CN114599400A - 用于治疗癌症的医药、组合医药、医药组合物、免疫应答细胞、核酸递送介质和制品 - Google Patents

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玉田耕治
佐古田幸美
安達圭志
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Neuer Immune Biotechnology Co ltd
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Abstract

本公开的示例性组合医药用于治疗对象中的癌症，包含：(a1)表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子、白细胞介素7和CCL19的免疫应答细胞或者(a2)协同包含编码白细胞介素7的核酸以及编码CCL19的核酸的一种或多种细胞或者核酸递送介质或者它们的组合；以及(b)免疫抑制阻断剂。本公开的示例性免疫应答细胞对特异性识别癌抗原的细胞表面分子、白细胞介素7、CCL19、以及免疫抑制阻断性多肽进行表达。

Description

用于治疗癌症的医药、组合医药、医药组合物、免疫应答细胞、 核酸递送介质和制品
技术领域
本公开涉及用于治疗癌症的医药、组合医药、医药组合物、免疫应答细胞、核酸递送介质和制品。
背景技术
癌症也称为恶性肿瘤，其治疗是医学的主要目标之一。以往，使用放射线和化学抗癌剂等进行治疗，但根据癌症的种类不同，其效果也大不相同，不能对所有的癌症都获得高效果。
近年来，开发有使用CAR-T细胞的CAR-T细胞疗法，所述CAR-T细胞是以使用基因医疗的技术而可以制作称为CAR(嵌合抗原受体)的特殊蛋白质的方式改变T细胞而得到。例如，已知CAR-T细胞疗法对于治疗复发或者难治性的CD19阳性的B细胞性急性淋巴母细胞性白血病(B-ALL)、以及复发或者难治性的CD19阳性的弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是有效的。国际公开第2017/159736号公开了在CAR-T细胞等对特异性识别癌抗原的细胞表面分子进行表达的免疫活性细胞中，使白细胞介素7(IL-7)以及趋化因子(C-C基序)配体19(CCL19)得以表达而提高抗肿瘤活性。国际公开第2019/073973号公开了包含核酸递送介质、编码IL-7的核酸、以及编码CCL19的核酸的、给药对象中具有记忆功能的T细胞或者B细胞的增强剂、或对给药对象中的T细胞或者B细胞诱导记忆功能的诱导剂。
在癌症的治疗中，以抗癌效果的增强、减少给药量所致的副作用的减轻等作为目的，多数情况是并用多种抗癌剂。
例如，日本特表2018-538339号公报公开了从提高使用了CAR-T细胞的治疗有效性的观点出发，提供包含将针对PD-L1的抗体和表达间皮素特异性CAR的细胞组合给药的、用于处置和间皮素的表达相关的疾病的组合物以及方法。
发明内容
抗癌剂的并用会带来协同效果，另一方面，也会因组合而导致效果的相互阻断，正在研究有作用的并用组合。
鉴于上述情况，本公开的课题是提供获得高抗癌效果的、用于治疗癌症的医药、组合医药、医药组合物、免疫应答细胞、核酸递送介质、以及制品。
本公开包含以下的方式。
一种用于治疗对象中的癌症的组合医药，包含：
(a)对特异性识别癌抗原的细胞表面分子、白细胞介素7(IL-7)以及趋化因子(C-C基序)配体19(CCL19)进行表达的免疫应答细胞；以及
(b)免疫抑制阻断剂。
本公开还包含以下的方式。
一种用于治疗对象中的癌症的组合医药，包含：
(a)协同包含编码白细胞介素7的核酸以及编码CCL19的核酸的一种或多种细胞或者核酸递送介质或者它们的组合；以及
(b)免疫抑制阻断剂。
本公开还包含以下的方式。
一种免疫应答细胞，所述免疫应答细胞对特异性识别癌抗原的细胞表面分子、白细胞介素7、CCL19、以及免疫抑制阻断性多肽进行表达。
发明效果
根据本公开，提供获得高抗癌效果的、用于治疗癌症的医药、组合医药、医药组合物、免疫应答细胞、核酸递送介质、以及制品。
附图说明
图1A是表示实施例中记载的、包含eGFP且不含IL-7以及CCL19的pMSGV载体(以下也称为eGFP-Conv.载体。包含IL-7-F2A-CCL19-F2A-eGFP DNA片段(序列号10)的pMSGV载体除去编码IL-7以及CCL19的区域的载体)的图谱的图。
图1B是表示实施例中记载的、包含IL-7-F2A-CCL19-F2A-eGFP DNA片段(序列号10)的pMSGV载体(以下也称为7×19表达载体)的图谱的图。
图2是表示用流式细胞仪测量未导入载体的TCR-T细胞(具体而言，未导入载体的、使源自脾细胞的P815肿瘤抗原P1A特异性TCR进行表达的小鼠T细胞。以下也称为载体未导入P1A-TCRT细胞。另外，与是否导入载体无关，将表达P1A特异性TCR的小鼠T细胞总称为P1A-TCRT细胞)、已导入eGFP-Conv.载体的P1A-TCRT细胞(以下也称为eGFP表达P1A-TCRT细胞)、以及已导入7×19表达载体的P1A-TCRT细胞(以下也称为eGFP表达P1A-7×19TCRT细胞)各自的eGFP和CD8的表达量的结果的散点图。
图3A是表示通过ELISA测定载体未导入P1A-TCRT细胞、eGFP表达P1A-TCRT细胞、以及eGFP表达P1A-7×19TCRT细胞各自的IL-7的表达量的结果的图表。
图3B是表示通过ELISA测定载体未导入P1A-TCRT细胞、eGFP表达P1A-TCRT细胞、以及eGFP表达P1A-7×19TCRT细胞各自的CCL19的表达量的结果的图表。
图4是表示在实施例中对DBA/2小鼠皮下注射肥大细胞瘤的细胞(P815)，对该DBA/2小鼠照射放射线之后，将载体未导入P1A-TCRT细胞或eGFP表达P1A-TCRT细胞和/或抗PD-1单克隆抗体给药于上述DBA/2小鼠时其经过天数和生存率的关系的图表。
图5A是表示在实施例中对DBA/2小鼠皮下注射肥大细胞瘤的细胞(P815)，对该DBA/2小鼠照射放射线之后，未进行处置时其经过天数和肿瘤体积的关系的图表。
图5B是表示在实施例中对DBA/2小鼠皮下注射肥大细胞瘤的细胞(P815)，对该DBA/2小鼠照射放射线之后，将抗PD-1单克隆抗体给药于上述DBA/2小鼠时其经过天数和肿瘤体积的关系的图表。
图5C是表示在实施例中对DBA/2小鼠皮下注射肥大细胞瘤的细胞(P815)，对该DBA/2小鼠照射放射线之后，将eGFP表达P1A-TCRT细胞给药于上述DBA/2小鼠时其经过天数和肿瘤体积的关系的图表。
图5D是表示在实施例中对DBA/2小鼠皮下注射肥大细胞瘤的细胞(P815)，对该DBA/2小鼠照射放射线之后，将eGFP表达P1A-TCRT细胞以及抗PD-1单克隆抗体给药于上述DBA/2小鼠时其经过天数和肿瘤体积的关系的图表。
图5E是表示在实施例中对DBA/2小鼠皮下注射肥大细胞瘤的细胞(P815)，对该DBA/2小鼠照射放射线之后，将eGFP表达P1A-7×19TCRT细胞给药于上述DBA/2小鼠时其经过天数和肿瘤体积的关系的图表。
图5F是表示在实施例中对DBA/2小鼠皮下注射肥大细胞瘤的细胞(P815)，对该DBA/2小鼠照射放射线之后，将eGFP表达P1A-7×19TCRT细胞以及抗PD-1单克隆抗体给药于上述DBA/2小鼠时其经过天数和肿瘤体积的关系的图表。
图6A是表示在实施例中对DBA/2小鼠皮下注射肥大细胞瘤的细胞(P815)，对该DBA/2小鼠照射放射线之后，将PD-1基因或者ROSA26基因被敲低(破坏)的eGFP表达P1A-7×19TCRT细胞给药于上述DBA/2小鼠或不给药、抗PD-1单克隆抗体给药于上述DBA/2小鼠或不给药时其经过天数和生存率的关系的图表。
图6B是表示在图6A的实验中不将P1A-TCRT细胞给药也不将抗PD-1单克隆抗体给药时其经过天数和肿瘤体积的关系的图表。
图6C是表示在图6A的实验中将ROSA26基因被敲低的eGFP表达P1A-7×19TCRT细胞给药时其经过天数和肿瘤体积的关系的图表。
图6D是表示在图6A的实验中将PD-1基因被敲低的eGFP表达P1A-7×19TCRT细胞给药时其经过天数和肿瘤体积的关系的图表。
图6E是表示在图6A的实验中将PD-1基因被敲低的eGFP表达P1A-7×19TCRT细胞、以及抗PD-1单克隆抗体给药时其经过天数和肿瘤体积的关系的图表。
图7是表示在实施例中对已接种癌细胞的DBA/2小鼠施以eGFP表达P1A-TCRT细胞或者eGFP表达P1A-7×19TCRT细胞的给药，肿瘤完全消退后通过流式细胞仪测定CD8以及eGFP表达量来评价表达有eGFP和CD8双方的eGFP表达P1A-TCRT细胞或者eGFP表达P1A-7×19TCRT细胞是否存在于脾细胞中的图表。
图8A是表示在图7的实验中得到的脾细胞中的未表达CD8但表达有eGFP的T细胞的比例以及表达有CD8以及eGFP双方的T细胞的比例的图表。
图8B是表示在图7的实验中得到的脾细胞中的未表达CD8但表达有eGFP的T细胞的数量以及表达有CD8以及eGFP双方的T细胞的数量的图表。
图8C是表示在图7的实验中得到的将脾细胞进一步与P815肿瘤细胞共培养时其经过天数和表达有CD8以及eGFP双方的T细胞的数量的关系的图表。
图8D是表示在图7的实验中得到的将脾细胞进一步P815肿瘤细胞共培养时其经过天数和培养上清中的IFN-γ浓度的关系的图表。
图9是表示通过图5F的实验在肿瘤完全消退后再次接种P815肿瘤细胞时以及对于天然(naive)DBA/2小鼠接种P815肿瘤细胞时各自的经过天数和肿瘤体积的关系的图表。
图10A是表示对DBA/2小鼠接种表达人CD20(hCD20)的P815肿瘤细胞(P815-hCD20肿瘤细胞)接种，然后腹腔内给药环磷酰胺，进而随后静注或不静注抗hCD20 CAR表达T细胞或者抗hCD20CAR-IL7/CCL19表达T细胞，随后施以或不施以对照IgG或者抗PD-1单克隆抗体给药时其时间经过和生存率的关系的图表。
图10B是表示在图10A的实验中不施以CAR-T的给药和抗体的给药时其时间经过和肿瘤体积的关系的图表。
图10C是表示在图10A的实验中不施以CAR-T的给药但施以抗PD-1单克隆抗体的给药时其时间经过和肿瘤体积的关系的图表。
图10D是表示在图10A的实验中施以抗hCD20 CAR表达T细胞给药且施以抗PD-1抗体给药时其时间经过和肿瘤体积的关系的图表。
图10E是表示在图10A的实验中施以抗hCD20 CAR-IL7/CCL19表达T细胞给药且施以对照IgG给药时其时间经过和肿瘤体积的关系的图表。
图10F是表示在图10A的实验中施以抗hCD20 CAR-IL7/CCL19表达T细胞给药且施以抗PD-1单克隆抗体给药时其时间经过和肿瘤体积的关系的图表。
图11A是表示在对DBA/2小鼠接种P815肿瘤细胞，于第7天静脉注射eGFP表达P1A-TCRT细胞或者eGFP表达P1A-7×19TCRT细胞的情况下，关于肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的细项，基于c-kit、CD11c、CD3、eGFP、CD4、以及CD8的表达调查的结果的散点图。
图11B是表示在图11A的实验中得到的免疫细胞的种别的细胞数的图表。
图12是表示在实施例中使用的编码CAR以及抗小鼠PD-1scFv的载体、以及编码CAR、IL-7、CCL19、以及抗小鼠PD-1scFv的载体的概念图。
图13是表示在实施例中使用的未转导的T细胞以及已转导各种含CAR构建物的T细胞通过流式细胞仪得到的前向散射-侧向散射的图表、以及表示使用protein L-bio以及sav-apc测定得到的CAR表达细胞的比例的图表。
图14是表示在实施例中使用的未转导的T细胞以及已转导各种含CAR构建物的T细胞的培养上清中的IL-7以及CCL19的浓度通过ELISA测定得到的结果的图表。
图15是表示在实施例中使用的未转导的T细胞以及已转导各种含CAR构建物的T细胞的培养上清中的抗PD-1抗体的浓度通过ELISA测定得到的结果的图表。
图16是表示在实施例中向DBA/2小鼠皮下注射表达人CD20的P815细胞，将环磷酰胺腹腔内给药之后，施以未转导的T细胞或者已转导各种含CAR构建物的T细胞给药时其经过天数和生存率的关系的图表、以及是表示实验组间的时序检验(Log-rank检验)得到的P值的表。
图17是表示在图16的实验中各实验组的经过天数和肿瘤体积的关系的图表。
具体实施方式
以下，详细说明本公开。以下中描述的构成要件的说明会基于本公开的具有代表性的实施方式完成，但本公开并不限于那样的实施方式。
就本公开中阶段性描述的数值范围而言，用一个数值范围描述的上限值或者下限值可以替换成其他的阶段性描述的数值范围的上限值或者下限值。另外，就本公开中描述的数值范围而言，其数值范围的上限值或者下限值可以替换成实施例所示的值。
进而，本公开中描述的组合物中的各成分的量，在组合物中与各成分相当的物质存在多种的情况下，只要没有特别说明，就是指组合物中存在的相应多种物质的合计量。
另外，在本公开中，“质量％”和“重量％”同义，“质量份”和“重量份”同义。
进而，在本公开中，两种以上的方式只要不矛盾，可以相互组合。
根据本公开涉及的一个方式，提供一种用于治疗对象中的癌症的组合医药(以下也称为“本公开涉及的组合医药A”)，其包含(a)表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子、白细胞介素7(IL-7)、以及CCL19的免疫应答细胞；以及(b)免疫抑制阻断剂。
本发明人等探求癌症治疗方法中有用的抗癌剂组合，结果发现通过本公开涉及的组合医药A，获得极高的癌症治疗效果。具体而言，在本公开涉及的组合医药A中，使用表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子、IL-7以及CCL19的免疫应答细胞(以下也称为“本公开涉及的免疫应答细胞A”)。通过本公开涉及的免疫应答细胞A、免疫抑制阻断剂的共同给药获得显著高的协同效果是由本发明人等首次发现的事项。
本公开涉及的免疫应答细胞A的细胞表面上存在的、特异性识别癌抗原的细胞表面分子，与在癌细胞上表达的癌抗原特异性结合。通过该结合，上述免疫应答细胞被拴系于癌细胞上。发生细胞内信号传递被触发等事件中的一个以上，启动对罹患癌症的患者(以下也称为癌症患者)的癌细胞进行攻击。需要说明的是，本公开中“识别”和“结合”可以互换使用。
另外，由于癌细胞具有抑制免疫应答细胞攻击癌细胞或抑制发出攻击癌细胞的指示的免疫抑制机制，因此癌症患者本身通过免疫对癌细胞的攻击受到抑制。作为本公开涉及的组合医药A的构成要素之一的免疫抑制阻断剂，通过阻断基于癌细胞的免疫抑制机制，认为可以使癌症患者的免疫系统更容易攻击癌细胞。
除了这些之外，本公开涉及的免疫应答细胞A也表达IL-7以及CCL19，由此不仅仅是本公开涉及的免疫应答细胞A，癌症患者的内源性的免疫应答细胞也集聚在癌细胞的周围，由此认为可以更有效地攻击癌细胞。
本公开涉及的组合医药A通过包含免疫抑制阻断剂和表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子、IL-7以及CCL19的免疫应答细胞，发挥由对特异性识别癌抗原的细胞表面分子进行表达的免疫应答细胞、所分泌的IL-7以及CCL19、以及免疫抑制阻断剂组成的因子的组合所致的协同效果，为此，发挥大幅改善的癌症治疗效果。该协同效果是无法通过各自的因子的个别效果预测到的优异效果。
例如，在单独使用表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子、白细胞介素7、以及CCL19的免疫应答细胞的情况下，以及在单独使用免疫抑制阻断剂的情况下，即便是治疗困难的癌症治疗的情况，只要使用本公开涉及的组合医药A就可以治疗。这可由后述的本公开涉及的免疫应答细胞C相关的实验结果得知。另外，通过这样的高治疗效果，即便是减少细胞的给药量的情况，也可以获得治疗效果，在使用自体细胞的情况下，即便是无法采集到以往所需的数量的免疫应答细胞的情况，也可以获得治疗效果。这样的效果是无法从表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子、白细胞介素7、以及CCL19的免疫应答细胞的单独给药、或免疫抑制阻断剂的单独给药预测到的效果。
<特异性识别癌抗原的细胞表面分子>
本公开中的特异性识别癌抗原的细胞表面分子是特异性结合癌抗原的分子，只要与癌抗原特异性结合，可以是多肽，也可以是适配体等核酸，也可以是这些以外的分子。在这里，癌抗原是指癌细胞中表达量比正常细胞高或癌细胞上特异性表达的蛋白质、糖脂等物质，作为该癌抗原，可以举出肿瘤相关抗原、癌睾丸抗原、血管生成相关抗原、基因突变所致的肿瘤新生抗原(新抗原：neoantigen)的表位肽。
作为通过细胞表面分子特异性识别的癌抗原的例子，具体而言，可以举出WT1、MART-1、NY-ESO-1、MAGE-A1、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A10、Glypican-3、KIF20A、Survivin、AFP、gp100、MUC1、DLL3、PRSS21、Nectin4、FAP、整合素(Integrin)β7、CT-83(KK-LC-1)、KRAS(突变型，即也包含mKRAS)、Epha2、PRAME、HA-1、PAP-10、PAP-5、TRP2-1、SART-1、VEGFR1、VEGFR2、NEIL3、MPHOSPH1、DEPDC1、FOXM1、CDH3、TTK、TOMM34、URLC10、KOC1、UBE2T、TOPK、ECT2、间皮素(MESOTHELIN)、NKG2D、P1A等蛋白质；GD2、GM2等糖脂。进而也可以举例为CD20、EGFR(EGFRvIII等)、EGFR突变体(EGFRvariant)、FITC、CD19、CD22、CD33、PSMA、ROR1、c-Met、HER2、CEA、CD7、CD10、CD30、CD34、CD38、CD41、CD44、CD74、CD123、CD133、CD171、CD180、MUC16、CS1(CD319)、IL-13Ra2、BCMA、LewisY、IgGκ链、叶酸受体α、PSCA、EpCAM、CAIX、CDS、CD49f、CD56、CD138、IGF1R、巨细胞病毒(CMV)感染细胞抗原、EGP-2、EGP-40、ERB-B2、ERB-B3、ERB-B4、FBP、胎儿型乙酰胆碱受体、GD3、HER-2、hTERT、K-轻链、LeY、L1细胞粘附分子、NKG2D配体、5T4、以及TAG-72，但不限于这些。作为细胞表面分子，可以包含一种以上的上述细胞表面分子。这些抗原的来源生物，可以为通过本公开涉及的组合医药A治疗的对象的生物种，例如人。
作为特异性识别癌抗原的细胞表面分子，可以举出特异性识别癌抗原的、细胞表面受体、人工受体、粘附因子。特异性识别癌抗原的细胞表面分子可以仅仅发挥与癌抗原结合而将本公开涉及的免疫应答细胞A配置于癌细胞附近的功能，但为了进一步提升癌症治疗效果，也可以具有使将免疫应答细胞的免疫应答活化的信号传递在细胞内发生的功能。特异性识别癌抗原的细胞表面分子例如可以是特异性识别癌抗原的抗体或者抗体片段。抗体或者抗体片段不限于IgM、IgD、IgG、IgA、IgE等，还可以是Fab、scFv等低分子抗体。
作为特异性识别癌抗原的细胞表面分子，可以举出特异性识别癌抗原的T细胞受体(TCR)、特异性识别癌抗原的嵌合抗原受体(CAR)等通过在细胞表面表达来对细胞赋予针对癌症的特异性识别能力的分子。TCR是上述细胞表面受体的一例，CAR是上述人工受体的一例，抗体(也包含Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv等低分子抗体)是上述粘附因子的一例。当然，只要特异性识别癌抗原，粘附因子还可以是糖链、适配体等除抗体以外的分子。这些细胞表面分子特异性识别癌抗原，由此本公开涉及的免疫应答细胞A可以局部存在于癌细胞周边。
TCR是在T细胞的细胞膜上表达的抗原受体分子。已知TCR以由α链和β链构成或者由γ链和δ链构成的异二聚体存在，通过识别与主要组织相容性基因复合体(MHC)分子结合的抗原分子使T细胞活化。TCR只要特异性识别癌抗原，就可以是由α链以及β链构成的异二聚体(α·βTCR)，也可以是由γ链以及δ链构成的异二聚体(γ·δTCR)。
TCR可以是内源性的TCR，也可以是外源性的TCR(重组TCR)。作为对内源性的TCR进行表达的T细胞以及将外源性的TCR基因导入的T细胞的来源，可以举出肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、肿瘤相关淋巴结、外周血淋巴细胞、胸水中淋巴细胞、腹水中淋巴细胞，但不限于这些。
作为用于分离对具有规定的抗原结合性的TCR进行表达的T细胞的方法，可以举出密度梯度离心分离；重置；与改变细胞密度的粒子的偶联；用抗体包被的磁珠进行的磁分离；亲和层析法(例如使用负选择的亲和层析法)；与单克隆抗体连结或者与单克隆抗体并用的细胞毒性剂(其中包含补体以及细胞毒素，但不限于这些)；通过与板、芯片等固体基质结合的抗体的淘选(panning)；淘洗(elutriation)；通过抗原刺激的选择性增殖；利用MHC和抗原的复合体的分离，但不限于这些。
另外，按照表达特定的TCR的方式改变的转基因小鼠等转基因动物也在被开发。
CAR是识别癌细胞的细胞表面抗原的单链抗体、和使诱导T细胞的活化的信号传递区域融合的人工嵌合蛋白质。CAR例如可以包含识别癌细胞的细胞表面抗原的单链抗体区域、跨膜区、以及诱导T细胞的活化的信号传递区域。就本公开涉及的组合医药A而言，在特异性识别癌抗原的细胞表面分子是CAR的情况下，作为该组合医药A的构成要素而给药的本公开涉及的免疫应答细胞A的数量，即便比单独使用CAR-T细胞的以往的方法所给药的CAR-T细胞数量(通常为1×106个以上)少，也可以发挥同等以上的效果。
作为CAR中的单链抗体(scFv)，可以举出包含源自单克隆抗体的抗原结合部位的轻链可变区以及重链可变区且连接体肽(linker peptide)位于轻链可变区以及重链可变区之间的寡肽或者多肽。
识别目的癌抗原的单链抗体，可以利用公知的方法制作。例如，可以在对小鼠等接种抗原之后，采集淋巴组织，制作抗体基因库，通过抗体直接克隆得到对识别癌抗原的抗体进行编码的碱基序列，以此为基础设计单链抗体。或者，也可以使用采集的淋巴组织制作杂交瘤，鉴定对识别癌抗原的抗体进行编码的杂交瘤，得到单克隆抗体，以其序列信息为基础设计单链抗体。或者，可以以由健康人的B细胞制作的天然抗体库和由源自具有针对癌抗原示出高中和活性的抗血清的癌症患者的B细胞制作的抗体库等为基础，制作单链抗体库，通过噬菌体展示使其呈递，选拔出识别癌抗原的单链抗体。
免疫应答细胞活化信号传递区域，是在上述单链抗体识别癌细胞的细胞表面抗原时可以向细胞内传递信号的区域，可以包含从CD28、4-1BB(CD137)、GITR、CD27、OX40、HVEM、CD3ζ、以及Fc受体相关γ链(Fc Receptor-associatedγchain)中任一细胞内区域的多肽中选择的至少一种或两种以上，还可以包含CD28、4-1BB、以及CD3ζ的三种细胞内区域的多肽。
各自的细胞内区域的多肽，可以通过由2～10氨基酸组成的寡肽连接体或者多肽连接体连结，作为该连接体(linker)序列，可以举出甘氨酸-丝氨酸连续序列。
免疫应答细胞的活化是指通过细胞内的信号传递或者蛋白质表达的变化的诱导而启动免疫应答。例如，CD3链响应配体结合以及免疫受体酪氨酸相关的阻断基序(ITAMs)而聚集，制作信号传递级联。另外，内源性的TCR或者外因性的CAR与抗原结合时，在结合的受体(例如CD4或者CD8、CD3γ/δ/ε/ζ等)的附近，包含大量分子的集合的免疫突触的形成可以发生。通过该膜结合信号传递分子的集合，CD3链内含有的ITAM基序进行磷酸化。该磷酸化可以使免疫应答细胞活化路径启动，最终使NF-κB以及AP-1等转录因子活化。这些转录因子，例如激发T细胞的整体的基因表达，启动T细胞介导的免疫应答，因此使用于主要的调节性T细胞蛋白质的增殖以及表达的IL-2的产生增加。
作为CAR中的跨膜区，可以举出源自CD8、T细胞受体的α链、β链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、GITR的任意的跨膜区的多肽。上述跨膜区，例如可以是人CD8跨膜区的多肽。通过该跨膜区，CAR被T细胞的细胞膜固定。
上述跨膜区可以包含由任意的寡肽或者多肽构成、长度为1～100个氨基酸、更具体为10～70个氨基酸的铰链区。作为铰链区，可以举出人CD8的铰链区。
另外，在识别癌细胞的细胞表面抗原的单链抗体和跨膜区、跨膜区和免疫应答细胞活化信号传递区域之间，可以设置由任意的寡肽或者多肽构成的间隔区。作为间隔区的长度，可以举出1～100个氨基酸，更具体为10～50个氨基酸，作为该间隔区，可以举出甘氨酸-丝氨酸连续序列。
特异性识别癌抗原的细胞表面分子的氨基酸序列，例如是源自哺乳动物的氨基酸序列，从抑制对人给药时的排斥反应的观点出发，可以为源自人的氨基酸序列。氨基酸序列可以通过检索公知的文献、NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/)等数据库而适当获得。特异性识别癌抗原的细胞表面分子可以是人的TCR、或单链抗体区域被人源化的CAR。
需要说明的是，特异性识别癌抗原的细胞表面分子只要对癌抗原的识别具有特异性，可以是间接识别。例如，将特异性识别癌抗原的抗体等分子与本公开涉及的免疫应答细胞A同时或者连续地向对象给药，识别该抗体等分子或者识别在抗体等分子上标记的标签，由此本公开涉及的免疫应答细胞A可以间接地特异性识别癌抗原。在这些情况下，作为识别抗体时的例子，可以举出CD16等作为细胞表面分子，作为在抗体等分子上标记的标签的例子，可以举出FITC等。
<IL-7>
IL-7在结构上是由源自骨髓以及胸腺的基质细胞产生的约25kDa的细胞因子。IL-7通过IL-7受体发出信号，用于促进造血干细胞向淋巴祖细胞分化，使得产生T细胞、B细胞、以及NK细胞。IL-7的氨基酸序列例如是源自哺乳动物的氨基酸序列，从抑制排斥反应的观点出发，可以为源自人的氨基酸序列。氨基酸序列可以通过检索公知的文献、NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/)等数据库而适当获得。
<CCL19>
趋化因子(C-C基序)配体19(CCL19)是属于CC趋化因子家族的细胞因子，胸腺以及淋巴结的表达量多。CCL19的氨基酸序列例如是源自哺乳动物的氨基酸序列，从抑制排斥反应的观点出发，可以是源自人的氨基酸序列。氨基酸序列可以通过检索公知的文献、NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/)等数据库而适当获得。
<本公开涉及的免疫应答细胞A>
免疫应答细胞是指参与免疫应答的细胞。作为免疫应答细胞的例子，可以举出T细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、B细胞等淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等抗原呈递细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞等粒细胞。作为T细胞的例子，可以举出α·βT细胞、γ·δT细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、肿瘤浸润T细胞、记忆T细胞、幼稚T细胞、自然杀伤T(NKT)细胞等。
免疫应答细胞可以从血液、脑脊液等体液、脾脏、胸腺、淋巴结等组织、或向原发肿瘤、转移性肿瘤、癌性腹水等癌症组织浸润的免疫细胞分离、纯化而得到，另外，可以使用由iPS细胞、ES细胞等多能干细胞或者造血干细胞等体性干细胞制作的免疫应答细胞。
免疫应答细胞可以是源自人、狗、猫、猪、小鼠等哺乳动物的T细胞，源自人的T细胞。
本公开涉及的免疫应答细胞A，表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子、IL-7以及CCL19的。在这里，“表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子、IL-7以及CCL19”是指特异性识别癌抗原的细胞表面分子、IL-7以及CCL19由免疫应答细胞产生，特异性识别癌抗原的细胞表面分子的至少一部分位于细胞表面(细胞外侧的细胞表面)，IL-7以及CCL19被分泌到细胞外。
本公开涉及的免疫应答细胞A例如可以通过向自活体采集的免疫应答细胞、或者从iPS细胞、ES细胞等多能性干细胞或造血干细胞等体性干细胞诱导的免疫应答细胞等导入对特异性识别癌抗原的细胞表面分子进行编码的基因、对IL-7进行编码的基因、以及对CCL19进行编码的基因而得到。或者，从活体采集将特异性识别癌抗原的细胞表面分子(例如特异性识别癌抗原的TCR)内源性表达的免疫应答细胞活体，导入对IL-7进行编码的基因以及对CCL19进行编码的基因，由此也可以得到。需要说明的是，在本公开中，对XX进行编码(编码XX)的基因表述与对XX进行编码(编码XX)的核酸的表述可以互换使用。此时，核酸可以是单链也可以是双链，可以是DNA也可以是RNA，但优选双链DNA。
在向从活体采集的免疫应答细胞导入基因的情况下，如果采集由本公开涉及的组合医药A治疗的癌症患者本身的(也就是说自体的)免疫应答细胞，可以将排斥反应最小化。不过，并不排除使用异体的免疫应答细胞。也就是说，本公开涉及的免疫应答细胞A可以是源自对象本身的免疫应答细胞，也可以不是。
编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的基因、编码IL-7的基因、以及编码CCL19的基因分别可以存在于本公开涉及的免疫应答细胞A的基因组中，还可以由基因组外的载体携带，例如，从基因携带的稳定性的观点出发，可以使其存在于基因组中。另外，编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的基因、编码IL-7的基因、以及编码CCL19的基因可以统合存在于基因组中，也可以分散(分开)存在。特异性识别癌抗原的细胞表面分子例如在如为由αβ的二聚体或者γδ的二聚体构成的TCR时那样为异二聚体或者异多聚体的情况下，对构成异二聚体或者异多聚体的各自的分子进行编码的基因，可以统合存在于基因组中，也可以分散(分开)存在。
在一个实施方式中，编码IL-7的基因以及编码CCL19的基因为外源性，双方被整合到本公开涉及的免疫应答细胞A的基因组中，或者被在上述免疫应答细胞A中存在的一个或多个载体一起或个别编码。需要说明的是，使用PCR等公知的方法，可以容易地确认在细胞中是否有各基因存在。在本公开中，外源性(exogenous)表示该基因或者核酸不是原本存在于细胞内的基因或者核酸，而是从外部导入的基因或者核酸。
作为TCR，已报告有MART1特异性TCR(Cancer Res.54,5265-5268(1994))、MAGE-A3特异性TCR(Anticancer Res.,20,1793-1799(2000))、gp100特异性TCR(J.Immunol.170,2186-2194(2003))、NY-ESO-1特异性TCR(J.Immunol.,174、4415-4423(2005))、WT1特异性TCR(Blood,106,470-476(2005))、MAGE-A1特异性TCR(Int.Immunol.,8,1463-1466(1996))、P1A特异性TCR(Sarma,S.,Y.Guo,Y.Guilloux,C.Lee,X.-F.Bai,Y.Liu.1999.Cytotoxic T lymphocytes to an unmutated tumor antigen P1A：normaldevelopment but restrained effector function.J.Exp.Med.189：811.)、MAGE-A10特异性TCR、AFP特异性TCR、CT-83特异性TCR、KRAS(突变型，也就是说也包括mKRAS)特异性TCR、MAGE-A4特异性TCR、Epha2特异性TCR、BCMA特异性TCR、5T4特异性TCR、PRAME特异性TCR、HA-1特异性TCR等TCR，关于对那些进行编码的核酸序列，在上述各文献中有报告。在特异性识别癌抗原的细胞表面分子是TCR的情况下，关于编码TCR的基因的碱基序列，只要能够识别目的抗原分子且将T细胞活化，就可以是与上述文献中记载的编码TCR的碱基序列具有例如80％以上、更具体为85％以上、更具体为90％以上、更具体为95％以上、更具体为98％以上的序列同源性的碱基序列。在本公开中，氨基酸序列的序列同源性以及碱基序列的序列同源性可以使用例如BLAST(注册商标，National Library of Medicine)程序，用默认参数进行评价。
或者，编码TCR的基因的碱基序列维持上述文献中记载的编码TCR的碱基序列中对CDR进行编码的碱基序列，且在编码CDR的碱基序列以外的区域的碱基序列中，可以是与上述文献中记载的编码TCR的碱基序列中该区域的碱基序列具有60％以上、更具体为70％以上、更具体为80％以上、更具体为90％以上、更具体为95％以上的序列同源性的碱基序列。
当然，TCR的碱基序列因TCR的抗原特异性而变动，可以分离对与所希望的抗原结合的TCR进行表达的T细胞，分析该TCR的碱基序列。例如，对特异性识别特定抗原的TCR进行编码的基因的碱基序列，通过使用本技术领域中的公知方法，分析对作为使用特定的抗原诱导的细胞毒性T细胞(CTL)的TCR亚基的α链以及β链进行编码的碱基序列，由此可以得到(国际公开第2007/032255号、以及Morgan et al.,J Immunol,171,3288(2003))。在对TCR的碱基序列进行分析时，可以利用PCR法对编码各链的碱基序列进行扩增而加以分析。PCR引物例如可以是作为5'侧引物的5'-R引物(5'-gtctaccaggcattcgcttcat-3'：序列号1)、以及作为3'侧引物的TCRα链C区域特异性3-TRa-C引物(5'-tcagctggaccacagccgcagcgt-3'：序列号2)、TCRβ链C1区域特异性3-TRb-C1引物(5'-tcagaaatcctttctcttgac-3'：序列号3)、或者TCRβ链C2区域特异性3-TRbeta-C2引物(5'-ctagcctctggaatcctttctctt-3'：序列号4)，但不限于这些。抗原特异性TCR可以与呈递抗原(例如肽)的靶细胞以高结合力进行结合。另外，通过适当选择免疫应答细胞的种类，可以介导对呈递抗原肽的靶细胞的有效杀伤。
作为编码CAR的碱基序列，只要是对构成CAR的多肽进行编码的碱基序列，就没有特别限制，但可以包含对识别癌细胞的细胞表面抗原的单链抗体、跨膜区、以及诱导T细胞的活化的信号传递区域的多肽进行编码的碱基序列。
编码CAR中针对癌细胞的细胞表面抗原的单链抗体、跨膜区、以及免疫应答细胞活化信号传递区域的多肽的碱基序列的信息，可以通过检索公知的文献、NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/)等数据库而适当获得。
例如，对免疫应答细胞活化信号传递区域中的CD28、4-1BB、以及CD3ζ的跨膜区的多肽进行编码的碱基序列的信息，可以检索NCBI等数据库而适当获得，关于人CD28，可以例示注册为Genbank编号：NM_006139.2(更新日期：2014年5月10日)的碱基序列，关于人4-1BB，可以例示注册为Genbank编号：NM_001561.5(更新日期：2014年3月16日)的碱基序列，关于人CD3ζ，可以例示注册为Genbank编号：NM_000734.3(更新日期：2014年8月12日)的碱基序列。
另外，对人CD8的跨膜区的多肽进行编码的碱基序列的信息，可以检索NCBI等数据库而适当获得，可以例示注册为Genbank编号：NM_001768.6(更新日期：2014年5月10日)的碱基序列。
进而，关于对单链抗体的多肽进行编码的碱基序列的信息，也可以制作对成为靶的细胞表面抗原进行识别的单克隆抗体，利用埃德曼(Edmen)法等公知的方法确定该单克隆抗体的氨基酸序列，基于该氨基酸序列而获得。作为单克隆抗体的制作方法，可以举出使用杂交瘤制作的方法、通过基因工程的方法用包含抗体基因的表达载体来转化宿主而进行制作的方法、通过用所希望的抗原对转基因动物进行免疫而制作的方法。
编码IL-7的碱基序列以及编码CCL19的碱基序列的信息可以通过检索公知的文献、NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/)等数据库而适当获得。
编码IL-7的碱基序列可以根据本公开涉及的免疫应答细胞A的种类适当选择，例如可以是对人IL-7的氨基酸序列(序列号5)进行编码的碱基序列，另外，只要具有提高作为IL-7的细胞增殖率的作用，可以是与序列号5所示的碱基序列具有例如80％以上、更具体为85％以上、更具体为90％以上、更具体为95％以上、更具体为98％以上的序列同源性的碱基序列。
编码CCL19的碱基序列可以根据本公开涉及的免疫应答细胞A的种类适当选择，例如，可以是对人CCL19的氨基酸序列(序列号6)进行编码的碱基序列，另外，只要具有作为CCL19的T细胞迁移作用，就可以是与序列号6所示的碱基序列具有例如80％以上、更具体为85％以上、更具体为90％以上、更具体为95％以上、更具体为98％以上的序列同源性的碱基序列。
在本公开涉及的免疫应答细胞A中，编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的基因、编码IL-7的基因、以及编码CCL19的基因可以在合适的启动子的调控下。
本公开涉及的免疫应答细胞A，除了表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子、IL-7、以及CCL19之外，还进一步使IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-23、IL-27、IP-10、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL4L1、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL16、CXCL17、CX3CL1、XCL1、XCL2、CCL3L1、CCL3L3、CCL4L1、CCL4L2、Flt3L、Interferon-gamma、MIP-1alpha、GM-CSF、M-CSF、TGF-beta、TNF-alpha等其他免疫功能调控因子表达一种以上。
作为本公开涉及的免疫应答细胞A的分离方法，可以举出密度梯度离心分离；重置；与改变细胞密度的粒子的偶联；用抗体包被的磁珠进行的磁分离；亲和层析法(例如使用负选择的亲和层析法)；与单克隆抗体连结或者与单克隆抗体并用的细胞毒性剂(其中包含补体以及细胞毒素，但不限于这些)；通过与板、芯片等固体基质结合的抗体的淘选(panning)；淘洗(elutriation)；通过抗原刺激的选择性增殖；利用MHC和抗原的复合体的分离，但不限于这些。
在免疫应答细胞内源性表达对癌抗原进行特异性识别的细胞表面分子的情况下，例如在分离对特异性识别规定的癌抗原的TCR进行表达的T细胞的情况下，没有必要从外部导入对特异性识别癌抗原的细胞表面分子进行编码的基因，通常，从外部导入编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的基因、编码IL-7的基因、以及编码CCL19的基因中的一种以上。
包含用于导入免疫应答细胞的编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的基因的核酸、包含编码IL-7的基因的核酸以及包含编码CCL19的基因的核酸分别可以根据编码该分子的碱基序列的信息，通过化学合成的方法、利用PCR进行扩增的方法等公知的技术来制作。需要说明的是，为了使成为包含基因的核酸的导入对象的免疫应答细胞中该基因的表达最佳化，可以改变编码区域中的密码子。
成为导入的对象的基因可以以分别被不同的载体携带的状态被导入，也可以两种以上的基因携带于相同载体的状态被导入。例如，在将编码IL-7的基因以及编码CCL19的基因导入免疫应答细胞的情况下，编码IL-7的基因和编码CCL19的基因可以通过不同的载体导入，还可以使相同载体携带两基因而导入。
另外，在将编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的基因、编码IL-7的基因以及编码CCL19的基因导入免疫应答细胞的情况下，
(i)可以使编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的基因、编码IL-7的基因以及编码CCL19的基因分别被不同的载体携带而导入；
(ii)可以使编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的基因以及编码IL-7的基因被相同载体携带，使编码CCL19的基因被另外载体携带而导入；
(iii)可以使编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的基因以及编码CCL19的基因被相同载体携带，使编码IL-7的基因被另外载体携带而导入；
(iv)可以使编码IL-7的基因以及编码CCL19的基因被相同载体携带，使编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的基因被另外载体携带而导入；
(v)可以使编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的基因、编码IL-7的基因以及编码CCL19的基因被相同载体携带而导入。
可以考虑导入效率而以两种以上的基因被相同载体携带的状态导入。此时，该两种以上的基因统合存在于免疫应答细胞中。
例如，可以使用以下的载体或者载体组使用。
(a)含有编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的基因、编码IL-7的基因、以及编码CCL19的基因的载体；
(b)由以下的载体(b-1)以及载体(b-2)构成的载体组：
(b-1)含有对特异性识别癌抗原的细胞表面分子进行编码的基因的载体；
(b-2)含有编码IL-7的基因以及编码CCL19的基因的载体；
(c)由以下的载体(c-1)以及载体(c-2)构成的载体组：
(c-1)含有对特异性识别癌抗原的细胞表面分子进行编码的基因以及编码IL-7的基因的载体；
(c-2)含有编码CCL19的基因的载体；
(d)由以下的载体(d-1)以及载体(d-2)构成的载体组：
(d-1)含有编码IL-7的基因的载体；
(d-2)含有对特异性识别癌抗原的细胞表面分子进行编码的基因以及编码CCL19的基因的载体；
(e)由以下的载体(e-1)、载体(e-2)以及载体(e-3)构成的载体组：
(e-1)含有对特异性识别癌抗原的细胞表面分子进行编码的基因的载体；
(e-2)含有编码IL-7的基因的载体；
(e-3)含有编码CCL19的基因的载体。
载体组可以设计成冗余(redundant)包含基因，例如可以设计由上述(c-1)以及(d-2)构成的载体组。此时，编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的基因包含于双方的载体，两载体所含的对特异性识别癌抗原的细胞表面分子进行编码的基因可以彼此相同或不同。
可以使上述载体中任意的载体、或者与上述的载体不同的载体中，进一步含有编码IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-23、IL-27、IP-10、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL4L1、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL16、CXCL17、CX3CL1、XCL1、XCL2、CCL3L1、CCL3L3、CCL4L1、CCL4L2、Flt3L、Interferon-gamma、MIP-1alpha、GM-CSF、M-CSF、TGF-beta、TNF-alpha等一种以上的其他免疫功能调控因子的基因，导入到免疫应答细胞中。
作为将携带基因的载体导入免疫应答细胞的方法，没有特别限制，但可以举出病毒感染法、转座子法、磷酸钙法、脂质体转染法、显微注射法、电穿孔法等公知的方法。通过可将外源基因导入基因组的病毒感染法导入的方法，可以带来基因携带的稳定性。
作为病毒感染法，可以举出将载体和包装质粒转染到GP2-293细胞(宝生物(Takara Bio)公司制造)、Plat-GP细胞(COSMO BIO公司制造)、PG13细胞(ATCC CRL-10686)、PA317细胞(ATCC CRL-9078)等包装细胞中而制作重组病毒，使该重组病毒感染免疫应答细胞的方法，Retrovirus packaging Kit Eco(宝生物公司制)等市售的试剂盒进行。如果使用MSCV逆转录病毒表达系统等，可以将外源基因导入基因组中。
另外，编码IL-7的基因、编码CCL19的基因、以及根据需要的编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的基因向基因组的整合也可以使用公知的基因编辑技术进行。作为公知的基因编辑技术，可以举出使用锌指核酸酶、TALEN(类转录激活因子效应物核酸酶)、CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat)-Cas系统等内切核酸酶的技术。根据需要导入的编码其他外源蛋白质的基因向基因组的整合也可以使用相同的方法进行。
另外，在将这些基因整合到免疫应答细胞的基因组的情况下，可以与调控该基因的上游启动子一起以可运作的方式(即，可以在该启动子的调控下进行表达的方式)整合到基因组的非编码区域等，还可以在没有启动子的情况下以可运作的方式整合到已存在于基因组中的启动子的下游。作为已存在于基因组中的启动子，可以举出TCRα、TCRβ的启动子等。
在编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的基因、编码IL-7的基因、编码CCL19的基因、以及根据需要导入的编码追加的外源蛋白质的基因中有两种以上的基因相近存在的情况下，可以使这两种以上的基因在共通的启动子的调控下进行表达。当在共通的启动子的调控下使其表达时，使用2A肽、IRES肽等，将转录和/或翻译分段，可以使各自的多肽得以表达。
在将携带编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的基因、编码IL-7的基因以及编码CCL19的基因中的两种以上的载体导入免疫应答细胞的情况下，该载体中的上述两种以上的基因的排列顺序没有特别限定。例如，在上述(a)含有编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的基因、编码IL-7的基因以及编码CCL19的基因的载体中，这三种基因的排列顺序没有限定。具体而言，按照从上游(5’末端侧)到下游(3’末端侧)的顺序，可以是编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的基因、编码IL-7的基因以及编码CCL19的基因依次排列的顺序，也可以是编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的基因、编码CCL19的基因以及编码IL-7的基因依次排列的顺序，也可以是编码IL-7的基因、编码CCL19的基因以及编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的基因依次排列的顺序，也可以是编码IL-7的基因、编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的基因以及编码CCL19的基因依次排列的顺序，也可以是编码CCL19的基因、编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的基因以及编码IL-7的基因依次排列的顺序，也可以是编码CCL19的基因、编码IL-7的基因以及编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的基因依次排列的顺序。
另外，在上述(b-2)含有编码IL-7的基因以及编码CCL19的基因的载体中，编码IL-7的基因以及编码CCL19的基因的排列顺序不受特别限制，相对于编码IL-7的基因，编码CCL19的基因可以配置在上游，也可以配置在下游。
在上述(c-1)含有编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的基因以及编码IL-7的基因的载体中，编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的基因以及编码IL-7的基因的排列顺序不受特别限制，相对于编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的基因，编码IL-7的基因可以配置在上游，也可以配置在下游。
在上述(d-2)含有编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的基因以及编码CCL19的基因的载体中，编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的基因以及编码CCL19的基因的排列顺序不受特别限制，相对于编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的基因，编码CCL19的基因可以配置在上游，也可以配置在下游。
需要说明的是，编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的基因、编码IL-7的基因以及编码CCL19的基因可以分别由不同的启动子进行转录，也可以使用内部核糖体进入位点(IRES：internal ribozyme entry site)或者自剪切型2A肽以一个启动子进行转录。
在以一个启动子使多个基因进行转录的情况下，就各基因之间的碱基序列而言，只要可以表达各基因，可以包含任意的碱基序列，但可以包含编码自剪切型肽(2A肽)或者IRES的碱基序列，还可以包含编码2A肽的碱基序列。通过使用这样的碱基序列来连结多个基因，使各基因高效表达成为可能。可包含编码自剪切型肽(2A肽)或者IRES的碱基序列的基因之间的碱基序列例如可以是编码IL-7的基因和编码CCL19的基因之间的碱基序列，还可以是编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的基因和编码IL-7的基因之间的碱基序列，还可以是编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的基因和编码CCL19的基因之间的碱基序列，还可以是编码α·βTCR中的α链的基因和编码其中的β链的基因之间的碱基序列，还可以是编码γ·δTCR中的γ链的基因和编码其中的δ链的基因之间的碱基序列。也就是说，就这些的基因间的各区域而言，根据需要，可以包含编码自剪切型肽(2A肽)或者IRES的碱基序列。
2A肽是指源自病毒的自剪切型肽，作为例子，在序列号7所示的氨基酸序列的情况下，具有该氨基酸序列中的G-P间(从C末端起一个残基的位置)被内质网切断的特征(Szymczak et al.,Expert Opin.Biol.Ther.5(5)：627-638(2005))。因此，隔着2A肽整合到其前后的核酸会在细胞内彼此独立表达。
作为上述2A肽，可以是源自小核糖核酸病毒、轮状病毒、昆虫病毒、口蹄疫病毒或者锥虫病毒的2A肽，还可以是序列号8所示的源自小核糖核酸病毒的2A肽(F2A)。
用于向免疫应答细胞导入基因的载体可以为直链状也可以为环状，可以为质粒等非病毒载体，也可以为病毒载体，也可以为利用转座子的载体。用于向免疫应答细胞导入基因的载体，可以含有启动子、终止子等调控序列、药剂抗性基因、报告基因等选择标记序列中的一个以上。也可以在向免疫应答细胞导入基因之后，利用载体所含的启动子，使基因的表达得以进行。例如，也可运作的方式在载体中的启动子序列的下游配置编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的基因、编码IL-7的基因以及编码CCL19的基因中的一个以上，由此可以使该基因高效转录。
作为上述启动子的例子，可以举出逆转录病毒的LTR启动子、SV40早期启动子、巨细胞病毒启动子、单纯疱疹病毒的胸腺激酶启动子等源自病毒的启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、Xist启动子、β-肌动蛋白启动子、RNA聚合酶II启动子、多肽链延长因子基因启动子等源自哺乳类的启动子。另外，可以使用由四环素诱导的四环素应答型启动子、由干扰素诱导的Mx1启动子等。通过使用由特定物质诱导的启动子，能够根据癌症的治疗经过对被启动子转录调控的基因(例如，编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的基因、编码IL-7的基因以及编码CCL19的基因中的一个以上)的表达进行调控。
作为上述病毒载体的例子，可以举出逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体。作为逆转录病毒载体，可以举出pMSGV载体(Tamada K.et al.,ClinCancer Res 18：6436-6445(2002))、pMSCV载体(宝生物公司制)等。如果使用逆转录病毒载体，则导入基因被宿主细胞的基因组摄取，因此长期且稳定地表达导入基因成为可能。
免疫应答细胞中特异性识别癌抗原的细胞表面分子、IL-7以及CCL19的表达可以通过流式细胞仪、ELISA、蛋白质免疫印迹法(Western blotting)等进行确认。另外，对这些进行编码的基因的导入，可以如上所述确认表达产物，或者，可以通过Northern印迹法、Southern印迹法、RT-PCR等PCR等进行确认。在用于基因导入的载体含有标记基因的情况下，可以通过调查插入到该表达载体中的标记基因的表达来确认基因的导入。
另外，本公开涉及的免疫应答细胞A，为了使细胞凋亡诱导成为可能，可以进一步表达单纯疱疹病毒的胸腺激酶(HSV-TK)、诱导性胱天蛋白酶9(inducible caspase 9)等自杀基因。这些酶的基因也可以通过与上述相同的方法导入免疫应答细胞内(例如，免疫应答细胞的基因组内)。例如，可以使携带编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的基因、编码IL-7的基因、以及编码CCL19的基因中的一种以上的载体、或与该载体不同的载体中包含编码自杀基因的核酸，向免疫应答细胞导入。
自杀基因是指通过表达而直接或继发地诱导具有细胞毒性的物质，从而具有使表达自杀基因的细胞死亡的功能的基因。通过使免疫应答细胞包含编码自杀基因的核酸，可以根据癌症的治疗经过，例如在肿瘤消失情况下施以使自杀基因的功能活化的药剂的给药，可以减少或除去在活体内存在的本公开涉及的免疫应答细胞A。
作为自杀基因，可以举出在以下的文献中记载的对单纯疱疹病毒的胸腺激酶(HSV-TK)、诱导性胱天蛋白酶9(inducible caspase 9)进行编码的基因等，作为使该基因的功能活化的药剂，对于前者可以举出更昔洛韦，对于后者可以举出作为二聚体诱导化合物(chemical induction of dimerization：CID)的AP1903(Cooper LJ.,et.al.Cytotherapy.2006；8(2)：105-17.,Jensen M.C.et.al.Biol Blood MarrowTransplant.2010Sep；16(9)：1245-56.,Jones BS.Front Pharmacol.2014Nov 27；5：254.,Minagawa K.,Pharmaceuticals(Basel).2015May 8；8(2)：230-49.,Bole-Richard E.,Front Pharmacol.2015Aug 25；6：174)。
<免疫抑制阻断剂>
免疫抑制阻断剂是指解除或者减少免疫应答细胞活化的抑制的物质。就免疫应答细胞活化的抑制而言，例如通过调节性T细胞(Treg)与树突状细胞结合所致的细胞毒性T细胞或者辅助性T细胞与树突状细胞的结合的阻断；通过Treg分泌TGF-β、IL-10等抑制性细胞因子、穿孔素、颗粒酶等细胞毒性物质等所致的细胞毒性T细胞、辅助性T细胞等的活化阻断；PD-1和PD-L1的相互作用、CTLA-4和CD80/CD86的相互作用等所致的免疫检查点导致的细胞毒性T细胞的活化抑制等而产生。免疫抑制阻断剂是解除针对免疫应答细胞活化的上述等的抑制、使免疫应答细胞活化成为可能的物质。
作为免疫抑制阻断剂的例子，可以举出免疫检查点阻断剂、阻断Treg、源自骨髓的免疫抑制细胞(MDSC)等免疫抑制性细胞的浸润、生存、或者功能的分子靶向药物、CCR4阻断剂、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)阻断剂、前列腺素E2[PGE2]抑制剂、细胞毒性抗癌剂。免疫抑制阻断剂只要具有这些功能，可以是抗体，例如可以是IgG单克隆抗体或者抗体片段。
就免疫检查点阻断剂而言，典型的是使由在T细胞的表面表达的免疫检查点分子介导的免疫抑制机制被解除或者减轻的物质。免疫检查点阻断剂例如与免疫检查点分子(例如PD-1、CTLA-4、BTLA、TIM-3、TIGIT、LAG-3等)或者免疫检查点分子的配体(例如PD-L1、PD-L2、CD80/CD86、Siglec-15等)结合，阻断通过配体启动来自免疫检查点分子的信号传递，由此可以减少针对免疫应答的抑制反应。
阻断Treg、MDSC等免疫抑制性细胞的浸润、生存、或者功能的分子靶向药物，例如通过阻断酪氨酸激酶，使向癌组织内浸润的Treg减少，从而可以使减轻癌症微环境中的免疫抑制。
CCR4阻断剂可以通过阻断趋化因子受体CCR4召集Treg的作用来减轻癌症微环境中的免疫抑制。
IDO阻断剂可以通过阻断IDO的酶活性或者抑制IDO的表达自体来抑制犬尿氨酸的产生，减少通过犬尿氨酸进行的Treg活化。
PGE2抑制剂可以通过抑制PGE2与位于Treg表面的前列腺素EP4受体结合而使Treg的免疫抑制作用上升，减轻癌症微环境中的免疫抑制。
细胞毒性抗癌剂可以通过减少Treg等免疫抑制细胞的数量，减少针对免疫应答的抑制。
作为免疫检查点阻断剂的例子，可以举出PD-1阻断剂、PD-L1阻断剂、CTLA-4阻断剂、CD47阻断剂、SIRPα阻断剂、BTLA阻断剂、TIM-3阻断剂、TIGIT阻断剂、LAG-3阻断剂、Siglec-15阻断剂、半乳糖凝集素-9阻断剂等。作为阻断Treg、MDSC等免疫抑制性细胞的浸润、生存、或者功能的分子靶向药物的例子，可以举出索拉非尼(Sorafenib)、舒尼替尼(Sunitinib)等。作为CCR4阻断剂的例子，可以举出抗CCR4抗体(例如莫格利珠单抗(Mogamulizumab))等。作为IDO阻断剂的例子，可以举出Epacadostat等。作为前列腺素E2[PGE2]抑制剂的例子，可以举出阿司匹林等。作为细胞毒性抗癌剂的例子，可以举出环磷酰胺、吉西他滨(Gemcitabine)等。
免疫抑制阻断剂可以包含从由PD-1阻断剂、PD-L1阻断剂、PD-L2阻断剂、CTLA-4阻断剂、BTLA(B-and T-lymphocyte attenuator)阻断剂、TIM-3(T-cell immunoglobulinand mucin domain 3)阻断剂、TIGIT(T-cell immunoreceptor with Ig and ITIMdomains)阻断剂、LAG-3(Lymphocyte Activation Gene-3)阻断剂、以及Siglec-15阻断剂构成的组中选择的一种以上。
本公开涉及的组合医药A中的免疫抑制阻断剂，可以是免疫检查点阻断剂，更具体地可以是PD-1阻断剂或者PD-L1阻断剂，进一步具体的可以是针对PD-1的抗体或者针对PD-L1的抗体。作为针对PD-1的抗体的例子，可以举出Nivolumab(纳武单抗)、Pembrolizumab(派姆单抗)、Toripalimab(特瑞普利单抗)、Cemiplimab-rwlc(西米普利单抗)、Sintilimab(信迪利单抗)等。作为针对PD-L1的抗体的例子，可以举出Atezolizumab(阿特珠单抗)、Durvalumab(德瓦鲁单抗)、Avelumab(阿维鲁单抗)等。作为针对CTLA-4的抗体的例子，可以举出Ipilimumab(伊匹单抗)等。此外还可以举出针对CD47、SIRPα的抗体等。
在本公开涉及的组合医药A中，除了由本公开涉及的免疫应答细胞A表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子之外，还使IL-7以及CCL19得以表达，进而通过包含免疫抑制阻断剂，认为发挥下述效果：不仅发挥由特异性识别癌抗原的细胞表面分子所致的癌症抑制效果，还通过IL-7、CCL19以及免疫抑制阻断剂的组合减轻癌症微环境中的免疫抑制性，进而内源性的细胞毒性T细胞等被诱导向癌细胞周边并活化。因此，通过本公开涉及的组合医药A，可以带来在单独施以本公开涉及的免疫应答细胞A的给药而未施以免疫抑制阻断剂的给药的情况下或在虽表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子但未表达IL-7以及CCL19的免疫应答细胞和免疫抑制阻断剂被共同给药的情况下无法达成的提高癌症治疗效果。
癌症治疗效果可以通过例如哺乳动物、例如作为人的对象的肿瘤细胞的数量减少、肿瘤的尺寸减少、肿瘤的消失、肿瘤负荷的减少等来进行评价。
免疫抑制阻断剂由于将癌周围的免疫抑制性的微环境中的免疫应答细胞的一般作用活化，所以不仅提高本公开涉及的免疫应答细胞A的癌细胞攻击活性，而且还提高内源性的免疫应答细胞的癌细胞攻击活性。因此，免疫抑制阻断剂即使为例如以特定的分子为靶的免疫检查点阻断剂，本公开涉及的免疫应答细胞A没有必要在细胞表面上表达该靶分子，可以表达靶分子，也可以不表达。
在本公开中，用语“抗体”不仅指完全的抗体分子，还可以指保持对抗原的结合能力的抗体分子的片段。这样的抗体片段在本技术领域也是公知的，通常在体外(in vitro)以及在体内(in vivo)双方都可以使用。因此，当本说明书中使用时，用语“抗体”不仅指完全的免疫球蛋白分子，还至也包含作为公知的抗体功能片段的F(ab’)2以及Fab的概念。本公开中，抗体也包含完全的天然抗体、双特异性抗体、嵌合抗体、Fab、Fab’、单链抗体(scFv)、融合多肽、以及非常规型的抗体。
在本公开中，单链抗体(scFv)是以形成VH：：VL异二聚体形式共价结合的免疫球蛋白的重链(VH)以及轻链(VL)的可变区的融合蛋白质。重链(VH)以及轻链(VL)直接结合，或者，VH的N末端和VL的C末端通过肽连接体结合，或VH的C末端和VL的N末端通过肽连接体结合。肽连接体的长度例如为10个氨基酸、15个氨基酸、20个氨基酸、或者25个氨基酸。肽连接体通常富含有助于柔软性的甘氨酸、以及有助于溶解性的丝氨酸或苏氨酸。尽管除去恒定区且导入了肽连接体，scFv蛋白质维持了原始免疫球蛋白所具有的向抗原的结合特异性。Huston等(如Proc.Nat.Acad.Sci.USA,85：5879-5883,1988)所记载的那样，scFv可以从包含VH编码序列以及VL编码序列的核酸来表达。关于scFv，也可以参考美国专利第5,091,513号、第5,132,405号、以及第4,956,778号；以及美国专利公开第20050196754号以及20050196754号。
作为免疫检查点阻断剂的抗体，只要具有规定的抗原结合性，可以是IgG单克隆，也可以是Fab片段，也可以是scFv，也可以是除此以外的抗体或者抗体片段。scFv例如可以通过制作小鼠杂交瘤克隆然后将完全IgG(或者IgM)转换为scFv的方法、制作被免疫的噬菌体展示scFv然后其抗原对库进行筛选的方法、使用抗原筛选现成的scFv噬菌体展示库而直接获得scFv的方法等来获得。
由人以外的动物(例如小鼠)得到的抗体，有可能在对人给药的情况下引起免疫应答，所以可以变成将抗体的不变部分的基因重组为人抗体基因而制作的嵌合抗体、将互补性决定区域(CDR)以外的部分重组为人抗体基因而制作的人源化抗体。另外，可以使用噬菌体展示或者产生人抗体的基因改变小鼠得到完全人源化抗体，而不是使小鼠等产生抗体。
<给药用组合物>
就本公开涉及的组合医药A而言，包含本公开涉及的免疫应答细胞A的给药用组合物(以下也称为第一给药用组合物)可以进一步含有药学上可接受的添加剂，作为上述添加剂，可以举出生理盐水、缓冲生理盐水、细胞培养基、葡萄糖、注射用水、甘油、乙醇以及它们的组合、稳定剂、增溶剂、表面活性剂、缓冲剂、防腐剂、等渗剂、填充剂、以及润滑剂。
就本公开涉及的组合医药A而言，包含免疫抑制阻断剂的给药用组合物(以下也称为第二给药用组合物)可以进一步含有药学上可接受的添加剂，作为上述添加剂，可以举出生理盐水、缓冲生理盐水、细胞培养基、葡萄糖、注射用水、甘油、乙醇以及它们的组合、稳定剂、增溶剂、表面活性剂、缓冲剂、防腐剂、等渗剂、填充剂、以及润滑剂。
需要说明的是，第二给药用组合物，可以是与第一给药用组合物相同的组合物，此时一种给药用组合物可以包含本公开涉及的免疫应答细胞A和免疫抑制阻断剂双方。
在第二给药用组合物是与第一给药用组合物不同的组合物的情况下，如后所述，第一给药用组合物和第二给药用组合物可以一起给药，也可以在各自的时间(时间点)给药。也就是说，本公开涉及的免疫应答细胞A和免疫抑制阻断剂可以一起给药，也而可以在不同时间点分别给药。
第一给药用组合物中所含的本公开涉及的免疫应答细胞A的量可以根据癌症的种类、位置、重症度、接受治疗的对象的年龄、体重以及状态等适当调整，每次给药例如可以给药1×104～1×1011个、更具体为1×105～1×1010个、更具体为1×106～1×109个。另外，关于本公开涉及的免疫应答细胞A的量可以为少量，每次给药低于1×106个、例如1×105～5×105个、更具体为1.5×105～4×105个。
如上所述，在单独使用本公开涉及的免疫应答细胞A的情况下，以及在单独使用免疫抑制阻断剂的情况下，即便是治疗困难的癌症治疗的情况，只要使用本公开涉及的组合医药A就可以治疗。因此，就第一给药用组合物所含的本公开涉及的免疫应答细胞A的量而言，可以是在单独以相同量(相同细胞数)使用本公开涉及的免疫应答细胞A的情况下不会发挥抗癌效果的少量。通过与免疫抑制阻断剂的协同效果，只要是能够发挥抗癌效果的量，免疫应答细胞A的量的下限值没有特别限制。
第一给药用组合物可以以1天4次、1天3次、1天2次、1天1次、每隔1天、每隔2天、每隔3天、每隔4天、每隔5天、1周1次、每隔7天、每隔8天、每隔9天、1周2次、1月1次或者1月2次的频度给药。另外，给药次数总计可以为例如1次～10次、即1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次或者10次，但也可以给药超过10次。
第二给药用组合物中所含的免疫抑制阻断剂的量可以根据癌症的种类、位置、重症度、接受治疗的对象的年龄、体重以及状态等适当调整，每次给药的免疫抑制阻断剂的用量例如可以为0.1～500mg/kg、更具体为0.5～250mg/kg、更具体为1～100mg/kg。
第二给药用组合物可以以1天4次、1天3次、1天2次、1天1次、每隔1天、每隔2天、每隔3天、每隔4天、每隔5天、1周1次、每隔7天、每隔8天、每隔9天、1周2次、1月1次或者1月2次的频度给药。另外，给药次数总计可以为例如1次～30次、即1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、或者11次～30次，但也可以给药超过30次。
第一给药用组合物的给药时间和第二给药用组合物的给药时间的关系没有特别限定，可以先开始第一给药用组合物的给药，也可以先开始第二给药用组合物的给药，或者可以同时开始第一给药用组合物和第二给药用组合物的给药。关于各自的给药用组合物的给药次数、给药频度之间的关系，没有特别限定。
第一给药用组合物和第二给药用组合物可以是相同的组合物，此时，提供包含本公开涉及的免疫应答细胞A和免疫抑制阻断剂双方的医药组合物(合剂)。在本公开涉及的组合医药A中的第一给药用组合物和第二给药用组合物是不同组合物的情况下，第一给药用组合物和第二给药用组合物可以同时给药，也可以在不同的时间(也就是隔开间隔)给药。不过，从有效获得本公开涉及的免疫应答细胞A和免疫抑制阻断剂的协同效果的观点出发，第一给药用组合物的给药时间和第二给药用组合物的给药时间之间的间隔(一种给药用组合物的给药时间、和与其时间最接近的另一种给药用组合物的给药时间之间的间隔)，可以为三个月以内、两个月以内、一个月以内、两周以内。上述间隔可以为一周以内，还可以为三天以内，但如后述的实施例所示，本公开涉及的免疫应答细胞A在活体内长时间维持，所以无需使上述间隔极短。
如此就本公开涉及的组合医药A而言，本公开涉及的免疫应答细胞A和免疫抑制阻断剂可以在独立的时间(例如不同时间)给药。另外，在本公开中，用语“共同给药”以及“并用”包括：多种药剂含于同一组合物而给药的情况、多种药剂含于不同组合物并同时给药的情况下，多种药剂含于不同组合物并于不同时间点给药的情况的任意情况。
如上所述，本公开涉及的组合医药A，通过由对特异性识别癌抗原的细胞表面分子进行表达的免疫应答细胞、所分泌的IL-7以及CCL19、以及免疫抑制阻断剂组成的因子的组合所致的协同效果，可以发挥改善程度令人吃惊的癌症治疗效果。
第一给药用组合物，可以使用本领域技术人员已知的方法对需要治疗癌症的对象给药，例如可以通过局部注射(包含导管给药)、全身注射、静脉内注射或者非经口给药(例如经皮给药、经粘膜给药，更具体为点鼻、点眼、舌下、栓剂、贴剂等)进行给药。第一给药用组合物从处理的观点出发被配制成可注射单位给药量的形态(溶液、悬浮液、乳剂)。作为给药方法的更具体的例子，可以举出向静脉内、肿瘤内、皮内、皮下、肌肉内、腹腔内、动脉内、髓内、心脏内、关节内、滑膜囊内、颅内、鞘内、以及蛛网膜下腔(髓液)的注射。
第二给药用组合物可以使用本领域技术人员已知的方法对需要治疗癌症的对象给药，例如，可以通过经口给药、局部注射(包含导管给药)、全身注射、静脉内注射或者非经口给药(例如经皮给药、经粘膜给药，更具体为点鼻、点眼、舌下、栓剂、贴剂等)进行给药。第二给药用组合物从处理的观点出发被配制成可注射单位给药量的形态(溶液、悬浮液、乳剂)。作为给药方法的更具体的例子，可以举出向静脉内、肿瘤内、皮内、皮下、肌肉内、腹腔内、动脉内、髓内、心脏内、关节内、滑膜囊内、颅内、鞘内、以及蛛网膜下腔(髓液)的注射。
本公开涉及的免疫应答细胞A，从治疗对象的患者获得原始免疫应答细胞或者其前体细胞，从治疗对象的患者获得本公开涉及的免疫应答细胞A所必需的基因之后，可以对相同患者给药(自体给药)，或者可以对不同的患者给药(异体给药)。或者，原始免疫应答细胞或者其前体细胞可以从iPS细胞、ES细胞等多能性干细胞或者造血干细胞等体性干细胞来制作。
第一给药用组合物以及第二给药用组合物，例如可以作为被缓冲成规定pH的无菌的液体制剂、例如等渗水溶液、悬浮液、乳剂、分散物或者粘性组合物进行给药。上述液体制剂可以是注射用的液体制剂。另外，为了延长与特定组织的接触时间，可以使上述液体制剂为具有合适的粘度范围内的粘度的粘性组合物的形态。液体制剂例如可以包含溶剂或者分散介质，该溶剂或者分散介质包含水、生理盐水、磷酸盐缓冲生理盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)以及它们的混合物。
上述液体制剂可以通过将本公开涉及的免疫应答细胞A和/或免疫抑制阻断剂，和各种量的其他成分一起在适量的合适溶剂中配合而制备。上述液体制剂可以包含合适的担体、稀释剂、或者赋形剂(Excipient)。上述液体制剂另外可以被冻干。液体制剂可以进一步包含各种辅助物质，这取决于所需的给药路径，作为辅助物质的例子，可以举出润湿剂、分散剂或者乳化剂(例如甲基纤维素)、pH缓冲剂、胶凝剂或者增粘添加剂、保存剂、矫味剂、着色剂等。关于液体制剂中可以包含的成分，也可以参考“REMINGTON’S PHARMACEUTICALSCIENCE”，17版、1985的记载。
另外，液体制剂可以进一步包含提高液体制剂的稳定性以及无菌性的各种添加剂，作为其例子，可以举出抗菌性保存剂、抗氧化剂、螯合剂、以及缓冲剂等。为了防止微生物的作用，可以使用各种抗菌剂以及抗真菌剂、例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸等。用于液体制剂的媒介物(Vehicle)、稀释剂或者添加剂，必须与其中所含的本公开涉及的免疫应答细胞A和/或免疫抑制阻断剂具有相容性。
液体制剂可以与血液是等渗。等渗可以通过使液体制剂含有氯化钠、或者其他的药学上可接受的浸透压调节物质(例如葡萄糖、硼酸、酒石酸钠、丙二醇、或其他的无机溶质或者有机溶质等)来达成。
本公开涉及的组合医药A，除了包含本公开涉及的免疫应答细胞A以及免疫抑制阻断剂之外，进而还包含其他的抗癌剂。作为其他的抗癌剂的例子，可以举出苯达莫司汀、异环磷酰胺、达卡巴嗪等烷化剂、喷司他丁、氟达拉滨、克拉屈滨、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、依诺他滨等代谢拮抗药、利妥昔单抗、西妥昔单抗、曲妥单抗等分子靶向药、伊马替尼、吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼、达沙替尼、舒尼替尼、曲美替尼等激酶阻断剂、硼替佐米等蛋白酶体阻断剂、环孢菌素、他克莫司等钙调神经磷酸酶阻断剂、伊达比星、多柔比星、丝裂霉素C等抗癌性抗生素、依立替康、依托泊苷等植物生物碱、顺铂、奥沙利铂、卡铂等铂制剂、他莫昔芬、比卡鲁胺等激素疗法药、干扰素等免疫调控药。其他的抗癌剂例如可以包含烷化剂以及代谢拮抗药中的至少一种。
<使用本公开涉及的组合医药A的癌症治疗>
在将本公开涉及的组合医药A用于治疗癌症的情况下，治疗的对象例如是任意的哺乳动物即可，例如是灵长类的动物，更具体可以为人。治疗对象可以是宠物或者家畜，作为其例子，可以举出狗、猫、猪、牛、马、绵羊、山羊等。
成为治疗对象的癌症可以是实体癌，还可以是血癌，除了腺癌、鳞癌、腺鳞癌、未分化癌、大细胞癌、小细胞癌、皮肤癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、阴道癌、宫颈癌、宫体癌、肝癌、肾癌、胰腺癌、脾癌、肺癌、气管癌、支气管癌、结肠癌、小肠癌、胃癌、食管癌、胆囊癌、睾丸癌、卵巢癌等癌、骨组织、软骨组织、脂肪组织、肌肉组织、血管组织和造血组织的癌之外，还可以举出软骨肉瘤、尤文氏肉瘤、恶性血管内皮瘤、恶性神经鞘瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤等肉瘤、肝母细胞瘤、髓母细胞瘤、肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、胰母细胞瘤、胸膜肺母细胞瘤、视网膜母细胞瘤等母细胞瘤、胚细胞肿瘤、淋巴瘤、白血病。
通过本公开涉及的组合医药A，可以减轻癌症微环境中的免疫抑制性，成为治疗对象的癌症不限于血液系统的癌症，对实体癌也有治疗效果。因此，对于用以往的方法难以治疗的实体癌也发挥高有效性。
本公开涉及的组合医药A，在确诊为癌症之前，甚至是怀疑有对象内的癌细胞存在的状况下，向对象施以预防给药。在本公开中，这样的使用形态也包含在用于治疗癌症的使用的概念中。
<对象中的癌症的治疗方法>
根据本公开涉及的一个方式，提供一种治疗对象中的癌症的方法(以下也称为本公开涉及的癌症的治疗方法A)，其包含组合下述(a)和(b)向对象给药，
(a)特异性识别癌抗原的细胞表面分子、IL-7、以及表达CCL19的免疫应答细胞；以及
(b)免疫抑制阻断剂。
在这里，本公开涉及的癌症的治疗方法A中的免疫应答细胞是本公开涉及的免疫应答细胞A，关于其构成以及例子等，如有关本公开涉及的免疫应答细胞A的上述说明所述。另外，关于本公开涉及的癌症的治疗方法A中的免疫抑制阻断剂的详细构成以及例子，如本公开涉及的组合医药A中的免疫抑制阻断剂的上述说明所述。
除此之外，关于本公开涉及的癌症的治疗方法A中的对象、癌症的种类、用量、给药计划等、治疗方法的详细内容，也如前述的本公开涉及的组合医药A的说明所述。例如，可以同时施以(a)的免疫应答细胞和(b)的免疫抑制阻断剂的给药，还可以在不同的时间点给药。另外，(a)的免疫应答细胞和(b)的免疫抑制阻断剂均可以以治疗有效量施以给药。
本公开涉及的癌症的治疗方法A通过由对特异性识别癌抗原的细胞表面分子、IL-7以及CCL19进行表达的免疫应答细胞、以及免疫抑制阻断剂组成的因子的组合所致的协同效果，可以发挥改善程度令人吃惊的癌症治疗效果。
进而，根据本公开，提供(a)表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子、IL-7以及CCL19的免疫应答细胞、以及(b)免疫抑制阻断剂在用于治疗癌症的医药的制造中的使用。就该使用而言，关于免疫应答细胞、免疫抑制阻断剂、给药用组合物、癌症的治疗等的详细内容，如前述的本公开涉及的组合医药A的说明所述。
除此之外，根据本公开，还提供与免疫抑制阻断剂并用来用于治疗对象中的癌症的、包含表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子、IL-7以及CCL19的免疫应答细胞的医药。包含本公开涉及的免疫应答细胞A的医药通过与免疫抑制阻断剂并用，产生协同效果，可以发挥改善程度令人吃惊的癌症治疗效果。关于免疫应答细胞、免疫抑制阻断剂、给药用组合物、癌症的治疗等的详细内容，如前述的本公开涉及的组合医药A的说明所述。进而，也提供与免疫抑制阻断剂并用来用于治疗对象中的癌症的、表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子、IL-7以及CCL19的免疫应答细胞。
进而，根据本公开，也提供与表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子、IL-7以及CCL19的免疫应答细胞并用来用于治疗对象中的癌症的、包含免疫抑制阻断剂的医药。包含免疫抑制阻断剂的医药通过本公开涉及的免疫应答细胞A并用，产生协同效果，可以发挥改善程度令人吃惊的癌症治疗效果。关于免疫应答细胞、免疫抑制阻断剂、给药用组合物、癌症的治疗等的详细内容，如前述的本公开涉及的组合医药A的说明所述。进而，也提供与表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子、IL-7以及CCL19的免疫应答细胞并用来用于治疗对象中的癌症的、免疫抑制阻断剂。
根据本公开，也提供由显示与免疫抑制阻断剂并用的容器收纳且包含表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子、IL-7以及CCL19的免疫应答细胞的医药。关于免疫应答细胞、免疫抑制阻断剂等的详细内容，如前述的本公开涉及的组合医药A的说明所述。另外，关于医药的构成的详细内容，如前述的第一给药用组合物的说明所述。显示与免疫抑制阻断剂并用的容器，可以是附有使用方法的显示的小瓶(vial)、静脉注射袋、细胞储存袋、输液袋等容器，也可以是艾本德(Eppendorf)管之类的容器。在这样的容器中，以例如前述的第一给药用组合物的说明中记载的状态收纳本公开涉及的免疫应答细胞A的医药。免疫抑制阻断剂并用的该显示可以附着在容器的任何面上，可以考虑辨识性而附着在容器的外表面。另外，显示可以不附于容器本身，还可以附着于进一步容纳一个或多个容器的箱子等的外壳。另外，与免疫抑制阻断剂并用的显示，不限于明确指示与免疫抑制阻断剂并用的显示，可以是言及与免疫抑制阻断剂并用的可能性的任意显示。
根据本公开，也提供包含记载有和免疫抑制阻断剂并用的药品说明书、和收纳有包含表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子、IL-7以及CCL19的免疫应答细胞的医药的容器的制品。关于免疫应答细胞、免疫抑制阻断剂等的详细内容，如前述的本公开涉及的组合医药A的说明所述。另外，关于医药的构成的详细内容，如前述的第一给药用组合物的说明所述。收纳有本公开涉及的免疫应答细胞A的容器，可以是附有使用方法的显示的小瓶、静脉注射袋、细胞储存袋、输液袋等容器，也可以是艾本德管之类的容器。在这样的容器中，以例如前述的第一给药用组合物的说明中记载的状态收纳本公开涉及的免疫应答细胞A的医药。另外，药品说明书中的与免疫抑制阻断剂并用的记载，不限于明确指示与免疫抑制阻断剂并用的记载，可以是言及与免疫抑制阻断剂的并用的可能性的任意记载。
如以上的说明所述，根据本公开涉及的一个方式，通过由表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子、IL-7以及CCL19的免疫应答细胞、以及免疫抑制阻断剂的组合所致的协同效果，可以得到改善程度令人吃惊的癌症治疗效果。
本公开涉及的实施方式包括以下的方式。
<1>一种组合医药，用于治疗对象中的癌症，包含：
(a)表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子、白细胞介素7以及CCL19的免疫应答细胞；以及
(b)免疫抑制阻断剂。
<2>如<1>所述的组合医药，其中，上述免疫应答细胞和上述免疫抑制阻断剂在不同时间点被分别给药。
<3>如<1>或者<2>所述的组合医药，其中，编码白细胞介素7的核酸以及编码CCL19的核酸为外源性，二者被整合到上述免疫应答细胞的基因组中，或者一起或个别由在上述免疫应答细胞中存在的一个或多个载体一起或个别编码。
<4>如<1>～<3>中任意一项所述的组合医药，其中，上述特异性识别癌抗原的细胞表面分子是嵌合抗原受体(CAR)或者T细胞受体(TCR)。
<5>如<1>～<4>中任意一项所述的组合医药，上述免疫抑制阻断剂包含从由PD-1阻断剂、PD-L1阻断剂、PD-L2阻断剂、CTLA-4阻断剂、BTLA(B-and T-lymphocyteattenuator)阻断剂、TIM-3(T-cell immunoglobulin and mucin domain 3)阻断剂、TIGIT(T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains)阻断剂、LAG-3(LymphocyteActivation Gene-3)阻断剂和Siglec-15阻断剂构成的组中选择的一种以上。
<6>如<1>～<5>中任意一项所述的组合医药，其中，上述免疫抑制阻断剂是抗体。
<7>如<6>所述的组合医药，其中，上述抗体是IgG单克隆抗体或者抗体片段。
<8>如<1>～<7>中任意一项所述的组合医药，其中，上述癌症是实体癌。
<9>如<1>～<8>中任意一项所述的组合医药，其中，上述免疫应答细胞是源自上述对象本身的免疫应答细胞。
<10>如<1>～<9>中任意一项所述的组合医药，其中，上述免疫应答细胞从由T细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)和B细胞等淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞等抗原呈递细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞以及肥大细胞构成的组中选择。
<11>一种医药，用于与免疫抑制阻断剂并用来治疗对象中的癌症，包含：
表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子、白细胞介素7以及CCL19的免疫应答细胞。
<12>一种医药，用于与表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子、白细胞介素7、以及CCL19的免疫应答细胞并用来治疗对象中的癌症，且包含免疫抑制阻断剂。
<13>如<11>或者<12>所述的医药，其中，以上述免疫抑制阻断剂和上述免疫应答细胞在不同时间点被分别给药的形态使用。
<14>一种医药，由显示与免疫抑制阻断剂并用的容器收纳，且包含表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子、白细胞介素7以及CCL19的免疫应答细胞。
<15>一种制品，包含：
记载有与免疫抑制阻断剂并用的药品说明书；和
收纳医药的容器，所述医药包含表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子、白细胞介素7以及CCL19的免疫应答细胞。
<16>一种医药组合物，用于治疗对象中的癌症，包含：
(a)表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子、白细胞介素7以及CCL19的免疫应答细胞；以及
(b)免疫抑制阻断剂。
<17>如<16>所述的医药组合物，上述特异性识别癌抗原的细胞表面分子是嵌合抗原受体(CAR)或者T细胞受体(TCR)。
<18>一种治疗对象中的癌症的方法，包含：
组合(a)表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子、IL-7以及CCL19的免疫应答细胞以及(b)免疫抑制阻断剂向对象给药。
<19>一种(a)表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子、IL-7以及CCL19的免疫应答细胞、以及(b)免疫抑制阻断剂在用于治疗癌症的医药的制造中的使用。
以下，对本公开涉及的另一方式进行说明。
根据本公开的一个方式，提供一种组合医药(以下也称为本公开涉及的组合医药B)，用于治疗对象中的癌症，包含：
(a)协同包含编码白细胞介素7的核酸以及编码CCL19的核酸的一种或多种细胞或者核酸递送介质或者它们的组合；以及
(b)免疫抑制阻断剂。
在这里，关于组合医药B中的白细胞介素7、CCL19、编码白细胞介素7的核酸、编码CCL19的核酸、以及免疫抑制阻断剂的定义、例子、氨基酸序列、碱基序列、优选的实施方式等的详细内容，与本公开涉及的免疫应答细胞A以及本公开涉及的组合医药A中的、白细胞介素7、CCL19、编码白细胞介素7的基因、编码CCL19的基因、以及免疫抑制阻断剂的定义、例子、氨基酸序列、碱基序列、优选的实施方式等的详细内容分别相同。
另外，在本公开中，“协同包含”是指在有多种要素(例如多种细胞、多种核酸递送介质、或者一个以上的细胞以及一个以上的核酸递送介质)存在的情况下，作为所含的对象示出的物质(例如编码特定多肽的核酸)含于上述多种要素中至少一种，没有必要是上述多种要素的全部都包含该物质。也就是说，“协同包含”也可以表述成“整体上包含”。另外，“协同包含”的意思的范围也包含作为所含的对象示出的多种物质的全部含于单一的细胞或者核酸递送介质中的情况，这样的构成也是优选的构成之一。
因此，关于本公开涉及的组合医药B，在包含细胞I以及细胞II的情况下，可以是细胞I包含编码白细胞介素7的核酸但不含编码CCL19的核酸、细胞II包含编码CCL19的核酸但不含编码白细胞介素7的核酸的构成。同样地，关于本公开涉及的组合医药B，在包含核酸递送介质I以及核酸递送介质II的情况下，可以是核酸递送介质I包含编码白细胞介素7的核酸但不含编码CCL19的核酸、核酸递送介质II包含编码CCL19的核酸但不含编码白细胞介素7的核酸的构成。
或者，本公开涉及的组合医药B，可以包含包含编码白细胞介素7的核酸以及编码CCL19的核酸二者的单一的细胞或者核酸递送介质。
进而，“协同包含编码白细胞介素7的核酸以及编码CCL19的核酸的一种或多种细胞或者核酸递送介质或者它们的组合”中的“它们的组合”表示一种或多种细胞与一种或多种核酸递送介质的组合，表示编码白细胞介素7的核酸含于这些一种或多种细胞以及一种或多种核酸递送介质中的至少一种中、编码CCL19的核酸含于这些一种或多种细胞以及一种或多种核酸递送介质中的至少一种中的组合。
进而，在本公开中，多肽一般是指氨基酸残基以肽键连结而成的聚合物，所谓的蛋白质也含在其例子中。多肽的氨基酸残基数可以为10个以上，也可以为20个以上，也可以为30个以上，也可以为40个以上，也可以为50个以上，也可以为70个以上，也可以为100个以上。氨基酸残基数的上限值没有特别限制，但氨基酸残基数可以为10000个以下，也可以为5000个以下，也可以为2000个以下，也可以为1000个以下，也可以为500个以下，也可以为200个以下，也可以为100个以下，也可以为70个以下，也可以为50个以下，也可以为40个以下，也可以为30个以下，也可以为20个以下。上述的下限值和上限值，只要不产生矛盾，可以自由组合形成范围。
就本公开涉及的组合医药B而言，细胞只要是可以表达作为含有对象而言及的核酸(例如编码白细胞介素7的核酸和/或编码CCL19的核酸)的细胞，就没有特别限定。细胞优选为在已被导入到体内的情况下在癌细胞周边集聚或浸润的细胞。在作为含有对象而言及的核酸在一个细胞内存在两个以上的情况下，在该细胞内，这些核酸可以在分别独立地整合到基因组中的状态或者被质粒携带的状态下包含，或在彼此连结而整合到基因组的状态或者被质粒携带的状态下包含。作为上述细胞的例子，可以举出免疫应答细胞、厌氧菌的细胞、以及间充质干细胞(MSC)。
就本公开涉及的组合医药B而言，核酸递送介质只要是可以将作为含有对象而言及的核酸(例如编码白细胞介素7的核酸和/或编码CCL19的核酸)递送到细胞中并使其表达的核酸递送介质，就没有特别限定。该细胞优选为人的细胞，更优选为人的体内的细胞，进一步优选为人体内的癌细胞或者免疫应答细胞。也就是说，核酸递送介质优选为在已被导入到体内的情况下向癌细胞内或者免疫应答细胞内递送核酸的核酸递送介质。
作为上述核酸递送介质的例子，可以举出病毒、脂质体以及纳米粒子。按照常规方法使用本领域公知的介质作为核酸递送介质即可。作为核酸递送介质，也可以使用病毒载体。
当作为含有对象而言及的核酸在一个核酸递送介质内存在两个以上时，就该核酸递送介质内而言，它们的核酸可以在分别独立的状态下包含，或在彼此连结的状态下包含。
癌细胞由于具有抑制免疫应答细胞攻击癌细胞或抑制发出攻击癌细胞的指示的免疫抑制机制，因此癌症患者本身的免疫所致的对癌细胞的攻击受到抑制。作为本公开涉及的组合医药B的构成要素之一的免疫抑制阻断剂，通过阻断由癌细胞所致的免疫抑制机制，认为可以更容易地使癌症患者的免疫系统攻击癌细胞。
除了这些之外，协同包含编码白细胞介素7的核酸以及编码CCL19的核酸的一种或多种细胞或者核酸递送介质或者它们的组合，在癌症组织的附近表达IL-7，或者向细胞(典型的是体内的细胞)进行核酸递送并使IL-7表达，进而表达CCL19，或者向细胞(典型的是体内的细胞)进行核酸递送并使CCL19表达，由此癌症患者的内源性的免疫应答细胞向癌细胞的周围集聚，认为更有效攻击癌细胞成为可能。从这一点出发，优选成为核酸递送的对象的细胞是体内的癌细胞。
本公开涉及的组合医药B，通过包含免疫抑制阻断剂和协同包含编码白细胞介素7的核酸以及编码CCL19的核酸的一种或多种细胞或者核酸递送介质或者它们的组合，发挥由所表达的IL-7以及CCL19、以及免疫抑制阻断剂构成的因子的组合所致的协同效果，为此，可以发挥大幅改善的癌症治疗效果。该协同效果是无法根据各因子的个别的效果预测到的优异效果。
在某实施方式中，组合医药B中的上述一种或多种细胞或者核酸递送介质，向免疫应答细胞等癌细胞以外的细胞进行核酸递送。在该实施方式中，本公开涉及的组合医药B中上述一种或多种细胞或者核酸递送介质或者它们的组合，可以进一步包含对特异性识别癌抗原的细胞表面分子进行编码的核酸。此时，包含对特异性识别癌抗原的细胞表面分子进行编码的核酸的细胞或者核酸递送介质，可以包含或不含编码白细胞介素7的核酸，也可以包含或不含编码CCL19的核酸。也就是说，就本公开涉及的组合医药B中上述一种或多种细胞或者核酸递送介质或者它们的组合而言，在进一步包含对特异性识别癌抗原的细胞表面分子进行编码的核酸的情况下，上述一种或多种细胞或者核酸递送介质或者它们的组合，协同(换言之，作为整体)包含编码白细胞介素7的核酸、编码CCL19的核酸、以及编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的核酸即可。
就本公开涉及的组合医药B中上述一种或多种细胞或者核酸递送介质或者它们的组合而言，在递送核酸的细胞中，通过进一步表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子，可以更加增加癌症治疗效果。例如，在使核酸递送介质包含对特异性识别癌抗原的细胞表面分子进行编码的核酸的情况下，将该核酸递送介质向对象给药，向对象的体内的T细胞导入上述核酸，由此在该T细胞中细胞表面分子得以表达。
在某实施方式中，组合医药B中的上述一种或多种细胞或者核酸递送介质，为了向癌细胞递送核酸，在其表面具有特异性识别癌细胞的分子。关于特异性识别癌细胞的分子的例子以及优选的实施方式等的详细内容，与特异性识别癌细胞的细胞表面分子的例子以及优选的实施方式等的详细内容相同。
在组合医药B中的上述一种或多种细胞或者核酸递送介质是“细胞”的情况下，例如，将编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的核酸导入该细胞，在施以组合医药B的给药前进行培养，由此可以在其表面表达特异性识别癌抗原的scFv等。
在组合医药B中的上述一种或多种细胞或者核酸递送介质是“病毒”的情况下，例如，将编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的核酸整合到病毒基因组，转染到合适的细胞，使病毒产生、增殖，由此可以在其表面表达特异性识别癌抗原的scFv等。可以在病毒的包膜或者衣壳中包含scFv等抗体，例如，在使用疱疹病毒的情况下，负责疱疹病毒的侵袭的包膜糖蛋白质gD无法与原始受体结合，从可以向该包膜糖蛋白质gD插入特异性识别癌抗原的scFv等抗体。
另外，在组合医药B中上述一种或多种细胞或者核酸递送介质是脂质体、纳米粒子等时，可以预先使特异性识别癌细胞的分子提高公知的方法或者基于此的方法结合到表面。
在这里，关于特异性识别癌抗原的细胞表面分子、以及编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的核酸的定义、例子、氨基酸序列、碱基序列、优选的实施方式等的详细内容，与本公开涉及的免疫应答细胞A以及本公开涉及的组合医药A中的特异性识别癌抗原的细胞表面分子、以及编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的基因的定义、例子、氨基酸序列、碱基序列、优选的实施方式等的详细内容分别相同。
编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的核酸，优选含于免疫应答细胞中。换言之，本公开涉及的组合医药B中的上述一种或多种细胞或者核酸递送介质或者它们的组合，优选包含免疫应答细胞，该免疫应答细胞包含编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的核酸。该免疫应答细胞可以包含或不含编码白细胞介素7的核酸，也可以包含或不含编码CCL19的核酸。特异性识别癌抗原的细胞表面分子，优选是特异性识别癌抗原的T细胞受体(TCR)、特异性识别癌抗原的嵌合抗原受体(CAR)等通过细胞表面表达来对细胞赋予针对癌症的特异性识别能力的分子。
因此，在某实施方式中，也可以说本公开涉及的组合医药B能与使用了CAR-T或者TCR-T的处置并用。
在一个实施方式中，上述协同包含编码白细胞介素7的核酸以及编码CCL19的核酸的一种或多种细胞或者核酸递送介质或者它们的组合可以包含表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子、白细胞介素7以及CCL19的免疫应答细胞。另外，免疫抑制阻断剂可以是细胞所表达的免疫抑制阻断性多肽，本公开涉及的组合医药B可以包含对免疫抑制阻断性多肽进行表达的细胞。作为该细胞的例子，可以举出作为协同包含编码白细胞介素7的核酸以及编码CCL19的核酸的一种或多种细胞或者核酸递送介质或者它们的组合中的细胞的例子而如后所述的细胞。或者，使其包含包含对免疫抑制阻断性多肽进行编码的核酸的核酸递送介质代替本公开涉及的组合医药B中的免疫抑制阻断剂，也包含在本公开涉及的实施方式的范畴之中。该核酸递送介质可以是与包含其他核酸的核酸递送介质相同的核酸递送介质，也可以是不同的核酸递送介质。
因此，根据本公开的在某实施方式，上述免疫抑制阻断剂是多肽，上述细胞或者核酸递送介质或它们的组合进一步协同包含对免疫抑制阻断剂多肽进行编码的核酸。
另外，就本公开涉及的组合医药B而言，在包含对免疫抑制阻断性多肽进行表达的细胞、和表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子、白细胞介素7以及CCL19的免疫应答细胞的情况下，这些可以是相同的细胞，也可以是不同的细胞。在对免疫抑制阻断性多肽进行表达的细胞和表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子、白细胞介素7以及CCL19的免疫应答细胞是相同免疫应答细胞的情况下，本公开涉及的组合医药B通过包含该免疫应答细胞，可以包含免疫抑制阻断剂以及协同包含编码白细胞介素7的核酸以及编码CCL19的核酸的一种或多种细胞或者核酸递送介质或者它们的组合。当然，就免疫抑制阻断剂而言，作为与协同包含编码白细胞介素7的核酸以及编码CCL19的核酸的一种或多种细胞或者核酸递送介质或者它们的组合独立的成分，可以含于本公开涉及的组合医药B。换言之，并非由上述一种或多种细胞或者核酸递送介质或者它们的组合表达的物质，可以作为单独添加的物质含于本公开涉及的组合医药B中。
如上所述，本公开涉及的组合医药B中的细胞或者核酸递送介质或者其组合，可以是从由免疫应答细胞、病毒、厌氧菌、脂质体、间充质干细胞(MSC)、以及纳米粒子构成的组中选择的至少一种，可以混合使用从上述这些中选择的多种。
在这里，免疫应答细胞只要是参与免疫应答且包含成为所含的对象的核酸(例如编码白细胞介素7的核酸和/或编码CCL19的核酸)并能表达的细胞，就没有特别限制。成为递送对象的核酸，可以含于免疫应答细胞的基因组中，也可以由基因组外的载体携带，例如，从基因携带的稳定性的观点出发可以含于基因组中。上述免疫应答细胞优选为从活体采集的免疫应答细胞，例如可以举出T细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、B细胞等淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等抗原呈递细胞、以及嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞等粒细胞。作为优选的例子，可以举出从人、狗、猫、猪、小鼠等哺乳动物采集的T细胞，进而优选从人采集的T细胞。需要说明的是，在使用包含从活体采集的T细胞的细胞群的情况下，该细胞群可以除了包含T细胞以外还包含其他细胞，按细胞数计算可以以占细胞总数的50％以上、或者60％以上、或者70％以上、或者80％以上、或者90％以上的比例包含T细胞。关于T细胞等免疫应答细胞，例如可以从血液、脑脊液等体液、脾脏、胸腺、淋巴结等组织、或向原发肿瘤、转移性肿瘤、癌症性腹水等癌症组织浸润的免疫细胞采集包含免疫应答细胞的细胞群采集而得到。为了提高细胞群所含的T细胞等免疫应答细胞的比例，将已分离的细胞群根据需要提供给基于常规方法的分离工序或者纯化工序。另外，免疫应答细胞可以是从ES细胞或者iPS细胞制作的免疫应答细胞。就作为免疫应答细胞的例的T细胞的例子而言，可以举出α·βT细胞、γ·δT细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、肿瘤浸润T细胞、记忆T细胞、幼稚T细胞、以及NKT细胞。需要说明的是，免疫应答细胞的来源和组合医药的给药对象可以是相同个体，也可以是不同个体，但优选是相同个体。例如，在给药对象是人的情况下，免疫应答细胞可以是从作为给药对象的患者本人采集的自体细胞，也可以是从他人采集的异体细胞。即供者和受者可以一致，也可以不一致，但优选一致。
作为核酸递送介质的病毒，优选是可以包封成为递送对象的核酸(例如编码白细胞介素7的核酸和/或编码CCL19的核酸)且能感染癌细胞的病毒，更优选为溶瘤病毒。上述溶瘤病毒(oncolytic virus)是指具有即便感染正常细胞感染也几乎不增殖、但如果感染癌细胞感染就会增殖而杀灭癌细胞(癌细胞损伤)的能力的病毒，例如在MolecularTherapy、第18巻、第2号、2010年21月、233～234页有综述。溶瘤病毒只要具有感染癌细胞而杀灭癌细胞的能力，就没有特别限定，但作为其例子，可以举出溶瘤痘苗病毒、溶瘤腺病毒、溶瘤单纯疱疹病毒、溶瘤呼肠孤病毒、溶瘤麻疹病毒、溶瘤新城疫病毒、溶瘤牛痘病毒、溶瘤腮腺炎病毒、以及溶瘤柯萨奇病毒。
作为溶瘤痘苗病毒，例如是Kim MK et al.Science TranslationalMedicine.2013May 15；5(185)：185ra63、Heo J,et al.Nature Medicine,2013(3)：329-36.doi：10.1038/nm.3089.Epub 2013Feb 10.、国际公开第2012/094386号中记载的痘苗病毒，但并不限于此。作为溶瘤腺病毒的例子，可以举出Tedcastle A et al.Mol Ther.2016；24：796-804,Marino N,Illingworth S,Kodialbail P,Patel A,Calderon H,Lear R,Fisher KD,Champion BR,Brown ACN.PLoS One 2017；12(5)：e0177810、Freedman JD,etal.EMBO Mol Med 9：1067-1087(2017)、Lang FF et al.,Journal of Clinical Oncology(2018)、James M.et al.The Journal of Oncology,188(6)：2391-7,2012、专利第3867968号公报以及专利第5574284号公报中记载的腺病毒，但不限于这些。另外，作为溶瘤单纯疱疹病毒的例子，可以举出Mazzacurati et al.,Mol Ther,2015Jan；23(1)：99-107、HirookaY,et al.BMC Cancer 2018,18,596、Nakatake R,et al.Cancer Sci.2018Mar,109(3)；600-610.以及Andtbacka RHI,et al.J Clin Oncol.2015；33：2780-2788中记载的单纯疱疹病毒，但不限于这些。作为溶瘤呼肠孤病毒的例子，可以举出Mahalingam,et al,Cancers2018,10,160中记载的呼肠孤病毒，但并不限于此。作为溶瘤新城疫病毒的例子，可以举出Journal of Virology.2016Jun；90(11)：5343-5352.中记载的新城疫病毒，但并不限于此。作为溶瘤水疱性口炎病毒的例子，可以举出Muik A.et al.Cancer Res；74(13)；3567-78.中记载的水疱性口炎病毒，但并不限于此。溶瘤病毒也可以具有通过基因改变附加的蛋白质表达功能。作为通过该附加的蛋白质表达功能表达的蛋白质，可以使由成为递送对象的核酸编码的多肽(例如白细胞介素7和/或CCL19)表达。
作为“协同包含编码白细胞介素7的核酸以及编码CCL19的核酸的一种或多种细胞或者核酸递送介质或者它们的组合”中的细胞的厌氧菌，只要是下述厌氧菌的细胞，就没有特别限制，该厌氧菌的细胞包含成为所含的对象的核酸(例如编码白细胞介素7的核酸和/或编码CCL19的核酸)并能够表达。厌氧菌优选是具有向癌细胞中集聚的能力的厌氧性革兰氏阳性菌，作为其例子，可以举出双歧杆菌等双歧杆菌属、乳酸杆菌属、以及李斯特菌属。需要说明的是，已知厌氧菌容易在低氧的环境下生长，容易向癌细胞集聚。厌氧菌也可以被本公开涉及的组合医药B的给药对象的体内的细胞所摄取。
作为核酸递送介质的脂质体，只要是可以包封成为递送对象的核酸(例如编码白细胞介素7的核酸和/或编码CCL19的核酸)且由磷脂双层膜构成的脂质纳米胶囊，就没有特别限制。该脂质体可以是市售品，还可以是通过常规方法合成的脂质体。为了提高向癌细胞的集聚，脂质体可以接受PEG修饰，或表面具有凝集素或蛋白质(例如抗体)等靶向探针分子。
作为“协同包含编码白细胞介素7的核酸以及编码CCL19的核酸的一种或多种细胞或者核酸递送介质或者它们的组合”中的细胞的间充质干细胞(MSC)，只要是包含成为所含的对象的核酸(例如编码白细胞介素7的核酸和/或编码CCL19的核酸)并能表达的MSC，就没有特别限制。MSC优选为向癌细胞集聚的MSC。
作为核酸递送介质的纳米粒子，只要是具有能将成为递送对象的核酸(例如编码白细胞介素7的核酸和/或编码CCL19的核酸)向癌细胞递送的能力且为纳米量级、优选直径5～800nm的颗粒体，就没有特别限制。作为纳米粒子的例子，可以举出金纳米粒子等金属纳米粒子、以及二氧化硅纳米粒子。该纳米粒子可以是市售品，也可以通过常规方法合成的纳米粒子。纳米粒子例如通过高通透性和滞留效应(Enhanced Permeability and RetentionEffect(EPR效应))可以到达癌细胞。根据纳米粒子的材质，核酸能以通过与纳米粒子的表面结合而被包封在纳米粒子内等的形使含于纳米粒子中。
就本公开涉及的组合医药B而言，分别被细胞或者核酸递送介质所含的编码白细胞介素7的核酸、编码CCL19的核酸、以及任意包含的编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的核酸，分别以可运作的方式与启动子的下游连结。使细胞或者核酸递送介质包含这些核酸的操作，按照常规方法进行即可。在向细胞导入核酸的情况下，例如可以使用从电穿孔法(例如Cytotechnology,3,133(1990))、磷酸钙法(例如日本特开平2-227075号公报)、脂质体转染法(例如Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,84,7413(1987))、以及病毒感染法中选择的方法进行导入。病毒感染法可以是通过将包含导入的核酸的载体和包装质粒转染到称为GP2-293细胞(宝生物公司制)、Plat-GP细胞(COSMO BIO公司制)、PG13细胞(ATCC CRL-10686)、或者PA317细胞(ATCC CRL-9078)的包装细胞中，制作重组病毒，使T细胞感染该重组病毒的方法(例如国际公开第2017/159736号)。
或者，成为导入对象的核酸可以使用公知的基因编辑技术，按照能在适当的启动子的调控下进行表达的方式整合到细胞的基因组中。作为公知的基因编辑术的例子，可以举出使用锌指核酸酶、TALEN(类转录激活因子效应物核酸酶)、CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复：Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat)-Cas系统等内切核酸酶的技术。
在成为含有对象的核酸被细胞包含的情况下，该核酸可以整合到细胞的基因组中，也可以由细胞内的载体携带。在成为含有对象的核酸为两个以上且含于相同细胞中的情况下，它们可以相邻且整合到细胞的基因组中，还可以整合到细胞的基因组中，还可以含于相同载体中，还可以分别含于不同的载体中。另外，成为含有对象的核酸中的一些含于基因组中，剩余的含于载体中。
在成为含有对象的核酸被核酸递送介质包含的情况下，该核酸可以单独包含，还可以被载体携带。在成为含有对象的核酸为两个以上且含于相同核酸递送介质中的情况下，它们可以含于相同载体中，还可以分别含于不同载体，还可以含于相同病毒中，还可以含于不同病毒中。另外，各核酸可以含于相同核酸递送介质中，还可以含于不同核酸递送介质中。
载体可以为直链状也可以为环状，可以是质粒等非病毒载体，还可以是病毒载体，还可以是基于转座子的载体。载体可以包含启动子、终止子等调控序列、药剂抗性基因、报告基因等选择标记序列中的一个以上。可以利用载体所含的启动子，使载体所含的基因的表达得以进行。
本公开涉及的组合医药B，通过由IL-7以及CCL19、以及免疫抑制阻断剂构成的因子的组合所致的协同效果，可以发挥改善程度令人吃惊的癌症治疗效果。该效果在本公开涉及的组合医药B包含含有对特异性识别癌抗原的细胞表面分子进行编码的核酸的细胞或者核酸递送介质的情况下更加显著，在包含含有对特异性识别癌抗原的细胞表面分子进行编码的核酸的免疫应答细胞的情况下更进一步显著。
就本公开涉及的组合医药B而言，包含了协同包含编码白细胞介素7的核酸以及编码CCL19的核酸的一种或多种细胞或者核酸递送介质或者它们的组合的给药用组合物(以下也称为第三给药用组合物)，进而可以包含药学上可接受的添加剂，作为上述添加剂，可以举出生理盐水、缓冲生理盐水、细胞培养基、葡萄糖、注射用水、甘油、乙醇以及它们的组合、稳定剂、增溶剂以及表面活性剂、缓冲剂以及防腐剂、等渗剂、填充剂、以及润滑剂。
与本公开涉及的组合医药A中的给药组合物有关的说明，可以将第一给药用组合物理解为第三给药用组合物，在用于施以本公开涉及的组合医药B的给药的给药组合物中应用。例如，第二给药用组合物可以是与第三给药用组合物相同的组合物，此时，一个给药用组合物包含免疫抑制阻断剂和上述一种或多种细胞或者核酸递送介质或者它们的组合双方。此时，提供包含免疫抑制阻断剂和协同包含编码白细胞介素7的核酸以及编码CCL19的核酸的一种或多种细胞或者核酸递送介质或者它们的组合双方的医药组合物(合剂)。
在第二给药用组合物是与第三给药用组合物不同的组合物的情况下，第三给药用组合物和第二给药用组合物可以一起给药，还可以在不同的时间(时间点)给药。
因此，上述细胞或者核酸递送介质或它们的组合、与上述免疫抑制阻断剂，可以在不同时间点分别给药。
不过，与本公开涉及的组合医药A中的给药组合物有关的说明中的本公开涉及的免疫应答细胞A的量的记载，理解为上述一种或多种细胞或者核酸递送介质或者它们的组合包含细胞时第三给药用组合物中的细胞量的记载，在本公开涉及的组合医药B中的给药组合物的说明中应用。
另外，与本公开涉及的组合医药A有关的说明，将本公开涉及的组合医药A理解为本公开涉及的组合医药B，将本公开涉及的免疫应答细胞A以及“表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子、IL-7以及CCL19的免疫应答细胞”理解为协同包含编码白细胞介素7的核酸以及编码CCL19的核酸的一种或多种细胞或者核酸递送介质或者它们的组合，只要没有特别矛盾，可以在本公开涉及的组合医药B中应用。其中也包括与治疗对象的生物种、个体、疾病的种、用量、给药计划等、组合医药的使用形态的说明。
上述一种或多种细胞或者核酸递送介质或者它们的组合包含核酸递送介质时第三给药用组合物中的核酸递送介质的量，可以根据癌症的种类、位置、重症度、接受治疗的对象的年龄、体重以及状态等适当调整，使应该递送的核酸成为用于递送治疗有效量的适当量即可。
与使用了本公开涉及的组合医药A的癌症治疗有关的说明，将本公开涉及的组合医药A理解为本公开涉及的组合医药B，将本公开涉及的免疫应答细胞A以及表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子、IL-7以及CCL19的免疫应答细胞，理解为协同包含编码白细胞介素7的核酸以及编码CCL19的核酸的一种或多种细胞或者核酸递送介质或者它们的组合，可以在使用了本公开涉及的组合医药B的癌症的治疗中应用。例如，根据本公开涉及的一个方式，提供一种治疗对象中的癌症的方法(以下也称为本公开涉及的癌症的治疗方法B)，其包括组合下述(a)和(b)向对象给药，
(a)协同包含编码白细胞介素7的核酸以及编码CCL19的核酸的一种或多种细胞或者核酸递送介质或者它们的组合；以及
(b)免疫抑制阻断剂。
同样地，根据本公开，提供(a)协同包含编码白细胞介素7的核酸以及编码CCL19的核酸的一种或多种细胞或者核酸递送介质或者它们的组合、以及(b)免疫抑制阻断剂在用于治疗癌症的医药的制造中的使用。另外，也提供一种医药，其用于与免疫抑制阻断剂并用来治疗对象中的癌症，且包含了协同包含编码白细胞介素7的核酸以及编码CCL19的核酸的一种或多种细胞或者核酸递送介质或者它们的组合。进而，也提供一种用于与免疫抑制阻断剂并用来治疗对象中的癌症的、协同包含编码白细胞介素7的核酸以及编码CCL19的核酸的一种或多种细胞或者核酸递送介质或者它们的组合。协同包含编码白细胞介素7的核酸以及编码CCL19的核酸的一种或多种细胞或者核酸递送介质或者它们的组合、和免疫抑制阻断剂，可以一起给药，还可以在不同时间点分别给药。
进而，根据本公开，也提供一种用于与协同包含编码白细胞介素7的核酸以及编码CCL19的核酸的一种或多种细胞或者核酸递送介质或者它们的组合并用来治疗对象中的癌症的、包含免疫抑制阻断剂的医药。进而，也提供一种用于与协同包含编码白细胞介素7的核酸以及编码CCL19的核酸的一种或多种细胞或者核酸递送介质或者它们的组合并用来治疗对象中的癌症的、免疫抑制阻断剂。
根据本公开，也提供一种由显示与免疫抑制阻断剂并用的容器收纳、且包含了协同包含编码白细胞介素7的核酸以及编码CCL19的核酸的一种或多种细胞或者核酸递送介质或者它们的组合的医药。容器、显示等的详细内容如上述所示。除此之外，还提供一种制品，其包含记载有和免疫抑制阻断剂并用的药品说明书、和收纳了包含一种或多种细胞或者核酸递送介质或者它们的组合的医药的容器，该一种或多种细胞或者核酸递送介质或者它们的组合协同包含编码白细胞介素7的核酸以及编码CCL19的核酸。容器、药品说明书等的详细内容如上述所示。
如以上的说明所述，根据本公开涉及的一个方式，通过由协同包含编码白细胞介素7的核酸以及编码CCL19的核酸的一种或多种细胞或者核酸递送介质或者它们的组合、以及免疫抑制阻断剂的组合所致的协同效果，可以得到改善程度令人吃惊的癌症治疗效果。
根据本公开涉及的又一个方式，提供对特异性识别癌抗原的细胞表面分子、白细胞介素7、CCL19、以及免疫抑制阻断性多肽进行表达的免疫应答细胞(以下也称为本公开涉及的免疫应答细胞C)。
在这里，本公开涉及的免疫应答细胞C中的、特异性识别癌抗原的细胞表面分子、白细胞介素7、CCL19、编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的核酸、编码白细胞介素7的核酸、编码CCL19的核酸、以及免疫抑制阻断剂的定义、例子、氨基酸序列、碱基序列、优选的实施方式等的详细内容，与本公开涉及的免疫应答细胞A以及本公开涉及的组合医药A中的、特异性识别癌抗原的细胞表面分子、白细胞介素7、CCL19、编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的核酸、编码白细胞介素7的基因、编码CCL19的基因、以及免疫抑制阻断剂的定义、例子、氨基酸序列、碱基序列、优选的实施方式等的详细内容分别相同。
本公开涉及的免疫应答细胞C可以认为是本公开涉及的免疫应答细胞A进一步表达免疫抑制阻断性多肽的细胞。因此，关于免疫应答细胞A的说明中已经完成的事项(与特异性识别癌抗原的细胞表面分子、白细胞介素7、以及CCL19有关的说明等)，与在免疫应答细胞A的说明中与它们有关的记载相同，所以省略说明。
免疫抑制阻断性多肽是指属于本公开涉及的组合医药A中的免疫抑制阻断剂的范畴的物质中与多肽相当的物质。免疫抑制阻断性多肽借出或减轻免疫应答细胞活化的抑制。
作为免疫抑制阻断性多肽的例子，可以举出免疫检查点阻断性多肽、阻断Treg、源自骨髓的免疫抑制细胞(MDSC)等免疫抑制性细胞的浸润、生存、或者功能的多肽、CCR4阻断性多肽、吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)阻断性多肽、前列腺素E2[PGE2]抑制性多肽、细胞毒性抗癌多肽。免疫抑制阻断性多肽只要具有这些功能，可以是抗体，例如可以是IgG单克隆抗体或者抗体片段。
免疫检查点阻断性多肽，典型的是将由在T细胞的表面表达的免疫检查点分子介导的免疫抑制机制解除或者减轻的多肽。免疫检查点阻断性多肽，例如与免疫检查点分子(例如PD-1、CTLA-4、BTLA、TIM-3、TIGIT、LAG-3等)或者免疫检查点分子的配体(例如PD-L1、PD-L2、CD80/CD86、Siglec-15等)结合，阻断通过配体启动来自免疫检查点分子的信号传递，由此可以减少针对免疫应答的抑制反应。
作为免疫检查点阻断性多肽的例子，可以举出PD-1阻断性多肽、PD-L1阻断性多肽、CTLA-4阻断性多肽、CD47阻断性多肽、SIRPα阻断性多肽、BTLA阻断性多肽、TIM-3阻断性多肽、TIGIT阻断性多肽、LAG-3阻断性多肽、Siglec-15阻断性多肽、半乳糖凝集素-9阻断性多肽等。作为CCR4阻断性多肽的例子，可以举出抗CCR4抗体(例如莫格利珠单抗)等。
免疫抑制阻断性多肽可以包含从由PD-1阻断性多肽、PD-L1阻断性多肽、PD-L2阻断性多肽、CTLA-4阻断性多肽、BTLA(B-and T-lymphocyte attenuator)阻断性多肽、TIM-3(T-cell immunoglobulin and mucin domain 3)阻断性多肽、TIGIT(T-cellimmunoreceptor with Ig and ITIM domains)阻断性多肽、LAG-3(LymphocyteActivation Gene-3)阻断性多肽、以及Siglec-15阻断性多肽构成的组中选择的一种以上。
免疫抑制阻断性多肽可以是免疫检查点阻断性多肽，更具体地可以为PD-1阻断性多肽或者PD-L1阻断性多肽，进而具体地可以为针对PD-1的抗体或者针对PD-L1的抗体。作为针对PD-1的抗体的例子，可以举出Nivolumab(纳武单抗)、Pembrolizumab(派姆单抗)、Toripalimab(特瑞普利单抗)、Cemiplimab-rwlc(西米普利单抗)、Sintilimab(信迪利单抗)等。PD-L1的抗体的例子，可以举出Atezolizumab(阿特珠单抗)、Durvalumab(德瓦鲁单抗)、Avelumab(阿维鲁单抗)等。作为针对CTLA-4的抗体的例子，可以举出Ipilimumab(伊匹单抗)等。另外也可以举出针对CD47、SIRPα的抗体等。
抗体只要具有规定的抗原结合性，可以是IgG单克隆，也可以是Fab片段，也可以是scFv，也可以是除此以外的抗体或者抗体片段。就作为免疫抑制阻断性多肽的抗PD-1scFv的例子而言，可以举出自序列号16中的N末端数起第592～835位的氨基酸序列，作为对其进行编码的核酸序列的例子，可以举出在序列号15中的5’末端数起第1717个残基～2505个残基的核酸序列。
针对感兴趣的靶标的单链抗体(scFv)，可以通过公知的方法来制作。例如，可以在对小鼠等接种抗原之后，采集淋巴组织，制作抗体基因库，通过抗体直接克隆得到对识别癌抗原的抗体进行编码的碱基序列，以其为基础设计单链抗体。或者，可以使用所采集的淋巴组织制作杂交瘤，鉴定对识别癌抗原的抗体进行编码的杂交瘤，得到单克隆抗体，以其序列信息为基础设计单链抗体。或者，以由健康人的B细胞制作的天然抗体库、由源自对癌抗原示出高中和活性的抗血清的癌症患者的B细胞制作的抗体库等为基础，制作单链抗体的库，通过噬菌体展示使其呈递，选拔出识别癌抗原的单链抗体。
本公开涉及的免疫应答细胞C对特异性识别癌抗原的细胞表面分子、IL-7、CCL19、以及免疫抑制阻断性多肽进行表达。在这里，“对特异性识别癌抗原的细胞表面分子、IL-7、CCL19、以及免疫抑制阻断性多肽进行表达”是指特异性识别癌抗原的细胞表面分子、IL-7、CCL19、以及免疫抑制阻断性多肽由免疫应答细胞产生，特异性识别癌抗原的细胞表面分子的至少一部分位于细胞表面(细胞外侧的细胞表面)，IL-7、CCL19、以及免疫抑制阻断性多肽被分泌到细胞外。
癌细胞具有抑制免疫应答细胞攻击癌细胞或抑制发出攻击癌细胞的指示的免疫抑制机制，因此由癌症患者本身的免疫所致的向癌细胞的攻击受到抑制。本公开涉及的免疫应答细胞C所表达的免疫抑制阻断性多肽阻断由癌细胞所致的免疫抑制机制，认为由此使癌症患者的免疫系统对癌细胞的攻击更为容易。
除了这些之外，本公开涉及的免疫应答细胞C也表达IL-7以及CCL19，由此不仅仅是本公开涉及的免疫应答细胞C，癌症患者的内源性的免疫应答细胞也向癌细胞的周围集聚，因此认为更有效地攻击癌细胞成为可能。
本公开涉及的免疫应答细胞C通过对特异性识别癌抗原的细胞表面分子、白细胞介素7、CCL19、以及免疫抑制阻断性多肽进行表达，发挥由对特异性识别癌抗原的细胞表面分子进行表达的免疫应答细胞、分泌的IL-7、CCL19、以及免疫抑制阻断性多肽组成的因子的组合所致的协同效果，为此，可以发挥大幅改善的癌症治疗效果。该协同效果是无法从各自的因子的个别效果预测到的优异效果。
例如，如后述的实施例所示，在使用表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子、白细胞介素7、以及CCL19但不表达免疫抑制阻断性多肽的免疫应答细胞的情况下，以及在使用表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子以及免疫抑制阻断性多肽但不表达白细胞介素7以及CCL19的免疫应答细胞的情况下，即便是治疗困难的癌症治疗的情况，只要使用本公开涉及的免疫应答细胞C，就可以治疗。另外，通过这样的高治疗效果，即便是减少细胞的给药量的情况，也可以获得治疗效果，在使用自体细胞的情况下，即便是无法采集足够数量的免疫应答细胞的情况，也可以获得治疗效果。这样的效果是无法由特异性识别癌抗原的细胞表面分子、白细胞介素7、以及CCL19的共表达、或者特异性识别癌抗原的细胞表面分子以及免疫抑制阻断性多肽的共表达预测到的效果。
本公开涉及的免疫应答细胞C例如可以通过向从活体采集的免疫应答细胞、或者由iPS细胞、ES细胞等多能性干细胞或造血干细胞等体性干细胞诱导的免疫应答细胞等导入编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的核酸、编码IL-7的核酸、编码CCL19的核酸、以及编码免疫抑制阻断性多肽的核酸而得到。或者，通过从活体采集内源性表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子(例如特异性识别癌抗原的TCR)的免疫应答细胞，导入编码IL-7的核酸、编码CCL19的核酸、以及编码免疫抑制阻断性多肽的核酸而得到。
在向从活体采集的免疫应答细胞导入核酸的情况下，如果采集由本公开涉及的免疫应答细胞C的医药治疗的癌症患者本身的(也就是说自体的)免疫应答细胞，可以将排斥反应最小化。不过，并不排除使用异体的免疫应答细胞。也就是说，本公开涉及的免疫应答细胞C可以是源自对象本身的免疫应答细胞，也可以不是。
编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的核酸、编码IL-7的核酸、编码CCL19的核酸、以及编码免疫抑制阻断性多肽的核酸可以分别存在于本公开涉及的免疫应答细胞C的基因组中，也可以由基因组外的载体携带，例如，从核酸携带的稳定性的观点出发，可以在基因组中存在。另外，编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的核酸、编码IL-7的核酸、编码CCL19的核酸、以及编码免疫抑制阻断性多肽的核酸可以统合(例如连结)存在于基因组中，也可以分散(分开)存在于基因组中，或者，可以是仅这些中的一部分统合(例如连结)存在于基因组中，另一部分分散(分离)存在于基因组中。特异性识别癌抗原的细胞表面分子，例如在如为由αβ的二聚体或者γδ的二聚体构成的TCR时那样为异二聚体或者异多聚体的情况下，对构成异二聚体或者异多聚体的各自的分子进行编码的核酸，可以统合存在于基因组中，也可以分散(分开)存在。
在一个实施方式中，编码IL-7的核酸、编码CCL19的核酸、以及编码免疫抑制阻断性多肽的核酸中的至少一种是外源性，也可以全部为外源性。另外，编码IL-7的核酸、编码CCL19的核酸、以及编码免疫抑制阻断性多肽的核酸可以分别独立地整合到基因组中，也可以整合到载体中。在某实施方式中，编码IL-7的核酸、编码CCL19的核酸、以及编码免疫抑制阻断性多肽的核酸全部整合到本公开涉及的免疫应答细胞C的基因组中，或者一起或个别整合到在上述免疫应答细胞C中存在的一个或多个载体中。在其他实施方式中，编码IL-7的核酸、编码CCL19的核酸、以及编码免疫抑制阻断性多肽的核酸中的一部分整合到本公开涉及的免疫应答细胞C的基因组中，剩余的整合到在上述免疫应答细胞C中存在的一个或多个载体中。
在某实施方式中，编码免疫抑制阻断性多肽的核酸整合到上述免疫应答细胞的基因组中，或者，整合到与在免疫应答细胞中存在的、协同包含编码IL-7的核酸以及编码CCL19的核酸的一个或多个载体中的任一个可以相同或不同的载体中。
需要说明的是，细胞中是否有各核酸，可以使用PCR等公知的方法地容易确认。
免疫抑制阻断性多肽的氨基酸序列以及编码免疫抑制阻断性多肽的碱基序列的信息，可以通过检索公知的文献、NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/)等数据库而适当获得。
在免疫应答细胞内源性表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子的情况下，例如在使规定的对特异性识别癌抗原的TCR进行的T细胞分离的情况下，没有必要从外部导入编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的核酸，在除此以外的情况下，从外部导入编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的核酸、编码IL-7的核酸、编码CCL19的核酸、以及免疫抑制阻断性多肽中的一种以上。
用于向免疫应答细胞导入的编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的核酸、编码IL-7的核酸、编码CCL19的核酸、以及编码免疫抑制阻断性多肽的核酸可以分别根据编码该分子的碱基序列的信息，通过化学合成的方法、利用PCR扩增的方法等公知的技术来制作。需要说明的是，为了使成为包含基因的核酸的导入对象的免疫应答细胞中该基因的表达最佳化，可以改变编码区域中的密码子。
成为导入对象的核酸群的导入，可以使一个或多个核酸递送介质包含核酸群而进行。作为此时的核酸递送介质的例子，可以举出前述的病毒、脂质体以及纳米粒子。脂质体以及纳米粒子可以在使载体包含核酸的状态下包含。如此，根据本公开，也提供一种协同包含编码白细胞介素7的核酸、编码CCL19的核酸、以及编码免疫抑制阻断性多肽的核酸的一种或多种核酸递送介质。在免疫应答细胞未对特异性识别癌抗原的细胞表面分子进行内源性表达等情况下，上述核酸递送介质可以进一步包含编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的核酸。
在以下的说明中，对包含核酸群的载体进行说明，但即便是核酸递送介质的情况下，只要没有矛盾，相同的说明也适用。或者，核酸递送介质可以包含以下说明所述的载体。
成为导入对象的核酸，可以在分别由不同载体携带的状态下被导入，可以在由相同载体携带两种以上的核酸的状态下导入。例如，在将编码IL-7的核酸、编码CCL19的核酸、以及编码免疫抑制阻断性多肽的核酸导入免疫应答细胞的情况下，编码IL-7的核酸和编码CCL19的核酸可以由不同载体导入，也可以使相同载体携带两核酸而导入。编码CCL19的核酸和编码免疫抑制阻断性多肽的核酸可以由不同载体导入，也可以使相同载体携带两核酸而导入。编码IL-7的核酸和编码免疫抑制阻断性多肽的核酸可以由不同载体导入，也可以使相同载体携带两核酸而导入。与也导入对特异性识别癌抗原的细胞表面分子进行编码的核酸的情况有关的以下记载的说明，也是除了“编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的核酸”以外同样地能应用于导入编码IL-7的核酸、编码CCL19的核酸、以及编码免疫抑制阻断性多肽的核酸的情况(换言之，没有必要导入编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的核酸的情况)。
在将编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的核酸、编码IL-7的核酸、编码CCL19的核酸、以及编码免疫抑制阻断性多肽的核酸导入免疫应答细胞的情况下，
(i)可以使编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的核酸、编码IL-7的核酸、编码CCL19的核酸、以及编码免疫抑制阻断性多肽的核酸分别由不同载体携带而导入；
(ii)可以使编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的核酸以及编码IL-7的核酸由相同载体携带，使编码CCL19的核酸由另一载体携带，使编码免疫抑制阻断性多肽的核酸由又另一个载体携带而导入；
(iii)可以使编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的核酸以及编码CCL19的核酸由相同载体携带，使编码IL-7的核酸由另一载体携带，使编码免疫抑制阻断性多肽的核酸由又另一个载体携带而导入；
(iv)可以使编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的核酸以及编码免疫抑制阻断性多肽的核酸由相同载体携带，使编码IL-7的核酸由另一载体携带，使编码CCL19的核酸由又另一个载体携带而导入；
(v)可以使编码IL-7的核酸以及编码CCL19的核酸由相同载体携带，使编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的核酸由另一载体携带，使编码免疫抑制阻断性多肽的核酸由又另一个载体携带而导入；
(vi)可以使编码IL-7的核酸以及编码免疫抑制阻断性多肽的核酸由相同载体携带，使编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的核酸由另一载体携带，使编码CCL19的核酸由又另一个载体携带而导入；
(vii)可以使编码CCL19的核酸以及编码免疫抑制阻断性多肽的核酸由相同载体携带，使编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的核酸由另一载体携带，使编码IL-7的核酸由又另一个载体携带而导入；
(viii)可以使编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的核酸以及编码IL-7的核酸由相同载体携带，使编码CCL19的核酸以及编码免疫抑制阻断性多肽的核酸由另一载体一起携带而导入；
(ix)可以使编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的核酸以及编码CCL19的核酸由相同载体携带，使编码IL-7的核酸以及编码免疫抑制阻断性多肽的核酸由另一载体一起携带而导入；
(x)可以使编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的核酸以及编码免疫抑制阻断性多肽的核酸由相同载体携带，使编码IL-7的核酸以及编码CCL19的核酸由另一载体一起携带而导入；
(xi)可以使编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的核酸、编码IL-7的核酸、以及编码CCL19的核酸由相同载体携带，使编码免疫抑制阻断性多肽的核酸由另一载体携带而导入；
(xii)可以使编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的核酸、编码IL-7的核酸、以及编码免疫抑制阻断性多肽的核酸由相同载体携带，使编码CCL19的核酸由另一载体携带而导入；
(xiii)可以使编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的核酸、编码CCL19的核酸、以及编码免疫抑制阻断性多肽的核酸由相同载体携带，使编码IL-7的核酸由另一载体携带而导入；
(xiv)可以使编码IL-7的核酸、编码CCL19的核酸、以及编码免疫抑制阻断性多肽的核酸由相同载体携带，使编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的核酸由另一载体携带而导入；
(xv)可以使编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的核酸、编码IL-7的核酸、编码CCL19的核酸、以及编码免疫抑制阻断性多肽的核酸由相同载体携带而导入。
可以考虑导入效率，在使两种以上的核酸由相同载体携带的状态下导入。此时，该两种以上的核酸在免疫应答细胞中统合存在。
例如，可以使用以下的载体或者载体组。
(f)含有编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的核酸、编码IL-7的核酸、编码CCL19的核酸、以及编码免疫抑制阻断性多肽的核酸的载体(与上述(xv)情况相当)
(g)由以下的载体(g-1)以及载体(g-2)构成的载体组(与上述xiv情况相当)。
(g-1)含有对特异性识别癌抗原的细胞表面分子进行编码的核酸的载体
(g-2)含有编码IL-7的核酸、编码CCL19的核酸、编码免疫抑制阻断性多肽的核酸的载体
关于其他的情况，可以同样涉及合适的载体组。
载体组可以设计成冗余(redundant)包含核酸。也就是说，编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的核酸、编码IL-7的核酸、编码CCL19的核酸、编码免疫抑制阻断性多肽的核酸中的特定的一个核酸可以包含在属于载体组的载体中的两个以上中。
可以使上述载体中的任意载体、或者与上述载体不同的载体中进一步含有对IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-23、IL-27、IP-10、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL4L1、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL16、CXCL17、CX3CL1、XCL1、XCL2、CCL3L1、CCL3L3、CCL4L1、CCL4L2、Flt3L、Interferon-gamma、MIP-1alpha、GM-CSF、M-CSF、TGF-beta、TNF-alpha等一种以上的其他免疫功能调控因子进行编码的核酸，向免疫应答细胞导入。
作为将携带核酸的载体导入免疫应答细胞的方法，没有特别限制，但可以举出病毒感染法、转座子法、磷酸钙法、脂质体转染法、显微注射法、电穿孔法等公知的方法。通过外源核酸可向基因组导入的病毒感染法导入的方法，可以获得核酸携带的稳定性。
作为病毒感染法，可以举出将载体和包装质粒转染到GP2-293细胞(宝生物公司制)、Plat-GP细胞(COSMO BIO公司制)、PG13细胞(ATCC CRL-10686)、PA317细胞(ATCC CRL-9078)等包装细胞而制作重组病毒，使该重组病毒感染免疫应答细胞的方法，可以使用Retrovirus packaging Kit Eco(宝生物公司制)等市售的试剂盒进行。如果使用MSCV逆转录病毒表达系统等，外源核酸向基因组的导入成为可能。
另外，编码IL-7的核酸、编码CCL19的核酸、编码免疫抑制阻断性多肽的核酸、以及根据需要的编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的核酸向基因组的整合也可以使用公知的基因编辑技术进行。作为公知的基因编辑技术，可以举出使用锌指核酸酶、TALEN(类转录激活因子效应物核酸酶)、CRISPR(Clustered Regularly Interspaced ShortPalindromic Repeat)-Cas系统等内切核酸酶的技术。根据需要导入的对其他外源蛋白质进行编码的核酸向基因组的整合，也可以使用相同的方法进行。
另外，在将这些核酸(基因)整合到免疫应答细胞的基因组的情况下，可以与调控该基因的上游启动子一起以可运作的方式(即，可以在该启动子的调控下进行表达的方式)整合到基因组的非编码区域等，还可以在没有启动子的情况下以可运作的方式整合到已存在于基因组中的启动子的下游。作为已存在于基因组中的启动子，可以举出TCRα、TCRβ的启动子等。
在编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的核酸、编码IL-7的核酸、编码CCL19的核酸、编码免疫抑制阻断性多肽的核酸、以及根据需要导入的对追加的外源蛋白质进行编码的核酸中有两种以上的核酸相邻存在的情况下，也可以使这两种以上的核酸在共通的启动子的调控下进行表达。当在共通的启动子的调控下使其表达时，可以使用2A肽、IRES肽等，将转录和/或翻译分段，可以使各自的多肽得以表达。
在将携带编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的核酸、编码IL-7的核酸、编码CCL19的核酸、以及编码免疫抑制阻断性多肽的核酸中的两种以上的载体导入免疫应答细胞的情况下，该载体中上述两种以上的核酸的排列顺序没有特别限定。例如，就上述(f)含有编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的核酸、编码IL-7的核酸、编码CCL19的核酸、以及编码免疫抑制阻断性多肽的核酸的载体而言，这四个核酸的排列顺序没有限定。具体而言，按照从上游(5’末端侧)到下游(3’末端侧)的顺序，可以按照下述的顺序排列，
(i)编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的核酸、编码IL-7的核酸、编码CCL19的核酸、以及编码免疫抑制阻断性多肽的核酸中的任一个；
(ii)上述四个核酸中的剩余(三个)的任一个；
(iii)上述四个核酸中的剩余(两个)的任一个；
(iv)上述四个核酸中的最后剩余的一个。
同样地，就考虑用于使免疫应答细胞内源性表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子时的含有编码IL-7的核酸、编码CCL19的核酸、以及编码免疫抑制阻断性多肽的核酸的载体而言，可以按照下述的顺序排列，
(i)编码IL-7的核酸、编码CCL19的核酸、以及编码免疫抑制阻断性多肽的核酸中的任一个；
(ii)上述三个核酸中的剩余(两个)的任一个；
(iii)上述三个核酸中的最后剩余的一个。
需要说明的是，编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的核酸、编码IL-7的核酸、编码CCL19的核酸、以及编码免疫抑制阻断性多肽的核酸可以分别由不同的启动子转录，可以使用内部核糖体进入位点(IRES：internal ribozyme entry site)或者自剪切型2A肽通过一个启动子进行转录。
在通过一个启动子转录多个核酸的情况下，各核酸之间的碱基序列只要可以表达各核酸，可以包含任意的碱基序列，可以包含对自剪切型肽(2A肽)或者IRES进行编码的碱基序列，还可以包含编码2A肽的碱基序列。通过使用这样的碱基序列来连结多个核酸，使各核酸高效表达成为可能。可以包含对自剪切型肽(2A肽)或者IRES进行编码的碱基序列的核酸间的碱基序列，例如可以是编码IL-7的核酸和编码CCL19的核酸之间的碱基序列，还可以是编码IL-7的核酸和编码免疫抑制阻断性多肽的核酸之间的碱基序列，还可以是编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的核酸和编码IL-7的核酸之间的碱基序列，还可以是编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的核酸和编码CCL19的核酸之间的碱基序列，还可以是编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的核酸和编码免疫抑制阻断性多肽的核酸之间的碱基序列，还可以是编码CCL19的核酸和编码免疫抑制阻断性多肽的核酸之间的碱基序列，还可以是编码α·βTCR中的α链的核酸和编码β链的核酸之间的碱基序列，还可以是编码γ·δTCR中的γ链的核酸和编码δ链的核酸之间的碱基序列。也就是说，关于这些核酸间的区域的每个，根据需要，可以使其包含编码自剪切型肽(2A肽)或者IRES的碱基序列。
2A肽是源自病毒的自剪切型肽，其详细内容如前所述。
用于向免疫应答细胞导入核酸的载体可以为直链状也可以为环状，可以是质粒等非病毒载体，还可以是病毒载体，还可以是基于转座子的载体。用于向免疫应答细胞导入核酸的载体，可以含有启动子、终止子等调控序列、药剂抗性核酸、报告核酸等选择标记序列中的一个以上。也可以在向免疫应答细胞导入核酸之后，利用载体所含的启动子，使核酸的表达得以进行。例如，以可以运作的方式在载体中的启动子序列的下游配置编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的核酸、编码IL-7的核酸、编码CCL19的核酸、以及编码免疫抑制阻断性多肽的核酸中的一个以上，由此可以使该核酸高效转录。
作为上述启动子的例子，可以举出逆转录病毒的LTR启动子、SV40早期启动子、巨细胞病毒启动子、单纯疱疹病毒的胸腺激酶启动子等源自病毒的启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、Xist启动子、β-肌动蛋白启动子、RNA聚合酶II启动子、多肽链延长因子基因启动子等源自哺乳类的启动子。另外，可以使用由四环素诱导的四环素应答型启动子、由干扰素诱导的Mx1启动子等。通过使用由特定物质诱导的启动子，能够根据癌症的治疗经过对被启动子转录调控的基因(例如编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的基因、编码IL-7的基因、编码CCL19的基因、以及编码免疫抑制阻断性多肽的基因中的一个以上)的表达进行调控。
作为上述病毒载体的例子，可以举出逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体。作为逆转录病毒载体，可以举出pMSGV载体(Tamada K.et al.,ClinCancer Res 18：6436-6445(2002))、pMSCV载体(宝生物公司制)等。如果使用逆转录病毒载体，导入核酸被宿主细胞的基因组摄取，因此长期且稳定地表达导入核酸成为可能。
免疫应答细胞中特异性识别癌抗原的细胞表面分子、IL-7、CCL19、以及免疫抑制阻断性多肽的表达可以通过流式细胞仪、ELISA、蛋白质免疫印迹法等进行确认。另外，对它们进行编码的核酸的导入，可以如上所述对表达产物进行确认，或者，可以通过Northern印迹法、Southern印迹法、RT-PCR等PCR等进行确认。在用于核酸导入的载体含有标记基因的情况下，可以通过调查插入到该表达载体的标记基因的表达来确认核酸的导入。
<包含本公开涉及的免疫应答细胞C的医药>
根据本公开，提供包含对特异性识别癌抗原的细胞表面分子、白细胞介素7、CCL19、以及免疫抑制阻断性多肽进行表达的免疫应答细胞的医药(以下也称为本公开涉及的医药C)。也就是说，本公开涉及的医药C是包含本公开涉及的免疫应答细胞C的医药。
本公开涉及的医药C还可以包含药学上可接受的添加剂，作为上述添加剂，可以举出生理盐水、缓冲生理盐水、细胞培养基、葡萄糖、注射用水、甘油、乙醇以及它们的组合、稳定剂、增溶剂、表面活性剂、缓冲剂、防腐剂、等渗剂、填充剂、以及润滑剂。
本公开涉及的医药C所含的本公开涉及的免疫应答细胞C的量，可以根据癌症的种类、位置、重症度、接受治疗的对象的年龄、体重以及状态等适当调整，每次给药例如可以给药1×104～1×1011个、更具体为1×105～1×1010个、更具体为1×106～1×109个。另外，本公开涉及的免疫应答细胞C的量，可以为少量，每次给药低于1×106个、例如1×105～5×105个、更具体为1.5×105～4×105个。
如上所述，在使用表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子、白细胞介素7、以及CCL19但不表达免疫抑制阻断性多肽的免疫应答细胞的情况下，以及在使用表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子以及免疫抑制阻断性多肽但不表达白细胞介素7以及CCL19的免疫应答细胞情况下，即便是治疗困难的癌症治疗的情况，只要使用本公开涉及的免疫应答细胞C，就可以治疗。因此，就医药C所含的本公开涉及的免疫应答细胞C的量而言，在使用表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子、白细胞介素7、以及CCL19但不表达免疫抑制阻断性多肽的免疫应答细胞的情况下，以及在使用表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子以及免疫抑制阻断性多肽但不表达白细胞介素7以及CCL19的免疫应答细胞情况下，可以是不发挥抗癌效果的程度的少量。只要是免疫应答细胞C能发挥抗癌效果的量，则免疫应答细胞C的量的下限值没有特别限制。
本公开涉及的医药C可以以1天4次、1天3次、1天2次、1天1次、每隔1天、每隔2天、每隔3天、每隔4天、每隔5天、1周1次、每隔7天、每隔8天、每隔9天、1周2次、1月1次或者1月2次的频度给药。另外，给药次数总计可以为例如1次～10次、即1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次或者10次，也可以超过10次。
如上所述，本公开涉及的医药C通过由对特异性识别癌抗原的细胞表面分子进行表达的免疫应答细胞、以及所分泌的IL-7、CCL19、以及免疫抑制阻断性肽组成的因子的组合所致的协同效果，可以发挥改善程度令人吃惊的癌症治疗效果。
本公开涉及的医药C可以使用本领域技术人员已知的方法，对需要治疗癌症的对象给药，例如可以通过局部注射(包含导管给药)、全身注射、静脉内注射或者非经口给药(例如经皮给药、经粘膜给药，更具体为点鼻、点眼、舌下、栓剂、贴剂等)进行给药。本公开涉及的医药C从处理的观点出发被配制成可注射单位给药量的形态(溶液、悬浮液、乳剂)。作为给药方法的更具体的例子，可以举出向静脉内、肿瘤内、皮内、皮下、肌肉内、腹腔内、动脉内、髓内、心脏内、关节内、滑膜囊内、颅内、鞘内、以及蛛网膜下腔(髓液)的注射。
就本公开涉及的免疫应答细胞C而言，从治疗对象的患者获得原始免疫应答细胞或者其前体细胞，导入为成为本公开涉及的免疫应答细胞C所必需的基因的导入后，可以对相同患者给药(自体给药)，或者也可以对不同患者给药(异体给药)。或者，原始免疫应答细胞或者其前体细胞可以从iPS细胞、ES细胞等多能性干细胞或者造血干细胞等体性干细胞来制作。
本公开涉及的医药C例如可以作为被缓冲成规定pH的无菌的液体制剂、例如等渗水溶液、悬浮液、乳剂、分散物或者粘性组合物进行给药。上述液体制剂可以是注射用的液体制剂。另外，为了延长与特定组织的接触时间，可以使上述液体制剂为具有合适的粘度范围内的粘度的粘性组合物的形态。液体制剂例如可以包含溶剂或分散介质，该溶剂或者分散介质包含水、生理盐水、磷酸盐缓冲生理盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)以及它们的混合物。
上述液体制剂可以通过将本公开涉及的免疫应答细胞C和各种量的其他成分一起在适量的合适溶剂中配合而制备。上述液体制剂可以包含合适的担体、稀释剂、或者赋形剂(Excipient)。上述液体制剂另外可以被冻干。液体制剂可以进一步包含各种辅助物质，这取决于所需的给药路径，作为辅助物质的例子，可以举出润湿剂、分散剂或者乳化剂(例如甲基纤维素)、pH缓冲剂、胶凝剂或者增粘添加剂、保存剂、矫味剂、着色剂等。关于液体制剂中可以包含的成分，也可以参考“REMINGTON’SPHARMACEUTICAL SCIENCE”，17版、1985的记载。
另外，液体制剂可以进一步包含提高液体制剂的稳定性以及无菌性的各种添加剂，作为其例子，可以举出抗菌性保存剂、抗氧化剂、螯合剂、以及缓冲剂等。为了防止微生物的作用，可以使用各种抗菌剂以及抗真菌剂、例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸等。用于液体制剂的媒介物(Vehicle)、稀释剂或者添加剂，必须与其中所含的本公开涉及的免疫应答细胞C具有相容性。
液体制剂可以与血液是等渗。等渗可以通过使液体制剂包含氯化钠、或者其他的药学上可接受的浸透压调节物质(例如葡萄糖、硼酸、酒石酸钠、丙二醇、或其他的无机溶质或者有机溶质等)来达成。
本公开涉及的医药C除了包含本公开涉及的免疫应答细胞C之外，进而还包含其他抗癌剂。作为其他抗癌剂的例子，可以举出苯达莫司汀、异环磷酰胺、达卡巴嗪等烷化剂、喷司他丁、氟达拉滨、克拉屈滨、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、依诺他滨等代谢拮抗药、利妥昔单抗、西妥昔单抗、曲妥单抗等分子靶向药、伊马替尼、吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼、达沙替尼、舒尼替尼、曲美替尼等激酶阻断剂、硼替佐米等蛋白酶体阻断剂、环孢菌素、他克莫司等钙调神经磷酸酶阻断剂、伊达比星、多柔比星、丝裂霉素C等抗癌性抗生素、依立替康、依托泊苷等植物生物碱、顺铂、奥沙利铂、卡铂等铂制剂、他莫昔芬、比卡鲁胺等激素疗法药、干扰素等免疫调控药。其他的抗癌剂例如可以包含烷化剂以及代谢拮抗药中的至少一种。
<本公开涉及的医药C的癌症的治疗>
在将本公开涉及的医药C用于治疗癌症的情况下，治疗的对象例如是任意的哺乳动物即可，例如是灵长类的动物，更具体可以为人。治疗对象可以是宠物或者家畜，作为其例子，可以举出狗、猫、猪、牛、马、绵羊、山羊等。
成为治疗对象的癌症可以是实体癌，还可以是血癌，除了腺癌、鳞癌、腺鳞癌、未分化癌、大细胞癌、小细胞癌、皮肤癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、阴道癌、宫颈癌、宫体癌、肝癌、肾癌、胰腺癌、脾癌、肺癌、气管癌、支气管癌、结肠癌、小肠癌、胃癌、食管癌、胆囊癌、睾丸癌、卵巢癌等癌、骨组织、软骨组织、脂肪组织、肌肉组织、血管组织和造血组织的癌之外，还可以举出软骨肉瘤、尤文氏肉瘤、恶性血管内皮瘤、恶性神经鞘瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤等肉瘤、肝母细胞瘤、髓母细胞瘤、肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、胰母细胞瘤、胸膜肺母细胞瘤、视网膜母细胞瘤等母细胞瘤、胚细胞肿瘤、淋巴瘤、白血病。
通过本公开涉及的医药C，可以减轻癌症微环境中的免疫抑制性，成为治疗对象的癌症不限于血液系统的癌症，对实体癌也有治疗效果。因此，对于用以往的方法难以治疗的实体癌也发挥高有效性。
本公开涉及的医药C在确诊为癌症之前，甚至是怀疑有对象内的癌细胞存在的状况下，向对象施以预防给药。在本公开中，这样的使用形态也包含在用于治疗癌症的使用的概念中。
<对象中的癌症的治疗方法>
根据本公开涉及的一个方式，提供一种治疗对象中的癌症的方法(以下也称为本公开涉及的癌症的治疗方法C)，其包含向对象施以下述(a)的给药，
(a)对特异性识别癌抗原的细胞表面分子、白细胞介素7、CCL19、以及免疫抑制阻断性多肽进行表达的免疫应答细胞。
在这里，本公开涉及的癌症的治疗方法C中的免疫应答细胞是本公开涉及的免疫应答细胞C，关于其详细构成以及例子等，如与本公开涉及的免疫应答细胞C有关的上述说明所述。
除此之外，关于本公开涉及的癌症的治疗方法C中的对象、癌症的种类、用量、给药计划等、治疗方法的详细内容，如前述的本公开涉及的医药C的说明所述。本公开涉及的免疫应答细胞C可以以治疗有效量施以给药。
本公开涉及的癌症的治疗方法C通过由免疫应答细胞所表达的特异性识别癌抗原的细胞表面分子、IL-7、CCL19、以及免疫抑制阻断性多肽组成的因子的组合所致的协同效果，可以发挥改善程度令人吃惊的癌症治疗效果。
进而，根据本公开，提供对特异性识别癌抗原的细胞表面分子、白细胞介素7、CCL19、以及免疫抑制阻断性多肽进行表达的免疫应答细胞在用于治疗癌症的医药的制造中的使用。就该使用而言，关于免疫应答细胞、癌症的治疗等的详细内容，如前述的本公开涉及的医药C的说明所述。
除此之外，根据本公开，也提供一种用于治疗对象中的癌症的、对特异性识别癌抗原的细胞表面分子、白细胞介素7、CCL19、以及免疫抑制阻断性多肽进行表达的免疫应答细胞。
本公开涉及的医药C由在本公开涉及的组合医药A的说明中记载的容器收纳。也提供一种包含收纳有医药C的容器的制品。
如以上的说明所述，本公开涉及的一个方式，通过由免疫应答细胞所表达的特异性识别癌抗原的细胞表面分子、IL-7、CCL19、以及免疫抑制阻断性肽的组合所致的协同效果，可以得到改善程度令人吃惊的癌症治疗效果。
(实施例)
以下，根据实施例基，对实施方式进一步具体说明，本公开并不由此被限定。以下，只要没有特别说明，％以及ppm均为质量基准。
[IL-7×CCL19表达载体的制作]
人工合成小鼠IL-7(无终止密码子)、随后的F2A和编码小鼠CCL19的IL-7-F2A-CCL19 DNA片段(序列号9)。为了制作表达IL-7、CCL19以及eGFP的载体，通过限制酶(NcoI以及EcoRI)处理以及连接(Ligation)将合成的IL-7-F2A-CCL19 DNA片段插入到具有F2A-eGFP序列的pMSGV逆转录病毒表达载体(Tamada k et al.,Clin Cancer Res 18：6436-6445(2002))的MCS，得到包含IL-7-F2A-CCL19-F2A-eGFP DNA片段(序列号10)的pMSGV载体(7×19表达载体)。将得到的载体的图谱示于图1B。另外，作为对照，制作包含eGFP但不含IL-7以及CCL19的pMSGV载体(eGFP-Conv.载体)制作。将eGFP-Conv、载体的图谱示于图1A。需要说明的是，就序列号10而言，第1～462个碱基是IL-7(第1～75个碱基是IL-7的信号序列)，第463～537个碱基是F2A，第538～861个碱基是CCL19(第538～612个碱基是CCL19的信号序列)，第868～942是F2A，第946～1662个碱基是编码eGFP的核酸，第1663～1665个碱基是终止密码子。另外，与上述序列号10的碱基序列対应的氨基酸序列由序列号11表示。需要说明的是，由于使用限制酶NcoI，序列号10中的第4个碱基被从胸腺嘧啶(t)置换成鸟嘌呤(g)(序列号11中的第二个氨基酸被从苯丙氨酸(F)置换成缬氨酸(V))。
为了小鼠T细胞的转导，制作逆转录病毒。使用Lipofectamine 3000(ThermoFisher Scientific株式会社制)，将上述的7×19表达载体或者eGFP-Conv、载体、和pCL-Eco质粒(Imgenex公司制)转染到GP2-293包装细胞株(宝生物公司制)，制作已导入7×19表达载体或者eGFP-Conv.载体的逆转录病毒。
作为上述GP2-293细胞的培养液，使用添加了10％FCS、100U/ml的青霉素、100μg/ml的链霉素的DMEM。另外，作为在后述的实施例中使用的T细胞的培养液，使用添加了10％FCS、100U/ml的青霉素、100μg/ml的链霉素、50mM的2-巯基乙醇的RPMI-1640。
[对特异性识别P815肿瘤抗原P1A的TCR、IL-7、CCL19、以及eGFP进行表达的T细胞的制作]
从天本SLC株式会社(日本静冈县)购入雌雄的DBA/2小鼠(6～81周龄)，用于实验。将对特异性识别H-2Ld限制性的P815肿瘤抗原P1A的TCR进行表达的转基因小鼠(Sarma,S.,Y.Guo,Y.Guilloux,C.Lee,X.-F.Bai,Y.Liu.1999.J.Exp.Med.189：811-820)与DBA/2小鼠回交至少10代。全部小鼠在无病原体的条件被维持。
从对特异性识别回交后的P1A的TCR进行表达的转基因小鼠采集脾细胞，得到源自脾细胞的对P815肿瘤抗原P1A特异性TCR进行表达的小鼠T细胞(P1A特异性TCR-T细胞；以下也称为载体未导入P1A-TCRT细胞)。需要说明的是，与是否导入载体无关，将表达P1A特异性TCR的小鼠T细胞总称为P1A-TCRT细胞。为了转导，将载体未导入P1A-TCRT细胞在适于细胞活化的适当量的P1A肽(LPYLGWLVF；序列号12)以及IL-2的存在下孵育48小时，使其活化。在48小时的孵育之后，回收培养细胞，使用mouse Pan T cell Isolation Kit(MiltenyiBiotec,Bergisch Gladbach,Germany制)，通过负磁分选对载体未导入P1A-TCRT细胞进行浓缩。将已分离的载体未导入P1A-TCRT细胞转移到涂有25μg/ml的RetroNectin(注册商标：宝生物公司制)的板上。在上述板上被活化的上述载体未导入P1A-TCRT细胞(1×106cells/ml)的存在下，对含有已导入上述制作的7×19表达载体或者已导入eGFP-Conv.载体的逆转录病毒的上清进行混合，以1500rpm离心2小时，培养6小时。为了从培养液除去逆转录病毒，回收T细胞，进行清洗，转移到含有IL-2的新的增殖培养液(RPMI-1640)，进而培养2天，得到包含已导入7×19表达载体的P1A-TCRT细胞(以下也称为eGFP表达P1A-7×19TCRT细胞)的P1A-TCRT细胞的群、或者包含已导入eGFP-Conv.载体的P1A-TCRT细胞(以下也称为eGFP表达P1A-TCRT细胞)的P1A-TCRT细胞的群。各表达载体的转导通过检测eGFP作为替代标记(surrogate markers)的流式细胞仪分析来确认。如上所述，eGFP表达P1A-7×19TCRT细胞以及eGFP表达P1A-TCRT细胞，并不占据各P1A-TCRT细胞群的整体，在本说明书中，为了简化记载，除非另有说明，将针对该细胞群的处理记载为针对eGFP表达P1A-7×19TCRT细胞或者eGFP表达P1A-TCRT细胞的处理。
[基因导入的确认]
(流式细胞仪分析)
eGFP以及CD8的表达水平是通过双色流式细胞仪分析进行的。在别藻蓝蛋白(APC)结合抗CD8单克隆抗体(53-6.7，Affymetrix公司制)的存在下对未进行基于逆转录病毒的基因导入的载体未导入P1A-TCRT细胞、eGFP表达P1A-7×19TCRT细胞、以及eGFP表达P1A-TCRT细胞进行培养。流式细胞仪使用EC800(索尼株式会社制)或者BD LSRForetessa X-20(BD Biosciences公司制)，数据分析使用FlowJo software(Tree Star公司制)。
将结果以散点图的形式示于图2。在图2、图3A以及图3B中，“Transduction(-)”表示未进行基因导入的P1A-TCRT细胞(载体未导入P1A-TCRT细胞)，“Conv.P1A-T cells”表示eGFP表达P1A-TCRT细胞，“7×19P1A-T cells”表示eGFP表达P1A-7×19TCRT细胞。另外，图2中记载的百分数的值示出在各区域存在的细胞数的比例。
如图2所示，就eGFP表达P1A-7×19TCRT细胞以及eGFP表达P1A-TCRT细胞而言，表达eGFP的T细胞被观察到70％～80％左右，可知7×19表达载体或者eGFP-Conv.载体被成功导入。
(基于ELISA的分析)
回收上述中将eGFP表达P1A-7×19TCRT细胞或者eGFP表达P1A-TCRT细胞培养2天后的培养上清，使用市售的ELISA试剂盒(R&Dsystems公司制)对培养上清中的IL-7以及CCL19的浓度进行测定。结果示于图3A以及图3B。标准差与3连孔的平均值一起也示于图表中。图表中的“N.D.”表示未被检测，“***”表示P值为P<0.001。如图3A以及图3B所示，在eGFP表达P1A-7×19TCRT细胞中，IL-7以及CCL19的表达得到确认。
(通过对荷癌小鼠给药的抗癌效果的分析)
在第0天，向6～81周龄的雌雄的DBA/2小鼠在侧腹皮下接种用0.1ml的HBSS悬浮的5×105个P815肥大细胞瘤(mastocytoma)。需要说明的是，P815肥大细胞瘤与DBA/2小鼠同源，以后简称为单P815细胞、P815肿瘤细胞。第6天，为了对小鼠预处理而进行亚致死剂量(3-5Gy)的照射。第7天，将小鼠分成6个组，第1组以及第2组是静脉给药eGFP表达P1A-7×19TCRT细胞1×106个，第3组以及第4组是静脉给药eGFP表达P1A-TCRT细胞1×106个，第5组以及第6组不进行T细胞的给药(需要说明的是，如上所述，所记载的细胞数是包含eGFP表达P1A-7×19TCRT细胞或者eGFP表达P1A-TCRT细胞的P1A-TCRT细胞群中的T细胞总数)。另外，关于第2组、第4组以及第6组的小鼠，进而，以第10天为初次，以1周1次的频度且以100μg/个体的量腹腔内注射抗PD-1单克隆抗体(默克公司制，Clone G4；以下中记载的抗PD-1单克隆抗体也同样)，共计6次。对各小鼠的生存率进行分析，并1周2次测定小鼠的肿瘤体积。肿瘤体积用数显卡尺测定，按照下式求出。
肿瘤体积＝1/2×(肿瘤的长轴长)×(肿瘤的短轴长)2
各小鼠的生存率的分析结果示于图4，测定肿瘤体积的结果示于图5A～5F。数据集中了独立的5次实验。
在图4以及图5A～5F中，□表示未给药小鼠(样本量＝15只；上述第5组)，■表示仅给药抗PD-1单克隆抗体的小鼠(样本量＝11只；上述第6组)，△表示给药eGFP表达P1A-TCRT细胞的小鼠(样本量＝17只；上述第3组)，▲表示除了给药eGFP表达P1A-TCRT细胞还给药抗PD-1单克隆抗体的小鼠(样本量＝14只；上述第4组)，○表示给药eGFP表达P1A-7×19TCRT细胞的小鼠(样本量＝24只；上述第1组)，●表示除了给药eGFP表达P1A-7×19TCRT细胞还给药抗PD-1单克隆抗体的小鼠(样本量＝19只；上述第2组)。在图4以及图5A～5F中，横轴表示皮下接种P815肥大细胞瘤之后的天数(day)。另外，图5A～5F中也记载了相对于每组的小鼠总数(分母)的肿瘤排斥小鼠的数量(分子)。就Logrank检验中的P值而言，在△组和○组之间是P＝0.0005，在▲组和●组之间是P＝0.0002，在△组和▲组之间是P＝0.7284，在○组和●组之间是P＝0.0253。
根据如图4以及图5A～5F所示的结果，可知除了给药eGFP表达P1A-7×19TCRT细胞还给药抗PD-1单克隆抗体的小鼠(●)，能够达成给药eGFP表达P1A-7×19TCRT细胞的小鼠(○)或者除了给药eGFP表达P1A-TCRT细胞还给药PD-1单克隆抗体的小鼠(▲)无法达成的水平的生存率的上升以及实体癌的肿瘤体积增加的抑制。另一方面，在给药eGFP表达P1A-TCRT细胞和抗PD-1单克隆抗体给药的小鼠(▲)中，未见高协同效果。
(已破坏PD-1或ROSA26的P1A-TCRT的制作)
为了基因编辑，与上述一样在P1A肽(LPYLGWLVF；序列号12)以及IL-2的存在下孵育适于细胞活化的适当量的载体未导入P1A-TCRT细胞48小时，使其活化。在48小时的孵育之后，回收培养细胞，使用mouse Pan T cell Isolation Kit(Miltenyi Biotec,BergischGladbach,Germany)，通过负磁分选对载体未导入P1A-TCRT细胞进行浓缩。清洗得到的T细胞PBS，在Buffer R(Thermo Fisher Scientific株式会社制)中再悬浮，与由TrueCut(注册商标)Cas9蛋白质v2(Thermo Fisher Scientific株式会社制)以及基因特异性引导RNA构成的Cas9-RNP复合体混合。使用Neon Transfection System(Invitrogen公司制)，通过电穿孔将Cas9-RNP复合体导入T细胞。由此进行目标基因的破坏。进而，在电穿孔后马上使T细胞在包含IL-2的cRPMI中再悬浮，与上述一样将7×19表达载体包装于逆转录病毒，向T细胞导入。需要说明的是，以小鼠PD-1为靶的引导RNA，参考Okada M,et al.Blockage of CoreFucosylation Reduces Cell-Surface Expression of PD-1and Promotes Anti-tumorImmune Responses of T Cells.Cell Rep.2017；20(5)：1017-1028进行设计，引导RNA部分的序列是5’-UCUGGGCAUGUGGGUCCGGC-3’(序列号13)。另外，引导RNA的合成委托ThermoFisher Scientific株式会社进行。作为对照，将引导RNA改成以ROSA26为靶的5’-CUCCAGUCUUUCUAGAAGAU-3’(序列号14)，进行小鼠ROSA26的破坏。以ROSA26为靶的引导RNA是从Thermo Fisher Scientific株式会社购入的。
(已破坏PD-1或者ROSA26的P1A-TCRT的给药实验)
第0天，向6～81周龄的雌雄的DBA/2小鼠侧腹皮下接种用0.1ml的HBSS悬浮的5×105个P815肥大细胞瘤(肥大细胞瘤)。第6天，为了对小鼠预处理而进行亚致死剂量(3-5Gy)的照射。将小鼠分成4个组，第7天以后分别进行以下的处置。
第1组：不进行T细胞的给药也不进行抗体的给药。
第2组：在第7天静脉给药已敲低(knockdown)ROSA26的eGFP表达P1A-7×19TCRT细胞1×106个。
第3组：在第7天静脉给药包含已敲低PD-1的eGFP表达P1A-7×19TCRT细胞的细胞群1×106个。
第4组：在第7天静脉给药包含已敲低PD-1的eGFP表达P1A-7×19TCRT细胞的细胞群1×106个静脉给药，进而，以10天为初次，以1周1次的频度且以100μg/个体的量腹腔内注射抗PD-1单克隆抗体，共计6次。
需要说明的是，如上所述，所记载的细胞数是包含eGFP表达P1A-7×19TCRT细胞的P1A-TCRT细胞群中的T细胞的总数。
然后，对各小鼠的生存率进行分析，并通过使用上述的数显卡尺的方法1周2次测定小鼠的肿瘤体积。各小鼠的生存率的分析结果示于图6A，肿瘤体积测定的结果示于图6B～6E。需要说明的是，样本量在任何组都为N＝6。
在图6A～6E中，×表示未给药小鼠(上述第1组)，□表示给药已敲低ROSA26区域的eGFP表达P1A-7×19TCRT细胞的小鼠(上述第2组)，◇表示给药已敲低PD-1的eGFP表达P1A-7×19TCRT细胞的小鼠(上述第3组)，◆表示除了给药已敲低PD-1的eGFP表达P1A-7×19TCRT细胞还给药抗PD-1单克隆抗体的小鼠(上述第4组)。
在图6A～6E中，横轴表示皮下接种P815肥大细胞瘤之后的天数(day)。另外，图6B～6E也记载了相对于每组的小鼠总数(分母)的肿瘤排斥小鼠的数量(分子)。就Logrank检验中的P值而言，在×组和○组之间是P＝0.0454，在□组和◇组之间是P＝0.0431，在◇组和◆组之间是P＝0.0402。
根据图6A～6E所示的结果，可知由除了给药eGFP表达P1A-7×19TCRT细胞还给药抗PD-1单克隆抗体的小鼠获得的癌症治疗效果，与eGFP表达P1A-7×19TCRT细胞中仅敲低PD-1的情况相比更高。这表示给药抗PD-1单克隆抗体不仅促进eGFP表达P1A-7×19TCRT细胞的免疫应答，还促进通过eGFP表达P1A-7×19TCRT细胞诱导到癌细胞周边的内源性的免疫细胞的作用。
(小鼠脾脏中的P1A-TCRT细胞的维持)
第0天，向6～81周龄的雌雄的DBA/2小鼠侧腹皮下接种用0.1ml的HBSS悬浮的5×105个P815肥大细胞瘤(肥大细胞瘤)。第6天，对小鼠预处理并进行亚致死剂量(3-5Gy)的照射。第7天，将小鼠分成两个组，第1组是静脉给药eGFP表达P1A-7×19TCRT细胞1×106个，第2组是静脉给药eGFP表达P1A-TCRT细胞1×106个。对肿瘤已完全消退的小鼠个体在第119天实施安乐死，收集脾细胞，计数，用流式细胞仪进行分析，对脾脏中的P1A-TCRT细胞的维持进行评价。进而，使用磁性分选法从脾细胞分离T细胞，将2×106个T细胞与用丝裂霉素C处理过的1×106个P815细胞一起孵育。3天后以及5天后，回收培养上清，通过ELISA测定IFN-γ的浓度。另外，用流式细胞仪测定与P815细胞的培养期间的P1A-TCRT细胞的数量(每1孔)。通过这些试验，对脾脏中的P1A-TCRT细胞的功能进行评价。
关于样本量，eGFP表达P1A-7×19TCRT细胞给药组为5只，eGFP表达P1A-TCRT细胞给药组为2只。
关于所收集的脾细胞，通过与图2所示的实验相同的流式细胞仪(不过，门(gate)从4分门变为包含CD8-eGFP+门和CD8+eGFP+门的客户门(Custom gate))，对CD8和eGFP的表达进行测定的结果示于图7。另外，脾细胞中未表达CD8但表达有eGFP的细胞(CD8-eGFP+细胞)的比例的平均值在图8A中用白条表示，细胞数的平均值在图8B中白条表示。另外，脾细胞中CD8和eGFP均表达的细胞(CD8+eGFP+细胞)的比例的平均值在图8A中用黑条表示，细胞数的平均值在图8B中用黑条表示。在图8A以及图8B中，Conv.“P1A-T cells”的数据由于值小而几乎不可见，而白条位于黑条的左侧。在图7、图8A以及图8B中，“Conv.P1A-T cells”表示eGFP表达P1A-TCRT细胞给药组，“7×19P1A-T cells”表示eGFP表达P1A-7×19TCRT细胞给药组。根据图7、图8A以及图8B所示的结果，可知在eGFP表达P1A-7×19TCRT细胞给药组中，即便是第119天的小鼠，保持已导入基因的P1A-TCRT细胞得到维持。需要说明的是，就图7中记载的百分数的值而言，示出未表达CD8但表达有eGFP的细胞(CD8-eGFP+细胞)数的比例(在eGFP表达P1A-TCRT细胞给药组为0.055％，在eGFP表达P1A-7×19TCRT细胞给药组为0.97％)以及CD8和eGFP均表达的细胞(CD8+eGFP+细胞)数的比例(在eGFP表达P1A-TCRT细胞给药组为0.0068％，在eGFP表达P1A-7×19TCRT细胞给药组为0.47％)。
进而，使用流式细胞仪测定与P815细胞的培养期间的CD8和eGFP均表达的P1A-TCRT细胞数(每1孔)而得的结果示于图8C。另外，使用ELISA测定培养上清而得的IFN-γ的浓度示于图8D。在图8C以及图8D中，各时间点的左侧的条(白条)表示eGFP表达P1A-TCRT细胞给药组的结果，各时间点的右侧的条(黑条)表示eGFP表达P1A-7×19TCRT细胞给药组。不过，在图8C中，表示eGFP表达P1A-TCRT细胞给药组的结果的左侧的条，与横轴重叠(也就是说，CD8和eGFP均表达的P1A-TCRT细胞数几乎为0)，所以实际上不可见。在图8C以及图8D中，结果通过平均值以及标准差示出，*表示P值为P<0.05，**表示P<0.01。
根据图8C以及图8D所示的结果，可知即便是119天的小鼠，保持已导入的基因保持的P1A-TCRT细胞的功能被保持。
(基于癌细胞的再挑战实验)
第0天，向6～81周龄的雌雄的DBA/2小鼠侧腹皮下接种用0.1ml的HBSS悬浮的5×105个P815细胞。第6天，对小鼠预处理并进行亚致死剂量(3-5Gy)的照射。第7天，静脉给药eGFP表达P1A-7×19TCRT细胞1×106个的(需要说明的是，如上所述，所记载的细胞数是包含eGFP表达P1A-7×19TCRT细胞的P1A-TCRT细胞群中的T细胞的总数)。进而，以第10天为初次，以1周1次的频度且以100μg/个体的量腹腔内注射抗PD-1单克隆抗体，共计6次。对于肿瘤已完全消退的4只小鼠，在第117天再次向侧腹再度下接种用0.1ml的HBSS悬浮的5×105个P815肥大细胞瘤(肥大细胞瘤)。进而，作为对照，向6只天然DBA/2小鼠侧腹皮下接种用0.1ml的HBSS悬浮的5×105个P815肥大细胞瘤(肥大细胞瘤)。将针对肿瘤已完全消退的小鼠的P815细胞的再接种日、或者针对天然DBA/2小鼠的P815细胞的接种日为0天，将直到第20天的小鼠的肿瘤体积的测定结果和经过天数一起示于图9。小鼠的肿瘤体积如图5A～5F的记载所述用数显卡尺进行测定，在本实验中用平均值以及标准差示出。
在图9中，×表示对天然DBA/2小鼠接种P815细胞的结果，●表示对肿瘤已完全消退的小鼠再接种P815细胞的结果。
由图9示的结果可知，通过eGFP表达P1A-7×19TCRT细胞和抗PD-1单克隆抗体的给药而治愈的小鼠，即便在第117天也保持针对癌细胞的抵抗力。
[表达IL-7以及CCL19的CAR-T细胞的制作]
通过在国际公开第2016/56228号的0061段～0066段中记载的方法，制作对照抗hCD20 CAR载体以及IL-7/CCL19表达-抗hCD20 CAR载体，导入DBA/2小鼠的脾脏以及淋巴结来源的3×106个纯化后的小鼠T细胞，制作抗hCD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞或者抗hCD20 CAR表达T细胞。对照抗hCD20 CAR载体是包含对抗hCD20 CAR进行编码的核酸的载体，IL-7/CCL19表达-抗hCD20 CAR载体是包含按顺序对抗hCD20CAR-F2A-IL-7-F2A-CCL19进行编码的核酸的载体。
(通过对荷癌小鼠给药的抗癌效果的分析)
第0天，向6～121周龄的雄DBA/2小鼠侧腹皮下接种用0.1ml的HBSS悬浮的5×105个P815-hCD20肿瘤细胞(Nat Biotechnol.2018；36(4)：346-351)。第11天，向小鼠的腹腔内给药作为抗癌剂的环磷酰胺(CPA、100mg/kg)。将小鼠分成5个组，以后的处理如以下所述。
第1组：既未CAR表达T细胞给药也未抗体给药。
第2组：以第17天为起始日每4～5天腹腔内给药抗PD-1单克隆抗体，共计5次。
第3组：第14天静脉给药0.25×106个抗hCD20 CAR表达T细胞，以第17天为起始日每4～5天以100μg/个体的量腹腔内给药抗PD-1单克隆抗体，共计5次。
第4组：第14天静脉给药0.25×106个抗hCD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞，以第17天为起始日每4～5天以100μg/个体的量腹腔内给药不识别PD-1的仓鼠对照IgG抗体，共计5次。
第5组：第14天静脉给药0.25×106个抗hCD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞，以第17天为起始日每4～5天以100μg/个体的量腹腔内给药抗PD-1单克隆抗体，共计5次。
对各小鼠的生存率进行分析，并通过使用上述的数显卡尺的方法1周2次测定小鼠的肿瘤体积。各小鼠的生存率的分析结果示于图10A，测定直至第70天的肿瘤体积的测定结果示于图10B～10F。数据是集中了独立的2次实验的结果的数据。
在图10A～10F中，×表示未给药小鼠(样本量＝10只；上述第1组)，□表示仅给药抗PD-1单克隆抗体的小鼠(样本量＝10只；上述第2组)，◆表示除了给药抗hCD20 CAR表达T细胞还给药抗PD-1单克隆抗体的小鼠(样本量＝5只；上述第3组)，○表示除了给药抗hCD20CAR-IL-7/CCL19表达T细胞还给药不识别PD-1的仓鼠对照IgG抗体的小鼠(样本量＝10只；上述第4组)，●表示除了给药抗hCD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞还给药抗PD-1单克隆抗体的小鼠(样本量＝10只；上述第5组)。不过，图10B～10F中所有组均为N＝5。在图10A～10F中，横轴表示皮下接种P815-hCD20肿瘤细胞之后的天数(day)。另外，图10B～10F也记载了相对于各组的小鼠总数(分母)的肿瘤排斥小鼠的数量(分子)。就Logrank检验中的P值而言，在□组和◆组之间是P＝0.7293，在□组和●组之间是P<0.0001，在◆组和●组之间是P<0.0001，在○组和●组之间是P<0.0001。
根据图10A～10F所示的结果，在除了给药抗hCD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞还给药抗PD-1单克隆抗体的小鼠(●)中，即便是给药量为分别单独给药无法获得足够抗癌效果的用量的情况，也可以达成显著高的生存率以及实体癌的肿瘤体积增加的抑制。另一方面，在除了给药抗hCD20CAR表达T细胞还给药抗PD-1单克隆抗体的小鼠(▲)或者除了给药抗hCD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞还给药对照IgG抗体的小鼠(○)中，不会获得这样的效果。
另外，抗hCD20 CAR表达T细胞的给药量较少，如上述所示为0.25×106个，在与抗PD-1单克隆抗体共同给药的情况下，即便细胞数少，也会得到高效果。
(淋巴细胞向肿瘤组织的浸润的分析)
第0天，向DBA/2小鼠接种P815肿瘤细胞，在第7天静脉注射eGFP表达P1A-TCRT细胞或者eGFP表达P1A-7×19TCRT细胞。需要说明的是，这些细胞在注射前纯度提高到eGFP阳性细胞的比例超过95％。采集肿瘤细胞，制备成单细胞悬浮液，第12天，测量细胞数，通过流式细胞仪分析调查c-kit、eGFP、CD11c、CD3、CD4以及CD8的表达。图11A示出具有代表性的点图。示出鉴定为非肿瘤细胞的c-kit阴性细胞的比例(左上的图)、c-kit阴性细胞群中CD-3阴性/CD11c阳性的树突状细胞的比例(右上的图)、以及CD-3阳性/eGFP阴性的内源性T细胞的比例以及CD3-阳性/eGFP阳性的被注射的P1A-TCRT细胞的比例(中央的图)。在图11A中，“Conv.P1A-T cells”表示eGFP表达P1A-TCRT细胞的给药组，“7×19P1A-T cells”表示eGFP表达P1A-7×19TCRT细胞的给药组。示出内源性T细胞群中CD-4阳性细胞或者CD8阳性细胞的比例(左下的图)以及注射的P1A-TCRT细胞的比例(右下的图)。图11B中通过平均值以及标准差(SD)示出每1×105个P815肿瘤细胞的各种肿瘤浸润淋巴细胞的细胞数(n＝5)。DC表示树突状细胞，Endogenous T表示内源性T细胞，P1A-T表示P1A-TCRT细胞。白条表示用eGFP表达P1A-TCRT细胞处理过的小鼠中的肿瘤浸润淋巴细胞亚群，黑条表示用eGFP表达P1A-7×19TCRT细胞处理过的小鼠中的肿瘤浸润淋巴细胞亚群。*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。
需要说明的是，为了从P815肿瘤细胞分离肿瘤浸润淋巴细胞，使用已知在P815肥大细胞瘤为高度阳性且在树突状细胞以及T细胞为低阳性度的的c-kit染色。根据图11A以及图11B的结果可知，首先，被注射eGFP表达P1A-7×19TCRT细胞的小鼠中c-kit阴性的肿瘤浸润淋巴细胞的比例，高于被注射eGFP表达P1A-TCRT细胞的小鼠中c-kit阴性的肿瘤浸润淋巴细胞的比例。就c-kit阴性肿瘤浸润淋巴细胞的亚群而言，CD3阴性/CD11c阳性的树突状细胞的比例也示于图11A。图11A进而还示出CD3阳性/eGFP阴性的内源性T细胞的亚群、以及为CD3阳性/eGFP阳性的被注射的P1A-TCRT细胞或P1A-7×19TCRT细胞的亚群中CD4以及CD8的表达比例。通过与CD4/CD8染色有关的进一步分析，用eGFP表达P1A-7×19TCRT细胞处理过的小鼠中肿瘤浸润树突状细胞、CD-4阳性以及CD8阳性内源性T细胞、以及CD8阳性P1A-T细胞的数量，显著多于用eGFP表达P1A-TCRT细胞处理过的小鼠中它们的数量。这示于图11B。在图11B中，示出与白条(用eGFP表达P1A-TCRT细胞处理过的小鼠中的肿瘤浸润淋巴细胞亚群)相比，在黑条(用eGFP表达P1A-7×19TCRT细胞处理过的小鼠中的肿瘤浸润淋巴细胞亚群)中，DC(树突状细胞)、Engogenous T(内源性T细胞)、以及注射的P1A-TCRT细胞或P1A-7×19TCRT细胞的任一种的细胞数都更多。这些结果证明内源性T细胞在基于eGFP表达P1A-7×19TCRT细胞的处理中的重要作用。这与通过抗PD-1单克隆抗体和eGFP表达P1A-7×19TCRT细胞的组合而不是抗PD-1单克隆抗体和eGFP表达P1A-TCRT细胞获得协同效果是一致的。
(抗hCD20 CAR-抗PD-1抗体表达载体的制作)
将序列号15的核酸序列的构建物，使用NcoI位点以及SalI位点导入到pMSGV逆转录病毒表达载体(Tamada k et al.,Clin Cancer Res 18：6436-6445(2002))，制作包含抗hCD20scFvCAR以及抗mPD-1scFv的pMSGV载体(以后也称为抗hCD20 CAR-抗PD-1抗体表达载体)。将得到的载体的配置图作为conventional CAR-PD-1scFv示于图12。在序列号15的核酸序列中，从5’末端数起，第1～57个核苷酸相当于编码前导序列的核酸序列，第58～375个核苷酸相当于编码抗hCD20scFv轻链的核酸序列，第376～420个核苷酸相当于编码连接体的核酸序列，421～783个核苷酸相当于编码抗hCD20scFv重链的核酸序列，第793～1635个核苷酸相当于编码跨膜区以及细胞质区域的核酸序列，第1642个核苷酸～1716个核苷酸相当于编码2A肽的核酸序列，第1717～1773个核苷酸相当于编码前导序列的核酸序列，第1774～2106个核苷酸相当于编码抗mPD-1scFv轻链的核酸序列，第2107～2151个核苷酸相当于编码连接序列的核酸序列，第2152～2505个核苷酸相当于编码抗mPD-1scFv重链的核酸序列，第2506～2529个核苷酸相当于编码FLAG标签的核酸序列，第2539～2556个核苷酸相当于编码His标签的核酸序列。需要说明的是，就抗hCD20 CAR-抗PD-1抗体表达载体以及后述的抗hCD20 CAR-IL-7/CCL19-抗PD-1抗体表达载体而言，作为2A肽，使用口蹄疫病毒的2A肽(也称为F2A肽)的。通过将2A肽插入到基因间，同时表达多个多肽成为可能。另外，如上所述，抗hCD20 CAR-抗PD-1抗体表达载体以及后述的抗hCD20CAR-IL-7/CCL19-抗PD-1抗体表达载体包含FLAG标签以及His标签(His×6)的序列。
序列号15的核酸序列所编码的氨基酸序列示为序列号16。就序列号16而言，从N末端数起，第1～545位的氨基酸序列为抗hCD20 CAR的氨基酸序列，第548～572位的氨基酸序列为2A肽的氨基酸序列，第592～702位的氨基酸序列为抗mPD-1VL的氨基酸序列，第703～717位的氨基酸序列为连接体的氨基酸序列，第718～835位的氨基酸序列为抗mPD-1VH的氨基酸序列，第836～843位的氨基酸序列为FLAG标签的氨基酸序列，第847～852位的氨基酸序列为His标签的氨基酸序列。
(抗hCD20 CAR-IL-7/CCL19-抗PD-1抗体表达载体的制作)
将序列号17的核酸序列的构建物，使用NcoI位点以及SalI位点导入到pMSGV逆转录病毒表达载体(Tamada k et al.,Clin Cancer Res 18：6436-6445(2002))，制作包含抗hCD20scFvCAR、mIL-7、mCCL19、以及抗mPD-1scFv的pMSGV载体(以后也称为抗hCD20 CAR-IL-7/CCL19-抗PD-1抗体表达载体)。得到的载体的配置图在图12作为7×19CAR-PD-1scFv示出。就序列号17的核酸序列而言，从5’末端数起，第1～57个核苷酸相当于编码前导序列的核酸序列，第58～375个核苷酸相当于编码抗hCD20scFv轻链的核酸序列，第376～420个核苷酸相当于编码连接的核酸序列，第421～783个核苷酸相当于编码抗hCD20scFv重链的核酸序列，第792～1038个核苷酸相当于编码小鼠CD8的核酸序列，第1039～1161个核苷酸相当于编码小鼠CD28的核酸序列，第1162～1296个核苷酸相当于编码小鼠4-1BB的核酸序列，第1297～1635个核苷酸相当于编码小鼠CD3ζ的核酸序列，第1642～1716个核苷酸相当于编码2A肽的核酸序列，第1720～1794个核苷酸相当于编码mIL-7的前导序列的核酸序列，第1720～2181个核苷酸相当于编码m编码IL-7的核酸序列，第2182～2256个核苷酸相当于编码2A肽的核酸序列，第2257～2331个氨基酸序列为mCCL19的前导序列编码的氨基酸序列，第2257～2580个核苷酸相当于编码mCCL19的核酸序列，第2584～2658个核苷酸相当于编码2A肽的核酸序列，第2659～2715个核苷酸相当于编码前导序列的核酸序列，第2716～3048个核苷酸相当于编码抗mPD-1scFv轻链的核酸序列，第3049～3093个核苷酸相当于编码连接体序列的核酸序列，第3094～3447个核苷酸相当于编码抗mPD-1scFv重链的核酸序列，第3448～3471个核苷酸相当于编码FLAG标签的核酸序列，第3480～3497个核苷酸相当于编码His标签的核酸序列。
序列号17的核酸序列所编码的氨基酸序列示为序列号18。就序列号18而言，从N末端数起，第1～261位的氨基酸序列为抗hCD20scFv的氨基酸序列，第265～346位的序列为mCD8的氨基酸序列，第347～387位的氨基酸序列为mCD28的氨基酸序列，第388～432位的氨基酸序列为m4-1BB的氨基酸序列，第433～545位的氨基酸序列为mCD3的氨基酸序列，第548～572位的氨基酸序列为2A肽的氨基酸序列，第574～727位的氨基酸序列为mIL-7的氨基酸序列，第728～752位的氨基酸序列为2A肽的氨基酸序列，第753～860位的氨基酸序列为mCCL19的氨基酸序列，第862～886位的氨基酸序列为2A肽的氨基酸序列，第906～1016位的氨基酸序列为抗mPD-1VL的氨基酸序列，第1017～1031位的氨基酸序列为连接体的氨基酸序列，第1032～1149位的氨基酸序列为抗mPD-1VH的氨基酸序列，第1150～1157位的氨基酸序列为FLAG标签的氨基酸序列，第1161～1166位的氨基酸序列为His标签的氨基酸序列。
(已导入抗hCD20 CAR-抗PD-1抗体表达载体、或者抗hCD20CAR-IL-7/CCL19-抗PD-1抗体表达载体的逆转录病毒的制作)
为了小鼠T细胞的转导，制作逆转录病毒载体。使用Lipofectamine(注册商标)2000或者3000(Life Technologies公司制)，对GP2-293包装细胞(宝生物公司制)转染上述的抗hCD20 CAR-抗PD-1抗体表达载体或者抗hCD20 CAR-IL-7/CCL19-抗PD-1抗体表达载体、和pCL-Eco逆转录病毒包装质粒(Imgenex公司制)，制作已导入抗hCD20 CAR-抗PD-1抗体表达载体或者抗hCD20 CAR-IL-7/CCL19-抗PD-1抗体表达载体的逆转录病毒。转染后经48小时后回收含有上述逆转录病毒的上清。
作为上述GP2-293细胞的培养液，使用添加了10％FCS、100U/ml的青霉素、100mg/ml的链霉素的DMEM。另外，作为在后述的实施例中使用的T细胞的培养液，使用添加了10％FCS、100U/ml的青霉素、100mg/ml的链霉素、50mM的2-巯基乙醇、2mM的L-谷氨酰胺的RPMI-1640。
另外，同样地，还制作除了不含编码抗PD-1scFv的核酸序列以外与抗hCD20 CAR-抗PD-1抗体表达载体相同的表达载体(以下也称为抗hCD20 CAR表达载体)、以及除了不含编码抗PD-1scFv的核酸序列以外与抗hCD20 CAR-IL-7/CCL19-抗PD-1抗体表达载体相同的表达载体(以下也称为抗hCD20 CAR-IL-7/CCL19表达载体)，使用其同样地制作逆转录病毒载体。
(小鼠T细胞的转导)
为了小鼠T细胞的转导，将脾脏以及淋巴结来源的纯化后的小鼠T细胞，用已固层化的抗CD3单克隆抗体(3μg/ml)、抗CD28单克隆抗体(1μg/ml)、IL-2(100IU/ml)活化48小时。接着，将含有已导入在上述中制作的抗hCD20 CAR-抗PD-1抗体表达载体、抗hCD20CAR-IL-7/CCL19-抗PD-1抗体表达载体、抗hCD20 CAR表达载体、或者抗hCD20 CAR-IL-7/CCL19表达载体的逆转录病毒的上清，与在涂有25μg/ml的RetroNectin(注册商标：宝生物公司制)的板上活化的上述的小鼠T细胞(1×106cells/ml)混合，以1500rpm离心2小时，在IL-2(100IU/ml)的存在下培养6小时。为了从培养液除去逆转录病毒，回收小鼠T细胞，转移到含有IL-2(100IU/ml)的新的增殖培养液(RPMI)，进而培养42小时，得到已导入抗hCD20 CAR-抗PD-1抗体表达载体的小鼠T细胞(以下也称为抗hCD20 CAR-抗PD-1抗体表达T细胞)、已导入抗hCD20CAR-IL-7/CCL19-抗PD-1抗体表达载体的小鼠T细胞(以下也称为抗hCD20 CAR-IL-7/CCL19-抗PD-1抗体表达T细胞)、已导入抗hCD20 CAR表达载体的小鼠T细胞(以下也称为抗hCD20 CAR表达T细胞)、或者已导入抗hCD20 CAR-IL-7/CCL19表达载体的小鼠T细胞(以下也称为抗hCD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞)。
为了检测CAR表达，用生物素化的重组protein L(也记为protein L-bio)对未转导的T细胞(在图13中记为uninf.)或者转导了各种编码上述CAR的逆转录病毒载体的T细胞进行染色，接着用使其结合别藻蓝蛋白的链霉亲和素(也记为sav-apc)进行染色。用流式细胞仪分析CAR的表达水平。结果示于图13。
在图13以后的图中，uninf.表示未转导的T细胞，conv.表示抗hCD20CAR表达T细胞，conv./PD-1表示抗hCD20 CAR-抗PD-1抗体表达T细胞，7×19表示抗hCD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞，7×19/PD-1表示抗hCD20 CAR-IL-7/CCL19-抗PD-1抗体表达T细胞。就图13中的各T细胞的数据而言，左侧是FSC-SSC绘图(plot)，右侧是别藻蓝蛋白染色的阳性度(横轴)和细胞数(纵轴)的图表。另外，右侧的图表中所示的直方图表示染色阳性的细胞的比例(％)。如图13所示，可知未转导的T细胞以外的用编码CAR的逆转录病毒载体转导的T细胞，如预期的那样表达CAR。
在将各种CAR-T细胞用于实验之前，用ELISA试剂盒测定IL-7的浓度以及CCL19的浓度。具体而言，将未转化的T细胞、抗hCD20 CAR表达T细胞、抗hCD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞、抗hCD20 CAR-抗PD-1抗体表达T细胞、或者抗hCD20 CAR-IL-7/CCL19-抗PD-1抗体表达T细胞培养2天，回收培养上清，使用市售的ELISA试剂盒(R&D systems公司制)测定培养上清中的IL-7以及CCL19的浓度。结果示于图14。在图14中，3连孔的平均值和标准差也示于图表。需要说明的是，在各图表中，数据从左侧开始依次以未转化的T细胞(uninf.)、抗hCD20 CAR表达T细胞(conv.)、抗hCD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞(7×19)、抗hCD20 CAR-抗PD-1抗体表达T细胞(conv./PD-1)、抗hCD20CAR-IL-7/CCL19-抗PD-1抗体表达T细胞(7×19/PD-1)、以及仅培养基(在培养液不含T细胞的情况下进行相同的处理得到的数据)的顺序排列。如图14所示，在抗hCD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞(7×19)以及抗hCD20CAR-IL-7/CCL19-抗PD-1抗体表达T细胞(7×19/PD-1)的情况下，可见IL-7以及CCL19的表达。
在将各种CAR-T细胞用于实验之前，用两种ELISA试剂盒测定抗mPD-1scFv(PD-1scFv)的浓度。具体而言，将未转化的T细胞、抗hCD20CAR表达T细胞、抗hCD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞、抗hCD20 CAR-抗PD-1抗体表达T细胞、或者抗hCD20 CAR-IL-7/CCL19-抗PD-1抗体表达T细胞培养2天，回收培养上清，通过ELISA测定培养上清中的IL-7以及CCL19的浓度。在ELISA中，将由小鼠PD-1和免疫球蛋白Fc部分构成的重组融合蛋白质固定于孔中，捕捉PD-1scFv，将抗FLAG标签或者抗6×His标签用于检测。结果示于图15。在图15中，3连孔的平均值与标准差也示于图表。需要说明的是，在各图表中、数据从左侧起依次以未转化的T细胞(uninf.)、抗hCD20 CAR表达T细胞(conv.)、抗hCD20CAR-IL-7/CCL19表达T细胞(7×19)、抗hCD20 CAR-抗PD-1抗体表达T细胞(conv./PD-1)、抗hCD20 CAR-IL-7/CCL19-抗PD-1抗体表达T细胞(7×19/PD-1)、以及仅培养基(在培养液不含T细胞的情况下进行相同的处理得到的数据)的顺序排列。如图15所示，在抗hCD20 CAR-抗PD-1抗体表达T细胞(conv./PD-1)以及抗hCD20 CAR-IL-7/CCL19-抗PD-1抗体表达T细胞(7×19/PD-1)的情况下，可见抗PD-1scFv的表达。
(通过对荷癌小鼠给药的抗癌效果的分析)
第0天，向6～121周龄的雄DBA/2小鼠侧腹皮下接种用0.1ml的HBSS悬浮的5×105个P815-hCD20肿瘤细胞(Nat Biotechnol.2018；36(4)：346-351)。第11天，向小鼠的腹腔内施以作为抗癌剂的环磷酰胺(CPA、100mg/kg)的给药。将小鼠分成5个组，以后的处理如以下所述。
第1组：未施以任何的CAR表达T细胞的给药。
第2组：第14天静脉给药0.25×106个抗hCD20 CAR表达T细胞。
第3组：第14天静脉给药0.25×106个抗hCD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞。
第4组：第14天静脉给药0.25×106个抗hCD20 CAR-抗PD-1抗体表达T细胞。
第5组：第14天静脉给药0.25×106个抗hCD20 CAR-IL-7/CCL19-抗PD-1抗体表达T细胞。
对各小鼠的生存率进行分析，且通过使用上述的数显卡尺的方法1周2次测定小鼠的肿瘤体积。各自的小鼠的生存率的分析结果示于图16，直至70天的肿瘤体积的测定结果示于图17。在图17中，最初的14天的肿瘤体积放大示于各图表的右侧。
在图17中，cpa only表示第1组(尽管进行环磷酰胺给药，但未进行CAR表达T细胞的给药)。在图17中，任何组都为N＝10。在图17中，横轴表示皮下接种P815-hCD20肿瘤细胞之后的天数(day)。关于小鼠的生存时间，将各组之间的Logrank检验的结果以P值的值示于图16的下侧的表中。
根据图16所示的结果，可知通过使用与本公开涉及的免疫应答细胞C相当的抗hCD20 CAR-IL-7/CCL19-抗PD-1抗体表达T细胞，具有P815-hCD20的小鼠的生存时间显著增加。尤其要强调的是，在使用抗hCD20 CAR-抗PD-1抗体表达T细胞的情况下，或在使用抗hCD20CAR-IL-7/CCL19表达T细胞的情况下，试验期间大部分的小鼠死亡，与此相对，通过抗hCD20 CAR-IL-7/CCL19-抗PD-1抗体表达T细胞，即便经过98天后也有50％的小鼠生存。由此可知，在使用表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子、白细胞介素7、以及CCL19但不表达免疫抑制阻断性多肽的免疫应答细胞的情况下，以及在使用表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子以及免疫抑制阻断性多肽但不表达白细胞介素7以及CCL19的免疫应答细胞情况下，即便是治疗困难的癌症治疗的情况，如果使用本公开涉及的免疫应答细胞C，就可以治疗。另外，由P值可知，通过抗hCD20CAR-IL-7/CCL19-抗PD-1抗体表达T细胞的治疗效果与在其他各组中得到的结果相比在统计学上存在显著差异，是高治疗效果。
由图15中记载的、基于抗hCD20 CAR-抗PD-1抗体表达T细胞的抗PD-1scFv的表达量、和基于抗hCD20 CAR-IL-7/CCL19-抗PD-1抗体表达T细胞的抗PD-1scFv的表达量的比较可知，抗hCD20 CAR-IL-7/CCL19-抗PD-1抗体表达T细胞由于其导入基因的数量多且核苷酸长度长，因此如果考虑导入以及表达中的劣势，可以理解为通过抗hCD20CAR-IL-7/CCL19-抗PD-1抗体表达T细胞的上述的治疗效果是非常惊人的。
另外，由图17所示的结果可以理解为在被施以抗hCD20CAR-IL-7/CCL19-抗PD-1抗体表达T细胞给药的小鼠中肿瘤体积的增加本身受到抑制。该肿瘤体积增加的抑制，不仅比未施以CAR表达T细胞给药的情况(cpa only)以及施以抗hCD20 CAR表达T细胞给药的情况(conv.)显著，而且还比施以抗hCD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞给药的情况以及施以抗hCD20 CAR-抗PD-1抗体表达T细胞给药的情况显著。
另外，可知抗hCD20 CAR表达T细胞的给药量少到如上述所示的0.25×106个，即使细胞数少也会得到高效果。
如以上所述，由实施例可知，通过本公开的各种方式涉及的组合医药以及免疫应答细胞得到针对癌细胞的高治疗效果。
本公开的例示的实施方式也包含以下的实施方式。
<1>一种组合医药，用于治疗对象中的癌症，包含：
(a)表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子、白细胞介素7以及CCL19的免疫应答细胞；以及
(b)免疫抑制阻断剂。
<2>根据<1>所述的组合医药，其中，上述免疫应答细胞和上述免疫抑制阻断剂在不同时间点被分别给药。
<3>根据<1>或者<2>所述的组合医药，其中，编码白细胞介素7的核酸以及编码CCL19的核酸被整合到上述免疫应答细胞的基因组中，或者一起或个别地被整合到在上述免疫应答细胞中存在的一个或多个载体中。
<4>根据<1>～<3>中任意一项所述的组合医药，其中，上述免疫应答细胞是源自上述对象本身的免疫应答细胞。
<5>根据<1>～<4>中任意一项所述的组合医药，其中，上述免疫应答细胞从由T细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)和B细胞等淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞等抗原呈递细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、以及肥大细胞构成的组中选择。
<6>一种组合医药，用于治疗对象中的癌症，包含：
(a)协同包含编码白细胞介素7的核酸以及编码CCL19的核酸的一种或多种细胞或者核酸递送介质或者它们的组合，以及
(b)免疫抑制阻断剂。
<7>根据<6>所述的组合医药，其中，上述一种或多种细胞或者核酸递送介质或者它们的组合，包含从免疫应答细胞、病毒、厌氧菌、脂质体、间充质干细胞(MSC)、以及纳米粒子中选择的至少一种。
<8>根据<6>或者<7>所述的组合医药，其中，上述一种或多种细胞或者核酸递送介质或者它们的组合，表面具有特异性识别癌抗原的分子。
<9>根据<6>或者<7>所述的组合医药，其中，上述一种或多种细胞或者核酸递送介质或者它们的组合，还包含编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的核酸，上述特异性识别癌抗原的细胞表面分子是嵌合抗原受体(CAR)或者T细胞受体(TCR)。
<10>根据<6>～<9>中任意一项所述的组合医药，其中，上述免疫抑制阻断剂是多肽，上述细胞或者核酸递送介质或它们的组合还协同包含对免疫抑制阻断剂多肽进行编码的核酸。
<11>根据<6>～<9>中任意一项所述的组合医药，其中，上述细胞或者核酸递送介质或它们的组合、和上述免疫抑制阻断剂在不同时间点被分别给药。
<12>根据<1>～<5>中任意一项所述的组合医药，其中，上述特异性识别癌抗原的细胞表面分子是嵌合抗原受体(CAR)或者T细胞受体(TCR)。
<13>根据<1>～<12>中任意一项所述的组合医药，其中，上述免疫抑制阻断剂包含从由PD-1阻断剂、PD-L1阻断剂、PD-L2阻断剂、CTLA-4阻断剂、BTLA(B-and T-lymphocyteattenuator)阻断剂、TIM-3(T-cell immunoglobulin and mucin domain 3)阻断剂、TIGIT(T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains)阻断剂、LAG-3(LymphocyteActivation Gene-3)阻断剂、以及Siglec-15阻断剂构成的组中选择的一种以上。
<14>根据<1>～<13>中任意一项所述的组合医药，其中，上述免疫抑制阻断剂是抗体。
<15>根据<14>所述的组合医药，其中，上述抗体是IgG单克隆抗体或者抗体片段。
<16>根据<1>～<15>中任意一项所述的组合医药，其中，上述癌症是实体癌。
<17>一种医药，用于与免疫抑制阻断剂并用来治疗对象中的癌症，包含：
(i)表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子、白细胞介素7以及CCL19的免疫应答细胞；或者(ii)协同包含编码白细胞介素7的核酸以及编码CCL19的核酸的一种或多种细胞或者核酸递送介质或者它们的组合。
<18>一种医药，包含免疫抑制阻断剂，用于与下述(i)或(ii)并用来治疗对象中的癌症，
(i)表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子、白细胞介素7以及CCL19的免疫应答细胞；
(ii)协同包含编码白细胞介素7的核酸以及编码CCL19的核酸的一种或多种细胞或者核酸递送介质或者它们的组合。
<19>根据<17>或者<18>所述的医药，其中，上述免疫抑制阻断剂与上述免疫应答细胞或上述一种或多种细胞或者核酸递送介质或者它们的组合以在不同时间点被分别给药的方式使用。
<20>一种医药，其中，收纳在显示与免疫抑制阻断剂并用的容器中，且包含：
(i)表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子、白细胞介素7以及CCL19的免疫应答细胞；或者(ii)协同包含编码白细胞介素7的核酸以及编码CCL19的核酸的一种或多种细胞或者核酸递送介质或者它们的组合。
<21>一种制品，包含：
记载有和免疫抑制阻断剂并用的药品说明书；和
收纳医药的容器，所述医药包含(i)表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子、白细胞介素7以及CCL19的免疫应答细胞；或者(ii)协同包含编码白细胞介素7的核酸以及编码CCL19的核酸的一种或多种细胞或者核酸递送介质或者它们的组合。
<22>一种医药组合物，用于治疗对象中的癌症，包含：
(a)(i)表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子、白细胞介素7以及CCL19的免疫应答细胞；或者(ii)协同包含编码白细胞介素7的核酸以及编码CCL19的核酸的一种或多种细胞或者核酸递送介质或者它们的组合；以及
(b)免疫抑制阻断剂。
<23>根据<22>所述的医药组合物，其中，上述特异性识别癌抗原的细胞表面分子是嵌合抗原受体(CAR)或者T细胞受体(TCR)。
<24>一种免疫应答细胞，对特异性识别癌抗原的细胞表面分子、白细胞介素7、CCL19、以及免疫抑制阻断性多肽进行表达。
<25>根据<24>所述的免疫应答细胞，其中，编码白细胞介素7的核酸以及编码CCL19的核酸被整合到上述免疫应答细胞的基因组中，或者一起或个别地被整合到在上述免疫应答细胞中存在的一个或多个载体中。
<26>根据<25>所述的免疫应答细胞，其中，编码免疫抑制阻断性多肽的核酸被整合到上述免疫应答细胞的基因组中，或者被整合到在上述免疫应答细胞中存在的、与上述一个或多个载体中的任一个相同或不同的载体中。
<27>根据<24>～<26>中任意一项所述的免疫应答细胞，其中，上述特异性识别癌抗原的细胞表面分子是嵌合抗原受体(CAR)或者T细胞受体(TCR)。
<28>根据<24>～<27>中任意一项所述的免疫应答细胞，其中，上述免疫抑制阻断性多肽包含从由PD-1阻断性多肽、PD-L1阻断性多肽、PD-L2阻断性多肽、CTLA-4阻断性多肽、BTLA(B-and T-lymphocyte attenuator)阻断性多肽、TIM-3(T-cell immunoglobulinand mucin domain 3)阻断性多肽、TIGIT(T-cell immunoreceptor with Ig and ITIMdomains)阻断性多肽、LAG-3(Lymphocyte Activation Gene-3)阻断性多肽、以及Siglec-15阻断性多肽构成的组中选择的一种以上。
<29>根据<24>～<28>中任意一项所述的免疫应答细胞，其中，上述免疫抑制阻断性多肽是抗体。
<30>根据<29>所述的免疫应答细胞，其中，上述抗体是IgG单克隆抗体或者抗体片段。
<31>根据<24>～<30>中任意一项所述的免疫应答细胞，其中，从由T细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)和B细胞等淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞等抗原呈递细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、以及肥大细胞构成的组中选择。
<32>一种医药，包含<24>～<31>中任意一项所述的免疫应答细胞。
<33>根据<32>所述的医药，其中，用于对对象中的癌症进行治疗。
<34>根据<33>所述的医药，其中，上述癌症是实体癌。
<35>根据<33>或者<34>所述的医药，其中，上述免疫应答细胞是源自上述对象本身的免疫应答细胞。
<36>一种协同包含编码白细胞介素7的核酸、编码CCL19的核酸、以及编码免疫抑制阻断性多肽的核酸的一种或多种核酸递送介质。
<37>根据<36>所述的核酸递送介质，其中，还包含编码特异性识别癌抗原的细胞表面分子的核酸。
本申请是基于2019年10月日28申请的日本专利申请2019-195407主张优先权，日本专利申请2019-195407的公开内容整体作为参考被并入本说明书。
本说明书中记载的全部的文献、专利申请、以及技术标准作为参考被并入本说明书的程度，与个别文献、专利申请、以及技术标准作为被具体或个别并入的程度相同。
序列表
<110> 诺伊尔免疫生物科技株式会社
<120> 用于治疗癌症的医药、组合医药、医药组合物、免疫应答细胞、核酸递送介质和制品
<130> CO-F05142-00
<150> JP2019-195407
<151> 2019-10-28
<160> 18
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工设计
<220>
<223> 5'-R 引物
<400> 1
gtctaccagg cattcgcttc at 22
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工设计
<220>
<223> 3-TRa-C 引物
<400> 2
tcagctggac cacagccgca gcgt 24
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工设计
<220>
<223> 3-TRb-C1 引物
<400> 3
tcagaaatcc tttctcttga c 21
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工设计
<220>
<223> 3-TRbeta-C2 引物
<400> 4
ctagcctctg gaatcctttc tctt 24
<210> 5
<211> 177
<212> PRT
<213> 人工设计
<220>
<223> 人 IL-7
<400> 5
Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile
1 5 10 15
Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys
20 25 30
Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu
35 40 45
Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe
50 55 60
Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe
65 70 75 80
Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser
85 90 95
Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr
100 105 110
Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala
115 120 125
Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu
130 135 140
Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu
145 150 155 160
Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu
165 170 175
His
<210> 6
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工设计
<220>
<223> 人 CCL19
<400> 6
Met Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ser Leu Leu Val Leu Trp Thr Ser Pro
1 5 10 15
Ala Pro Thr Leu Ser Gly Thr Asn Asp Ala Glu Asp Cys Cys Leu Ser
20 25 30
Val Thr Gln Lys Pro Ile Pro Gly Tyr Ile Val Arg Asn Phe His Tyr
35 40 45
Leu Leu Ile Lys Asp Gly Cys Arg Val Pro Ala Val Val Phe Thr Thr
50 55 60
Leu Arg Gly Arg Gln Leu Cys Ala Pro Pro Asp Gln Pro Trp Val Glu
65 70 75 80
Arg Ile Ile Gln Arg Leu Gln Arg Thr Ser Ala Lys Met Lys Arg Arg
85 90 95
Ser Ser
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工设计
<220>
<223> 2A 肽剪切区域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Val 或 Ile
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸（Xaa can be any naturally occurring
氨基酸）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> 任何氨基酸
<400> 7
Asp Xaa Glu Xaa Asn Pro Gly Pro
1 5
<210> 8
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工设计
<220>
<223> 2A肽(F2A)
<400> 8
Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala
1 5 10 15
Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 9
<211> 864
<212> DNA
<213> 人工设计
<220>
<223> 小鼠IL-7-F2A-小鼠CCL19
<400> 9
atgttccatg tttcttttag atatatcttt ggaattcctc cactgatcct tgttctgctg 60
cctgtcacat catctgagtg ccacattaaa gacaaagaag gtaaagcata tgagagtgta 120
ctgatgatca gcatcgatga attggacaaa atgacaggaa ctgatagtaa ttgcccgaat 180
aatgaaccaa acttttttag aaaacatgta tgtgatgata caaaggaagc tgcttttcta 240
aatcgtgctg ctcgcaagtt gaagcaattt cttaaaatga atatcagtga agaattcaat 300
gtccacttac taacagtatc acaaggcaca caaacactgg tgaactgcac aagtaaggaa 360
gaaaaaaacg taaaggaaca gaaaaagaat gacgcatgtt tcctaaagag actactgaga 420
gaaataaaaa cttgttggaa taaaattttg aagggcagta taggaagcgg agtgaaacag 480
actttgaatt ttgaccttct caagttggcg ggagacgtgg agtccaaccc tggacctatg 540
gccccccgtg tgaccccact cctggccttc agcctgctgg ttctctggac cttcccagcc 600
ccaactctgg ggggtgctaa tgatgcggaa gactgctgcc tgtctgtgac ccagcgcccc 660
atccctggga acatcgtgaa agccttccgc taccttctta atgaagatgg ctgcagggtg 720
cctgctgttg tgttcaccac actaaggggc tatcagctct gtgcacctcc agaccagccc 780
tgggtggatc gcatcatccg aagactgaag aagtcttctg ccaagaacaa aggcaacagc 840
accagaagga gccctgtgtc ttga 864
<210> 10
<211> 1665
<212> DNA
<213> 人工设计
<220>
<223> 小鼠 Il-7-F2A-小鼠CCL19-F2A-eGFP
<400> 10
atggtccacg tctccttcag atacatcttc ggcatccccc ccctgatcct ggtcctcctg 60
cctgtcacct ccagcgaatg tcatatcaag gacaaagagg gcaaggctta tgagagcgtc 120
ctgatgatct ccattgatga gctggataag atgaccggca ccgacagcaa ctgtcccaac 180
aatgagccca acttctttag aaagcacgtg tgtgacgata ccaaggaggc tgccttcctg 240
aacagggccg ccagaaagct gaagcagttc ctgaagatga acatttccga ggagttcaac 300
gtgcacctcc tcaccgtgag ccagggcacc cagacactgg tcaattgcac ctccaaggag 360
gagaagaacg tgaaagagca gaaaaagaat gatgcttgtt tcctcaagag gctgctgagg 420
gagatcaaga cctgttggaa taagatcctg aaaggcagca tcggcagcgg agtcaagcaa 480
accctgaact tcgacctgct gaaactggcc ggagatgtgg agagcaatcc cggccctatg 540
gcccccagag tcacccctct gctggccttc agcctgctcg tgctgtggac cttccccgct 600
cccaccctgg gcggcgccaa tgatgctgag gactgttgcc tctccgtgac ccagaggccc 660
atccctggaa acatcgtcaa agccttcagg tacctgctca acgaagacgg atgtagggtg 720
cctgccgtgg tgttcacaac actgagaggc taccagctct gcgcccctcc tgatcagccc 780
tgggtcgaca gaatcatcag aaggctgaag aagtccagcg ccaagaacaa aggcaatagc 840
acaaggagaa gccctgtgag cgaattcgga agcggagtga aacagacttt gaattttgac 900
cttctcaagt tggcgggaga cgtggagtcc aaccctggac catgcatggt gagcaagggc 960
gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc 1020
cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg 1080
aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg 1140
acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc 1200
aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc 1260
aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag 1320
ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac 1380
tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac 1440
ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag 1500
aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct gagcacccag 1560
tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg 1620
accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca agtaa 1665
<210> 11
<211> 554
<212> PRT
<213> 人工设计
<220>
<223> 小鼠 Il-7-F2A-小鼠 CCL19-2A-eGFP 氨基酸
<400> 11
Met Val His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Ile Pro Pro Leu Ile
1 5 10 15
Leu Val Leu Leu Pro Val Thr Ser Ser Glu Cys His Ile Lys Asp Lys
20 25 30
Glu Gly Lys Ala Tyr Glu Ser Val Leu Met Ile Ser Ile Asp Glu Leu
35 40 45
Asp Lys Met Thr Gly Thr Asp Ser Asn Cys Pro Asn Asn Glu Pro Asn
50 55 60
Phe Phe Arg Lys His Val Cys Asp Asp Thr Lys Glu Ala Ala Phe Leu
65 70 75 80
Asn Arg Ala Ala Arg Lys Leu Lys Gln Phe Leu Lys Met Asn Ile Ser
85 90 95
Glu Glu Phe Asn Val His Leu Leu Thr Val Ser Gln Gly Thr Gln Thr
100 105 110
Leu Val Asn Cys Thr Ser Lys Glu Glu Lys Asn Val Lys Glu Gln Lys
115 120 125
Lys Asn Asp Ala Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Arg Glu Ile Lys Thr
130 135 140
Cys Trp Asn Lys Ile Leu Lys Gly Ser Ile Gly Ser Gly Val Lys Gln
145 150 155 160
Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn
165 170 175
Pro Gly Pro Met Ala Pro Arg Val Thr Pro Leu Leu Ala Phe Ser Leu
180 185 190
Leu Val Leu Trp Thr Phe Pro Ala Pro Thr Leu Gly Gly Ala Asn Asp
195 200 205
Ala Glu Asp Cys Cys Leu Ser Val Thr Gln Arg Pro Ile Pro Gly Asn
210 215 220
Ile Val Lys Ala Phe Arg Tyr Leu Leu Asn Glu Asp Gly Cys Arg Val
225 230 235 240
Pro Ala Val Val Phe Thr Thr Leu Arg Gly Tyr Gln Leu Cys Ala Pro
245 250 255
Pro Asp Gln Pro Trp Val Asp Arg Ile Ile Arg Arg Leu Lys Lys Ser
260 265 270
Ser Ala Lys Asn Lys Gly Asn Ser Thr Arg Arg Ser Pro Val Ser Glu
275 280 285
Phe Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu
290 295 300
Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Cys Met Val Ser Lys Gly
305 310 315 320
Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly
325 330 335
Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp
340 345 350
Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys
355 360 365
Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val
370 375 380
Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe
385 390 395 400
Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe
405 410 415
Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly
420 425 430
Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu
435 440 445
Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His
450 455 460
Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn
465 470 475 480
Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp
485 490 495
His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro
500 505 510
Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn
515 520 525
Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly
530 535 540
Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
545 550
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工设计
<220>
<223> P1A 肽
<400> 12
Leu Pro Tyr Leu Gly Trp Leu Val Phe
1 5
<210> 13
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工设计
<220>
<223> 用于PD-1基因的引导RNA
<400> 13
ucugggcaug uggguccggc 20
<210> 14
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工设计
<220>
<223> 用于ROSA26的引导RNA
<400> 14
cuccagucuu ucuagaagau 20
<210> 15
<211> 2559
<212> DNA
<213> 人工设计
<220>
<223> 抗hCD20 CAR 和 抗mPD抗体
<400> 15
atggactgga cctggcggat cctgttcctg gtggctgctg ctacaggcgc ccacagccag 60
atcgtgctgt ctcagtctcc cgccatcctg tctgctagcc ctggcgagaa agtgaccatg 120
acctgcagag ccagcagcag cgtgtcctac atccactggt tccagcagaa gcccggcagc 180
agccccaagc cttggatcta cgccacaagc aacctggcct ctggcgtgcc agtgcggttt 240
agcggctctg gctctggcac cagctacagc ctgaccatca gcagagtgga agccgaggac 300
gccgccacct actactgtca gcagtggacc agcaaccccc ccacattcgg cggaggcacc 360
aagctggaaa tcaagggcgg aggcggatct ggcggcggag gatctggggg aggcggctct 420
caggtgcagc tgcagcagcc tggcgctgag ctcgtgaaac ctggcgcctc cgtgaagatg 480
agctgcaagg ccagcggcta caccttcaca agctacaaca tgcactgggt caagcagacc 540
cctggcagag gcctggaatg gatcggcgct atctaccccg gcaacggcga cacctcctac 600
aaccagaagt tcaagggcaa ggccaccctg accgccgaca agagcagcag cacagcctac 660
atgcagctgt cctccctgac cagcgaggac agcgccgtgt actactgcgc cagatctacc 720
tactacggcg gcgactggta cttcaacgtg tggggcgctg gcaccaccgt gaccgtgtct 780
gctgcggccg cagtcgtgcc agtccttcag aaagtgaact ctactactac caagccagtg 840
ctgcgaactc cctcacctgt gcaccctacc gggacatctc agccccagag accagaagat 900
tgtcggcccc gtggctcagt gaaggggacc ggattggact tcgcctgtga tatttacatc 960
tgggcaccct tggccggaat ctgcgtggcc cctctgctgt ccttgatcat cactctcatc 1020
tgctaccaca ggagccgaaa tagtagaagg aacagactcc ttcaaagtga ctacatgaac 1080
atgactcccc ggaggcctgg gctcactcga aagccttacc agccctacgc ccctgccaga 1140
gactttgcag cgtaccgccc caaatggatc aggaaaaaat tcccccacat attcaagcaa 1200
ccatttaaga agaccactgg agcagctcaa gaggaagatg cttgtagctg ccgatgtcca 1260
caggaagaag aaggaggagg aggaggctat gagctgagag caaaattcag caggagtgca 1320
gagactgctg ccaacctgca ggaccccaac cagctctaca atgagctcaa tctagggcga 1380
agagaggaat atgacgtctt ggagaagaag cgggctcggg atccagagat gggaggcaaa 1440
cagcagagga ggaggaaccc ccaggaaggc gtatacaatg cactgcagaa agacaagatg 1500
gcagaagcct acagtgagat cggcacaaaa ggcgagaggc ggagaggcaa ggggcacgat 1560
ggcctttacc agggtctcag cactgccacc aaggacacct atgatgccct gcatatgcag 1620
accctggccc ctcgcgaatt cggctccggc gtgaagcaga cactgaactt cgacctgctc 1680
aagctggctg gagacgtgga gagcaacccc ggccctatga catgggcccc tctgctgctg 1740
attttcctgc agcacctgag aggcagctgc gcccagtttg tgctgaccca gcccaaaaca 1800
gtgtccgaga gcctgggcag aaccgtgaca atcagctgca aaaggagcag cggctccgtg 1860
ggcgattact acgtgagctg gcaccagcag aggtttggca gcagccctaa gaccgtcatc 1920
tacctggacg atgagaggcc ttccggcgtc cccaaaaggt tctccggctc catcgacagc 1980
tccagcaata gcgctagcct caccatcacc gacctccaga ccgacgatga ggccgattac 2040
ttctgcctca gctacgacag caacaaccac ttcgtcttcg gctccggaac ccacctgaca 2100
gtgctgggcg gaggaggatc cggaggagga ggaagcggag gaggcggaag cgaggtgcag 2160
ctggtggagt ccggaggagg actggctcaa cccggaaaga gcctgaagct gtcctgcgag 2220
gccagcggct tcacctttag cgactacggc atgaactggt tcaggcaggc ccccggaaag 2280
ggcctggaat gggtggccta catcagcagc ggctccaaca agatcaccta cgccgacaca 2340
gtcaagggca ggtttaccgt gagcagggat aacggcaaga accagctgtt cctgcagatg 2400
aataacctga agagcgagga taccgccatc tactattgcg tggattccgg cttcaactcc 2460
tatagcgacg tctggggcca gggcatccag gtcaccgtga gcagcgacta caaggacgac 2520
gacgacaagt tcgtggagca tcaccaccat caccactga 2559
<210> 16
<211> 852
<212> PRT
<213> 人工设计
<220>
<223> 抗hCD20 CAR 和 抗mPD抗体
<400> 16
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Ala His Ser Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala
20 25 30
Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val
35 40 45
Ser Tyr Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro
50 55 60
Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe
65 70 75 80
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val
85 90 95
Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn
100 105 110
Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu
130 135 140
Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met
145 150 155 160
Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp
165 170 175
Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr
180 185 190
Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala
195 200 205
Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser
210 215 220
Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr
225 230 235 240
Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr
245 250 255
Val Thr Val Ser Ala Ala Ala Ala Val Val Pro Val Leu Gln Lys Val
260 265 270
Asn Ser Thr Thr Thr Lys Pro Val Leu Arg Thr Pro Ser Pro Val His
275 280 285
Pro Thr Gly Thr Ser Gln Pro Gln Arg Pro Glu Asp Cys Arg Pro Arg
290 295 300
Gly Ser Val Lys Gly Thr Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
305 310 315 320
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Ile Cys Val Ala Pro Leu Leu Ser Leu Ile
325 330 335
Ile Thr Leu Ile Cys Tyr His Arg Ser Arg Asn Ser Arg Arg Asn Arg
340 345 350
Leu Leu Gln Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Leu
355 360 365
Thr Arg Lys Pro Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Ala Arg Asp Phe Ala Ala
370 375 380
Tyr Arg Pro Lys Trp Ile Arg Lys Lys Phe Pro His Ile Phe Lys Gln
385 390 395 400
Pro Phe Lys Lys Thr Thr Gly Ala Ala Gln Glu Glu Asp Ala Cys Ser
405 410 415
Cys Arg Cys Pro Gln Glu Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Glu Leu
420 425 430
Arg Ala Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Thr Ala Ala Asn Leu Gln Asp
435 440 445
Pro Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
450 455 460
Asp Val Leu Glu Lys Lys Arg Ala Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
465 470 475 480
Gln Gln Arg Arg Arg Asn Pro Gln Glu Gly Val Tyr Asn Ala Leu Gln
485 490 495
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Thr Lys Gly Glu
500 505 510
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
515 520 525
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Thr Leu Ala Pro
530 535 540
Arg Glu Phe Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu
545 550 555 560
Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Met Thr Trp Ala
565 570 575
Pro Leu Leu Leu Ile Phe Leu Gln His Leu Arg Gly Ser Cys Ala Gln
580 585 590
Phe Val Leu Thr Gln Pro Lys Thr Val Ser Glu Ser Leu Gly Arg Thr
595 600 605
Val Thr Ile Ser Cys Lys Arg Ser Ser Gly Ser Val Gly Asp Tyr Tyr
610 615 620
Val Ser Trp His Gln Gln Arg Phe Gly Ser Ser Pro Lys Thr Val Ile
625 630 635 640
Tyr Leu Asp Asp Glu Arg Pro Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly
645 650 655
Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Asp Leu
660 665 670
Gln Thr Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Leu Ser Tyr Asp Ser Asn
675 680 685
Asn His Phe Val Phe Gly Ser Gly Thr His Leu Thr Val Leu Gly Gly
690 695 700
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln
705 710 715 720
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Pro Gly Lys Ser Leu Lys
725 730 735
Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Gly Met Asn
740 745 750
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile
755 760 765
Ser Ser Gly Ser Asn Lys Ile Thr Tyr Ala Asp Thr Val Lys Gly Arg
770 775 780
Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn Gln Leu Phe Leu Gln Met
785 790 795 800
Asn Asn Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Val Asp Ser
805 810 815
Gly Phe Asn Ser Tyr Ser Asp Val Trp Gly Gln Gly Ile Gln Val Thr
820 825 830
Val Ser Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Phe Val Glu His His
835 840 845
His His His His
850
<210> 17
<211> 3501
<212> DNA
<213> 人工设计
<220>
<223> 抗hCD20 CAR, mil7, mccl19, 和 抗mPD抗体
<400> 17
atggactgga cctggcggat cctgttcctg gtggctgctg ctacaggcgc ccacagccag 60
atcgtgctgt ctcagtctcc cgccatcctg tctgctagcc ctggcgagaa agtgaccatg 120
acctgcagag ccagcagcag cgtgtcctac atccactggt tccagcagaa gcccggcagc 180
agccccaagc cttggatcta cgccacaagc aacctggcct ctggcgtgcc agtgcggttt 240
agcggctctg gctctggcac cagctacagc ctgaccatca gcagagtgga agccgaggac 300
gccgccacct actactgtca gcagtggacc agcaaccccc ccacattcgg cggaggcacc 360
aagctggaaa tcaagggcgg aggcggatct ggcggcggag gatctggggg aggcggctct 420
caggtgcagc tgcagcagcc tggcgctgag ctcgtgaaac ctggcgcctc cgtgaagatg 480
agctgcaagg ccagcggcta caccttcaca agctacaaca tgcactgggt caagcagacc 540
cctggcagag gcctggaatg gatcggcgct atctaccccg gcaacggcga cacctcctac 600
aaccagaagt tcaagggcaa ggccaccctg accgccgaca agagcagcag cacagcctac 660
atgcagctgt cctccctgac cagcgaggac agcgccgtgt actactgcgc cagatctacc 720
tactacggcg gcgactggta cttcaacgtg tggggcgctg gcaccaccgt gaccgtgtct 780
gctgcggccg cagtcgtgcc agtccttcag aaagtgaact ctactactac caagccagtg 840
ctgcgaactc cctcacctgt gcaccctacc gggacatctc agccccagag accagaagat 900
tgtcggcccc gtggctcagt gaaggggacc ggattggact tcgcctgtga tatttacatc 960
tgggcaccct tggccggaat ctgcgtggcc cctctgctgt ccttgatcat cactctcatc 1020
tgctaccaca ggagccgaaa tagtagaagg aacagactcc ttcaaagtga ctacatgaac 1080
atgactcccc ggaggcctgg gctcactcga aagccttacc agccctacgc ccctgccaga 1140
gactttgcag cgtaccgccc caaatggatc aggaaaaaat tcccccacat attcaagcaa 1200
ccatttaaga agaccactgg agcagctcaa gaggaagatg cttgtagctg ccgatgtcca 1260
caggaagaag aaggaggagg aggaggctat gagctgagag caaaattcag caggagtgca 1320
gagactgctg ccaacctgca ggaccccaac cagctctaca atgagctcaa tctagggcga 1380
agagaggaat atgacgtctt ggagaagaag cgggctcggg atccagagat gggaggcaaa 1440
cagcagagga ggaggaaccc ccaggaaggc gtatacaatg cactgcagaa agacaagatg 1500
gcagaagcct acagtgagat cggcacaaaa ggcgagaggc ggagaggcaa ggggcacgat 1560
ggcctttacc agggtctcag cactgccacc aaggacacct atgatgccct gcatatgcag 1620
accctggccc ctcgcgaatt cggaagcgga gtgaaacaga ctttgaattt tgaccttctc 1680
aagttggcgg gagacgtgga gtccaaccct ggaccatgca tgttccatgt ttcttttaga 1740
tatatctttg gaattcctcc actgatcctt gttctgctgc ctgtcacatc atctgagtgc 1800
cacattaaag acaaagaagg taaagcatat gagagtgtac tgatgatcag catcgatgaa 1860
ttggacaaaa tgacaggaac tgatagtaat tgcccgaata atgaaccaaa cttttttaga 1920
aaacatgtat gtgatgatac aaaggaagct gcttttctaa atcgtgctgc tcgcaagttg 1980
aagcaatttc ttaaaatgaa tatcagtgaa gaattcaatg tccacttact aacagtatca 2040
caaggcacac aaacactggt gaactgcaca agtaaggaag aaaaaaacgt aaaggaacag 2100
aaaaagaatg acgcatgttt cctaaagaga ctactgagag aaataaaaac ttgttggaat 2160
aaaattttga agggcagtat aggaagcgga gtgaaacaga ctttgaattt tgaccttctc 2220
aagttggcgg gagacgtgga gtccaaccct ggacctatgg ccccccgtgt gaccccactc 2280
ctggccttca gcctgctggt tctctggacc ttcccagccc caactctggg gggtgctaat 2340
gatgcggaag actgctgcct gtctgtgacc cagcgcccca tccctgggaa catcgtgaaa 2400
gccttccgct accttcttaa tgaagatggc tgcagggtgc ctgctgttgt gttcaccaca 2460
ctaaggggct atcagctctg tgcacctcca gaccagccct gggtggatcg catcatccga 2520
agactgaaga agtcttctgc caagaacaaa ggcaacagca ccagaaggag ccctgtgtct 2580
cgaggctccg gcgtgaagca gacactgaac ttcgacctgc tcaagctggc tggagacgtg 2640
gagagcaacc ccggccctat gacatgggcc cctctgctgc tgattttcct gcagcacctg 2700
agaggcagct gcgcccagtt tgtgctgacc cagcccaaaa cagtgtccga gagcctgggc 2760
agaaccgtga caatcagctg caaaaggagc agcggctccg tgggcgatta ctacgtgagc 2820
tggcaccagc agaggtttgg cagcagccct aagaccgtca tctacctgga cgatgagagg 2880
ccttccggcg tccccaaaag gttctccggc tccatcgaca gctccagcaa tagcgctagc 2940
ctcaccatca ccgacctcca gaccgacgat gaggccgatt acttctgcct cagctacgac 3000
agcaacaacc acttcgtctt cggctccgga acccacctga cagtgctggg cggaggagga 3060
tccggaggag gaggaagcgg aggaggcgga agcgaggtgc agctggtgga gtccggagga 3120
ggactggctc aacccggaaa gagcctgaag ctgtcctgcg aggccagcgg cttcaccttt 3180
agcgactacg gcatgaactg gttcaggcag gcccccggaa agggcctgga atgggtggcc 3240
tacatcagca gcggctccaa caagatcacc tacgccgaca cagtcaaggg caggtttacc 3300
gtgagcaggg ataacggcaa gaaccagctg ttcctgcaga tgaataacct gaagagcgag 3360
gataccgcca tctactattg cgtggattcc ggcttcaact cctatagcga cgtctggggc 3420
cagggcatcc aggtcaccgt gagcagcgac tacaaggacg acgacgacaa gttcgtggag 3480
catcaccacc atcaccactg a 3501
<210> 18
<211> 1166
<212> PRT
<213> 人工设计
<220>
<223> 抗hCD20 CAR, mil7, mccl19, 和 抗mPD抗体
<400> 18
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Ala His Ser Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala
20 25 30
Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val
35 40 45
Ser Tyr Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro
50 55 60
Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe
65 70 75 80
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val
85 90 95
Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn
100 105 110
Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu
130 135 140
Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met
145 150 155 160
Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp
165 170 175
Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr
180 185 190
Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala
195 200 205
Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser
210 215 220
Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr
225 230 235 240
Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr
245 250 255
Val Thr Val Ser Ala Ala Ala Ala Val Val Pro Val Leu Gln Lys Val
260 265 270
Asn Ser Thr Thr Thr Lys Pro Val Leu Arg Thr Pro Ser Pro Val His
275 280 285
Pro Thr Gly Thr Ser Gln Pro Gln Arg Pro Glu Asp Cys Arg Pro Arg
290 295 300
Gly Ser Val Lys Gly Thr Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
305 310 315 320
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Ile Cys Val Ala Pro Leu Leu Ser Leu Ile
325 330 335
Ile Thr Leu Ile Cys Tyr His Arg Ser Arg Asn Ser Arg Arg Asn Arg
340 345 350
Leu Leu Gln Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Leu
355 360 365
Thr Arg Lys Pro Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Ala Arg Asp Phe Ala Ala
370 375 380
Tyr Arg Pro Lys Trp Ile Arg Lys Lys Phe Pro His Ile Phe Lys Gln
385 390 395 400
Pro Phe Lys Lys Thr Thr Gly Ala Ala Gln Glu Glu Asp Ala Cys Ser
405 410 415
Cys Arg Cys Pro Gln Glu Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Glu Leu
420 425 430
Arg Ala Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Thr Ala Ala Asn Leu Gln Asp
435 440 445
Pro Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
450 455 460
Asp Val Leu Glu Lys Lys Arg Ala Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
465 470 475 480
Gln Gln Arg Arg Arg Asn Pro Gln Glu Gly Val Tyr Asn Ala Leu Gln
485 490 495
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Thr Lys Gly Glu
500 505 510
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
515 520 525
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Thr Leu Ala Pro
530 535 540
Arg Glu Phe Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu
545 550 555 560
Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Cys Met Phe His
565 570 575
Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Ile Pro Pro Leu Ile Leu Val Leu
580 585 590
Leu Pro Val Thr Ser Ser Glu Cys His Ile Lys Asp Lys Glu Gly Lys
595 600 605
Ala Tyr Glu Ser Val Leu Met Ile Ser Ile Asp Glu Leu Asp Lys Met
610 615 620
Thr Gly Thr Asp Ser Asn Cys Pro Asn Asn Glu Pro Asn Phe Phe Arg
625 630 635 640
Lys His Val Cys Asp Asp Thr Lys Glu Ala Ala Phe Leu Asn Arg Ala
645 650 655
Ala Arg Lys Leu Lys Gln Phe Leu Lys Met Asn Ile Ser Glu Glu Phe
660 665 670
Asn Val His Leu Leu Thr Val Ser Gln Gly Thr Gln Thr Leu Val Asn
675 680 685
Cys Thr Ser Lys Glu Glu Lys Asn Val Lys Glu Gln Lys Lys Asn Asp
690 695 700
Ala Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Arg Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn
705 710 715 720
Lys Ile Leu Lys Gly Ser Ile Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn
725 730 735
Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
740 745 750
Met Ala Pro Arg Val Thr Pro Leu Leu Ala Phe Ser Leu Leu Val Leu
755 760 765
Trp Thr Phe Pro Ala Pro Thr Leu Gly Gly Ala Asn Asp Ala Glu Asp
770 775 780
Cys Cys Leu Ser Val Thr Gln Arg Pro Ile Pro Gly Asn Ile Val Lys
785 790 795 800
Ala Phe Arg Tyr Leu Leu Asn Glu Asp Gly Cys Arg Val Pro Ala Val
805 810 815
Val Phe Thr Thr Leu Arg Gly Tyr Gln Leu Cys Ala Pro Pro Asp Gln
820 825 830
Pro Trp Val Asp Arg Ile Ile Arg Arg Leu Lys Lys Ser Ser Ala Lys
835 840 845
Asn Lys Gly Asn Ser Thr Arg Arg Ser Pro Val Ser Arg Gly Ser Gly
850 855 860
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
865 870 875 880
Glu Ser Asn Pro Gly Pro Met Thr Trp Ala Pro Leu Leu Leu Ile Phe
885 890 895
Leu Gln His Leu Arg Gly Ser Cys Ala Gln Phe Val Leu Thr Gln Pro
900 905 910
Lys Thr Val Ser Glu Ser Leu Gly Arg Thr Val Thr Ile Ser Cys Lys
915 920 925
Arg Ser Ser Gly Ser Val Gly Asp Tyr Tyr Val Ser Trp His Gln Gln
930 935 940
Arg Phe Gly Ser Ser Pro Lys Thr Val Ile Tyr Leu Asp Asp Glu Arg
945 950 955 960
Pro Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser
965 970 975
Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Asp Leu Gln Thr Asp Asp Glu Ala
980 985 990
Asp Tyr Phe Cys Leu Ser Tyr Asp Ser Asn Asn His Phe Val Phe Gly
995 1000 1005
Ser Gly Thr His Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1010 1015 1020
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
1025 1030 1035
Gly Gly Gly Leu Ala Gln Pro Gly Lys Ser Leu Lys Leu Ser Cys
1040 1045 1050
Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Gly Met Asn Trp Phe
1055 1060 1065
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser
1070 1075 1080
Ser Gly Ser Asn Lys Ile Thr Tyr Ala Asp Thr Val Lys Gly Arg
1085 1090 1095
Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn Gln Leu Phe Leu Gln
1100 1105 1110
Met Asn Asn Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Val
1115 1120 1125
Asp Ser Gly Phe Asn Ser Tyr Ser Asp Val Trp Gly Gln Gly Ile
1130 1135 1140
Gln Val Thr Val Ser Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Phe
1145 1150 1155
Val Glu His His His His His His
1160 1165

Claims (37)

1.一种组合医药，用于治疗对象中的癌症，包含：
(a)表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子、白细胞介素7以及CCL19的免疫应答细胞；以及
(b)免疫抑制阻断剂。
2.根据权利要求1所述的组合医药，其中，
所述免疫应答细胞和所述免疫抑制阻断剂在不同时间点被分别给药。
3.根据权利要求1或2所述的组合医药，其中，
编码白细胞介素7的核酸以及编码CCL19的核酸被整合到所述免疫应答细胞的基因组中，或者一起或个别地被整合到在所述免疫应答细胞中存在的一个或多个载体中。
4.根据权利要求1～3中任意一项所述的组合医药，其中，
所述免疫应答细胞是源自所述对象本身的免疫应答细胞。
5.根据权利要求1～4中任意一项所述的组合医药，其中，
所述免疫应答细胞从由T细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)和B细胞等淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞等抗原呈递细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞以及肥大细胞构成的组中选择。
6.一种组合医药，用于治疗对象中的癌症，包含：
(a)协同包含编码白细胞介素7的核酸以及编码CCL19的核酸的一种或多种细胞或者核酸递送介质或者它们的组合；以及
(b)免疫抑制阻断剂。
7.根据权利要求6所述的组合医药，其中，
所述一种或多种细胞或者核酸递送介质或者它们的组合包含从免疫应答细胞、病毒、厌氧菌、脂质体、间充质干细胞(MSC)和纳米粒子中选择的至少一种。
8.根据权利要求6或7所述的组合医药，其中，
所述一种或多种细胞或者核酸递送介质或者它们的组合在表面具有特异性识别癌抗原的分子。
9.根据权利要求6或7所述的组合医药，其中，
所述一种或多种细胞或者核酸递送介质或者它们的组合还包含对特异性识别癌抗原的细胞表面分子进行编码的核酸，所述特异性识别癌抗原的细胞表面分子是嵌合抗原受体(CAR)或者T细胞受体(TCR)。
10.根据权利要求6～9中任意一项所述的组合医药，其中，
所述免疫抑制阻断剂是多肽，所述细胞或者核酸递送介质或它们的组合还协同包含对免疫抑制阻断剂多肽进行编码的核酸。
11.根据权利要求6～9中任意一项所述的组合医药，其中，
所述细胞或者核酸递送介质或它们的组合、以及所述免疫抑制阻断剂在不同时间点被分别给药。
12.根据权利要求1～5中任意一项所述的组合医药，其中，
所述特异性识别癌抗原的细胞表面分子是嵌合抗原受体(CAR)或者T细胞受体(TCR)。
13.根据权利要求1～12中任意一项所述的组合医药，其中，
所述免疫抑制阻断剂包含从由PD-1阻断剂、PD-L1阻断剂、PD-L2阻断剂、CTLA-4阻断剂、BTLA(B-and T-lymphocyte attenuator)阻断剂、TIM-3(T-cell immunoglobulin andmucin domain 3)阻断剂、TIGIT(T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains)阻断剂、LAG-3(Lymphocyte Activation Gene-3)阻断剂和Siglec-15阻断剂构成的组中选择的一种以上。
14.根据权利要求1～13中任意一项所述的组合医药，其中，
所述免疫抑制阻断剂是抗体。
15.根据权利要求14所述的组合医药，其中，
所述抗体是IgG单克隆抗体或者抗体片段。
16.根据权利要求1～15中任意一项所述的组合医药，其中，
所述癌症是实体癌。
17.一种医药，用于与免疫抑制阻断剂并用来治疗对象中的癌症，包含：
(i)表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子、白细胞介素7以及CCL19的免疫应答细胞；或者(ii)协同包含编码白细胞介素7的核酸以及编码CCL19的核酸的一种或多种细胞或者核酸递送介质或者它们的组合。
18.一种医药，包含免疫抑制阻断剂，用于与下述(i)或(ii)并用来治疗对象中的癌症，
(i)表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子、白细胞介素7以及CCL19的免疫应答细胞；
(ii)协同包含编码白细胞介素7的核酸以及编码CCL19的核酸的一种或多种细胞或者核酸递送介质或者它们的组合。
19.根据权利要求17或18所述的医药，其中，
所述免疫抑制阻断剂与所述免疫应答细胞或所述一种或多种细胞或者核酸递送介质或者它们的组合以在不同时间点被分别给药的方式使用。
20.一种医药，收纳在显示与免疫抑制阻断剂并用的容器中，且包含：
(i)表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子、白细胞介素7以及CCL19的免疫应答细胞；或者(ii)协同包含编码白细胞介素7的核酸以及编码CCL19的核酸的一种或多种细胞或者核酸递送介质或者它们的组合。
21.一种制品，包含：
记载有与免疫抑制阻断剂并用的药品说明书；和
收纳医药的容器，所述医药包含(i)表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子、白细胞介素7以及CCL19的免疫应答细胞；或者(ii)协同包含编码白细胞介素7的核酸以及编码CCL19的核酸的一种或多种细胞或者核酸递送介质或者它们的组合。
22.一种医药组合物，用于治疗对象中的癌症，包含：
(a)(i)表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子、白细胞介素7以及CCL19的免疫应答细胞；或者(ii)协同包含编码白细胞介素7的核酸以及编码CCL19的核酸的一种或多种细胞或者核酸递送介质或者它们的组合；以及
(b)免疫抑制阻断剂。
23.根据权利要求22所述的医药组合物，其中，
所述特异性识别癌抗原的细胞表面分子是嵌合抗原受体(CAR)或者T细胞受体(TCR)。
24.一种免疫应答细胞，所述免疫应答细胞表达特异性识别癌抗原的细胞表面分子、白细胞介素7、CCL19以及免疫抑制阻断性多肽。
25.根据权利要求24所述的免疫应答细胞，其中，
编码白细胞介素7的核酸以及编码CCL19的核酸被整合到所述免疫应答细胞的基因组中，或者一起或个别地被整合到在所述免疫应答细胞中存在的一个或多个载体中。
26.根据权利要求25所述的免疫应答细胞，其中，
编码免疫抑制阻断性多肽的核酸被整合到所述免疫应答细胞的基因组中，或者被整合到在所述免疫应答细胞中存在的、与所述一个或多个载体中的任一个相同或不同的载体中。
27.根据权利要求24～26中任意一项所述的免疫应答细胞，其中，
所述特异性识别癌抗原的细胞表面分子是嵌合抗原受体(CAR)或者T细胞受体(TCR)。
28.根据权利要求24～27中任意一项所述的免疫应答细胞，其中，
所述免疫抑制阻断性多肽包含从由PD-1阻断性多肽、PD-L1阻断性多肽、PD-L2阻断性多肽、CTLA-4阻断性多肽、BTLA(B-and T-lymphocyte attenuator)阻断性多肽、TIM-3(T-cell immunoglobulin and mucin domain 3)阻断性多肽、TIGIT(T-cell immunoreceptorwith Ig and ITIM domains)阻断性多肽、LAG-3(Lymphocyte Activation Gene-3)阻断性多肽和Siglec-15阻断性多肽构成的组中选择的一种以上。
29.根据权利要求24～28中任意一项所述的免疫应答细胞，其中，
所述免疫抑制阻断性多肽是抗体。
30.根据权利要求29所述的免疫应答细胞，其中，
所述抗体是IgG单克隆抗体或者抗体片段。
31.根据权利要求24～30中任意一项所述的免疫应答细胞，其中，
所述免疫应答细胞从由T细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)和B细胞等淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞等抗原呈递细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞以及肥大细胞构成的组中选择。
32.一种医药，所述医药包含权利要求24～31中任意一项所述的免疫应答细胞。
33.根据权利要求32所述的医药，其中，
所述医药用于对对象中的癌症进行治疗。
34.根据权利要求33所述的医药，其中，
所述癌症是实体癌。
35.根据权利要求33或34所述的医药，其中，
所述免疫应答细胞是源自所述对象本身的免疫应答细胞。
36.一种核酸递送介质，所述核酸递送介质为一种或多种，协同包含编码白细胞介素7的核酸、编码CCL19的核酸以及编码免疫抑制阻断性多肽的核酸。
37.根据权利要求36所述的核酸递送介质，其中，
所述核酸递送介质还包含对特异性识别癌抗原的细胞表面分子进行编码的核酸。
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