TW201930589A - 表現特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子、il-7、及ccl19之免疫活性細胞 - Google Patents

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Abstract

本發明之目的在於提供一種以間皮素作為靶之免疫活性細胞。
本發明製作一種表現特異性辨識人類間皮素(Human Mesothelin)之細胞表面分子、介白素7(IL-7)、及趨化因子(C-C基元)配體19(CCL19)之免疫活性細胞。較佳為特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子係具備單鏈抗體、細胞膜貫通區、及誘導免疫活性細胞之活化之訊息傳遞區之嵌合抗原受體(CAR)，或者重鏈可變區與輕鏈可變區經由包含2～30個胺基酸序列之胜肽連接子結合。

Description

表現特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子、IL-7、及CCL19之免疫活性細胞
本發明係關於一種表現特異性辨識人類間皮素(Human Mesothelin)之細胞表面分子、介白素7(Interleukin-7：IL-7)、及趨化因子(C-C基元)配體19(chemokine(C-C motif)ligand 19：CCL19)之免疫活性細胞；含有此種免疫活性細胞之醫藥組合物；包含編碼特異性辨識間皮素之細胞表面分子之核酸、編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸之表現載體；或表現特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子、IL-7、及CCL19之免疫活性細胞之製作方法，其特徵在於將編碼特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子之核酸、編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸導入至免疫活性細胞。
惡性腫瘤係世界上較多之罹患者所有之疾病，一般廣泛進行化學療法、放射線療法或外科療法。然而，存在各種問題，例如產生副作用，失去一部分功能，或者無法治療復發或轉移。因此，為了將患者之生活品質(QOL)維持為更高，近年來，進行免疫細胞療法之開發。該免疫細胞療法係自患者採集免疫活性細胞，以提高此種免疫活性細胞之免疫功能之方式進行處理而擴增，再次移入至患者之療法。具體而言，已知有一種自患者採集T細胞，於此種T細胞導入編碼嵌合抗原受體(constitutive androstane receptor：以下亦稱為「CAR」)之核酸進行擴增，再次移入至患者之療法(參照非專利文獻1)。此種療法目前於世界上進行臨床試驗，獲得於白血病或淋巴瘤等造血器官惡性腫瘤等中表現出有效性之結果。
另一方面，本發明者等人提出一種藉由同時表現IL-7與CCL19，明顯抑制實體癌之免疫細胞療法(參照專利文獻1、2)。藉由此種方法，可使內源性之免疫活性細胞活化或者提高對腫瘤細胞之聚集能力。
另外，已知間皮素表現於間皮瘤、大腸癌(直腸癌、結腸癌)、胰腺癌、卵巢癌、肺癌、乳腺癌、頭頸部癌等癌細胞中。揭示有一種以此種間皮素作為靶之CAR-T細胞(參照專利文獻3、4)。
[先前技術文獻]
[專利文獻]
專利文獻1：國際公開第2016/056228號說明書
專利文獻2：國際公開第2017/159736號說明書
專利文獻3：美國專利申請案公開第2014/0301993號說明書
專利文獻4：日本專利特開2017-518053號公報
[非專利文獻]
非專利文獻1：中澤洋三 信州醫學雜誌 61(4)：197～203(2013)
[發明所欲解決之問題]
業界開發出一種使用如上所述同時表現IL-7與CCL19之表現CAR之T細胞或表現TCR(T Cell Receptor，T細胞受體)之T細胞等之免疫細胞療法，且進行可明顯提昇免疫活性細胞之增殖能力、存活能力、或宿主之免疫活性細胞之聚集能力，適應於先前於免疫細胞療法中未見充分之治療效果之實體癌之技術的開發。另一方面，現狀為於以在間皮瘤、胰腺癌等癌細胞中高表現之間皮素作為靶之表現CAR之免疫活性細胞之開發中，臨床結果中亦未出現令人滿意之結果，例如免疫活性細胞於癌局部之聚集不充分，或者有抗腫瘤效果較短而腫瘤復發之虞。因此，本發明之課題在於提供一種以新穎之間皮素作為靶之免疫活性細胞。
[解決問題之技術手段]
本發明者等人研究迄今為止自己開發出之表現CAR、IL-7及CCL19之T細胞之進一步之可能性。其結果為發現：藉由選擇使用含有特定之胺基酸序列作為特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子，且含有與人類間皮素特異性結合之單鏈抗體之CAR，具有對表現間皮素之癌細胞之細胞毒殺活性，並且可抑制因由表現間皮素之癌細胞所形成之腫瘤所引起之存活率降低，從而完成本發明。
即，本發明如下所述。
[1]一種免疫活性細胞，其表現特異性辨識人類間皮素(Human Mesothelin)之細胞表面分子、介白素7(IL-7)、及趨化因子(C-C基元)配體19(CCL19)。
[2]如上述[1]記載之免疫活性細胞，其特徵在於其係自生物體分離之免疫活性細胞。
[3]如上述[1]或[2]記載之免疫活性細胞，其特徵在於含有編碼外來之特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子之核酸、編碼外來之IL-7之核酸、及編碼外來之CCL19之核酸。
[4]如上述[3]記載之免疫活性細胞，其特徵在於編碼外來之IL-7之核酸、及編碼外來之CCL19之核酸係編碼外來之人類IL-7之核酸、及編碼外來之人類CCL19之核酸。
[5]如上述[3]或[4]記載之免疫活性細胞，其特徵在於在基因組中殖入有編碼外來之特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子之核酸、編碼外來之IL-7之核酸、及編碼外來之CCL19之核酸。
[6]如上述[1]至[5]中任一項記載之免疫活性細胞，其特徵在於特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子係具備單鏈抗體、細胞膜貫通區、及誘導免疫活性細胞之活化之訊息傳遞區之嵌合抗原受體(CAR)。
[7]如上述[6]記載之免疫活性細胞，其中CAR中之單鏈抗體係以下之任一種。
(1-1)包括：含有包含序列編號13所表示之胺基酸序列之重鏈CDR1、包含序列編號14所表示之胺基酸序列之重鏈CDR2、及包含序列編號15所表示之胺基酸序列之重鏈CDR3之重鏈可變區、及含有包含序列編號16所表示之胺基酸序列之輕鏈CDR1、包含序列編號17所表示之胺基酸序列之輕鏈CDR2、及包含序列編號18所表示之胺基酸序列之輕鏈CDR3之輕鏈可變區的單鏈抗體；
(2-1)包括：含有包含序列編號13所表示之胺基酸序列之重鏈CDR1、包含序列編號14所表示之胺基酸序列之重鏈CDR2、及包含序列編號15所表示之胺基酸序列之重鏈CDR3之重鏈可變區、及含有包含序列編號19所表示之胺基酸序列之輕鏈CDR1、包含序列編號17所表示之胺基酸序列之輕鏈CDR2、及包含序列編號18所表示之胺基酸序列之輕鏈CDR3之輕鏈可變區的單鏈抗體；
(3-1)包括：含有包含序列編號20所表示之胺基酸序列之重鏈CDR1、包含序列編號21所表示之胺基酸序列之重鏈CDR2、及包含序列編號22所表示之胺基酸序列之重鏈CDR3之重鏈可變區、及含有包含序列編號23所表示之胺基酸序列之輕鏈CDR1、包含序列編號24所表示之胺基酸序列之輕鏈CDR2、及包含序列編號25所表示之胺基酸序列之輕鏈CDR3之輕鏈可變區的單鏈抗體；
[8]如上述[6]或[7]記載之免疫活性細胞，其中CAR中之單鏈抗體係以下之任一種。
(1-2)包括：包含與序列編號1所表示之胺基酸序列具有85%以上之序列一致性之胺基酸序列之重鏈可變區、及包含與序列編號2所表示之胺基酸序列具有85%以上之序列一致性之胺基酸序列之輕鏈可變區的單鏈抗體；
(2-2)包括：包含與序列編號3所表示之胺基酸序列具有85%以上之序列一致性之胺基酸序列之重鏈可變區、及包含與序列編號4所表示之胺基酸序列具有85%以上之序列一致性之胺基酸序列之輕鏈可變區的單鏈抗體；
(3-2)包括：包含與序列編號5所表示之胺基酸序列具有85%以上之序列一致性之胺基酸序列之重鏈可變區、及包含與序列編號6所表示之胺基酸序列具有85%以上之序列一致性之胺基酸序列之輕鏈可變區的單鏈抗體；
(4-2)包括：包含與序列編號1所表示之胺基酸序列具有85%以上之序列一致性之胺基酸序列之重鏈可變區、及包含與序列編號4所表示之胺基酸序列具有85%以上之序列一致性之胺基酸序列之輕鏈可變區的單鏈抗體；
(5-2)包括：包含與序列編號3所表示之胺基酸序列具有85%以上之序列一致性之胺基酸序列之重鏈可變區、及包含與序列編號2所表示之胺基酸序列具有85%以上之序列一致性之胺基酸序列之輕鏈可變區的單鏈抗體；
[9]如上述[6]至[8]中任一項記載之免疫活性細胞，其中CAR中之單鏈抗體係以下之任一種。
(1-3)包括：包含序列編號1所表示之胺基酸序列之重鏈可變區、及包含序列編號2所表示之胺基酸序列之輕鏈可變區的單鏈抗體；
(2-3)包括：包含序列編號3所表示之胺基酸序列之重鏈可變區、包含序列編號4所表示之胺基酸序列之輕鏈可變區的單鏈抗體；
(3-3)包括：包含序列編號5所表示之胺基酸序列之重鏈可變區、及包含序列編號6所表示之胺基酸序列之輕鏈可變區的單鏈抗體；
(4-3)包括：包含序列編號1所表示之胺基酸序列之重鏈可變區、及包含序列編號4所表示之胺基酸序列之輕鏈可變區的單鏈抗體；
(5-3)包括：包含序列編號3所表示之胺基酸序列之重鏈可變區、及包含序列編號2所表示之胺基酸序列之輕鏈可變區的單鏈抗體；
[10]如上述[6]至[9]中任一項記載之免疫活性細胞，其特徵在於CAR中之細胞膜貫通區包含與序列編號7所表示之胺基酸序列具有85%以上之序列一致性之胺基酸序列。
[11]如上述[6]至[10]中任一項記載之免疫活性細胞，其特徵在於CAR中之誘導免疫活性細胞之活化之訊息傳遞區包含序列編號8、9及10所表示之胺基酸序列。
[12]如上述[7]至[11]中任一項記載之免疫活性細胞，其特徵在於重鏈可變區與輕鏈可變區經由包含2～30個胺基酸序列之胜肽連接子結合。
[13]如上述[12]記載之免疫活性細胞，其特徵在於胜肽連接子包含序列編號26或序列編號27所表示之胺基酸序列。
[14]如上述[6]至[13]中任一項記載之免疫活性細胞，其中CAR中之單鏈抗體係以下之任一種。
(1-4)依序包括：包含序列編號1所表示之胺基酸序列之重鏈可變區、包含序列編號26所表示之胺基酸序列之胜肽連接子、及包含序列編號2所表示之胺基酸序列之輕鏈可變區的單鏈抗體；
(2-4)依序包括：包含序列編號3所表示之胺基酸序列之重鏈可變區、包含序列編號26所表示之胺基酸序列之胜肽連接子、及包含序列編號4所表示之胺基酸序列之輕鏈可變區的單鏈抗體；
(3-4)依序包括：包含序列編號2所表示之胺基酸序列之輕鏈可變區、包含序列編號26所表示之胺基酸序列之胜肽連接子、及包含序列編號1所表示之胺基酸序列之重鏈可變區的單鏈抗體；
(4-4)依序包括：包含序列編號1所表示之胺基酸序列之重鏈可變區、包含序列編號27所表示之胺基酸序列之胜肽連接子、及包含序列編號2所表示之胺基酸序列之輕鏈可變區的單鏈抗體；
(5-4)依序包括：包含序列編號2所表示之胺基酸序列之輕鏈可變區、包含序列編號27所表示之胺基酸序列之胜肽連接子、及包含序列編號1所表示之胺基酸序列之重鏈可變區的單鏈抗體；
(6-4)依序包括：包含序列編號5所表示之胺基酸序列之重鏈可變區、包含序列編號26所表示之胺基酸序列之胜肽連接子、及包含序列編號6所表示之胺基酸序列之輕鏈可變區的單鏈抗體；
(7-4)依序包括：包含序列編號6所表示之胺基酸序列之輕鏈可變區、包含序列編號26所表示之胺基酸序列之胜肽連接子、及包含序列編號5所表示之胺基酸序列之重鏈可變區的單鏈抗體；
(8-4)依序包括：包含序列編號5所表示之胺基酸序列之重鏈可變區、包含序列編號27所表示之胺基酸序列之胜肽連接子、及包含序列編號6所表示之胺基酸序列之輕鏈可變區的單鏈抗體；
(9-4)依序包括：包含序列編號6所表示之胺基酸序列之輕鏈可變區、包含序列編號27所表示之胺基酸序列之胜肽連接子、及包含序列編號5所表示之胺基酸序列之重鏈可變區的單鏈抗體；
[15]如上述[6]至[14]中任一項記載之免疫活性細胞，其特徵在於CAR中之誘導免疫活性細胞之活化之訊息傳遞區包含CD28之細胞內區域之多胜肽、4-1BB之細胞內區域之多胜肽、及CD3ζ之細胞內區域之多胜肽。
[16]如上述[1]至[15]中任一項記載之免疫活性細胞，其特徵在於免疫活性細胞為T細胞。
[17]如上述[1]至[16]中任一項記載之免疫活性細胞，其特徵在於免疫活性細胞係源自人類或自人類分離之T細胞。
[18]一種醫藥組合物，其含有如上述[1]至[17]中任一項記載之免疫活性細胞、及藥學上容許之添加劑。
[19]如上述[18]記載之醫藥組合物，其係用於癌症之治療。
[20]一種表現載體，其含有編碼特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子之核酸、編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸。
[21]一種表現特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子、IL-7、及CCL19之免疫活性細胞之製作方法，其特徵在於將編碼特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子之核酸、IL-7編碼之核酸、及編碼CCL19之核酸導入至免疫活性細胞。
[發明之效果]
本發明之免疫活性細胞具有表現人類間皮素之癌細胞毒殺活性，可抑制表現人類間皮素之腫瘤形成。又，本發明之免疫活性細胞亦具有癌細胞之復發抑制效果。
本發明之免疫活性細胞只要為表現特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子、IL-7、及CCL19之免疫活性細胞即可，較佳為含有編碼外來之細胞表面分子之核酸、編碼外來之IL-7之核酸、及編碼外來之CCL19之核酸之免疫活性細胞，藉由此種免疫活性細胞，可抑制由表現人類間皮素之癌細胞而形成腫瘤。
(人類間皮素)
人類間皮素係40 kDa之蛋白質，於正常細胞中幾乎不表現，於間皮瘤、胰腺癌等癌細胞中高表現。人類間皮素之序列資訊可檢索公知之文獻或NCBI(National Center for Biotechnology Information，美國生物技術資訊中心)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/)等之資料庫而適當獲取。例如作為人類間皮素之胺基酸序列資訊，可列舉：Genbank登錄號NP_037536.2、AAV87530.1或該等之同功異型物等。
(細胞表面分子)
作為特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子，可列舉特異性辨識人類間皮素之CAR、特異性辨識源自人類間皮素之胜肽之T細胞受體(T cell receptor：TCR)、與人類間皮素特異性結合之蛋白質或核酸等藉由於細胞表面表現而賦予對人類間皮素特異性之辨識能力之分子或因子。再者，CAR係使辨識癌細胞之細胞表面抗原之單鏈抗體(single chain Fv：scFv)與誘導T細胞之活化之訊息傳遞區融合而成的人工嵌合蛋白質。
上述細胞表面分子較佳為藉由訊息胜肽(前導序列)而局部存在於免疫活性細胞之細胞表面。作為訊息胜肽，可列舉源自免疫球蛋白重鏈、免疫球蛋白輕鏈、CD8、T細胞受體之α、β鏈、CD3ζ、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154、GITR的訊息胜肽(前導序列)之多胜肽。具體而言，可列舉：包含於序列編號11或12所表示之胺基酸序列中具有85%以上、較佳為90%以上、更佳為95%以上、進而較佳為98%以上之序列一致性之胺基酸序列，且具有與序列編號11或12同等之作用之多胜肽；或包含於序列編號11或12所表示之胺基酸序列中缺失、置換、插入及/或附加了一個或複數個胺基酸之胺基酸序列，且具有與序列編號11或12所表示之胺基酸序列同等之作用之多胜肽。再者，訊息胜肽係於完成局部存在化之成熟蛋白質中被去除。
於本說明書中，「缺失、置換、插入及/或附加了一個或數個胺基酸殘基之胺基酸序列」亦包含缺失、置換、插入及/或附加了例如1～30個之範圍內、較佳為1～20個之範圍內、更佳為1～15個之範圍內、進而較佳為1～10個之範圍內、進而較佳為1～5個之範圍內、進而較佳為1～3個之範圍內、進而較佳為1～2個之範圍內之數量之胺基酸殘基的胺基酸序列。該等胺基酸殘基之變異處理可藉由化學合成、基因工程技術、突變誘發等業者已知之任意之方法進行。
於本說明書中，用語「一致性」意指多胜肽或多核苷酸序列近似性之程度(其係由查詢序列與其他較佳為一致之類型之序列(核酸或蛋白質序列)之匹配而確定)。作為計算及確定「一致性」之較佳之電腦程式法，例如可列舉：GCG BLAST(Basic Local Alignment Search Tool，基本局域對準搜索工具)(Altschul et al., J. Mol. Biol. 1990, 215:403-410; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 1997, 25:3389-3402; Devereux et al., Nucleic Acid Res. 1984, 12:387)、以及BLASTN 2.0(Gish W., http://blast.Wustl.edu, 1996-2002)、以及FASTA(Pearson及Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988, 85:2444-2448)、以及確定及排序重複最長之一對片段重疊群之GCG GelMerge(Wibur及Lipman, SIAM J. Appl. Math. 1984, 44:557-567; Needleman及Wunsch, J. Mol. Biol. 1970, 48:443-453)。
(特異性辨識人類間皮素之單鏈抗體)
於細胞表面分子為CAR之情形時，較佳為含有特異性辨識人類間皮素之單鏈抗體(scFv)作為特異性辨識人類間皮素之分子。於此種特異性辨識人類間皮素之單鏈抗體中，特異性辨識人類間皮素之抗體之重鏈可變區(VH)與輕鏈可變區(VL)只要藉由用以連結上述重鏈可變區及上述輕鏈可變區之胜肽連接子結合即可。作為此種特異性辨識人類間皮素之單鏈抗體中之重鏈可變區與輕鏈可變區之組合，例如可列舉以下之組合。再者，輕鏈可變區相對於重鏈可變區可位於上游(N末端側)，亦可位於下游(C末端側)。
(1-1)含有包含序列編號13所表示之胺基酸序列之重鏈CDR(complementarity determining region，互補決定區)1、包含序列編號14所表示之胺基酸序列之重鏈CDR2、及包含序列編號15所表示之胺基酸序列之重鏈CDR3之重鏈可變區、與含有包含序列編號16所表示之胺基酸序列之輕鏈CDR1、包含序列編號17所表示之胺基酸序列之輕鏈CDR2、及包含序列編號18所表示之胺基酸序列之輕鏈CDR3之輕鏈可變區的組合；
(2-1)含有包含序列編號13所表示之胺基酸序列之重鏈CDR1、包含序列編號14所表示之胺基酸序列之重鏈CDR2、及包含序列編號15所表示之胺基酸序列之重鏈CDR3之重鏈可變區、與含有包含序列編號19所表示之胺基酸序列之輕鏈CDR1、包含序列編號17所表示之胺基酸序列之輕鏈CDR2、及包含序列編號18所表示之胺基酸序列之輕鏈CDR3之輕鏈可變區的組合；
(3-1)含有包含序列編號20所表示之胺基酸序列之重鏈CDR1、包含序列編號21所表示之胺基酸序列之重鏈CDR2、及包含序列編號22所表示之胺基酸序列之重鏈CDR3之重鏈可變區、與含有包含序列編號23所表示之胺基酸序列之輕鏈CDR1、包含序列編號24所表示之胺基酸序列之輕鏈CDR2、及包含序列編號25所表示之胺基酸序列之輕鏈CDR3之輕鏈可變區的組合；
除此以外，例如亦可列舉基於特異性辨識以下之文獻(美國專利第8,357,783號、日本專利特表2017-518053)等中所記載之公知之人類間皮素之抗體之重鏈可變區及輕鏈可變區之胺基酸序列，基於IMGT、Kabat、Chothia、North或Contact等編號系統特定特異性辨識人類間皮素之重鏈可變區及輕鏈可變區之CDR，且具備此種CDR之重鏈可變區與輕鏈可變區之組合。再者，CDR可藉由以下之AbodyBuilder網站(http://opig.stats.ox.ac.uk/webapps/sabdab-sabpred/Modelling.php)特定。
又，作為上述特異性辨識人類間皮素之單鏈抗體中之重鏈可變區與輕鏈可變區之組合，亦可列舉以下之組合。
(1-2)包含與序列編號1所表示之胺基酸序列具有85%以上、較佳為90%以上、更佳為95%以上、進而較佳為98%以上之序列一致性之胺基酸序列之重鏈可變區、與包含與序列編號2所表示之胺基酸序列具有85%以上、較佳為90%以上、更佳為95%以上、進而較佳為98%以上之序列一致性之胺基酸序列之輕鏈可變區的組合；
(2-2)包含與序列編號3所表示之胺基酸序列具有85%以上、較佳為90%以上、更佳為95%以上、進而較佳為98%以上之序列一致性之胺基酸序列之重鏈可變區、與包含與序列編號4所表示之胺基酸序列具有85%以上、較佳為90%以上、更佳為95%以上、進而較佳為98%以上之序列一致性之胺基酸序列之輕鏈可變區的組合；
(3-2)包含與序列編號5所表示之胺基酸序列具有85%以上、較佳為90%以上、更佳為95%以上、進而較佳為98%以上之序列一致性之胺基酸序列之重鏈可變區、與包含與序列編號6所表示之胺基酸序列具有85%以上、較佳為90%以上、更佳為95%以上、進而較佳為98%以上之序列一致性之胺基酸序列之輕鏈可變區的組合；
(4-2)包含與序列編號1所表示之胺基酸序列具有85%以上、較佳為90%以上、更佳為95%以上、進而較佳為98%以上之序列一致性之胺基酸序列之重鏈可變區、與包含與序列編號4所表示之胺基酸序列具有85%以上、較佳為90%以上、更佳為95%以上、進而較佳為98%以上之序列一致性之胺基酸序列之輕鏈可變區的組合；
(5-2)包含與序列編號3所表示之胺基酸序列具有85%以上、較佳為90%以上、更佳為95%以上、進而較佳為98%以上之序列一致性之胺基酸序列之重鏈可變區、與包含與序列編號2所表示之胺基酸序列具有85%以上、較佳為90%以上、更佳為95%以上、進而較佳為98%以上之序列一致性之胺基酸序列之輕鏈可變區的組合；
除此以外，例如亦可為包含與特異性辨識以下之文獻(美國專利第8,357,783號、日本專利特表2017-518053)等中所記載之公知之人類間皮素之抗體之重鏈可變區具有85%以上、較佳為90%以上、更佳為95%以上、進而較佳為98%以上之序列一致性之胺基酸序列之重鏈可變區、與包含與特異性辨識上述公知之人類間皮素之抗體之輕鏈可變區具有85%以上、較佳為90%以上、更佳為95%以上、進而較佳為98%以上之序列一致性之胺基酸序列之輕鏈可變區的組合。
進而，作為上述特異性辨識人類間皮素之單鏈抗體中之重鏈可變區與輕鏈可變區之組合，亦可列舉以下之組合。
(1-3)包含序列編號1所表示之胺基酸序列之重鏈可變區、與包含序列編號2所表示之胺基酸序列之輕鏈可變區的組合；
(2-3)包含序列編號3所表示之胺基酸序列之重鏈可變區、與包含序列編號4所表示之胺基酸序列之輕鏈可變區的組合；
(3-3)包含序列編號5所表示之胺基酸序列之重鏈可變區、與包含序列編號6所表示之胺基酸序列之輕鏈可變區的組合；
(4-3)包含序列編號1所表示之胺基酸序列之重鏈可變區、與包含序列編號4所表示之胺基酸序列之輕鏈可變區的組合；
(5-3)包含序列編號3所表示之胺基酸序列之重鏈可變區、與包含序列編號2所表示之胺基酸序列之輕鏈可變區的組合；
除此以外，例如亦可為特異性辨識以下之文獻(美國專利第8,357,783號、日本專利特表2017-518053)等中所記載之公知之人類間皮素之抗體之重鏈可變區或輕鏈可變區的組合。
(胜肽連接子)
重鏈可變區及輕鏈可變區係經由胜肽連接子結合。此種胜肽連接長度為2～30，較佳為15～25，更佳為15或25。具體而言，可較佳地列舉：包含於包含甘胺酸-絲胺酸連續序列之序列編號26或27所表示之胺基酸序列中具有85%以上、較佳為90%以上、更佳為95%以上、進而較佳為98%以上之序列一致性之胺基酸序列，且具有與序列編號26或27同等之作用之多胜肽；或包含於序列編號26或27所表示之胺基酸序列中缺失、置換、插入及/或附加了一個或複數個胺基酸之胺基酸序列，且具有與序列編號26或27所表示之胺基酸序列同等之作用之多胜肽。
作為上述特異性辨識人類間皮素之單鏈抗體中之重鏈可變區與輕鏈可變區及胜肽連接子之組合，亦可列舉以下之組合。再者，以下之「依序」係自N末端側起依序之含義。
(1-4)依序包括：包含序列編號1所表示之胺基酸序列之重鏈可變區、包含序列編號26所表示之胺基酸序列之胜肽連接子、及包含序列編號2所表示之胺基酸序列之輕鏈可變區的組合；
(2-4)依序包括：包含序列編號3所表示之胺基酸序列之重鏈可變區、包含序列編號26所表示之胺基酸序列之胜肽連接子、及包含序列編號4所表示之胺基酸序列之輕鏈可變區的組合；
(3-4)依序包括：包含序列編號2所表示之胺基酸序列之輕鏈可變區、包含序列編號26所表示之胺基酸序列之胜肽連接子、及包含序列編號1所表示之胺基酸序列之重鏈可變區的組合；
(4-4)依序包括：包含序列編號1所表示之胺基酸序列之重鏈可變區、包含序列編號27所表示之胺基酸序列之胜肽連接子、及包含序列編號2所表示之胺基酸序列之輕鏈可變區的組合；
(5-4)依序包括：包含序列編號2所表示之胺基酸序列之輕鏈可變區、包含序列編號27所表示之胺基酸序列之胜肽連接子、及包含序列編號1所表示之胺基酸序列之重鏈可變區的組合；
(6-4)依序包括：包含序列編號5所表示之胺基酸序列之重鏈可變區、包含序列編號26所表示之胺基酸序列之胜肽連接子、及包含序列編號6所表示之胺基酸序列之輕鏈可變區的組合；
(7-4)依序包括：包含序列編號6所表示之胺基酸序列之輕鏈可變區、包含序列編號26所表示之胺基酸序列之胜肽連接子、及包含序列編號5所表示之胺基酸序列之重鏈可變區的組合；
(8-4)依序包括：包含序列編號5所表示之胺基酸序列之重鏈可變區、包含序列編號27所表示之胺基酸序列之胜肽連接子、及包含序列編號6所表示之胺基酸序列之輕鏈可變區的組合；
(9-4)依序包括：包含序列編號6所表示之胺基酸序列之輕鏈可變區、包含序列編號27所表示之胺基酸序列之胜肽連接子、及包含序列編號5所表示之胺基酸序列之重鏈可變區的組合；
(IL-7、CCL19)
上述IL-7係T細胞之生存所必需之細胞激素，由骨髓、胸腺、淋巴器官・組織之基質細胞等非造血細胞產生。另一方面，幾乎未見T細胞本身之產生能力。
又，上述CCL19主要由淋巴結之樹狀細胞或巨噬細胞產生，具有經由作為其受體之CCR7引起T細胞或B細胞、成熟之樹狀細胞之移動之功能。
IL-7及CCL19所源自之生物並無特別限定，較佳為人類。再者，該等蛋白質之胺基酸序列可自GenBank等公知之序列資料庫獲取。例如作為人類IL-7之胺基酸序列之例，可列舉登記為GenBank登錄號：NM_000880.3(序列編號28)之序列、或該等之同功異型物等。又，作為人類CCL19之胺基酸序列之例，可列舉登記為GenBank登錄號：NM_006274.2(序列編號29)之序列、或該等之同功異型物等。再者，IL-7及CCL19可具有訊息胜肽，但於成熟蛋白質中，訊息胜肽被去除。例如於序列編號28所記載之人類IL-7之胺基酸序列中，1～25位之序列對應於訊息胜肽。又，例如於序列編號29所記載之人類CCL19之胺基酸序列中，1～21位之序列對應於訊息胜肽。
又，IL-7及CCL19亦可為如上所述之天然蛋白質之變異體。作為IL-7之變異體之例，可列舉：包含於序列編號28所記載之人類IL-7之胺基酸序列中具有85%以上、較佳為90%以上、更佳為95%以上、進而較佳為98%以上之序列一致性之胺基酸序列，且具有IL-7中之細胞增殖率或細胞存活率之提高作用之多胜肽；或包含於序列編號28所記載之人類IL-7之胺基酸序列中缺失、置換、插入及/或附加了一個或複數個胺基酸之胺基酸序列，且具有IL-7中之細胞增殖率或細胞存活率之提高作用之多胜肽。作為人類CCL19之變異體之例，可列舉：包含於序列編號29所記載之人類CCL19之胺基酸序列中具有85%以上、較佳為90%以上、更佳為95%以上、進而較佳為98%以上之序列一致性之胺基酸序列，且具有細胞於CCL19中之移動作用之多胜肽；或包含於序列編號29所記載之人類CCL19之胺基酸序列中缺失、置換、插入及/或附加了一個或複數個胺基酸之胺基酸序列，且具有細胞於CCL19中之移動作用之多胜肽。
(其他免疫功能控制因子)
本發明之免疫活性細胞亦可進而表現IL-15、CCL21、IL-2、IL-4、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18、IP-10、Interferon-γ、MIP-1alpha、GM-CSF、M-CSF、TGF-beta、TNF-alpha等其他免疫功能控制因子，作為上述其他免疫控制因子，較佳為IL-12以外之免疫功能控制因子。
(細胞膜貫通區)
作為本發明中之細胞膜貫通區，可列舉源自CD8、T細胞受體之α、β鏈、CD3ζ、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154、GITR之細胞膜貫通區之多胜肽，可較佳地列舉：包含與序列編號7所表示之人類CD8細胞膜貫通區之胺基酸序列具有85%以上、較佳為90%以上、更佳為95%以上、進而較佳為98%以上之序列一致性之胺基酸序列，且具有與序列編號7所表示之胺基酸序列同等之作用之多胜肽；或包含於序列編號7所表示之胺基酸序列中缺失、置換、插入及/或附加了一個或複數個胺基酸之胺基酸序列，且具有與序列編號7所表示之胺基酸序列同等之作用之多胜肽。藉由此種細胞膜貫通區，CAR固定於T細胞之細胞膜。
於上述細胞膜貫通區，包含任意之寡胜肽或多胜肽，亦可包含長度為1～100個胺基酸、較佳為10～70個胺基酸之鉸鏈區。作為鉸鏈區，可列舉人類CD8之鉸鏈區。
(免疫活性細胞活化訊息傳遞區)
免疫活性細胞活化訊息傳遞區係於上述細胞表面分子辨識間皮素時，可訊息傳遞至細胞內之區域，較佳為包含選自CD28、4-1BB(CD137)、GITR、CD27、OX40、HVEM、CD3ζ或Fc受體相關(Receptor-associated)γ鏈(chain)之細胞內區域之多胜肽中之至少1種或2種以上，更佳為包含CD28之細胞內區域之多胜肽、4-1BB之細胞內區域之多胜肽、及CD3ζ之細胞內區域之多胜肽3種多胜肽。作為CD28之細胞內區域之胺基酸序列，可列舉：包含與序列編號8所表示之胺基酸序列具有85%以上、較佳為90%以上、更佳為95%以上、進而較佳為98%以上之序列一致性之胺基酸序列，且具有與序列編號8所表示之胺基酸序列同等之作用之多胜肽；或包含於序列編號8所表示之胺基酸序列中缺失、置換、插入及/或附加了一個或複數個胺基酸之胺基酸序列，且具有與序列編號8所表示之胺基酸序列同等之作用之多胜肽。作為4-1BB之細胞內區域之胺基酸序列，可列舉：包含與序列編號9所表示之胺基酸序列具有85%以上、較佳為90%以上、更佳為95%以上、進而較佳為98%以上之序列一致性之胺基酸序列，且具有與序列編號9所表示之胺基酸序列同等之作用之多胜肽；或包含於序列編號9所表示之胺基酸序列中缺失、置換、插入及/或附加了一個或複數個胺基酸之胺基酸序列，且具有與序列編號9所表示之胺基酸序列同等之作用之多胜肽。作為CD3ζ之細胞內區域之胺基酸序列，可列舉：包含與序列編號10所表示之胺基酸序列具有85%以上、較佳為90%以上、更佳為95%以上、進而較佳為98%以上之序列一致性之胺基酸序列，且具有與序列編號10所表示之胺基酸序列同等之作用之多胜肽；或包含於序列編號10所表示之胺基酸序列中缺失、置換、插入及/或附加了一個或複數個胺基酸之胺基酸序列，且具有與序列編號10所表示之胺基酸序列同等之作用之多胜肽。再者，於使用T細胞作為免疫活性細胞時，只要選擇可訊息傳遞至T細胞內之多胜肽即可，於使用其他免疫活性細胞時，亦只要選擇可訊息傳遞至此種免疫活性細胞之多胜肽即可。作為使用T細胞作為免疫活性細胞之情形時之免疫活性細胞活化訊息傳遞區，可列舉包含序列編號8、9及10所表示之胺基酸序列之多胜肽，可較佳地列舉自N末端側起依序包含序列編號8、9及10所表示之胺基酸序列之多胜肽。
(細胞外鉸鏈區、間隔子)
又，可於辨識間皮素之細胞表面分子與細胞膜貫通區之間設置包含任意之寡胜肽或多胜肽之細胞外鉸鏈區。作為細胞外鉸鏈區之長度，可列舉1～100個胺基酸殘基、較佳為10～70個胺基酸殘基，作為此種細胞外鉸鏈區，可列舉源自CD8、CD28、CD4等之鉸鏈區、或免疫球蛋白之鉸鏈區。
進而，可於細胞膜貫通區與免疫活性細胞活化訊息傳遞區之間設置包含任意之寡胜肽或多胜肽之間隔子區。作為間隔子區之長度，可列舉1～100個胺基酸殘基、較佳為10～50個胺基酸殘基，作為此種間隔子區，可列舉甘胺酸-絲胺酸連續序列。
(各區域之配置)
於上述CAR中，上述各區域可自N末端起依序配置單鏈抗體、細胞膜貫通區、免疫活性細胞活化訊息傳遞區。具體而言，可列舉自N末端側起依序配置特異性辨識人類間皮素之單鏈抗體、人類CD8之細胞外鉸鏈區、人類CD8之細胞膜貫通區、人類CD28之T細胞活化訊息傳遞區、人類4-1BB之T細胞活化訊息傳遞區、及人類CD3ζ之T細胞活化訊息傳遞區之CAR。
(由自殺基因表現之蛋白質)
又，本發明之免疫活性細胞可表現具有使單純疱疹病毒之胸苷激酶(HSV-TK)或誘導性半胱天冬酶9(inducible caspase 9)等自體細胞死亡之功能之蛋白質(由自殺基因表現之蛋白質)。藉由表現該等基於自殺基因之蛋白質，可具有直接或二次誘導具有細胞毒性之物質，使自體細胞死亡之功能。因此，例如可根據癌症之治療經過，於腫瘤消失之情形時投予活化上述功能之藥劑，控制存在於生物體內之本發明之免疫活性細胞。即，可視需要確實地降低本發明之免疫活性細胞之成為細胞激素釋放症候群之風險。
作為活化單純疱疹病毒之胸苷激酶(HSV-TK)或誘導性半胱天冬酶9(inducible caspase 9)之功能之藥劑，針對前者可列舉更昔洛韋，針對後者可列舉作為二聚物誘導化合物(chemical induction of dimerization：CID)之AP1903(Cooper LJ., et. al. Cytotherapy. 2006; 8(2):105-17., Jensen M. C. et. al. Biol Blood Marrow Transplant. 2010 Sep; 16(9):1245-56., Jones BS. Front Pharmacol. 2014 Nov 27; 5:254., Minagawa K., Pharmaceuticals (Basel). 2015 May 8; 8(2):230-49., Bole-Richard E., Front Pharmacol. 2015 Aug 25;6:174)。
(免疫活性細胞之細胞之種類)
作為上述免疫活性細胞之細胞之種類，只要為藉由參與免疫應答，導入編碼特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子之核酸、編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸，可表現特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子、IL-7及CCL19之細胞，則並無特別限制，較佳為自生物體分離之免疫活性細胞，可列舉T細胞、自然殺手細胞(NK細胞)、B細胞等淋巴細胞系細胞；單核球、巨噬細胞、樹狀細胞等抗原呈現細胞；或嗜中性球、嗜酸性球、嗜鹼性球、肥胖細胞等粒細胞，其係自生物體分離者。具體而言，可較佳地列舉：源自人類、狗、貓、豬、小鼠等哺乳動物或自哺乳動物分離之T細胞，較佳為源自人類或自人類分離之T細胞。再者，源自人類、狗、貓、豬、小鼠等哺乳動物之T細胞包含將自人類、狗、貓、豬、小鼠等哺乳動物分離(採集)之T細胞人為地於生物體外培養之T細胞、或由該T細胞繼代培養之T細胞。又，作為上述分離之T細胞，可為主要包含T細胞之細胞群，除T細胞以外，亦可包含其他細胞，較佳為以50%以上、較佳為60%以上、更佳為70%以上、進而較佳為80%以上、最佳為90%之比率包含T細胞。又，T細胞可自浸潤於血液、骨髓液等體液、脾臟、胸腺、淋巴結等組織、或原發腫瘤、轉移性腫瘤、癌性腹水等癌組織之免疫細胞分離包含免疫活性細胞之細胞群而獲得。為了提高上述細胞群中所包含之T細胞之比率，亦可視需要藉由常規方法將分離之上述細胞群進而進行單離或純化而獲得。進而，作為上述免疫活性細胞之細胞，亦可利用由ES細胞(embryonic stem cell，胚胎幹細胞)或iPS細胞(induced pluripotent stem cell，誘導性多能幹細胞)所製作者。作為此種T細胞，可列舉：α・βT細胞、γ・δT細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、腫瘤浸潤T細胞、記憶T細胞、初始T細胞、NKT細胞。再者，免疫活性細胞之源自與投予對象可相同亦可不同。進而，於投予對象為人類之情形時，作為免疫活性細胞，可使用自作為投予對象之患者本人採集之自體細胞，亦可使用自他人採集之異體細胞。即，供體與受體可一致亦可不一致，較佳為一致。
(免疫活性細胞之製作方法)
作為本發明之免疫活性細胞之製作方法，可列舉將編碼細胞表面分子之核酸、編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸導入至免疫活性細胞而製作之方法，例如可較佳地列舉藉由上述專利文獻1或2中所記載之方法等，將下述本發明之表現載體導入至免疫活性細胞而製作之方法。或者亦可列舉如下方法：自對受精卵注入表現特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子、IL-7、及/或CCL19之載體所製作之基因轉殖哺乳動物純化免疫活性細胞而獲得；或者於自此種基因轉殖哺乳動物進行純化所獲得之免疫活性細胞，進而視需要導入表現特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子、IL-7、及/或CCL19之載體而製作。
作為編碼細胞表面分子之核酸、編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸、或將下述本發明之載體導入至免疫活性細胞之情形時之核酸或載體的導入方法，只要為於免疫活性細胞導入核酸或載體之方法即可，例如可列舉：電穿孔法(Cytotechnology, 3, 133(1990))、磷酸鈣法(日本專利特開平2-227075號公報)、脂轉染法(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84, 7413(1987))、病毒感染法等方法。作為此種病毒感染法，可列舉將導入之載體及包裝質體轉染至GP2-293細胞(TAKARA BIO公司製造)、Plat-GP細胞(Cosmo Bio公司製造)、PG13細胞(ATCC CRL-10686)、PA317細胞(ATCC CRL-9078)等包裝細胞而製作重組病毒，使免疫活性細胞細胞感染此種重組病毒之方法(上述專利文獻2)。
於使用載體製作上述「表現特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子、IL-7、及CCL19之免疫活性細胞」之情形時，可藉由以下之任一方法製作。
(1)將含有編碼特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子之核酸、編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸且表現特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子、IL-7及CCL19之載體導入至免疫活性細胞的方法；
(2)將含有編碼特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子之核酸且表現特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子之載體、以及含有編碼IL-7之核酸及編碼CCL19之核酸且表現IL-7及CCL19之載體2種載體同時或階段性地導入至免疫活性細胞的方法；
(3)將含有編碼特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子之核酸及編碼IL-7之核酸且表現特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子及IL-7之載體、以及含有編碼CCL19之核酸且表現CCL19之載體2種載體同時或階段性地導入至免疫活性細胞的方法；
(4)將含有編碼特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子之核酸及編碼CCL19之核酸且表現特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子及CCL19之載體、以及含有編碼IL-7之核酸且表現IL-7之載體2種載體同時或階段性地導入至免疫活性細胞的方法；
(5)將含有編碼特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子之核酸及編碼IL-7之核酸且表現特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子及IL-7之載體、以及含有編碼特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子之核酸及編碼CCL19之核酸且表現特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子及CCL19之載體2種載體同時或階段性地導入至免疫活性細胞的方法；
(6)將含有編碼特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子之核酸及編碼IL-7之核酸且表現特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子及IL-7之載體、以及含有編碼IL-7之核酸及編碼CCL19之核酸且表現IL-7及CCL19之載體2種載體同時或階段性地導入至免疫活性細胞的方法；
(7)將含有編碼特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子之核酸及編碼CCL19之核酸且表現特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子及CCL19之載體、以及含有編碼IL-7之核酸及編碼CCL19之核酸且表現IL-7及CCL19之載體2種載體同時或階段性地導入至免疫活性細胞的方法；
(8)將含有編碼特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子之核酸且表現特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子之載體、含有編碼IL-7之核酸且表現IL-7之載體、及含有編碼CCL19之核酸且表現CCL19之載體3種載體同時或階段性地導入至免疫活性細胞的方法；
進而，於使用載體製作上述「表現特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子、IL-7、及CCL19之免疫活性細胞」之情形時，亦可預先製備表現特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子之免疫活性細胞，使用此種表現特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子之免疫活性細胞，藉由以下之任一方法而製作。
(1)將含有編碼IL-7之核酸及編碼CCL19之核酸且表現IL-7及CCL19之載體導入至上述表現特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子之免疫活性細胞的方法；
(2)將含有編碼IL-7之核酸且表現IL-7之載體、及含有編碼CCL19之核酸且表現CCL19之載體2種同時或階段性地導入至上述表現特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子之免疫活性細胞的方法；
於使用上述各免疫活性細胞之情形時，可使用含有該免疫細胞之該免疫活性細胞之培養物。又，可於將編碼特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子之核酸、編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸殖入至免疫活性細胞之基因組之狀態下使用，亦可於不殖入至基因組之狀態(例如游離之狀態)下使用。進而，於使用上述各免疫活性細胞之情形時，亦可使用已將編碼特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子之核酸、編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸殖入至免疫活性細胞之基因組之免疫活性細胞、與未將編碼特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子之核酸、編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸殖入至基因組之免疫活性細胞的混合物。
又，如上所述，「表現特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子、IL-7、及CCL19之免疫活性細胞」可藉由將上述特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子、編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸使用公知之基因編輯技術，以能夠於適當之啟動子之控制下表現之方式殖入至細胞之基因組而製造。作為公知之基因編輯技術，可列舉使用鋅指核酸酶、TALEN(transcription activator-like effector nucleases，類轉錄活化因子核酸酶)、CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat，規律間隔成簇短回文重複序列)-Cas系統等核酸內切酶之技術。又，例如於使表現特異性辨識人類間皮素之CAR(抗人類間皮素CAR)之免疫活性細胞表現其他外來蛋白質之情形時，亦可同樣地使用基因編輯技術，將包含編碼其他外來蛋白質之鹼基序列之多核苷酸以能夠於適當之啟動子之控制下表現之方式殖入至細胞之基因組。具體而言，可列舉：將與適當之啟動子功能性地連結之包含編碼抗人類間皮素CAR(或其他蛋白質)之鹼基序列之多核苷酸殖入至細胞基因組之非編碼區等的方法；將包含編碼抗人類間皮素CAR(或其他蛋白質)之鹼基序列之多核苷酸殖入至細胞基因組之內源性啟動子之下游的方法等。作為內源性啟動子，例如可列舉TCRα、TCRβ之啟動子等。
(投予對象)
作為上述投予對象，可較佳地列舉哺乳動物或哺乳動物細胞，於上述哺乳動物中，可更佳地列舉：人類、小鼠、狗、大鼠、豚鼠、兔、雞、羊、豬、牛、馬、貓、猴、黑猩猩，可尤佳地列舉人類。
(表現載體)
本發明之表現載體只要可與免疫活性細胞或其前驅細胞接觸而導入至細胞內，使編碼於此之特定之蛋白質(多胜肽)於免疫活性細胞中表現，藉此製作本發明之免疫活性細胞即可，為何種實施形態並無特別限定。業者可設計並製作能夠於免疫活性細胞中表現所需之蛋白質(多胜肽)之表現載體。例如作為本發明之含有編碼特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子之核酸、編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸之表現載體，可列舉用以製作上述本發明之免疫活性細胞之以下之(a)～(e)中之任一表現載體(以下，亦稱為「表現IL-7/CCL19之抗人類間皮素載體」)。再者，以下之「2個表現載體」意指2種表現載體之集合，「3個表現載體」意指3種表現載體之集合。
(a)含有編碼特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子之核酸、編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸之表現載體：
(b)以下之(b-1)及(b-2)2個表現載體：
(b-1)含有編碼特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子之核酸之表現載體；
(b-2)含有編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸之表現載體；
(c)以下之(c-1)及(c-2)2個表現載體：
(c-1)含有編碼特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子之核酸、及編碼IL-7之核酸之表現載體；
(c-2)含有編碼CCL19之核酸之表現載體；
(d)以下之(d-1)及(d-2)2個表現載體：
(d-1)含有編碼IL-7之核酸之表現載體；
(d-2)含有編碼特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子之核酸、及編碼CCL19之核酸之表現載體；
(e)以下之(e-1)及(e-2)2個表現載體：
(e-1)含有編碼特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子之核酸、及編碼IL-7之核酸之表現載體；
(e-2)含有編碼特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子之核酸、及編碼CCL19之核酸之表現載體；
(f)以下之(f-1)及(f-2)2個表現載體：
(f-1)含有編碼特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子之核酸、及編碼IL-7之核酸之表現載體；
(f-2)含有編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸之表現載體；
(g)以下之(g-1)及(g-2)2個表現載體：
(g-1)含有編碼特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子之核酸、及編碼CCL19之核酸之表現載體；
(g-2)含有編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸之表現載體；
(h)以下之(h-1)、(h-2)及(h-3)3個表現載體：
(h-1)含有編碼特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子之核酸之表現載體；
(h-2)含有編碼IL-7之核酸之表現載體；
(h-3)含有編碼CCL19之核酸之表現載體；
上述表現IL-7/CCL19之抗人類間皮素載體亦可進而含有編碼IL-15、CCL21、IL-2、IL-4、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18、IP-10、Interferon-γ、MIP-1alpha、GM-CSF、M-CSF、TGF-β、TNF-α、檢查點抑制抗體或其片段等其他免疫功能控制因子之核酸，作為編碼上述其他免疫控制因子之核酸，較佳為編碼IL-12以外之免疫功能控制因子之核酸。
(核酸)
於本說明書中，「核酸」只要為核苷酸、及具有與該核苷酸同等之功能之分子進行聚合而成之分子，則可為任意者，例如可列舉：作為核糖核苷酸之聚合物之RNA(ribonucleic acid，核糖核酸)、作為脫氧核糖核苷酸之聚合物之DNA(deoxyribonucleic acid，去氧核糖核酸)、核糖核苷酸與脫氧核糖核苷酸進行混合而成之聚合物、及包含核苷酸類似物之核苷酸聚合物，進而，亦可為包含核酸衍生物之核苷酸聚合物。又，核酸可為單鏈核酸或雙鏈核酸。又，雙鏈核酸亦包含對一鏈，另一鏈於嚴格之條件下進行雜交之雙鏈核酸。
作為上述核苷酸類似物，只要為與RNA或DNA相比，為了提昇核酸酶耐性或者使之穩定化，為了提高與互補鏈核酸之親和性，或者為了提高細胞透過性，或者為了可視化而對核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、RNA或DNA實施修飾之分子，則可為任一分子。作為核苷酸類似物，可為天然存在之分子，亦可為非天然之分子，例如可列舉糖部修飾核苷酸類似物或磷酸二酯鍵修飾核苷酸類似物等。
作為上述糖部修飾核苷酸類似物，只要為對核苷酸之糖之化學結構之一部分或全部加成或取代任意之化學結構物質者，則可為任一化合物，作為其具體例，可列舉：經2'-O-甲基核糖取代之核苷酸類似物、經2'-O-丙基核糖取代之核苷酸類似物、經2'-甲氧基乙氧基核糖取代之核苷酸類似物、經2'-O-甲氧基乙基核糖取代之核苷酸類似物、經2'-O-[2-(胍)乙基]核糖取代之核苷酸類似物、經2'-氟核糖取代之核苷酸類似物、藉由於糖部導入交聯結構而具有2種環狀結構之交聯結構型人工核酸(Bridged Nucleic Acid)(BNA)，更具體而言，可列舉：2'位之氧原子與4'位之碳原子經由亞甲基進行交聯而成之鎖人工核酸(Locked Nucleic Acid)(LNA)、及乙烯交聯結構型人工核酸(Ethylene bridged nucleic acid)(ENA)[Nucleic Acid Research, 32, e175(2004)]，進而可列舉：胜肽核酸(PNA)[Acc. Chem. Res., 32, 624(1999)]、氧胜肽核酸(OPNA)[J. Am. Chem. Soc., 123, 4653 (2001)]及胜肽核糖核酸(PRNA)[J. Am. Chem. Soc., 122, 6900 (2000)]等。
作為上述磷酸二酯鍵修飾核苷酸類似物，只要為對核苷酸之磷酸二酯鍵之化學結構之一部分或全部加成或取代任意之化學物質者，則可為任一化合物，作為其具體例，可列舉：經硫代磷酸酯鍵取代之核苷酸類似物、經N3'-P5'胺基磷酸酯鍵取代之核苷酸類似物等[細胞工程，16, 1463-1473 (1997)][RNAi法與反義法，Kodansha(2005)]。
作為上述核酸衍生物，只要為與核酸相比，為了提昇核酸酶耐性，為了穩定化，為了提高與互補鏈核酸之親和性，為了提高細胞透過性，或者為了可視化而於該核酸加成另一化學物質之分子，則可為任一分子，作為其具體例，可列舉：5'-多胺加成衍生物、膽固醇加成衍生物、類固醇加成衍生物、膽汁酸加成衍生物、維生素加成衍生物、Cy5加成衍生物、Cy3加成衍生物、6-FAM加成衍生物及生物素加成衍生物等。
(編碼特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子、IL-7、CCL19等之核酸)
上述編碼特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子之核酸、編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸分別可列舉源自哺乳動物之核酸，可較佳地列舉源自人類之核酸。上述各核酸可根據導入本發明之表現載體之細胞之種類適當選擇，此種各核酸之序列資訊可檢索公知之文獻或NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/)等資料庫而適當獲取。
作為編碼特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子之核酸，可列舉編碼特異性辨識人類間皮素之CAR之核酸。
作為上述編碼特異性辨識人類間皮素之CAR中所包含之單鏈抗體之核酸，具體而言，可列舉以下之(1-1D)～(3-1D)。
(1-1D)編碼包括：含有包含序列編號13所表示之胺基酸序列之重鏈CDR1、包含序列編號14所表示之胺基酸序列之重鏈CDR2、及包含序列編號15所表示之胺基酸序列之重鏈CDR3之重鏈可變區、及含有包含序列編號16所表示之胺基酸序列之輕鏈CDR1、包含序列編號17所表示之胺基酸序列之輕鏈CDR2、及包含序列編號18所表示之胺基酸序列之輕鏈CDR3之輕鏈可變區之單鏈抗體的核酸；
(2-1D)編碼包括：含有包含序列編號13所表示之胺基酸序列之重鏈CDR1、包含序列編號14所表示之胺基酸序列之重鏈CDR2、及包含序列編號15所表示之胺基酸序列之重鏈CDR3之重鏈可變區、及含有包含序列編號19所表示之胺基酸序列之輕鏈CDR1、包含序列編號17所表示之胺基酸序列之輕鏈CDR2、及包含序列編號18所表示之胺基酸序列之輕鏈CDR3之輕鏈可變區之單鏈抗體的核酸；
(3-1D)編碼包括：含有包含序列編號20所表示之胺基酸序列之重鏈CDR1、包含序列編號21所表示之胺基酸序列之重鏈CDR2、及包含序列編號22所表示之胺基酸序列之重鏈CDR3之重鏈可變區、及含有包含序列編號23所表示之胺基酸序列之輕鏈CDR1、包含序列編號24所表示之胺基酸序列之輕鏈CDR2、及包含序列編號25所表示之胺基酸序列之輕鏈CDR3之輕鏈可變區之單鏈抗體的核酸；
作為上述編碼特異性辨識人類間皮素之CAR中所包含之單鏈抗體之核酸的其他態樣1，具體而言，可列舉以下之(1-2D)～(5-2D)。
(1-2D)編碼包括：與序列編號1所表示之胺基酸序列具有85%以上、較佳為90%以上、更佳為95%以上、進而較佳為98%以上之序列一致性之胺基酸序列之重鏈可變區、及包含與序列編號2所表示之胺基酸序列具有85%以上、較佳為90%以上、更佳為95%以上、進而較佳為98%以上之序列一致性之胺基酸序列之輕鏈可變區之單鏈抗體的核酸；
(2-2D)編碼包括：包含與序列編號3所表示之胺基酸序列具有85%以上、較佳為90%以上、更佳為95%以上、進而較佳為98%以上之序列一致性之胺基酸序列之重鏈可變區、及包含與序列編號4所表示之胺基酸序列具有85%以上、較佳為90%以上、更佳為95%以上、進而較佳為98%以上之序列一致性之胺基酸序列之輕鏈可變區之單鏈抗體的核酸；
(3-2D)編碼包括：包含與序列編號5所表示之胺基酸序列具有85%以上、較佳為90%以上、更佳為95%以上、進而較佳為98%以上之序列一致性之胺基酸序列之重鏈可變區、及包含與序列編號6所表示之胺基酸序列具有85%以上、較佳為90%以上、更佳為95%以上、進而較佳為98%以上之序列一致性之胺基酸序列之輕鏈可變區之單鏈抗體的核酸；
(4-2D)編碼包括：包含與序列編號1所表示之胺基酸序列具有85%以上、較佳為90%以上、更佳為95%以上、進而較佳為98%以上之序列一致性之胺基酸序列之重鏈可變區、及包含與序列編號4所表示之胺基酸序列具有85%以上、較佳為90%以上、更佳為95%以上、進而較佳為98%以上之序列一致性之胺基酸序列之輕鏈可變區之單鏈抗體的核酸；
(5-2D)編碼包括：包含與序列編號3所表示之胺基酸序列具有85%以上、較佳為90%以上、更佳為95%以上、進而較佳為98%以上之序列一致性之胺基酸序列之重鏈可變區、及包含與序列編號2所表示之胺基酸序列具有85%以上、較佳為90%以上、更佳為95%以上、進而較佳為98%以上之序列一致性之胺基酸序列之輕鏈可變區之單鏈抗體的核酸；
作為上述編碼特異性辨識人類間皮素之CAR中所包含之單鏈抗體之核酸的其他態樣2，具體而言，可列舉以下之(1-3D)～(5-3D)。
(1-3D)編碼包括：包含序列編號1所表示之胺基酸序列之重鏈可變區、及包含序列編號2所表示之胺基酸序列之輕鏈可變區之單鏈抗體的核酸；
(2-3D)編碼包括：包含序列編號3所表示之胺基酸序列之重鏈可變區、及包含序列編號4所表示之胺基酸序列之輕鏈可變區之單鏈抗體的核酸；
(3-3D)編碼包括：包含序列編號5所表示之胺基酸序列之重鏈可變區、及包含序列編號6所表示之胺基酸序列之輕鏈可變區之單鏈抗體的核酸；
(4-3D)編碼包括：包含序列編號1所表示之胺基酸序列之重鏈可變區、及包含序列編號4所表示之胺基酸序列之輕鏈可變區之單鏈抗體的核酸；
(5-3D)編碼包括：包含序列編號3所表示之胺基酸序列之重鏈可變區、及包含序列編號2所表示之胺基酸序列之輕鏈可變區之單鏈抗體的核酸；
作為上述編碼特異性辨識人類間皮素之CAR中所包含之單鏈抗體之核酸的其他態樣3，具體而言，可列舉以下之(1-4D)～(9-4D)。
(1-4D)編碼依序包括：包含序列編號1所表示之胺基酸序列之重鏈可變區、包含序列編號26所表示之胺基酸序列之胜肽連接子、及包含序列編號2所表示之胺基酸序列之輕鏈可變區之單鏈抗體的核酸；
(2-4D)編碼依序包括：包含序列編號3所表示之胺基酸序列之重鏈可變區、包含序列編號26所表示之胺基酸序列之胜肽連接子、及包含序列編號4所表示之胺基酸序列之輕鏈可變區之單鏈抗體的核酸；
(3-4D)編碼依序包括：包含序列編號2所表示之胺基酸序列之輕鏈可變區、包含序列編號26所表示之胺基酸序列之胜肽連接子、及包含序列編號1所表示之胺基酸序列之重鏈可變區之單鏈抗體的核酸；
(4-4D)編碼依序包括：包含序列編號1所表示之胺基酸序列之重鏈可變區、包含序列編號27所表示之胺基酸序列之胜肽連接子、及包含序列編號2所表示之胺基酸序列之輕鏈可變區之單鏈抗體的核酸；
(5-4D)編碼依序包括：包含序列編號2所表示之胺基酸序列之輕鏈可變區、包含序列編號27所表示之胺基酸序列之胜肽連接子、及包含序列編號1所表示之胺基酸序列之重鏈可變區之單鏈抗體的核酸；
(6-4D)編碼依序包括：包含序列編號5所表示之胺基酸序列之重鏈可變區、包含序列編號26所表示之胺基酸序列之胜肽連接子、及包含序列編號6所表示之胺基酸序列之輕鏈可變區之單鏈抗體的核酸；
(7-4D)編碼依序包括：包含序列編號6所表示之胺基酸序列之輕鏈可變區、包含序列編號26所表示之胺基酸序列之胜肽連接子、及包含序列編號5所表示之胺基酸序列之重鏈可變區之單鏈抗體的核酸；
(8-4D)編碼依序包括：包含序列編號5所表示之胺基酸序列之重鏈可變區、包含序列編號27所表示之胺基酸序列之胜肽連接子、及包含序列編號6所表示之胺基酸序列之輕鏈可變區之單鏈抗體的核酸；
(9-4D)編碼依序包括：包含序列編號6所表示之胺基酸序列之輕鏈可變區、包含序列編號27所表示之胺基酸序列之胜肽連接子、及包含序列編號5所表示之胺基酸序列之重鏈可變區之單鏈抗體的核酸；
作為編碼上述CAR中所包含之細胞膜貫通區之多胜肽之核酸，可列舉編碼包含與序列編號8所表示之胺基酸序列具有85%以上、較佳為90%以上、更佳為95%以上、進而較佳為98%以上之序列一致性之胺基酸序列之人類CD8細胞膜貫通區之多胜肽的核酸。又，作為編碼上述CAR中所包含之免疫活性細胞活化訊息傳遞區中之CD28、4-1BB及CD3ζ之細胞內區域之多胜肽的核酸，可列舉：編碼包含與序列編號8所表示之人類CD28之細胞內區域之胺基酸序列具有85%以上、較佳為90%以上、更佳為95%以上、進而較佳為98%以上之序列一致性之胺基酸序列，且具有與序列編號8所表示之胺基酸序列同等之作用之多胜肽的核酸；編碼包含與序列編號9所表示之人類4-1BB之細胞內區域之胺基酸序列具有85%以上、較佳為90%以上、更佳為95%以上、進而較佳為98%以上之序列一致性之胺基酸序列，且具有與序列編號9所表示之胺基酸序列同等之作用之多胜肽的核酸；編碼包含與序列編號10所表示之人類CD3ζ之細胞內區域之胺基酸序列具有85%以上、較佳為90%以上、更佳為95%以上、進而較佳為98%以上之序列一致性之胺基酸序列，且具有與序列編號10所表示之胺基酸序列同等之作用之多胜肽的核酸；或該等之組合，較佳為可列舉：自上游(5'末端側)起依序編碼序列編號8所表示之人類CD28之細胞內區域之多胜肽之細胞內區域之多胜肽的核酸；編碼序列編號9所表示之人類4-1BB之細胞內區域之多胜肽的核酸；編碼序列編號10所表示之人類CD3ζ之細胞內區域之多胜肽的核酸。
作為編碼IL-7之核酸，可列舉編碼包含與序列編號28所表示之胺基酸序列具有85%以上、較佳為90%以上、更佳為95%以上、進而較佳為98%以上之序列一致性之胺基酸序列，且具有與序列編號28所表示之胺基酸序列同等之作用之多胜肽的核酸，具體而言，可列舉包含序列編號30所表示之鹼基序列之核酸，只要具有IL-7中之細胞增殖率或細胞存活率之提高作用，則亦可為與包含序列編號30所表示之鹼基序列之核酸具有80%以上、較佳為85%以上、更佳為90%以上、進而較佳為95%以上、最佳為98%以上之序列一致性之核酸。作為編碼CCL19之核酸，可列舉編碼包含與序列編號29所表示之胺基酸序列具有85%以上、較佳為90%以上、更佳為95%以上、進而較佳為98%以上之序列一致性之胺基酸序列，且具有與序列編號29所表示之胺基酸序列同等之作用之多胜肽的核酸，具體而言，可列舉包含序列編號31所表示之鹼基序列之核酸，只要具有細胞於CCL19中之移動作用，則亦可使用與包含序列編號31所表示之鹼基序列之核酸具有80%以上、較佳為85%以上、更佳為90%以上、進而較佳為95%以上、最佳為98%以上之序列一致性之核酸。
(自殺基因)
又，於本發明之表現載體中，亦可包含編碼自殺基因之核酸。自殺基因意指具有藉由進行表現而直接或二次誘導具有細胞毒性之物質，使自體細胞死亡之功能之基因。藉由使本發明之表現載體包含編碼自殺基因之核酸，可根據癌症之治療經過，例如於腫瘤消失之情形時，投予活化自殺基因之功能之藥劑，控制生物體內之免疫活性細胞。又，IL-7或CCL19係與其他細胞激素不同，作為副作用引起細胞激素釋放症候群或基因導入細胞之腫瘤化之可能性較低。然而，藉由導入有本發明之表現載體之免疫活性細胞之功能提高，於攻擊靶之癌組織時，可能會有釋放之細胞激素等意外地影響周邊組織之情況。於此種情形時，藉由使本發明之表現載體包含編碼自殺基因之核酸，可確實地降低成為細胞激素釋放症候群之風險。
作為自殺基因，可列舉以下之文獻中所記載之編碼單純疱疹病毒之胸苷激酶(HSV-TK)或誘導性半胱天冬酶9(inducible caspase 9)的基因等，作為活化此種基因之功能之藥劑，針對前者可列舉更昔洛韋，針對後者可列舉作為二聚物誘導化合物(chemical induction of dimerization：CID)之AP1903。
(核酸序列資訊之獲取及核酸之製作)
本發明之表現載體中所包含之上述各核酸可為源自天然之核酸，亦可為人工合成之核酸，可根據導入本發明之表現載體之細胞之種類適當選擇，序列資訊可檢索公知之文獻或NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/)等資料庫而適當獲取。
上述各核酸可利用基於編碼各者之核酸之鹼基序列之資訊進行化學合成之方法、或藉由PCR(polymerase chain reaction，聚合酶鏈反應)進行擴增之方法等公知之技術製作。再者，用以編碼胺基酸之選擇之密碼子可進行修飾以使目標宿主細胞中之核酸之表現最佳化。
(各核酸之配置)
本發明之表現載體中之(a)含有編碼特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子之核酸、編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸的表現載體可任一核酸配置於任一上游或下游。具體而言，若以含有編碼抗人類間皮素CAR之核酸作為編碼特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子之核酸的情形為例，則自上游(5'末端側)起依序可為編碼抗人類間皮素CAR之核酸、編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸，可為編碼抗人類間皮素CAR之核酸、編碼CCL19之核酸、及編碼IL-7之核酸，可為編碼IL-7之核酸、編碼CCL19之核酸、及編碼抗人類間皮素CAR之核酸，可為編碼IL-7之核酸、編碼抗間皮素CAR之核酸、及編碼CCL19之核酸，可為編碼CCL19之核酸、編碼抗間皮素CAR之核酸、及編碼IL-7之核酸，亦可為編碼CCL19之核酸、編碼IL-7之核酸、及編碼抗人類間皮素CAR之核酸。
於本發明之載體中之(b-2)、(f-2)及(g-2)中之含有編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸的表現載體中，編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸之配置並無特別限制，編碼CCL19之核酸相對於編碼IL-7之核酸可配置於上游，亦可配置於下游。
於本發明之載體中之(c-1)、(e-1)及(f-1)中之含有編碼特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子之核酸、及編碼IL-7之核酸的表現載體中，編碼特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子之核酸及編碼IL-7之核酸的配置並無特別限制，編碼IL-7之核酸相對於編碼特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子之核酸可配置於上游，亦可配置於下游。
於本發明之載體中之(d-2)、(e-2)及(g-1)中之含有編碼特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子之核酸、及編碼CCL19之核酸的表現載體中，編碼特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子之核酸及編碼CCL19之核酸的配置並無特別限制，編碼CCL19之核酸相對於編碼特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子之核酸可配置於上游，亦可配置於下游。
(轉錄)
再者，編碼特異性辨識間皮素之細胞表面分子之核酸、編碼IL-7之核酸、編碼CCL19之核酸、及編碼自殺基因之核酸可分別藉由另一啟動子轉錄，亦可使用內部核糖體進入部位(IRES：internal ribozyme entry site)或自切斷型2A胜肽，藉由一個啟動子轉錄。
只要於使用內部核糖體進入部位(IRES)或自切斷型2A胜肽，藉由一個啟動子轉錄編碼IL-7之核酸及編碼CCL19之核酸之情形時之上述各核酸之間、或包含上述編碼特異性辨識間皮素之細胞表面分子之核酸之情形時之該核酸與編碼IL-7之核酸及編碼CCL19之核酸之間可表現各核酸，則可包含任意之核酸，較佳為經由編碼自切斷型胜肽(2A胜肽)或IRES之序列、較佳為編碼2A胜肽之序列連結。藉由使用此種序列連結，可高效率地表現各核酸。
2A胜肽係源自病毒之自切斷型胜肽，具有序列編號32所表示之胺基酸序列中之G-P間(距C末端1個殘基之位置)經內質網切斷之特徵(Szymczak et al., Expert Opin. Biol. Ther. 5(5):627-638(2005))。因此，經由2A胜肽殖入至其前後之核酸係於細胞內相互獨立地表現。
作為上述2A胜肽，較佳為源自小核糖核酸病毒、輪狀病毒、昆蟲病毒、口蹄疫病毒或錐體蟲病毒之2A胜肽，更佳為序列編號33所表示之源自小核糖核酸病毒之2A胜肽(F2A)。
(載體之種類)
作為本發明之表現載體中之載體之種類，可為直鏈狀，亦可為環狀，可為質體等非病毒載體，可為病毒載體，亦可為藉由轉位子之載體。又，於此種載體中，亦可含有啟動子或終止子等控制序列、或藥劑耐性基因、報導基因等之選擇標記序列。藉由於啟動子序列之下游可作動地配置編碼IL-7之核酸及編碼CCL19之核酸，可高效率地轉錄各核酸。
作為上述啟動子，可列舉：反轉錄病毒之LTR啟動子、SV40初始啟動子、巨細胞病毒啟動子、單純疱疹病毒之胸苷激酶啟動子等源自病毒之啟動子、磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動子、Xist啟動子、β-肌動蛋白啟動子、RNA聚合酶II啟動子等源自哺乳類之啟動子。又，亦可使用由四環素誘導之四環素應答型啟動子、由干擾素誘導之Mx1啟動子等。藉由於本發明之表現載體中使用由上述特定之物質誘導之啟動子，例如於使用含有本發明之載體之免疫活性細胞作為用於癌症之治療之醫藥組合物的情形時，可根據癌症之治療經過而控制IL-7及CCL19之表現之誘導。
作為上述病毒載體，可列舉：反轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體，可較佳地列舉反轉錄病毒載體，可更佳地列舉pMSGV載體(Tamada k et al., Clin Cancer Res 18:6436-6445(2002))或pMSCV載體(TAKARA BIO公司製造)。若使用反轉錄病毒載體，則導入基因納入至主體細胞之基因組，故而可長時間且穩定地表現。
關於免疫活性細胞中之本發明之表現載體含有之確認，例如於含有編碼CAR之核酸之情形時，可藉由流式細胞儀、Northern印跡、Southern印跡、RT-PCR等PCR、ELISA、Western印跡調查CAR之表現，於本發明之表現載體中含有標記基因之情形時，可藉由調查插入至該表現載體之標記基因之表現而確認。
(醫藥組合物)
本發明之醫藥組合物只要含有本發明之免疫活性細胞及藥學上容許之添加劑即可，作為上述添加劑，可列舉：生理食鹽水、緩衝生理食鹽水、細胞培養基、葡萄糖、注射用水、甘油、乙醇及該等之組合、穩定劑、助溶劑及界面活性劑、緩衝劑及防腐劑、等張劑、填充劑以及潤滑劑。又，由於上述本發明之醫藥組合物中之免疫活性細胞具備誘導免疫活性細胞之活化之訊息傳遞區，故而本發明之醫藥組合物亦可用作用於癌症之治療之醫藥組合物。於此種用於癌症之治療之醫藥組合物中，可包含記載有用於癌症之治療之使用方法等之隨附文件、標幟、包裝體等。進而，由於上述本發明之醫藥組合物中之免疫活性細胞具有腫瘤之復發抑制效果，故而本發明之醫藥組合物可用作用於抑制腫瘤復發之醫藥組合物。於此種用於抑制腫瘤復發之醫藥組合物中，可包含記載有用於抑制腫瘤復發之使用方法等之隨附文件、標幟、包裝體等。
本發明之醫藥組合物可使用業者已知之方法，投予至必需其之受檢體，作為投予方法，可列舉於靜脈內、腫瘤內、皮內、皮下、肌內、腹腔內、動脈內、髓內、心臟內、關節內、滑液囊內、頭蓋內、脊椎內及蛛網膜下(髓液)之注射。
本發明之醫藥組合物可列舉如下方法：1天4次、3次、2次或1次、隔1天、隔2天、隔3天、隔4天、隔5天、一週1次、隔7天、隔8天、隔9天、一週2次、一月1次或一月2次獨立地分一次或數次投予。
作為本發明之醫藥組合物中之癌症，並無特別限定，較佳為於癌組織中表現間皮素之癌種、或源自表現間皮素之癌細胞之癌種，可列舉：間皮瘤、大腸癌(結腸癌或直腸癌)、胰腺癌、胸腺癌、膽管癌、肺癌(腺癌、鱗狀細胞癌、腺鱗狀細胞癌、未分化癌、大細胞癌、小細胞癌)、皮膚癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、陰道癌、頸癌、子宮癌、肝癌、腎癌、胰腺癌、脾癌、氣管癌、支氣管癌、結腸癌、小腸癌、胃癌、食道癌、膽囊癌、睾丸癌、卵巢癌等癌症；或骨組織、軟骨組織、脂肪組織、肌組織、血管組織及造血組織之癌症，除此以外，亦可列舉：軟骨肉瘤、尤因氏肉瘤、惡性血管內皮細胞瘤、惡性神經鞘瘤、骨肉瘤、軟組織肉瘤等肉瘤；或肝胚細胞瘤、神經管胚細胞瘤、腎胚細胞瘤、神經胚細胞瘤、胰胚細胞瘤、胸膜肺胚細胞瘤、視網膜胚細胞瘤等胚細胞瘤；或胚細胞腫瘤。作為投予量，可投予治療有效量，例如於1次之投予中，作為投予細胞之個數，可列舉：1×104 ～1×1010 個、較佳為1×105 ～1×109 個、更佳為5×106 ～5×108 個。
本發明之醫藥組合物可與其他抗癌劑併用而使用。作為其他抗癌劑，可列舉：環磷醯胺、苯達莫司汀、異環磷醯胺、達卡巴嗪等烷基化藥；噴司他丁、氟達拉濱、克拉屈濱、甲胺喋呤、5-氟尿嘧啶、6-巰嘌呤、依諾他濱等抗代謝藥；利妥昔單抗、西妥昔單抗、曲妥珠單抗等分子靶向藥；伊馬替尼、吉非替尼、埃羅替尼、阿法替尼、達沙替尼、舒尼替尼、曲美替尼等激酶抑制劑；硼替佐米等蛋白酶體抑制劑；環孢素、他克莫司等鈣調磷酸酶抑制藥；艾達黴素、多柔比星、絲裂黴素C等抗癌性抗生素；伊立替康、依託泊苷等植物鹼；順鉑、奧沙利鉑、卡鉑等鉑製劑；他莫昔芬、比卡魯胺等激素療法藥；干擾素、納武單抗、派姆單抗等免疫控制藥。
作為上述「將本發明之醫藥組合物與其他抗癌劑併用而使用」之方法，可列舉如下方法：使用其他抗癌劑進行處理，其後使用本發明之醫藥組合物；同時使用本發明之醫藥組合物與其他抗癌劑；或者使用本發明之醫藥組合物進行處理，其後使用其他抗癌劑。又，於併用本發明之用於治療癌症之醫藥組合物與其他抗癌劑之情形時，藉由進一步提昇癌症之治療效果，並且減少各抗癌劑之投予次數或投予量，可降低由各抗癌劑所引起之副作用。又，於本發明之醫藥組合物中亦可包含上述其他抗癌劑。
(本發明之其他態樣)
作為本發明之另一態樣1，可列舉：1)一種癌症之治療方法，其特徵在於將本發明之免疫活性細胞投予至需要治療癌症之患者；或2)一種本發明之免疫活性細胞，其用於用作醫藥組合物；或3)一種本發明之免疫活性細胞之用途，其用於製備醫藥組合物。
又，作為本發明之另一態樣2，可列舉一種嵌合抗原受體(CAR)，其具備以下之任一單鏈抗體、細胞膜貫通區、及誘導免疫活性細胞之活化之訊息傳遞區；藉由使免疫活性細胞表現該CAR，可利用由人類間皮素所引起之刺激而活化免疫活性細胞。
(1-1)包括：含有包含序列編號13所表示之胺基酸序列之重鏈CDR1、包含序列編號14所表示之胺基酸序列之重鏈CDR2、及包含序列編號15所表示之胺基酸序列之重鏈CDR3之重鏈可變區，以及含有包含序列編號16所表示之胺基酸序列之輕鏈CDR1、包含序列編號17所表示之胺基酸序列之輕鏈CDR2、及包含序列編號18所表示之胺基酸序列之輕鏈CDR3之輕鏈可變區的單鏈抗體；
(2-1)包括：含有包含序列編號13所表示之胺基酸序列之重鏈CDR1、包含序列編號14所表示之胺基酸序列之重鏈CDR2、及包含序列編號15所表示之胺基酸序列之重鏈CDR3之重鏈可變區，以及含有包含序列編號19所表示之胺基酸序列之輕鏈CDR1、包含序列編號17所表示之胺基酸序列之輕鏈CDR2、及包含序列編號18所表示之胺基酸序列之輕鏈CDR3之輕鏈可變區的單鏈抗體；
(3-1)包括：含有包含序列編號20所表示之胺基酸序列之重鏈CDR1、包含序列編號21所表示之胺基酸序列之重鏈CDR2、及包含序列編號22所表示之胺基酸序列之重鏈CDR3之重鏈可變區，以及含有包含序列編號23所表示之胺基酸序列之輕鏈CDR1、包含序列編號24所表示之胺基酸序列之輕鏈CDR2、及包含序列編號25所表示之胺基酸序列之輕鏈CDR3之輕鏈可變區的單鏈抗體；
進而，作為本發明之另一態樣3，可列舉一種套組，其具備本發明之表現載體，且用以製作免疫活性細胞；作為該套組，只要具備本發明之表現載體，則並無特別限制，可包含用以製作本發明之免疫活性細胞之說明書、或用於將本發明之表現載體導入至免疫活性細胞之試劑。
進而，作為本發明之另一態樣4，可列舉一種癌症之復發抑制方法，其將同時表現細胞表面分子(較佳為具備特異性辨識人類間皮素之單鏈抗體之CAR)、IL-7及CCL19之免疫活性細胞投予至對象。
以下，藉由實施例更具體地說明本發明，但本發明之技術範圍並不限定於該等例示。
[實施例1]抗人類間皮素CAR之製作
(抗人類間皮素CAR之scFv序列及DNA片段之合成)
為了比較VL及VH之序列、順序、及適當之訊息胜肽之種類，設計圖1所示之9種抗人類間皮素scFv之序列。
VH07(15)VL07包含序列編號1所表示之重鏈可變區之胺基酸序列、序列編號26所表示之胜肽連接子之胺基酸序列、及序列編號2所表示之輕鏈可變區之胺基酸序列。
VH36(15)VL36包含序列編號3所表示之重鏈可變區之胺基酸序列、序列編號26所表示之胜肽連接子之胺基酸序列、及序列編號4所表示之輕鏈可變區之胺基酸序列。
VL07(15)VH07包含序列編號2所表示之輕鏈可變區之胺基酸序列、序列編號26所表示之胜肽連接子之胺基酸序列、及序列編號1所表示之重鏈可變區之胺基酸序列。
VH07(25)VL07包含序列編號1所表示之重鏈可變區之胺基酸序列、序列編號27所表示之胜肽連接子之胺基酸序列、及序列編號2所表示之輕鏈可變區之胺基酸序列。
VL07(25)VH07包含序列編號2所表示之輕鏈可變區之胺基酸序列、序列編號27所表示之胜肽連接子之胺基酸序列、及序列編號1所表示之重鏈可變區之胺基酸序列。
VHMO(15)VLMO包含序列編號5所表示之重鏈可變區之胺基酸序列、序列編號26所表示之胜肽連接子之胺基酸序列、及序列編號6所表示之輕鏈可變區之胺基酸序列。
VLMO(15)VHMO包含序列編號6所表示之輕鏈可變區之胺基酸序列、序列編號26所表示之胜肽連接子之胺基酸序列、及序列編號5所表示之重鏈可變區之胺基酸序列。
VHMO(25)VLMO包含序列編號5所表示之重鏈可變區之胺基酸序列、序列編號27所表示之胜肽連接子之胺基酸序列、及序列編號6所表示之輕鏈可變區之胺基酸序列。
VLMO(25)VHMO包含序列編號6所表示之輕鏈可變區之胺基酸序列、序列編號27所表示之胜肽連接子之胺基酸序列、及序列編號5所表示之重鏈可變區之胺基酸序列。再者，序列編號1與序列編號3所表示之胺基酸序列係如下方面不同：序列編號1中之第127個為甘胺酸(G)，相對於此，於序列編號3所表示之胺基酸序列中為白胺酸(L)。又，序列編號2與序列編號4所表示之胺基酸序列係如下方面不同：序列編號2中之第33個酪胺酸(Y)於序列編號4所表示之胺基酸序列中缺失。
其次，分別合成編碼上述各抗人類間皮素scFv之胺基酸序列之DNA片段。
(表現IL-7/CCL19及HSV-TK之抗人類間皮素IL-7/CCL19 CAR表現載體、及不表現IL-7/CCL19之常規(Conv.)抗人類間皮素CAR表現載體之製作)
於CAR-T細胞療法中，有因對靶抗原之強力之免疫應答而發生細胞激素釋放症候群等全身性之副作用的情況。為了應對該問題，製作導入源自疱疹病毒之胸苷激酶基因HSV-TK作為自殺基因之CAR構建物。若將該構建物基因導入至T細胞，使表現CAR之T細胞表現HSV-TK，則藉由添加作為巨細胞病毒治療藥之更昔洛韋，CAR-T細胞誘導細胞凋亡而死亡，故而藉由投予更昔洛韋，可控制體內之CAR-T細胞。
依據上述專利文獻2中所記載之方法，首先，製作自N末端側起依序具備抗人類間皮素scFv、人類CD8膜貫通區及人類CD28-4-1BB-CD3ζ細胞內訊息傳遞區之第3代CAR構建物。於該構建物之C末端加入作為2A胜肽之F2A，進而，於其下游加入人類IL-7-F2A-人類CCL19-F2A-HSV-TK。將所獲得之依序具備scFv、人類CD8膜貫通區、人類CD28-4-1BB-CD3ζ細胞內訊息傳遞區、人類IL-7、人類CCL19、HSV-TK之構建物插入至pMSGV1反轉錄病毒表現載體(Tamada k et al., Clin Cancer Res 18:6436-6445(2012))而製作表現抗人類間皮素scFv、人類CD8膜貫通區、人類CD28-4-1BB-CD3ζ細胞內訊息傳遞區、人類IL-7、人類CCL19、及HSV-TK之pMSGV載體。其次，以藉由上述「抗人類間皮素CAR之scFv序列及DNA片段之合成」欄中所記載之方法所合成之各抗人類間皮素scFv DNA片段，藉由限制酶(NcoI及NotI)處理及結紮而置換上述pMSGV載體內之抗人類間皮素scFv區，製作各「表現IL-7/CCL19之抗人類間皮素CAR載體」。再者，pMSGV1載體係於scFv之N末端側具備源自免疫球蛋白G之訊息胜肽T(序列編號11)，但關於以VH07(15)VL07 DNA片段置換上述scFv區者，亦製作進而作為訊息胜肽，將上述序列編號11所表示之訊息胜肽T置換為序列編號12所表示之訊息胜肽P者。進而，作為無IL-7及CCL19之對照，使用HSV-TK代替上述人類IL-7-F2A-人類CCL19-F2A-HSV-TK，除此以外，藉由與上述相同之方法製作「常規抗人類間皮素CAR載體」。
(導入有表現IL-7/CCL19之抗人類間皮素CAR載體或常規抗人類間皮素CAR載體之反轉錄病毒之製作)
為了於T細胞導入基因，製作反轉錄病毒。使用脂染胺3000(Life Technologies公司製造)，將上述各表現IL-7/CCL19之抗人類間皮素CAR載體或常規抗人類間皮素CAR載體及p-Ampho質體(TAKARA BIO公司製造)轉染至GP2-293包裝細胞株(TAKARA BIO公司製造)，藉此製作導入有表現IL-7/CCL19之抗人類間皮素CAR載體或常規抗人類間皮素CAR載體之反轉錄病毒。於自轉染起48小時後回收含有上述反轉錄病毒之上清液。
作為上述GP2-293細胞之培養液，使用加入有10% FCS、1%青黴素-鏈黴素(Penicillin-Streptmycin)(和光純藥公司製造)之DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium，達爾伯克改良伊格爾培養基)。又，作為下述實施例中所使用之T細胞之培養液，使用包含2.0%人類AB型血清(Sigma-Aldrich公司製造)、1%青黴素-鏈黴素(和光純藥公司製造)、2.5 μg/ml之兩性黴素B(Bristol-Myers Squibb公司製造)之GT-T551。
(T細胞之轉導)
將自健康人供體之血液採集之2×106 個末梢血液單細胞於將抗CD3單株抗體(5 μg/ml)及Retronectin(註冊商標：TAKARA BIO公司製造，25 μg/ml)固相化以進行T細胞之活化之平板上，與IL-2(Peprotech公司製造)一起於37℃、5%CO2 培養箱中培養3天。於培養開始後第2天，於預先經25 μg/ml之Retronectin(TAKARA BIO公司製造)塗佈之表面未處理24孔板每孔添加上述所製作之含有導入有表現IL-7/CCL19之抗人類間皮素CAR載體或常規抗人類間皮素CAR載體之反轉錄病毒之上清液500 μl，藉由2000 g、2小時之離心而製作反轉錄病毒預載板。製作共計2片平板，離心結束後藉由1.5% BSA/PBS進行清洗，於使用之前於4℃下保存。於培養第3天，自上述平板回收活化之細胞，調整為細胞懸浮液(1×105 cells/ml)。將該細胞懸浮液添加於反轉錄病毒預載板每孔1 ml，於IL-2之存在下於37℃、5% CO2 培養箱中培養24小時，進行第1次之反轉錄病毒感染。次日(培養第4天)，將各孔之細胞溶液轉移至保存之第2片之病毒預載板，以500 g離心1分鐘後，於37℃下培養4小時，進行第2次之感染。於37℃下培養4小時後，將各孔之細胞懸浮液1 ml轉移至新12孔細胞培養板，藉由含有IL-2之新培養液(GT-T551)稀釋至4倍，於37℃、5% CO2 培養箱中進行培養。培養至自末梢血液單細胞之培養開始日起計數第7天，獲得作為導入有表現IL-7/CCL19之抗人類間皮素CAR載體之T細胞之「表現抗人類間皮素CAR-IL-7/CCL19之T細胞」、或作為導入有常規抗人類間皮素CAR載體之T細胞之「表現抗人類間皮素CAR之T細胞」。於表現抗人類間皮素CAR-IL-7/CCL19之T細胞中含有編碼外來之抗人類間皮素CAR之核酸、編碼外來之IL-7之核酸、及編碼外來之CCL19之核酸。於表現抗人類間皮素CAR之T細胞中含有編碼抗人類間皮素CAR之核酸，不含有編碼外來之IL-7之核酸、及編碼外來之CCL19之核酸。又，同時，作為CAR陰性細胞對照，製作藉由相同之方法活化自同一健康人供體獲得之末梢血液單細胞但非感染反轉錄病毒之「非表現CAR、IL-7、及CCL19之T細胞」(非基因導入細胞：Non-infection)。
此處，如上所述，為了於T細胞中導入編碼抗人類間皮素CAR之核酸、編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸，使用反轉錄病毒載體。因此，於培養導入有上述各核酸之T細胞進行增殖之情形時，亦有於該T細胞之細胞質內包含反轉錄病毒載體者，多數情況下於T細胞中，編碼抗人類間皮素CAR之核酸、編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸殖入至基因組。於在該T細胞中，編碼抗人類間皮素CAR之核酸、編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸殖入至基因組之情形時，自導入有抗人類間皮素CAR、IL-7、及CCL19之外來之重組構建物表現。
[實施例2]藉由流式細胞儀之CAR表現測定
(流式細胞儀分析)
藉由流式細胞儀分析而進行辨識間皮素作為抗原之CAR之表現等級分析。使所製作之表現抗人類間皮素CAR-IL-7/CCL19之T細胞與重組人類間皮素(於C末端包含6-His者)(BioLegend公司製造)、藻紅蛋白(PE)標記抗6-His單株抗體(abcam公司製造)、及別藻藍蛋白(APC)標記抗CD8單株抗體(Affymetrix公司製造)進行反應，進行染色。流式細胞儀使用EC800(索尼公司製造)，資料分析係使用FlowJo software(Tree Star公司製造)。
(結果)
首先，將具有VH07(15)VL07(藉由訊息胜肽T表現)、VH07(15)VL07(藉由訊息胜肽P表現)或VH36(15)VL36作為scFv區之表現抗人類間皮素CAR-IL-7/CCL19之T細胞之流式細胞儀分析結果示於圖2。於圖2中，於各圖表中橫軸表示CAR之表現，縱軸表示CD8之表現。如圖2所示，確認到與非表現CAR、IL-7、及CCL19之T細胞(Non-infection)相比，3種表現抗人類間皮素CAR-IL-7/CCL19之T細胞均CAR之表現較高。
其次，將具有VH07(15)VL07、VL07(15)VH07、VH07(25)VL07、VL07(25)VH07作為scFv區之表現抗人類間皮素CAR-IL-7/CCL19之T細胞之流式細胞儀分析結果示於圖3。於圖3中，於各圖表中橫軸表示CAR之表現，縱軸表示CD8之表現。(a)係非表現CAR、IL-7、及CCL19之T細胞(Non-infection)之結果，(b)～(e)係具有各scFv區之表現抗人類間皮素CAR-IL-7/CCL19之T細胞之結果。又，圖中之數值表示各族群之百分比。如圖3(b)～(e)所示，於表現抗人類間皮素CAR-IL-7/CCL19之T細胞中，確認到CAR之表現。
[實施例3]各腫瘤細胞之間皮素表現
(流式細胞儀分析)
為了確認表現間皮素之腫瘤細胞株，確認各腫瘤細胞株中之間皮素之表現等級。藉由經PE標記之市售之間皮素抗體(Catalog Number FAB32652P：R&D systems公司製造)將惡性間皮瘤之細胞株ACC-MESO-1、Y-MESO8A、NCI-H2052、NCI-H226、MSTO211H、腎癌之細胞株A498染色，藉由流式細胞儀分析而測定各腫瘤細胞中之間皮素之表現。再者，PE標記抗人類間皮素抗體係以3 μg/樣本進行染色。流式細胞儀使用EC800(索尼公司製造)，資料分析係使用FlowJo software(Tree Star公司製造)。
(結果)
將結果示於圖4。於惡性間皮瘤之細胞株ACC-MESO-1、Y-MESO8A、NCI-H2052、NCI-H226、MSTO211H中確認到間皮素之表現。另一方面，於腎癌之細胞株A498中未確認到間皮素之表現。
[實施例4]細胞毒殺性試驗-1
(共培養試驗)
以表現抗人類間皮素CAR-IL-7/CCL19之T細胞(scFv區為VH07(15)VL07或VH07(25)VL07)作為效應子，與間皮素陽性腫瘤細胞株(ACC-MESO-1、NCI-H2052)或間皮素陰性腫瘤細胞株(A498)一起，於培養板上，以成為1：1、1：3、1：5(1：5僅為IFN-γ之測定分析)之方式調整效應子：腫瘤細胞比後，於37℃培養箱中進行共培養。將此種共培養之說明示於圖5。培養液使用包含10%胎牛血清(Fetal calf serum：FCS)、1%青黴素-鏈黴素(和光純藥公司製造)、50 μM之2-ME(Gibco公司製造)及25 mM之HEPES(Sigma-Aldrich公司製造)之RPMI。藉由流式細胞儀測定自共培養開始起2天後殘存之腫瘤細胞株，並且使用市售之IFN-γELISA套組(BioLegend公司製造)測定培養上清液中所產生之IFN-γ。將自共培養開始起2天後殘存之腫瘤細胞株之藉由流式細胞儀之測定結果示於圖6A～6C，將共培養後產生之IFN-γ之測定結果示於圖7A～7C。再者，作為表現抗人類間皮素CAR-IL-7/CCL19之T細胞之對照，使用非表現CAR、IL-7、及CCL19之T細胞(Non infection)。於使用流式細胞儀時，藉由Zombie Yellow(註冊商標：BioLegend公司製造)將死細胞染色加以區分，藉由PE標記抗CD45單株抗體(BioLegend公司製造)將T細胞染色。流式細胞儀使用BD LSRFortessa X-20(BD Biosciences公司製造)，資料分析係使用FlowJo software(Tree Star公司製造)。
(結果)
如圖6A～6C所示，顯示於對照之非表現CAR、IL-7、及CCL19之T細胞(Non-infection)之各者與靶腫瘤細胞之共培養中，任一靶腫瘤細胞均與僅腫瘤之孔(tumor only)相同程度地增殖。另一方面，於表現抗人類間皮素CAR-IL-7/CCL19之T細胞中，於與間皮素陰性靶細胞(A498：圖6C)之共培養中，靶腫瘤細胞係以與僅腫瘤之孔相同之方式增殖，但於與間皮素陽性腫瘤細胞(ACC-MESO-1：圖6A、NCI-H2052：圖6B)之共培養中，將僅間皮素陽性腫瘤細胞之孔和與對照細胞之共培養之孔進行比較，觀察到腫瘤細胞之數量明顯減少。藉此，可確認到表現抗人類間皮素CAR-IL-7/CCL19之T細胞抗原特異性地毒殺腫瘤細胞。
進而，如圖7A～C所示，於使用共培養後之上清液之IFN-γ之ELISA分析中，亦僅於表現抗人類間皮素CAR-IL-7/CCL19之T細胞與間皮素陽性腫瘤細胞(ACC-MESO-1：圖7A、NCI-H2052：圖7B)之共培養之上清液中確認到明顯之IFN-γ之產生。
[實施例5]細胞毒殺性試驗-2
(共培養試驗)
藉由與實施例4相同之方法，將表現抗人類間皮素CAR-IL-7/CCL19之T細胞(scFv區為VHMO(15)VLMO、VLMO(15)VHMO、VHMO(25)VLMO或VLMO(25)VHMO)、或「非表現CAR、IL-7、及CCL19之T細胞」(非基因導入細胞：Non-infection)與作為間皮素陽性腫瘤細胞株之PAN02腫瘤細胞株或間皮素陰性腫瘤細胞株一起，於培養板上，以成為1：1、1：3之方式調整效應子：腫瘤細胞比後，於37℃培養箱中進行共培養。將自共培養開始起3天後或5天後殘存之白細胞或PAN02腫瘤細胞株之藉由流式細胞儀之測定結果示於圖8，將共培養後產生之IFN-γ之測定結果示於圖9。再者，本實施例及下述實施例5之「腫瘤模型中之治療效果」中所使用之表現抗人類間皮素CAR、IL-7及CCL19之T細胞係使用以插入小鼠IL-7-F2A-小鼠CCL19-F2A-HSV-TK代替人類IL-7-F2A-人類CCL19-F2A-HSV-TK，插入小鼠CD8膜貫通區及小鼠CD28-4-1BB-CD3ζ細胞內訊息傳遞區代替人類CD8膜貫通區及人類CD28-4-1BB-CD3ζ細胞內訊息傳遞區之方式製備之pMSGV1反轉錄病毒表現載體作為pMSGV1反轉錄病毒表現載體，使用源自脾臟及淋巴細胞之小鼠T細胞作為T細胞，依據實施例1之方法製作(以下稱為「表現抗人類間皮素CAR-小鼠IL-7/小鼠CCL19之小鼠T細胞」)。又，本實施例中所使用之「非表現CAR、IL-7、及CCL19之T細胞」(非基因導入細胞：Non-infection)使用源自脾臟及淋巴細胞之小鼠T細胞作為T細胞。
(結果)
如圖8所示，可確認到表現抗人類間皮素CAR-小鼠IL-7/小鼠CCL19之小鼠T細胞毒殺腫瘤細胞。又，如圖9所示，於使用共培養後之上清液之IFN-γ之ELISA中，亦僅於表現抗人類間皮素CAR-小鼠IL-7/小鼠CCL19之小鼠T細胞與PAN02腫瘤細胞株之共培養之上清液中確認到明顯之IFN-γ之產生。
[實施例6]腫瘤模型中之治療效果
(對腫瘤模型小鼠投予表現抗小鼠間皮素CAR-IL-7/CCL19之T細胞)
對7-10週齡之C57BL/6小鼠(自SLC公司購買)皮下接種5×105 個PAN02胰臟癌細胞株。於接種後第7天將抗癌劑環磷醯胺(Cyclophosphamide：CPA，100 mg/kg)投予至腹腔內，於第10天將1×106 個上述實施例5中所製作之表現抗人類間皮素CAR-小鼠IL-7/小鼠CCL19之小鼠T細胞(scFv區為VHMO(15)VLMO、VLMO(15)VHMO、VHMO(25)VLMO或VLMO(25)VHMO))或「表現抗人類間皮素CAR之小鼠T細胞」投予至靜脈內。將VHMO(15)VLMO、VHMO(25)VLMO中之小鼠之存活率之結果示於圖10，將VHMO(15)VLMO、VLMO(15)VHMO、VHMO(25)VLMO或VLMO(25)VHMO)中之腫瘤之體積之結果示於圖11。於圖10中，橫軸係皮下接種PAN02後之天數(將對小鼠皮下接種PAN02之日設為0天)，縱軸為存活率。又，於圖11中，橫軸係皮下接種PAN02後之天數，縱軸係腫瘤體積(腫瘤之長軸×(腫瘤之短軸)2 /2(mm3 ))。「未處理」表示僅投予CPA之群組，「Conv.」表示於投予CPA後投予表現抗人類間皮素CAR之小鼠T細胞之群組，「7×19」表示於投予CPA後投予表現抗人類間皮素CAR-小鼠IL-7/小鼠CCL19之小鼠T細胞之群組。再者，上述「表現抗人類間皮素CAR之小鼠T細胞」係於上述實施例1中所記載之「表現抗人類間皮素CAR之T細胞」之製作方法中，使用插入HSV-TK代替人類IL-7-F2A-人類CCL19-F2A-HSV-TK，插入小鼠CD8膜貫通區及小鼠CD28-4-1BB-CD3ζ細胞內訊息傳遞區代替人類CD8膜貫通區及人類CD28-4-1BB-CD3ζ細胞內訊息傳遞區而製備之pMSGV1反轉錄病毒表現載體作為pMSGV1反轉錄病毒表現載體，使用源自脾臟及淋巴細胞之小鼠T細胞作為T細胞，除此以外，藉由與實施例1相同之方法製作。
(結果)
如圖10所示，可知藉由投予本發明之表現抗人類間皮素CAR-IL-7/CCL19之T細胞，存活率有意義地提高。又，如圖11所示，可知藉由投予本發明之表現抗人類間皮素CAR-IL-7/CCL19之T細胞，明顯抑制腫瘤之增殖。由此可知，於腫瘤模型小鼠中，表現抗人類間皮素CAR-IL-7/CCL19之T細胞表現出優異之抗腫瘤活性。
[實施例7]腫瘤模型中之治療效果-2
可知表現抗人類間皮素CAR-IL-7/CCL19之T細胞表現出優異之抗腫瘤活性，但為了進一步確認長期之抗腫瘤效果及胰臟癌以外之抗腫瘤效果，將人類惡性胸膜間皮瘤細胞株投予至免疫缺乏小鼠而形成腫瘤，其後，調查由表現抗人類間皮素CAR-IL-7/CCL19之T細胞之投予之有無所引起之143天內之腫瘤復發之有無。本實施例中所使用之「ACC-MESO-1-GFP-Luc株之製作方法」、「T細胞之活化方法」如下所述。
(ACC-MESO-1-GFP-Luc株之製作)
對由愛知縣癌中心研究所之關戸好孝教授分讓之作為間皮素陽性腫瘤細胞株之人類惡性間皮瘤細胞株ACC-MESO-1使用慢病毒進行綠色螢光蛋白質-螢光素酶(GFP-Luc)之基因導入。
於第0天於96孔板以1×103 cells/well接種ACC-MESO-1。培養基使用添加10% FBS(fetal calf serum，胎牛血清)之RPMI1640 (Gibco公司製造)。於第1天以MOI(multiplicity of infection，感染複數)100添加發光細胞製作用慢病毒粒子RediFect Red-FLuc-GFP(PerkinElmer公司製造)開始轉導。此時，為了提高基因導入效率，將海地美溴銨(Hexadimethrine Bromide)(Sigma-aldrich公司製造)以成為最終濃度4 μg/mL之方式添加至培養基中。於添加病毒24小時後(第2天)去除包含病毒之培養基而進行培養基之更換。繼續培養後，藉由SH800(SONY公司製造)僅分選表現GFP之細胞，獲得表現GFP之ACC-MESO-1、即「ACC-MESO-1-GFP-Luc」。
(表現抗人類間皮素CAR-IL-7-CCL19之T細胞及表現抗人類間皮素CAR之T細胞之製作)
於本實施例7中，使用藉由實施例1所獲得之表現IL-7/CCL19之抗人類間皮素CAR載體(scFv區經VH07(15)VL07 DNA片段置換：訊息胜肽為序列編號11所表示之訊息胜肽T)或常規抗人類間皮素CAR載體(scFv區經VH07(15)VL07 DNA片段置換：訊息胜肽為序列編號11所表示之訊息胜肽T)。
(T細胞之活化)
於第0天，於使Retronectin 25 μL/mL(TAKARA BIO公司製造)及抗人類CD3單株抗體5 μg/mL(invitrogen公司製造，5 μg/mL)固相化之細胞培養用6孔板，將自健康人供體採集之2×106 個末梢血液單細胞與IL-2(Peprotech公司製造)一起於37℃、5%CO2 培養箱中開始培養。培養液使用於OpTmizer CTS(Gibco公司製造)中加入L-麩醯胺2 mM(Gibco公司製造)、1%青黴素-鏈黴素(和光純藥工業公司製造)及兩性黴素2.5 μg/mL(Bristol-Myers Squibb公司製造)而成者。培養3天，於第3天於顯微鏡下確認到T細胞活化而發生形態變化，獲得活化T細胞。
(腫瘤之復發觀察)
首先，於第0天對8週齡之雌NSG免疫缺乏小鼠以2×106 cells/mouse胸腔內投予上述ACC-MESO-1-GFP-Luc。於第1天使用體內成像系統(in vivo imaging system：IVIS)確認向胸腔內之腫瘤移植。於第1天，將藉由實施例1之方法製作後冷凍之表現抗人類間皮素CAR之T細胞、表現抗人類間皮素CAR-IL-7-CCL19之T細胞(scFv區為VH07(15)VL07)、及藉由上述方法活化之T細胞解凍。由於上述表現抗人類間皮素CAR之T細胞及上述表現抗人類間皮素CAR-IL-7-CCL19之T細胞之CAR表現率分別為49.6%、32.5%，故而於表現抗人類間皮素CAR之T細胞加入上述活化T細胞而合計兩者之CAR表現率後，準備投予1×105 cells之上述表現抗人類間皮素CAR之T細胞之群(N＝5)、投予1×105 cells之上述表現抗人類間皮素CAR-IL-7-CCL19之T細胞之群(N＝5)。表現抗人類間皮素CAR之T細胞及表現抗人類間皮素CAR-IL-7-CCL19之T細胞之投予係自尾靜脈藉由靜脈內投予而進行。進而，於第3天以後，進行使用IVIS之腫瘤螢光強度之測定(發光量：Total Flux(photons/sec)。將結果示於圖12A、B。又，將對上述結果中之自投予起之天數與小鼠之存活率之關係進行圖表化而成者示於圖13，將對自投予起之天數與合計之螢光量(photons/second)之關係進行圖表化而成者示於圖14。於圖12A、B、圖13及圖14中，以「7×19 CAR-T」表示投予表現抗人類間皮素CAR-IL-7-CCL19之T細胞者，以「Conventional CAR-T」表示投予表現抗人類間皮素CAR之T細胞者。再者，於本實施例7中，由於使用內源性T細胞缺損之NSG免疫缺乏小鼠作為受體，故而排除受體之內源性T細胞之影響，評價投予之表現抗人類間皮素CAR-IL-7-CCL19之T細胞本身之效果。
如圖12A、B、圖13及圖14所示，於第21天，7×19 CAR-T、Conventional CAR-T均幾乎未觀察到腫瘤螢光強度。於7×19 CAR-T中，其後，於第143天之前未觀察到腫瘤螢光，確認到完全抑制復發。另一方面，於Conventional CAR-T中，自大致第45天起開始觀察到腫瘤螢光，於第115天腫瘤螢光強度提高，於第129天1隻死亡，於第143天剩餘之4隻亦死亡。因此，可知藉由投予表現CAR-IL-7-CCL19之T細胞，不僅具有對胰臟癌之細胞毒殺活性，亦具有對人類惡性胸膜間皮瘤等表現人類間皮素之癌細胞之細胞毒殺活性，且具有長期之抗腫瘤效果。
本申請案係以2017年12月24日提出申請之日本專利特願2017-247109號作為基礎，其內容全部包含於本說明書中。
圖1係表示實施例1中所製作之9種抗人類間皮素scFv之配置(a)及胺基酸序列(b)之圖。
圖2係表示於實施例2中調查表現抗人類間皮素CAR-IL-7/CCL19之T細胞中之CAR之表現之結果的圖。(a)係非表現CAR、IL-7、及CCL19之T細胞(Non-infection)之結果，(b)～(d)分別為具有VH07(15)VL07(訊息胜肽T)、VH07(15)VL07(訊息胜肽P)、VH36(15)VL36作為scFv區之表現抗人類間皮素CAR-IL-7/CCL19之T細胞之結果。
圖3係表示於實施例2中調查表現抗人類間皮素CAR-IL-7/CCL19之T細胞中之CAR之表現之結果的圖。(a)係非表現CAR、IL-7、及CCL19之T細胞(Non-infection)之結果，(b)～(e)分別為具有VH07(15)VL07、VL07(15)VH07、VH07(25)VL07、VL07(25)VH07作為scFv區之表現抗人類間皮素CAR-IL-7/CCL19之T細胞之結果。
圖4係於實施例3中藉由流式細胞儀確認腫瘤細胞株中之間皮素之表現等級之圖。
圖5係實施例4中表現抗人類間皮素CAR-IL-7/CCL19之T細胞與間皮素陽性腫瘤細胞株或間皮素陰性腫瘤細胞株之共培養試驗之說明圖。
圖6A係表示實施例4中殘存之腫瘤細胞株ACC-MESO-1之藉由流式細胞儀之測定結果的圖。
圖6B係表示實施例4中殘存之腫瘤細胞株NCI-H2052之藉由流式細胞儀之測定結果的圖。
圖6C係表示實施例4中殘存之腫瘤細胞株A498之藉由流式細胞儀之測定結果的圖。
圖7A係表示實施例4中表現抗人類間皮素CAR-IL-7/CCL19之T細胞與間皮素陽性腫瘤細胞株ACC-MESO-1之共培養後產生之IFN-γ之測定結果的圖。
圖7B係表示實施例4中表現抗人類間皮素CAR-IL-7/CCL19之T細胞與間皮素陽性腫瘤細胞株NCI-H2052之共培養後產生之IFN-γ之測定結果的圖。
圖7C係表示實施例4中表現抗人類間皮素CAR-IL-7/CCL19之T細胞與間皮素陰性腫瘤細胞株A498之共培養後產生之IFN-γ之測定結果的圖。
圖8係表示實施例5中殘存之白細胞(Lymphocyte number)或PAN02腫瘤細胞株之藉由流式細胞儀之測定結果的圖。
圖9係表示實施例5中表現抗間皮素CAR-IL-7/CCL19之T細胞與PAN02腫瘤細胞株之共培養後產生之IFN-γ之測定結果的圖。
圖10係表示於實施例6中由對腫瘤模型小鼠投予表現間皮素CAR-小鼠IL-7/小鼠CCL19之小鼠T細胞所帶來之存活率之結果之圖。
圖11係表示於實施例6中由對腫瘤模型小鼠投予表現間皮素CAR-小鼠IL-7/小鼠CCL19之小鼠T細胞所引起之腫瘤之體積之測定結果的圖。
圖12A係表示於實施例7中將投予ACC-MESO-1-GFP-Luc之日設為第1天，以曝光時間30秒對第1、3、7、10、14、21、31、38天之小鼠進行攝影之結果之圖。
圖12B係表示於實施例7中將投予ACC-MESO-1-GFP-Luc之日設為第1天，以曝光時間30秒對第45、59、73、87、101、115、129、143天之小鼠進行攝影之結果之圖。自第129天之左邊起第2個個體由於死亡，故而省略照片。
圖13係表示實施例7中自投予起之天數與小鼠之存活率之關係的圖表。
圖14係表示實施例7中自投予起之天數與合計之螢光量之關係的圖表。

Claims (21)

  1. 一種免疫活性細胞，其表現特異性辨識人類間皮素(Human Mesothelin)之細胞表面分子、介白素7(IL-7)、及趨化因子(C-C基元)配體19(CCL19)。
  2. 如請求項1之免疫活性細胞，其係自生物體分離之免疫活性細胞。
  3. 如請求項1或2之免疫活性細胞，其含有編碼外來之特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子之核酸、編碼外來之IL-7之核酸、及編碼外來之CCL19之核酸。
  4. 如請求項3之免疫活性細胞，其中編碼外來之IL-7之核酸、及編碼外來之CCL19之核酸係編碼外來之人類IL-7之核酸、及編碼外來之人類CCL19之核酸。
  5. 如請求項3或4之免疫活性細胞，其於基因組中殖入有編碼外來之特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子之核酸、編碼外來之IL-7之核酸、及編碼外來之CCL19之核酸。
  6. 如請求項1至5中任一項之免疫活性細胞，其中特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子係具備單鏈抗體、細胞膜貫通區、及誘導免疫活性細胞之活化之訊息傳遞區之嵌合抗原受體(CAR)。
  7. 如請求項6之免疫活性細胞，其中CAR中之單鏈抗體係以下之任一種： (1-1)包括：含有包含序列編號13所表示之胺基酸序列之重鏈CDR1、包含序列編號14所表示之胺基酸序列之重鏈CDR2、及包含序列編號15所表示之胺基酸序列之重鏈CDR3之重鏈可變區，以及含有包含序列編號16所表示之胺基酸序列之輕鏈CDR1、包含序列編號17所表示之胺基酸序列之輕鏈CDR2、及包含序列編號18所表示之胺基酸序列之輕鏈CDR3之輕鏈可變區的單鏈抗體； (2-1)包括：含有包含序列編號13所表示之胺基酸序列之重鏈CDR1、包含序列編號14所表示之胺基酸序列之重鏈CDR2、及包含序列編號15所表示之胺基酸序列之重鏈CDR3之重鏈可變區，以及含有包含序列編號19所表示之胺基酸序列之輕鏈CDR1、包含序列編號17所表示之胺基酸序列之輕鏈CDR2、及包含序列編號18所表示之胺基酸序列之輕鏈CDR3之輕鏈可變區的單鏈抗體； (3-1)包括：含有包含序列編號20所表示之胺基酸序列之重鏈CDR1、包含序列編號21所表示之胺基酸序列之重鏈CDR2、及包含序列編號22所表示之胺基酸序列之重鏈CDR3之重鏈可變區，以及含有包含序列編號23所表示之胺基酸序列之輕鏈CDR1、包含序列編號24所表示之胺基酸序列之輕鏈CDR2、及包含序列編號25所表示之胺基酸序列之輕鏈CDR3之輕鏈可變區的單鏈抗體。
  8. 如請求項6或7之免疫活性細胞，其中CAR中之單鏈抗體係以下之任一種： (1-2)包括：包含與序列編號1所表示之胺基酸序列具有85%以上之序列一致性之胺基酸序列之重鏈可變區、及包含與序列編號2所表示之胺基酸序列具有85%以上之序列一致性之胺基酸序列之輕鏈可變區的單鏈抗體； (2-2)包括：包含與序列編號3所表示之胺基酸序列具有85%以上之序列一致性之胺基酸序列之重鏈可變區、及包含與序列編號4所表示之胺基酸序列具有85%以上之序列一致性之胺基酸序列之輕鏈可變區的單鏈抗體； (3-2)包括：包含與序列編號5所表示之胺基酸序列具有85%以上之序列一致性之胺基酸序列之重鏈可變區、及包含與序列編號6所表示之胺基酸序列具有85%以上之序列一致性之胺基酸序列之輕鏈可變區的單鏈抗體； (4-2)包括：包含與序列編號1所表示之胺基酸序列具有85%以上之序列一致性之胺基酸序列之重鏈可變區、及包含與序列編號4所表示之胺基酸序列具有85%以上之序列一致性之胺基酸序列之輕鏈可變區的單鏈抗體； (5-2)包括：包含與序列編號3所表示之胺基酸序列具有85%以上之序列一致性之胺基酸序列之重鏈可變區、及包含與序列編號2所表示之胺基酸序列具有85%以上之序列一致性之胺基酸序列之輕鏈可變區的單鏈抗體。
  9. 如請求項6至8中任一項之免疫活性細胞，其中CAR中之單鏈抗體係以下之任一種： (1-3)包括：包含序列編號1所表示之胺基酸序列之重鏈可變區、及包含序列編號2所表示之胺基酸序列之輕鏈可變區的單鏈抗體； (2-3)包括：包含序列編號3所表示之胺基酸序列之重鏈可變區、及包含序列編號4所表示之胺基酸序列之輕鏈可變區的單鏈抗體； (3-3)包括：包含序列編號5所表示之胺基酸序列之重鏈可變區、及包含序列編號6所表示之胺基酸序列之輕鏈可變區的單鏈抗體； (4-3)包括：包含序列編號1所表示之胺基酸序列之重鏈可變區、及包含序列編號4所表示之胺基酸序列之輕鏈可變區的單鏈抗體； (5-3)包括：包含序列編號3所表示之胺基酸序列之重鏈可變區、及包含序列編號2所表示之胺基酸序列之輕鏈可變區的單鏈抗體。
  10. 如請求項6至9中任一項之免疫活性細胞，其中CAR中之細胞膜貫通區包含與序列編號7所表示之胺基酸序列具有85%以上之序列一致性之胺基酸序列。
  11. 如請求項6至10中任一項之免疫活性細胞，其中CAR中之誘導免疫活性細胞之活化之訊息傳遞區包含序列編號8、9及10所表示之胺基酸序列。
  12. 如請求項7至11中任一項之免疫活性細胞，其中重鏈可變區與輕鏈可變區經由包含2～30個胺基酸序列之胜肽連接子結合。
  13. 如請求項12之免疫活性細胞，其中胜肽連接子包含序列編號26或序列編號27所表示之胺基酸序列。
  14. 如請求項6至13中任一項之免疫活性細胞，其中CAR中之單鏈抗體係以下之任一種： (1-4)依序包括：包含序列編號1所表示之胺基酸序列之重鏈可變區、包含序列編號26所表示之胺基酸序列之胜肽連接子、及包含序列編號2所表示之胺基酸序列之輕鏈可變區的單鏈抗體； (2-4)依序包括：包含序列編號3所表示之胺基酸序列之重鏈可變區、包含序列編號26所表示之胺基酸序列之胜肽連接子、及包含序列編號4所表示之胺基酸序列之輕鏈可變區的單鏈抗體； (3-4)依序包括：包含序列編號2所表示之胺基酸序列之輕鏈可變區、包含序列編號26所表示之胺基酸序列之胜肽連接子、及包含序列編號1所表示之胺基酸序列之重鏈可變區的單鏈抗體； (4-4)依序包括：包含序列編號1所表示之胺基酸序列之重鏈可變區、包含序列編號27所表示之胺基酸序列之胜肽連接子、及包含序列編號2所表示之胺基酸序列之輕鏈可變區的單鏈抗體； (5-4)依序包括：包含序列編號2所表示之胺基酸序列之輕鏈可變區、包含序列編號27所表示之胺基酸序列之胜肽連接子、及包含序列編號1所表示之胺基酸序列之重鏈可變區的單鏈抗體； (6-4)依序包括：包含序列編號5所表示之胺基酸序列之重鏈可變區、包含序列編號26所表示之胺基酸序列之胜肽連接子、及包含序列編號6所表示之胺基酸序列之輕鏈可變區的單鏈抗體； (7-4)依序包括：包含序列編號6所表示之胺基酸序列之輕鏈可變區、包含序列編號26所表示之胺基酸序列之胜肽連接子、及包含序列編號5所表示之胺基酸序列之重鏈可變區的單鏈抗體； (8-4)依序包括：包含序列編號5所表示之胺基酸序列之重鏈可變區、包含序列編號27所表示之胺基酸序列之胜肽連接子、及包含序列編號6所表示之胺基酸序列之輕鏈可變區的單鏈抗體； (9-4)依序包括：包含序列編號6所表示之胺基酸序列之輕鏈可變區、包含序列編號27所表示之胺基酸序列之胜肽連接子、及包含序列編號5所表示之胺基酸序列之重鏈可變區的單鏈抗體。
  15. 如請求項6至14中任一項之免疫活性細胞，其中CAR中之誘導免疫活性細胞之活化之訊息傳遞區包含CD28之細胞內區域之多胜肽、4-1BB之細胞內區域之多胜肽、及CD3ζ之細胞內區域之多胜肽。
  16. 如請求項1至15中任一項之免疫活性細胞，其中免疫活性細胞為T細胞。
  17. 如請求項1至16中任一項之免疫活性細胞，其中免疫活性細胞係源自人類或自人類分離之T細胞。
  18. 一種醫藥組合物，其含有如請求項1至17中任一項之免疫活性細胞、及藥學上容許之添加劑。
  19. 如請求項18之醫藥組合物，其係用於癌症之治療。
  20. 一種表現載體，其含有編碼特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子之核酸、編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸。
  21. 一種表現特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子、IL-7、及CCL19之免疫活性細胞之製作方法，其特徵在於將編碼特異性辨識人類間皮素之細胞表面分子之核酸、編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸導入至免疫活性細胞。
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