在指定的时间点静置细胞。使NK92细胞静置5天，然后进行表型和功能分析。通过免疫印迹评估IRP2的敲落效率。使Jurkat细胞静置2天，然后将单细胞分选到96孔板中。扩增克隆并通过免疫印迹分析评估IRP2的敲除效率，并且扩增阳性克隆以进行表型和功能分析以及IRP2的慢病毒转导。
IRP2 CAR构建
将人IRP2合成为基因串(GeneArt，Thermo Fischer Scientific)。然后将IRP2(NM_004136.4)克隆到第三代自失活慢病毒表达载体pELNS中，其表达由延伸因子1α(EF-1α)启动子驱动，与T2A和第二代抗PSMA CAR同框。衍生自单克隆抗体J591的抗PSMA CAR的scfv用作肿瘤靶向部分，而细胞内结构域由CD28共刺激结构域和CD3ζ链组成。在对照载体中，IRP2已被报告基因eGFP取代。
重组慢病毒产生
转染前24小时，接种HEK-293细胞(5×106个细胞/5ml培养基)。使用无内毒素质粒大提试剂盒(Endotoxin-free Plasmid Maxiprep Kit，Sigma)纯化所有质粒DNA。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)和Optimem培养基(Invitrogen、Life Technologies)，用1.3pmol psPAX2(慢病毒包装质粒)和0.72pmol pMD2G(VSV-G包膜表达质粒)以及1.64pmol的pLV-EF1A＞mCherry(ns):P2A:EGF或PLV-EIF1A＞hIREB2:P2A:EGFP(VectorBuilder)转染HEK-293T细胞。在转导后48和72小时收集病毒上清液。使用VIVASPIN 20(Sartorius)浓缩病毒颗粒，并将病毒上清液储存在-80℃下。
如Giordano-Attianese等人,Nat Biotechnol,2020,38,426-432)所述产生CAR构建体的慢病毒颗粒。
Jurkat细胞的慢病毒转导
使用R10FBS，将Jurkat细胞接种在U形底的96孔板中(5×105个细胞/孔)。将病毒上清液解冻，并以1:16至1:1’160’000的不同病毒稀释度转导Jurkat细胞。将板以400×g离心3分钟并在37℃下孵育24小时。然后改变培养基并使细胞再静置2天。通过利用流式细胞术分析GFP表达来评估转导效率。对GFP+细胞进行流式分选(频率为10-30％阳性细胞)并扩增以用于表型分析。通过免疫印迹分析评估IRP2的慢病毒过表达。
原代T细胞的慢病毒转导
在书面知情同意后从健康供体中获得血液样品。通过标准密度梯度离心方案(Lymphoprep；Fresenius Kabi)分离外周血单核细胞(PBMC)。使用磁性CD4+和CD8+珠粒(Miltenyi Biotec)对CD4+和CD8+T细胞进行正选。在R10AB中培养纯化的CD4+和CD8+T细胞。将CD4+和CD8+T细胞涂板到24孔细胞培养板中，并在含有IL-2(150U/ml)的R10AB中以1:1的比率用抗CD3和抗CD28单克隆抗体包被的珠粒(Invitrogen、Life Technologies)刺激。T细胞在激活后18-22小时在Retronectin(Takara Bio)包被的细胞培养板中用慢病毒颗粒转导。每24小时用新鲜的IL-2(150U/ml)更换培养基。转导后5天，通过流式细胞术分析细胞的CD71表达。使用CytoFLEX流式细胞仪(Beckman Coulter)采集样品。使用
Figure BDA0003509444050000911
_V10.5(Tree Star,USA)分析数据。如所描述的那样使用CAR构建体对原代T细胞进行慢病毒转导7。
转导的原代CAR T细胞的活化和增殖
将表达CAR或CAR_IREB2的转导T细胞调整为进行同等CAR表达。为了刺激CAR，使用了多克隆抗Fab抗体(Jackson Immuno Research)。简单来说，在37℃下，用20μg/ml在PBS中的抗Fab包被96孔板4小时。在激活之前，向原代T细胞中加载细胞增殖染料Cell Trace紫(CTV；1μM，Thermo Fisher Scientific)。将板洗涤两次并将染色的T细胞接种(1×105/孔)并刺激5天。通过流式细胞术分析CTV稀释度和CD71表达。使用BD FACS LSR II流式细胞仪(BD Bioscience)采集样品。使用
Figure BDA0003509444050000912
_V10.5(Tree Star,USA)分析数据。
统计分析
数据提供为平均值+/-SEM。使用GraphPad Prism 8.00(GraphPad Software)，通过使用未配对的双尾学生t检验或配对的双尾学生t检验来确定统计学显著性。为了比较配对样本中的增加(之前相对于之后)，使用简单的线性回归模型。小于0.05的P值被视为统计学显著的。
实施例9：IRP/IRE调节系统协调NK细胞中的CD71表达
迄今为止，所述实验确定(i)通过CD71摄取铁作为控制NK细胞增殖的关键代谢检查点；并且(ii)与NV NK细胞相比，CD71在活化的CE上优先上调。接下来，发明人的问题是CD71本身是如何在NV和CE NK细胞中被调节的。为了解决这个问题，发明人首先评估了CD71的诱导是否依赖于NK细胞转录活性。与先前的实验一样，CD71在细胞因子刺激的CE中的诱导程度高于NV NK细胞(图5A，上图)。在两个亚群中，转录抑制-使用放线菌素-完全阻止了刺激诱导的CD71上调，就像使用放线菌酮阻断翻译一样(图5A下图)。因此，在两个细胞亚群中类似地需要转录和翻译。接下来，我们检查了TFRC的转录可在NV与CE NK细胞之间受到差异调节的可能性。为此，我们分析了TFRC的转录物丰度。实际上，活化的CE中的TFRC mRNA水平高于NV NK细胞，但在刺激后在两个亚群中都被进一步诱导(图7A)。c-Myc是在各种免疫细胞中调节TFRC的关键转录因子。鉴于活化的CE中的TFRC mRNA的丰度增加高于NV NK细胞，CE NK细胞中的优先c-Myc诱导因此可以解释活化的CE与NV NK细胞之间的CD71差异调节。然而，c-Myc在两个NK细胞亚群中同等地被诱导(图5F)。这些数据共同确定了活化的NV和CE NK细胞对连续转录和翻译以支持CD71的表达的对称需求。
许多参与细胞铁稳态的基因在其mRNA的5’或3’UTR中含有铁反应元件(IRE)。铁调节蛋白1和2(IRP1和IRP2)结合IRE，从而控制mRNA稳定性和翻译。TFRC mRNA在3’UTR中含有5个IRE；其中IRP的结合使mRNA稳定并促进翻译。根据教科书，这发生在缺铁条件下。发明人推断，无论细胞铁丰度如何，IRP表达选择性地在CE NK细胞中增加将解释这些细胞中更高的TFRC转录物丰度和增强的活化依赖性CD71表达。支持这一观点，IRP1和IRP2的蛋白质丰度在静止和活化的CE NK细胞中都较高(图6A中图和下图)。这些数据与IRP以细胞亚群特异性方式(即，在CE NK细胞中)产生假性缺铁状态一致，因此在转录后水平上选择性地控制一组不同的蛋白质的丰度。为了进一步探讨这个概念，我们分析了FTH1(编码铁蛋白重链)的转录物和蛋白质丰度，其在5’UTR中含有IRE——其中IRP的结合抑制翻译。FTH1 mRNA在活化的CE NK细胞中增加(图7B)——尽管有这些更高的转录水平，但铁蛋白重链的蛋白质丰度(如果有的话)在未刺激和活化的CE NK细胞两者中都较低(图6E)。这一发现高度暗示了IRP以其CE相对于NV NK细胞特异性丰度在这些细胞中参与调节含有IRE的mRNA的翻译。
为了从基因上研究IRP在调节NK细胞的CD71-以及因此其增殖-中的作用，发明人继续利用NK细胞系NK92。在这些细胞中，IRP1和IRP2水平均使用siRNA方法各自选择性地降低(图7C-D)。值得注意的是，在IRP1沉默后没有观察到CD71蛋白表达的一致变化，而在IRP2沉默的细胞中，CD71丰度显著下降(图7E)。因此，在使IRP2沉默时也发现铁蛋白重链的表达增加，但IRP1没有(图7F)。为了确定这一发现的稳健性，发明人使用第二NK细胞系(NKL细胞)重复了这些实验。与NK92细胞类似，IRP2的沉默也在该细胞系中显著降低CD71并增加铁蛋白重链表达(图7G-K)。最后，使用CRISPR/Cas9技术敲除IRP2(图7L)也降低了NK92细胞中的CD71表达，这直接转化为增殖速率降低(图7M)。因此，这些数据概括了在CE相对于NV NK细胞中通过基因操纵获得的发现，并且确定了IRE/IRP调节轴——具体地IRE/IRP2——是通过控制CD71的表达调节NK细胞/NK细胞系中的增殖的重要系统。
实施例10：强制IRP表达是同样支持T细胞增殖的分子模块。
使用工程化的嵌合抗原受体(CAR)T细胞进行的过继性细胞治疗是用于控制各种恶性肿瘤，特别是治疗血液系统恶性肿瘤的一种有希望的方法。然而，并非所有患者都对CAR T细胞治疗产生应答，有些患者复发——并且实体癌的治疗仍然具有独特的挑战性。基于NK细胞研究的结果，发明人推断，基因强制假性缺铁也可特异性地改善(CAR)T细胞的活化驱动的(即邻近(context dependent)依赖性的)增殖-以及因此治疗潜力。为了开始检查IRP在调节T细胞中的CD71表达和相互关联的增殖中的作用，发明人首先使用siRNA技术抑制了Jurkat T细胞中的IRP1和IRP2的丰度(图8A-B)。与NK细胞系类似，IRP2的减少是减少CD71表达和增加铁蛋白重链的蛋白质丰度的主导因素(图8C-D)。相反，与用编码mCherry(LV-mCherry)的对照载体转导的细胞相比，IRP2敲除的(ko)Jurkat细胞中IRP2(LV-IREB2)的慢病毒过表达增加了CD71表达(图8E-F，左上图和左下图)。LV-IREB2依赖性增加的CD71细胞表面表达与更快的Jurkat T细胞增殖相关(图8F，右下图)。重要的是，CD71的表达在人原代CD4+和CD8+T细胞中也受LV-IREB2的慢病毒转导调节(图8G-H)。
在这些观察结果的鼓励下，发明人继续测试假性缺铁-通过IREB2的表达强制实现-在表达CAR的原代人T细胞中如何影响CD71的调节和相互关联的增殖。对于这些概念验证实验，使用了针对人前列腺特异性膜抗原(hPSMA)的CAR T细胞模型。CD4+T细胞使用编码CAR(CAR)或CAR和IRP2两者(CAR_IREB2)的载体进行慢病毒转导。通过蛋白质印迹分析证实了IRP2在CAR_IREB2 T细胞中的过表达(图8I)。当在非活化条件下评估时，IRP2的过表达不影响CD71的细胞表面表达(图8J，上图)。然而，在将CAR与α-Fab抗体交联后，与CAR T细胞相比，CAR_IREB2上的CD71表达始终较高(图8J，下图)。CAR_IREB2 T细胞不自发增殖(图8K，上图)，但增加的IRP2驱动的以及因此严格活化依赖性的CD71表达足以驱动优异的增殖(图8K，下图)。这些数据一起表明IRP2也在T细胞，特别是CAR T细胞中调节CD71的表达和相互关联的细胞增殖。重要的是，通过在CAR T细胞中过表达IRP2来诱导假性缺铁以严格活化依赖性(即邻近依赖性)方式增强增殖。
序列表
<110> 巴塞尔大学(Universität Basel)
<120> 细胞治疗方法
<130> AC2078 PCT BS
<150> EP 19 19 2299.6
<151> 2019-08-19
<160> 7
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 889
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> IRP1
<400> 1
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1 5 10 15
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<223> IRP2 同种型1
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275 280 285
Lys Pro Tyr Ile Arg Thr Ser Leu Ser Pro Gly Ser Gly Met Val Thr
290 295 300
His Tyr Leu Ser Ser Ser Gly Val Leu Pro Tyr Leu Ser Lys Leu Gly
305 310 315 320
Phe Glu Ile Val Gly Tyr Gly Cys Ser Ile Cys Val Gly Asn Thr Ala
325 330 335
Pro Leu Ser Asp Ala Val Leu Asn Ala Val Lys Gln Gly Asp Leu Val
340 345 350
Thr Cys Gly Ile Leu Ser Gly Asn Lys Asn Phe Glu Gly Arg Leu Cys
355 360 365
Asp Cys Val Arg Ala Asn Tyr Leu Ala Ser Pro Pro Leu Val Val Ala
370 375 380
Tyr Ala Ile Ala Gly Thr Val Asn Ile Asp Phe Gln Thr Glu Pro Leu
385 390 395 400
Gly Thr Asp Pro Thr Gly Lys Asn Ile Tyr Leu His Asp Ile Trp Pro
405 410 415
Ser Arg Glu Glu Val His Arg Val Glu Glu Glu His Val Ile Leu Ser
420 425 430
Met Phe Lys Ala Leu Lys Asp Lys Ile Glu Met Gly Asn Lys Arg Trp
435 440 445
Asn Ser Leu Glu Ala Pro Asp Ser Val Leu Phe Pro Trp Asp Leu Lys
450 455 460
Ser Thr Tyr Ile Arg Cys Pro Ser Phe Phe Asp Lys Leu Thr Lys Glu
465 470 475 480
Pro Ile Ala Leu Gln Ala Ile Glu Asn Ala His Val Leu Leu Tyr Leu
485 490 495
Gly Asp Ser Val Thr Thr Asp His Ile Ser Pro Ala Gly Ser Ile Ala
500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
Thr Arg Gly Thr Phe Ala Asn Ile Lys Leu Phe Asn Lys Phe Ile Gly
545 550 555 560
Lys Pro Ala Pro Lys Thr Ile His Phe Pro Ser Gly Gln Thr Leu Asp
565 570 575
Val Phe Glu Ala Ala Glu Leu Tyr Gln Lys Glu Gly Ile Pro Leu Ile
580 585 590
Ile Leu Ala Gly Lys Lys Tyr Gly Ser Gly Asn Ser Arg Asp Trp Ala
595 600 605
Ala Lys Gly Pro Tyr Leu Leu Gly Val Lys Ala Val Leu Ala Glu Ser
610 615 620
Tyr Glu Lys Ile His Lys Asp His Leu Ile Gly Ile Gly Ile Ala Pro
625 630 635 640
Leu Gln Phe Leu Pro Gly Glu Asn Ala Asp Ser Leu Gly Leu Ser Gly
645 650 655
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660 665 670
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> IRP2 同种型3 序列1
<400> 4
Met Lys Lys Glu Asp Val Met Asn Ile Leu Asp Trp Lys Thr Lys Gln
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Ser Asn Val Glu Val Pro Phe Phe Pro Ala Arg Val Leu Leu Gln Asp
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50 55 60
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65 70 75 80
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Gln Glu Val Glu Phe Gly Arg Asn Arg Glu Arg Leu Gln Phe Phe Lys
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Gly Ile Glu Thr Glu Ala Val Met Leu Gly Leu Pro Val Ser Leu Thr
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275 280 285
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Tyr Gly Ala Ile Leu Ser Phe Phe Pro Val Asp Asn Val Thr Leu Lys
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340 345 350
Thr Tyr Leu Lys Ala Val Lys Leu Phe Arg Asn Asp Gln Asn Ser Ser
355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
Thr Asp Met Lys Ser Asp Phe Gln Ala Cys Leu Asn Glu Lys Val Gly
405 410 415
Phe Lys Gly Phe Gln Ile Ala Ala Glu Lys Gln Lys Asp Ile Val Ser
420 425 430
Ile His Tyr Glu Gly Ser Glu Tyr Lys Leu Ser His Gly Ser Val Val
435 440 445
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Leu Ala Ala Gly Leu Leu Ala Lys Lys Ala Val Glu Ala Gly Leu Arg
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Cys Asp Cys Val Arg Ala Asn Tyr Leu Ala Ser Pro Pro Leu Val Val
565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
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Ser Met Phe Lys Ala Leu Lys Asp Lys Ile Glu Met Gly Asn Lys Arg
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Trp Asn Ser Leu Glu Ala Pro Asp Ser Val Leu Phe Pro Trp Asp Leu
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Glu Pro Ile Ala Leu Gln Ala Ile Glu Asn Ala His Val Leu Leu Tyr
675 680 685
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<211> 906
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> IRP2 同种型3 序列2
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Met Lys Lys Glu Asp Val Met Asn Ile Leu Asp Trp Lys Thr Lys Gln
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Ser Asn Val Glu Val Pro Phe Phe Pro Ala Arg Val Leu Leu Gln Asp
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Phe Thr Gly Ile Pro Ala Met Val Asp Phe Ala Ala Met Arg Glu Ala
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Trp Ser Ser Arg Val Phe Lys Asn Val Ala Val Ile Pro Pro Gly Thr
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Gly Ile Glu Thr Glu Ala Val Met Leu Gly Leu Pro Val Ser Leu Thr
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Leu Pro Glu Val Val Gly Cys Glu Leu Thr Gly Ser Ser Asn Pro Phe
260 265 270
Val Thr Ser Ile Asp Val Val Leu Gly Ile Thr Lys His Leu Arg Gln
275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
Tyr Gly Ala Ile Leu Ser Phe Phe Pro Val Asp Asn Val Thr Leu Lys
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His Leu Glu His Thr Gly Phe Ser Lys Ala Lys Leu Glu Ser Met Glu
340 345 350
Thr Tyr Leu Lys Ala Val Lys Leu Phe Arg Asn Asp Gln Asn Ser Ser
355 360 365
Gly Glu Pro Glu Tyr Ser Gln Val Ile Gln Ile Asn Leu Asn Ser Ile
370 375 380
Val Pro Ser Val Ser Gly Pro Lys Arg Pro Gln Asp Arg Val Ala Val
385 390 395 400
Thr Asp Met Lys Ser Asp Phe Gln Ala Cys Leu Asn Glu Lys Val Gly
405 410 415
Phe Lys Gly Phe Gln Ile Ala Ala Glu Lys Gln Lys Asp Ile Val Ser
420 425 430
Ile His Tyr Glu Gly Ser Glu Tyr Lys Leu Ser His Gly Ser Val Val
435 440 445
Ile Ala Ala Val Ile Ser Cys Thr Asn Asn Cys Asn Pro Ser Val Met
450 455 460
Leu Ala Ala Gly Leu Leu Ala Lys Lys Ala Val Glu Ala Gly Leu Arg
465 470 475 480
Val Lys Pro Tyr Ile Arg Thr Ser Leu Ser Pro Gly Ser Gly Met Val
485 490 495
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Gly Phe Glu Ile Val Gly Tyr Gly Cys Ser Thr Cys Val Gly Asn Thr
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Ala Pro Leu Ser Asp Ala Val Leu Asn Ala Val Lys Gln Gly Asp Leu
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Val Thr Cys Gly Ile Leu Ser Gly Asn Lys Asn Phe Glu Gly Arg Leu
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565 570 575
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580 585 590
Leu Gly Thr Asp Pro Thr Gly Lys Asn Ile Tyr Leu His Asp Ile Trp
595 600 605
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610 615 620
Ser Met Phe Lys Ala Leu Lys Asp Lys Ile Glu Met Gly Asn Lys Arg
625 630 635 640
Trp Asn Ser Leu Glu Ala Pro Asp Ser Val Leu Phe Pro Trp Asp Leu
645 650 655
Lys Ser Thr Tyr Ile Arg Cys Pro Ser Phe Phe Asp Lys Leu Thr Lys
660 665 670
Glu Pro Ile Ala Leu Gln Ala Ile Glu Asn Ala His Val Leu Leu Tyr
675 680 685
Leu Gly Asp Ser Val Thr Thr Asp His Ile Ser Pro Ala Gly Ser Ile
690 695 700
Ala Arg Asn Ser Ala Ala Ala Lys Tyr Leu Thr Asn Arg Gly Leu Thr
705 710 715 720
Pro Arg Glu Phe Asn Ser Tyr Gly Ala Arg Arg Gly Asn Asp Ala Val
725 730 735
Met Thr Arg Gly Thr Phe Ala Asn Ile Lys Leu Phe Asn Lys Phe Ile
740 745 750
Gly Lys Pro Ala Pro Lys Thr Ile His Phe Pro Ser Gly Gln Thr Leu
755 760 765
Asp Val Phe Glu Ala Ala Glu Leu Tyr Gln Lys Glu Gly Ile Pro Leu
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Ile Ile Leu Ala Gly Lys Lys Tyr Gly Ser Gly Asn Ser Arg Asp Trp
785 790 795 800
Ala Ala Lys Gly Pro Tyr Leu Leu Gly Val Lys Ala Val Leu Ala Glu
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Ser Tyr Glu Lys Ile His Lys Asp His Leu Ile Gly Ile Gly Ile Ala
820 825 830
Pro Leu Gln Phe Leu Pro Gly Glu Asn Ala Asp Ser Leu Gly Leu Ser
835 840 845
Gly Arg Glu Thr Phe Ser Leu Thr Phe Pro Glu Glu Leu Ser Pro Gly
850 855 860
Ile Thr Leu Asn Ile Gln Thr Ser Thr Gly Lys Val Phe Ser Val Ile
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Ala Ser Phe Glu Asp Asp Val Glu Ile Thr Leu Tyr Lys His Gly Gly
885 890 895
Leu Leu Asn Phe Val Ala Arg Lys Phe Ser
900 905
<210> 6
<211> 343
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> IRP2 同种型4
<400> 6
Met Asp Ala Pro Lys Ala Gly Tyr Ala Phe Glu Tyr Leu Ile Glu Thr
1 5 10 15
Leu Asn Asp Ser Ser His Lys Lys Phe Phe Asp Val Ser Lys Leu Gly
20 25 30
Thr Lys Tyr Asp Val Leu Pro Tyr Ser Ile Arg Val Leu Leu Glu Ala
35 40 45
Ala Val Arg Asn Cys Asp Gly Phe Leu Met Lys Lys Glu Asp Val Met
50 55 60
Asn Ile Leu Asp Trp Lys Thr Lys Gln Ser Asn Val Glu Val Pro Phe
65 70 75 80
Phe Pro Ala Arg Val Leu Leu Gln Asp Phe Thr Gly Ile Pro Ala Met
85 90 95
Val Asp Phe Ala Ala Met Arg Glu Ala Val Lys Thr Leu Gly Gly Asp
100 105 110
Pro Glu Lys Val His Pro Ala Cys Pro Thr Asp Leu Thr Val Asp His
115 120 125
Ser Leu Gln Ile Asp Phe Ser Lys Cys Ala Ile Gln Asn Ala Pro Asn
130 135 140
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145 150 155 160
Val Gln Pro Lys Lys Leu Pro Cys Arg Gly Gln Thr Thr Cys Arg Gly
165 170 175
Ser Cys Asp Ser Gly Glu Leu Gly Arg Asn Ser Gly Thr Phe Ser Ser
180 185 190
Gln Ile Glu Asn Thr Pro Ile Leu Cys Pro Phe His Leu Gln Pro Val
195 200 205
Pro Glu Pro Glu Thr Val Leu Lys Asn Gln Glu Val Glu Phe Gly Arg
210 215 220
Asn Arg Glu Arg Leu Gln Phe Phe Lys Trp Ser Ser Arg Val Phe Lys
225 230 235 240
Asn Val Ala Val Ile Pro Pro Gly Thr Gly Met Ala His Gln Ile Asn
245 250 255
Leu Glu Tyr Leu Ser Arg Val Val Phe Glu Glu Lys Asp Leu Leu Phe
260 265 270
Pro Asp Ser Val Val Gly Thr Asp Ser His Ile Thr Met Val Asn Gly
275 280 285
Leu Gly Ile Leu Gly Trp Gly Val Gly Gly Ile Glu Thr Glu Ala Val
290 295 300
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305 310 315 320
Glu Leu Thr Gly Ser Ser Asn Pro Phe Val Thr Ser Ile Asp Val Val
325 330 335
Leu Gly Ile Thr Lys Val Ser
340
<210> 7
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> T2A 肽
<400> 7
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro

Claims (48)

1.一种淋巴细胞，其包含编码至少一种铁调节蛋白(IRP)的合成多核苷酸，其中所述至少一种铁调节蛋白是IRP1(SEQ ID NO:1)和/或IRP2(SEQ ID NO:2-6)。
2.根据权利要求1所述的淋巴细胞，其中所述合成多核苷酸编码如SEQ ID NO:2所示的IRP2。
3.根据权利要求1或2所述的淋巴细胞，其中所述淋巴细胞是T细胞或自然杀伤(NK)细胞。
4.根据权利要求3所述的淋巴细胞，其中所述淋巴细胞是肿瘤浸润性淋巴细胞、修饰的T细胞或病毒特异性T细胞。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的淋巴细胞，其中所述至少一种铁调节蛋白是组成型表达的。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的淋巴细胞，其中所述编码至少一种铁调节蛋白的合成多核苷酸处于组成型启动子的控制下。
7.根据权利要求6所述的淋巴细胞，其中所述组成型启动子是EF-1α启动子。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的淋巴细胞，其中所述淋巴细胞还包含嵌合抗原受体(CAR)。
9.根据权利要求8所述的淋巴细胞，其中所述CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区域以及信号传导结构域。
10.根据权利要求9所述的淋巴细胞，其中所述抗原结合结构域是抗体或其抗原结合片段。
11.根据权利要求10所述的淋巴细胞，其中所述抗原结合片段是Fab或scFv。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的淋巴细胞，其中所述抗原结合结构域特异性地结合肿瘤抗原或病毒抗原。
13.根据权利要求12所述的淋巴细胞，其中所述肿瘤抗原存在于靶细胞群或组织的细胞表面上。
14.根据权利要求8至13中任一项所述的淋巴细胞，其中所述CAR由多核苷酸编码，其中编码CAR的多核苷酸与编码IRP1和/或IRP2的合成多核苷酸转录连接。
15.根据权利要求14所述的淋巴细胞，其中所述编码CAR的多核苷酸和所述编码IRP1和/或IRP2的合成多核苷酸通过编码自切割肽的多核苷酸连接。
16.根据权利要求15所述的淋巴细胞，其中所述自切割肽是2A自切割肽。
17.根据权利要求15或16所述的淋巴细胞，其中所述自切割肽是T2A。
18.一种病毒载体，其包含至少一个编码IRP1(SEQ ID NO:1)和/或IRP2(SEQ ID NO:2-6)的多核苷酸。
19.根据权利要求18所述的病毒载体，其中所述病毒载体包含编码如SEQ ID NO:2所示的IRP2的多核苷酸。
20.根据权利要求18或19所述的病毒载体，其中所述病毒载体来源于慢病毒、腺相关病毒(AAV)、腺病毒、单纯疱疹病毒、逆转录病毒、甲病毒、黄病毒、弹状病毒、麻疹病毒、新城疫病毒或痘病毒。
21.根据权利要求20所述的病毒载体，其中所述病毒载体来源于慢病毒。
22.根据权利要求18至22中任一项所述的病毒载体，其中所述至少一个编码IRP1和/或IRP2的多核苷酸处于组成型启动子的控制下。
23.根据权利要求22所述的病毒载体，其中所述组成型启动子是EF-1α启动子。
24.根据权利要求18至23中任一项所述的病毒载体，其中所述病毒载体包含另一编码CAR的多核苷酸。
25.根据权利要求24所述的病毒载体，其中所述编码CAR的多核苷酸与所述编码IRP1和/或IRP2的多核苷酸转录连接。
26.根据权利要求25所述的病毒载体，其中所述编码CAR的多核苷酸和所述编码IRP1和/或IRP2的多核苷酸通过编码自切割肽的多核苷酸连接。
27.根据权利要求26所述的病毒载体，其中所述自切割肽是2A自切割肽。
28.根据权利要求26或27所述的病毒载体，其中所述自切割肽是T2A。
29.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至17中任一项所述的淋巴细胞或根据权利要求18至28中任一项所述的病毒载体以及药学上可接受的载剂。
30.根据权利要求1至17中任一项所述的淋巴细胞、根据权利要求18至28中任一项所述的病毒载体或根据权利要求29所述的药物组合物，其用于在治疗中使用。
31.根据权利要求1至17中任一项所述的淋巴细胞、根据权利要求18至28中任一项所述的病毒载体或根据权利要求29所述的药物组合物，其用于治疗癌症。
32.根据权利要求31所述所述用途的淋巴细胞、病毒载体或药物组合物，其中所述癌症是血液系统癌症或实体肿瘤。
33.根据权利要求32所述所述用途的淋巴细胞、病毒载体或药物组合物，其中所述血液系统癌症是急性成淋巴细胞性白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血病或多发性骨髓瘤，并且其中所述实体肿瘤是结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、肝细胞癌、肺癌、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤或肉瘤。
34.根据权利要求1至17中任一项所述的淋巴细胞、根据权利要求18至28中任一项所述的病毒载体或根据权利要求29所述的药物组合物，其用于预防和/或治疗病毒感染。
35.根据权利要求34所述所述用途的淋巴细胞、病毒载体或药物组合物，其中所述病毒感染是由人免疫缺陷病毒(HIV)、腺病毒、多瘤病毒、流感病毒或人疱疹病毒引起的，具体地，其中所述人疱疹病毒是巨细胞病毒(CMV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、单纯疱疹病毒(HSV)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)或人疱疹病毒8(HHV8)。
36.一种用于治疗患有癌症的受试者或用于预防和/或治疗受试者的病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至17中任一项所述的淋巴细胞、根据权利要求18至28中任一项所述的病毒载体或根据权利要求29所述的药物组合物。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述癌症是血液系统癌症或实体肿瘤，具体地，其中所述血液系统癌症是急性成淋巴细胞性白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血病或多发性骨髓瘤，并且其中所述实体肿瘤是结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、肝细胞癌、肺癌、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤或肉瘤。
38.根据权利要求36所述的方法，其中所述病毒感染是由人免疫缺陷病毒(HIV)、腺病毒、多瘤病毒、流感病毒或人疱疹病毒引起的，具体地，其中所述人疱疹病毒是巨细胞病毒(CMV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、单纯疱疹病毒(HSV)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)或人疱疹病毒8(HHV8)。
39.一种用于产生根据权利要求1至17中任一项所述的淋巴细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供从受试者获得的淋巴细胞；
b)将编码至少一种铁调节蛋白的合成多核苷酸引入步骤(a)的所述淋巴细胞中，其中所述铁调节蛋白是IRP1(SEQ ID NO:1)和/或IRP2(SEQ ID NO:2-6)；以及
c)表达由已在步骤(b)中引入所述淋巴细胞中的所述合成多核苷酸编码的所述至少一种铁调节蛋白。
40.根据权利要求39所述的方法，其中在步骤(b)中将编码嵌合抗原受体(CAR)的第二合成多核苷酸引入所述淋巴细胞中。
41.根据权利要求40所述的方法，其中将所述合编码CAR的成多核苷酸与编码IRP1和/或IRP2的合成多核苷酸组合。
42.根据权利要求40或41所述的方法，其中将所述编码CAR的合成多核苷酸与所述编码IRP1和/或IRP2的合成多核苷酸转录连接。
43.根据权利要求40至42所述的方法，其中所述编码CAR的合成多核苷酸和所述编码IRP1和/或IRP2的多核苷酸通过编码自切割肽的多核苷酸连接。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述自切割肽是2A自切割肽。
45.根据权利要求43或44所述的方法，其中所述自切割肽是T2A。
46.根据权利要求39至45中任一项所述的方法，其中通过病毒转导将所述一个或多个合成多核苷酸引入所述淋巴细胞中。
47.根据权利要求46所述的方法，其中病毒转导使用根据权利要求18至28中任一项所述的病毒载体进行。
48.根据权利要求39至47中任一项所述的方法，其中在将所述一个或多个合成多核苷酸引入所述淋巴细胞中之前或之后激活所述淋巴细胞。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR901228A (fr) 1943-01-16 1945-07-20 Deutsche Edelstahlwerke Ag Système d'aimant à entrefer annulaire
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US5585362A (en) 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
US5199942A (en) 1991-06-07 1993-04-06 Immunex Corporation Method for improving autologous transplantation
US5350674A (en) 1992-09-04 1994-09-27 Becton, Dickinson And Company Intrinsic factor - horse peroxidase conjugates and a method for increasing the stability thereof
WO1994012520A1 (en) 1992-11-20 1994-06-09 Enzon, Inc. Linker for linked fusion polypeptides
US5747654A (en) 1993-06-14 1998-05-05 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant disulfide-stabilized polypeptide fragments having binding specificity
JP2003516124A (ja) 1999-10-15 2003-05-13 ユニバーシティー オブ マサチューセッツ 標的とした遺伝的干渉の手段としてのｒｎａ干渉経路遺伝子
US6326193B1 (en) 1999-11-05 2001-12-04 Cambria Biosciences, Llc Insect control agent
AU2001275474A1 (en) 2000-06-12 2001-12-24 Akkadix Corporation Materials and methods for the control of nematodes
US7745140B2 (en) 2002-01-03 2010-06-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Activation and expansion of T-cells using an engineered multivalent signaling platform as a research tool
US7754482B2 (en) 2004-05-27 2010-07-13 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Artificial antigen presenting cells and uses therefor
JOP20190224A1 (ar) 2017-03-29 2019-09-26 Iovance Biotherapeutics Inc عمليات من أجل إنتاج الخلايا اللمفاوية المرتشحة للأورام واستخداماتها في العلاج المناعي

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