CN111549044B - 靶向trbc1 car-t细胞的制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供靶向TRBC1 CAR‑T细胞的制备方法与应用。本发明还提供编码TRBC1 CAR的基因和包含所述基因的生物材料以及TRBC1 CAR感染T细胞前需删除TRBC1阳性T细胞从而构建TRBC1 CAR‑T的方法。T细胞包含TRBC1阳性（C1）和阴性（C2）细胞，因此TRBC1 CAR感染T细胞，不仅导入C2（CAR‑C2），而且会导入C1（CAR‑C1），CAR‑C1的CAR与自身TRBC1结合从而导致TRBC1不被其他TRBC1 CAR‑T识别，而且导致CAR‑C1杀伤能力下降。因此制备TRBC1 CAR‑T时，需预先去除TRBC1阳性T细胞。

Description

靶向TRBC1 CAR-T细胞的制备方法与应用
技术领域
本发明涉及免疫治疗领域，具体地说，涉及一种靶向TRBC1 CAR-T细胞的制备方法与应用。
背景技术
T细胞白血病和淋巴瘤侵袭性较强，且缺乏有效靶向治疗手段，5年生存率较低。因此，亟需探索治疗T细胞白血病和淋巴瘤的新方法。
嵌合抗原受体（Chimeric antigen receptor，CAR）基因修饰T 细胞（CAR-T）疗法通过基因工程技术将识别肿瘤细胞且能激活T细胞的CAR体外导入患者外周血T细胞，赋予T细胞识别和杀伤肿瘤细胞的能力，再将改造过的T细胞回输给患者，从而达到控制甚至清除肿瘤的一种免疫治疗技术。虽然CAR-T疗法在B细胞白血病和淋巴瘤治疗中取得显著疗效，然而正常T细胞、肿瘤T细胞和治疗性T细胞的相似性限制了CAR-T免疫疗法在T细胞恶性肿瘤中的应用。
T细胞受体（T cell receptor，TCR）是T细胞特异且广泛表达的一种膜蛋白，包括正常和恶性T细胞，因此TCR可以作为T细胞肿瘤的CAR-T识别靶点。TCR 由α和β链组成，二者均分别包含可变区和恒定区，其中TCRβ链恒定区的编码基因为TRBC1或TRBC2，即每个T细胞TCRβ链恒定区随机表达TRBC1或TRBC2，因此人体正常T细胞由表达TRBC1和TRBC2的T细胞亚群组成（图1）。由于T细胞随机表达TRBC1或TRBC2，因此每类功能T细胞中表达TRBC1和TRBC2的比例相对稳定（TRBC1:TRBC2约1:2），例如CD4阳性和CD8阳性T细胞中表达TRBC1和TRBC2的比例相近，因此全部删失TRBC1阳性T细胞或TRBC2阳性T细胞都会保留部分功能T细胞而不会对免疫系统造成严重破坏。然而，T细胞来源的肿瘤细胞是单克隆起源，仅表达TRBC1或TRBC2，因此靶向识别TRBC1或TRBC2的CAR-T细胞，预期不仅可以消除T细胞来源的肿瘤细胞而且还可以保留部分正常T细胞。因此，TRBC1和TRBC2分子是T细胞恶性肿瘤潜在的CAR-T治疗靶点。
发明内容
本发明的目的是提供一种靶向TRBC1 CAR-T细胞的制备方法与应用。
本发明的另一目的是提供编码TRBC1 CAR的基因和包含该基因的生物材料以及TRBC1 CAR感染T细胞前需删除TRBC1阳性T细胞从而构建TRBC1 CAR-T的方法。。
本发明构思如下：JOVI-1抗体可以特异识别TRBC1，其轻链可变区和重链可变区用于构建TRBC1 CAR慢病毒载体，并将其感染患者外周血T细胞（TRBC1 CAR-T）可以靶向识别和杀伤TRBC1阳性肿瘤细胞，但由于外周血T细胞中存在TRBC1阳性（C1）和阴性（C2）两群T细胞，因此TRBC1 CAR慢病毒感染外周血T细胞时，不仅会导入C2细胞（CAR-C2），而且会不可避免地导入C1细胞（CAR-C1），研究人员发现：（1）CAR-C1细胞中的CAR与自身的TRBC1结合从而导致TRBC1不能被其他TRBC1 CAR-T细胞识别；（2）大量CAR被自身TRBC1结合而不能识别靶细胞的TRBC1从而导致CAR-C1细胞识别和杀伤靶细胞的能力下降；（3）CAR-C2细胞中混有TRBC1阳性T细胞会加速TRBC1 CAR-T细胞的衰竭和终末分化。
TRBC1 CAR-T细胞可以特异识别和杀伤TRBC1阳性肿瘤细胞，可作为TRBC1阳性T细胞恶性肿瘤患者潜在有效的治疗方法，但制备TRBC1 CAR-T细胞前必须预先去除其中TRBC1阳性T细胞。本发明为TRBC1阳性T细胞恶性肿瘤的CAR-T细胞治疗提供有力工具。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种靶向T细胞TRBC1的CAR基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码蛋白的氨基酸如SEQ ID NO:2所示。
本发明中，CAR的设计包含CD8α信号肽，anti-TRBC1轻链可变区，连接接头，anti-TRBC1重链可变区，CD8α铰链区，CD8α跨膜区，4-1BB，CD3 ζ胞内信号区和FLAG-tag，并进行全基因合成，CAR的结构示意图见图3。将合成的基因通过EcoR I与Sal I双酶切，克隆到慢病毒载体pCDH-EF1-Luc2-T2A-tdTomato中，并命名为pCDH-EF1-TRBC1 CAR。
第二方面，本发明提供含有所述CAR基因的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体（如慢病毒或逆转录病毒）、工程菌或转基因细胞系。
第三方面，本发明提供一种靶向TRBC1阳性T细胞的慢病毒载体，所述慢病毒载体携带有所述CAR基因。
所述慢病毒载体的出发载体可以是pCDH-EF1-Luc2-T2A-tdTomato。
第四方面，本发明提供靶向TRBC1阳性T细胞的慢病毒载体的制备方法，包括：将所述CAR基因构建到载体pCDH-EF1-Luc2-T2A-tdTomato的XbaI和SalI酶切位点之间。
第五方面，本发明提供所述CAR基因、含有所述CAR基因的生物材料、携带有CAR基因的慢病毒载体，或按照上述方法制备的慢病毒载体在制备靶向TRBC1的CAR-T细胞中的应用。
第六方面，本发明提供靶向TRBC1的CAR-T细胞的制备方法，包括：将所述CAR基因通过慢病毒载体导入TRBC2阳性T细胞中，使CAR基因整合到T细胞基因组上，从而实现目的基因在TRBC2阳性T细胞中的表达。具体如下：
1）按照前述方法制备慢病毒载体，用携带有CAR基因的慢病毒载体转染宿主细胞（如293ft细胞），产生慢病毒；
2）利用流式细胞仪或磁珠从外周血中分离出TRBC2阳性T细胞，并用慢病毒感染TRBC2阳性T细胞。
TRBC2阳性T细胞的获得方法包括：向外周血T细胞中加入JOVI-1抗体，通过流式细胞仪或磁珠去除TRBC1阳性T细胞（TRBC1+ T细胞，记为C1），从而获得TRBC2阳性T细胞（TRBC2+ T细胞，记为C2）。
第七方面，本发明提供按照上述方法制备的靶向TRBC1的CAR-T细胞。
第八方面，本发明提供所述CAR-T细胞的以下任一应用：
i）用于治疗T细胞淋巴瘤和T细胞白血病；
ii）用于制备治疗T细胞淋巴瘤和T细胞白血病的药物或组合物。
第九方面，本发明提供用于治疗T细胞淋巴瘤和T细胞白血病的药物或组合物，有效成分为所述CAR-T细胞。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
由于外周血T细胞中存在TRBC1阳性（C1）和阴性（C2）两群T细胞，因此TRBC1 CAR慢病毒感染外周血T细胞时，不仅会导入C2细胞（CAR-C2），而且会不可避免地导入C1细胞（CAR-C1），本发明首次发现：（1）CAR-C1细胞中的CAR与自身的TRBC1结合从而导致TRBC1不能被其他TRBC1 CAR-T细胞识别；（2）大量CAR被自身TRBC1结合而不能识别靶细胞的TRBC1从而导致CAR-C1细胞识别和杀伤靶细胞的能力下降；（3）CAR-C2细胞中混有TRBC1阳性T细胞会加速TRBC1 CAR-T细胞的衰竭和终末分化。
本发明在CAR-T细胞制备过程中，通过预先去除TRBC1阳性T细胞，所制备的靶向TRBC1的CAR-T细胞（即CAR-C2细胞）对T细胞淋巴瘤和T细胞白血病具有更好的治疗效果。
附图说明
图1为本发明中TRBC1与TRBC2的结构；其中，a：组成TCR分子的α链和β链及其结构；b：αβ TCR β链基因重排示意图。
图2为本发明中靶向TRBC1 CAR感染T细胞后的分类和相互关系。TRBC1阳性T细胞（C1），TRBC1阴性T细胞（C2）, 表达靶向TRBC1 CAR的TRBC1阳性T细胞（CAR-C1）和表达靶向TRBC1 CAR的TRBC1阴性T细胞（CAR-C2）。
图3为本发明中靶向T细胞TRBC1的CAR的结构示意图。
图4为本发明较佳实施例中T细胞分选为TRBC1阳性T细胞（左）和TRBC1阴性T（右）细胞后TRBC1表达检测结果。
图5为本发明较佳实施例中慢病毒感染TRBC1阳性T细胞和TRBC1阴性T细胞感染效率。
图6为本发明较佳实施例中CAR-C1和CAR-C2细胞TRBC1表达情况。
图7为本发明较佳实施例中CAR-C1,CAR-C2细胞与C1,CAR-C1,C2细胞共孵育后IFN-γ分泌水平。
图8为本发明较佳实施例中CAR-C1和CAR-C2细胞与C1,CAR-C1,C2细胞共孵育后CD107a表达情况。
图9为本发明较佳实施例中CAR-C1和CAR-C2细胞不同效靶比杀伤C1,CAR-C1,C2细胞的情况。
图10为本发明较佳实施例中CAR-C2细胞与C1细胞共孵育后终末期分化情况。初始T细胞（naïve T，CD45RA+ CCR7+）；中枢记忆T细胞（TCM，CD45RA- CCR7+）效应记忆T细胞（TEM，CD45RA- CCR7-）与效应T细胞（Effector T, CD45RA+ CCR7-）。
图11为本发明较佳实施例中CAR-C2细胞与C1细胞共孵育后衰竭指标表达升高。
图12为本发明较佳实施例中表达GFP和luciferase的Jurkat细胞（表达TRBC1）尾静脉注射进NOG重度联合免疫缺陷小鼠体内后3天分别接受未进行基因修饰T细胞（MOCK）、CAR-C1和CAR-C2细胞的回输，结果显示，尽管CAR-C1和CAR-C2细胞均能体内杀伤Jurkat细胞，但CAR-C2体内杀伤Jurkat细胞能力显著强于CAR-C1，而且CAR-C1虽能体内杀伤Jurkat细胞，但并未延长小鼠总体生存期。
图7-图8，图10-图12中，*、***表示不同处理组之间的差异具有统计学意义，*表示P<0.05，***表示P<0.001。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J & Russell DW,Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2001），或按照制造厂商说明书建议的条件。
慢病毒包装质粒（pMDL，VSV-G，REV）、载体pCDH-EF1-Luc2-T2A-tdTomato和pCDH-EF1-Luc-T2A-copGFP质粒购自武汉淼灵生物科技有限公司。XbaI和SalI内切酶购自NewEngland Biolabs (Beijing) LTD.。JOVI-1抗体购自Ancell Corporation。X-VIVO15培养基购自Lonza公司。PEI购自Sigma公司。IL-2和OKT3购自ACROBiosystems有限公司。CD28抗体购自同立海源公司。293ft细胞和Jurkat细胞购自ATCC。CD45RA, CCR7, CD107a, PD1,TIM3, LAG3, CFSE, PI等流式抗体购自BD公司。NOG重度联合免疫缺陷小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
实施例1 靶向TRBC1阳性T细胞的慢病毒载体的构建
首先设计并合成靶向T细胞TRBC1的CAR基因，并将其克隆至慢病毒载体，随后转染宿主细胞（如293ft细胞）并制备了浓缩后慢病毒。携带TRBC1 CAR的慢病毒感染外周血T细胞后，会产生4类T细胞：TRBC1阳性T细胞（C1），TRBC2阳性T细胞(C2)，TRBC1 CAR修饰的TRBC1阳性T细胞（CAR-C1）和TRBC1 CAR修饰的TRBC2阳性T细胞（CAR-C2），如图2所示。而CAR-C1细胞中的CAR可能与自身的TRBC1结合从而导致TRBC1不能被其它TRBC1 CAR-T细胞识别，而且大量CAR被自身TRBC1结合而不能识别靶细胞的TRBC1从而导致CAR-C1细胞识别和杀伤靶细胞的能力下降。本发明对CAR-C1和CAR-C2细胞识别和杀伤功能以及发生原因进行了系统研究。
CAR的设计包含CD8α信号肽，anti-TRBC1轻链可变区，连接接头，anti-TRBC1重链可变区，CD8α铰链区，CD8α跨膜区，4-1BB，CD3 ζ胞内信号区和FLAG-tag，并进行全基因合成，CAR的结构示意图见图3。将合成的基因（SEQ ID NO:1）通过XbaI与SalI双酶切，克隆到慢病毒载体 pCDH-EF1-Luc2-T2A-tdTomato中，并命名为pCDH-EF1-TRBC1 CAR。
重组慢病毒载体的构建方法包括：
（1）合成靶向TRBC1 CAR的核苷酸序列（SEQ ID NO:1），并在这段核苷酸序列的两端分别添加XbaI和SalI酶切位点，并克隆到pUC57载体上；
（2）用XbaI和SalI双酶切包含目的基因的pUC57载体，切胶回收目的基因片段；
（3）用XbaI和SalI双酶切原始载体pCDH-EF1-Luc2-T2A-tdTomato，切胶回收约6.5kb的载体片段；
（4）用DNA连接酶连接回收的目的基因片段和载体片段，即得携带TRBC1 CAR的重组慢病毒载体。
实施例2 慢病毒的制备
将实施例1的重组慢病毒载体通过转染试剂（PEI）转染293ft细胞产生慢病毒。具体方法包括：
包装质粒混合物（pMDL:VSV-G:REV=5:3:2，质量比）和TRBC1 CAR慢病毒载体按1:1的质量比加入500 μL无血清培养基Opti-MEM中，涡旋至充分混匀。将32g PEI加入500 μL无血清培养基Opti-MEM中，涡旋至充分混匀。然后将500ul质粒混合物与500ul PEI混合，并将其加入汇合度约90%的293ft细胞中，48小时后收集病毒上清，超速离心后，对病毒进行100倍浓缩，进而获得浓缩后病毒。
实施例3 TRBC2阳性T细胞的制备
为了制备CAR-C1和CAR-C2细胞，首先要获得C1和C2细胞。将健康志愿者来源T细胞通过流式细胞分选获得了TRBC1阳性T细胞和TRBC1阴性T细胞。分选后用T细胞培养基（T细胞培养基的配方如下：X-VIVO15培养基+100U/mL IL-2+50ng/μL OKT3+1μg/mL CD28抗体）培养，用JOVI-1抗体测定TRBC1表达，结果见图4。结果显示，分选效果较好，可用于后续实验。
JOVI-1抗体能结合TRBC1阳性T细胞，因此能评价TRBC1阳性T细胞的比例，而在流式分选的时候加入JOVI-1抗体，其结合TRBC1阳性T细胞，未发生结合的就是TRBC2细胞，从而区分出TRBC1阳性T细胞和TRBC2阳性T细胞。
实施例4 CAR-T细胞的制备及其功能
细胞分选后，用浓缩后病毒感染激活的TRBC1阳性T细胞（C1）和TRBC1阴性T细胞（C2），MOI=10:1（T细胞培养基成分中的OKT3和CD28抗体能激活T细胞）。感染72小时之后，检测CAR表达水平。以抗FLAG流式抗体检测CAR表达，结果如图5所示。与对照未感染病毒T细胞相比43% TRBC1阳性 T细胞表达CAR，46.5% TRBC1阴性T细胞表达CAR，两类T细胞的感染效率相似。
CAR-C1和CAR-C2细胞TRBC1表达检测：
为了验证靶向TRBC1 CAR表达于TRBC1细胞时，是否会发生CAR与细胞自身TRBC1结合导致抗原结合位点遮蔽。用JOVI-1流式抗体检测了CAR-C1和CAR-C2细胞TRBC1表达，结果见图6。CAR-C1细胞中检测不到TRBC1表达，表明CAR-C1细胞表达的CAR与自身TRBC1结合遮蔽了JOVI-1单抗抗原结合位点。
CAR-C1与CARC-2细胞功能鉴定：
（一）IFN-γ释放实验鉴定CAR-T功能
将CAR-C1细胞与CAR-C2细胞与105个C1、C2和CAR-C1细胞以1:1的效靶比共孵育24小时之后检测上清IFN-γ浓度，结果见图7。结果表明，CAR-C1与CAR-C2特异性识别C1细胞并分泌IFN-γ且CAR-C2细胞分泌的IFN-γ显著高于CAR-C1，P < 0.001。而CAR-C1,CAR-C2与CAR-C1和C2细胞共孵育后分泌的IFN-γ水平显著低于与C1共孵育分泌的IFN-γ。从以上结果可知，CAR-C1,CAR-C2特异性识别C1表面的TRBC1抗原，且CAR-C2功能强于CAR-C1。CAR-C1中的CAR遮挡自身的TRBC1而不能被其他CAR-C1和CAR-C2细胞识别。
将CAR-C1细胞与CAR-C2细胞与105个C1、C2和CAR-C1细胞分别以1:1的效靶比共孵育6小时后检测CAR-C1与CAR-C2中特异激活指标CD107a的表达结果（图8）。结果表明，CAR-C1与CAR-C2特异性识别C1细胞并表达CD107a且CAR-C2细胞CD107a表达显著高于CAR-C1，P< 0.001。而CAR-C1,CAR-C2与CAR-C1和C2细胞共孵育后表达的CD107a显著低于与C1共孵育表达的CD107a。以上结果进一步表明，CAR-C1,CAR-C2特异性识别C1表面的TRBC1抗原，且CAR-C2功能强于CAR-C1。CAR-C1中的CAR遮挡自身的TRBC1而不能被其他CAR-C1和CAR-C2细胞识别。
（二）CAR-C1和CAR-C2对于C1,CAR-C1,C2细胞的细胞毒性
CAR-C1和CAR-C2分别与CFSE预标记的C1，CAR-C1，C2以5:1,2.5:1,1.25:1效靶比共孵育，流式鉴定CFSE标记的靶细胞中细胞死亡比例（PI+ 靶细胞百分比）。图9结果显示，CAR-C1与CAR-C2特异性识别并杀伤C1细胞并且CAR-C2细胞杀伤功能显著高于CAR-C1，P <0.001；二者对CAR-C1和C2细胞基本无杀伤作用。以上结果表明，CAR-C1,CAR-C2特异性杀伤TRBC1阳性的C1细胞，且CAR-C2杀伤能力强于CAR-C1。CAR-C1中的CAR遮挡自身的TRBC1而不能被其他CAR-C1和CAR-C2细胞杀伤。
在制备靶向TRBC1 CAR-T过程中，如果T细胞里混有TRBC1阳性细胞，除了可能会产生不能被CAR-T细胞杀伤的CAR-C1细胞外，还可能导致CAR-T细胞被持续激活，加速CAR-T细胞耗竭和终末期分化，导致其体内持久性受限。为了探究靶向TRBC1 CAR-T细胞中存在的TRBC1+ 细胞对其功能的影响，将CAR-C2细胞与C1细胞以2:1的比例共培养6天，然后用流式细胞技术检测细胞分型和衰竭信号表达。
1、CAR-C2细胞与C1细胞共孵育后细胞分型的变化
根据T细胞表面CD45RA与CCR7分子的表达可将T细胞分为初始T细胞（naïve T，CD45RA+CCR7+）、中枢记忆T细胞（TCM，CD45RA-CCR7+）、效应记忆T细胞（TEM，CD45RA-CCR7-）与效应T细胞（Effector T, CD45RA+CCR7-）。通过流式细胞术鉴定CAR-C2细胞与C1细胞共孵育6天后的细胞分型和单独培养的CAR-C2细胞的细胞分型。图10结果显示，共孵育的CAR-C2细胞中初始T细胞比例显著低于单独培养的CAR-C2细胞，P<0.001；同时CAR-C2细胞中效应T细胞比例显著高于单独培养的CAR-C2细胞，P < 0.01。
2、CAR-C2细胞与C1细胞共孵育后衰竭指标变化
通过流式细胞术检测了单独培养的CAR-C2和CAR-C2细胞与C1细胞共孵育6天后CAR-C2中衰竭指标的表达。检测的衰竭指标包括：PD-1,TIM-3和LAG-3。图11结果显示，与C1共孵育的CAR-C2细胞中PD-1, TIM-3和LAG-3表达均显著高于单独培养的CAR-C2细胞。
实施例5 靶向TRBC1的CAR-T细胞的体内治疗效果
Jurkat细胞系表达TRBC1，尾静脉接种NOG重度联合免疫缺陷小鼠后可以形成T细胞白血病小鼠模型，因此该模型为评价CAR-C1和CAR-C2杀伤TRBC1阳性细胞能力的体内模型。为了在小鼠体内测量Jurkat细胞的数量，将pCDH-EF1-Luc-T2A-copGFP质粒进行慢病毒包装和浓缩，浓缩后的慢病毒感染Jurkat细胞（MOI=10:1），得到表达GFP和luciferase的Jurkat（GFP-Luc Jurkat）。利用IVIS Imaging system (Caliper LifeSciences)检测luciferase的表达，从而评价小鼠体内GFP-Luc Jurkat细胞数量，细胞数量越多，luciferase荧光强度越强。
将15只NOG重度联合免疫缺陷小鼠分为三组，每组5只，向每只小鼠的尾静脉注射3×106 GFP-Luc Jurkat细胞，3天后，每组小鼠分别接受5×105未进行基因修饰T细胞（MOCK）、CAR-C1和CAR-C2细胞的回输（图12，A），结果显示，尽管CAR-C1和CAR-C2细胞均能体内杀伤GFP-Luc Jurkat细胞，但CAR-C2体内杀伤GFP-Luc Jurkat细胞能力显著强于CAR-C1（图12，B），CAR-T细胞回输后20天计算每只小鼠luciferase荧光强度并汇总每组结果，结果显示尽管CAR-C1和CAR-C2细胞均能体内杀伤GFP-Luc Jurkat细胞，但CAR-C2体内杀伤GFP-Luc Jurkat细胞能力显著强于CAR-C1（图12，C），而且CAR-C1虽能体内杀伤GFP-Luc Jurkat细胞，但并未延长小鼠总体生存期（图12，D）。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 北京市肿瘤防治研究所
<120> 靶向TRBC1 CAR-T细胞的制备方法与应用
<130> KHP201113738.6YS
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1524
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccccgc cttcctgctg 60
atccccgacg tggtgatgac ccagagcccc ctgagcctgc ccgtgagcct gggcgaccag 120
gccagcatca gctgcagaag cagccagaga ctggtgcaca gcaacggcaa cacctacctg 180
cactggtacc tgcagaagcc cggccagagc cccaagctgc tgatctacag agtgagcaac 240
agattccccg gcgtgcccga cagattcagc ggcagcggca gcggcaccga cttcaccctg 300
aagatcagca gagtggaggc cgaggacctg ggcatctact tctgcagcca gagcacccac 360
gtgccctaca ccttcggcgg cggcaccaag ctggagatca agagaggcgg cggcggcagc 420
ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc gaggtgagac tgcagcagag cggccccgac 480
ctgatcaagc ccggcgccag cgtgaagatg agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc 540
ggctacgtga tgcactgggt gaagcagaga cccggccagg gcctggagtg gatcggcttc 600
atcaacccct acaacgacga catccagagc aacgagagat tcagaggcaa ggccaccctg 660
accagcgaca agagcagcac caccgcctac atggagctga gcagcctgac cagcgaggac 720
agcgccgtgt actactgcgc cagaggcgcc ggctacaact tcgacggcgc ctacagattc 780
ttcgacttct ggggccaggg caccaccctg accgtgagca gcgactacaa ggacgacgac 840
gacaagagcg gcaccaccac ccccgccccc agacccccca cccccgcccc caccatcgcc 900
agccagcccc tgagcctgag acccgaggcc tgcagacccg ccgccggcgg cgccgtgcac 960
accagaggcc tggacttcgc ctgcgacatc tacatctggg cccccctggc cggcacctgc 1020
ggcgtgctgc tgctgagcct ggtgatcacc ctgtactgca agagaggcag aaagaagctg 1080
ctgtacatct tcaagcagcc cttcatgaga cccgtgcaga ccacccagga ggaggacggc 1140
tgcagctgca gattccccga ggaggaggag ggcggctgcg agctgagagt gaagttcagc 1200
agaagcgccg acgcccccgc ctacaagcag ggccagaacc agctgtacaa cgagctgaac 1260
ctgggcagaa gagaggagta cgacgtgctg gacaagagaa gaggcagaga ccccgagatg 1320
ggcggcaagc ccagaagaaa gaacccccag gagggcctgt acaacgagct gcagaaggac 1380
aagatggccg aggcctacag cgagatcggc atgaagggcg agagaagaag aggcaagggc 1440
cacgacggcc tgtaccaggg cctgagcacc gccaccaagg acacctacga cgccctgcac 1500
atgcaggccc tgccccccag atga 1524
<210> 2
<211> 507
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser
20 25 30
Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser
35 40 45
Gln Arg Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu
50 55 60
Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn
65 70 75 80
Arg Phe Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
85 90 95
Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile
100 105 110
Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly
115 120 125
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Arg Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp
145 150 155 160
Leu Ile Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly
165 170 175
Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Val Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly
180 185 190
Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Ile
195 200 205
Gln Ser Asn Glu Arg Phe Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys
210 215 220
Ser Ser Thr Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp
225 230 235 240
Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ala Gly Tyr Asn Phe Asp Gly
245 250 255
Ala Tyr Arg Phe Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val
260 265 270
Ser Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ser Gly Thr Thr Thr Pro
275 280 285
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
290 295 300
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
305 310 315 320
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
325 330 335
Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
340 345 350
Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
355 360 365
Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg
370 375 380
Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser
385 390 395 400
Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
405 410 415
Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
420 425 430
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn
435 440 445
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
450 455 460
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
465 470 475 480
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
485 490 495
Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500 505

Claims (1)

1.靶向TRBC1的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，包括：将靶向T细胞TRBC1的CAR基因通过慢病毒载体导入TRBC2阳性T细胞中，使CAR基因整合到T细胞基因组上；
所述靶向T细胞TRBC1的CAR基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
具体步骤如下：
1）将靶向T细胞TRBC1的CAR基因构建到载体pCDH-EF1-Luc2-T2A-tdTomato的XbaI和SalI酶切位点之间，得到靶向TRBC1阳性T细胞的慢病毒载体，用所述慢病毒载体转染宿主细胞，产生慢病毒；
2）利用流式细胞仪或磁珠从外周血中分离出TRBC2阳性T细胞，并用慢病毒感染TRBC2阳性T细胞。
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