KR20230017358A - 면역 기능 제어 인자를 발현하는 면역 담당 세포 및 발현 벡터 - Google Patents

면역 기능 제어 인자를 발현하는 면역 담당 세포 및 발현 벡터 Download PDF

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Abstract

본 발명은 면역 담당 세포에서 면역 담당 세포의 면역 기능 제어 인자를 발현하여, 증식능, 생존능 및 T세포의 집적능을 겸비하는 면역 담당 세포나, 이와 같은 면역 담당 세포를 제작하기 위한 면역 기능 제어 인자 발현 벡터를 제공하는 것을 과제로 한다. 암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자, 인터루킨 7(IL-7) 및 CCL19를 발현하는 면역 담당 세포를 제작한다. 암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자는 암 항원을 특이적으로 인식하는 T세포 수용체이거나, 면역 담당 세포가 T세포인 것이 바람직하다.

Description

면역 기능 제어 인자를 발현하는 면역 담당 세포 및 발현 벡터{IMMUNOCOMPETENT CELL AND EXPRESSION VECTOR EXPRESSING REGULATORY FACTORS OF IMMUNE FUNCTION}
본 발명은 암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자, 인터루킨 7(IL-7) 및 CCL19를 발현하는 면역 담당 세포나, 이와 같은 면역 담당 세포를 함유하는 항암제나, 이와 같은 면역 담당 세포를 제작하기 위한 발현 벡터에 관한 것이다.
암은 전 세계에서 많은 이환자(罹患者)가 있는 질환으로, 일반적으로 화학 요법, 방사선 요법 또는 외과 요법이 널리 수행되고 있다. 그러나, 부작용이 발생하거나, 일부 기능을 잃거나, 전이를 치료하기 어려운 등 다양한 문제가 있었다.
이에, 보다 환자의 QOL을 높게 유지하기 위해, 최근 면역 요법의 개발이 진행되고 있다. 이 면역 요법에서, 면역 세포 요법은 환자로부터 면역 담당 세포를 채취하고, 이와 같은 면역 담당 세포의 면역 기능을 높이도록 처치하고 증폭하여, 다시 환자에게 이입하는 요법이다. 구체적으로는, 환자로부터 T세포를 채취하고, 이와 같은 T세포에 CAR을 코딩하는 유전자를 도입하고 증폭하여, 다시 환자에게 이입하는 요법(비특허 문헌 1 참조)이 알려져 있다. 이 요법은 현재 전 세계에서 임상 시험이 진행되고 있으며, 백혈병이나 림프종 등의 조혈기 악성 종양 등에서 유효성을 나타내는 결과가 얻어지고 있다.
또한, T세포 등의 면역 담당 세포의 면역 기능 제어 인자로는 사이토카인, 케모카인, 시그널 제어 단백질 등, 적어도 수백 종류의 인자가 알려져 있다. 그 중에서 인터루킨 7(IL-7)은 T세포의 생존에 필수적인 사이토카인이며, 골수, 흉선, 림프 기관·조직의 스트로마(stroma) 세포 등의 비조혈 세포에 의해 산생(産生)되는 것으로 알려져 있다. 이와 같은 IL-7의 기능을 이용한 T세포로서, IL-7과 IL-7R 알파를 융합한 키메라 사이토카인 수용체를 발현하는 T세포(특허 문헌 1 참조)가 개시되어 있다. 그러나, 이와 같은 T세포에서의 키메라 사이토카인 수용체는, 하나의 융합 단백질로서 도입한 T세포의 막 표면에 한정되어 발현하며, 자기 세포에 대해서만 리간드 비의존적으로 IL-7R 등의 사이토카인 시그널을 전달하는 것 일뿐, 상기 수용체를 도입하지 않은 T세포의 기능을 높일 수는 없었다.
또한, CCL19나 CCL21, IL-7의 발현 저하가 SIRP 알파 변이 마우스의 비장에서의 T세포 영역의 유지 결손의 원인이 된다는 것(비특허 문헌 2 참조)이나, CCL19나 CCL21, IL-7이 2차 림프 조직(비장이나 림프절)에서 T세포의 항상성을 유지하는 기능을 가지고 있다는 것(비특허 문헌 3 참조)이 개시되어 있다. 그러나, 상기 비특허 문헌 2, 3은 2차 림프 조직의 T세포 영역에 항시적으로 존재하는 비활성화 T세포에 대한 작용을 나타낸 것이며, 항종양 면역 반응과 직접적인 관계성을 나타내는 것은 아니었다. 또한, 상기 비특허 문헌 2, 3에서의 CCL19나 CCL21, IL-7 발현 세포는 T세포가 아니라 2차 림프 조직에 존재하는 세망내피계의 세포였다.
한편, T세포 수용체(T cell receptor: 이하 'TCR'이라고도 함)는 T세포의 세포막 위에 발현하고 있는 항원 수용체 분자이다. 알파사슬과 베타사슬, 또는 감마사슬과 델타사슬로 이루어지는 헤테로 이량체로서 존재하고 있으며, 주요 조직 적합 유전자 복합체(MHC) 분자에 결합한 항원 분자를 인식함으로써 T세포를 활성화하는 것으로 알려져 있다.
이와 같은 TCR의 기능을 응용하여, 암세포에 발현하는 종양 항원을 인식할 수 있는 TCR 유전자를 암환자로부터 얻어진 T세포에 도입하고, 증폭 후 다시 환자에게 이입하는 면역 요법의 개발이 진행되고 있다. 구체적으로는, WT1 발현 세포를 특이적으로 인식하는 TCR을 발현하는 세포를 함유하는 수막종 치료용 의약 조성물(특허 문헌 2 참조)이 개시되어 있다.
상기 기술의 일부에는, 조혈기 악성 종양에 대한 항종양 효과를 인정하는 것이 있지만, 고형암에 대해서는 아직 현저한 효과가 나타난 예가 없다. 이는, 이입한 면역 담당 세포의 생체 내에서의 생존 효율이 낮다는, 혹은 이입한 면역 담당 세포에 의해 유도되는 내재성 면역 담당 세포의 활성화나 종양 국부에 대한 집적이 불충분하다는 문제를 생각할 수 있으며, 이들을 해결하는 기술의 개발이 요구되고 있다.
특허 문헌 1: 국제 공개 제2013/123061호 공보 특허 문헌 2: 일본 특허 공개 공보 제2013-116891호
비특허 문헌 1: 나카자와 요조, 신슈(Shinshu) 의학잡지 61(4): 197~203(2013) 비특허 문헌 2: SATO-HASHIMOTO M. et al., J. Immunol., 2011, vol. 187, no. 1,291-7 비특허 문헌 3: SIEGERT S. et al., Front. Immunol., 2012, vol. 3, article 285
종래의 면역 요법에 이용하는 면역 담당 세포에서는, 내재성 면역 담당 세포의 면역 유도 효과나 면역 담당 세포의 증식능, 생존능 또는 T세포의 집적능이 충분히 증강되지 않았다. 이에, 본 발명의 과제는 면역 담당 세포에서 면역 담당 세포의 면역 기능 제어 인자를 발현하여, 증식능, 생존능 및 T세포의 집적능을 겸비한 면역 담당 세포나 이와 같은 면역 담당 세포를 제작하기 위한 면역 기능 제어 인자 발현 벡터를 제공하는 것에 있다.
발명자들은 면역 담당 세포를 이용한 암 면역 요법에서, 보다 우수한 면역 유도 효과나 항종양 활성을 달성하는 것을 목적으로, 면역 기능 제어 인자를 발현하는 세포의 개량을 시도했다. 그 과정에서, 면역 담당 세포의 면역 기능을 제어하는 인자인 사이토카인, 케모카인, 시그널 제어 단백질에 착안하여, 상기 면역 담당 세포의 면역 기능을 제어하는 인자를 발현하는 벡터를 구축했다. 이와 같은 발현 벡터를 면역 담당 세포에 도입한 결과, 종래의 면역 담당 세포보다 우수한 면역 유도 효과, 증식능, 생존능 및 T세포의 집적능을 갖는 면역 담당 세포를 제작할 수 있다는 것을 발견하여, 본 발명을 완성했다.
즉, 본 발명은 이하의 (1)~(9)에 개시되는 바와 같은 것이다.
(1) 암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자, 인터루킨 7(IL-7) 및 CCL19를 발현하는 면역 담당 세포.
(2) 암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자가 암 항원을 특이적으로 인식하는 T세포 수용체인 것을 특징으로 하는 상기 (1)에 기재된 면역 담당 세포.
(3) 면역 담당 세포가 T세포인 것을 특징으로 하는 상기 (1) 또는 (2)에 기재된 면역 담당 세포.
(4) 암 항원이 WT1, MART-1, NY-ESO-1, MAGE-A1, MAGE-A3, MAGE-A4, Glypican-3, KIF20A, Survivin, AFP-1, gp100, MUC1, PAP-10, PAP-5, TRP2-1, SART-1, VEGFR1, VEGFR2, NEIL3, MPHOSPH1, DEPDC1, FOXM1, CDH3, TTK, TOMM34, URLC10, KOC1, UBE2T, TOPK, ECT2, MESOTHELIN, NKG2D, P1A, GD2 또는 GM2인 것을 특징으로 하는 상기 (1)~(3) 중 어느 하나에 기재된 면역 담당 세포.
(5) 상기 (1)~(4) 중 어느 하나에 기재된 면역 담당 세포를 제작하기 위한 이하의 (a)~(e) 중 어느 하나의 발현 벡터.
(a) 암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자를 코딩하는 핵산, IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 함유하는 발현 벡터:
(b) 이하의 (b-1) 및 (b-2)의 2개의 발현 벡터:
(b-1) 암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자를 코딩하는 핵산을 함유하는 발현 벡터;
(b-2) IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 함유하는 발현 벡터;
(c) 이하의 (c-1) 및 (c-2)의 2개의 발현 벡터:
(c-1) 암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자를 코딩하는 핵산 및 IL-7을 코딩하는 핵산을 함유하는 발현 벡터;
(c-2) CCL19를 코딩하는 핵산을 함유하는 발현 벡터;
(d) 이하의 (d-1) 및 (d-2)의 2개의 발현 벡터:
(d-1) IL-7을 코딩하는 핵산을 함유하는 발현 벡터;
(d-2) 암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자를 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 함유하는 발현 벡터;
(e) 이하의 (e-1), (e-2) 및 (e-3)의 3개의 발현 벡터:
(e-1) 암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자를 코딩하는 핵산을 함유하는 발현 벡터;
(e-2) IL-7을 코딩하는 핵산을 함유하는 발현 벡터;
(e-3) CCL19를 코딩하는 핵산을 함유하는 발현 벡터;
(6) 암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자가 암 항원을 특이적으로 인식하는 T세포 수용체인 것을 특징으로 하는 상기 (5)에 기재된 발현 벡터.
(7) (a)의 발현 벡터에서의, 암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자를 코딩하는 핵산, IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산,
(b-2)의 발현 벡터에서의, IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산,
(c-1)의 발현 벡터에서의, 암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자를 코딩하는 핵산 및 IL-7을 코딩하는 핵산, 또는
(d-2)의 발현 벡터에서의, 암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자를 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산
이 자기 절단형 펩티드를 통해 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 상기 (5) 또는 (6)에 기재된 발현 벡터.
(8) 자살 유전자를 코딩하는 핵산을 함유하는 것을 특징으로 하는 상기 (5)~(7) 중 어느 하나에 기재된 발현 벡터.
(9) 상기 (1)~(4) 중 어느 하나에 기재된 면역 담당 세포와 약학적으로 허용되는 첨가제를 함유하는 항암제.
본 발명의 암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자, IL-7 및 CCL19를 발현하는 면역 담당 세포(이하, 'IL-7×CCL19 발현 면역 담당 세포'라고도 함)를 이용하면, 항종양 활성을 가지며, 세포 표면 분자가 특이적으로 인식하는 항원을 갖는 암 세포에 의해 형성된 종양으로 인한 생존률 저하를 억제하는 것이 가능해진다. 또한, 본 발명의 발현 벡터를 이용하면, 증식능, 생존능 및 T세포 집적능을 겸비한 면역 담당 세포를 제작하는 것이 가능해진다.
도 1은 IL-7×CCL19 발현 벡터의 맵을 나타내는 도면이다.
도 2a는 IL-7/CCL19 발현 T세포의 세포수를 조사한 결과를 나타내는 도면이다.
도 2b는 IL-7/CCL19 발현 T세포의 생존율을 조사한 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 IL-7/CCL19 발현 T세포에 의한 T세포 유주(遊走) 시험의 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 IL-7×CCL19×HSV-TK 발현 벡터의 맵을 나타내는 도면이다.
도 5는 TCR×IL-7×CCL19 발현 벡터의 맵을 나타내는 도면이다.
도 6은 IL-7×CCL19×eGFP 발현 벡터의 맵을 나타내는 도면이다.
도 7은 미처리 마우스, P1A 특이적 TCR/eGFP 발현 T세포를 투여한 마우스, 및 P1A 특이적 TCR/IL-7/CCL19/eGFP 발현 T세포를 투여한 마우스의 생존율을 나타내는 도면이다.
도 8은 미처리 마우스, P1A 특이적 TCR/eGFP 발현 T세포를 투여한 마우스, 및 P1A 특이적 TCR/IL-7/CCL19/eGFP 발현 T세포를 투여한 마우스의 종양 부피를 조사한 결과를 나타내는 도면이다.
본 발명의 IL-7×CCL19 발현 면역 담당 세포는 암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자, 인터루킨 7(IL-7) 및 CCL19를 발현하면 특별히 제한되지 않으며, 또한 IL-15, CCL21, IL-2, IL-4, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18, IP-10, CCL4, Flt3L, Interferon-gamma, MIP-1 alpha, GM-CSF, M-CSF, TGF-beta, TNF-alpha 등의 다른 면역 기능 제어 인자를 발현할 수도 있다.
암 항원이란, 암세포에서 정상 세포보다 높게 발현하는, 혹은 암세포에 특이적으로 발현하는 단백질, 당지질 등의 물질을 의미하며, 이와 같은 암 항원으로는 종양 관련 항원이나 암정소 항원, 혈관 신생 관련 항원, 유전자 변이에 의한 암 신생 항원(네오안티젠)의 에피토프 펩티드를 들 수 있으며, 구체적으로는 WT1, MART-1, NY-ESO-1, MAGE-A1, MAGE-A3, MAGE-A4, Glypican-3, KIF20A, Survivin, AFP-1, gp100, MUC1, PAP-10, PAP-5, TRP2-1, SART-1, VEGFR1, VEGFR2, NEIL3, MPHOSPH1, DEPDC1, FOXM1, CDH3, TTK, TOMM34, URLC10, KOC1, UBE2T, TOPK, ECT2, MESOTHELIN, NKG2D, P1A 등의 단백질이나, GD2, GM2 등의 당지질을 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자로는, 암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 수용체, 인공 수용체, 접착 인자를 들 수 있으며, 암 항원을 특이적으로 인식하는 T세포 수용체나 암 항원을 특이적으로 인식하는 키메라 항원 수용체(constitutive androstane receptor: CAR) 등의, 세포 표면에 발현함으로써 암에 대해 특이적인 식별능을 부여하는 분자를 바람직하게 들 수 있으며, TCR을 보다 바람직하게 들 수 있다. TCR로는, 암 항원을 특이적으로 인식하는 한, 알파사슬 및 베타사슬로 이루어지는 헤테로 이량체(알파·베타 TCR)일 수도 있고, 감마사슬 및 델타사슬로 이루어지는 헤테로 이량체(감마·델타 TCR)일 수도 있다. 아울러, 암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자는 암 항원의 인식이 특이적이라면, 간접적으로 인식하는 것일 수도 있다. 예를 들어, 암 항원을 특이적으로 인식하는 항체 등의 분자를 본 발명의 면역 담당 세포와 동시에 또는 연속하여 대상에 투여하고, 상기 항체 등의 분자를 인식하거나 또는 항체 등의 분자에 표지된 태그를 인식함으로써, 본 발명의 면역 담당 세포는 간접적으로 암 항원을 특이적으로 인식할 수 있다. 항체를 인식하는 경우의 예로는, 세포 표면 분자로서 CD16 등을 들 수 있으며, 항체 등의 분자에 표지하는 태그의 예로는 FITC 등을 들 수 있다.
본 발명의 IL-7×CCL19 발현 면역 담당 세포에서의 면역 담당 세포의 종류로는 면역 반응에 관여하는 세포이면 무방하며, T세포, 자연 살해 세포(NK 세포), B세포 등의 림프구계 세포나, 단구(單球), 대식 세포(macrophage), 수지상 세포(dendritic cell) 등의 항원 제시 세포나, 호중구, 호산구, 호염기구, 비만 세포 등의 과립구를 들 수 있으며, 인간, 개, 고양이, 돼지, 쥐 등의 포유 동물 유래의 T세포, 바람직하게는 인간 유래의 T세포를 들 수 있다. 또한, T세포는 혈액, 골수액 등의 체액이나, 비장, 흉선, 림프절 등의 조직 혹은 원발 종양, 전이성 종양, 암성 복수 등의 암 조직에 침윤하는 면역 세포로부터 분리, 정제하여 얻을 수 있으며, 또한 ES 세포나 iPS 세포로부터 제작된 것을 이용할 수도 있다. 이와 같은 T세포로는 알파·베타 T세포, 감마·델타 T세포, CD8＋ T세포, CD4＋ T세포, 종양 침윤 T세포, 메모리 T세포, 나이브 T세포, NK T세포를 들 수 있다.
본 발명의 IL-7×CCL19 발현 면역 담당 세포의 제작 방법으로는 후술하는 본 발명의 발현 벡터를 면역 담당 세포에 도입하여 제작하는 방법을 들 수 있다. 혹은 수정란, ES 세포 또는 iPS 세포에 대해, 암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자, 인터루킨 7(IL-7) 및/또는 CCL19를 발현하는 벡터를 도입하고 나서 유도하여 제작하는 방법이나, 암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자를 유전자 도입에 의해 발현한 트랜스제닉(transgenic) 포유 동물로부터 분리하여 얻은 면역 담당 세포에, 추가로 필요에 따라 암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자, 인터루킨 7(IL-7) 및/또는 CCL19를 발현하는 벡터를 도입하여 제작하는 방법도 들 수 있다.
후술하는 본 발명의 발현 벡터를 상기 면역 담당 세포에 도입하여 제작하는 방법으로는 특별히 제한되지 않으나, 바이러스 감염법, 칼슘 인산법, 리포펙션(lipofection)법, 미세주입(microinjection)법, 전기천공(electroporation)법 등의 공지의 방법으로 도입하는 방법을 들 수 있으며, 바이러스 감염법으로 도입하는 방법을 바람직하게 들 수 있다.
바이러스 감염법으로는 본 발명의 발현 벡터와 패키징 플라스미드를 GP2-293 세포{타카라바이오사(Takara Bio Inc.) 제품}, Plat-GP 세포{코스모바이오사(Cosmo Bio Company, Limited) 제품}, PG13 세포(ATCC CRL-10686), PA317 세포(ATCC CRL-9078) 등의 패키징 세포에 트랜스펙션(transfection)하여 재조합 바이러스를 제작하고, 이와 같은 재조합 바이러스를 면역 담당 세포에 감염시키는 방법을 들 수 있으며, Retrovirus packagin Kit Eco(타카라바이오사 제품) 등의 시판의 키트를 이용하여 수행할 수도 있다.
또한, 본 발명의 면역 담당 세포는 암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자, IL-7 및 CCL19를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 공지의 유전자 편집 기술을 이용하여 적절한 프로모터의 제어하에서 발현 가능하도록, 세포의 게놈에 편입시킴으로써 제작할 수도 있다. 공지의 유전자 편집 기술로는 징크 핑거 뉴클레아제(Zinc Finger Nuclease), TALEN(Transcription Activator-Like Effector Nuclease), CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat)-Cas 시스템 등의 엔도뉴클레아제를 이용하는 기술을 들 수 있다. 본 발명의 면역 담당 세포에 다른 외래 단백질을 발현시키는 경우도 마찬가지로, 유전자 편집 기술을 이용하여, 다른 외래 단백질을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 적절한 프로모터의 제어하에서 발현 가능하도록, 세포의 게놈에 편입시킬 수도 있다. 적절한 프로모터의 제어하에서 발현 가능하도록 폴리뉴클레오티드를 세포 게놈에 편입시키는 방법으로는, 암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자, IL-7 및 CCL19(또는 다른 단백질)를 코딩하는 염기 서열을 적절한 프로모터의 하류에 기능적으로 연결한 폴리뉴클레오티드(즉, 상기 프로모터의 제어하에서 발현 가능하도록 코딩 서열을 연결한 폴리뉴클레오티드)를 세포 게놈의 비코딩 영역 등에 편입시키는 방법; 암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자, IL-7 및 CCL19(또는 다른 단백질)를 코딩하는 염기 서열을 포함한 폴리뉴클레오티드를 세포 게놈의 내재성 프로모터의 하류에 편입시키는 방법 등을 들 수 있다. 내재성 프로모터로는 예를 들어 TCRα, TCRβ의 프로모터 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 IL-7×CCL19 발현 면역 담당 세포에 후술하는 단순 헤르페스 바이러스의 티미딘키나아제(HSV-TK)나 유도성 카스파제 9(inducible caspase 9)가 발현하도록 할 수도 있다.
본 발명의 IL-7×CCL19 발현 면역 담당 세포는 암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자, IL-7 및 CCL19를 발현하기 때문에, 증식능, 생존능 및 내인성 T세포의 집적능이 높아, 다양한 면역 담당 세포를 이용한 양자 면역 요법에 응용하는 것이 가능하다. 양자 면역 요법의 예로는 수지상 세포 요법, NK 세포 요법, 감마·델타 T세포 요법, 알파·베타 T세포 요법, CTL 요법, TIL 요법 등을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 환자로부터 채취한 면역 담당 세포에 후술하는 본 발명의 발현 벡터를 도입하고 증폭하여 환자에게 투여하는 방법을 들 수 있다. 이하에 구체적인 예를 들지만, 이에 한정하는 것은 아니다. 수지상 세포 요법에서는, 환자로부터 채취한 단구로부터 분화한 수지상 세포에, 수술로 적출한 암 조직 또는 그 용해물(lysate)을 집어 넣고, 환자의 체내에 투여하는 공정을 포함하지만, 본 발명의 발현 벡터를 수지상 세포에 도입하는 공정을 포함할 수도 있다. 여기서, 상기 암 조직이나 그 용해물 대신 암 항원 분자의 에피토프 펩티드를 인공적으로 합성하여 이용할 수도 있다. NK 세포 요법은 환자로부터 채취한 림프구를 IL-2 등의 복수의 자극 물질로 NK 세포를 활성화하여 증식시키고, 환자에게 투여하는 공정을 포함하지만, 본 발명의 벡터를 NK 세포에 도입하는 공정을 포함할 수도 있다. 아울러, 암에 대한 항체 의약을 활성화한 NK 세포와 병용함으로써 암세포를 효율적으로 공격하는 효과를 기대할 수 있다. 감마·델타 T세포 요법은 환자로부터 채취한 림프구를 IL-2나 졸레드론산을 이용해 배양 자극하여 감마·델타 T세포를 증식시키고, 환자에게 투여하는 공정을 포함하지만, 본 발명의 발현 벡터를 감마·델타 T세포에 도입하는 공정을 포함할 수도 있다. 알파·베타 T세포 요법은 환자로부터 채집한 림프구를 항CD3 항체나 IL-2로 배양하여 활성화한 알파·베타 T세포를 환자에게 투여하는 공정을 포함하지만, 본 발명의 발현 벡터를 알파·베타 T세포에 도입하는 공정을 포함할 수도 있다. CTL 요법은 환자로부터 채집한 림프구를 환자로부터 채취한 암세포로 자극하고, 항CD3 항체나 IL-2를 첨가하여 배양하여, 암세포에 특이적인 CTL을 증식시켜 환자에게 투여하는 공정을 포함하지만, 본 발명의 발현 벡터를 CTL에 도입하는 공정을 포함할 수도 있다. 또한, 상기 암세포 대신 암 항원 에피토프 펩티드를 제시하는 항원 제시 세포를 이용할 수도 있다. TIL 요법은 환자로부터 채취한 암 조직으로부터 림프구를 채집하고, IL-2 등으로 자극·배양하여 환자에게 투여하는 공정을 포함하지만, 본 발명의 발현 벡터를 림프구에 도입하는 공정을 포함할 수도 있다.
본 발명의 발현 벡터는 상기 본 발명의 IL-7×CCL19 발현 면역 담당 세포를 제작하기 위한 이하의 (a)~(e) 중 어느 하나이다.
(a) 암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자를 코딩하는 핵산, IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 함유하는 발현 벡터:
(b) 이하의 (b-1) 및 (b-2)의 2개의 발현 벡터:
(b-1) 암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자를 코딩하는 핵산을 함유하는 발현 벡터;
(b-2) IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 함유하는 발현 벡터;
(c) 이하의 (c-1) 및 (c-2)의 2개의 발현 벡터:
(c-1) 암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자를 코딩하는 핵산 및 IL-7을 코딩하는 핵산을 함유하는 발현 벡터;
(c-2) CCL19를 코딩하는 핵산을 함유하는 발현 벡터;
(d) 이하의 (d-1) 및 (d-2)의 2개의 발현 벡터:
(d-1) IL-7을 코딩하는 핵산을 함유하는 발현 벡터;
(d-2) 암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자를 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 함유하는 발현 벡터;
(e) 이하의 (e-1), (e-2) 및 (e-3)의 3개의 발현 벡터:
(e-1) 암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자를 코딩하는 핵산을 함유하는 발현 벡터;
(e-2) IL-7을 코딩하는 핵산을 함유하는 발현 벡터;
(e-3) CCL19를 코딩하는 핵산을 함유하는 발현 벡터;
본 발명의 발현 벡터는 또한 IL-15, CCL21, IL-2, IL-4, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18, IP-10, CCL4, Flt3L, Interferon-gamma, MIP-1 alpha, GM-CSF, M-CSF, TGF-beta, TNF-alpha 등의 다른 면역 기능 제어 인자를 코딩하는 핵산을 함유할 수도 있다.
상기 암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자를 코딩하는 핵산, 인터루킨 7(IL-7)을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산은 각각 포유 동물 유래의 핵산을 들 수 있으며, 인간 유래의 핵산을 바람직하게 들 수 있다. 상기 각각의 핵산은 본 발명의 발현 벡터를 도입하는 세포의 종류에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 이와 같은 각각의 핵산의 서열 정보는 공지의 문헌이나 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/) 등의 데이터베이스를 검색하여 적절히 입수할 수 있다.
상기 암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자를 코딩하는 핵산으로는, 인간 유래의 핵산을 바람직하게 들 수 있다. 이와 같은 암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자를 코딩하는 핵산은 T세포 수용체(TCR)를 코딩하는 핵산 또는 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 핵산을 들 수 있으며, 천연 유래의 핵산일 수도, 인공 합성의 핵산일 수도 있고, 본 발명의 발현 벡터를 도입하는 세포의 종류에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 서열 정보는 공지의 문헌이나 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/) 등의 데이터베이스를 검색하여 적절히 입수할 수 있다.
암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자를 코딩하는 핵산, IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산은 각각을 코딩하는 핵산의 염기 서열의 정보에 기초하여 화학 합성하는 방법이나, PCR에 의해 증폭하는 방법 등의 공지의 기술에 의해 제작할 수 있다. 아울러, 아미노산을 코딩하기 위해 선택되는 코돈은 목적 숙주 세포에서의 핵산의 발현을 최적화하기 위해 개변(改變)될 수도 있다.
상기 TCR을 코딩하는 핵산에서의 TCR로는 알파사슬 및 베타사슬로 이루어지는 헤테로 이량체(알파·베타 TCR)일 수도 있고, 감마사슬 및 델타사슬로 이루어지는 헤테로 이량체(감마·델타 TCR)일 수도 있다. 아울러, 알파·베타 TCR을 코딩하는 핵산에는 TCR의 알파사슬을 코딩하는 핵산과 베타사슬을 코딩하는 핵산이 모두 포함되며, 감마·델타 TCR을 코딩하는 핵산에는 TCR의 감마사슬을 코딩하는 핵산과 델타사슬을 코딩하는 핵산이 모두 포함된다.
상기 TCR을 코딩하는 핵산의 서열 정보는 당해 기술 분야에서의 공지의 방법을 이용함으로써, 특정 항원 펩티드를 이용하여 유도된 CTL의 TCR 서브유닛으로서의 알파사슬 및 베타사슬의 핵산으로부터 동정할 수 있다(국제 공개 제2007/032255호 공보 및 Morgan et al., J Immunol, 171, 3288(2003)). 예를 들어, TCR을 해석하기 위해서는 PCR법이 바람직하다. 해석을 위한 PCR 프라이머는 예를 들어 5'측 프라이머로서의 5'-R 프라이머(5'-gtctaccaggcattcgcttcat-3': 서열 번호 3) 및 3'측 프라이머로서의, TCR 알파사슬 C 영역에 특이적인 3-TRa-C 프라이머(5'-tcagctggaccacagccgcagcgt-3': 서열 번호 4), TCR 베타사슬 C1 영역에 특이적인 3-TRb-C1 프라이머(5'-tcagaaatcctttctcttgac-3': 서열 번호 5) 또는 TCR 베타사슬 C2 영역에 특이적인 3-TRbeta-C2 프라이머(5'-ctagcctctggaatcctttctctt-3': 서열 번호 6)일 수 있으나, 이들로 한정되지 않는다. TCR 유도체는 항원 펩티드를 제시하는 표적 세포와 높은 결합력으로 결합할 수 있는 동시에, 임의로, 항원 펩티드를 제시하는 표적 세포의 효율적인 살상을 인비보 및 인비트로로 매개할 수 있다.
상기 TCR을 코딩하는 핵산으로는 예를 들어 MART1 특이적 TCR(Cancer Res. 54, 5265-5268(1994)), MAGE-A3 특이적 TCR(Anticancer Res., 20, 1793-1799(2000)), gp100 특이적 TCR(J. Immunol. 170, 2186-2194(2003)), NY-ESO-1 특이적 TCR(J. Immunol., 174, 4415-4423(2005)), WT1 특이적 TCR(Blood, 106, 470-476(2005)), MAGE-A1 특이적 TCR(Int. Immunol., 8, 1463-1466(1996)), P1A 특이적 TCR(Sarma, S., Y. Guo, Y. Guilloux, C. Lee, X. -F. Bai, Y. Liu. 1999. Cytotoxic T lymphocytes to an unmutated tumor antigen P1A: normal development but restrained effector function. J. Exp. Med. 189:811.) 등의 TCR을 코딩하는 핵산이나, MHC 분자에 결합한 항원 분자를 인식하는 동시에, T세포를 활성화할 수 있는 한 상기 문헌에 기재된 TCR을 코딩하는 염기 서열과 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 동일성을 갖는 염기 서열일 수 있다. 또한, 상기 문헌에 기재된 TCR을 코딩하는 염기 서열 중에서 CDR을 코딩하는 서열을 특정하고, 이와 같은 CDR을 코딩하는 서열을 유지하는 동시에, CDR을 코딩하는 서열 이외의 서열에서, 상기 문헌에 기재된 TCR을 코딩하는 염기 서열과 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 갖는 염기 서열일 수 있다.
IL-7을 코딩하는 핵산으로는, 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 들 수 있으며, IL-7에서의 세포 증식률 또는 세포 생존율의 항진 작용을 갖는 한, 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열과 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 동일성을 갖는 염기 서열일 수 있다. CCL19를 코딩하는 핵산으로는, 서열 번호 2에 나타난 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 들 수 있으며, CCL19에서의 세포의 유주 작용을 갖는 한, 서열 번호 2에 나타난 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열과 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 동일성을 갖는 염기 서열을 이용할 수도 있다.
또한, 본 발명의 발현 벡터에는 자살 유전자를 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 자살 유전자란 발현함으로써 직접적으로 혹은 이차적으로 세포 독성을 갖는 물질을 유도하여, 자신의 세포를 죽음에 이르게 하는 기능을 갖는 유전자를 의미한다. 본 발명의 발현 벡터에 자살 유전자를 코딩하는 핵산을 포함시킴으로써, 암의 치료 경과에 따라, 예를 들어 종양이 소실된 경우에 자살 유전자의 기능을 활성화하는 약제를 투여하여, 생체 내의 면역 담당 세포를 제어할 수 있다. 또한, IL-7 또는 CCL19는 다른 사이토카인과는 달리, 부작용으로 사이토카인 방출 증후군이나 유전자 도입 세포의 종양화를 일으킬 가능성이 낮다. 그러나 본 발명의 발현 벡터를 도입한 면역 담당 세포의 기능이 높아짐으로써, 표적 암 조직을 공격할 때 방출하는 사이토카인 등이 예상 외로 주변 조직에 영향을 줄 수 있다. 이와 같은 경우에는 본 발명의 발현 벡터에 자살 유전자를 코딩하는 핵산을 포함시킴으로써, 사이토카인 방출 증후군이 발생할 리스크를 확실히 저감시키는 것이 가능해진다.
자살 유전자로는 이하의 문헌에 기재된 단순 헤르페스 바이러스의 티미딘키나아제(HSV-TK)나 유도성 카스파제 9(inducible caspase 9)를 코딩하는 유전자 등을 들 수 있으며, 이와 같은 유전자의 기능을 활성화하는 약제로는, 전자에 대해서는 간시클로비르(ganciclovir), 후자에 대해서는 이량체 유도 화합물(chemical induction of dimerization: CID)인 AP1903을 들 수 있다(Cooper LJ., et. al. Cytotherapy. 2006;8(2):105-17., Jensen M. C. et. al. Biol Blood Marrow Transplant. 2010 Sep;16(9):1245-56., Jones BS. Front Pharmacol. 2014 Nov 27;5:254., Minagawa K., Pharmaceuticals(Basel). 2015 May 8;8(2):230-49., Bole-Richard E., Front Pharmacol. 2015 Aug 25;6:174).
본 발명의 벡터에서의, (a) 암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자를 코딩하는 핵산, IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 함유하는 발현 벡터는 어느 핵산이 어느 상류 또는 하류에 배치될 수 있다. 구체적으로는, 암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자를 코딩하는 핵산으로서 TCR을 코딩하는 핵산을 함유하는 경우를 예로 들면, 상류부터 순서대로 TCR을 코딩하는 핵산, IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산일 수도 있고, TCR을 코딩하는 핵산, CCL19를 코딩하는 핵산 및 IL-7을 코딩하는 핵산일 수도 있고, IL-7을 코딩하는 핵산, CCL19를 코딩하는 핵산 및 TCR을 코딩하는 핵산일 수도 있고, IL-7을 코딩하는 핵산, TCR을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산일 수도 있고, CCL19를 코딩하는 핵산, TCR을 코딩하는 핵산 및 IL-7을 코딩하는 핵산일 수도 있고, CCL19를 코딩하는 핵산, IL-7을 코딩하는 핵산 및 TCR을 코딩하는 핵산일 수도 있다.
본 발명의 벡터에서의, (b-2) IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 함유하는 발현 벡터에 있어서, IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산의 배치는 특별히 제한되지 않으며, IL-7을 코딩하는 핵산에 대해 CCL19를 코딩하는 핵산이 상류에 배치될 수도 하류에 배치될 수도 있다.
본 발명의 벡터에서의, (c-1) 암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자를 코딩하는 핵산 및 IL-7을 코딩하는 핵산을 함유하는 발현 벡터에 있어서, 암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자를 코딩하는 핵산 및 IL-7을 코딩하는 핵산의 배치는 특별히 제한되지 않으며, 암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자를 코딩하는 핵산에 대해 IL-7을 코딩하는 핵산이 상류에 배치될 수도 하류에 배치될 수도 있다.
본 발명의 벡터에서의, (d-2) 암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자를 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 함유하는 발현 벡터에 있어서, 암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자를 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산의 배치는 특별히 제한되지 않으며, 암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자를 코딩하는 핵산에 대해 CCL19를 코딩하는 핵산이 상류에 배치될 수도 하류에 배치될 수도 있다.
아울러, 암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자를 코딩하는 핵산, IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산은 각각 별개의 프로모터에 의해 전사될 수도 있으며, 내부 리보자임 엔트리 부위(IRES: internal ribozyme entry site) 또는 자기 절단형 2A 펩티드를 사용하여 하나의 프로모터로 전사될 수도 있다.
내부 리보자임 엔트리 부위(IRES) 또는 자기 절단형 2A 펩티드를 사용하여 하나의 프로모터로 IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 전사시키는 경우의 상기 각 핵산의 사이나, 상기 암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자를 코딩하는 핵산을 포함하는 경우의 상기 핵산과 IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산의 사이나, 알파·베타 TCR을 코딩하는 핵산을 포함하는 경우의 알파사슬을 코딩하는 핵산과 베타사슬을 코딩하는 핵산의 사이나, 감마·델타 TCR을 코딩하는 핵산을 포함하는 경우의 감마사슬을 코딩하는 핵산과 델타사슬을 코딩하는 핵산의 사이에는, 각각의 핵산을 발현할 수 있는 한 임의의 핵산을 포함할 수 있으나, 자기 절단형 펩티드(2A 펩티드) 또는 IRES를 코딩하는 서열, 바람직하게는 2A 펩티드를 코딩하는 서열을 통해 연결되어 있는 것이 바람직하다. 이와 같은 서열을 이용해 연결함으로써, 각각의 핵산을 효율적으로 발현시키는 것이 가능해진다.
또한, 자살 유전자를 코딩하는 핵산을 함유하는 경우에는, 자살 유전자의 위치는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어 암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자를 코딩하는 핵산, IL-7을 코딩하는 핵산 또는 CCL19를 코딩하는 핵산을 발현시키기 위한 프로모터의 하류에 2A 펩티드 또는 IRES를 코딩하는 서열을 통해 상기 각각의 핵산의 상류 또는 하류에 배치할 수도 있고, 다른 프로모터의 하류에 배치할 수도 있다.
2A 펩티드란, 바이러스 유래의 자기 절단형 펩티드이며, 서열 번호 7로 나타나는 아미노산 서열중의 G-P 사이(C말단으로부터 1잔기의 위치)가 소포체로 절단되는 특징을 갖는다(Szymczak et al., Expert Opin. Biol. Ther. 5(5):627-638(2005)). 때문에, 2A 펩티드를 통해 그 전후에 편입된 핵산은 세포 내에서 서로 독립적으로 발현하게 된다.
상기 2A 펩티드로는 피코르나바이러스(picornavirus), 로타바이러스(rotavirus), 곤충 바이러스, 아프타바이러스(aphthovirus) 또는 트리파노소마(trypanosoma) 바이러스 유래의 2A 펩티드인 것이 바람직하고, 서열 번호 8에 나타난 피코르나바이러스 유래의 2A 펩티드(F2A)인 것이 보다 바람직하다.
본 발명의 발현 벡터에서의 벡터로는 직쇄형일 수도 환형일 수도 있으며, 플라스미드 등의 비바이러스 벡터일 수도, 바이러스 벡터일 수도, 트랜스포손(transposon)에 의한 벡터일 수도 있다. 또한, 이와 같은 벡터에는 프로모터나 터미네이터 등의 제어 서열이나, 약제 내성 유전자, 리포터 유전자 등의 선택 마커 서열을 함유할 수도 있다. 프로모터 서열의 하류에 작동 가능하도록 IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 배치함으로써, 각각의 핵산을 효율적으로 전사하는 것이 가능해진다.
상기 프로모터로는 레트로바이러스(retrovirus)의 LTR 프로모터, SV40 초기 프로모터, 시토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 프로모터, 단순 헤르페스 바이러스의 티미딘키나아제 프로모터 등의 바이러스 유래 프로모터, 포스포글리세린산 키나아제(PGK) 프로모터, Xist 프로모터, β-액틴 프로모터, RNA 폴리머라아제 II 프로모터 등의 포유류 유래 프로모터를 들 수 있다. 또한, 테트라사이클린에 의해 유도되는 테트라사이클린 응답형 프로모터, 인터페론에 의해 유도되는 Mx1 프로모터 등을 이용할 수도 있다. 본 발명의 발현 벡터에 있어서 상기 특정 물질에 의해 유도되는 프로모터를 이용함으로써, 암의 치료 경과에 따라 IL-7 및 CCL19의 발현의 유도를 제어하는 것이 가능해진다.
상기 바이러스 벡터로는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스(lentivirus) 벡터, 아데노바이러스(adenovirus) 벡터, 아데노 수반 바이러스 벡터를 들 수 있으며, 레트로바이러스 벡터를 바람직하게 들 수 있고, pMSGV 벡터(Tamada k et al., Clin Cancer Res 18:6436-6445(2002))나 pMSCV 벡터(타카라바이오사 제품)를 보다 바람직하게 들 수 있다. 레트로바이러스 벡터를 이용하면, 도입 유전자는 호스트 세포의 게놈에 넣어지기 때문에, 장기간 안정적으로 발현하는 것이 가능해진다.
면역 담당 세포에서의 본 발명의 발현 벡터 함유의 확인은, 예를 들어 TCR을 코딩하는 핵산을 함유하는 경우에는 유세포 분석(flow cytometry), 노던 블로팅(northern blotting), 서던 블로팅(southern blotting), RT-PCR 등의 PCR, ELISA, 웨스턴 블로팅(western blotting)에 의해 TCR의 발현을 조사할 수 있으며, 본 발명의 발현 벡터에 마커 유전자를 함유하는 경우에는, 상기 발현 벡터에 삽입된 마커 유전자의 발현을 조사함으로써 확인할 수 있다.
본 발명의 IL-7×CCL19 발현 면역 담당 세포에 함유하는 발현 벡터에 TCR을 코딩하는 핵산을 함유하는 경우에는 발현하는 TCR의 가변 영역은 세포 외에 위치하며, 이와 같은 TCR의 가변 영역을 구비함으로써, TCR 발현 면역 담당 세포는 MHC 분자에 결합한 항원 분자를 인식하는 것이 가능해진다.
본 발명의 항암제는 본 발명의 IL-7×CCL19 발현 면역 담당 세포와 약학적으로 허용되는 첨가제를 함유하면 특별히 제한되지 않으며, 상기 첨가제로는 생리 식염수, 완충 생리 식염수, 세포 배양 배지, 덱스트로오스, 주사용수, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 조합, 안정제, 가용화제 및 계면활성제, 완충제 및 방부제, 등장화제, 충전제 및 윤활제를 들 수 있다.
본 발명의 항암제는 당업자에게 이미 공지된 방법을 이용하여 암 치료를 필요로 하는 피험체에 투여할 수 있으며, 투여 방법으로는 정맥내, 종양내, 피내, 피하, 근육내, 복강내, 동맥내, 수(髓)내, 심장내, 관절내, 활액낭내, 두엽내, 수강(髓腔)내 및 지주막하(수액(髓液))에의 주사를 들 수 있다.
투여하는 항암제에 포함되는 본 발명의 IL-7×CCL19 발현 면역 담당 세포의 양은 암의 종류, 위치, 중증도, 치료를 받는 피험체의 연령, 체중 및 상태 등에 따라 적절히 조정할 수 있으나, 바람직하게는 1회 투여에서 1×104~1×1010개, 바람직하게는 1×105~1×109개, 보다 바람직하게는 5×106~5×108개를 들 수 있다.
투여하는 항암제는 1일 4회, 3회, 2회 또는 1회, 1일 간격, 2일 간격, 3일 간격, 4일 간격, 5일 간격, 주 1회, 7일 간격, 8일 간격, 9일 간격, 주 2회, 월 1회 또는 월 2회 독립적으로 투여하는 방법을 들 수 있다.
본 발명의 항암제나 후술하는 암의 치료 방법에서의 암으로는 고형암일 수도 혈액암일 수도 있으며, 선암, 편평상피암, 선편평상피암, 미분화암, 대세포암, 소세포암, 피부암, 유방암, 전립선암, 방광암, 질암, 경부암, 자궁암, 간장암, 신장암, 췌장암, 비장암, 폐암, 기관암, 기관지암, 결장암, 소장암, 위암, 식도암, 담낭암, 정소암, 난소암 등의 암이나, 골 조직, 연골 조직, 지방 조직, 근조직, 혈관 조직 및 조혈 조직의 암 외, 연골육종, 유잉육종, 악성 혈관내피종, 악성 신경초종, 골육종, 연부 조직 육종 등의 육종이나, 간모세포종, 수모세포종, 신아세포종, 신경아세포종, 췌모세포종, 흉막 폐 모세포종, 망막모세포종 등의 아세포종이나, 생식 세포 종양이나, 림프종이나, 백혈병을 들 수 있다.
본 발명의 항암제는 다른 항암제와 병용하여 이용할 수 있다. 다른 항암제로는 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 벤다무스틴(bendamustine), 이포스파미드(ifosfamide), 디카바진(dacarbazine) 등의 알킬화 약, 펜토스타틴(pentostatin), 플루다라빈(fludarabine), 클라드리빈(cladribine), 메토트렉세이트(methotrexate), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 6-메르캅토푸린(6-mercaptopurine), 에노시타빈(enocitabine) 등의 대사 길항약, 리툭시맙(rituximab), 세툭시맙(cetuximab), 트라스투주맙(trastuzumab) 등의 분자 표적약, 이매티닙(imatinib), 제피티닙(gefitinib), 엘로티닙(erlotinib), 아파티닙(afatinib), 다사티닙(dasatinib), 수니티닙(sunitinib), 트라메티닙(trametinib) 등의 키나아제 저해제, 보르테조밉(bortezomib) 등의 프로테아좀(proteasome) 저해제, 시클로스포린(cyclosporine), 타크로리무스(tacrolimus) 등의 칼시뉴린(calcineurin) 저해약, 아이다루비신(idarubicin), 독소루비신(doxorubicin), 마이토마이신 C(mitomycin C) 등의 항암성 항생 물질, 이리노테칸(irinotecan), 에토포시드(etoposide) 등의 식물 알카로이드, 시스플라틴(cisplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 카르보플라틴 등의 플라티나 제제, 타목시펜(tamoxifen), 비칼루타마이드(bicalutamide) 등의 호르몬 요법약, 인터페론(interferon), 니볼루맙(nivolumab), 펨브롤리주맙(pembrolizumab) 등의 면역 제어약을 들 수 있으며, 알킬화 약 또는 대사 길항약을 바람직하게 들 수 있다.
상기 '본 발명의 항암제와 다른 항암제와 병용하여 이용하는' 방법으로는, 다른 항암제를 이용하여 처리하고, 그 후 본 발명의 항암제를 이용하는 방법이나, 본 발명의 항암제와 다른 항암제를 동시에 이용하는 방법이나, 본 발명의 항암제를 이용하여 처리하고, 그 후 다른 항암제를 이용하는 방법을 들 수 있으며, 다른 항암제를 이용하여 처리하고, 그 후 본 발명의 항암제를 이용하는 방법을 바람직하게 들 수 있다. 또한, 본 발명의 항암제와 다른 항암제와 병용한 경우에는 암 치료 효과가 보다 향상됨과 동시에, 각각의 항암제의 투여 회수 또는 투여량을 줄임으로써 각각의 항암제에 의한 부작용을 저감시키는 것이 가능해진다. 또한, 본 발명의 항암제에 상기 다른 항암제를 포함시킬 수도 있다.
발명의 다른 양태 1로서, 1) 암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자, 인터루킨 7(IL-7) 및 CCL19를 발현하는 면역 담당 세포를 암 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 특징으로 하는 암의 치료 방법이나, 2) 항암제로서 사용하기 위한, 암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자, 인터루킨 7(IL-7) 및 CCL19를 발현하는 면역 담당 세포나, 3) 암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자, 인터루킨 7(IL-7) 및 CCL19를 발현하는 면역 담당 세포의 항암제의 조제에서의 사용을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 양태 2로서, 상기 본 발명의 발현 벡터를 구비하고 있는, 암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자, 인터루킨 7(IL-7) 및 CCL19를 발현하는 면역 담당 세포를 제작하기 위한 키트를 들 수 있으며, 이와 같은 키트로는 본 발명의 발현 벡터를 구비하고 있으면 특별히 제한되지 않고, 본 발명의 IL-7×CCL19 발현 면역 담당 세포를 제작하기 위한 설명서나 본 발명의 발현 벡터를 면역 담당 세포에 도입하기 위해 이용하는 시약을 포함할 수 있다.
(면역 기능 제어 인자의 선택)
T세포의 기능을 제어할 수 있는 분자는 적어도 생체 내에 수백 종류나 존재한다. 발명자들은 면역 담당 세포에서의 면역 기능 제어 효과를 더욱더 높이기 위한 제어 분자로서, 지금까지의 지식이나 경험을 기초로, 방대한 조합 중에서 우선은 IL-7과 CCL19를 선택하는 동시에, 각각 단독이 아니라 2개의 조합, 즉 IL-7과 CCL19의 조합을 선택하여, 이와 같은 면역 담당 세포의 면역 기능 제어 인자를 발현하는 벡터를 제작했다.
(IL-7 및 CCL19를 발현하는 벡터의 제작-1)
항FITC scFv, 마우스 CD8 막 관통 영역, 마우스 CD28-4-1BB-CD3ζ 세포내 시그널 모티프로 이루어지는 항FITC CAR을 코딩하는 항FITC CAR DNA 단편(서열 번호 9), 서열 번호 8에 나타내는 2A 펩티드(F2A)와, 상기 펩티드에 이어지는 제한 효소 사이트(MCS)를 코딩하는 F2A-MCS DNA 단편(서열 번호 10), 마우스 IL-7(종결코돈 없음)과, 이에 이어지는 F2A와 마우스 CCL19를 코딩하는 IL-7-F2A-CCL19 DNA 단편(서열 번호 11)을 인공 합성했다(라이프 테크놀로지사 제품).
IL-7 및 CCL19를 발현하는 벡터를 제작하기 위해, 상기 항FITC CAR DNA 단편과 상기 F2A-MCS DNA 단편을 연결하여 항FITC CAR-F2A-MCS 컨스트럭트(construct)를 제작했다. 다음으로, 제작한 컨스트럭트를 pMSGV 레트로바이러스 발현 벡터(Tamada k et al., Clin Cancer Res 18:6436-6445(2002))에 클로닝하여 항FITC CAR-F2A-MCS를 포함하는 pMSGV 벡터를 제작했다. 이와 같은 pMSGV 벡터의 MCS에 상기 IL-7-F2A-CCL19 DNA 단편을 제한 효소(NsiI 및 SalI) 처리 및 결찰(ligation)에 의해 삽입하여, 항FITC CAR-F2A-IL-7-F2A-CCL19를 포함하는 pMSGV 벡터(IL-7×CCL19 발현 벡터(1))를 얻었다. 얻어진 벡터의 맵을 도 1에 나타내었다. 또한, 컨트롤로서, 상기 항FITC CAR DNA 단편을 상기 pMSGV 레트로바이러스 발현 벡터에 클로닝하여, IL-7 및 CCL19를 포함하지 않는 pMSGV 벡터(컨트롤 벡터(1))를 제작했다.
(IL-7×CCL19 발현 벡터를 도입한 레트로바이러스의 제작)
마우스 T세포의 형질 도입을 위해 레트로바이러스를 제작했다. 리포펙타민 2000 또는 3000(라이프 테크놀로지사 제품)을 이용하여 상술한 IL-7×CCL19 발현 벡터(1) 또는 컨트롤 벡터(1)와 pCL-Eco 플라스미드(Imgenex사 제품)를 GP2-293 패키징 세포주(타카라바이오사 제품)에 트랜스펙션함으로써, IL-7×CCL19 발현 벡터(1) 또는 컨트롤 벡터(1)를 도입한 레트로바이러스를 제작했다.
상기 GP2-293 세포의 배양액으로는, 10% FCS, 100U/ml의 페니실린, 100mg/ml의 스트렙토마이신을 가한 DMEM을 이용했다. 또한, 후술하는 실시예에서 이용하는 T세포의 배양액으로는, 10% FCS, 100U/ml의 페니실린, 100mg/ml의 스트렙토마이신, 50mM의 2-메르캅토에탄올, 2mM의 L-글루타민을 가한 RPMI-1640을 이용했다.
(마우스 T세포의 형질 도입)
마우스 T세포의 형질 도입을 위해, 비장 및 림프절 유래의 3×106개의 정제한 마우스 T세포를 고층화(固層化)한 항CD3mAb(3μg/ml) 및 IL-2(100IU/ml)로 48시간 활성화했다. 다음으로, 상기 설명에서 제작한 IL-7×CCL19 발현 벡터(1) 또는 컨트롤 벡터(1)를 도입한 레트로바이러스를 함유하는 상청을 25μg/ml의 레트로넥틴(RetroNectin, 등록 상표: 타카라바이오사 제품)으로 코팅한 플레이트에서 활성화시킨 상술한 마우스 T세포(1×106cells/ml)와 혼합하고, 1500rpm으로 2시간 원심 분리 후, IL-2(100IU/ml)의 존재하에서 6시간 배양했다. 배양액으로부터 레트로바이러스를 제거하기 위해, 마우스 T세포를 회수하고, IL-2(100IU/ml)를 함유하는 새로운 증식 배양액(RPMI)으로 옮기고, 다시 42시간 배양하여, IL-7×CCL19 발현 벡터(1)를 도입한 마우스 T세포(IL-7/CCL19 발현 T세포(1)) 또는 컨트롤 벡터(1)를 도입한 마우스 T세포(컨트롤 T세포(1))를 얻었다.
(IL-7 및 CCL19를 발현하는 발현 벡터의 제작-2)
상기에서의 IL-7×CCL19 발현 벡터(1)의 제작에서, 서열 번호 9에 나타난 서열에 포함되는 항FITC scFv영역의 서열을, 리툭시맙의 서열을 기초로 라이프 테크놀로지사가 합성한 항인간 CD20 scFv(서열 번호 12)의 서열로 치환한 이외에는 상기 'IL-7 및 CCL19를 발현하는 발현 벡터의 제작-1'과 동일한 방법으로 항인간 CD20 CAR-F2A-IL-7-F2A-CCL19를 포함하는 pMSGV 벡터(IL-7×CCL19 발현 벡터(2))를 제작했다. 마찬가지로, 상기에서의 컨트롤 벡터(1)의 제작에서, 서열 번호 9에 나타난 서열에 포함되는 항FITC scFv영역의 서열을, 상기 항인간 CD20 scFv(서열 번호 12)의 서열로 치환한 이외는 상기 'IL-7 및 CCL19를 발현하는 발현 벡터의 제작-1'과 동일한 방법으로 IL-7 및 CCL19를 포함하지 않는 pMSGV 벡터(컨트롤 벡터(2))를 제작했다. 이와 같은 IL-7×CCL19 발현 벡터(2) 또는 컨트롤 벡터(2)를 상기와 동일한 방법으로 레트로바이러스를 이용해 마우스 T세포에 도입하여, IL-7/CCL19 발현 T세포(2) 또는 컨트롤 T세포(2)를 제작했다.
(IL-7/CCL19 발현 T세포의 세포수 및 생존율)
IL-7/CCL19 발현 T세포에 의해 산생되는 IL-7이나 CCL19가 생물적인 기능을 발휘하여, 면역 유도 효과를 나타내는지 여부에 대해 검토했다. 제작한 IL-7/CCL19 발현 T세포(2)(4×105개) 또는 컨트롤 T세포(2)를 함유하는 샘플을 5일간 배양했다. 상기 배양은 IL-7 및 CCL19의 발현에서 인간 CD20 CAR에 의한 영향을 배제하기 위해, CD20에 의한 항원 자극없이 수행했다. 그 다음, 트리판 블루에 의해 세포수와 생존율을 조사했다. 결과를 도 2a, 도 2b에 나타내었다. 도 2a는 세포수, 도 2b는 생존율이며, 검은 칼럼은 IL-7/CCL19 발현 T세포, 흰 칼럼은 컨트롤 T세포를 나타낸다.
(결과)
도 2a, 도 2b에 나타내는 바와 같이, IL-7/CCL19 발현 T세포(2)에서는 컨트롤 T세포(2)와 비교하여 세포수가 대략 5배, 생존율은 대략 2배 높아져 있었다. 따라서, 본 발명의 발현 벡터를 T세포에 도입한 IL-7/CCL19 발현 T세포를 이용함으로써, IL-7이나 CCL19가 생물적인 기능을 발휘하여 면역 유도 효과를 나타내는 것이 명백해졌다.
[T세포 유주 시험]
(IL-7/CCL19 발현 T세포에 의한 T세포 유주 시험)
트랜스웰(transwell)을 이용한 세포 유주 시험에 의해, CCL19의 유주 야기 효과를 검토했다. 응답측 T세포의 유주성은 96웰의 트랜스웰(등록 상표) 챔버(Corning Costar사 제품)를 이용하여 구멍 직경 5μm의 폴리카보네이트 필터를 통해 유주시킴으로써 측정했다. 구체적으로는, 챔버의 하층에서 IL-7/CCL19 발현 T세포(1) 또는 컨트롤 T세포(1)을 배양했다. 상기 배양은 IL-7 및 CCL19의 발현에서 FITC CAR에 의한 영향을 배제하기 위해, FITC에 의한 항체 자극없이 수행했다. 응답측 T세포는 MACS(Miltenyi Biotec사 제품)의 네가티브 선택에 의해, 비장이나 림프절로부터 조제했다. 응답측 T세포는 CytoTell blue(AAT Bioquest사 제품)로 라벨링하고, 상층에서 3시간 배양했다. 챔버의 상층으로부터 하층으로의 유주는 유세포 분석(EC800: 소니사 제품)으로 조사하였으며, 데이터 해석은 FlowJo 소프트웨어(Tree Star사 제품)를 이용했다. 결과를 도 3에 나타낸다. 도 3에서, 검은 칼럼은 IL-7/CCL19 발현 T세포(1), 흰 칼럼은 컨트롤 T세포(1)를 나타내며, 세로축은 하층의 챔버에 유주한 응답측 T세포의 절대수를 나타낸다. 또한, 통계학적 유의차는 Student's t-test로 검토했다.
(결과)
도 3에 나타내는 바와 같이, IL-7/CCL19 발현 T세포(1)는 컨트롤 T세포(1)와 비교하여 대략 1.8배의 T세포를 하층에 유주시켰다. T세포 등의 림프구 이입 요법에서는, 투여한 T세포에 의한 암세포 손상이 물론 중요하지만, 이에 더하여, 암환자에게 원래 존재하는 내재성 T세포(=숙주측 면역 세포)를 활성화하여 암세포를 공격하는 세포로서 동원하는 것이 중요하다. 이를 위해서는 항종양 활성을 갖는 림프구를 단순히 외부로부터 이입하는 것뿐 아니라, 어떤 방법을 통해 이입한 T세포와 내재성 T세포의 능동적인 상호 작용을 야기하여 내재성 T세포를 암 국부에 집적하도록 시키는 것이 면역 치료 효과를 높이는 점에서 바람직하다. 도 3의 결과로부터, IL-7/CCL19 발현 T세포(1)는 내인성 T세포를 집적시키는 능력을 갖기 때문에, 이입한 T세포와 내재성 T세포의 능동적인 상호 작용을 유도하는 것이 가능하다는 것이 명확해졌다.
또한, 도 2a, 도 2b, 도 3의 결과로부터 IL-7 및 CCL19 발현하는 T세포는 IL-7에 의해 효과적으로 증식하여, 생존율도 높은 동시에, CCL19에 의해 T세포를 집적한다는 면역 유도에 빠뜨릴 수 없는 중요한 효과를 구비하고 있어, 우수한 면역 유도 효과를 갖는 것이 명백해졌다. 즉, 면역 담당 세포에서 'IL-7'과 'CCL19'의 2개의 제어 분자를 발현시킴으로써, 이와 같은 면역 담당 세포의 증식 능력, 생존율, 면역 유도 효과를 향상시키는 것이 가능하다는 것이 명백해졌다. 또한, 상술한 바와 같이 IL-7 및 CCL19를 발현하는 T세포는 증식능, 생존능 및 T세포 집적능을 겸비하고 있기 때문에, 암 조직에서의 T세포나 수지상 세포의 침투 효과나 종양 증식 억제 효과를 가지는 가능성이 시사되었다.
[IL-7×CCL19×HSV-TK발현 벡터의 제작]
pMSGV1 벡터의 멀티 클로닝 사이트에 IL-7, CCL19 및 자살 유전자인 HSV-TK의 각 유전자를 코딩하는 염기 서열을, 자기 절단형 펩티드인 2A 펩티드를 코딩하는 염기 서열을 사이에 두고 탠덤하게 배열한 염기 서열을 클로닝함으로써 IL-7, CCL19 및 HSV-TK를 발현하는 벡터를 제작할 수 있다. 이와 같은 벡터의 맵을 도 4에 나타내었다.
상기와 같이 제작한 IL-7×CCL19×HSV-TK 발현 벡터를 도입한 면역 담당 세포는 상기 면역 담당 세포를 투여한 피험체에 간시클로비르를 투여함으로써 피험체 내의 면역 담당 세포를 제어하는 것이 가능해진다.
[TCR×IL-7×CCL19 발현 벡터의 제작]
pMSGV1 벡터의 멀티 클로닝 사이트에 TCR, IL-7 및 CCL19의 각 유전자를 코딩하는 염기 서열을 자기 절단형 펩티드인 2A 펩티드를 코딩하는 염기 서열을 사이에 두고 탠덤하게 배열한 염기 서열을 클로닝함으로써 TCR, IL-7 및 CCL19를 발현하는 벡터를 제작할 수 있다. 이와 같은 벡터의 맵을 도 5에 나타내었다.
상기와 같이 제작한 TCR×IL-7×CCL19 발현 벡터를 도입한 면역 담당 세포는 암세포의 표면에 존재하는 암 항원뿐 아니라, 암세포 내의 암 항원에서 유래하는 펩티드가 MHC에 제시된 복합체에 대해서도 특이적으로 결합하는 것이 가능해져, 보다 광범위한 종양 관련 표적 분자에 대한 특이적 T세포의 유도가 가능해진다.
[IL-7, CCL19 및 eGFP를 발현하는 발현 벡터의 제작]
마우스 IL-7(종결코돈 없음)과 이에 이어지는 F2A, 마우스 CCL19를 코딩하는 IL-7-F2A-CCL19 DNA 단편을 인공 합성했다(라이프 테크놀로지사 제품).
IL-7, CCL19 및 eGFP를 발현하는 벡터를 제작하기 위해, 상기에서 합성한 IL-7-F2A-CCL19 DNA 단편을 F2A-eGFP 서열을 갖는 pMSGV 레트로바이러스 발현 벡터(Tamada k et al., Clin Cancer Res 18:6436-6445(2002))의 MCS에 제한 효소(NCOI 및 ECORI) 처리 및 결찰에 의해 삽입하여, IL-7-F2A-CCL19-F2A-eGFP DNA 단편(서열 번호 13)을 포함하는 pMSGV 벡터(IL-7×CCL19 발현 벡터(3))를 얻었다. 얻어진 벡터의 맵을 도 6에 나타내었다. 또한, 컨트롤로서, eGFP를 포함하고, IL-7 및 CCL19를 포함하지 않는 pMSGV 벡터(컨트롤 벡터(3))를 제작했다. 아울러, 서열 번호 13에서, 1~462번째의 염기가 IL-7(1~75번째의 염기는 IL-7의 시그널 서열), 463~537번째의 염기가 F2A, 538~861번째의 염기가 CCL19(538~612번째의 염기는 CCL19의 시그널 서열), 868~942가 F2A, 946~1662번째의 염기가 eGFP를 코딩하는 핵산, 1663~1665번째의 염기가 종결코돈이다. 또한, 상기 염기 서열 13에 대응하는 아미노산 서열을 서열 번호 14에 나타내었다. 아울러, 제한 효소 NcoI를 사용하기 위해, 서열 번호 13에서의 4번째의 염기 티민(t)을 구아닌(g)으로(서열 번호 14에서의 2번째의 아미노산 페닐알라닌(F)을 발린(V)으로) 치환했다.
[P815 종양 항원 P1A 특이적인 TCR, IL-7, CCL19 및 eGFP를 발현하는 T세포의 제작]
Y. Liu로부터 입수한, H-2Ld 구속성의 P815 종양 항원 P1A 특이적인 TCR을 발현하는 형질전환 마우스(Sarma, S., Y. Guo, Y. Guilloux, C. Lee, X. -F. Bai, Y. Liu. 1999. J. Exp. Med. 189:811.)로부터 비장 세포를 채취하고, 비장 세포 유래의 P815 종양 항원 P1A 특이적인 TCR을 발현하는 마우스 T세포(P1A 특이적 TCR-T세포)를 얻었다. 그 다음, 실시예 1과 동일한 방법으로, IL-7×CCL19 발현 벡터(3) 및 컨트롤 벡터(3)를 도입한 레트로바이러스를 제작하고, 상기 P1A 특이적 TCR-T세포를 포함하는 비장 세포(3×106개/웰)를 P1A 펩티드로 48시간 활성화한 세포에 형질 도입하여, P1A 특이적 TCR/IL-7/CCL19/eGFP 발현 T세포 또는 P1A 특이적 TCR/eGFP 발현 T세포를 얻었다. 각 발현 벡터의 형질 도입은 대리 지표(surrogate marker)로서 eGFP를 검출하는 유세포 분석 해석에 의해 확인했다. 얻어진 각각의 T세포의 eGFP의 발현 레벨은 모든 실험에서 70~80%였다.
0일째에, 6~10주령의 수컷 DBA/2 마우스(n=30)에 0.1ml의 HBSS로 현탁한 5×105개의 P815 비만세포종(mastocytoma)을 옆구리에 피하 접종했다. 6일째에, 마우스를 프리컨디셔닝(preconditioning)을 위해 준치사량(3-5Gy)의 조사를 수행했다. 7일째에, 마우스(n=10)를 3개의 군으로 나누고, P1A 특이적 TCR/IL-7/CCL19/eGFP 발현 T세포 또는 P1A 특이적 TCR/eGFP 발현 T세포(세포 모두 70~80% eGFP 포지티브)를 각각 1×106개 정맥에 투여했다. 그 후, 각각의 마우스의 생존율을 해석하는 동시에 사망한 마우스의 종양 부피를 측정했다. 각각의 마우스의 생존율의 해석 결과를 도 7에, 사망한 마우스의 종양 부피를 측정한 결과를 도 8에 나타내었다.
도 7에서, ▲는 미처리 마우스, ■는 P1A 특이적 TCR/eGFP 발현 T세포를 투여한 마우스, ●는 P1A 특이적 TCR/IL-7/CCL19/eGFP 발현 T세포를 투여한 마우스의 결과이며, 가로축이 P815 비만세포종을 피하 접종한 후의 일수(day), 세로축이 생존율(%)이다. P1A 특이적 TCR/IL-7/CCL19/eGFP 발현 T세포를 투여한 마우스는 60일째에도 80%가 생존하고, 100일을 넘어서도 50%가 생존하고 있었다. 따라서, P1A 특이적 TCR, IL-7 및 CCL19를 발현하는 면역 담당 세포를 이용함으로써 항종양 효과가 발휘되어 종양에 의한 생존율의 저하를 억제하는 것이 밝혀졌다.
또한, 도 8에서, 가로축이 P815 비만세포종을 피하 접종한 후의 일수(day), 세로축이 종양 부피(mm3)이다. 도 8로부터 알 수 있는 바와 같이, P1A 특이적 TCR/IL-7/CCL19/eGFP 발현 T세포를 투여한 마우스에서는 종양 부피의 증가가 현저히 억제되고 있으며, P1A 특이적 TCR/IL-7/CCL19/eGFP 발현 T세포는 우수한 항종양 활성을 갖는 것 및 고형암에 대한 치료 효과를 발휘하는 것이 명백해졌다.
본 발명의 IL-7×CCL19 발현 면역 담당 세포는 증식능, 생존능 및 림프구 집적 능력을 겸비하기 때문에, 면역 요법 분야에서 이용 가능하다.
<110> YAMAGUCHI UNIVERSITY <120> IMMUNOCOMPETENT CELL AND EXPRESSION VECTOR EXPRESSING REGULATORY FACTORS OF IMMUNE FUNCTION <130> 18IC18100 <150> PCT/JP <151> 2016-03-17 <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 177 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human IL-7 <400> 1 Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile 1 5 10 15 Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys 20 25 30 Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu 35 40 45 Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe 50 55 60 Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe 65 70 75 80 Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser 85 90 95 Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr 100 105 110 Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala 115 120 125 Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu 130 135 140 Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu 145 150 155 160 Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu 165 170 175 His <210> 2 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human CCL19 <400> 2 Met Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ser Leu Leu Val Leu Trp Thr Ser Pro 1 5 10 15 Ala Pro Thr Leu Ser Gly Thr Asn Asp Ala Glu Asp Cys Cys Leu Ser 20 25 30 Val Thr Gln Lys Pro Ile Pro Gly Tyr Ile Val Arg Asn Phe His Tyr 35 40 45 Leu Leu Ile Lys Asp Gly Cys Arg Val Pro Ala Val Val Phe Thr Thr 50 55 60 Leu Arg Gly Arg Gln Leu Cys Ala Pro Pro Asp Gln Pro Trp Val Glu 65 70 75 80 Arg Ile Ile Gln Arg Leu Gln Arg Thr Ser Ala Lys Met Lys Arg Arg 85 90 95 Ser Ser <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'-R primer <400> 3 gtctaccagg cattcgcttc at 22 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3-TRa-C primer <400> 4 tcagctggac cacagccgca gcgt 24 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3-TRb-C1 primer <400> 5 tcagaaatcc tttctcttga c 21 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900 cctaccggga catctcagcc ccagagacca gaagattgtc ggccccgtgg ctcagtgaag 960 gggaccggat tggacttcgc ctgtgatatt tacatctggg cacccttggc cggaatctgc 1020 gtggcccctc tgctgtcctt gatcatcact ctcatctgct accacaggag ccgaaatagt 1080 agaaggaaca gactccttca aagtgactac atgaacatga ctccccggag gcctgggctc 1140 actcgaaagc cttaccagcc ctacgcccct gccagagact ttgcagcgta ccgccccaaa 1200 tggatcagga aaaaattccc ccacatattc aagcaaccat ttaagaagac cactggagca 1260 gctcaagagg aagatgcttg tagctgccga tgtccacagg aagaagaagg aggaggagga 1320 ggctatgagc tgagagcaaa attcagcagg agtgcagaga ctgctgccaa cctgcaggac 1380 cccaaccagc tctacaatga gctcaatcta gggcgaagag aggaatatga cgtcttggag 1440 aagaagcggg ctcgggatcc agagatggga ggcaaacagc agaggaggag gaacccccag 1500 gaaggcgtat acaatgcact gcagaaagac aagatggcag aagcctacag tgagatcggc 1560 acaaaaggcg agaggcggag aggcaagggg cacgatggcc tttaccaggg tctcagcact 1620 gccaccaagg acacctatga tgccctgcat atgcagaccc tggcccctcg ctaa 1674 <210> 10 <211> 146 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F2A-MCS <400> 10 ggaagcggag tgaaacagac tttgaatttt gaccttctca agttggcggg agacgtggag 60 tccaaccctg gaccatgcat aaaaagctta aaccagttaa ctggaaaacg cgtaaagtcg 120 acaaaggcca aaaaggccaa cgtacg 146 <210> 11 <211> 864 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouseIL-7-F2A-mouseCCL19 <400> 11 atgttccatg tttcttttag atatatcttt ggaattcctc cactgatcct tgttctgctg 60 cctgtcacat catctgagtg ccacattaaa gacaaagaag gtaaagcata tgagagtgta 120 ctgatgatca gcatcgatga attggacaaa atgacaggaa ctgatagtaa ttgcccgaat 180 aatgaaccaa acttttttag aaaacatgta tgtgatgata caaaggaagc tgcttttcta 240 aatcgtgctg ctcgcaagtt gaagcaattt cttaaaatga atatcagtga agaattcaat 300 gtccacttac taacagtatc acaaggcaca caaacactgg tgaactgcac aagtaaggaa 360 gaaaaaaacg taaaggaaca gaaaaagaat gacgcatgtt tcctaaagag actactgaga 420 gaaataaaaa cttgttggaa taaaattttg aagggcagta taggaagcgg agtgaaacag 480 actttgaatt ttgaccttct caagttggcg ggagacgtgg agtccaaccc tggacctatg 540 gccccccgtg tgaccccact cctggccttc agcctgctgg ttctctggac cttcccagcc 600 ccaactctgg ggggtgctaa tgatgcggaa gactgctgcc tgtctgtgac ccagcgcccc 660 atccctggga acatcgtgaa agccttccgc taccttctta atgaagatgg ctgcagggtg 720 cctgctgttg tgttcaccac actaaggggc tatcagctct gtgcacctcc agaccagccc 780 tgggtggatc gcatcatccg aagactgaag aagtcttctg ccaagaacaa aggcaacagc 840 accagaagga gccctgtgtc ttga 864 <210> 12 <211> 783 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-humanCD20 scFv <400> 12 atggactgga cctggcggat cctgttcctg gtggctgctg ctacaggcgc ccacagccag 60 atcgtgctgt ctcagtctcc cgccatcctg tctgctagcc ctggcgagaa agtgaccatg 120 acctgcagag ccagcagcag cgtgtcctac atccactggt tccagcagaa gcccggcagc 180 agccccaagc cttggatcta cgccacaagc aacctggcct ctggcgtgcc agtgcggttt 240 agcggctctg gctctggcac cagctacagc ctgaccatca gcagagtgga agccgaggac 300 gccgccacct actactgtca gcagtggacc agcaaccccc ccacattcgg cggaggcacc 360 aagctggaaa tcaagggcgg aggcggatct ggcggcggag gatctggggg aggcggctct 420 caggtgcagc tgcagcagcc tggcgctgag ctcgtgaaac ctggcgcctc cgtgaagatg 480 agctgcaagg ccagcggcta caccttcaca agctacaaca tgcactgggt caagcagacc 540 cctggcagag gcctggaatg gatcggcgct atctaccccg gcaacggcga cacctcctac 600 aaccagaagt tcaagggcaa ggccaccctg accgccgaca agagcagcag cacagcctac 660 atgcagctgt cctccctgac cagcgaggac agcgccgtgt actactgcgc cagatctacc 720 tactacggcg gcgactggta cttcaacgtg tggggcgctg gcaccaccgt gaccgtgtct 780 gct 783 <210> 13 <211> 1665 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse Il-7-F2A-mouseCCL19-F2A-eGFP <400> 13 atggtccacg tctccttcag atacatcttc ggcatccccc ccctgatcct ggtcctcctg 60 cctgtcacct ccagcgaatg tcatatcaag gacaaagagg gcaaggctta tgagagcgtc 120 ctgatgatct ccattgatga gctggataag atgaccggca ccgacagcaa ctgtcccaac 180 aatgagccca acttctttag aaagcacgtg tgtgacgata ccaaggaggc tgccttcctg 240 aacagggccg ccagaaagct gaagcagttc ctgaagatga acatttccga ggagttcaac 300 gtgcacctcc tcaccgtgag ccagggcacc cagacactgg tcaattgcac ctccaaggag 360 gagaagaacg tgaaagagca gaaaaagaat gatgcttgtt tcctcaagag gctgctgagg 420 gagatcaaga cctgttggaa taagatcctg aaaggcagca tcggcagcgg agtcaagcaa 480 accctgaact tcgacctgct gaaactggcc ggagatgtgg agagcaatcc cggccctatg 540 gcccccagag tcacccctct gctggccttc agcctgctcg tgctgtggac cttccccgct 600 cccaccctgg gcggcgccaa tgatgctgag gactgttgcc tctccgtgac ccagaggccc 660 atccctggaa acatcgtcaa agccttcagg tacctgctca acgaagacgg atgtagggtg 720 cctgccgtgg tgttcacaac actgagaggc taccagctct gcgcccctcc tgatcagccc 780 tgggtcgaca gaatcatcag aaggctgaag aagtccagcg ccaagaacaa aggcaatagc 840 acaaggagaa gccctgtgag cgaattcgga agcggagtga aacagacttt gaattttgac 900 cttctcaagt tggcgggaga cgtggagtcc aaccctggac catgcatggt gagcaagggc 960 gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc 1020 cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg 1080 aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg 1140 acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc 1200 aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc 1260 aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag 1320 ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac 1380 tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac 1440 ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag 1500 aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct gagcacccag 1560 tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg 1620 accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca agtaa 1665 <210> 14 <211> 554 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse Il-7-F2A-mouse CCL19-2A-eGFP amino acid <400> 14 Met Val His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Ile Pro Pro Leu Ile 1 5 10 15 Leu Val Leu Leu Pro Val Thr Ser Ser Glu Cys His Ile Lys Asp Lys 20 25 30 Glu Gly Lys Ala Tyr Glu Ser Val Leu Met Ile Ser Ile Asp Glu Leu 35 40 45 Asp Lys Met Thr Gly Thr Asp Ser Asn Cys Pro Asn Asn Glu Pro Asn 50 55 60 Phe Phe Arg Lys His Val Cys Asp Asp Thr Lys Glu Ala Ala Phe Leu 65 70 75 80 Asn Arg Ala Ala Arg Lys Leu Lys Gln Phe Leu Lys Met Asn Ile Ser 85 90 95 Glu Glu Phe Asn Val His Leu Leu Thr Val Ser Gln Gly Thr Gln Thr 100 105 110 Leu Val Asn Cys Thr Ser Lys Glu Glu Lys Asn Val Lys Glu Gln Lys 115 120 125 Lys Asn Asp Ala Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Arg Glu Ile Lys Thr 130 135 140 Cys Trp Asn Lys Ile Leu Lys Gly Ser Ile Gly Ser Gly Val Lys Gln 145 150 155 160 Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn 165 170 175 Pro Gly Pro Met Ala Pro Arg Val Thr Pro Leu Leu Ala Phe Ser Leu 180 185 190 Leu Val Leu Trp Thr Phe Pro Ala Pro Thr Leu Gly Gly Ala Asn Asp 195 200 205 Ala Glu Asp Cys Cys Leu Ser Val Thr Gln Arg Pro Ile Pro Gly Asn 210 215 220 Ile Val Lys Ala Phe Arg Tyr Leu Leu Asn Glu Asp Gly Cys Arg Val 225 230 235 240 Pro Ala Val Val Phe Thr Thr Leu Arg Gly Tyr Gln Leu Cys Ala Pro 245 250 255 Pro Asp Gln Pro Trp Val Asp Arg Ile Ile Arg Arg Leu Lys Lys Ser 260 265 270 Ser Ala Lys Asn Lys Gly Asn Ser Thr Arg Arg Ser Pro Val Ser Glu 275 280 285 Phe Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu 290 295 300 Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Cys Met Val Ser Lys Gly 305 310 315 320 Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly 325 330 335 Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp 340 345 350 Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys 355 360 365 Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val 370 375 380 Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe 385 390 395 400 Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe 405 410 415 Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly 420 425 430 Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu 435 440 445 Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His 450 455 460 Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn 465 470 475 480 Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp 485 490 495 His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro 500 505 510 Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn 515 520 525 Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly 530 535 540 Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 545 550

Claims (12)

  1. 암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자를 발현하는 면역 담당 세포에 도입하고, 상기 암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자, 인터루킨 7(IL-7) 및 CCL19를 발현하는 면역 담당 세포를 제작하기 위한 IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자를 발현하는 면역 담당 세포에 발현 벡터를 사용하여 IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 도입하는 것을 특징으로 하는, IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자를 발현하는 면역 담당 세포에 IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 함유하는 발현 벡터를 사용하여 도입하는 것을 특징으로 하는 IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산.
  4. 제 2항 또는 제 3항에 있어서,
    발현 벡터에 자살 유전자를 코딩하는 핵산을 함유하는 것을 특징으로 하는 IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산.
  5. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산이 각각 프로모터 하류에 기능적으로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는, IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산.
  6. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자가 암 항원을 특이적으로 인식하는 키메라 항원 수용체(CAR), 암 항원을 특이적으로 인식하는 T 세포 수용체, 또는 암 항원을 특이적으로 인식하는 항체인 것을 특징으로 하는, IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산.
  7. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역 담당 세포가 림프구, 항원 제시 세포, 또는 과립구인 것을 특징으로 하는 IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산.
  8. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역 담당 세포가 T 세포인 것을 특징으로 하는 IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산.
  9. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    암 항원이 WT1, MART-1, NY-ESO-1, MAGE-A1, MAGE-A3, MAGE-A4, Glypican-3, KIF20A, Survivin, AFP-1, gp100, MUC1, PAP-10, PAP-5, TRP2-1, SART-1, VEGFR1, VEGFR2, NEIL3, MPHOSPH1, DEPDC1, FOXM1, CDH3, TTK, TOMM34, URLC10, KOC1, UBE2T, TOPK, ECT2, MESOTHELIN, NKG2D, P1A, GD2 또는 GM2인 것을 특징으로 하는 IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산.
  10. 암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자를 발현하는 면역 담당 세포에 인터루킨 7(IL-7)을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 도입하는 것을 특징으로 하는, 암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자, IL-7 및 CCL19를 발현하는 면역 담당 세포의 제작 방법.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 암 항원을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자를 발현하는 면역 담당 세포에 발현 벡터를 사용하여 IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 도입하는 것을 특징으로 하는 제작 방법.
  12. 제 10항 또는 제 11항에 있어서,
    면역 담당 세포가 T 세포인 것을 특징으로 하는 제작 방법.
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