JP7085988B2 - Pd-1-cd28融合タンパク質および医療におけるその使用 - Google Patents
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Description
(a)SEQ ID NO: 18に示されるようなアミノ酸配列との比較において1、2、3、4、5、6、7、8、9または10まで、好ましくは1~8、より好ましくは1~6、なおさらに好ましくは1~5、なおさらに好ましくは1または2、またはなおさらに好ましくは1つの置換、欠失または挿入を有し、PD-L1またはPD-L2結合活性を有することを特徴とする配列を含むPD-1ポリペプチド;
(b)SEQ ID NO: 20のアミノ酸配列を有するPD-1の膜貫通ドメイン;および
(c)配列YMNM(SEQ ID NO: 29)および/またはPYAP(SEQ ID NO: 30)を有するCD28ポリペプチドの細胞内ドメインに由来する配列を含むCD28ポリペプチド
を有する、タンパク質の融合物に関する。
・Milone et al., Mol. Ther. 17(2009), 1453-1464;Carpenito et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106(2009), 3360-3365;Wang et al., Hum. Gene Ther. 18(2007), 712-725;Pule et al., Mol. Ther. 12(2005), 933-941およびWang et al., Cancer Immunol. Res. 3(2015), 815-826に記載されているようなキメラ抗原受容体;
・Rapoport et al., Nature Medicine, 21(2015), 914-921に提供されているようなアルファ/ベータTCR改変T細胞;
・Rosenberg et al., Clin. Cancer Res. 17(2011), 4550-4557に提供されているようなTIL上で発現した天然TCR;
・可溶性ポリペプチドとして発現する、または細胞表面上に膜貫通タンパク質として提示される抗CD3 T細胞エンゲージャー;および
・TCRサブユニットおよびヒトまたはヒト化抗体ドメインを含むT細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)
を含む。たとえば、当技術分野において公知であるように、TCRサブユニットは、TCR細胞外ドメイン、TCR膜貫通ドメインおよび/またはTCR細胞内ドメインを含み得る(上記段落で引用されるすべての参考文献は参照により全体として本明細書に組み入れられる)。
[本発明1001]
C末端を介してCD28ポリペプチドの細胞内ドメインのN末端に機能的に連結しているPD-1ポリペプチドを含む融合タンパク質であって、該PD-1ポリペプチドがPD-1の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む、融合タンパク質。
[本発明1002]
PD-1ポリペプチドが、SEQ ID NO: 16の配列、またはSEQ ID NO: 16との比較において1~10個の置換、欠失もしくは挿入を有しかつPD-L1および/もしくはPD-L2結合活性を有することを特徴とする配列を含む、本発明1001の融合タンパク質。
[本発明1003]
PD-1の膜貫通ドメインがSEQ ID NO: 20のアミノ酸配列を有する、本発明1001または1002の融合タンパク質。
[本発明1004]
CD28ポリペプチドが、配列YMNM(SEQ ID NO: 29)および/またはPYAP(SEQ ID NO: 30)を有するCD28ポリペプチドの細胞内ドメインに由来する配列を含む、本発明1001~1003のいずれかの融合タンパク質。
[本発明1005]
CD28ポリペプチドがSEQ ID NO: 22のアミノ酸配列を有する、本発明1001~1004のいずれかの融合タンパク質。
[本発明1006]
SEQ ID NO: 24からなる、本発明1001~1005のいずれかの融合タンパク質。
[本発明1007]
(a)SEQ ID NO: 18との比較において1~10個の置換、欠失または挿入を有しかつPD-L1および/またはPD-L2結合活性を有することを特徴とする配列を含むPD-1ポリペプチド;
(b)SEQ ID NO: 20のアミノ酸配列を有するPD-1の膜貫通ドメイン;ならびに
(c)配列YMNM(SEQ ID NO: 29)および/またはPYAP(SEQ ID NO: 30)を有するCD28ポリペプチドの細胞内ドメインに由来する配列を含むCD28ポリペプチド
を有する、本発明1006の融合タンパク質。
[本発明1008]
本発明1001~1007のいずれかの融合タンパク質をコードする、核酸分子。
[本発明1009]
第二のポリペプチドをさらにコードする、本発明1008の核酸分子。
[本発明1010]
本発明1008の核酸分子である第一の核酸分子と、第二のポリペプチドをコードする第二の核酸分子とを含む、組成物。
[本発明1011]
第二のポリペプチドが、キメラ抗原受容体、アルファ/ベータT細胞受容体、天然T細胞受容体、抗CD3 T細胞エンゲージャーまたはT細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)である、本発明1009の核酸分子または本発明1010の組成物。
[本発明1012]
本発明1008~1009および1011のいずれかの核酸分子を含む、ベクター。
[本発明1013]
第一の核酸分子および第二の核酸分子が第一のベクターおよび第二のベクターに含まれる、本発明1010または1011の組成物。
[本発明1014]
第一および第二のベクターが同じまたは異なるベクターである、本発明1013の組成物。
[本発明1015]
本発明1008、1009および1011のいずれかの核酸分子;本発明1010、1011、1013および1014のいずれかの組成物;または本発明1012のベクターを含む、形質導入細胞。
[本発明1016]
本発明1008の核酸分子によってコードされた融合タンパク質を発現する、形質導入細胞。
[本発明1017]
本発明1009または1011の核酸分子;本発明1010、1011、1013および1014のいずれかの組成物;または本発明1012のベクターを含む、融合タンパク質および第二のポリペプチドを発現する形質導入細胞。
[本発明1018]
本発明1001~1007のいずれかに規定された融合タンパク質を発現する形質導入細胞を産生するための方法であって、
(a)本発明1012のベクターまたは本発明1013もしくは1014の組成物を細胞に形質導入する工程;
(b)該形質導入細胞の中または上での該融合タンパク質の発現が可能な条件下で、該形質導入細胞を培養する工程;および
(c)該形質導入細胞を培養物から回収する工程
を含む、方法。
[本発明1019]
本発明1018の方法によって得ることのできる、本発明1008の核酸分子によってコードされた融合タンパク質を発現する形質導入細胞。
[本発明1020]
本発明1008、1009および1011のいずれかの核酸分子によってコードされた融合タンパク質を発現する形質導入細胞、本発明1015~1017および1019のいずれかの形質導入細胞、または本発明1018の方法によって産生された形質導入細胞を含む、薬学的組成物。
[本発明1021]
肺がん、卵巣がん、黒色腫、結腸がん、胃がん、腎細胞がん、食道がん、神経膠腫、尿路上皮がん、網膜芽細胞腫、乳がん、非ホジキンリンパ腫、膵臓がん、ホジキンリンパ腫、骨髄腫、肝細胞がん、白血病、子宮頸がん、胆管がん、口腔がん、頭頸部がんまたは中皮腫を処置する方法に使用するための、本発明1008、1009および1011のいずれかの核酸分子によってコードされた融合タンパク質を発現する形質導入細胞、本発明1015~1017および1019のいずれかの形質導入細胞、または本発明1018の方法によって産生された形質導入細胞。
[本発明1022]
本発明1008~1010のいずれかの核酸分子、本発明1011のベクターおよび/または本発明1001~1007のいずれかの融合タンパク質を含む、キット。
例示的に、以下の実施例1~3および5においては、PD-1ポリペプチドおよびCD28ポリペプチドのネズミ配列を用いて融合タンパク質を構築した。実施例4は、C末端を介してヒトCD28ポリペプチド(SEQ ID NO: 21(核酸(cDNA));22(タンパク質))の細胞内ドメインのN末端に機能的に連結/融合しているPD-1ポリペプチドを含み、PD-1ポリペプチドがPD-1の細胞外ドメイン(SEQ ID NO: 17(cDNA)、18(タンパク質))およびPD-1の膜貫通ドメイン(SEQ ID NO: 15(核酸)および16(タンパク質)に示される、SEQ ID NO: 19(cDNA)、20(タンパク質)を含む、ヒトPD-1-CD28融合タンパク質(SEQ ID NO: 23(核酸(cDNA));24(タンパク質))の機能分析に関する。実施例4で調製したPD-1-CD28融合タンパク質は、SEQ ID NO: 24(SEQ ID NO: 23に示されたcDNAによってコードされる)に示すアミノ酸配列を有する。
実施例1.1 ネズミPD-1-CD28融合タンパク質PTM(SEQ ID NO: 13(核酸(cDNA))および14(タンパク質))、CTM(SEQ ID NO: 43(核酸(cDNA))および44(タンパク質))、CEX(SEQ ID NO: 49(核酸(cDNA))および50(タンパク質))、PTM-FMNM(SEQ ID NO: 51(核酸(cDNA))および52(タンパク質))、PTM-AYAA(SEQ ID NO: 53(核酸(cDNA));54(タンパク質))およびPTM-FMNM-AYAA(SEQ ID NO: 55(核酸(cDNA));56(タンパク質))
オーバーラップエクステンションPCRおよびレトロウイルスpMP71ベクターへの組換え発現によるクローニング(Schambach et al., Mol Ther 2(5) (2000), 435-45;EP-B10955374)によってPD-1-CD28融合タンパク質を産生した。増幅を三工程で実施した:第一に、PD-1細胞外および膜貫通ドメインを、CD28細胞内ドメイン
のための部分的オーバーラップで増幅した。同時に、CD28細胞内を、PD-1膜貫通ドメイン
のための部分的オーバーラップで増幅した。第三の反応工程において、両方の産物を、5'-PD-1プライマー
および3'-CD28プライマー
を使用する増幅鋳型として使用した。増幅後、EcoRIおよびNotI制限酵素切断およびDNAライゲーションを使用して、インサートをpMP71ベクター中にライゲートした。
PD-1欠失変異体は、以前にOkazaki T et al., Proc Natl Acad Sci USA 98(24) (2001), 13866-13871によって記載されている。PD-1欠失変異体は、SEQ ID NO: 57(核酸(cDNA))および58(タンパク質)に示される配列を含む。
2.1 細胞株
ネズミ膵臓がん細胞株Panc02およびその卵白アルブミン形質移入相対物Panc02-OVAは以前に記載されている(Jacobs et al., Int J Cancer 128(4) (2011), 897-907)。野生型C57Bl/6マウスの膵臓に発がん物質Methycholantren Aを注入して発がんを誘発することにより、Panc02細胞株を作製した。完全長ネズミPD-L1(SEQ ID NO: 29(核酸(cDNA))および30(タンパク質))を含むpMXs-puro(Kitamura et al., Exp. Hematol. 31 (2003), 1007-1014)の形質導入および最終濃度10μg/mlのピューロマイシンによる選択によってPanc02-OVA-PD-L1およびPanc02-PD-L1を作製した。パッケージング細胞株Plat-Eは以前にMorita et al., Gene Ther 7 (2000), 1063-6によって記載されている。すべての細胞を、10%ウシ胎仔血清(FBS、Life Technologies、USA)、1%ペニシリンおよびストレプトマイシン(PS)および1%L-グルタミン(すべてPAA、Germanyから)を含むDMEM中で培養した。10μg/mlピューロマイシンおよび1μg/mlブラストサイジン(Sigma、Germany)をPlat-E(Platinum-E)培地に添加した。一次ネズミT細胞(培養に関しては以下のセクション2.5を参照)を、10%FBS、1%PSおよび1%L-グルタミンを含むRPMI1640中で培養し、1%ピルビン酸ナトリウム、1mM HEPESおよび50μM β-メルカプトエタノールをT細胞培地に添加した。
卵白アルブミンに特異的なT細胞受容体(OT-1)のためのトランスジェニックマウスをJackson Laboratory、USA(ストック番号003831)から取得し、本発明者らの動物施設中、特定病原体除去(SPF)条件下で飼育した。OT-1マウスをCD45.1コンジェニックマーカーマウス(Jackson Laboratoryから取得、ストック番号002014)およびCD90.1コンジェニックマーカーマウス(ストック番号000406)と交配させて、CD45.1-OT-1およびCD90.1-OT-1マウスをそれぞれ作製した。野生型C57B1/6マウスをJanvier、Franceから購入した。2×106個の腫瘍細胞の皮下注射によって腫瘍を誘発させ、マウスを、示されるようにT細胞の静脈内注射によって処置した。再チャレンジ実験のために、マウスの、以前に拒絶された腫瘍の部位とは反対側の脇腹に0.5×106個の細胞を皮下注射した。すべての実験は無作為化され、盲検化されたものであった。中和実験のために、抗IFN-γ抗体R4-6A2(BioXcell、USA)またはアイソタイプ対照(BioXcell、USA)を3日ごとに一匹あたり200μgの用量で四回腹腔内投与した。1日おきに腫瘍の成長およびマウスの状態をモニタした。
レトロウイルスベクターpMP71(Schambach et al., Mol Ther 2(5) (2000), 435-45;EP-B10955374)をエコトロピックパッケージング細胞株Plat-E(Platinum-E)の形質移入に使用した。Leisegang et al., J Mol Med 86 (2008), 573-83;Mueller et al., J Virol. 86 (2012), 10866-10869;Kobold et al., J Natl Cancer Inst (2014)(近刊)によって記載された方法にしたがって形質導入を実施した。手短にいうと、パッケージング細胞株Plat E(Morita et al., Gene Ther 7 (2000) 1063-6によって記載されている)を6ウェルプレートに播種し、一晩かけて70~80%コンフルエンスまで増殖させた。1日目に、DNA 16μgを100mM CaCl2(Merck、Germany)および126.7μMクロロキン(Sigma、USA)と混合した。Plat-E細胞を低血清培地(3%)中で30分間飢餓状態にし、次いで沈殿したDNAととも6時間インキュベートした。次いで培地を除去し、培養液と交換した。2日目に、一次脾細胞をC57B1/6マウス(Harlan Laboratories、The Netherlands)から採取した。脾細胞の単一細胞懸濁液を、T細胞培地中、抗CD3(クローン145-2c11 BD Pharmingen、USA)、抗CD28(クローン37.51、BD Pharmingen、USA)および組換えネズミIL-2(Peprotech、Germany)で一晩かけて刺激した。3日目に、24ウェルプレートを12.5μg/mlの組換えレトロネクチン(Takara Biotech、Japan)によって室温で2時間コートし、2%ウシ血清アルブミン(Roth、Germany)によって37℃で30分間ブロックし、PBSで洗浄した。Plat Eの上清を採取し、フィルタ(40μm、Milipore、USA)に通した。次いで、新鮮なT細胞培地をPlat E細胞に添加した。ろ過された上清1mlを各ウェルに分配し、4℃で2時間スピノキュレーションした。次いで上清を24ウェルプレートから取り出した。106個のT細胞を、1ウェルあたり10UのIL-2および400000個の抗CD3および抗CD28ビーズ(Invitrogen、Germany)で補足されたT細胞培地1mlに播種し、32℃、800gで30分間スピノキュレーションした。4日目に、Plat E上清を再び採取し、ろ過した。1mlを24ウェルプレートの各ウェルに添加し、32℃、800gで90分間スピノキュレーションした。その後、細胞を37℃でさらに6時間インキュベートした。1mlの上清をIL-2とのT細胞培地で置き換えた。5日目に、細胞を採取し、計数し、1mlあたり10ngのIL-15(Peprotech、Germany)で補足されたT細胞培地中、106個/mlの密度で再び播種した。T細胞を、細胞分析または機能アッセイを実施する10日目まで、この密度で維持した。
T細胞および腫瘍細胞を、抗PD-1ブロッキング抗体(10μg/ml、クローンRPM1-14、Biolegend)または抗マウスH2kb SIINFEKL抗体(20μg/ml、クローン25.D1-16、Miltenyi Biotech、Germany)の存在下または非存在下、10:1の比で48時間共培養した。IFN-γに関して上清をELISA(BD)によって分析した。
3.1 機能的T細胞アッセイ
T細胞を、抗CD3e抗体(100ng/ml、クローン145-2C11、eBioscience)、抗CD28抗体(2μg/ml、クローン37.51、eBioscience)または組換えPD-L1 Fcキメラ(5μg/ml、R&D Systems)もしくはこれらの組み合わせのいずれかで48時間刺激した。サイトカインを、上清中、ELISA(IL-2およびIFN-γ、いずれもBD;カタログ番号それぞれDY402およびDY485)によって定量化または免疫ブロッティング(R&D製のネズミサイトカインアレイ;カタログ番号ARY006)によって定性的に検出した。増殖アッセイのために、細胞を上記のように24時間刺激したのち、上記のように染色した。カウントビーズ(Life Technologies、Germany;カタログ番号C36950)の添加およびその後のフローサイトメトリーによる分析によって細胞を計数した。死傷アッセイのために、融合タンパク質で形質転換された300,000個のT細胞を、上記のように、抗CD3e抗体および組換えPD-L1(R&D、カタログ番号1019-B7-100)で40時間刺激した。その間、Panc-OVA腫瘍細胞を、8ウェルプレートの1ウェルあたり15,000個の密度で播種し、一晩かけて増殖させた。16時間後、刺激されたT細胞を、腫瘍細胞を含むウェルに添加し、細胞数を、ICELLigence計器(ACEA Bioscience、USA)を使用するインピーダンス計測によって連続的にモニタした。
ヒトCD3+PBMCにヒトPTM(hPTM)融合タンパク質(SEQ ID NO: 23(核酸(cDNA))および24(タンパク質))をレトロウイルス的に形質導入し、IL-2(Peprotech)およびIL-15(Peprotech)を使用して4日間増殖させた。刺激アッセイを実施してT細胞刺激を測定した。したがって、平底96ウェルプレートを、0.1μg/ml抗ヒトCD3抗体(クローン:HIT3a;eBioscience)または0.1μg/ml抗ヒトCD3抗体および5μg/ml組換えヒトFc B7-H1キメラ(R&D)または0.1μg/ml抗ヒトCD3抗体および2μg/mlの抗ヒトCD28抗体(クローン:cd28.2;eBioscience)のいずれかを含有するPBSで、4℃で一晩かけてコートした。1ウェルあたり3.0×105個の形質導入細胞を、コートした96ウェルプレートに入れた。37℃で48時間インキュベートしたのち、5%CO2細胞上清を捕集した。ヒトIFN-γ-ELISA(BD Bioscience)を製造者のガイドラインにしたがって使用して、ヒトIFN-γ放出を定量化した。
フローサイトメトリーによる分析の前に、腫瘍拒絶後のマウスまたは対照マウスからの脾細胞を4時間インキュベートした(ICS)、ペプチドSIINFEKL(SEQ ID NO: 65)、TRP2またはP15E(いずれもJPT Peptides、Germanyから)1μg/ml。活性対対照ペプチドTRP2の刺激の比を式:標的条件からの%CD8+IFNγ+細胞/TRP2条件の%CD8+IFNγ+で計算することにより、バックグラウンド正規化を実施した。
BD FACS Canto II(BD bioscience、Germany)でのマルチカラーフローサイトメトリーは以下の抗体パネルを使用した:養子移入OT-1 T細胞の分析の場合、抗PD-1(PE-Cy7、クローン29F.1A12)および抗CD8(APC、クローン53.6-7、いずれもBiolegend、USA);p-Akt分析の場合、抗マウスCD8a(Pacific Blue、クローン53-6.7)および抗マウスPD-1(PeCy7、クローン29F.1A12、いずれもBiolegend、USA)、Foxp3/転写因子染色緩衝液セット(eBioscience、USA)を使用するその後の固定化および透過処理ならびに抗Akt(pS473)(AlexaFluor 647、クローンM89-61、eBioscience)による染色。ki67および増殖分析のために、細胞を、Fixable Viability Dye(eFluorTM 780、eBioscience)、抗マウスCD8aおよび抗マウスPD-1(APCクローン29F.1A12、Biolegend)で染色し、続いて固定し、透過処理した。抗Ki67(PE、クローン16A8、Biolegend)で細胞内染色したのち、細胞を洗浄し、Count Bright Absolute Counting Beads(Life Technologies)を含有するPBS中に再懸濁させた。追跡実験のために、細胞を、抗マウスCD8a(APC-Cy7、クローン53-6.7、Biolegend)、抗マウスCD45.1(APC、クローンA20、eBioscience)または抗マウスCD90.1(PeCy7またはPacific BlueTM、BiolegendクローンOX7)で染色した。同時追跡実験のために、CD45.1細胞とCD90.1細胞との比を計算した。細胞を固定/透過処理し、抗マウスIFN-γ抗体(FITC、クローンXMG1.2、Biolegend)で細胞内染色した。インビトロ再刺激のために、細胞を、抗CD3e-APC(クローン145-2C11、Biolegend)、抗CD8-PerCP(クローン53-6.7、Biolegend)および抗IFN-γ-FITC(クローンXMG1.2、Biolegend)抗体で染色した。PD-L1結合能力のために、細胞を5μg/mlの組換えPD-L1-Fc(R&D)とともにインキュベートし、抗ヒトIgG-APC抗体(クローンHP6017、Biolegend)で染色した。PD-L1発現分析のために、腫瘍細胞を、示されたように、組換えIFN-γ(Peprotech、Germany)で48時間刺激した。細胞を抗PD-L1-APC抗体(クローン10F.9G2、Biolegend)で染色した。抗CD45(PacBlue、クローン30F11、Biolegend)、抗CD11b(Percp-Cy5.5、クローンM1/70、Biolegend)、抗Ly6(APC-Cy7、HK1.4、Biolegend)および抗Gr1(FITC、クローンRB6-8C5、Biolegend)抗体を使用して、骨髄由来サプレッサ細胞の染色を実施した。抗CD4(APC-Cy7、クローンGK1.5、Biolegend)、抗CD8(Percp、53-6.7、Biolegend)抗体およびFoxp3のための細胞内染色(eFluor450、クローンFJK-16s、eBioscience)により、制御性T細胞を検出した。
統計分析には、GraphPad Prismソフトウェアバージョン5.0bを使用した。報告されるすべての変数は連続変数である。対応のない両側スチューデントt検定を使用して、実験条件間の差を分析した。個々のマウスの実験条件の比較のために、マン・ホイットニー検定を使用した。p値<0.05を有意と見なした。インビボ実験のために、二元配置ANOVAをボンフェローニ法による多重検定補正とともに使用してグループ間の差を分析した。
3.6.1 新規なPD-1-CD28融合受容体の理論的根拠および設計
樹立したOVA発現Panc02(Panc02-OVA)腫瘍を有するマウスにおいて、OVA特異的CD8+T細胞の養子移入の効能を評価した。移入T細胞は、大部分のマウスにおいて腫瘍を拒絶しなかった。これは、腫瘍に浸潤する移入T細胞上のPD-1の上方制御と平行に起こった(図5Aおよび5B)。Panc02-OVA細胞が、IFN-γによって上方制御されるPD-1のリガンド(PD-L1)を発現すると仮定すると(図5Cおよび5D)、これは、腫瘍における抗原特異的T細胞応答を抑制する際の、PD-1-PD-L1軸の関連する役割を指し示す。理論によって拘束されることなく、PD-1媒介抑制からの移入T細胞の保護が養子T細胞療法の効能を増強し得ると仮定した。PD-1はCD28/CTLA-4ファミリーのメンバーであるため、受容体シグナル伝達が適合性であり、融合PD-1-CD28受容体構築物がPD-L1によるPD-1の係合をCD28共刺激活性に変えることができると思われた(図5Eのスキーム)。したがって、一次ネズミT細胞中に形質導入するための、PD-1の膜外および膜貫通部分とCD28の細胞内ドメインからなる融合受容体が設計された。
ネズミPD-1膜貫通PD-1-CD28融合タンパク質(PTM、SEQ ID NO: 13(cDNA)および14(タンパク質))の機能性を試験するために、一次ネズミT細胞を形質導入し、アゴニストCD3抗体および組換えPD-L1(SEQ ID NO: 29および30)で刺激した。PTM形質導入T細胞は、非形質導入T細胞(図6F)と比較して、顕著に増加したIFN-γ(170+/-26対0.5+/-0.5ng/ml、p=0.003、図1A)およびIL-2誘発を示した。抗CD28抗体によるさらなる刺激がサイトカイン産生をさらに促進した(図7A)。サイトカイン誘発は、PD-L1係合時のAKTの下流リン酸化と平行に起こり(図1B)、形質導入T細胞におけるCD28シグナル伝達を実証した。PTM受容体の活性化は、非形質導入T細胞(1ビーズあたり42+/-4対6+/-1細胞、p=0.001、図1C)と比較して、生細胞の数を統計的に有意に高めた。この細胞数の増加は、形質導入T細胞による強いki67上方制御と関連し(図1D)、強い有糸分裂活性を示した。PTM形質導入OT-1 T細胞をPanc02-OVAまたはPanc02細胞とともに共培養すると、非形質導入T細胞と比較したときの形質導入T細胞中のIFN-γ放出によって証明されるように、強い共刺激活性が認められた(545+/-37対191+/-0.5ng/ml、p<0.001、図1E)。ネズミPTM融合タンパク質の共刺激活性は、MHC-Iブロッキング(図1E)およびOVA陰性Panc02-PD-L1細胞との共培養(図7B)によって証明されるように、PD-L1の存在、腫瘍細胞によるOVA発現およびTCR係合に依存するものであった。抗CD3抗体およびPD-L1予備刺激PTM受容体形質導入T細胞は、腫瘍細胞の即時および完全な溶解を媒介したが、一方で、非形質導入T細胞は無効であった(22時間からp<0.001、図1F)。合わさって、これらの所見は、ネズミPTM融合タンパク質を形質導入されたT細胞がPD-1-PD-L1媒介アネルギーに対して耐性になったことを示す。これらの結果は、ネズミPD-1-CD28融合タンパク質(PTM、SEQ ID NO: 13(核酸)(cDNA));14(タンパク質))受容体の機能性および治療ポテンシャルをインビトロで実証する。
2つのPD-1-CD28融合タンパク質が、2倍までのサイトカイン誘発、わずかしかない増殖活性およびいくらかの細胞溶解ポテンシャルを有するものとして記載されている(Ankri et al., J. Immunol 191(8) (2013), 4121-4129およびProsser et al., Mol. Immunol. 51(3-4) (2012), 263-272)。ネズミPTM融合タンパク質で認められた強い効果を考慮して、本発明者らの結果との差がPD-1-CD28融合タンパク質(PTM)の構造に関連するかどうかを分析した。したがって、(ネズミ)CD28膜貫通ドメイン(CTM、SEQ ID NO: 43(核酸(cDNA));44(タンパク質))またはCD28膜貫通ドメイン+CD28細胞外ドメイン(CEX、SEQ ID NO: 49(核酸(cDNA));50(タンパク質))の一部を含む、PD-1-CD28融合受容体構築物のためのさらなる融合タンパク質を産生した;図2Aを参照すること。抗CD3抗体および組換えPD-L1で刺激した場合、すべての受容体は、IFN-γ放出(79+/-0.9対4+/-1対7+/-2ng/ml、p<0.001、図2B)および増殖の誘発(1ビーズあたり540+/-45対278+/-37対279+/-46個、それぞれp=0.01および0.02、図2C)によって評価すると、機能的であった。しかし、PTM融合タンパク質は、IFN-γ分泌および増殖の両方に関してCTMおよびCEX受容体よりもはるかに優れていた。機構的に、増強された活性は、CTMおよびCEX融合タンパク質とは反対に、PTM融合タンパク質へのPD-L1の結合の増強と平行に起こるものであった(MFI9315+/-165対2311+/-144対2997+/-167、p<0.001、図2D)。フローサイトメトリーによるCD8-T細胞上の発現は、すべての融合タンパク質の場合で大きく優れているわけではなかったため(図2E)、PTM融合タンパク質の増強された結合は、この構築物の表面発現の増加によっては部分的にしか説明することができない。PTM融合タンパク質の増強された結合は、他の融合タンパク質CEXおよびCTMと比較して、その顕著に優れた機能活性の原因であり得る。
PTMの活性の根底にある機構をさらに解明するために、本発明者らは、CD28のシグナル伝達ドメインを非機能的にした変異体PD-1-CD28 PTM融合タンパク質を産生した。細胞内CD28ドメインのYMNMモチーフは、CD28活性化時、最適なサイトカイン分泌のために必要であり、PYAPモチーフはサイトカイン産生および細胞増殖活性の両方に不可欠である(Boomer and Green, Cold Spring Harb Perspect Biol 8 (2010), a002436)。本発明者らは、一次ネズミT細胞中での発現のためのPTM-FMNM変異体構築物(SEQ ID NO: 51(核酸(cDNA));52(タンパク質))、PTM-AYAA変異体構築物(SEQ ID NO: 53(核酸(cDNA));54(タンパク質))およびPTM-FMNM-AYAA二重変異体構築物(SEQ ID NO: 55(核酸(cDNA));56(タンパク質))を生成した(図3A)。PTM構築物を発現するT細胞または3つの変異体構築物の1つを抗CD3抗体および組換えPD-L1で刺激した。PTM融合構築物形質導入T細胞は、PTM-FMNM、PTM-AYAAまたはPTM-FMNM-AYAAよりも統計的に有意に多いIFN-γを産生した(22+/-2対8+/-1対1+/-0.07対0.1+/-0.05ng/ml、p<0.001、図3B)。PTM融合構築物の係合はPYAP依存的に増殖を誘発したが、一方で、YMNMは増殖効果にとって重要ではなかった(図3C)。対照的に、PTM融合構築物係合による種々のサイトカインおよびケモカインの産生は、変異体構築物が天然のPTM融合タンパク質と比較して弱い誘発因子であったため、両方のモチーフに依存すると思われる(図3D)。
ネズミPD-1-CD28(PTM;SEQ ID NO: 13(核酸(cDNA));14(タンパク質))融合タンパク質形質導入抗原特異的T細胞の効力をさらに評価するために、本発明者らは、皮下Panc02-OVA腫瘍を有するマウスを、非形質導入OT-1 T細胞またはPTM融合タンパク質形質導入OT-1 T細胞で処置した。PTM受容体形質導入T細胞は、非形質導入T細胞を受けたマウスと比較して、優れた抗腫瘍免疫を誘発した(図4A)。興味深いことに、PTM融合タンパク質形質導入OT-1 T細胞は、PD-L1を強く過剰発現するPanc02-OVA-PD-L1モデルにおいては、それらの治療ポテンシャルを保持したが、一方で、非形質導入OT-1細胞の効果はほぼ完全に無効化された(図7C)。Panc02-OVA細胞で再チャレンジした場合、PTM融合タンパク質を形質導入したOT-1 T細胞で処置されたマウス12匹のうち11匹が、対照マウスの0%と比較して、腫瘍がないままであった(p<0.001、図4B)。そのうえ、野生型Panc02細胞で再チャレンジした場合、PTM融合タンパク質形質導入OT-1 T細胞で事前に処置されたマウス11匹のうち9匹が、腫瘍がないままであった(p<0.001、図4C)。これらの結果は、p15Eのような他のPanc02特異的腫瘍関連抗原に対する免疫をもたらす、治癒したマウスにおけるエピトープの広がりを示唆する(Bauer et al., Gut 56(9) (2007), 1275-1282)。したがって、腫瘍を有しないマウスのリンパ節を、SIINFEKL(OVA;SEQ ID NO: 65))およびp15E(gp70)特異的CD8+T細胞の存在に関して分析した。形質導入T細胞移入後のマウスにおいて、対照ペプチドに特異的なCTLと比較して、SIINFEKL特異的CTL細胞の数の統計的に有意な増加が見いだされた(13+/-3対1+/-0、p=0.008、図4D)。本発明者はまた、p15E特異的CTLの、小さな、しかし統計的に有意な増加を検出した(3+/-1対1+/-0、p=0.008、図4D)。得られた免疫は、ナイーブな脾細胞を移入されたマウス3匹の皆無と比較して、治癒したマウスからの脾細胞を養子移入したマウス9匹のうち3匹における腫瘍保護および腫瘍成長の遅延によって示されるように、移入可能であった(図4E)。
非形質導入OT-1 T細胞に対するPTM融合タンパク質形質導入OT-1 T細胞の治療効能が、PTM融合タンパク質中のCD28ドメインの存在によるものか、または単にT細胞表面上の非シグナル伝達PD-1の発現によるものかを区別するために、本発明者らは、PD-1の細胞内部分を欠くPD-1欠失変異体(PD-1del、SEQ ID NO: 57(核酸(cDNA));58(タンパク質))を発現させた。PD-1del形質導入OT-1 T細胞の注入は、PTM融合タンパク質形質導入OT-1 T細胞の注入とは対照的に、Panc02-OVAモデルにおいて、非形質導入OT-1 T細胞と比較して、治療効能を改善しなかった(図5A)。これらの結果は、PTM融合タンパク質の細胞内CD28ドメインに対する依存性を示した。本発明者らは次に、腫瘍を有するマウスにおいて、PTM融合タンパク質(SEQ ID NO: 13(核酸(cDNA));14(タンパク質))-形質導入OT-1 T細胞と非形質導入OT-1 T細胞との運命を調べた。PTM融合タンパク質形質導入T細胞は、非形質導入T細胞と比較して、Panc02-OVA腫瘍中で富化を示した(59+/-2対49+/-1%、p=0.002)。この効果は、リンパ節または非腫瘍保有マウスの器官中では認められなかった(図5B)。加えて、PTM融合タンパク質形質導入OT-1 T細胞は、他の器官または非腫瘍保有マウスと比較して、腫瘍中で非形質導入OT-1 T細胞よりも統計的に有意に多くのIFN-γを産生した(1.5+/-0.2対0.6+/-0.02対0.9+/-0.03、PTM IFN-γ+と非形質導入IFN-γ+T細胞との比、p=0.002、図5C)。インビボでのIFN-γの中和は、PTM形質導入OT-1 T細胞の治療的影響をほぼ完全に無効化して、受容体の機能にとってのこのサイトカインの重要性を示した(図7D)。腫瘍中のPTM融合タンパク質形質導入OT-1 T細胞の蓄積の原因であるシグナル伝達モチーフをさらに解明するために、本発明者らは、上記のPTM-FMNM(SEQ ID NO: 51(核酸(cDNA));52(タンパク質))、PTM-AYAA(SEQ ID NO: 53(核酸(cDNA));54(タンパク質))およびPTM-FMNM-AYAA(SEQ ID NO: 55(核酸(cDNA));56(タンパク質))変異体構築物形質導入T細胞を使用して、それらの運命を、腫瘍を有する動物中のPTM融合タンパク質形質導入OT-1 T細胞の運命と比較した。腫瘍部位におけるPTM融合タンパク質形質導入T細胞のT細胞浸潤および残存性は、YMNM(SEQ ID NO: 29)およびPYAP(SEQ ID NO: 30)モチーフの両方に依存すると思われる。理由は、変異体を有するT細胞が、野生型受容体を有するT細胞と比較して、より少ない量で見いだされたからである(図5D)。浸潤PTM融合タンパク質形質導入OT-1 T細胞の増加は、浸潤性CD8+T細胞と骨髄由来サプレッサ細胞(MDSC)との比を、PTM融合タンパク質形質導入OT-1 T細胞に有利なほうにシフトした(0.7+/-0.1対0.1+/-0.03、p<0.001、PTM-CD8+T細胞とMDSCとの比、図5E)。制御性T細胞に対するCD8+T細胞の比に関しても同様の効果が認められた(図7E)。合わさって、これらの知見は、PTM融合タンパク質形質導入T細胞の養子移入がバランスを免疫抑制から生産的免疫へと傾けたことを示す。
上記実施例1.1に記載された方法に沿って、ヒト相同体PD-1-CD28融合タンパク質を産生し、NotIおよびEcoRI消化およびライゲーションののち、pMP71ベクターにクローニングした。得られたヒトPD-1膜貫通融合タンパク質(hPTM(SEQ ID NO: 23)(核酸(cDNA))および24(タンパク質))は、PD-1細胞外(Uniprot Entry No: Q15116(エントリバージョン番号138および配列のバージョン3のアクセッション番号)、AA1~170;SEQ ID NO: 17(核酸(cDNA))および18(タンパク質))、ヒトPD-1膜貫通配列(Uniprot Entry No: Q15116(エントリバージョン番号138および配列のバージョン3のアクセッション番号)、AA171~191;SEQ ID NO: 19(核酸)および20(タンパク質))およびヒトCD28細胞内領域(Uniprot Entry No: P10747(エントリバージョン164および配列のバージョン1のアクセッション番号)、AA180~220;SEQ ID NO: 21(核酸(cDNA))および22(タンパク質))からなる。
一次ヒトT細胞にヒトPD-1-CD28融合タンパク質(hPTM、SEQ ID NO: 23(cDNA)および24(タンパク質))を形質導入し、抗CD3抗体単独で、または抗CD28抗体もしくは組換えPD-L1(R&D、カタログ番号156-B7-100)と組み合わせて刺激した。抗CD3抗体およびPD-L1によるT細胞の同時刺激は、抗CD3抗体刺激細胞と比較して、形質導入T細胞においてはIFN-γの有意に増加した誘発を生じさせたが、非形質導入T細胞においてはそうではなかった。これは、ヒトPD-1-CD28融合タンパク質を形質導入されたT細胞の機能性および刺激利点を実証する。
選別したCD4+T細胞集団および/または腫瘍細胞株EG7-PD-L1を使用して、実施例3の選択実験を繰り返した。これらの実験の材料および方法は、以下に示す例外を除いて、実施例2および3に概説されたものと同一であった。
ネズミ膵臓がん細胞株Panc02およびその卵白アルブミン形質移入相対物Panc02-OVAは、上記セクション2.1に記載されたとおりであった。
卵白アルブミンに特異的なCD8+T細胞受容体(OT-1)および卵白アルブミンに特異的なCD4+T細胞受容体(OT2)のためのトランスジェニックマウスをJackson Laboratory、USAから取得し、本発明者らの動物施設中、特定病原体除去(SPF)条件下で飼育した。野生型C57B1/6マウスをJanvier、Franceから購入した。
レトロウイルスベクターpMP71(Schambach et al., Mol Ther 2(5) (2000), 435-45;EP-B10955374)をエコトロピックパッケージング細胞株Plat-E(Platinum-E)の形質移入に使用した。Leisegang et al., J Mol Med 86 (2008), 573-83;Mueller et al., J Virol. 86 (2012), 10866-10869;Kobold et al., J Natl Cancer Inst (2014)(近刊)によって記載された方法にしたがって形質導入を実施した。手短にいうと、パッケージング細胞株Plat E(Morita et al., Gene Ther 7 (2000) 1063-6によって記載されている)を6ウェルプレートに播種し、一晩かけて70~80%コンフルエンスまで増殖させた。1日目に、DNA 18μgを100mM CaCl2(Merck、Germany)と混合した。Plat-E細胞を沈殿したDNAととも6時間インキュベートした。培地を除去し、培養液と交換した。2日目に、一次脾細胞をC57B1/6マウス(Harlan Laboratories、The Netherlands)から採取し、MACS CD4+(L3T4)T細胞選別キット(Miltenyi Biotec、Germany)によってCD4+T細胞に関して選別した。CD4+T細胞を、T細胞培地中、抗CD3(クローン145-2c11、BD Pharmingen、USA)、抗CD28(クローン37.51、BD Pharmingen、USA)、組換えネズミIL-2(Peprotech、Germany)および50μM β-メルカプトエタノールで一晩かけて刺激した。3日目に、24ウェルプレートを12.5μg/mlの組換えレトロネクチン(Takara Biotech、Japan)によって室温で2時間コートし、2%ウシ血清アルブミン(Roth、Germany)によって37℃で30分間ブロックし、PBSで洗浄した。Plat E培養物からウイルス含有上清を採取し、フィルタ(45μm、Milipore、USA)に通した。次いで、新鮮なT細胞培地をPlat E細胞に添加した。ろ過された上清1mlを24ウェルプレートの各ウェルに分配し、4℃で2時間スピノキュレーションした。次いで上清を24ウェルプレートから取り出した。1×106個のT細胞を、1ウェルあたり100UのIL-2および400,000個の抗CD3および抗CD28ビーズ(Invitrogen、Germany)で補足されたT細胞培地1mlに播種し、32℃、800×gで30分間スピノキュレーションした。4日目に、Platinum-E上清を再び採取し、ろ過した。ろ過上清1mlを24ウェルプレートの各ウェルに添加し、32℃、800×gで90分間スピノキュレーションした。その後、細胞を37℃で6時間インキュベートした。その後、細胞を採取し、計数し、1mlあたり10ngのIL-15(Peprotech、Germany)および50μM β-メルカプトエタノールで補足されたT細胞培地中、1×106個/mlの密度で再び播種した。T細胞を、細胞分析または機能アッセイを実施する10日目まで、この密度で維持した。
抗体ベースの刺激アッセイのために、96ウェルプレートを、ネズミ抗CD3抗体(100ng/ml、クローン145-2C11、eBioscience)を単独で、または抗CD28抗体(2μg/ml、クローン37.51、eBioscience)もしくは組換えPD-L1 Fcキメラ(5μg/ml、R&D Systems)のいずれかと組み合わせて含有するPBS(ビヒクル溶液)で4℃で12時間コートすることによって調製した。また、PBSのみを含むウェルを対照として調製した。その後、1ウェルあたり300,000個のT細胞を加え、36時間インキュベートした。カウントビーズ(Life Technologies、Germany;カタログ番号C36950)の添加によって細胞を計数し、その後の増殖、生存率および表現型分析をフローサイトメトリーによって実施した(以下に記載されるように)。ELISA(IL-2およびIFN-γの場合、いずれも製造業者の指示にしたがってBD)により、上清中のサイトカインを定量化した。
マルチカラーフローサイトメトリーは、BD FACS Canto II(BD bioscience、Germany)を使用して実施され、以下の抗体パネルを使用した。
5.6.1 形質導入CD4+T細胞のインビトロ機能および表現型分析
ネズミPD-1膜貫通PD-1-CD28融合タンパク質(PTM、SEQ ID NO: 13(cDNA)および14(タンパク質))の機能性を試験するために、一次ネズミCD4+T細胞にアゴニスト抗CD3抗体または組換えPD-L1(SEQ ID NO: 29および30)もしくは抗CD28抗体のいずれかと組み合わせたアゴニスト抗CD3抗体を形質導入し、刺激した。PTM形質導入CD4+T細胞は、非形質導入CD4+T細胞と比較して顕著に増加したIFN-γを示した(19998対291pg/ml、p<0.001、図9A)。PTM受容体の活性化は、対照と比較して増殖および生存率の統計学的に有意な改善を生じさせた(増殖の場合:1ビーズあたり151対68細胞(それぞれ、抗CD3抗体および組換えPD-L1対CD3抗体)、p<0.001、図9B;生存率の場合:60%対40%(それぞれ、抗CD3抗体および組換えPD-L1対CD3抗体)、p<0.001、図9C)。この細胞数の増加は、強いki67およびeosmesdermin/Tbr2(EOMES)上方制御と関連し、強い有糸分裂活性および増強された転写/顕著な活性化状態を示した(それぞれ図9Dおよび9E)。
PD-1-CD28(PTM;SEQ ID NO: 13(核酸(cDNA));14(タンパク質))タンパク質形質導入抗原特異的T細胞(実施例2および3に記載されたOT-1 T細胞)を使用して、皮下EG7-PD-L1腫瘍を有するマウスを処置した。PBSまたは非形質導入OT-1 T細胞で処置された同様な腫瘍保有マウスを対照として使用した。PTM受容体形質導入T細胞もまた、対照マウスと比較して、このモデルにおいて優れた抗腫瘍免疫を誘発し(図12A)、生存率を有意に改善した(p=0.03;図12B)。EG7-PD-L1細胞で再チャレンジした場合、PTM形質導入で事前に処置されていたマウスは効果的に治癒し、対照のナイーブなマウスと比較して腫瘍のないままであった(図12C)。
Claims (17)
- C末端を介してCD28ポリペプチドの細胞内ドメインのN末端に連結しているPD-1ポリペプチドを含む融合タンパク質であって、
該PD-1ポリペプチドがPD-1の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む融合タンパク質であり、
PD-1ポリペプチドが、SEQ ID NO:16の配列、またはSEQ ID NO:16との比較においてSEQ ID NO:16におけるアミノ酸1~170に位置するアミノ酸の1~10個の置換、欠失もしくは挿入を有し、かつPD-L1および/もしくはPD-L2結合活性を有することを特徴とする配列からなり、
PD-1の膜貫通ドメインがSEQ ID NO:20のアミノ酸配列からなり、CD28ポリペプチドの細胞内ドメインがSEQ ID NO:22のアミノ酸配列からなる、前記融合タンパク質。 - SEQ ID NO:24からなる、請求項1記載の融合タンパク質。
- 請求項1または2記載の融合タンパク質をコードする、核酸分子。
- 第二のポリペプチドをさらにコードする、請求項3記載の核酸分子。
- 請求項3記載の核酸分子である第一の核酸分子と、第二のポリペプチドをコードする第二の核酸分子とを含む、組成物。
- 第二のポリペプチドが、キメラ抗原受容体、アルファ/ベータT細胞受容体、天然T細胞受容体、抗CD3 T細胞エンゲージャーまたはT細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)である、請求項4記載の核酸分子または請求項5記載の組成物。
- 請求項3、4および6のいずれか一項記載の核酸分子を含む、ベクター。
- 第一の核酸分子および第二の核酸分子が第一のベクターおよび第二のベクターに含まれる、請求項5または6記載の組成物。
- 第一および第二のベクターが同じまたは異なるベクターである、請求項8記載の組成物。
- 請求項3、4および6のいずれか一項記載の核酸分子;請求項5、6、8および9のいずれか一項記載の組成物;または請求項7記載のベクターを含む、形質導入細胞。
- 請求項3記載の核酸分子によってコードされた融合タンパク質を発現する、形質導入細胞。
- 請求項4または6記載の核酸分子;請求項5、6、8および9のいずれか一項記載の組成物;または請求項7記載のベクターを含む、融合タンパク質および第二のポリペプチドを発現する形質導入細胞。
- 請求項1または2に規定された融合タンパク質を発現する形質導入細胞を産生するための方法であって、
(a)請求項7記載のベクターまたは請求項8もしくは9記載の組成物を細胞に形質導入する工程;
(b)該形質導入細胞の中または上での該融合タンパク質の発現が可能な条件下で、該形質導入細胞を培養する工程;および
(c)該形質導入細胞を培養物から回収する工程
を含む、方法。 - 請求項13記載の方法によって得ることのできる、請求項3記載の核酸分子によってコードされた融合タンパク質を発現する形質導入細胞。
- 請求項3、4および6のいずれか一項記載の核酸分子によってコードされた融合タンパク質を発現する形質導入細胞、請求項10~12および14のいずれか一項記載の形質導入細胞、または請求項13記載の方法によって産生された形質導入細胞を含む、薬学的組成物。
- 肺がん、卵巣がん、黒色腫、結腸がん、胃がん、腎細胞がん、食道がん、神経膠腫、尿路上皮がん、網膜芽細胞腫、乳がん、非ホジキンリンパ腫、膵臓がん、ホジキンリンパ腫、骨髄腫、肝細胞がん、白血病、子宮頸がん、胆管がん、口腔がん、頭頸部がんまたは中皮腫を処置するための、請求項3、4および6のいずれか一項記載の核酸分子によってコードされた融合タンパク質を発現する形質導入細胞、請求項10~12および14のいずれか一項記載の形質導入細胞、または請求項13記載の方法によって産生された形質導入細胞を含む、薬学的組成物。
- 請求項3、4、および6のいずれか一項記載の核酸分子、請求項7記載のベクターおよび/または請求項1または2記載の融合タンパク質を含む、キット。
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