JP2024038512A - がんを治療するための医薬、組み合わせ医薬、医薬組成物、免疫応答性細胞、核酸送達媒体、及び製品 - Google Patents

がんを治療するための医薬、組み合わせ医薬、医薬組成物、免疫応答性細胞、核酸送達媒体、及び製品 Download PDF

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耕治 玉田
Koji Tamada
幸美 佐古田
Yukimi Sakoda
圭志 安達
Keishi Adachi
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Noile Immune Biotech Inc
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Abstract

【課題】高い抗がん効果が得られる、がんを治療するための医薬、組み合わせ医薬、医薬組成物、免疫応答性細胞、核酸送達媒体、及び製品を提供する。【解決手段】例示的な組み合わせ医薬は、（ａ１）がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、インターロイキン７、及びＣＣＬ１９を発現する免疫応答性細胞又は（ａ２）インターロイキン７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸を協同して含む１種類又は複数種類の細胞若しくは核酸送達媒体又はそれらの組み合わせ、並びに（ｂ）免疫抑制阻害剤を含み、対象におけるがんを治療するために用いられる。例示的な免疫応答性細胞は、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、インターロイキン７、ＣＣＬ１９、及び免疫抑制阻害性ポリペプチドを発現する。【選択図】なし

Description

本開示は、がんを治療するための医薬、組み合わせ医薬、医薬組成物、免疫応答性細胞、核酸送達媒体、及び製品に関する。
がんは悪性新生物とも呼ばれ、その治療は医学における大きな目標の１つとなっている。従来、放射線、化学的抗がん剤を用いた治療などが行われてきたが、その効果はがんの種類によっても大きく異なり、全てのがんに対して高い効果が得られるわけではない。
遺伝子医療の技術を用いてＣＡＲ（キメラ抗原受容体）と呼ばれる特殊なタンパク質を作り出すことができるようＴ細胞を改変して得られたＣＡＲ－Ｔ細胞を用いたＣＡＲ－Ｔ細胞療法が近年開発されている。例えば、再発又は難治性のＣＤ１９陽性のＢ細胞性急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、及び再発又は難治性のＣＤ１９陽性のびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）に対してＣＡＲ－Ｔ細胞療法が有効であることが示されてきた。国際公開第２０１７／１５９７３６号は、ＣＡＲ－Ｔ細胞などのがん抗原を特異的に認識する細胞表面分子を発現する免疫担当細胞において、インターロイキン７（ＩＬ－７）及びケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド１９（ＣＣＬ１９）を発現させて抗腫瘍活性を向上させることを記載している。国際公開第２０１９／０７３９７３号は、核酸送達媒体、ＩＬ－７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を含む、投与対象におけるメモリー機能を有するＴ細胞又はＢ細胞の増強体や投与対象におけるＴ細胞又はＢ細胞にメモリー機能を誘導する誘導剤を記載している。
がんの治療においては、抗がん効果の増強や、投与量を減少させることによる副作用の軽減などを目的として、複数の抗がん剤が併用されることが多い。
例えば、特表２０１８－５３８３３９号公報は、ＣＡＲ－Ｔ細胞を用いた治療の有効性を高める観点から、ＰＤ－Ｌ１に対する抗体と組み合わせてメソテリンに特異的なＣＡＲを発現する細胞を投与することを含む、メソテリンの発現と関連する疾患の処置のための組成物及び方法を提供することを記載している。
抗がん剤の併用は、相乗的な効果をもたらすことがある一方、組み合わせによっては相互に効果を阻害することもあり、有用な併用の組み合わせが探索されている。
以上の状況に鑑みて、本開示は、高い抗がん効果が得られる、がんを治療するための医薬、組み合わせ医薬、医薬組成物、免疫応答性細胞、核酸送達媒体、及び製品を提供することを課題とする。
本開示は、以下の態様を含む。
（ａ）がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、インターロイキン７（ＩＬ－７）及びケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド１９（ＣＣＬ１９）を発現する免疫応答性細胞、並びに
（ｂ）免疫抑制阻害剤
を含む、対象におけるがんを治療するための組み合わせ医薬。
本開示は以下の態様も含む。
（ａ）インターロイキン７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸を協同して含む１種類又は複数種類の細胞若しくは核酸送達媒体又はそれらの組み合わせ、並びに
（ｂ）免疫抑制阻害剤
を含む、対象におけるがんを治療するための組み合わせ医薬。
本開示は、さらに以下の態様も含む。
がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、インターロイキン７、ＣＣＬ１９、及び免疫抑制阻害性ポリペプチドを発現する免疫応答性細胞。
本開示によれば、高い抗がん効果が得られる、がんを治療するための医薬、組み合わせ医薬、医薬組成物、免疫応答性細胞、核酸送達媒体、及び製品が提供される。
実施例に記載の、ｅＧＦＰを含みＩＬ－７及びＣＣＬ１９を含まないｐＭＳＧＶベクター（以下、ｅＧＦＰ－Ｃｏｎｖ．ベクターとも称する。ＩＬ－７－Ｆ２Ａ－ＣＣＬ１９－Ｆ２Ａ－ｅＧＦＰ ＤＮＡ断片（配列番号１０）を含むｐＭＳＧＶベクターからＩＬ－７及びＣＣＬ１９をコードする領域を抜いたベクター）のマップを示す図である。 実施例に記載の、ＩＬ－７－Ｆ２Ａ－ＣＣＬ１９－Ｆ２Ａ－ｅＧＦＰ ＤＮＡ断片（配列番号１０）を含むｐＭＳＧＶベクター（以下、７×１９発現ベクターとも称する）のマップを示す図である。 ベクターを導入していないＴＣＲ－Ｔ細胞（具体的には、ベクターを導入していない、脾臓細胞由来のＰ８１５腫瘍抗原Ｐ１Ａ特異的なＴＣＲを発現するマウスＴ細胞。以下、ベクター未導入Ｐ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞とも称する。また、ベクターの導入の有無に関わらず、Ｐ１Ａ特異的なＴＣＲを発現するマウスＴ細胞をＰ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞と総称する）、ｅＧＦＰ－Ｃｏｎｖ．ベクターを導入したＰ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞（以下、ｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞とも称する）、及び７×１９発現ベクターを導入したＰ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞（以下、ｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞とも称する）それぞれにおけるｅＧＦＰとＣＤ８の発現量をフローサイトメトリーで計測した結果を示す散布図である。 ベクター未導入Ｐ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞、ｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞、及びｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞それぞれにおけるＩＬ－７の発現量をＥＬＩＳＡにより測定した結果を示すグラフである。 ベクター未導入Ｐ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞、ｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞、及びｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞それぞれにおけるＣＣＬ１９の発現量をＥＬＩＳＡにより測定した結果を示すグラフである。 実施例において、ＤＢＡ／２マウスに肥満細胞腫の細胞（Ｐ８１５）を皮下注入し、該ＤＢＡ／２マウスを放射線照射した後に、ベクター未導入Ｐ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞若しくはｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞及び／又は抗ＰＤ－１モノクローナル抗体を前記ＤＢＡ／２マウスに投与したときの経過日数と生存率との関係を示すグラフである。 実施例において、ＤＢＡ／２マウスに肥満細胞腫の細胞（Ｐ８１５）を皮下注入し、該ＤＢＡ／２マウスを放射線照射した後に、処置を行わなかったときの経過日数と腫瘍体積との関係を示すグラフである。 実施例において、ＤＢＡ／２マウスに肥満細胞腫の細胞（Ｐ８１５）を皮下注入し、該ＤＢＡ／２マウスを放射線照射した後に、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体を前記ＤＢＡ／２マウスに投与したときの経過日数と腫瘍体積との関係を示すグラフである。 実施例において、ＤＢＡ／２マウスに肥満細胞腫の細胞（Ｐ８１５）を皮下注入し、該ＤＢＡ／２マウスを放射線照射した後に、ｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞を前記ＤＢＡ／２マウスに投与したときの経過日数と腫瘍体積との関係を示すグラフである。 実施例において、ＤＢＡ／２マウスに肥満細胞腫の細胞（Ｐ８１５）を皮下注入し、該ＤＢＡ／２マウスを放射線照射した後に、ｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞及び抗ＰＤ－１モノクローナル抗体を前記ＤＢＡ／２マウスに投与したときの経過日数と腫瘍体積との関係を示すグラフである。 実施例において、ＤＢＡ／２マウスに肥満細胞腫の細胞（Ｐ８１５）を皮下注入し、該ＤＢＡ／２マウスを放射線照射した後に、ｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞を前記ＤＢＡ／２マウスに投与したときの経過日数と腫瘍体積との関係を示すグラフである。 実施例において、ＤＢＡ／２マウスに肥満細胞腫の細胞（Ｐ８１５）を皮下注入し、該ＤＢＡ／２マウスを放射線照射した後に、ｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞及び抗ＰＤ－１モノクローナル抗体を前記ＤＢＡ／２マウスに投与したときの経過日数と腫瘍体積との関係を示すグラフである。 実施例において、ＤＢＡ／２マウスに肥満細胞腫の細胞（Ｐ８１５）を皮下注入し、該ＤＢＡ／２マウスを放射線照射した後に、ＰＤ－１遺伝子又はＲＯＳＡ２６遺伝子がノックダウン（破壊）されたｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞を前記ＤＢＡ／２マウスに投与し又は投与せず、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体を前記ＤＢＡ／２マウスに投与した又はしないときの経過日数と生存率との関係を示すグラフである。 図６Ａの実験において、Ｐ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞も抗ＰＤ－１モノクローナル抗体も投与しなかったときの、経過日数と腫瘍体積との関係を示すグラフである。 図６Ａの実験において、ＲＯＳＡ２６遺伝子がノックダウンされたｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞を投与したときの、経過日数と腫瘍体積との関係を示すグラフである。 図６Ａの実験において、ＰＤ－１遺伝子がノックダウンされたｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞を投与したときの、経過日数と腫瘍体積との関係を示すグラフである。 図６Ａの実験において、ＰＤ－１遺伝子がノックダウンされたｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞、及び抗ＰＤ－１モノクローナル抗体を投与したときの、経過日数と腫瘍体積との関係を示すグラフである。 実施例において、がん細胞を接種されたＤＢＡ／２マウスに、ｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞又はｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞を投与し、完全な腫瘍退縮後にｅＧＦＰとＣＤ８の両方を発現しているｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞又はｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞が脾臓細胞中に存在するかどうかをＣＤ８及びｅＧＦＰ発現量をフローサイトメトリーで測定することにより評価したグラフである。 図７の実験で得られた脾臓細胞中におけるＣＤ８を発現せずｅＧＦＰを発現しているＴ細胞の割合並びにＣＤ８及びｅＧＦＰの両方を発現しているＴ細胞の割合を示すグラフである。 図７の実験で得られた脾臓細胞中におけるＣＤ８を発現せずｅＧＦＰを発現しているＴ細胞の数並びにＣＤ８及びｅＧＦＰの両方を発現しているＴ細胞の数を示すグラフである。 図７の実験で得られた脾臓細胞をさらにＰ８１５腫瘍細胞と共培養したときの、経過日数とＣＤ８及びｅＧＦＰの両方を発現しているＴ細胞の数との関係を示すグラフである。 図７の実験で得られた脾臓細胞をさらにＰ８１５腫瘍細胞と共培養したときの、経過日数と培養上清中におけるＩＦＮ－γ濃度との関係を示すグラフである。 図５Ｆの実験で完全な腫瘍退縮後にＰ８１５腫瘍細胞を再度接種したとき、及びナイーブＤＢＡ／２マウスにＰ８１５腫瘍細胞を接種したときそれぞれの、経過日数と腫瘍体積との関係を示すグラフである。 ＤＢＡ／２マウスにヒトＣＤ２０（ｈＣＤ２０）を発現するＰ８１５腫瘍細胞（Ｐ８１５－ｈＣＤ２０腫瘍細胞）を接種し、その後にシクロホスファミドを腹腔内投与し、さらにその後に抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ発現Ｔ細胞又は抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を静注し又はせず、さらにその後にコントロールＩｇＧ又は抗ＰＤ－１モノクローナル抗体を投与し又はしなかったときの、時間経過と生存率との関係を示すグラフである。 図１０Ａの実験において、ＣＡＲ－Ｔの投与も抗体の投与も行わなかったときの時間経過と腫瘍体積との関係を示すグラフである。 図１０Ａの実験において、ＣＡＲ－Ｔの投与は行わず、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体を投与したときの時間経過と腫瘍体積との関係を示すグラフである。 図１０Ａの実験において、抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ発現Ｔ細胞を投与し、抗ＰＤ－１抗体を投与したときの時間経過と腫瘍体積との関係を示すグラフである。 図１０Ａの実験において、抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を投与し、コントロールＩｇＧを投与したときの時間経過と腫瘍体積との関係を示すグラフである。 図１０Ａの実験において、抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を投与し、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体を投与したときの時間経過と腫瘍体積との関係を示すグラフである。 ＤＢＡ／２マウスにＰ８１５腫瘍細胞を接種し、ｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞又はｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞を７日目に静脈注射した場合における、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の内訳について、ｃ－ｋｉｔ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ３、ｅＧＦＰ、ＣＤ４、及びＣＤ８の発現を基に調べた結果を示す散布図である。 図１１Ａの実験で得られた免疫細胞の種類毎の細胞数を示すグラフである。 実施例で用いた、ＣＡＲ及び抗マウスＰＤ－１ｓｃＦｖをコードするベクター、並びにＣＡＲ、ＩＬ－７、ＣＣＬ１９、及び抗マウスＰＤ－１ｓｃＦｖをコードするベクターを表した概念図である。 実施例で用いた形質導入していないＴ細胞及び種々のＣＡＲ含有構築物を形質導入したＴ細胞のフローサイトメトリーで得られた前方散乱－側方散乱を表すグラフ、並びにｐｒｏｔｅｉｎＬ－ｂｉｏ及びｓａｖ－ａｐｃを用いて測定されたＣＡＲ発現細胞の割合を示すグラフである。 実施例で用いた形質導入していないＴ細胞及び種々のＣＡＲ含有構築物を形質導入したＴ細胞の培養上清中におけるＩＬ－７及びＣＣＬ１９の濃度をＥＬＩＳＡで測定した結果を示すグラフである。 実施例で用いた形質導入していないＴ細胞及び種々のＣＡＲ含有構築物を形質導入したＴ細胞の培養上清中における抗ＰＤ－１抗体の濃度をＥＬＩＳＡで測定した結果を示すグラフである。 実施例において、ＤＢＡ／２マウスにヒトＣＤ２０を発現するＰ８１５細胞を皮下注入し、シクロホスファミドを腹腔内投与した後に、形質導入していないＴ細胞又は種々のＣＡＲ含有構築物を形質導入したＴ細胞を投与したときの経過日数と生存率との関係を示すグラフ、並びに実験群間のログランク検定によるＰ値を示す表である。 図１６の実験において、各実験群における経過日数と腫瘍体積との関係を示すグラフである。
以下において、本開示の内容について詳細に説明する。以下に記載する構成要件の説明は、本開示の代表的な実施態様に基づいてなされることがあるが、本開示はそのような実施態様に限定されるものではない。
本開示中に段階的に記載されている数値範囲において、１つの数値範囲で記載された上限値又は下限値は、他の段階的な記載の数値範囲の上限値又は下限値に置き換えてもよい。また、本開示中に記載されている数値範囲において、その数値範囲の上限値又は下限値は、実施例に示されている値に置き換えてもよい。
更に、本開示に記載されている組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する該当する複数の物質の合計量を意味する。
また、本開示において、「質量％」と「重量％」とは同義であり、「質量部」と「重量部」とは同義である。
更に、本開示において、２以上の態様は、矛盾が生じない限り互いに組み合わせてもよい。
本開示に係る一態様によれば、（ａ）がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、インターロイキン７（ＩＬ－７）、及びＣＣＬ１９を発現する免疫応答性細胞、並びに（ｂ）免疫抑制阻害剤を含む、対象におけるがんを治療するための組み合わせ医薬（以下、「本開示に係る組み合わせ医薬Ａ」とも称する）が提供される。
本発明者らは、がん治療方法における有用な抗がん剤の組み合わせを探求した結果、本開示に係る組み合わせ医薬Ａによって、極めて高いがん治療効果を得られることを見出した。具体的には、本開示に係る組み合わせ医薬Ａにおいては、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、ＩＬ－７及びＣＣＬ１９を発現する免疫応答性細胞（以下、「本開示に係る免疫応答性細胞Ａ」とも称する）が用いられる。本開示に係る免疫応答性細胞Ａと、免疫抑制阻害剤との共投与によって著しく高い相乗効果が得られることは、本発明者らにより初めて見出された事項である。
本開示に係る免疫応答性細胞Ａの細胞表面上に存在する、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子は、がん細胞に発現しているがん抗原に特異的に結合する。この結合により、前記免疫応答性細胞ががん細胞につなぎとめられる。細胞内シグナル伝達が引き起こされる等の事象のうち１つ以上が生じ、がんに罹患している者（以下、「がん罹患者」とも称する）のがん細胞への攻撃が開始される。なお、本開示において「認識」と「結合」とは互換的に用いられる。
また、がん細胞は免疫応答性細胞ががん細胞を攻撃したり、がん細胞を攻撃する指示を発したりすることを抑制する免疫抑制機構を有しているため、がん罹患者自身の免疫によるがん細胞への攻撃が抑制されている。本開示に係る組み合わせ医薬Ａの構成要素の１つである免疫抑制阻害剤は、がん細胞による免疫抑制機構を阻害することで、がん罹患者の免疫系ががん細胞を攻撃することをより容易にすると考えられる。
これらに加えて、本開示に係る免疫応答性細胞ＡがＩＬ－７及びＣＣＬ１９も発現していることにより、本開示に係る免疫応答性細胞Ａだけではなく、がん罹患者の内因性の免疫応答性細胞もがん細胞の周囲に集積するため、がん細胞をより効果的に攻撃することが可能になると考えられる。
本開示に係る組み合わせ医薬Ａは、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、ＩＬ－７及びＣＣＬ１９を発現する免疫応答性細胞と、免疫抑制阻害剤とを含むことによって、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子を発現する免疫応答性細胞、分泌されたＩＬ－７及びＣＣＬ１９、並びに免疫抑制阻害剤からなる因子の組み合わせによる相乗的な効果を発揮し、このために大きく改善したがん治療効果を奏すると考えられる。この相乗的な効果は、それぞれの因子の個別の効果からは予測することができないほど優れた効果である。
例えば、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、インターロイキン７、及びＣＣＬ１９を発現する免疫応答性細胞を単独で用いた場合、及び免疫抑制阻害剤を単独で用いた場合には治療困難ながん治療の場合でも、本開示に係る組み合わせ医薬Ａを用いれば治療可能となりうる。このことは、後述の本開示に係る免疫応答性細胞Ｃに関する実験結果から示唆される。また、このような高い治療効果により、細胞の投与量を減らした場合でも治療効果を得ることが可能となり、自家細胞を使用する場合において従来必要とされていた数の免疫応答性細胞を採取できない場合でも、治療効果を得ることが可能になる。このような効果は、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、インターロイキン７、及びＣＣＬ１９を発現する免疫応答性細胞の単独投与、あるいは、免疫抑制阻害剤の単独投与からは予測できない効果である。
＜がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子＞
本開示におけるがん抗原を特異的に認識する細胞表面分子とは、がん抗原に特異的に結合する分子であり、がん抗原に特異的に結合する限りはポリペプチドであっても、アプタマー等の核酸であっても、これら以外の分子であってもよい。ここでがん抗原とは、がん細胞において正常細胞よりも高く発現する、あるいはがん細胞に特異的に発現するタンパク質、糖脂質等の物質を意味し、かかるがん抗原としては、腫瘍関連抗原や癌精巣抗原、血管新生関連抗原、遺伝子変異によるがん新生抗原（ネオアンチゲン）のエピトープペプチドを挙げることができる。
細胞表面分子により特異的に認識されるがん抗原の例としては、具体的には、ＷＴ１、ＭＡＲＴ－１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ１０、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－３、ＫＩＦ２０Ａ、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ＡＦＰ、ｇｐ１００、ＭＵＣ１、ＤＬＬ３、ＰＲＳＳ２１、Ｎｅｃｔｉｎ４、ＦＡＰ、インテグリンβ７、ＣＴ－８３（ＫＫ－ＬＣ－１）、ＫＲＡＳ（変異型、つまりｍＫＲＡＳも含む）、Ｅｐｈａ２、ＰＲＡＭＥ、ＨＡ－１、ＰＡＰ－１０、ＰＡＰ－５、ＴＲＰ２－１、ＳＡＲＴ－１、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＮＥＩＬ３、ＭＰＨＯＳＰＨ１、ＤＥＰＤＣ１、ＦＯＸＭ１、ＣＤＨ３、ＴＴＫ、ＴＯＭＭ３４、ＵＲＬＣ１０、ＫＯＣ１、ＵＢＥ２Ｔ、ＴＯＰＫ、ＥＣＴ２、メソテリン（ＭＥＳＯＴＨＥＬＩＮ）、ＮＫＧ２Ｄ、Ｐ１Ａ等のタンパク質や、ＧＤ２、ＧＭ２等の糖脂質を挙げることができる。さらなる例としては、ＣＤ２０、ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ等）、ＥＧＦＲｖａｒｉａｎｔ、ＦＩＴＣ、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ｃ－Ｍｅｔ、ＨＥＲ２、ＣＥＡ、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ７４、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１７１、ＣＤ１８０、ＭＵＣ１６、ＣＳ１（ＣＤ３１９）、ＩＬ－１３Ｒａ２、ＢＣＭＡ、ＬｅｗｉｓＹ、ＩｇＧ κ鎖、葉酸受容体α、ＰＳＣＡ、ＥｐＣＡＭ、ＣＡＩＸ、ＣＤＳ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ１３８、ＩＧＦ１Ｒ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞抗原、ＥＧＰ－２、ＥＧＰ－４０、ＥＲＢ－Ｂ２、ＥＲＢ－Ｂ３、ＥＲＢ－Ｂ４、ＦＢＰ、胎児性アセチルコリン受容体、ＧＤ３、ＨＥＲ－２、ｈＴＥＲＴ、Ｋ－軽鎖、ＬｅＹ、Ｌ１細胞接着分子、ＮＫＧ２Ｄリガンド、５Ｔ４、及びＴＡＧ－７２も挙げることができるが、これらに限定されない。細胞表面分子として、これら等の細胞表面分子を１種以上含んでいてもよい。これらの抗原の由来生物は、本開示に係る組み合わせ医薬Ａによって治療される対象となる生物種とすることができ、例えばヒトである。
がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子としては、がん抗原を特異的に認識する、細胞表面受容体、人工受容体、接着因子を挙げることができる。がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子は、がん抗原に結合して本開示に係る免疫応答性細胞Ａをがん細胞の近傍に配置させる機能のみを果たすものでもよいが、がん治療効果をより上昇させるために、免疫応答性細胞の免疫応答を活性化させるシグナル伝達を細胞内で引き起こす機能も有しているものであってもよい。がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子は、例えば、がん抗原を特異的に認識する抗体又は抗体断片であってもよい。抗体又は抗体断片はＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ等に限定されるものではなく、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ等の低分子抗体であってもよい。
がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子としては、がん抗原を特異的に認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、がん抗原を特異的に認識するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）等の、細胞表面に発現することによってがんに対する特異的な識別能を細胞に付与する分子を挙げることができる。ＴＣＲは上記細胞表面受容体の一例であり、ＣＡＲは上記人工受容体の一例であり、抗体（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ等の低分子抗体も含む）は上記接着因子の一例であるともいえる。もちろん、がん抗原を特異的に認識する限りは、接着因子は糖鎖、アプタマー等の、抗体以外の分子であってもよい。これらの細胞表面分子は、がん抗原を特異的に認識し、それによって、本開示に係る免疫応答性細胞Ａは、がん細胞周辺に局在することが可能になる。
ＴＣＲはＴ細胞の細胞膜上に発現している抗原受容体分子である。ＴＣＲはアルファ鎖とベータ鎖、又はガンマ鎖とデルタ鎖からなるヘテロ二量体として存在しており、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原分子を認識することでＴ細胞を活性化することが知られている。ＴＣＲは、がん抗原を特異的に認識するかぎりアルファ鎖及びベータ鎖からなるヘテロ二量体（アルファ・ベータＴＣＲ）であっても、ガンマ鎖及びデルタ鎖からなるヘテロ二量体（ガンマ・デルタＴＣＲ）であってもよい。
ＴＣＲは内因性のものであっても、外来性のＴＣＲ（組換えＴＣＲ）であってもよい。内因性のＴＣＲを発現するＴ細胞及び外来性のＴＣＲを遺伝子導入するＴ細胞のソースとしては、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、腫瘍所属リンパ節、末梢血リンパ球、胸水中リンパ球、腹水中リンパ球が挙げられるが、これらに限定されない。
所定の抗原結合性を有するＴＣＲを発現するＴ細胞の分離のための手法としては、密度勾配遠心分離；リセッティング；細胞密度を変える粒子へのカップリング；抗体被覆された磁石ビーズによる磁気分離；アフィニティークロマトグラフィー（例えば、ネガティブセレクションを用いたアフィニティークロマトグラフィー）；モノクローナル抗体に連結されるか、又は、モノクローナル抗体との併用で使用される細胞毒性剤（これには、補体及び細胞毒素が含まれるが、これらに限定されない）；プレート、チップ等の固体マトリックスに結合された抗体によるパンニング；エルトリエーション；抗原刺激による選択的増殖；ＭＨＣと抗原の複合体を利用した分離が挙げられるが、これらに限定されない。
また、特定のＴＣＲを発現するように改変されたトランスジェニックマウス等のトランスジェニック動物も開発されている。
ＣＡＲは、がん細胞の細胞表面抗原を認識する一本鎖抗体と、Ｔ細胞の活性化を誘導するシグナル伝達領域を融合させた人工的なキメラタンパク質である。ＣＡＲは、例えば、がん細胞の細胞表面抗原を認識する一本鎖抗体領域、細胞膜貫通領域、及びＴ細胞の活性化を誘導するシグナル伝達領域を含むものであってもよい。本開示に係る組み合わせ医薬Ａにおいてがん抗原を特異的に認識する細胞表面分子がＣＡＲである場合、該組み合わせ医薬Ａの構成要素として投与される本開示に係る免疫応答性細胞Ａの数が、ＣＡＲ－Ｔ細胞を単独で用いる従来の方法において投与されるＣＡＲ－Ｔ細胞数（通常、１×１０６個以上）に比べて少なくても、同等以上の効果を奏することが可能である。
ＣＡＲにおける一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としては、モノクローナル抗体の抗原結合部位に由来する軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の間にリンカーペプチドが位置するオリゴ又はポリペプチドを挙げることができる。
目的のがん抗原を認識する一本鎖抗体は、公知の手法により作製することができる。例えば、マウス等に抗原を接種してからリンパ組織を採取して、抗体遺伝子のライブラリーを作製し、抗体ダイレクトクローニングによりがん抗原を認識する抗体をコードする塩基配列を得て、それを基に一本鎖抗体を設計してもよい。あるいは、採取したリンパ組織を用いてハイブリドーマを作製し、がん抗原を認識する抗体をコードするハイブリドーマを同定してモノクローナル抗体を得て、その配列情報を基に一本鎖抗体を設計してもよい。あるいは、健常人のＢ細胞から作製したナイーブ抗体ライブラリー、がん抗原に対して高い中和活性を示す抗血清をもつがん罹患者由来のＢ細胞から作製した抗体ライブラリー等を基にして一本鎖抗体のライブラリーを作製し、これをファージディスプレイにより提示させてがん抗原を認識する一本鎖抗体を選抜してもよい。
免疫応答性細胞活性化シグナル伝達領域は、前記一本鎖抗体ががん細胞の細胞表面抗原を認識した際に、細胞内にシグナル伝達することが可能な領域であり、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＯＸ４０、ＨＶＥＭ、ＣＤ３ζ、及びＦｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ γｃｈａｉｎのうちいずれかの細胞内領域のポリペプチドから選択される少なくとも１種又は２種以上を含んでいてもよく、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、及びＣＤ３ζの３種の細胞内領域のポリペプチドを含んでいてもよい。
それぞれの細胞内領域のポリペプチドは、２～１０アミノ酸からなるオリゴペプチドリンカー又はポリペプチドリンカーを介して連結されていてもよく、かかるリンカー配列として、グリシン－セリン連続配列を挙げることができる。
免疫応答性細胞の活性化とは、細胞内でのシグナル伝達又はタンパク質発現の変化の誘導により、免疫応答を開始させることを意味する。例えば、ＣＤ３鎖がリガンド結合及び免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＡＭｓ）に応答して集まると、シグナル伝達カスケードが作られる。また、内因性のＴＣＲ又は外因性のＣＡＲが抗原に結合すると、結合された受容体（例えば、ＣＤ４又はＣＤ８、ＣＤ３γ／δ／ε／ζ等）の近くで、多くの分子の集合を含む、免疫シナプスの形成が起こり得る。この膜結合シグナル伝達分子の集合によって、ＣＤ３鎖内に含有されたＩＴＡＭモチーフがリン酸化する。このリン酸化は、ひいては免疫応答性細胞活性化経路を開始させ、最終的には、ＮＦ－κＢ及びＡＰ－１などの転写因子を活性化しうる。これら転写因子は、例えばＴ細胞の全体的な遺伝子発現を惹起し、Ｔ細胞が媒介する免疫応答を開始させるために、主な制御性Ｔ細胞タンパク質の増殖及び発現のためのＩＬ－２の産生を増加させる。
ＣＡＲにおける細胞膜貫通領域としては、ＣＤ８、Ｔ細胞受容体のα鎖、β鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＧＩＴＲのいずれか由来の細胞膜貫通領域のポリペプチドを挙げることができる。前記細胞膜貫通領域は、例えば、ヒトＣＤ８細胞膜貫通領域のポリペプチドでもよい。かかる細胞膜貫通領域によって、ＣＡＲがＴ細胞の細胞膜に固定される。
前記細胞膜貫通領域には、任意のオリゴペプチド又はポリペプチドからなり、長さが１～１００アミノ酸、より具体的には１０～７０アミノ酸のヒンジ領域を含んでもよい。ヒンジ領域としては、ヒトＣＤ８のヒンジ領域を挙げることができる。
また、がん細胞の細胞表面抗原を認識する一本鎖抗体と細胞膜貫通領域、細胞膜貫通領域と免疫応答性細胞活性化シグナル伝達領域との間には、任意のオリゴペプチド又はポリペプチドからなるスペーサー領域を設けてもよい。スペーサー領域の長さとしては、１～１００アミノ酸、より具体的には１０～５０アミノ酸を挙げることができ、かかるスペーサー領域として、グリシン－セリン連続配列を挙げることができる。
がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子のアミノ酸配列は、例えば哺乳動物由来のアミノ酸配列であり、ヒトに投与した場合の拒絶反応を抑える観点からヒト由来のアミノ酸配列としてもよい。アミノ酸配列は、公知の文献やＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）等のデータベースを検索して適宜入手することができる。がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子は、ヒトのＴＣＲ、あるいは一本鎖抗体領域がヒト化されているＣＡＲであってもよい。
なお、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子は、がん抗原の認識が特異的であれば、間接的に認識するものであってもよい。例えば、がん抗原を特異的に認識する抗体等の分子を本開示に係る免疫応答性細胞Ａと同時又は連続して対象に投与し、当該抗体等の分子を認識するか、又は抗体等の分子に標識されたタグを認識することで、本開示に係る免疫応答性細胞Ａは間接的にがん抗原を特異的に認識し得る。これらの場合、抗体を認識する場合の例としては、細胞表面分子としてＣＤ１６等が挙げられ、抗体等の分子に標識するタグの例としては、ＦＩＴＣ等が挙げられる。
＜ＩＬ－７＞
ＩＬ－７は、構造的に骨髄及び胸腺由来のストロマ細胞から生産される約２５ｋＤａのサイトカインである。ＩＬ－７は、ＩＬ－７レセプターを通して造血幹細胞からリンパ前駆細胞への分化を促進するためのシグナルを出し、Ｔ細胞、Ｂ細胞、及びＮＫ細胞を生じさせる。ＩＬ－７のアミノ酸配列は、例えば哺乳動物由来のアミノ酸配列であり、拒絶反応を抑える観点からヒト由来のアミノ酸配列としてもよい。アミノ酸配列は、公知の文献やＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）等のデータベースを検索して適宜入手することができる。
＜ＣＣＬ１９＞
ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド１９（ＣＣＬ１９）はＣＣケモカインファミリーに属するサイトカインであり、胸腺及びリンパ節での発現量が多い。ＣＣＬ１９のアミノ酸配列は、例えば哺乳動物由来のアミノ酸配列であり、拒絶反応を抑える観点からヒト由来のアミノ酸配列としてもよい。アミノ酸配列は、公知の文献やＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）等のデータベースを検索して適宜入手することができる。
＜本開示に係る免疫応答性細胞Ａ＞
免疫応答性細胞とは、免疫応答に関与する細胞を指す。免疫応答性細胞の例としては、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、Ｂ細胞等のリンパ球系細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞等の抗原提示細胞、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞等の顆粒球が挙げられる。Ｔ細胞の例としては、アルファ・ベータＴ細胞、ガンマ・デルタＴ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、腫瘍浸潤Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞等が挙げられる。
免疫応答性細胞は、血液、骨髄液等の体液や、脾臓、胸腺、リンパ節等の組織、若しくは原発腫瘍、転移性腫瘍、がん性腹水等のがん組織に浸潤する免疫細胞から単離、精製して得ることができ、またｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞等の多能性幹細胞又は造血幹細胞などの体性幹細胞から作製された免疫応答性細胞を用いてもよい。
免疫応答性細胞は、ヒ卜、イヌ、ネコ、ブタ、マウス等の哺乳動物由来のＴ細胞であってもよく、ヒ卜由来のＴ細胞であってもよい。
本開示に係る免疫応答性細胞Ａは、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、ＩＬ－７及びＣＣＬ１９を発現する。ここで、「がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、ＩＬ－７及びＣＣＬ１９を発現する」とは、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、ＩＬ－７及びＣＣＬ１９が免疫応答性細胞により産生され、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子の少なくとも一部が細胞表面（細胞外側の細胞表面）に位置し、ＩＬ－７及びＣＣＬ１９が細胞外に分泌されることを指す。
本開示に係る免疫応答性細胞Ａは、例えば、生体から採取した免疫応答性細胞、又はｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞等の多能性幹細胞若しくは造血幹細胞などの体性幹細胞から誘導した免疫応答性細胞等に、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする遺伝子、ＩＬ－７をコードする遺伝子、及びＣＣＬ１９をコードする遺伝子を導入することで得ることができる。あるいは、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子（例えばがん抗原を特異的に認識するＴＣＲ）を内在的に発現している免疫応答性細胞を生体から採取して、ＩＬ－７をコードする遺伝子及びＣＣＬ１９をコードする遺伝子を導入することでも得ることができる。なお、本開示においては、ＸＸをコードする遺伝子なる表現と、ＸＸをコードする核酸なる表現は互換的に用いられる。この場合、核酸は一本鎖でも二本鎖でも、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいが、二本鎖ＤＮＡであることが好ましい。
生体から採取した免疫応答性細胞に遺伝子導入する場合、本開示に係る組み合わせ医薬Ａにより治療されるがん罹患者自身の（つまり自家の）免疫応答性細胞を採取すれば、拒絶反応を最小化できる。ただし、他家の免疫応答性細胞を使用することを排除するものではない。つまり、本開示に係る免疫応答性細胞Ａは、対象自身に由来する免疫応答性細胞であっても、なくてもよい。
がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする遺伝子、ＩＬ－７をコードする遺伝子、及びＣＣＬ１９をコードする遺伝子は、それぞれ、本開示に係る免疫応答性細胞Ａのゲノム中に存在していても、ゲノム外のベクターに担持されていてもよく、例えば、遺伝子担持の安定性の観点からゲノム中に存在させてもよい。また、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする遺伝子、ＩＬ－７をコードする遺伝子、及びＣＣＬ１９をコードする遺伝子は、ゲノム中にまとまって存在していてもよく、ばらばらに（分離して）存在していてもよい。がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子が、例えばαβの二量体又はγδの二量体からなるＴＣＲである場合のようにヘテロ二量体又はヘテロ多量体である場合、ヘテロ二量体又はヘテロ多量体を構成するそれぞれの分子をコードする遺伝子はゲノム中にまとまって存在していてもよく、ばらばらに（分離して）存在していてもよい。
一実施形態においては、ＩＬ－７をコードする遺伝子及びＣＣＬ１９をコードする遺伝子は外来性であり、双方が本開示に係る免疫応答性細胞Ａのゲノムに組み込まれているか、又は前記免疫応答性細胞Ａ中に存在する１個又は複数個のベクターに一緒に若しくは別個にコードされている。なお、細胞中に各遺伝子が存在しているかどうかは、ＰＣＲ等公知の手法を用いて容易に確認することができる。本開示において、「外来性」（exogenous）とは、当該遺伝子又は核酸が細胞内に元々存在していた遺伝子又は核酸ではなく、外部から導入された遺伝子又は核酸であることを表す。
ＴＣＲとしては、すでに、ＭＡＲＴ１特異的ＴＣＲ（Cancer Res.54,5265-5268(1994)）、ＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ（Anticancer Res.,20,1793-1799(2000)）、ｇｐ１００特異的ＴＣＲ（J.Immunol.170,2186-2194(2003)）、ＮＹ－ＥＳＯ－１特異的ＴＣＲ（J.Immunol.,174、4415-4423(2005)）、ＷＴ１特異的ＴＣＲ（Blood,106,470-476(2005)）、ＭＡＧＥ－Ａ１特異的ＴＣＲ（Int.Immunol.,8,1463-1466(1996)）、Ｐ１Ａ特異的ＴＣＲ（Sarma, S., Y. Guo, Y. Guilloux, C. Lee, X.-F. Bai, Y. Liu. 1999. Cytotoxic T lymphocytes to an unmutated tumor antigen P1A: normal development but restrained effector function. J. Exp. Med. 189:811.）、ＭＡＧＥ－Ａ１０特異的ＴＣＲ、ＡＦＰ特異的ＴＣＲ、ＣＴ－８３特異的ＴＣＲ、ＫＲＡＳ（変異型、つまりｍＫＲＡＳも含む）特異的ＴＣＲ、ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＴＣＲ、Ｅｐｈａ２特異的ＴＣＲ、ＢＣＭＡ特異的ＴＣＲ、５Ｔ４特異的ＴＣＲ、ＰＲＡＭＥ特異的ＴＣＲ、ＨＡ－１特異的ＴＣＲ等のＴＣＲが報告されており、それらをコードする核酸配列についても上記各文献に報告されている。がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子がＴＣＲである場合、ＴＣＲをコードする遺伝子の塩基配列は、目的の抗原分子を認識し、かつＴ細胞を活性化することができるかぎり、上記文献に記載のＴＣＲをコードする塩基配列と例えば８０％以上、より具体的には８５％以上、より具体的には９０％以上、より具体的には９５％以上、より具体的には９８％以上の配列同一性を有する塩基配列であってもよい。本開示において、アミノ酸配列の配列同一性及び塩基配列の配列同一性は、例えばＢＬＡＳＴ（登録商標、National Library of Medicine）プログラムを用いてデフォールトパラメータで評価することができる。
あるいは、ＴＣＲをコードする遺伝子の塩基配列は、上記文献に記載されたＴＣＲをコードする塩基配列中におけるＣＤＲをコードする塩基配列を維持し、かつＣＤＲをコードする塩基配列以外の領域の塩基配列において、上記文献に記載のＴＣＲをコードする塩基配列における当該領域の塩基配列と６０％以上、より具体的には７０％以上、より具体的には８０％以上、より具体的には９０％以上、より具体的には９５％以上の配列同一性を有する塩基配列でもよい。
もちろんＴＣＲの塩基配列は、ＴＣＲの抗原特異性により変動するものであり、所望の抗原に結合するＴＣＲを発現するＴ細胞を単離して、当該ＴＣＲの塩基配列を解析してもよい。例えば、特定の抗原を特異的に認識するＴＣＲをコードする遺伝子の塩基配列は、当技術分野における公知の方法を用いることにより、特定の抗原を用いて誘導された細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）のＴＣＲサブユニットとしてのアルファ鎖及びベータ鎖をコードする塩基配列を解析することで得ることができる（国際公開第２００７／０３２２５５号、及びMorgan et al., J Immunol, 171, 3288 (2003)）。ＴＣＲの塩基配列を解析する際には、ＰＣＲ法により各鎖をコードする塩基配列を増幅して解析してもよい。ＰＣＲプライマーは、例えば、５'側プライマーとしての５'－Ｒプライマー（５'－ｇｔｃｔａｃｃａｇｇｃａｔｔｃｇｃｔｔｃａｔ－３'：配列番号１）、及び３'側プライマーとしての、ＴＣＲアルファ鎖Ｃ領域に特異的な３－ＴＲａ－Ｃプライマー（５'－ｔｃａｇｃｔｇｇａｃｃａｃａｇｃｃｇｃａｇｃｇｔ－３'：配列番号２）、ＴＣＲベータ鎖Ｃ１領域に特異的な３－ＴＲｂ－Ｃ１プライマー（５'－ｔｃａｇａａａｔｃｃｔｔｔｃｔｃｔｔｇａｃ－３'：配列番号３）、又はＴＣＲベータ鎖Ｃ２領域に特異的な３－ＴＲｂｅｔａ－Ｃ２プライマー（５'－ｃｔａｇｃｃｔｃｔｇｇａａｔｃｃｔｔｔｃｔｃｔｔ－３'：配列番号４）であってもよいが、これらに限定されない。抗原特異的なＴＣＲは、抗原（例えばペプチド）を提示する標的細胞と高い結合力で結合することができる。また、免疫応答性細胞の種類を適切に選択することにより、抗原ペプチドを提示する標的細胞の効率的な殺傷を媒介することができる。
ＣＡＲをコードする塩基配列としては、ＣＡＲを構成するポリペプチドをコードする塩基配列であれば特に制限されず、がん細胞の細胞表面抗原を認識する一本鎖抗体、細胞膜貫通領域、及びＴ細胞の活性化を誘導するシグナル伝達領域のポリペプチドをコードする塩基配列が含まれる。
ＣＡＲにおけるがん細胞の細胞表面抗原に対する一本鎖抗体、細胞膜貫通領域、及び免疫応答性細胞活性化シグナル伝達領域のポリペプチドをコードする塩基配列の情報は、公知の文献やＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）などのデータベースを検索して適宜入手することができる。
たとえば、免疫応答性細胞活性化シグナル伝達領域におけるＣＤ２８、４－１ＢＢ、及びＣＤ３ζの細胞膜貫通領域のポリペプチドをコードする塩基配列の情報は、ＮＣＢＩなどのデータベースを検索して適宜入手することができ、ヒトＣＤ２８については、Ｇｅｎｂａｎｋ番号：ＮＭ＿００６１３９．２（更新日：２０１４年５月１０日）、ヒト４－１ＢＢについては、Ｇｅｎｂａｎｋ番号：ＮＭ＿００１５６１．５（更新日：２０１４年３月１６日）、ヒトＣＤ３ζについては、Ｇｅｎｂａｎｋ番号：ＮＭ＿０００７３４．３（更新日：２０１４年８月１２日）として登録されたものを例示することができる。
また、ヒトＣＤ８の細胞膜貫通領域のポリペプチドをコードする塩基配列の情報は、ＮＣＢＩ等のデータベースを検索し適宜入手することができ、Ｇｅｎｂａｎｋ番号：ＮＭ＿００１７６８．６（更新日：２０１４年５月１０日）として登録されたものを例示することができる。
さらに、一本鎖抗体のポリペプチドをコードする塩基配列の情報については、標的とする細胞表面抗原を認識するモノクローナル抗体を作製し、かかるモノクローナル抗体のアミノ酸配列をエドマン法などの公知の方法で決定し、かかるアミノ酸配列に基づいて入手することもできる。モノクローナル抗体の作製方法としては、ハイブリドーマを用いて作製する方法や、遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで宿主を形質転換して作製する方法や、トランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで作製する方法を挙げることができる。
ＩＬ－７をコードする塩基配列及びＣＣＬ１９をコードする塩基配列の情報は、公知の文献やＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）などのデータベースを検索して適宜入手することができる。
ＩＬ－７をコードする塩基配列は、本開示に係る免疫応答性細胞Ａの種類に応じて適宜選択でき、例えば、ヒトＩＬ－７のアミノ酸配列（配列番号５）をコードする塩基配列であってもよく、また、ＩＬ－７としての細胞増殖率の亢進作用を有する限り、配列番号５に示す塩基配列と例えば８０％以上、より具体的には８５％以上、より具体的には９０％以上、より具体的には９５％以上、より具体的には９８％以上の配列同一性を有する塩基配列であってもよい。
ＣＣＬ１９をコードする塩基配列は、本開示に係る免疫応答性細胞Ａの種類に応じて適宜選択でき、例えば、ヒトＣＣＬ１９のアミノ酸配列（配列番号６）をコードする塩基配列であってもよく、また、ＣＣＬ１９としてのＴ細胞遊走作用を有する限り、配列番号６に示す塩基配列と例えば８０％以上、より具体的には８５％以上、より具体的には９０％以上、より具体的には９５％以上、より具体的には９８％以上の配列同一性を有する塩基配列であってもよい。
本開示に係る免疫応答性細胞Ａにおいては、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする遺伝子、ＩＬ－７をコードする遺伝子、及びＣＣＬ１９をコードする遺伝子は、適切なプロモーターの制御下にあるようにする。
本開示に係る免疫応答性細胞Ａは、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、ＩＬ－７、及びＣＣＬ１９に加えて、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２３、ＩＬ－２７、ＩＰ－１０、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ４Ｌ１、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ１７、ＣＸ３ＣＬ１、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、ＣＣＬ３Ｌ１、ＣＣＬ３Ｌ３、ＣＣＬ４Ｌ１、ＣＣＬ４Ｌ２、Ｆｌｔ３Ｌ、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｇａｍｍａ、ＭＩＰ－１ａｌｐｈａ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＴＧＦ－ｂｅｔａ、ＴＮＦ－ａｌｐｈａ等の他の免疫機能制御因子を１種以上さらに発現していてもよい。
本開示に係る免疫応答性細胞Ａの分離のための手法としては、密度勾配遠心分離；リセッティング；細胞密度を変える粒子へのカップリング；抗体被覆された磁石ビーズによる磁気分離；アフィニティークロマトグラフィー（例えば、ネガティブセレクションを用いたアフィニティークロマトグラフィー）；モノクローナル抗体に連結されるか、又は、モノクローナル抗体との併用で使用される細胞毒性剤（これには、補体及び細胞毒素が含まれるが、これらに限定されない）；プレート、チップ等の固体マトリックスに結合された抗体によるパンニング；エルトリエーション；抗原刺激による選択的増殖；ＭＨＣと抗原の複合体を利用した分離が挙げられるが、これらに限定されない。
免疫応答性細胞ががん抗原を特異的に認識する細胞表面分子を内在的に発現している場合、例えば所定のがん抗原を特異的に認識するＴＣＲを発現しているＴ細胞を単離する場合には、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする遺伝子を外部から導入する必要は無いが、一般的には、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする遺伝子、ＩＬ－７をコードする遺伝子、及びＣＣＬ１９をコードする遺伝子のうちの１種以上を外部から導入する。
免疫応答性細胞に導入するためのがん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする遺伝子を含む核酸、ＩＬ－７をコードする遺伝子を含む核酸及びＣＣＬ１９をコードする遺伝子を含む核酸は、それぞれ、当該分子をコードする塩基配列の情報に基づき、化学合成する方法や、ＰＣＲによって増幅する方法等の公知の技術によって作製することができる。なお、コーディング領域におけるコドンは、遺伝子を含む核酸が導入される対象となる免疫応答性細胞における当該遺伝子の発現を最適化するために改変されてもよい。
導入の対象となる遺伝子は、それぞれ別々のベクターに担持された状態で導入されても、２種以上の遺伝子を同じベクターに担持した状態で導入してもよい。例えば、ＩＬ－７をコードする遺伝子及びＣＣＬ１９をコードする遺伝子を免疫応答性細胞に導入する場合、ＩＬ－７をコードする遺伝子とＣＣＬ１９をコードする遺伝子とは別々のベクターで導入してもよいし、同じベクターに両遺伝子を担持させて導入してもよい。
また、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする遺伝子、ＩＬ－７をコードする遺伝子及びＣＣＬ１９をコードする遺伝子を免疫応答性細胞に導入する場合、
（ｉ）がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする遺伝子、ＩＬ－７をコードする遺伝子及びＣＣＬ１９をコードする遺伝子を、それぞれ別個のベクターに担持させて導入してもよいし、
（ｉｉ）がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする遺伝子及びＩＬ－７をコードする遺伝子を同じベクターに担持させ、ＣＣＬ１９をコードする遺伝子を別個のベクターに担持させて導入してもよいし、
（ｉｉｉ）がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする遺伝子及びＣＣＬ１９をコードする遺伝子を同じベクターに担持させ、ＩＬ－７をコードする遺伝子を別個のベクターに担持させて導入してもよいし、
（ｉｖ）ＩＬ－７をコードする遺伝子及びＣＣＬ１９をコードする遺伝子を同じベクターに担持させ、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする遺伝子を別個のベクターに担持させて導入してもよいし、
（ｖ）がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする遺伝子、ＩＬ－７をコードする遺伝子及びＣＣＬ１９をコードする遺伝子を、同じベクターに担持させて導入してもよい。
導入効率を考慮して、２種以上の遺伝子を同じベクターに担持した状態で導入させてもよい。この場合は、当該２種以上の遺伝子は、免疫応答性細胞中でまとまって存在することになる。
例えば、以下のベクター又はベクター群を使用することができる。
（ａ）がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする遺伝子、ＩＬ－７をコードする遺伝子、及びＣＣＬ１９をコードする遺伝子を含有するベクター
（ｂ）以下のベクター（ｂ－１）及びベクター（ｂ－２）からなるベクター群：
（ｂ－１）がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする遺伝子を含有するベクター；
（ｂ－２）ＩＬ－７をコードする遺伝子及びＣＣＬ１９をコードする遺伝子を含有するベクター；
（ｃ）以下のベクター（ｃ－１）及びベクター（ｃ－２）からなるベクター群：
（ｃ－１）がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする遺伝子及びＩＬ－７をコードする遺伝子を含有するベクター；
（ｃ－２）ＣＣＬ１９をコードする遺伝子を含有するベクター；
（ｄ）以下のベクター（ｄ－１）及びベクター（ｄ－２）からなるベクター群：
（ｄ－１）ＩＬ－７をコードする遺伝子を含有するベクター；
（ｄ－２）がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする遺伝子及びＣＣＬ１９をコードする遺伝子を含有するベクター；
（ｅ）以下のベクター（ｅ－１）、ベクター（ｅ－２）及びベクター（ｅ－３）からなるベクター群：
（ｅ－１）がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする遺伝子を含有するベクター；
（ｅ－２）ＩＬ－７をコードする遺伝子を含有するベクター；
（ｅ－３）ＣＣＬ１９をコードする遺伝子を含有するベクター。
ベクター群は、遺伝子が冗長（ｒｅｄｕｎｄａｎｔ）に含まれるように設計してもよく、例えば上記（ｃ－１）及び（ｄ－２）からなるベクター群を設計してもよい。この場合は、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする遺伝子は両方のベクターに含まれるが、両ベクターに含まれるがん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする遺伝子は互いに同じであっても異なっていてもよい。
上記のベクターのうち任意のベクターに、又は上記のベクターとは別個のベクターに、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２３、ＩＬ－２７、ＩＰ－１０、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ４Ｌ１、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ１７、ＣＸ３ＣＬ１、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、ＣＣＬ３Ｌ１、ＣＣＬ３Ｌ３、ＣＣＬ４Ｌ１、ＣＣＬ４Ｌ２、Ｆｌｔ３Ｌ、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｇａｍｍａ、ＭＩＰ－１ａｌｐｈａ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＴＧＦ－ｂｅｔａ、ＴＮＦ－ａｌｐｈａ等の１種以上の他の免疫機能制御因子をコードする遺伝子をさらに含有させて、免疫応答性細胞に導入してもよい。
遺伝子を担持するベクターを免疫応答性細胞に導入する方法としては特に制限されないが、ウイルス感染法、トランスポゾン法、カルシウムリン酸法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法等の公知の方法が挙げられる。外来遺伝子のゲノムへの導入が可能なウイルス感染法により導入する方法は遺伝子担持の安定性をもたらしうる。
ウイルス感染法としては、ベクターとパッケージングプラスミドをＧＰ２－２９３細胞（タカラバイオ社製）、Ｐｌａｔ－ＧＰ細胞（コスモ・バイオ社製）、ＰＧ１３細胞（ATCC CRL-10686）、ＰＡ３１７細胞（ATCC CRL-9078）等のパッケージング細胞にトランスフェクションして組換えウイルスを作製し、かかる組換えウイルスを免疫応答性細胞に感染させる方法を挙げることができ、Retrovirus packaging Kit Eco（タカラバイオ社製）等の市販のキットを用いて行ってもよい。ＭＳＣＶレトロウイルス発現システム等を用いれば、外来遺伝子のゲノムへの導入が可能である。
また、ＩＬ－７をコードする遺伝子、ＣＣＬ１９をコードする遺伝子、及び必要ならがん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする遺伝子のゲノムへの組込みは、公知の遺伝子編集技術を用いて行うこともできる。公知の遺伝子編集技術としては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ（転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ）、ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ）－Ｃａｓシステム等のエンドヌクレアーゼを用いる技術が挙げられる。所望により導入される他の外来タンパク質をコードする遺伝子のゲノムへの組込みも、同様の手法により行うことができる。
また、これらの遺伝子を免疫応答性細胞のゲノムに組み込む場合には、当該遺伝子を制御する上流プロモーターと共にゲノムの非コード領域等に作動可能に（即ち、当該プロモーターの制御下で発現可能なように）組み込んでもよいし、プロモーター無しに、ゲノム中に既に存在しているプロモーターの下流に作動可能に組み込んでもよい。ゲノム中に既に存在しているプロモーターとしては、ＴＣＲα、ＴＣＲβのプロモーター等が挙げられる。
がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする遺伝子、ＩＬ－７をコードする遺伝子、ＣＣＬ１９をコードする遺伝子、及び所望により導入された追加の外来タンパク質をコードする遺伝子のうち２種以上の遺伝子が近接して存在する場合には、それら２種以上の遺伝子を共通のプロモーターの制御下で発現させることもできる。共通のプロモーターの制御下で発現させる場合には、２Ａペプチド、ＩＲＥＳペプチド等を使用して、転写及び／又は翻訳を分断してそれぞれのポリペプチドを発現させるようにできる。
がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする遺伝子、ＩＬ－７をコードする遺伝子及びＣＣＬ１９をコードする遺伝子のうちの２種以上を担持するベクターを免疫応答性細胞に導入する場合には、該ベクター中における前記２種以上の遺伝子の並び順は特に限定されない。例えば、前記（ａ）がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする遺伝子、ＩＬ－７をコードする遺伝子及びＣＣＬ１９をコードする遺伝子を含有するベクターにおいては、これら３種の遺伝子の並び順は限定されない。具体的には、上流（５’末端側）から下流（３’末端側）への順に、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする遺伝子、ＩＬ－７をコードする遺伝子及びＣＣＬ１９をコードする遺伝子が並ぶ順番であっても、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする遺伝子、ＣＣＬ１９をコードする遺伝子及びＩＬ－７をコードする遺伝子が並ぶ順番であっても、ＩＬ－７をコードする遺伝子、ＣＣＬ１９をコードする遺伝子及びがん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする遺伝子が並ぶ順番であっても、ＩＬ－７をコードする遺伝子、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする遺伝子及びＣＣＬ１９をコードする遺伝子が並ぶ順番であっても、ＣＣＬ１９をコードする遺伝子、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする遺伝子及びＩＬ－７をコードする遺伝子が並ぶ順番であっても、ＣＣＬ１９をコードする遺伝子、ＩＬ－７をコードする遺伝子及びがん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする遺伝子が並ぶ順番であってもよい。
また、上記（ｂ－２）ＩＬ－７をコードする遺伝子及びＣＣＬ１９をコードする遺伝子を含有するベクターにおいて、ＩＬ－７をコードする遺伝子及びＣＣＬ１９をコードする遺伝子の並び順は特に制限されず、ＩＬ－７をコードする遺伝子に対してＣＣＬ１９をコードする遺伝子が上流に配置されても下流に配置されてもよい。
上記（ｃ－１）がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする遺伝子及びＩＬ－７をコードする遺伝子を含有するベクターにおいて、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする遺伝子及びＩＬ－７をコードする遺伝子の並び順は特に制限されず、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする遺伝子に対してＩＬ－７をコードする遺伝子が上流に配置されても下流に配置されてもよい。
上記（ｄ－２）がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする遺伝子及びＣＣＬ１９をコードする遺伝子を含有するベクターにおいて、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする遺伝子及びＣＣＬ１９をコードする遺伝子の並び順は特に制限されず、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする遺伝子に対してＣＣＬ１９をコードする遺伝子が上流に配置されても下流に配置されてもよい。
なお、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする遺伝子、ＩＬ－７をコードする遺伝子及びＣＣＬ１９をコードする遺伝子はそれぞれ別のプロモーターにより転写されてもよく、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ：ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｚｙｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）又は自己切断型２Ａペプチドを使用して一つのプロモーターで転写されてもよい。
一つのプロモーターで複数の遺伝子を転写させる場合、それぞれの遺伝子の間の塩基配列は、それぞれの遺伝子を発現し得る限り、任意の塩基配列を含んでもよいが、自己切断型ペプチド（２Ａペプチド）又はＩＲＥＳをコードする塩基配列を含んでもよく、２Ａペプチドをコードする塩基配列を含んでもよい。このような塩基配列を用いて複数の遺伝子を連結することにより、それぞれの遺伝子を効率よく発現させることが可能となる。自己切断型ペプチド（２Ａペプチド）又はＩＲＥＳをコードする塩基配列を含みうる遺伝子間の塩基配列は、例えば、ＩＬ－７をコードする遺伝子とＣＣＬ１９をコードする遺伝子との間の塩基配列であってもよく、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする遺伝子とＩＬ－７をコードする遺伝子との間の塩基配列であってもよく、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする遺伝子とＣＣＬ１９をコードする遺伝子との間の塩基配列であってもよく、アルファ・ベータＴＣＲにおけるアルファ鎖をコードする遺伝子とベータ鎖をコードする遺伝子との間の塩基配列であってもよく、ガンマ・デルタＴＣＲにおけるガンマ鎖をコードする遺伝子とデルタ鎖をコードする遺伝子の間の塩基配列であってもよい。つまり、これらの遺伝子間の領域それぞれについて、所望により、自己切断型ペプチド（２Ａペプチド）又はＩＲＥＳをコードする塩基配列を含ませることができる。
２Ａペプチドとは、ウイルス由来の自己切断型ペプチドであり、例として配列番号７で示されるアミノ酸配列の場合、該アミノ酸配列中のＧ－Ｐ間（Ｃ末端から１残基の位置）が小胞体で切断される特徴を有する（Szymczak et al., Expert Opin. Biol. Ther.5(5):627-638(2005)）。そのため、２Ａペプチドを介してその前後に組み込まれた核酸は、細胞内で互いに独立して発現することとなる。
前記２Ａペプチドとしては、ピコルナウイルス、ロタウイルス、昆虫ウイルス、アフトウイルス又はトリパノソーマウイルス由来の２Ａペプチドであってもよく、配列番号８に示すピコルナウイルス由来の２Ａペプチド（Ｆ２Ａ）であってもよい。
免疫応答性細胞への遺伝子導入に用いられるベクターは直鎖状でも環状でもよく、プラスミド等の非ウイルスベクターでも、ウイルスベクターでも、トランスポゾンによるベクターでもよい。免疫応答性細胞への遺伝子導入に用いられるベクターは、プロモーター、ターミネーター等の制御配列、薬剤耐性遺伝子、レポーター遺伝子等の選択マーカー配列のうち１つ以上を含有していてもよい。免疫応答性細胞への遺伝子導入後も、ベクターに含まれるプロモーターを利用して遺伝子の発現を行わせるようにしてもよい。例えば、ベクター中のプロモーター配列の下流に作動可能にがん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする遺伝子、ＩＬ－７をコードする遺伝子及びＣＣＬ１９をコードする遺伝子のうち１つ以上を配置することで、当該遺伝子を効率よく転写させることができる。
前記プロモーターの例としては、レトロウイルスのＬＴＲプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーター等のウイルス由来プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、Ｘｉｓｔプロモーター、β－アクチンプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、ポリペプチド鎖伸長因子遺伝子プロモーター等の哺乳類由来プロモーターを挙げることができる。また、テトラサイクリンによって誘導されるテトラサイクリン応答型プロモーター、インターフェロンによって誘導されるＭｘ１プロモーター等を用いてもよい。特定の物質によって誘導されるプロモーターを用いることによって、プロモーターに転写制御される遺伝子（例えば、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする遺伝子、ＩＬ－７をコードする遺伝子及びＣＣＬ１９をコードする遺伝子のうち１つ以上）の発現をがんの治療経過に応じて制御することが可能となる。
前記ウイルスベクターの例としては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターを挙げることができる。レトロウイルスベクターとしては、ｐＭＳＧＶベクター（Tamada K. et al., Clin Cancer Res 18:6436-6445(2002)）、ｐＭＳＣＶベクター（タカラバイオ社製）等を挙げることができる。レトロウイルスベクターを用いれば、導入遺伝子はホスト細胞のゲノムへ取り込まれるため、導入遺伝子を長期間安定に発現することが可能となる。
免疫応答性細胞におけるがん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、ＩＬ－７及びＣＣＬ１９の発現は、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング等により確認することができる。また、これらをコードする遺伝子の導入は、上記のように発現産物を確認するか、あるいはノザンブロッティング、サザンブロッティング、ＲＴ－ＰＣＲ等のＰＣＲ等により確認することができる。遺伝子導入に用いるベクターがマーカー遺伝子を含有する場合には、当該発現ベクターに挿入されたマーカー遺伝子の発現を調べることによって遺伝子の導入を確認することができる。
また、本開示に係る免疫応答性細胞Ａは、アポトーシス誘導を可能とするために、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（HSV-TK）、誘導性カスパーゼ９（inducible caspase 9）等の自殺遺伝子をさらに発現してもよい。これらの酵素の遺伝子も、上記と同様の手法により免疫応答性細胞内に（例えば、免疫応答性細胞のゲノムに）導入できる。例えば、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする遺伝子、ＩＬ－７をコードする遺伝子、及びＣＣＬ１９をコードする遺伝子のうちの１種以上を担持するベクターに、若しくは該ベクターとは別個のベクターに、自殺遺伝子をコードする核酸を含ませて、免疫応答性細胞に導入してもよい。
自殺遺伝子とは、発現することによって直接的に、あるいは二次的に細胞毒性を有する物質を誘導し、自殺遺伝子を発現した細胞を死に至らしめる機能を有する遺伝子を意味する。自殺遺伝子をコードする核酸を免疫応答性細胞に含ませることによって、がんの治療経過に応じて、たとえば腫瘍が消失した場合に自殺遺伝子の機能を活性化する薬剤を投与し、生体内に存在する本開示に係る免疫応答性細胞Ａを減少又は除去することができる。
自殺遺伝子としては、以下の文献に記載された単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（HSV-TK）や誘導性カスパーゼ９（inducible caspase 9）をコードする遺伝子等を挙げることができ、かかる遺伝子の機能を活性化する薬剤としては、前者に対してはガンシクロビル、後者に対しては二量体誘導化合物（chemical induction of dimerization:CID）であるＡＰ１９０３を挙げることができる（Cooper LJ.,et. al. Cytotherapy. 2006;8(2):105-17.,Jensen M. C. et. al. Biol Blood Marrow Transplant. 2010 Sep;16(9):1245-56., Jones BS. Front Pharmacol.2014 Nov 27;5:254., Minagawa K., Pharmaceuticals (Basel). 2015 May 8;8(2):230-49., Bole-Richard E., Front Pharmacol. 2015 Aug 25;6:174）。
＜免疫抑制阻害剤＞
免疫抑制阻害剤は、免疫応答性細胞活性化の抑制を解除又は低減する物質を指す。免疫応答性細胞活性化の抑制は、例えば、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）が樹状細胞と結合することによる細胞傷害性Ｔ細胞又はヘルパーＴ細胞と樹状細胞との結合の阻害；ＴｒｅｇがＴＧＦ－β、ＩＬ－１０などの抑制性サイトカインやパーフォリン、グランザイムなどの細胞傷害性物質等を分泌することによる細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞等の活性化阻害；ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用、ＣＴＬＡ－４とＣＤ８０／ＣＤ８６との相互作用等による免疫チェックポイントによる細胞傷害性Ｔ細胞の活性化抑制などにより生じる。免疫抑制阻害剤は、免疫応答性細胞活性化に対する上記等の抑制を解除し、免疫応答性細胞が活性化することを可能にする物質である。
免疫抑制阻害剤の例としては、免疫チェックポイント阻害剤、Ｔｒｅｇ、骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）等の免疫抑制性細胞の浸潤、生存、又は機能を阻害する分子標的薬、ＣＣＲ４阻害剤、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）阻害剤、プロスタグランジンＥ２［ＰＧＥ２］抑制剤、細胞傷害性抗がん剤が挙げられる。免疫抑制阻害剤は、これらの機能を有する限り、抗体であってもよく、例えばＩｇＧモノクローナル抗体又は抗体断片であってもよい。
免疫チェックポイント阻害剤は、典型的にはＴ細胞の表面に発現する免疫チェックポイント分子を介した免疫抑制機構を解除又は軽減させる物質である。免疫チェックポイント阻害剤は、例えば、免疫チェックポイント分子（例えばＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３等）又は免疫チェックポイント分子のリガンド（例えばＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ８０／ＣＤ８６、Ｓｉｇｌｅｃ－１５等）に結合して、リガンドにより免疫チェックポイント分子からのシグナル伝達が開始されることを阻害することで、免疫応答に対する抑制反応を減少させることができる。
Ｔｒｅｇ、ＭＤＳＣ等の免疫抑制性細胞の浸潤、生存、又は機能を阻害する分子標的薬は、例えば、チロシンキナーゼを阻害することによって、がん組織内に浸潤してくるＴｒｅｇを減少させ、がん微小環境における免疫抑制を軽減させることができる。
ＣＣＲ４阻害剤は、ケモカインレセプターＣＣＲ４がＴｒｅｇを呼び集める働きを阻害することによって、がん微小環境における免疫抑制を軽減させることができる。
ＩＤＯ阻害剤は、ＩＤＯの酵素活性を阻害する、又はＩＤＯの発現自体を抑制することによりキヌレニンの産生を抑制し、キヌレニンによるＴｒｅｇ活性化を減少させることができる。
ＰＧＥ２抑制剤は、ＰＧＥ２がＴｒｅｇ表面にあるプロスタグランジンＥＰ４受容体と結合してＴｒｅｇの免疫抑制作用を上昇させることを抑制することで、がん微小環境における免疫抑制を軽減させることができる。
細胞傷害性抗がん剤は、Ｔｒｅｇ等の免疫抑制細胞の数を減少させることによって免疫応答に対する抑制を減少させることができる。
免疫チェックポイント阻害剤の例としては、ＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＣＴＬＡ－４阻害剤、ＣＤ４７阻害剤、ＳＩＲＰα阻害剤、ＢＴＬＡ阻害剤、ＴＩＭ－３阻害剤、ＴＩＧＩＴ阻害剤、ＬＡＧ－３阻害剤、Ｓｉｇｌｅｃ－１５阻害剤、ガレクチン－９阻害剤等が挙げられる。Ｔｒｅｇ、ＭＤＳＣ等の免疫抑制性細胞の浸潤、生存、又は機能を阻害する分子標的薬の例としては、ソラフェニブ、スニチニブ等が挙げられる。ＣＣＲ４阻害剤の例としては、抗ＣＣＲ４抗体（例えばモガムリズマブ）等が挙げられる。ＩＤＯ阻害剤の例としては、エパカドスタット等が挙げられる。プロスタグランジンＥ２［ＰＧＥ２］抑制剤の例としてはアスピリン等が挙げられる。細胞傷害性抗がん剤の例としては、シクロホスファミド、ゲムシタビン等が挙げられる。
免疫抑制阻害剤は、ＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＰＤ－Ｌ２阻害剤、ＣＴＬＡ－４阻害剤、ＢＴＬＡ（B- and T-lymphocyte attenuator）阻害剤、ＴＩＭ－３（T-cell immunoglobulin and mucin domain 3）阻害剤、ＴＩＧＩＴ（T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains）阻害剤、ＬＡＧ－３（Lymphocyte Activation Gene-3）阻害剤、及びＳｉｇｌｅｃ－１５阻害剤からなる群から選択される１種以上を含んでいてもよい。
本開示に係る組み合わせ医薬Ａにおける免疫抑制阻害剤は、免疫チェックポイント阻害剤であってもよく、より具体的にはＰＤ－１阻害剤又はＰＤ－Ｌ１阻害剤であってもよく、さらに具体的にはＰＤ－１に対する抗体又はＰＤ－Ｌ１に対する抗体であってもよい。ＰＤ－１に対する抗体の例としては、Nivolumab（ニボルマブ）、Pembrolizumab（ペムブロリズマブ）、Toripalimab（トリパリマブ）、Cemiplimab-rwlc（セミプリマブ）、Sintilimab（シンチリマブ）等が挙げられる。ＰＤ－Ｌ１に対する抗体の例としては、Atezolizumab（アテゾリズマブ）、Durvalumab（デュルバルマブ）、Avelumab （アベルマブ）等が挙げられる。ＣＴＬＡ－４に対する抗体の例としては、Ipilimumab（イピリムマブ）等が挙げられる。他にＣＤ４７、ＳＩＲＰαに対する抗体等も挙げられる。
本開示に係る組み合わせ医薬Ａにおいては、本開示に係る免疫応答性細胞Ａによりがん抗原を特異的に認識する細胞表面分子に加えて、ＩＬ－７及びＣＣＬ１９も発現させ、さらに免疫抑制阻害剤を含むことによって、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子によるがん抑制効果を発揮するだけでなく、ＩＬ－７、ＣＣＬ１９及び免疫抑制阻害剤の組み合わせによりがん微小環境における免疫抑制性を低減させ、さらに内因性の細胞傷害性Ｔ細胞等もがん細胞周辺に誘導し活性化する効果が得られると考えられる。このため、本開示に係る組み合わせ医薬Ａによれば、単に本開示に係る免疫応答性細胞Ａを投与し免疫抑制阻害剤は投与しない場合、あるいはがん抗原を特異的に認識する細胞表面分子を発現するがＩＬ－７及びＣＣＬ１９は発現しない免疫応答性細胞と免疫抑制阻害剤とを共投与した場合では達成できないような向上したがん治療効果をもたらすことができる。
がん治療効果は、例えば哺乳動物、例えばヒトである対象における腫瘍細胞の数の減少、腫瘍のサイズの減少、腫瘍の消滅、腫瘍負荷の減少等により評価することができる。
免疫抑制阻害剤は、がん周囲の免疫抑制性の微小環境における免疫応答性細胞一般の働きを活性化するものであるため、本開示に係る免疫応答性細胞Ａだけでなく、内因性の免疫応答性細胞のがん細胞攻撃活性を向上させるものである。このため、免疫抑制阻害剤が例えば特定の分子を標的とする免疫チェックポイント阻害剤であったとしても、本開示に係る免疫応答性細胞Ａが当該標的の分子を細胞表面に発現している必要は必ずしも無く、標的の分子を発現していても発現していなくてもよい。
本開示において、用語「抗体」は、完全な抗体分子のみならず、抗原への結合能を保持する抗体分子の断片をも指しうる。そのような抗体断片も当技術分野において公知であり、インビトロ及びインビボの両方で一般的に用いられている。したがって、本明細書中で用いる場合、用語「抗体」は、完全な免疫グロブリン分子のみならず、公知の抗体機能断片であるＦ（ａｂ’）２及びＦａｂをも包含する概念を指す。本開示において抗体は、完全な天然抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、融合ポリペプチド、及び非従来型の抗体をも包含する。
本開示において、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、ＶＨ：：ＶＬヘテロダイマーを形成するよう共有結合している免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）は、直接結合しているか、又は、ＶＨのＮ末端とＶＬのＣ末端とが、若しくはＶＨのＣ末端とＶＬのＮ末端とがペプチドリンカーによって結合している。ペプチドリンカーの長さは、例えば、１０アミノ酸、１５アミノ酸、２０アミノ酸、又は２５アミノ酸である。ペプチドリンカーは、通常、柔軟性に寄与するグリシン、及び、可溶性に寄与するセリン若しくはスレオニンに富んでいる。定常領域を除去し、かつペプチドリンカーを導入しているにもかかわらず、ｓｃＦｖタンパク質は、元となる免疫グロブリンが有している抗原への結合特異性を維持している。Ｈｕｓｔｏｎら(Proc.Nat.Acad.Sci.USA,85:5879-5883, 1988)により記載されているように、ｓｃＦｖは、ＶＨコード配列及びＶＬコード配列を含む核酸から発現され得る。ｓｃＦｖについては、米国特許第５，０９１，５１３号、第５，１３２，４０５号、及び第４，９５６，７７８号；並びに米国特許公開第２００５０１９６７５４号及び２００５０１９６７５４号も参照することができる。
免疫チェックポイント阻害剤としての抗体は、所定の抗原結合性を有していればＩｇＧモノクローナルであっても、Ｆａｂ断片であっても、ｓｃＦｖであっても、それ以外の抗体又は抗体断片であってもよい。ｓｃＦｖは、例えば、マウスハイブリドーマクローンを作製し、次に完全ＩｇＧ（又はＩｇＭ）をｓｃＦｖに変換する方法、免疫されたファージディスプレイｓｃＦｖを作製し、次いでその抗原を用いてライブラリーをスクリーニングする方法、抗原を使用して既製のｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーをスクリーニングしてｓｃＦｖを直接得る方法等により得ることができる。
ヒト以外の動物（例えばマウス）で得た抗体は、ヒトに投与した場合に免疫応答を引き起こす可能性があるため、抗体の不変部の遺伝子をヒト抗体遺伝子に組み換えて作製したキメラ抗体、相補性決定領域（ＣＤＲ）以外の部分をヒト抗体遺伝子に組み換えて作製したヒト化抗体に改変して用いてもよい。また、マウス等に抗体を産生させるのではなく、ファージディスプレイ、又はヒト抗体を産生する遺伝子改変マウスを用いて、完全ヒト化抗体を得てもよい。
＜投与用組成物＞
本開示に係る組み合わせ医薬Ａにおいて、本開示に係る免疫応答性細胞Ａを含む投与用組成物（以下、第１の投与用組成物とも称する）は、さらに薬学的に許容される添加剤を含有していてもよく、前記添加剤としては、生理食塩水、緩衝生理食塩水、細胞培養培地、デキストロース、注射用水、グリセロール、エタノール及びこれらの組合せ、安定剤、可溶化剤、界面活性剤、緩衝剤、防腐剤、等張化剤、充填剤、並びに潤滑剤を挙げることができる。
本開示に係る組み合わせ医薬Ａにおいて、免疫抑制阻害剤を含む投与用組成物（以下、第２の投与用組成物とも称する）は、さらに薬学的に許容される添加剤を含有していてもよく、前記添加剤としては、生理食塩水、緩衝生理食塩水、細胞培養培地、デキストロース、注射用水、グリセロール、エタノール及びこれらの組合せ、安定剤、可溶化剤、界面活性剤、緩衝剤、防腐剤、等張化剤、充填剤、並びに潤滑剤を挙げることができる。
なお、第２の投与用組成物は、第１の投与用組成物と同一の組成物であってもよく、この場合は１つの投与用組成物が本開示に係る免疫応答性細胞Ａと免疫抑制阻害剤の両方を含むことになる。
第２の投与用組成物が第１の投与用組成物と別個の組成物である場合は、後述のとおり、第１の投与用組成物と第２の投与用組成物は一緒に投与してもよいし、別々のタイミング（時点）で投与してもよい。つまり、本開示に係る免疫応答性細胞Ａと、免疫抑制阻害剤とは、一緒に投与されても、異なる時点で別々に投与されてもよい。
第１の投与用組成物に含まれる本開示に係る免疫応答性細胞Ａの量は、がんの種類、位置、重症度、治療を受ける対象の年齢、体重及び状態等に応じて適宜調整できるが、一回の投与当たり例えば１×１０４～１×１０１１個、より具体的には１×１０５～１×１０１０個、より具体的には１×１０６～１×１０９個を投与してもよい。また、本開示に係る免疫応答性細胞Ａの量は、一回の投与当たり１×１０６個未満、例えば１×１０５～５×１０５個、より具体的には１．５×１０５～４×１０５個と少量であってもよい。
上述のとおり、本開示に係る免疫応答性細胞Ａを単独で用いた場合、及び免疫抑制阻害剤を単独で用いた場合には治療困難ながん治療の場合でも、本開示に係る組み合わせ医薬Ａを用いれば治療可能となりうる。このため、第１の投与用組成物に含まれる本開示に係る免疫応答性細胞Ａの量は、本開示に係る免疫応答性細胞Ａを単独で同じ量（同じ細胞数）用いた場合には抗がん効果を奏さないほど少量であってもよい。免疫抑制阻害剤との相乗効果により、抗がん効果を奏すことができる量であれば、免疫応答性細胞Ａの量の下限値は特に制限されない。
第１の投与用組成物は、１日４回、１日３回、１日２回、１日１回、１日おき、２日おき、３日おき、４日おき、５日おき、週１回、７日おき、８日おき、９日おき、週２回、月１回又は月２回の頻度で投与してもよい。また、投与回数は総計で例えば１回～１０回、すなわち、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回又は１０回としてもよいが、１０回を超える回数投与しても構わない。
第２の投与用組成物に含まれる免疫抑制阻害剤の量は、がんの種類、位置、重症度、治療を受ける対象の年齢、体重及び状態等に応じて適宜調整できるが、一回の投与当たりの免疫抑制阻害剤の用量は、例えば、０．１～５００ｍｇ／ｋｇ、より具体的には０．５～２５０ｍｇ／ｋｇ、より具体的には１～１００ｍｇ／ｋｇとすることができる。
第２の投与用組成物は、１日４回、１日３回、１日２回、１日１回、１日おき、２日おき、３日おき、４日おき、５日おき、週１回、７日おき、８日おき、９日おき、週２回、月１回又は月２回の頻度で投与してもよい。また、投与回数は総計で例えば１回～３０回、すなわち、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、又は１１回～３０回としてもよいが、３０回を超える回数投与しても構わない。
第１の投与用組成物を投与するタイミングと、第２の投与用組成物を投与するタイミングとの関係は特に限定されず、第１の投与用組成物の投与を先に開始してもよいし、第２の投与用組成物の投与を先に開始してもよいし、あるいは第１の投与用組成物と第２の投与用組成物とは同時に投与を開始してもよい。それぞれの投与用組成物の投与回数、投与頻度の間の関係についても特に限定はされない。
第１の投与用組成物と第２の投与用組成物とは同一の組成物であってもよく、この場合は、本開示に係る免疫応答性細胞Ａと免疫抑制阻害剤の両方を含む医薬組成物（合剤）が提供される。本開示に係る組み合わせ医薬Ａにおける第１の投与用組成物と第２の投与用組成物とが異なる組成物である場合、第１の投与用組成物と第２の投与用組成物とは同時に投与されてもよく、別々のタイミングで（つまり間隔を空けて）投与されてもよい。ただし、本開示に係る免疫応答性細胞Ａと免疫抑制阻害剤とによる相乗効果を効果的に得る観点からは、第１の投与用組成物を投与するタイミングと第２の投与用組成物を投与するタイミングとの間の間隔（一方の投与用組成物を投与するタイミングと、それと最も時間的に近接しているもう一方の投与用組成物を投与するタイミングとの間の間隔）は、３ヶ月以内であってもよく、２ヶ月以内であってもよく、１ヶ月以内であってもよく、２週間以内であってもよい。前記間隔は、１週間以内であってもよく、３日以内であってもよいが、後述の実施例で示すように本開示に係る免疫応答性細胞Ａは生体内で長期間維持されているため、前記間隔を極端に短くする必要は無い。
このように本開示に係る組み合わせ医薬Ａにおいては、本開示に係る免疫応答性細胞Ａと免疫抑制阻害剤とは独立したタイミング（例えば異なるタイミング）で投与することができるものである。また、本開示において「共投与」及び「併用」の用語は、複数の剤が同一の組成物に含有されて投与される場合、複数の剤が別々の組成物に含有されるが同時に投与される場合、複数の剤が別々の組成物に含有され別々の時点で投与される場合のいずれをも包含する意味で用いられる。
上記のとおり、本開示に係る組み合わせ医薬Ａは、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子を発現する免疫応答性細胞、分泌されたＩＬ－７及びＣＣＬ１９、並びに免疫抑制阻害剤からなる因子の組み合わせによる相乗的な効果により、驚くべきほどに向上したがん治療効果を奏する。
第１の投与用組成物は、当業者に既知の方法を用いて、がんの治療を必要とする対象に投与することができ、例えば、局所注入（カテーテル投与を含む）、全身注入、静脈内注入又は非経口投与（例えば経皮投与、経粘膜投与、より具体的には点鼻、点眼、舌下、坐薬、パッチ等）によって投与することができる。第１の投与用組成物は、取り扱いの観点から、単位投与量の注入可能な形態（溶液、懸濁液、乳濁液）に製剤化されていてもよい。投与方法のより具体的な例としては、静脈内、腫瘍内、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、動脈内、髄内、心臓内、関節内、滑液嚢内、頭蓋内、髄腔内、及びくも膜下（髄液）への注射を挙げることができる。
第２の投与用組成物は、当業者に既知の方法を用いて、がんの治療を必要とする対象に投与することができ、例えば、経口投与、局所注入（カテーテル投与を含む）、全身注入、静脈内注入又は非経口投与（例えば経皮投与、経粘膜投与、より具体的には点鼻、点眼、舌下、坐薬、パッチ等）によって投与することができる。第２の投与用組成物は、取り扱いの観点から、単位投与量の注入可能な形態（溶液、懸濁液、乳濁液）に製剤化されていてもよい。投与方法のより具体的な例としては、静脈内、腫瘍内、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、動脈内、髄内、心臓内、関節内、滑液嚢内、頭蓋内、髄腔内、及びくも膜下（髄液）への注射を挙げることができる。
本開示に係る免疫応答性細胞Ａは、元となる免疫応答性細胞又はその前駆体細胞を治療対象の患者から得て、本開示に係る免疫応答性細胞Ａとするために必要な遺伝子の導入後に、同じ患者に投与してもよく（自家投与）、又は別の患者に投与してもよい（他家投与）。あるいは、元となる免疫応答性細胞又はその前駆体細胞は、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞等の多能性幹細胞又は造血幹細胞などの体性幹細胞から作製してもよい。
第１の投与用組成物及び第２の投与用組成物は、例えば、所定のｐＨに緩衝化されていてもよい無菌の液体調製物、例えば、等張水溶液、懸濁液、乳濁液、分散物又は粘性組成物として投与することができる。前記液体調製物は、注射用の液体調製物であってもよい。また、特定の組織との接触時間を長くするために、前記液体調製物を適切な粘度範囲内の粘度を有する粘性組成物の形態としてもよい。液体調製物は、例えば、水、生理食塩水、リン酸塩緩衝化生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液状ポリエチレングリコールなど）及びそれらの混合物からなる溶媒又は分散媒を含んでいてもよい。
前記液体調製物は、本開示に係る免疫応答性細胞Ａ及び／又は免疫抑制阻害剤を、その他の成分の様々な量とともに、適当量の適切な溶媒に配合することによって調製することができる。前記液体調製物は、好適な担体、希釈剤、又は賦形剤を含んでいてもよい。前記液体調製物はまた、凍結乾燥されていてもよい。液体調製物は、所望の投与経路に依存して、様々な補助物質をさらに含んでいてもよく、補助物質の例としては、湿潤剤、分散剤又は乳化剤（例えば、メチルセルロース）、ｐＨ緩衝化剤、ゲル化剤又は粘度増強添加剤、保存剤、矯味矯臭剤、着色剤などが挙げられる。液体調製物中が含みうる成分については、“ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥ”，１７版、１９８５の記載を参照することもできる。
また、液体調製物は、液体調製物の安定性及び無菌性を高める様々な添加剤をさらに含んでいてもよく、その例としては、抗菌性保存剤、酸化防止剤、キレート剤、及び緩衝剤などが挙げられる。微生物の作用を防止するために、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などを使用することができる。液体調製物に使用するビヒクル、希釈剤又は添加剤は、そこに含まれる本開示に係る免疫応答性細胞Ａ及び／又は免疫抑制阻害剤との適合性を有していなければならない。
液体調製物は血液と等張性であってもよい。等張性は、塩化ナトリウム、又は他の薬学的に許容され得る浸透圧調節物質（例えば、デキストロース、ホウ酸、酒石酸ナトリウム、プロピレングリコール、あるいは、他の無機溶質又は有機溶質など）を液体調製物に含有させることで達成することができる。
本開示に係る組み合わせ医薬Ａは、本開示に係る免疫応答性細胞Ａ及び免疫抑制阻害剤に加えて、さらに他の抗がん剤を含んでいてもよい。他の抗がん剤の例としては、ベンダムスチン、イオスファミド、ダカルバジン等のアルキル化薬、ペントスタチン、フルダラビン、クラドリビン、メソトレキセート、５－フルオロウラシル、６－メルカプトプリン、エノシタビン等の代謝拮抗薬、リツキシマブ、セツキシマブ、トラスツズマブ等の分子標的薬、イマチニブ、ゲフェチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、ダサチニブ、スニチニブ、トラメチニブ等のキナーゼ阻害剤、ボルテゾミブ等のプロテアソーム阻害剤、シクロスポリン、タクロリムス等のカルシニューリン阻害薬、イダルビジン、ドキソルビシンマイトマイシンＣ等の抗がん性抗生物質、イリノテカン、エトポシド等の植物アルカロイド、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン等のプラチナ製剤、タモキシフェン、ビカルダミド等のホルモン療法薬、インターフェロン等の免疫制御薬を挙げることができる。他の抗がん剤は、例えば、アルキル化薬及び代謝拮抗薬のうちの少なくとも１種を含んでいてもよい。
＜本開示に係る組み合わせ医薬Ａを用いたがんの治療＞
本開示に係る組み合わせ医薬Ａをがんの治療に用いる場合、治療の対象は例えば任意の哺乳動物でよいが、例えば霊長類の動物であり、より具体的にはヒトであってもよい。治療対象は、愛玩動物又は家畜であってもよく、その例としては、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギなどが挙げられる。
治療の対象となるがんは、固形がんでも血液がんでもよく、腺がん、扁平上皮がん、腺扁平上皮がん、未分化がん、大細胞がん、小細胞がん、皮膚がん、乳がん、前立腺がん、膀胱がん、膣がん、子宮頸部がん、子宮がん、肝臓がん、腎臓がん、膵臓がん、脾臓がん、肺がん、気管がん、気管支がん、結腸がん、小腸がん、胃がん、食道がん、胆嚢がん、精巣がん、卵巣がん等のがんや、骨組織、軟骨組織、脂肪組織、筋組織、血管組織及び造血組織のがんのほか、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性血管内皮腫、悪性シュワン腫、骨肉腫、軟部組織肉腫等の肉腫や、肝芽腫、髄芽腫、腎芽腫、神経芽腫、膵芽腫、胸膜肺芽腫、網膜芽腫等の芽腫や、胚細胞腫瘍や、リンパ腫や、白血病を挙げることができる。
本開示に係る組み合わせ医薬Ａによればがん微小環境における免疫抑制性を軽減することが可能であるため、治療対象となるがんは血球系のがんに限定されず、固形がんに対しても治療効果を奏する。このため、従来の方法では治療が難しかった固形がんに対しても高い有効性を発揮できる。
本開示に係る組み合わせ医薬Ａは、がんの確定診断がされる前であっても、対象内におけるがん細胞の存在が疑われる状況においては、対象に予防的に投与してもよい。本開示においては、このような使用形態も、がんの治療のための使用の概念に包含される。
＜対象におけるがんの治療方法＞
本開示に係る一態様によれば、
（ａ）がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、ＩＬ－７、及びＣＣＬ１９を発現する免疫応答性細胞、並びに
（ｂ）免疫抑制阻害剤
を組み合わせて対象に投与することを含む、対象におけるがんを治療する方法（以下、本開示に係るがんの治療方法Ａとも称する）が提供される。
ここで、本開示に係るがんの治療方法Ａにおける免疫応答性細胞は本開示に係る免疫応答性細胞Ａであり、その詳しい構成及び例などについては本開示に係る免疫応答性細胞Ａについての上記説明がそのまま当てはまる。また、本開示に係るがんの治療方法Ａにおける免疫抑制阻害剤の詳しい構成及び例についても、本開示に係る組み合わせ医薬Ａにおける免疫抑制阻害剤についての上記説明がそのまま当てはまる。
これに加え、本開示に係るがんの治療方法Ａにおける対象、がんの種類、用量、投与スケジュール等の、治療方法の詳細については、前述の本開示に係る組み合わせ医薬Ａの説明がそのまま当てはまる。例えば、（ａ）の免疫応答性細胞と、（ｂ）の免疫抑制阻害剤とは同時に投与されてもよいし、別々の時点で投与されてもよい。また、（ａ）の免疫応答性細胞と、（ｂ）の免疫抑制阻害剤とは、どちらも治療有効量で投与することができる。
本開示に係るがんの治療方法Ａは、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、ＩＬ－７及びＣＣＬ１９を発現する免疫応答性細胞、並びに免疫抑制阻害剤からなる因子の組み合わせによる相乗的な効果により、驚くべきほどに向上したがん治療効果を奏する。
さらに、本開示によれば、がんを治療するための医薬の製造における、（ａ）がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、ＩＬ－７及びＣＣＬ１９を発現する免疫応答性細胞、並びに（ｂ）免疫抑制阻害剤の使用が提供される。この使用においても、免疫応答性細胞、免疫抑制阻害剤、投与用組成物、がんの治療等の詳細については、前述の本開示に係る組み合わせ医薬Ａの説明がそのまま当てはまる。
加えて、本開示によれば、免疫抑制阻害剤と併用されて対象におけるがんを治療するために用いられる、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、ＩＬ－７及びＣＣＬ１９を発現する免疫応答性細胞を含む医薬も提供される。本開示に係る免疫応答性細胞Ａを含む医薬は、免疫抑制阻害剤と併用されることで、相乗的な効果を生じ、驚くべきほどに向上したがん治療効果を奏する。免疫応答性細胞、免疫抑制阻害剤、投与用組成物、がんの治療等の詳細については、前述の本開示に係る組み合わせ医薬Ａの説明がそのまま当てはまる。さらに、免疫抑制阻害剤と併用されて対象におけるがんを治療するために用いられる、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、ＩＬ－７及びＣＣＬ１９を発現する免疫応答性細胞も提供される。
さらに、本開示によれば、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、ＩＬ－７及びＣＣＬ１９を発現する免疫応答性細胞と併用されて対象におけるがんを治療するために用いられる、免疫抑制阻害剤を含む医薬も提供される。免疫抑制阻害剤を含む医薬は、本開示に係る免疫応答性細胞Ａと併用されることで、相乗的な効果を生じ、驚くべきほどに向上したがん治療効果を奏する。免疫応答性細胞、免疫抑制阻害剤、投与用組成物、がんの治療等の詳細については、前述の本開示に係る組み合わせ医薬Ａの説明がそのまま当てはまる。さらに、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、ＩＬ－７及びＣＣＬ１９を発現する免疫応答性細胞と併用されて対象におけるがんを治療するために用いられる、免疫抑制阻害剤も提供される。
本開示によれば、免疫抑制阻害剤と併用されることが表示された容器に収容され、かつ、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、ＩＬ－７及びＣＣＬ１９を発現する免疫応答性細胞を含む医薬も提供される。免疫応答性細胞、免疫抑制阻害剤等の詳細については、前述の本開示に係る組み合わせ医薬Ａの説明がそのまま当てはまる。また、医薬の構成の詳細については、前述の第１の投与用組成物の説明がそのまま当てはまる。免疫抑制阻害剤と併用されることが表示された容器は、使用方法の表示が付されたバイアル、静注バッグ、細胞保存用バッグ、点滴用バッグ等の容器であってもよいし、エッペンドルフチューブのような容器であってもよい。このような容器中に、本開示に係る免疫応答性細胞Ａを含む医薬は、例えば前述の第１の投与用組成物の説明に記載した状態で収容される。免疫抑制阻害剤と併用されることの表示は、容器のどの面に付されていてもよいが、視認性を考慮して容器の外面に付されていてもよい。また、表示は容器そのものにではなく、１つ又は複数の容器をさらに収納する箱等のケースに付されていてもよい。また、免疫抑制阻害剤と併用されることの表示は、免疫抑制阻害剤と併用されることを明示的に指示している表示に限られず、免疫抑制阻害剤との併用の可能性について言及している任意の表示であってもよい。
本開示によれば、免疫抑制阻害剤と併用されることが記載された添付文書と、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、ＩＬ－７及びＣＣＬ１９を発現する免疫応答性細胞を含む医薬を収容した容器と、を含む製品も提供される。免疫応答性細胞、免疫抑制阻害剤等の詳細については、前述の本開示に係る組み合わせ医薬Ａの説明がそのまま当てはまる。また、医薬の構成の詳細については、前述の第１の投与用組成物の説明がそのまま当てはまる。本開示に係る免疫応答性細胞Ａを収容した容器は、使用方法の表示が付されたバイアル、静注バッグ、細胞保存用バッグ、点滴用バッグ等の容器であってもよいし、エッペンドルフチューブのような容器であってもよい。このような容器中に、本開示に係る免疫応答性細胞Ａを含む医薬は、例えば前述の第１の投与用組成物の説明に記載した状態で収容される。また、添付文書中における免疫抑制阻害剤と併用されることの記載は、免疫抑制阻害剤と併用されることを明示的に指示している記載に限られず、免疫抑制阻害剤との併用の可能性について言及している任意の記載であってもよい。
以上説明したとおり、本開示に係る一態様によれば、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、ＩＬ－７及びＣＣＬ１９を発現する免疫応答性細胞、並びに免疫抑制阻害剤の組み合わせによる相乗的な効果により、驚くべきほどに向上したがん治療効果を得ることができる。
本開示に係る実施形態には以下のものが含まれる。
＜１＞ （ａ）がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、インターロイキン７及びＣＣＬ１９を発現する免疫応答性細胞、並びに
（ｂ）免疫抑制阻害剤
を含む、対象におけるがんを治療するための組み合わせ医薬。
＜２＞ 前記免疫応答性細胞と、前記免疫抑制阻害剤とが、異なる時点で別々に投与される、＜１＞に記載の組み合わせ医薬。
＜３＞ インターロイキン７をコードする遺伝子及びＣＣＬ１９をコードする遺伝子が外来性であり、双方が前記免疫応答性細胞のゲノムに組み込まれているか、又は前記免疫応答性細胞中に存在する１個又は複数個のベクターに一緒に若しくは別個にコードされている、＜１＞又は＜２＞に記載の組み合わせ医薬。
＜４＞ 前記がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である、＜１＞～＜３＞のうちいずれか１つに記載の組み合わせ医薬。
＜５＞ 前記免疫抑制阻害剤が、ＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＰＤ－Ｌ２阻害剤、ＣＴＬＡ－４阻害剤、ＢＴＬＡ（B- and T-lymphocyte attenuator）阻害剤、ＴＩＭ－３（T-cell immunoglobulin and mucin domain 3）阻害剤、ＴＩＧＩＴ（T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains）阻害剤、ＬＡＧ－３（Lymphocyte Activation Gene-3）阻害剤、及びＳｉｇｌｅｃ－１５阻害剤からなる群から選択される１種以上を含む、＜１＞～＜４＞のうちいずれか１つに記載の組み合わせ医薬。
＜６＞ 前記免疫抑制阻害剤が抗体である、＜１＞～＜５＞のうちいずれか１つに記載の組み合わせ医薬。
＜７＞ 前記抗体が、ＩｇＧモノクローナル抗体又は抗体断片である、＜６＞に記載の組み合わせ医薬。
＜８＞ 前記がんが固形がんである、＜１＞～＜７＞のうちいずれか１つに記載の組み合わせ医薬。
＜９＞ 前記免疫応答性細胞が、前記対象自身に由来する免疫応答性細胞である、＜１＞～＜８＞のうちいずれか１つに記載の組み合わせ医薬。
＜１０＞ 前記免疫応答性細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、及びＢ細胞等のリンパ球系細胞、単球、マクロファージ、及び樹状細胞等の抗原提示細胞、好中球、好酸球、好塩基球、並びに肥満細胞からなる群から選択される、＜１＞～＜９＞のうちいずれか１つに記載の組み合わせ医薬。
＜１１＞ 免疫抑制阻害剤と併用されて対象におけるがんを治療するために用いられる、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、インターロイキン７及びＣＣＬ１９を発現する免疫応答性細胞を含む医薬。
＜１２＞ がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、インターロイキン７、及びＣＣＬ１９を発現する免疫応答性細胞と併用されて対象におけるがんを治療するために用いられる、免疫抑制阻害剤を含む医薬。
＜１３＞ 前記免疫抑制阻害剤と前記免疫応答性細胞とが異なる時点で別々に投与される形態にて用いるための、＜１１＞又は＜１２＞に記載の医薬。
＜１４＞ 免疫抑制阻害剤と併用されることが表示された容器に収容され、かつ、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、インターロイキン７及びＣＣＬ１９を発現する免疫応答性細胞を含む医薬。
＜１５＞ 免疫抑制阻害剤と併用されることが記載された添付文書と、
がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、インターロイキン７及びＣＣＬ１９を発現する免疫応答性細胞を含む医薬を収容した容器と、
を含む製品。
＜１６＞ （ａ）がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、インターロイキン７及びＣＣＬ１９を発現する免疫応答性細胞、並びに
（ｂ）免疫抑制阻害剤
を含む、対象におけるがんを治療するための医薬組成物。
＜１７＞ 前記がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である、＜１６＞に記載の医薬組成物。
＜１８＞ （ａ）がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、ＩＬ－７及びＣＣＬ１９を発現する免疫応答性細胞、並びに
（ｂ）免疫抑制阻害剤
を組み合わせて対象に投与することを含む、対象におけるがんを治療する方法。
＜１９＞ がんを治療するための医薬の製造における、（ａ）がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、ＩＬ－７及びＣＣＬ１９を発現する免疫応答性細胞、並びに（ｂ）免疫抑制阻害剤の使用が提供される。
以下、本開示に係るさらなる態様について説明する。
本開示の一態様によれば、
（ａ）インターロイキン７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸を協同して含む１種類又は複数種類の細胞若しくは核酸送達媒体又はそれらの組み合わせ、並びに
（ｂ）免疫抑制阻害剤
を含む、対象におけるがんを治療するための組み合わせ医薬（以下、「本開示に係る組み合わせ医薬Ｂ」とも称する）が提供される。
ここで、組み合わせ医薬Ｂにおけるインターロイキン７、ＣＣＬ１９、インターロイキン７をコードする核酸、ＣＣＬ１９をコードする核酸、及び免疫抑制阻害剤の定義、例、アミノ酸配列、塩基配列、好ましい実施形態等の詳細は、本開示に係る免疫応答性細胞Ａ及び本開示に係る組み合わせ医薬Ａにおける、インターロイキン７、ＣＣＬ１９、インターロイキン７をコードする遺伝子、ＣＣＬ１９をコードする遺伝子、及び免疫抑制阻害剤の定義、例、アミノ酸配列、塩基配列、好ましい実施形態等の詳細と、それぞれ同様である。
また、本開示において「協同して含む」とは、複数の要素（例えば、複数の細胞、複数の核酸送達媒体、又は１つ以上の細胞及び１つ以上の核酸送達媒体）が存在する場合に、含まれる対象として示された物質（例えば特定のポリペプチドをコードする核酸）が、前記複数の要素のうち少なくとも１つには含まれていることを意味し、前記複数の要素の全てが当該物質を含んでいることは必要無い。つまり、「協同して含む」とは、「全体として含む」と表現することもできる。また、「協同して含む」の意味する範囲には、含まれる対象として示された複数の物質の全てが単一の細胞又は核酸送達媒体に含まれる場合も包含され、このような構成も好ましい構成の一つである。
このため、本開示に係る組み合わせ医薬Ｂが、細胞Ｉ及び細胞ＩＩを含む場合、細胞Ｉがインターロイキン７をコードする核酸を含んでＣＣＬ１９をコードする核酸を含まず、細胞ＩＩがＣＣＬ１９をコードする核酸を含んでインターロイキン７をコードする核酸を含まない構成であってもよい。同様に、本開示に係る組み合わせ医薬Ｂが、核酸送達媒体Ｉ及び核酸送達媒体ＩＩを含む場合、核酸送達媒体Ｉがインターロイキン７をコードする核酸を含んでＣＣＬ１９をコードする核酸を含まず、核酸送達媒体ＩＩがＣＣＬ１９をコードする核酸を含んでインターロイキン７をコードする核酸を含まない構成であってもよい。
あるいは、本開示に係る組み合わせ医薬Ｂは、インターロイキン７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸の両方を含む単一の細胞又は核酸送達媒体を含んでいてもよい。
さらに、「インターロイキン７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸を協同して含む１種類又は複数種類の細胞若しくは核酸送達媒体又はそれらの組み合わせ」における「それらの組み合わせ」とは、１種類又は複数種類の細胞と、１種類又は複数種類の核酸送達媒体との組み合わせであって、インターロイキン７をコードする核酸がそれら１種類又は複数種類の細胞及び１種類又は複数種類の核酸送達媒体のうち少なくとも１つに含まれ、ＣＣＬ１９をコードする核酸がそれら１種類又は複数種類の細胞及び１種類又は複数種類の核酸送達媒体のうち少なくとも１つに含まれている組み合わせを表す。
さらに、本開示においてポリペプチドとは、アミノ酸残基がペプチド結合で連結したポリマー一般を示し、いわゆるタンパク質もその例に含まれる。ポリペプチドのアミノ酸残基数は１０以上であってもよく、２０以上であってもよく、３０以上であってもよく、４０以上であってもよく、５０以上であってもよく、７０以上であってもよく、１００以上であってもよい。アミノ酸残基数の上限値は特に制限されないが、アミノ酸残基数は１００００以下であってもよく、５０００以下であってもよく、２０００以下であってもよく、１０００以下であってもよく、５００以下であってもよく、２００以下であってもよく、１００以下であってもよく、７０以下であってもよく、５０以下であってもよく、４０以下であってもよく、３０以下であってもよく、２０以下であってもよい。上記の下限値と上限値とは、矛盾の生じない限りにおいて自由に組み合わせて範囲を形成することができる。
本開示に係る組み合わせ医薬Ｂにおいて、細胞とは、含有対象として言及された核酸（例えば、インターロイキン７をコードする核酸及び／又はＣＣＬ１９をコードする核酸）を発現することが可能な細胞である限りは特に限定されない。細胞は、体内に導入された場合に、がん細胞周辺に集積あるいは浸潤する細胞であることが好ましい。含有対象として言及された核酸が一つの細胞内に２つ以上存在する場合、該細胞内において、それらの核酸は、それぞれ独立に、ゲノムに組み込まれた状態又はプラスミドに担持された状態で含まれていてもよく、あるいは互いに連結されてゲノムに組み込まれた状態又はプラスミドに担持された状態で含まれていてもよい。前記細胞の例としては、免疫応答性細胞、嫌気性菌の細胞、及び間葉系幹細胞（ＭＳＣ）が挙げられる。
本開示に係る組み合わせ医薬Ｂにおいて、核酸送達媒体とは、含有対象として言及された核酸（例えば、インターロイキン７をコードする核酸及び／又はＣＣＬ１９をコードする核酸）を細胞に送達して発現させることが可能な核酸送達媒体である限りは特に限定されない。該細胞は、ヒトの細胞であることが好ましく、ヒトの体内の細胞であることがより好ましく、ヒト体内のがん細胞又は免疫応答性細胞であることがさらに好ましい。つまり、核酸送達媒体は、体内に導入された場合に、がん細胞内又は免疫応答性細胞内に核酸を送達する核酸送達媒体であることが好ましい。
前記核酸送達媒体の例としては、ウイルス、リポソーム及びナノ粒子が挙げられる。核酸送達媒体として当業界で知られているものを、常法に従って用いればよい。核酸送達媒体として、ウイルスベクターを用いることも可能である。
含有対象として言及された核酸が２つ以上、一つの核酸送達媒体内に存在する場合、該核酸送達媒体内において、それらの核酸は、それぞれ独立した状態で含まれていてもよく、あるいは互いに連結された状態で含まれていてもよい。
がん細胞は免疫応答性細胞ががん細胞を攻撃したり、がん細胞を攻撃する指示を発したりすることを抑制する免疫抑制機構を有しているため、がん罹患者自身の免疫によるがん細胞への攻撃が抑制されている。本開示に係る組み合わせ医薬Ｂの構成要素の１つである免疫抑制阻害剤は、がん細胞による免疫抑制機構を阻害することで、がん罹患者の免疫系ががん細胞を攻撃することをより容易にすると考えられる。
これらに加えて、インターロイキン７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸を協同して含む１種類又は複数種類の細胞若しくは核酸送達媒体又はそれらの組み合わせが、がん組織の近傍でＩＬ－７を発現し、又は細胞（典型的には体内の細胞）に核酸送達してＩＬ－７を発現させ、さらにＣＣＬ１９を発現し、又は細胞（典型的には体内の細胞）に核酸送達してＣＣＬ１９を発現させることにより、がん罹患者の内因性の免疫応答性細胞ががん細胞の周囲に集積するため、がん細胞をより効果的に攻撃することが可能になると考えられる。この点から、核酸送達の対象となる細胞は、体内のがん細胞であることが好ましい。
本開示に係る組み合わせ医薬Ｂは、インターロイキン７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸を協同して含む１種類又は複数種類の細胞若しくは核酸送達媒体又はそれらの組み合わせと、免疫抑制阻害剤とを含むことによって、発現したＩＬ－７及びＣＣＬ１９、並びに免疫抑制阻害剤からなる因子の組み合わせによる相乗的な効果を発揮し、このために大きく改善したがん治療効果を奏すると考えられる。この相乗的な効果は、それぞれの因子の個別の効果からは予測することができないほど優れた効果である。
ある実施形態では、組み合わせ医薬Ｂにおける前記１種類又は複数種類の細胞又は核酸送達媒体は、免役応答性細胞等、がん細胞以外の細胞に核酸を送達する。かかる実施形態では、本開示に係る組み合わせ医薬Ｂにおける前記１種類又は複数種類の細胞若しくは核酸送達媒体又はそれらの組み合わせは、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸をさらに含んでいてもよい。この場合、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸を含む細胞又は核酸送達媒体は、インターロイキン７をコードする核酸を含んでいてもいなくてもよく、ＣＣＬ１９をコードする核酸を含んでいてもいなくてもよい。つまり、本開示に係る組み合わせ医薬Ｂにおける前記１種類又は複数種類の細胞若しくは核酸送達媒体又はそれらの組み合わせが、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸をさらに含む場合は、前記１種類又は複数種類の細胞若しくは核酸送達媒体又はそれらの組み合わせは、インターロイキン７をコードする核酸、ＣＣＬ１９をコードする核酸、及びがん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸を協同して（言い換えれば全体として）含んでいればよい。
本開示に係る組み合わせ医薬Ｂにおける前記１種類又は複数種類の細胞若しくは核酸送達媒体又はそれらの組み合わせが、核酸を送達した細胞において、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をさらに発現させることにより、がん治療効果をいっそう増強しうる。例えば、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸を核酸送達媒体に含ませた場合、当該核酸送達媒体を対象に投与して対象の体内のＴ細胞に前記核酸を導入することによって、当該Ｔ細胞において細胞表面分子が発現する。
ある実施形態では、組み合わせ医薬Ｂにおける前記１種類又は複数種類の細胞又は核酸送達媒体は、がん細胞に核酸を送達するために、がん細胞を特異的に認識する分子をその表面に有する。がん細胞を特異的に認識する分子の例及び好ましい実施形態等の詳細については、がん細胞を特異的に認識する細胞表面分子の例及び好ましい実施形態等の詳細と同様である。
組み合わせ医薬Ｂにおける前記１種類又は複数種類の細胞又は核酸送達媒体が「細胞」の場合、例えば、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸を当該細胞に導入し、組み合わせ医薬Ｂの投与前に培養することによって、その表面にがん抗原を特異的に認識するｓｃＦｖ等を発現させることができる。
組み合わせ医薬Ｂにおける前記１種類又は複数種類の細胞又は核酸送達媒体が「ウイルス」の場合、例えば、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸をウイルスゲノムに組み込み、適当な細胞にトランスフェクションしてウイルスを産生・増殖させることにより、その表面にがん抗原を特異的に認識するｓｃＦｖ等を発現させることができる。ｓｃＦｖ等の抗体はウイルスのエンベロープ又はカプシドに含ませてもよく、例えば、ヘルペスウイルスを用いる場合、ヘルペスウイルスへの侵入を担うエンベロープ糖タンパク質ｇＤを本来の受容体に結合不能とした上で、該エンベロープ糖タンパク質ｇＤにがん抗原を特異的に認識するｓｃＦｖ等の抗体を挿入してもよい。
また、組み合わせ医薬Ｂにおける前記１種類又は複数種類の細胞又は核酸送達媒体がリポソームやナノ粒子などの場合は、予め、表面にがん細胞を特異的に認識する分子を、公知の方法又はそれに準ずる方法で結合させておくことができる。
ここで、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、及びがん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸の定義、例、アミノ酸配列、塩基配列、好ましい実施形態等の詳細は、本開示に係る免疫応答性細胞Ａ及び本開示に係る組み合わせ医薬Ａにおけるがん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、及びがん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする遺伝子の定義、例、アミノ酸配列、塩基配列、好ましい実施形態等の詳細と、それぞれ同様である。
がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸は、免疫応答性細胞に含まれることが好ましい。言い換えれば、本開示に係る組み合わせ医薬Ｂにおける前記１種類又は複数種類の細胞若しくは核酸送達媒体又はそれらの組み合わせは、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸を含む免疫応答性細胞を含むことが好ましい。該免疫応答性細胞は、インターロイキン７をコードする核酸を含んでいてもいなくてもよく、ＣＣＬ１９をコードする核酸を含んでいてもいなくてもよい。がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子は、がん抗原を特異的に認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、がん抗原を特異的に認識するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）等の、細胞表面に発現することによってがんに対する特異的な識別能を細胞に付与する分子であることが好ましい。
このため、ある実施形態では、本開示に係る組み合わせ医薬Ｂは、ＣＡＲ－Ｔ又はＴＣＲ－Ｔを用いた処置と併用することができるともいえる。
一つの実施形態においては、前記インターロイキン７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸を協同して含む１種類又は複数種類の細胞若しくは核酸送達媒体又はそれらの組み合わせは、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、インターロイキン７及びＣＣＬ１９を発現する免疫応答性細胞を含んでいてもよい。また、免疫抑制阻害剤は、細胞が発現した免疫抑制阻害性ポリペプチドであってもよく、本開示に係る組み合わせ医薬Ｂは、免疫抑制阻害性ポリペプチドを発現する細胞を含んでいてもよい。該細胞の例としては、インターロイキン７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸を協同して含む１種類又は複数種類の細胞若しくは核酸送達媒体又はそれらの組み合わせにおける細胞の例として後述された細胞が挙げられる。あるいは、本開示に係る組み合わせ医薬Ｂにおける免疫抑制阻害剤の代わりに、免疫抑制阻害性ポリペプチドをコードする核酸を含む核酸送達媒体を含ませることも、本開示に係る実施形態の範疇に含まれる。該核酸送達媒体は、他の核酸を含む核酸送達媒体と同じ核酸送達媒体であっても、別個の核酸送達媒体であってもよい。
このため、本開示のある実施形態によれば、前記免疫抑制阻害剤がポリペプチドであって、前記細胞若しくは核酸送達媒体又はそれらの組み合わせが、免疫抑制阻害剤ポリペプチドをコードずる核酸をさらに協同して含む。
また、本開示に係る組み合わせ医薬Ｂが、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、インターロイキン７及びＣＣＬ１９を発現する免疫応答性細胞と、免疫抑制阻害性ポリペプチドを発現する細胞とを含む場合、これらは同じ細胞であってもよく、別の細胞であってもよい。がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、インターロイキン７及びＣＣＬ１９を発現する免疫応答性細胞と、免疫抑制阻害性ポリペプチドを発現する細胞とが同じ免疫応答性細胞である場合、本開示に係る組み合わせ医薬Ｂは、該免疫応答性細胞を含むことにより、インターロイキン７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸を協同して含む１種類又は複数種類の細胞若しくは核酸送達媒体又はそれらの組み合わせ、並びに免疫抑制阻害剤を含むといえる。もちろん、免疫抑制阻害剤は、インターロイキン７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸を協同して含む１種類又は複数種類の細胞若しくは核酸送達媒体又はそれらの組み合わせとは独立した成分として、本開示に係る組み合わせ医薬Ｂに含まれていてもよい。言い換えれば、前記１種類又は複数種類の細胞若しくは核酸送達媒体又はそれらの組み合わせにより発現される物質ではなく、別個に加えられた物質として、本開示に係る組み合わせ医薬Ｂに含まれていてもよい。
上記のとおり、本開示に係る組み合わせ医薬Ｂにおける細胞若しくは核酸送達媒体又はその組み合わせは、免疫応答性細胞、ウイルス、嫌気性菌、リポソーム、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、及びナノ粒子からなる群から選択される少なくとも１つであってもよく、これらから選ばれる複数を混合して用いてもよい。
ここで、免疫応答性細胞は、免疫応答に関与し、含有の対象となる核酸（例えば、インターロイキン７をコードする核酸及び／又はＣＣＬ１９をコードする核酸）を含んで発現できる細胞であれば特に制限されない。送達対象となる核酸は、免疫応答細胞のゲノムに含まれていても、ゲノム外のベクターに担持されていてもよいが、例えば、遺伝子担持の安定性の観点からゲノム中に含まれていてもよい。前記免疫応答性細胞は、生体から採取された免疫応答性細胞であることが好ましく、例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、Ｂ細胞等のリンパ球系細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞等の抗原提示細胞、並びに好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞等の顆粒球が挙げられる。好ましい例としては、ヒト、イヌ、ネコ、ブタ、マウス等の哺乳動物から採取されたＴ細胞、さらに好ましくはヒトから採取されたＴ細胞が挙げられる。なお、生体から採取されたＴ細胞を含む細胞集団を用いる場合、該細胞集団はＴ細胞以外に他の細胞も含んでいてもよいが、細胞数基準で全細胞数のうちの５０％以上、又は６０％以上、又は７０％以上、又は８０％以上、又は９０％以上の割合でＴ細胞を含んでいてもよい。Ｔ細胞等の免疫応答性細胞は、例えば、血液、骨髄液等の体液、脾臓、胸腺、リンパ節等の組織、若しくは原発腫瘍、転移性腫瘍、がん性腹水等のがん組織に浸潤する免疫細胞から、免疫応答性細胞を含む細胞集団を採取して得ることができる。細胞集団に含まれるＴ細胞等の免疫応答性細胞の割合を高めるため、分離した細胞集団を、必要に応じて、定法による単離工程又は精製工程に供してもよい。また、免疫応答性細胞は、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞から作製された免疫応答性細胞であってもよい。免疫応答性細胞の例としてのＴ細胞の例としては、アルファ・ベータＴ細胞、ガンマ・デルタＴ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、腫瘍浸潤Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、及びＮＫＴ細胞が挙げられる。なお、免疫応答性細胞の由来と、組み合わせ医薬の投与対象とは同じ個体であっても異なる個体であってもよいが、同じ個体であることが好ましい。例えば、投与対象がヒトの場合、免疫応答性細胞は、投与対象としての患者本人から採取した自家細胞であっても、他人から採取した他家細胞であってもよい。すなわち、ドナーとレシピエントは一致しても不一致でもよいが、一致することが好ましい。
核酸送達媒体としてのウイルスは、送達対象となる核酸（例えば、インターロイキン７をコードする核酸及び／又はＣＣＬ１９をコードする核酸）を封入でき、がん細胞に感染しうるウイルスであることが好ましく、腫瘍溶解性ウイルスであることがより好ましい。上記腫瘍溶解性ウイルス（oncolytic virus）とは、正常細胞に感染してもほとんど増殖しないが、がん細胞に感染すると増殖し、がん細胞を死滅（がん細胞傷害）させる能力を有するウイルスを意味し、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、第１８巻、第２号、２０１０年２月、２３３～２３４ページに総説されている。腫瘍溶解性ウイルスは、がん細胞に感染してがん細胞を死滅させる能力を有する限り特に限定されないが、その例としては、腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、腫瘍溶解性アデノウイルス、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス、腫瘍溶解性レオウイルス、腫瘍溶解性麻疹ウイルス、腫瘍溶解性ニューカッスル病ウイルス、腫瘍溶解性牛痘ウイルス、腫瘍溶解性ムンプスウイルス、及び腫瘍溶解性コクサッキーウイルスが挙げられる。
腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、例えば、Kim MK et al. Science Translational Medicine. 2013 May 15;5(185):185ra63、Heo J, et al. Nature Medicine, 2013 (3):329-36. doi: 10.1038/nm.3089. Epub 2013 Feb 10.、国際公開第２０１２／０９４３８６号に記載のワクシニアウイルスであるが、これに限定されない。腫瘍溶解性アデノウイルスの例としては、Tedcastle A et al. Mol Ther. 2016;24:796-804, Marino N, Illingworth S, Kodialbail P, Patel A, Calderon H, Lear R, Fisher KD, Champion BR, Brown ACN. PLoS One 2017;12(5):e0177810、Freedman JD, et al. EMBO Mol Med 9:1067-1087 (2017)、Lang FF et al., Journal of Clinical Oncology (2018)、James M. et al. The Journal of Oncology, 188(6):2391-7, 2012、特許第３８６７９６８号公報及び特許第５５７４２８４号公報に記載のアデノウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。また、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスの例としては、Mazzacurati et al., Mol Ther, 2015 Jan;23(1):99-107、Hirooka Y, et al. BMC Cancer 2018, 18, 596、Nakatake R, et al. Cancer Sci. 2018 Mar, 109(3);600-610.及びAndtbacka RHI, et al. J Clin Oncol. 2015;33:2780-2788に記載の単純ヘルペスウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。腫瘍溶解性レオウイルスの例としては、Mahalingam, et al, Cancers 2018, 10, 160に記載のレオウイルスが挙げられるが、これに限定されない。腫瘍溶解性ニューカッスル病ウイルスの例としては、Journal of Virology. 2016 Jun; 90(11):5343-5352.に記載のニューカッスル病ウイルスが挙げられるが、これに限定されない。腫瘍溶解性水泡口内炎ウイルス病ウイルスの例としては、Muik A. et al. Cancer Res; 74(13); 3567-78. に記載の水泡口内炎ウイルス病ウイルスが挙げられるが、これに限定されない。腫瘍溶解性ウイルスは、遺伝子改変により付加されたタンパク質発現機能を有しているものもある。当該付加されたタンパク質発現機能により発現されるタンパク質として、送達対象となる核酸にコードされるポリペプチド（例えば、インターロイキン７及び／又はＣＣＬ１９）を発現させてもよい。
「インターロイキン７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸を協同して含む１種類又は複数種類の細胞若しくは核酸送達媒体又はそれらの組み合わせ」における細胞としての嫌気性菌は、含有の対象となる核酸（例えば、インターロイキン７をコードする核酸及び／又はＣＣＬ１９をコードする核酸）を含んで発現できる嫌気性菌の細胞であれば特に制限されない。嫌気性菌は、がん細胞に集積する能力を有する嫌気性グラム陽性菌であることが好ましく、その例としては、ビフィズス菌等のビフィドバクテリウム属菌、ラクトバシラス属菌、及びリステリア属菌が挙げられる。なお、嫌気性菌は酸素が少ない環境下で生育しやすいことから、がん細胞に集積しやすいことが知られている。嫌気性菌は、本開示に係る組み合わせ医薬Ｂの投与の対象の体内の細胞に取り込まれることも可能である。
核酸送達媒体としてのリポソームは、送達対象となる核酸（例えば、インターロイキン７をコードする核酸及び／又はＣＣＬ１９をコードする核酸）を封入でき、リン脂質二重膜から構成される脂質ナノカプセルであれば特に制限されない。かかるリポソームは、市販品であってもよく、常法によって合成されたリポソームであってもよい。リポソームは、がん細胞への集積を向上するために、ＰＥＧ修飾を受ける、あるいはレクチン若しくはタンパク質（例えば抗体）等の標的化プローブ分子を表面に有していてもよい。
「インターロイキン７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸を協同して含む１種類又は複数種類の細胞若しくは核酸送達媒体又はそれらの組み合わせ」における細胞としての間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、含有の対象となる核酸（例えば、インターロイキン７をコードする核酸及び／又はＣＣＬ１９をコードする核酸）を含んで発現できるＭＳＣであれば特に制限されない。ＭＳＣは、がん細胞に集積するＭＳＣであることが好ましい。
核酸送達媒体としてのナノ粒子は、送達対象となる核酸（例えば、インターロイキン７をコードする核酸及び／又はＣＣＬ１９をコードする核酸）をがん細胞に送達できる能力を有し、ナノメートルオーダー、好ましくは直径５～８００ｎｍの粒子体であれば特に制限されない。ナノ粒子の例としては、金ナノ粒子等の金属ナノ粒子、及びシリカナノ粒子が挙げられる。かかるナノ粒子は市販品であってもよく、常法によって合成されたナノ粒子であってもよい。ナノ粒子は、例えばEnhanced Permeability and Retention Effect（ＥＰＲ効果）により、がん細胞に到達しうる。ナノ粒子の材質に応じて、核酸はナノ粒子の表面に結合させる、ナノ粒子内に封入する等の形でナノ粒子に含ませることができる。
本開示に係る組み合わせ医薬Ｂにおいて、それぞれ細胞又は核酸送達媒体に含まれるインターロイキン７をコードする核酸、ＣＣＬ１９をコードする核酸、及び任意に含まれるがん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸は、それぞれプロモーターの下流に作動可能に連結されていることが好ましい。これらの核酸を細胞又は核酸送達媒体に含ませる操作は、常法に従って行えばよい。細胞に核酸を導入する場合には、例えば、エレクトロポレーション法（例えばCytotechnology,3,133(1990)参照）、リン酸カルシウム法（例えば特開平２－２２７０７５号公報参照）、リポフェクション法（例えばProc.Natl.Acad.Sci.U．S.A.,84,7413(1987)参照）、及びウイルス感染法から選択される方法を用いて導入を行うことができる。ウイルス感染法は、導入する核酸を含むベクターと、パッケージングプラスミドとを、ＧＰ２－２９３細胞（タカラバイオ社製）、Ｐｌａｔ－ＧＰ細胞（コスモ・バイオ社製）、ＰＧ１３細胞（ATCC CRL-10686）、又はＰＡ３１７細胞（ATCC CRL-9078）といったパッケージング細胞にトランスフェクションして組換えウイルスを作製し、かかる組換えウイルスをＴ細胞に感染させる方法（例えば国際公開第２０１７／１５９７３６号参照）であってもよい。
あるいは、導入対象となる核酸は、公知の遺伝子編集技術を用いて、適切なプロモーターの制御下で発現可能なように、細胞のゲノムに組み込まれてもよい。公知の遺伝子編集術の例としては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ（転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ）、ＣＲＩＳＰＲ（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat）－Ｃａｓシステム等のエンドヌクレアーゼを用いる技術が挙げられる。
含有対象となる核酸が細胞に含まれる場合、当該核酸は細胞のゲノムに組み込まれていても、細胞内のベクターに担持されていてもよい。含有対象となる核酸が２つ以上、同じ細胞に含まれている場合には、それらは隣接して細胞のゲノムに組み込まれていてもよいし、別個に細胞のゲノムに組み込まれていてもよいし、同じベクター中に含まれていてもよいし、別個のベクター中に別々に含まれていてもよい。また、含有対象となる核酸のうちいくつかがゲノムに含まれ、残りがベクターに含まれていてもよい。
含有対象となる核酸が核酸送達媒体に含まれる場合、当該核酸は単独で含まれていても、ベクターに担持されていてもよい。含有対象となる核酸が２つ以上、同じ核酸送達媒体に含まれている場合には、それらは同じベクター中に含まれていてもよいし、別個のベクター中に別々に含まれていてもよいし、同じウイルス中に含まれていてもよいし、別個のウイルス中に含まれていてもよい。また、別々の核酸は、同じ核酸送達媒体に含まれていても、別々の核酸送達媒体に含まれていてもよい。
ベクターは直鎖状でも環状でもよく、プラスミド等の非ウイルスベクターでも、ウイルスベクターでも、トランスポゾンによるベクターでもよい。ベクターは、プロモーター、ターミネーター等の制御配列、薬剤耐性遺伝子、レポーター遺伝子等の選択マーカー配列のうち１つ以上を含有していてもよい。ベクターに含まれるプロモーターを利用して、ベクターに含まれる遺伝子の発現を行わせるようにしてもよい。
本開示に係る組み合わせ医薬Ｂは、ＩＬ－７及びＣＣＬ１９、並びに免疫抑制阻害剤からなる因子の組み合わせによる相乗的な効果により、驚くべきほどに向上したがん治療効果を奏する。該効果は、本開示に係る組み合わせ医薬Ｂが、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸を含む細胞又は核酸送達媒体を含む場合により顕著であり、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸を含む免疫応答性細胞を含む場合にさらに顕著である。
本開示に係る組み合わせ医薬Ｂにおいて、インターロイキン７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸を協同して含む１種類又は複数種類の細胞若しくは核酸送達媒体又はそれらの組み合わせを含む投与用組成物（以下、第３の投与用組成物とも称する）は、さらに薬学的に許容される添加剤を含有していてもよく、前記添加剤としては、生理食塩水、緩衝生理食塩水、細胞培養培地、デキストロース、注射用水、グリセロール、エタノール及びこれらの組合せ、安定剤、可溶化剤及び界面活性剤、緩衝剤及び防腐剤、等張化剤、充填剤、並びに潤滑剤を挙げることができる。
本開示に係る組み合わせ医薬Ａにおける投与組成物についての説明は、第１の投与用組成物を第３の投与用組成物に読み替えて、本開示に係る組み合わせ医薬Ｂの投与のための投与組成物に適用することができる。例えば、第２の投与用組成物は、第３の投与用組成物と同一の組成物であってもよく、この場合は１つの投与用組成物が前記１種類又は複数種類の細胞若しくは核酸送達媒体又はそれらの組み合わせと、免疫抑制阻害剤の両方を含むことになる。この場合は、インターロイキン７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸を協同して含む１種類又は複数種類の細胞若しくは核酸送達媒体又はそれらの組み合わせと、免疫抑制阻害剤の両方を含む医薬組成物（合剤）が提供される。
第２の投与用組成物が第３の投与用組成物と別個の組成物である場合は、第３の投与用組成物と第２の投与用組成物は一緒に投与してもよいし、別々のタイミング（時点）で投与してもよい。
このため、前記細胞若しくは核酸送達媒体又はそれらの組み合わせと、前記免疫抑制阻害剤とは、異なる時点で別々に投与されてもよい。
ただし、本開示に係る組み合わせ医薬Ａにおける投与組成物についての説明における本開示に係る免疫応答性細胞Ａの量の記載は、前記１種類又は複数種類の細胞若しくは核酸送達媒体又はそれらの組み合わせが細胞を含む場合における第３の投与用組成物中における細胞量の記載に読み替えて、本開示に係る組み合わせ医薬Ｂにおける投与組成物の説明に適用するものとする。
その他、本開示に係る組み合わせ医薬Ａについての説明は、本開示に係る組み合わせ医薬Ａを本開示に係る組み合わせ医薬Ｂと読み替え、本開示に係る免疫応答性細胞Ａ及び「がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、ＩＬ－７及びＣＣＬ１９を発現する免疫応答性細胞」を、インターロイキン７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸を協同して含む１種類又は複数種類の細胞若しくは核酸送達媒体又はそれらの組み合わせに読み替えて、特に矛盾の無い限り、本開示に係る組み合わせ医薬Ｂに適用できる。これには、治療対象の生物種、個体、疾患の種類、用量、投与スケジュール等、組み合わせ医薬の使用形態についての説明も含まれる。
前記１種類又は複数種類の細胞若しくは核酸送達媒体又はそれらの組み合わせが核酸送達媒体を含む場合における第３の投与用組成物中における核酸送達媒体の量は、がんの種類、位置、重症度、治療を受ける対象の年齢、体重及び状態等に応じて適宜調整できるが、送達すべき核酸を治療有効量送達するのに適切な量とすればよい。
本開示に係る組み合わせ医薬Ａを用いたがんの治療についての説明は、本開示に係る組み合わせ医薬Ａを本開示に係る組み合わせ医薬Ｂと読み替え、本開示に係る免疫応答性細胞Ａ及びがん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、ＩＬ－７及びＣＣＬ１９を発現する免疫応答性細胞を、インターロイキン７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸を協同して含む１種類又は複数種類の細胞若しくは核酸送達媒体又はそれらの組み合わせに読み替えて、本開示に係る組み合わせ医薬Ｂを用いたがんの治療に適用できる。例えば、本開示に係る一態様によれば、
（ａ）インターロイキン７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸を協同して含む１種類又は複数種類の細胞若しくは核酸送達媒体又はそれらの組み合わせ、並びに
（ｂ）免疫抑制阻害剤
を組み合わせて対象に投与することを含む、対象におけるがんを治療する方法（以下、本開示に係るがんの治療方法Ｂとも称する）が提供される。
同様に、本開示によれば、がんを治療するための医薬の製造における、（ａ）インターロイキン７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸を協同して含む１種類又は複数種類の細胞若しくは核酸送達媒体又はそれらの組み合わせ、並びに（ｂ）免疫抑制阻害剤の使用が提供される。また、免疫抑制阻害剤と併用されて対象におけるがんを治療するために用いられる、インターロイキン７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸を協同して含む１種類又は複数種類の細胞若しくは核酸送達媒体又はそれらの組み合わせを含む医薬も提供される。さらに、免疫抑制阻害剤と併用されて対象におけるがんを治療するために用いられる、インターロイキン７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸を協同して含む１種類又は複数種類の細胞若しくは核酸送達媒体又はそれらの組み合わせも提供される。インターロイキン７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸を協同して含む１種類又は複数種類の細胞若しくは核酸送達媒体又はそれらの組み合わせと、免疫抑制阻害剤とは、一緒に投与されても、異なる時点で別々に投与されてもよい。
さらに、本開示によれば、インターロイキン７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸を協同して含む１種類又は複数種類の細胞若しくは核酸送達媒体又はそれらの組み合わせと併用されて対象におけるがんを治療するために用いられる、免疫抑制阻害剤を含む医薬も提供される。さらに、インターロイキン７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸を協同して含む１種類又は複数種類の細胞若しくは核酸送達媒体又はそれらの組み合わせと併用されて対象におけるがんを治療するために用いられる、免疫抑制阻害剤も提供される。
本開示によれば、免疫抑制阻害剤と併用されることが表示された容器に収容され、かつ、インターロイキン７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸を協同して含む１種類又は複数種類の細胞若しくは核酸送達媒体又はそれらの組み合わせを含む医薬も提供される。容器、表示等の詳細は、上述のとおりである。加えて、免疫抑制阻害剤と併用されることが記載された添付文書と、インターロイキン７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸を協同して含む１種類又は複数種類の細胞若しくは核酸送達媒体又はそれらの組み合わせを含む医薬を収容した容器と、を含む製品も提供される。容器、添付文書等の詳細は、上述のとおりである。
以上説明したとおり、本開示に係る一態様によれば、インターロイキン７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸を協同して含む１種類又は複数種類の細胞若しくは核酸送達媒体又はそれらの組み合わせ、並びに免疫抑制阻害剤の組み合わせによる相乗的な効果により、驚くべきほどに向上したがん治療効果を得ることができる。
本開示に係るさらなる態様によれば、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、インターロイキン７、ＣＣＬ１９、及び免疫抑制阻害性ポリペプチドを発現する免疫応答性細胞（以下、本開示に係る免疫応答性細胞Ｃとも称する）が提供される。
ここで、本開示に係る免疫応答性細胞Ｃにおける、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、インターロイキン７、ＣＣＬ１９、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸、インターロイキン７をコードする核酸、ＣＣＬ１９をコードする核酸、及び免疫抑制阻害剤の定義、例、アミノ酸配列、塩基配列、好ましい実施形態等の詳細は、本開示に係る免疫応答性細胞Ａ及び本開示に係る組み合わせ医薬Ａにおける、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、インターロイキン７、ＣＣＬ１９、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸、インターロイキン７をコードする遺伝子、ＣＣＬ１９をコードする遺伝子、及び免疫抑制阻害剤の定義、例、アミノ酸配列、塩基配列、好ましい実施形態等の詳細と、それぞれ同様である。
本開示に係る免疫応答性細胞Ｃは、本開示に係る免疫応答性細胞Ａがさらに免疫抑制阻害性ポリペプチドを発現している細胞であると考えることができる。したがって、免疫応答性細胞Ａの説明において既に説明済みの事項（がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、インターロイキン７、及びＣＣＬ１９についての説明等）については、免疫応答性細胞Ａの説明におけるそれらの記載と同様であるので、説明を省略する。
免疫抑制阻害性ポリペプチドとは、本開示に係る組み合わせ医薬Ａにおける免疫抑制阻害剤の範疇に入る物質のうち、ポリペプチドに該当するものを指す。免疫抑制阻害性ポリペプチドは、免疫応答性細胞活性化の抑制を解除又は低減する。
免疫抑制阻害性ポリペプチドの例としては、免疫チェックポイント阻害性ポリペプチド、Ｔｒｅｇ、骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）等の免疫抑制性細胞の浸潤、生存、又は機能を阻害するポリペプチド、ＣＣＲ４阻害性ポリペプチド、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）阻害性ポリペプチド、プロスタグランジンＥ２［ＰＧＥ２］抑制性ポリペプチド、細胞傷害性抗がん性ポリペプチドが挙げられる。免疫抑制阻害性ポリペプチドは、これらの機能を有する限り、抗体であってもよく、例えばＩｇＧモノクローナル抗体又は抗体断片であってもよい。
免疫チェックポイント阻害性ポリペプチドは、典型的にはＴ細胞の表面に発現する免疫チェックポイント分子を介した免疫抑制機構を解除又は軽減させるポリペプチドである。免疫チェックポイント阻害性ポリペプチドは、例えば、免疫チェックポイント分子（例えばＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３等）又は免疫チェックポイント分子のリガンド（例えばＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ８０／ＣＤ８６、Ｓｉｇｌｅｃ－１５等）に結合して、リガンドにより免疫チェックポイント分子からのシグナル伝達が開始されることを阻害することで、免疫応答に対する抑制反応を減少させることができる。
免疫チェックポイント阻害性ポリペプチドの例としては、ＰＤ－１阻害性ポリペプチド、ＰＤ－Ｌ１阻害性ポリペプチド、ＣＴＬＡ－４阻害性ポリペプチド、ＣＤ４７阻害性ポリペプチド、ＳＩＲＰα阻害性ポリペプチド、ＢＴＬＡ阻害性ポリペプチド、ＴＩＭ－３阻害性ポリペプチド、ＴＩＧＩＴ阻害性ポリペプチド、ＬＡＧ－３阻害性ポリペプチド、Ｓｉｇｌｅｃ－１５阻害性ポリペプチド、ガレクチン－９阻害性ポリペプチド等が挙げられる。ＣＣＲ４阻害性ポリペプチドの例としては、抗ＣＣＲ４抗体（例えばモガムリズマブ）等が挙げられる。
免疫抑制阻害性ポリペプチドは、ＰＤ－１阻害性ポリペプチド、ＰＤ－Ｌ１阻害性ポリペプチド、ＰＤ－Ｌ２阻害性ポリペプチド、ＣＴＬＡ－４阻害性ポリペプチド、ＢＴＬＡ（B- and T-lymphocyte attenuator）阻害性ポリペプチド、ＴＩＭ－３（T-cell immunoglobulin and mucin domain 3）阻害性ポリペプチド、ＴＩＧＩＴ（T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains）阻害性ポリペプチド、ＬＡＧ－３（Lymphocyte Activation Gene-3）阻害性ポリペプチド、及びＳｉｇｌｅｃ－１５阻害性ポリペプチドからなる群から選択される１種以上を含んでいてもよい。
免疫抑制阻害性ポリペプチドは、免疫チェックポイント阻害性ポリペプチドであってもよく、より具体的にはＰＤ－１阻害性ポリペプチド又はＰＤ－Ｌ１阻害性ポリペプチドであってもよく、さらに具体的にはＰＤ－１に対する抗体又はＰＤ－Ｌ１に対する抗体であってもよい。ＰＤ－１に対する抗体の例としては、Nivolumab（ニボルマブ）、Pembrolizumab（ペムブロリズマブ）、Toripalimab（トリパリマブ）、Cemiplimab-rwlc（セミプリマブ）、Sintilimab（シンチリマブ）等が挙げられる。ＰＤ－Ｌ１に対する抗体の例としては、Atezolizumab（アテゾリズマブ）、Durvalumab（デュルバルマブ）、Avelumab （アベルマブ）等が挙げられる。ＣＴＬＡ－４に対する抗体の例としては、Ipilimumab（イピリムマブ）等が挙げられる。他にＣＤ４７、ＳＩＲＰαに対する抗体等も挙げられる。
抗体は、所定の抗原結合性を有していればＩｇＧモノクローナルであっても、Ｆａｂ断片であっても、ｓｃＦｖであっても、それ以外の抗体又は抗体断片であってもよい。免疫抑制阻害性ポリペプチドとしての抗ＰＤ－１ｓｃＦｖの例としては、配列番号１６におけるＮ末端から数えて５９２～８３５位のアミノ酸配列が挙げられ、それをコードする核酸配列の例としては、配列番号１５における５’末端から数えて１７１７番目の残基～２５０５番目の残基の核酸配列が挙げられる。
目的の標的に対する一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、公知の手法により作製することもできる。例えば、マウス等に抗原を接種してからリンパ組織を採取して、抗体遺伝子のライブラリーを作製し、抗体ダイレクトクローニングによりがん抗原を認識する抗体をコードする塩基配列を得て、それを基に一本鎖抗体を設計してもよい。あるいは、採取したリンパ組織を用いてハイブリドーマを作製し、がん抗原を認識する抗体をコードするハイブリドーマを同定してモノクローナル抗体を得て、その配列情報を基に一本鎖抗体を設計してもよい。あるいは、健常人のＢ細胞から作製したナイーブ抗体ライブラリー、がん抗原に対して高い中和活性を示す抗血清をもつがん罹患者由来のＢ細胞から作製した抗体ライブラリー等を基にして一本鎖抗体のライブラリーを作製し、これをファージディスプレイにより提示させてがん抗原を認識する一本鎖抗体を選抜してもよい。
本開示に係る免疫応答性細胞Ｃは、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、ＩＬ－７、ＣＣＬ１９、及び免疫抑制阻害性ポリペプチドを発現する。ここで、「がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、ＩＬ－７、ＣＣＬ１９、及び免疫抑制阻害性ポリペプチドを発現する」とは、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、ＩＬ－７、ＣＣＬ１９、及び免疫抑制阻害性ポリペプチドが免疫応答性細胞により産生され、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子の少なくとも一部が細胞表面（細胞外側の細胞表面）に位置し、ＩＬ－７、ＣＣＬ１９、及び免疫抑制阻害性ポリペプチドが細胞外に分泌されることを指す。
がん細胞は免疫応答性細胞ががん細胞を攻撃したり、がん細胞を攻撃する指示を発したりすることを抑制する免疫抑制機構を有しているため、がん罹患者自身の免疫によるがん細胞への攻撃が抑制されている。本開示に係る免疫応答性細胞Ｃが発現する免疫抑制阻害性ポリペプチドは、がん細胞による免疫抑制機構を阻害することで、がん罹患者の免疫系ががん細胞を攻撃することをより容易にすると考えられる。
これらに加えて、本開示に係る免疫応答性細胞ＣがＩＬ－７及びＣＣＬ１９も発現していることにより、本開示に係る免疫応答性細胞Ｃだけではなく、がん罹患者の内因性の免疫応答性細胞もがん細胞の周囲に集積するため、がん細胞をより効果的に攻撃することが可能になると考えられる。
本開示に係る免疫応答性細胞Ｃは、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、インターロイキン７、ＣＣＬ１９、及び免疫抑制阻害性ポリペプチドを発現することによって、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子を発現する免疫応答性細胞、分泌されたＩＬ－７、ＣＣＬ１９、及び免疫抑制阻害性ポリペプチドからなる因子の組み合わせによる相乗的な効果を発揮し、このために大きく改善したがん治療効果を奏すると考えられる。この相乗的な効果は、それぞれの因子の個別の効果からは予測することができないほど優れた効果である。
例えば、後述の実施例に示されるとおり、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、インターロイキン７、及びＣＣＬ１９を発現するが免疫抑制阻害性ポリペプチドを発現しない免疫応答性細胞を用いた場合、及びがん抗原を特異的に認識する細胞表面分子及び免疫抑制阻害性ポリペプチドを発現するが、インターロイキン７及びＣＣＬ１９を発現しない免疫応答性細胞を用いた場合には治療困難ながん治療の場合でも、本開示に係る免疫応答性細胞Ｃを用いれば治療可能となりうる。また、このような高い治療効果により、細胞の投与量を減らした場合でも治療効果を得ることが可能となり、自家細胞を使用する場合において十分な数の免疫応答性細胞を採取できない場合でも、治療効果を得ることが可能になる。このような効果は、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、インターロイキン７、及びＣＣＬ１９の共発現、あるいは、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子及び免疫抑制阻害性ポリペプチドの共発現からは予測できない効果である。
本開示に係る免疫応答性細胞Ｃは、例えば、生体から採取した免疫応答性細胞、又はｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞等の多能性幹細胞若しくは造血幹細胞などの体性幹細胞から誘導した免疫応答性細胞等に、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸、ＩＬ－７をコードする核酸、ＣＣＬ１９をコードする核酸、及び免疫抑制阻害性ポリペプチドをコードする核酸を導入することで得ることができる。あるいは、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子（例えばがん抗原を特異的に認識するＴＣＲ）を内在的に発現している免疫応答性細胞を生体から採取して、ＩＬ－７をコードする核酸、ＣＣＬ１９をコードする核酸、及び免疫抑制阻害性ポリペプチドをコードする核酸を導入することでも得ることができる。
生体から採取した免疫応答性細胞に核酸導入する場合、本開示に係る免疫応答性細胞Ｃを含む医薬により治療されるがん罹患者自身の（つまり自家の）免疫応答性細胞を採取すれば、拒絶反応を最小化できる。ただし、他家の免疫応答性細胞を使用することを排除するものではない。つまり、本開示に係る免疫応答性細胞Ｃは、対象自身に由来する免疫応答性細胞であっても、なくてもよい。
がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸、ＩＬ－７をコードする核酸、ＣＣＬ１９をコードする核酸、及び免疫抑制阻害性ポリペプチドをコードする核酸は、それぞれ、本開示に係る免疫応答性細胞Ｃのゲノム中に存在していても、ゲノム外のベクターに担持されていてもよく、例えば、核酸担持の安定性の観点からゲノム中に存在させてもよい。また、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸、ＩＬ－７をコードする核酸、ＣＣＬ１９をコードする核酸、及び免疫抑制阻害性ポリペプチドをコードする核酸は、ゲノム中にまとまって（例えば連結して）存在していてもよく、ばらばらに（分離して）存在していてもよく、あるいはこれらのうち一部のもののみがまとまって（例えば連結して）存在し、他のものはばらばらに（分離して）存在していてもよい。がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子が、例えばαβの二量体又はγδの二量体からなるＴＣＲである場合のようにヘテロ二量体又はヘテロ多量体である場合、ヘテロ二量体又はヘテロ多量体を構成するそれぞれの分子をコードする核酸はゲノム中にまとまって存在していてもよく、ばらばらに（分離して）存在していてもよい。
一実施形態においては、ＩＬ－７をコードする核酸、ＣＣＬ１９をコードする核酸、及び免疫抑制阻害性ポリペプチドをコードする核酸のうち少なくとも１つは外来性であり、全てが外来性であってもよい。また、ＩＬ－７をコードする核酸、ＣＣＬ１９をコードする核酸、及び免疫抑制阻害性ポリペプチドをコードする核酸は、それぞれ独立に、ゲノムに組み込まれていても、ベクターに組み込まれていてもよい。ある実施形態では、ＩＬ－７をコードする核酸、ＣＣＬ１９をコードする核酸、及び免疫抑制阻害性ポリペプチドをコードする核酸の全てが、本開示に係る免疫応答性細胞Ｃのゲノムに組み込まれているか、又は前記免疫応答性細胞Ｃ中に存在する１個又は複数個のベクターに一緒に若しくは別個に組み込まれている。別の実施形態では、ＩＬ－７をコードする核酸、ＣＣＬ１９をコードする核酸、及び免疫抑制阻害性ポリペプチドをコードする核酸のうち一部は本開示に係る免疫応答性細胞Ｃのゲノムに組み込まれているが、残りは前記免疫応答性細胞Ｃ中に存在する１個又は複数個のベクターに組み込まれている。
ある実施形態においては、免疫抑制阻害性ポリペプチドをコードする核酸は前記免疫応答性細胞のゲノムに組み込まれているか、又は、免疫応答性細胞中に存在する、ＩＬ－７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸を協同して含む１個又は複数個のベクターのうちいずれかと同じであっても異なっていてもよいベクターに組み込まれている。
なお、細胞中に各核酸が存在しているかどうかは、ＰＣＲ等公知の手法を用いて容易に確認することができる。
免疫抑制阻害性ポリペプチドのアミノ酸配列及び免疫抑制阻害性ポリペプチドをコードする塩基配列の情報は、公知の文献やＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）などのデータベースを検索して適宜入手することができる。
免疫応答性細胞ががん抗原を特異的に認識する細胞表面分子を内在的に発現している場合、例えば所定のがん抗原を特異的に認識するＴＣＲを発現しているＴ細胞を単離する場合には、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸を外部から導入する必要は無いが、これ以外の場合は、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸、ＩＬ－７をコードする核酸、ＣＣＬ１９をコードする核酸、及び免疫抑制阻害性ポリペプチドのうちの１種以上を外部から導入する。
免疫応答性細胞に導入するためのがん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸、ＩＬ－７をコードする核酸、ＣＣＬ１９をコードする核酸、及び免疫抑制阻害性ポリペプチドをコードする核酸は、それぞれ、当該分子をコードする塩基配列の情報に基づき、化学合成する方法や、ＰＣＲによって増幅する方法等の公知の技術によって作製することができる。なお、コーディング領域におけるコドンは、遺伝子を含む核酸が導入される対象となる免疫応答性細胞における当該遺伝子の発現を最適化するために改変されてもよい。
導入の対象となる核酸群の導入は、１つ又は複数の核酸送達媒体に核酸群を含ませて行うことができる。この場合の核酸送達媒体の例としては、前述のウイルス、リポソーム及びナノ粒子が挙げられる。リポソーム及びナノ粒子は、核酸をベクターに含ませた状態で含んでいてもよい。このように、本開示によれば、インターロイキン７をコードする核酸、ＣＣＬ１９をコードする核酸、及び免疫抑制阻害性ポリペプチドをコードする核酸を協同して含む１種類又は複数種類の核酸送達媒体も提供される。免疫応答性細胞ががん抗原を特異的に認識する細胞表面分子を内在的に発現していない場合などは、前記核酸送達媒体は、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸をさらに含んでいてもよい。
以下の説明では核酸群を含むベクターについて説明するが、核酸送達媒体の場合についても、矛盾が無い限り、同様の説明が当てはまる。あるいは、核酸送達媒体は以下に説明するようなベクターを含んでいてもよい。
導入の対象となる核酸は、それぞれ別々のベクターに担持された状態で導入されても、２種以上の核酸を同じベクターに担持した状態で導入してもよい。例えば、ＩＬ－７をコードする核酸、ＣＣＬ１９をコードする核酸、及び免疫抑制阻害性ポリペプチドをコードする核酸を免疫応答性細胞に導入する場合、ＩＬ－７をコードする核酸とＣＣＬ１９をコードする核酸とは別々のベクターで導入してもよいし、同じベクターに両核酸を担持させて導入してもよい。ＣＣＬ１９をコードする核酸と免疫抑制阻害性ポリペプチドをコードする核酸とは別々のベクターで導入してもよいし、同じベクターに両核酸を担持させて導入してもよい。ＩＬ－７をコードする核酸と免疫抑制阻害性ポリペプチドをコードする核酸とは別々のベクターで導入してもよいし、同じベクターに両核酸を担持させて導入してもよい。がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸も導入する場合についての以下に記載の説明も、「がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸」を除くこと以外は同様に、ＩＬ－７をコードする核酸、ＣＣＬ１９をコードする核酸、及び免疫抑制阻害性ポリペプチドをコードする核酸を導入する場合（言い換えれば、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸の導入が必要無い場合）に適用できる。
がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸、ＩＬ－７をコードする核酸、ＣＣＬ１９をコードする核酸、及び免疫抑制阻害性ポリペプチドをコードする核酸を免疫応答性細胞に導入する場合、
（ｉ）がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸、ＩＬ－７をコードする核酸、ＣＣＬ１９をコードする核酸、及び免疫抑制阻害性ポリペプチドをコードする核酸を、それぞれ別個のベクターに担持させて導入してもよいし、
（ｉｉ）がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸及びＩＬ－７をコードする核酸を同じベクターに担持させ、ＣＣＬ１９をコードする核酸を別個のベクターに担持させ、免疫抑制阻害性ポリペプチドをコードする核酸を別個のさらなるベクターに担持させて導入してもよいし、
（ｉｉｉ）がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸を同じベクターに担持させ、ＩＬ－７をコードする核酸を別個のベクターに担持させ、免疫抑制阻害性ポリペプチドをコードする核酸を別個のさらなるベクターに担持させて導入してもよいし、
（ｉｖ）がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸及び免疫抑制阻害性ポリペプチドをコードする核酸を同じベクターに担持させ、ＩＬ－７をコードする核酸を別個のベクターに担持させ、ＣＣＬ１９をコードする核酸を別個のさらなるベクターに担持させて導入してもよいし、
（ｖ）ＩＬ－７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸を同じベクターに担持させ、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸を別個のベクターに担持させ、免疫抑制阻害性ポリペプチドをコードする核酸を別個のさらなるベクターに担持させて導入してもよいし、
（ｖｉ）ＩＬ－７をコードする核酸及び免疫抑制阻害性ポリペプチドをコードする核酸を同じベクターに担持させ、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸を別個のベクターに担持させ、ＣＣＬ１９をコードする核酸を別個のさらなるベクターに担持させて導入してもよいし、
（ｖｉｉ）ＣＣＬ１９をコードする核酸及び免疫抑制阻害性ポリペプチドをコードする核酸を同じベクターに担持させ、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸を別個のベクターに担持させ、ＩＬ－７をコードする核酸を別個のさらなるベクターに担持させて導入してもよいし、
（ｖｉｉｉ）がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸及びＩＬ－７をコードする核酸を同じベクターに担持させ、ＣＣＬ１９をコードする核酸及び免疫抑制阻害性ポリペプチドをコードする核酸を別個のベクターに一緒に担持させて導入してもよいし、
（ｉｘ）がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸を同じベクターに担持させ、ＩＬ－７をコードする核酸及び免疫抑制阻害性ポリペプチドをコードする核酸を別個のベクターに一緒に担持させて導入してもよいし、
（ｘ）がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸及び免疫抑制阻害性ポリペプチドをコードする核酸を同じベクターに担持させ、ＩＬ－７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸を別個のベクターに一緒に担持させて導入してもよいし、
（ｘｉ）がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸、ＩＬ－７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を同じベクターに担持させ、免疫抑制阻害性ポリペプチドをコードする核酸を別個のベクターに担持させて導入してもよいし、
（ｘｉｉ）がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸、ＩＬ－７をコードする核酸、及び免疫抑制阻害性ポリペプチドをコードする核酸を同じベクターに担持させ、ＣＣＬ１９をコードする核酸を別個のベクターに担持させて導入してもよいし、
（ｘｉｉｉ）がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸、ＣＣＬ１９をコードする核酸、及び免疫抑制阻害性ポリペプチドをコードする核酸を同じベクターに担持させ、ＩＬ－７をコードする核酸を別個のベクターに担持させて導入してもよいし、
（ｘｉｖ）ＩＬ－７をコードする核酸、ＣＣＬ１９をコードする核酸、及び免疫抑制阻害性ポリペプチドをコードする核酸を同じベクターに担持させ、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸を別個のベクターに担持させて導入してもよいし、
（ｘｖ）がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸、ＩＬ－７をコードする核酸、ＣＣＬ１９をコードする核酸、及び免疫抑制阻害性ポリペプチドをコードする核酸を、同じベクターに担持させて導入してもよい。
導入効率を考慮して、２種以上の核酸を同じベクターに担持した状態で導入させてもよい。この場合は、当該２種以上の核酸は、免疫応答性細胞中でまとまって存在することになる。
例えば、以下のベクター又はベクター群を使用することができる。
（ｆ）がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸、ＩＬ－７をコードする核酸、ＣＣＬ１９をコードする核酸、及び免疫抑制阻害性ポリペプチドをコードする核酸を含有するベクター（上記（ｘｖ）の場合に相当）
（ｇ）以下のベクター（ｇ－１）及びベクター（ｇ－２）からなるベクター群（上記ｘｉｖの場合に相当）。
（ｇ－１）がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸を含有するベクター
（ｇ－２）ＩＬ－７をコードする核酸、ＣＣＬ１９をコードする核酸、免疫抑制阻害性ポリペプチドをコードする核酸を含有するベクター
その他の場合についても、同様に適切なベクター群を設計することができる。
ベクター群は、核酸が冗長（ｒｅｄｕｎｄａｎｔ）に含まれるように設計してもよい。つまり、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸、ＩＬ－７をコードする核酸、ＣＣＬ１９をコードする核酸、免疫抑制阻害性ポリペプチドをコードする核酸のうちの特定の一つの核酸が、ベクター群に属するベクターのうちの２つ以上に含まれていてもよい。
上記のベクターのうち任意のベクターに、又は上記のベクターとは別個のベクターに、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２３、ＩＬ－２７、ＩＰ－１０、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ４Ｌ１、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ１７、ＣＸ３ＣＬ１、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、ＣＣＬ３Ｌ１、ＣＣＬ３Ｌ３、ＣＣＬ４Ｌ１、ＣＣＬ４Ｌ２、Ｆｌｔ３Ｌ、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｇａｍｍａ、ＭＩＰ－１ａｌｐｈａ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＴＧＦ－ｂｅｔａ、ＴＮＦ－ａｌｐｈａ等の１種以上の他の免疫機能制御因子をコードする核酸をさらに含有させて、免疫応答性細胞に導入してもよい。
核酸を担持するベクターを免疫応答性細胞に導入する方法としては特に制限されないが、ウイルス感染法、トランスポゾン法、カルシウムリン酸法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法等の公知の方法が挙げられる。外来核酸のゲノムへの導入が可能なウイルス感染法により導入する方法は核酸担持の安定性をもたらしうる。
ウイルス感染法としては、ベクターとパッケージングプラスミドをＧＰ２－２９３細胞（タカラバイオ社製）、Ｐｌａｔ－ＧＰ細胞（コスモ・バイオ社製）、ＰＧ１３細胞（ATCC CRL-10686）、ＰＡ３１７細胞（ATCC CRL-9078）等のパッケージング細胞にトランスフェクションして組換えウイルスを作製し、かかる組換えウイルスを免疫応答性細胞に感染させる方法を挙げることができ、Retrovirus packaging Kit Eco（タカラバイオ社製）等の市販のキットを用いて行ってもよい。ＭＳＣＶレトロウイルス発現システム等を用いれば、外来核酸のゲノムへの導入が可能である。
また、ＩＬ－７をコードする核酸、ＣＣＬ１９をコードする核酸、免疫抑制阻害性ポリペプチドをコードする核酸、及び必要ならがん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸のゲノムへの組込みは、公知の遺伝子編集技術を用いて行うこともできる。公知の遺伝子編集技術としては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ（転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ）、ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ）－Ｃａｓシステム等のエンドヌクレアーゼを用いる技術が挙げられる。所望により導入される他の外来タンパク質をコードする核酸のゲノムへの組込みも、同様の手法により行うことができる。
また、これらの核酸（遺伝子）を免疫応答性細胞のゲノムに組み込む場合には、当該遺伝子を制御する上流プロモーターと共にゲノムの非コード領域等に作動可能に（即ち、当該プロモーターの制御下で発現可能なように）組み込んでもよいし、プロモーター無しに、ゲノム中に既に存在しているプロモーターの下流に作動可能に組み込んでもよい。ゲノム中に既に存在しているプロモーターとしては、ＴＣＲα、ＴＣＲβのプロモーター等が挙げられる。
がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸、ＩＬ－７をコードする核酸、ＣＣＬ１９をコードする核酸、免疫抑制阻害性ポリペプチドをコードする核酸、及び所望により導入された追加の外来タンパク質をコードする核酸のうち２種以上の核酸が近接して存在する場合には、それら２種以上の核酸を共通のプロモーターの制御下で発現させることもできる。共通のプロモーターの制御下で発現させる場合には、２Ａペプチド、ＩＲＥＳペプチド等を使用して、転写及び／又は翻訳を分断してそれぞれのポリペプチドを発現させるようにできる。
がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸、ＩＬ－７をコードする核酸、ＣＣＬ１９をコードする核酸、及び免疫抑制阻害性ポリペプチドをコードする核酸のうちの２種以上を担持するベクターを免疫応答性細胞に導入する場合には、該ベクター中における前記２種以上の核酸の並び順は特に限定されない。例えば、前記（ｆ）がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸、ＩＬ－７をコードする核酸、ＣＣＬ１９をコードする核酸、及び免疫抑制阻害性ポリペプチドをコードする核酸を含有するベクターにおいては、これら４種の核酸の並び順は限定されない。具体的には、上流（５’末端側）から下流（３’末端側）への順に、
（ｉ）がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸、ＩＬ－７をコードする核酸、ＣＣＬ１９をコードする核酸、及び免疫抑制阻害性ポリペプチドをコードする核酸のうちのいずれか、
（ｉｉ）上記４つの核酸のうちの残余（３つ）のうちのいずれか
（ｉｉｉ）上記４つの核酸のうちの残余（２つ）のうちのいずれか、
（ｉｖ）上記４つの核酸のうちの最後に残ったもの
で並んでいてもよい。
同様に、免疫応答性細胞ががん抗原を特異的に認識する細胞表面分子を内在的に発現している場合に用いることが考えられるＩＬ－７をコードする核酸、ＣＣＬ１９をコードする核酸、及び免疫抑制阻害性ポリペプチドをコードする核酸を含有するベクターについても、
（ｉ）ＩＬ－７をコードする核酸、ＣＣＬ１９をコードする核酸、及び免疫抑制阻害性ポリペプチドをコードする核酸のうちのいずれか、
（ｉｉ）上記３つの核酸のうちの残余（２つ）のうちのいずれか
（ｉｉｉ）上記３つの核酸のうちの最後に残ったもの
の順に並んでいてもよい。
なお、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸、ＩＬ－７をコードする核酸、ＣＣＬ１９をコードする核酸、及び免疫抑制阻害性ポリペプチドをコードする核酸は、それぞれ別のプロモーターにより転写されてもよく、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ：ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｚｙｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）又は自己切断型２Ａペプチドを使用して一つのプロモーターで転写されてもよい。
一つのプロモーターで複数の核酸を転写させる場合、それぞれの核酸の間の塩基配列は、それぞれの核酸を発現し得る限り、任意の塩基配列を含んでもよいが、自己切断型ペプチド（２Ａペプチド）又はＩＲＥＳをコードする塩基配列を含んでもよく、２Ａペプチドをコードする塩基配列を含んでもよい。このような塩基配列を用いて複数の核酸を連結することにより、それぞれの核酸を効率よく発現させることが可能となる。自己切断型ペプチド（２Ａペプチド）又はＩＲＥＳをコードする塩基配列を含みうる核酸間の塩基配列は、例えば、ＩＬ－７をコードする核酸とＣＣＬ１９をコードする核酸との間の塩基配列であってもよく、ＩＬ－７をコードする核酸と免疫抑制阻害性ポリペプチドをコードする核酸との間の塩基配列であってもよく、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸とＩＬ－７をコードする核酸との間の塩基配列であってもよく、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸とＣＣＬ１９をコードする核酸との間の塩基配列であってもよく、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸と免疫抑制阻害性ポリペプチドをコードする核酸との間の塩基配列であってもよく、ＣＣＬ１９をコードする核酸と免疫抑制阻害性ポリペプチドをコードする核酸との間の塩基配列であってもよく、アルファ・ベータＴＣＲにおけるアルファ鎖をコードする核酸とベータ鎖をコードする核酸との間の塩基配列であってもよく、ガンマ・デルタＴＣＲにおけるガンマ鎖をコードする核酸とデルタ鎖をコードする核酸の間の塩基配列であってもよい。つまり、これらの核酸間の領域それぞれについて、所望により、自己切断型ペプチド（２Ａペプチド）又はＩＲＥＳをコードする塩基配列を含ませることができる。
２Ａペプチドとは、ウイルス由来の自己切断型ペプチドであり、その詳細は前述のとおりである。
免疫応答性細胞への核酸導入に用いられるベクターは直鎖状でも環状でもよく、プラスミド等の非ウイルスベクターでも、ウイルスベクターでも、トランスポゾンによるベクターでもよい。免疫応答性細胞への核酸導入に用いられるベクターは、プロモーター、ターミネーター等の制御配列、薬剤耐性核酸、レポーター核酸等の選択マーカー配列のうち１つ以上を含有していてもよい。免疫応答性細胞への核酸導入後も、ベクターに含まれるプロモーターを利用して核酸の発現を行わせるようにしてもよい。例えば、ベクター中のプロモーター配列の下流に作動可能にがん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸、ＩＬ－７をコードする核酸、ＣＣＬ１９をコードする核酸、及び免疫抑制阻害性ポリペプチドをコードする核酸のうち１つ以上を配置することで、当該核酸を効率よく転写させることができる。
前記プロモーターの例としては、レトロウイルスのＬＴＲプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーター等のウイルス由来プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、Ｘｉｓｔプロモーター、β－アクチンプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、ポリペプチド鎖伸長因子遺伝子プロモーター等の哺乳類由来プロモーターを挙げることができる。また、テトラサイクリンによって誘導されるテトラサイクリン応答型プロモーター、インターフェロンによって誘導されるＭｘ１プロモーター等を用いてもよい。特定の物質によって誘導されるプロモーターを用いることによって、プロモーターに転写制御される遺伝子（例えば、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする遺伝子、ＩＬ－７をコードする遺伝子、ＣＣＬ１９をコードする遺伝子、及び免疫抑制阻害性ポリペプチドをコードする遺伝子のうち１つ以上）の発現をがんの治療経過に応じて制御することが可能となる。
前記ウイルスベクターの例としては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターを挙げることができる。レトロウイルスベクターとしては、ｐＭＳＧＶベクター（Tamada K. et al., Clin Cancer Res 18:6436-6445(2002)）、ｐＭＳＣＶベクター（タカラバイオ社製）等を挙げることができる。レトロウイルスベクターを用いれば、導入核酸はホスト細胞のゲノムへ取り込まれるため、導入核酸を長期間安定に発現することが可能となる。
免疫応答性細胞におけるがん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、ＩＬ－７、ＣＣＬ１９、及び免疫抑制阻害性ポリペプチドの発現は、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング等により確認することができる。また、これらをコードする核酸の導入は、上記のように発現産物を確認するか、あるいはノザンブロッティング、サザンブロッティング、ＲＴ－ＰＣＲ等のＰＣＲ等により確認することができる。核酸導入に用いるベクターがマーカー遺伝子を含有する場合には、当該発現ベクターに挿入されたマーカー遺伝子の発現を調べることによって核酸の導入を確認することができる。
＜本開示に係る免疫応答性細胞Ｃを含む医薬＞
本開示によれば、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、インターロイキン７、ＣＣＬ１９、及び免疫抑制阻害性ポリペプチドを発現する免疫応答性細胞を含む医薬（以下、「本開示に係る医薬Ｃ」とも称する）が提供される。つまり、本開示に係る医薬Ｃは、本開示に係る免疫応答性細胞Ｃを含む医薬である。
本開示に係る医薬Ｃは、さらに薬学的に許容される添加剤を含有していてもよく、前記添加剤としては、生理食塩水、緩衝生理食塩水、細胞培養培地、デキストロース、注射用水、グリセロール、エタノール及びこれらの組合せ、安定剤、可溶化剤、界面活性剤、緩衝剤、防腐剤、等張化剤、充填剤、並びに潤滑剤を挙げることができる。
本開示に係る医薬Ｃに含まれる本開示に係る免疫応答性細胞Ｃの量は、がんの種類、位置、重症度、治療を受ける対象の年齢、体重及び状態等に応じて適宜調整できるが、一回の投与当たり例えば１×１０４～１×１０１１個、より具体的には１×１０５～１×１０１０個、より具体的には１×１０６～１×１０９個を投与してもよい。また、本開示に係る免疫応答性細胞Ｃの量は、一回の投与当たり１×１０６個未満、例えば１×１０５～５×１０５個、より具体的には１．５×１０５～４×１０５個と少量であってもよい。
上述のとおり、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、インターロイキン７、及びＣＣＬ１９を発現するが免疫抑制阻害性ポリペプチドを発現しない免疫応答性細胞を用いた場合、及びがん抗原を特異的に認識する細胞表面分子及び免疫抑制阻害性ポリペプチドを発現するが、インターロイキン７及びＣＣＬ１９を発現しない免疫応答性細胞を用いた場合には治療困難ながん治療の場合でも、本開示に係る免疫応答性細胞Ｃを用いれば治療可能となりうる。このため、医薬Ｃに含まれる本開示に係る免疫応答性細胞Ｃの量は、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、インターロイキン７、及びＣＣＬ１９を発現するが免疫抑制阻害性ポリペプチドを発現しない免疫応答性細胞を用いた場合、及びがん抗原を特異的に認識する細胞表面分子及び免疫抑制阻害性ポリペプチドを発現するが、インターロイキン７及びＣＣＬ１９を発現しない免疫応答性細胞を用いた場合には抗がん効果を奏さないほど少量であってもよい。免疫応答性細胞Ｃが抗がん効果を奏すことができる量であれば、免疫応答性細胞Ｃの量の下限値は特に制限されない。
本開示に係る医薬Ｃは、１日４回、１日３回、１日２回、１日１回、１日おき、２日おき、３日おき、４日おき、５日おき、週１回、７日おき、８日おき、９日おき、週２回、月１回又は月２回の頻度で投与してもよい。また、投与回数は総計で例えば１回～１０回、すなわち、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回又は１０回としてもよいが、１０回を超える回数投与しても構わない。
上記のとおり、本開示に係る医薬Ｃは、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子を発現する免疫応答性細胞、並びに分泌されたＩＬ－７、ＣＣＬ１９、及び免疫抑制阻害性ペプチドからなる因子の組み合わせによる相乗的な効果により、驚くべきほどに向上したがん治療効果を奏する。
本開示に係る医薬Ｃは、当業者に既知の方法を用いて、がんの治療を必要とする対象に投与することができ、例えば、局所注入（カテーテル投与を含む）、全身注入、静脈内注入又は非経口投与（例えば経皮投与、経粘膜投与、より具体的には点鼻、点眼、舌下、坐薬、パッチ等）によって投与することができる。本開示に係る医薬Ｃは、取り扱いの観点から、単位投与量の注入可能な形態（溶液、懸濁液、乳濁液）に製剤化されていてもよい。投与方法のより具体的な例としては、静脈内、腫瘍内、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、動脈内、髄内、心臓内、関節内、滑液嚢内、頭蓋内、髄腔内、及びくも膜下（髄液）への注射を挙げることができる。
本開示に係る免疫応答性細胞Ｃは、元となる免疫応答性細胞又はその前駆体細胞を治療対象の患者から得て、本開示に係る免疫応答性細胞Ｃとするために必要な遺伝子の導入後に、同じ患者に投与してもよく（自家投与）、又は別の患者に投与してもよい（他家投与）。あるいは、元となる免疫応答性細胞又はその前駆体細胞は、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞等の多能性幹細胞又は造血幹細胞などの体性幹細胞から作製してもよい。
本開示に係る医薬Ｃは、例えば、所定のｐＨに緩衝化されていてもよい無菌の液体調製物、例えば、等張水溶液、懸濁液、乳濁液、分散物又は粘性組成物として投与することができる。前記液体調製物は、注射用の液体調製物であってもよい。また、特定の組織との接触時間を長くするために、前記液体調製物を適切な粘度範囲内の粘度を有する粘性組成物の形態としてもよい。液体調製物は、例えば、水、生理食塩水、リン酸塩緩衝化生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液状ポリエチレングリコールなど）及びそれらの混合物からなる溶媒又は分散媒を含んでいてもよい。
前記液体調製物は、本開示に係る免疫応答性細胞Ｃを、その他の成分の様々な量とともに、適当量の適切な溶媒に配合することによって調製することができる。前記液体調製物は、好適な担体、希釈剤、又は賦形剤を含んでいてもよい。前記液体調製物はまた、凍結乾燥されていてもよい。液体調製物は、所望の投与経路に依存して、様々な補助物質をさらに含んでいてもよく、補助物質の例としては、湿潤剤、分散剤又は乳化剤（例えば、メチルセルロース）、ｐＨ緩衝化剤、ゲル化剤又は粘度増強添加剤、保存剤、矯味矯臭剤、着色剤などが挙げられる。液体調製物中が含みうる成分については、“ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥ”，１７版、１９８５の記載を参照することもできる。
また、液体調製物は、液体調製物の安定性及び無菌性を高める様々な添加剤をさらに含んでいてもよく、その例としては、抗菌性保存剤、酸化防止剤、キレート剤、及び緩衝剤などが挙げられる。微生物の作用を防止するために、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などを使用することができる。液体調製物に使用するビヒクル、希釈剤又は添加剤は、そこに含まれる本開示に係る免疫応答性細胞Ｃとの適合性を有していなければならない。
液体調製物は血液と等張性であってもよい。等張性は、塩化ナトリウム、又は他の薬学的に許容され得る浸透圧調節物質（例えば、デキストロース、ホウ酸、酒石酸ナトリウム、プロピレングリコール、あるいは、他の無機溶質又は有機溶質など）を液体調製物に含有させることで達成することができる。
本開示に係る医薬Ｃは、本開示に係る免疫応答性細胞Ｃに加えて、さらに他の抗がん剤を含んでいてもよい。他の抗がん剤の例としては、ベンダムスチン、イオスファミド、ダカルバジン等のアルキル化薬、ペントスタチン、フルダラビン、クラドリビン、メソトレキセート、５－フルオロウラシル、６－メルカプトプリン、エノシタビン等の代謝拮抗薬、リツキシマブ、セツキシマブ、トラスツズマブ等の分子標的薬、イマチニブ、ゲフェチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、ダサチニブ、スニチニブ、トラメチニブ等のキナーゼ阻害剤、ボルテゾミブ等のプロテアソーム阻害剤、シクロスポリン、タクロリムス等のカルシニューリン阻害薬、イダルビジン、ドキソルビシンマイトマイシンＣ等の抗がん性抗生物質、イリノテカン、エトポシド等の植物アルカロイド、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン等のプラチナ製剤、タモキシフェン、ビカルダミド等のホルモン療法薬、インターフェロン等の免疫制御薬を挙げることができる。他の抗がん剤は、例えば、アルキル化薬及び代謝拮抗薬のうちの少なくとも１種を含んでいてもよい。
＜本開示に係る医薬Ｃを用いたがんの治療＞
本開示に係る医薬Ｃをがんの治療に用いる場合、治療の対象は例えば任意の哺乳動物でよいが、例えば霊長類の動物であり、より具体的にはヒトであってもよい。治療対象は、愛玩動物又は家畜であってもよく、その例としては、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギなどが挙げられる。
治療の対象となるがんは、固形がんでも血液がんでもよく、腺がん、扁平上皮がん、腺扁平上皮がん、未分化がん、大細胞がん、小細胞がん、皮膚がん、乳がん、前立腺がん、膀胱がん、膣がん、子宮頸部がん、子宮がん、肝臓がん、腎臓がん、膵臓がん、脾臓がん、肺がん、気管がん、気管支がん、結腸がん、小腸がん、胃がん、食道がん、胆嚢がん、精巣がん、卵巣がん等のがんや、骨組織、軟骨組織、脂肪組織、筋組織、血管組織及び造血組織のがんのほか、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性血管内皮腫、悪性シュワン腫、骨肉腫、軟部組織肉腫等の肉腫や、肝芽腫、髄芽腫、腎芽腫、神経芽腫、膵芽腫、胸膜肺芽腫、網膜芽腫等の芽腫や、胚細胞腫瘍や、リンパ腫や、白血病を挙げることができる。
本開示に係る医薬Ｃによればがん微小環境における免疫抑制性を軽減することが可能であるため、治療対象となるがんは血球系のがんに限定されず、固形がんに対しても治療効果を奏する。このため、従来の方法では治療が難しかった固形がんに対しても高い有効性を発揮できる。
本開示に係る医薬Ｃは、がんの確定診断がされる前であっても、対象内におけるがん細胞の存在が疑われる状況においては、対象に予防的に投与してもよい。本開示においては、このような使用形態も、がんの治療のための使用の概念に包含される。
＜対象におけるがんの治療方法＞
本開示に係る一態様によれば、
（ａ）がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、インターロイキン７、ＣＣＬ１９、及び免疫抑制阻害性ポリペプチドを発現する免疫応答性細胞を対象に投与することを含む、対象におけるがんを治療する方法（以下、本開示に係るがんの治療方法Ｃとも称する）が提供される。
ここで、本開示に係るがんの治療方法Ｃにおける免疫応答性細胞は本開示に係る免疫応答性細胞Ｃであり、その詳しい構成及び例などについては本開示に係る免疫応答性細胞Ｃについての上記説明がそのまま当てはまる。
これに加え、本開示に係るがんの治療方法Ｃにおける対象、がんの種類、用量、投与スケジュール等の、治療方法の詳細については、前述の本開示に係る医薬Ｃの説明がそのまま当てはまる。本開示に係る免疫応答性細胞Ｃは、治療有効量で投与することができる。
本開示に係るがんの治療方法Ｃは、免疫応答性細胞により発現されるがん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、ＩＬ－７、ＣＣＬ１９、及び免疫抑制阻害性ポリペプチドからなる因子の組み合わせによる相乗的な効果により、驚くべきほどに向上したがん治療効果を奏する。
さらに、本開示によれば、がんを治療するための医薬の製造における、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、インターロイキン７、ＣＣＬ１９、及び免疫抑制阻害性ポリペプチドを発現する免疫応答性細胞の使用が提供される。この使用においても、免疫応答性細胞、がんの治療等の詳細については、前述の本開示に係る医薬Ｃの説明がそのまま当てはまる。
加えて、本開示によれば、対象におけるがんを治療するために用いられる、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、インターロイキン７、ＣＣＬ１９、及び免疫抑制阻害性ポリペプチドを発現する免疫応答性細胞も提供される。
本開示に係る医薬Ｃは、本開示に係る組み合わせ医薬Ａの説明において記載したような容器に収容されていてもよい。医薬Ｃを収容した容器を含む製品も提供される。
以上説明したとおり、本開示に係る一態様によれば、る免疫応答性細胞により発現されるがん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、ＩＬ－７、ＣＣＬ１９、及び免疫抑制阻害性ペプチドの組み合わせによる相乗的な効果により、驚くべきほどに向上したがん治療効果を得ることができる。
以下、実施例に基づいて実施形態をさらに具体的に説明するが、本開示はこれにより何ら限定されるものではない。以下、特に断りのない限り、％及びｐｐｍはいずれも質量基準である。
［ＩＬ－７×ＣＣＬ１９発現ベクターの作製］
マウスＩＬ－７（ストップコドン無し）と、それに続くＦ２ＡとマウスＣＣＬ１９をコードするＩＬ－７－Ｆ２Ａ－ＣＣＬ１９ ＤＮＡ断片（配列番号９）を人工合成した。ＩＬ－７、ＣＣＬ１９及びｅＧＦＰを発現するベクターを作製するために、合成したＩＬ－７－Ｆ２Ａ－ＣＣＬ１９ ＤＮＡ断片を、Ｆ２Ａ－ｅＧＦＰ配列を有するｐＭＳＧＶレトロウイルス発現ベクター（Tamada k et al., Clin Cancer Res 18:6436-6445(2002)）のＭＣＳに、制限酵素（ＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩ）処理及びライゲーションにより挿入し、ＩＬ－７－Ｆ２Ａ－ＣＣＬ１９－Ｆ２Ａ－ｅＧＦＰ ＤＮＡ断片（配列番号１０）を含むｐＭＳＧＶベクター（７×１９発現ベクター）を得た。得られたベクターのマップを図１Ｂに示す。また、コントロールとしてｅＧＦＰを含み、ＩＬ－７及びＣＣＬ１９を含まないｐＭＳＧＶベクター（ｅＧＦＰ－Ｃｏｎｖ．ベクター）を作製した。ｅＧＦＰ－Ｃｏｎｖ．ベクターのマップを図１Ａに示す。なお、配列番号１０において、１～４６２番目の塩基がＩＬ－７（１～７５番目の塩基はＩＬ－７のシグナル配列）、４６３～５３７番目の塩基がＦ２Ａ、５３８～８６１番目の塩基がＣＣＬ１９（５３８～６１２番目の塩基はＣＣＬ１９のシグナル配列）、８６８～９４２がＦ２Ａ、９４６～１６６２番目の塩基がｅＧＦＰをコードする核酸、１６６３～１６６５番目の塩基がストップコドンである。また、上記配列番号１０の塩基配列に対応するアミノ酸配列を配列番号１１に示す。なお、制限酵素ＮｃｏＩを使用するため、配列番号１０における４番目の塩基はチミン（ｔ）からグアニン（ｇ）に（配列番号１１における２番目のアミノ酸はフェニルアラニン（Ｆ）からバリン（Ｖ）に）置換されている。
マウスＴ細胞の形質導入のために、レトロウイルスを作製した。リポフェクタミン３０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）を用い、上述の７×１９発現ベクター又はｅＧＦＰ－Ｃｏｎｖ．ベクターと、ｐＣＬ－Ｅｃｏプラスミド（Ｉｍｇｅｎｅｘ社製）をＧＰ２－２９３パッケージング細胞株（タカラバイオ社製）にトランスフェクションすることで、７×１９発現ベクター又はｅＧＦＰ－Ｃｏｎｖ．ベクターを導入したレトロウイルスを作製した。
前記ＧＰ２－２９３細胞の培養液としては、１０％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを加えたＤＭＥＭを用いた。また、後述の実施例で用いるＴ細胞の培養液としては、１０％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５０ｍＭの２－メルカプトエタノールを加えたＲＰＭＩ－１６４０を用いた。
［Ｐ８１５腫瘍抗原Ｐ１Ａを特異的に認識するＴＣＲ、ＩＬ－７、ＣＣＬ１９、及びｅＧＦＰを発現するＴ細胞の作製］
雌雄のＤＢＡ／２マウス（６～８週齢）を日本エスエルシー株式会社（静岡県）から購入して実験に用いた。Ｈ－２Ｌｄ拘束性のＰ８１５腫瘍抗原Ｐ１Ａを特異的に認識するＴＣＲを発現するトランスジェニックマウス（Sarma, S., Y. Guo, Y. Guilloux, C. Lee, X.-F. Bai, Y. Liu. 1999. J. Exp. Med. 189:811-820）をＤＢＡ／２マウスと少なくとも１０世代戻し交配した。全てのマウスは、病原体フリーな条件で維持した。
戻し交配後のＰ１Ａを特異的に認識するＴＣＲを発現するトランスジェニックマウスから脾臓細胞を採取し、脾臓細胞由来のＰ８１５腫瘍抗原Ｐ１Ａ特異的なＴＣＲを発現するマウスＴ細胞（Ｐ１Ａ特異的ＴＣＲ－Ｔ細胞；以下、ベクター未導入Ｐ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞とも称する）を得た。なお、ベクターの導入の有無に関わらず、Ｐ１Ａ特異的なＴＣＲを発現するマウスＴ細胞をＰ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞と総称する。形質導入のため、ベクター未導入Ｐ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞を、細胞活性化に適切な量のＰ１Ａペプチド（ＬＰＹＬＧＷＬＶＦ；配列番号１２）及びＩＬ－２の存在下で４８時間インキュベートして活性化した。４８時間のインキュベート後に、培養細胞を回収し、mouse Pan T cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany製)を用いてネガティブマグネティックソーティングによりベクター未導入Ｐ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞を濃縮した。単離したベクター未導入Ｐ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞を、２５μｇ／ｍｌのレトロネクチン（登録商標：タカラバイオ社製）でコートしたプレートに移した。上述で作製した７×１９発現ベクター又はｅＧＦＰ－Ｃｏｎｖ．ベクターを導入したレトロウイルスを含有する上清を、前記プレート上で活性化された上述のベクター未導入Ｐ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞（１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）の存在下で混合し、１５００ｒｐｍで２時間遠心後、６時間培養した。培養液からレトロウイルスを除去するため、Ｔ細胞を回収し、洗浄し、ＩＬ－２を含有する新しい増殖培養液（ＲＰＭＩ－１６４０）に移し、さらに２日間培養し、７×１９発現ベクターを導入したＰ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞（以下、ｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞とも称する）を含むＰ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞の集団、又はｅＧＦＰ－Ｃｏｎｖ．ベクターを導入したＰ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞（以下、ｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞とも称する）を含むＰ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞の集団を得た。各発現ベクターの形質導入はサロゲートマーカーとしてｅＧＦＰを検出するフローサイトメトリー解析によって確認した。上記のとおり、ｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞及びｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞は、それぞれのＰ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞集団の全体を占めているわけではないが、本明細書中では、記載の簡略化のため、特に明記が無い限りは、当該細胞集団に対する処理を、ｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞又はｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞に対する処理として記載する。
［遺伝子導入の確認］
（フローサイトメトリー解析）
ｅＧＦＰ及びＣＤ８の発現レベルは２色フローサイトメトリー解析によって行った。レトロウイルスによる遺伝子の導入を行っていないベクター未導入Ｐ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞、ｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞、及びｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞をアロフィコシアニン（ＡＰＣ）結合抗ＣＤ８モノクローナル抗体（５３－６．７、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）の存在下で培養した。フローサイトメトリーはＥＣ８００（ソニー株式会社製）又はＢＤ ＬＳＲＦｏｒｅｔｅｓｓａ Ｘ－２０（ＢＤバイオサイエンス社製）を用い、データ解析はＦｌｏｗＪｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ社製）を用いた。
結果を図２に散布図として示す。図２、図３Ａ及び図３Ｂ中、「Transduction(-)」は遺伝子導入を行わなかったＰ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞（ベクター未導入Ｐ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞）を表し、「Conv. P1A-T cells」はｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞を表し、「7×19 P1A-T cells」はｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞を表す。また、図２中に記載されたパーセントの値は、各領域に存在する細胞数の割合を示している。
図２に示すように、ｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞及びｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞においては、ｅＧＦＰを発現しているＴ細胞が７０％～８０％程度観察され、７×１９発現ベクター又はｅＧＦＰ－Ｃｏｎｖ．ベクターが成功裏に導入できたことが分かる。
（ＥＬＩＳＡによる解析）
上記でｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞又はｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞を２日間培養した培養上清を回収し、培養上清中のＩＬ－７及びＣＣＬ１９の濃度を市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて測定した。結果を図３Ａ及び図３Ｂに示す。３連のウエルの平均値と共に標準偏差もグラフには示した。グラフ中の「Ｎ．Ｄ．」は検出されなかったことを示し、「＊＊＊」はＰ値がＰ＜０．００１であることを示す。図３Ａ及び図３Ｂに示されるように、ｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞では、ＩＬ－７及びＣＣＬ１９の発現が確認された。
（担がんマウスへの投与による抗がん効果の解析）
０日目に、６～８週齢の雌雄のＤＢＡ／２マウスに０．１ｍｌのＨＢＳＳで懸濁した５×１０５個のＰ８１５マストサイトーマ（肥満細胞腫）を側腹に皮下接種した。なお、Ｐ８１５マストサイトーマは、ＤＢＡ／２マウスにシンジェニックであり、以降、単にＰ８１５細胞、Ｐ８１５腫瘍細胞とも称する。６日目に、マウスをプレコンディショニングのために亜致死量（３－５Ｇｙ）の照射を行った。７日目に、マウスを６つの群に分けて、第１群及び第２群にはｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞を１×１０６個静脈に投与し、第３群及び第４群にはｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞を１×１０６個静脈に投与し、第５群及び第６群にはＴ細胞の投与を行わなかった（なお、上記のとおり、記載された細胞数は、ｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞又はｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞を含むＰ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞集団中のＴ細胞の全数である）。また、第２群、第４群及び第６群のマウスについては、さらに、１０日目を初回として週１回の頻度で計６回抗ＰＤ－１モノクローナル抗体（メルク社製、クローンＧ４；以下に記載の抗ＰＤ－１モノクローナル抗体についても同様）を１００μｇ／個体の量で腹腔内注入した。それぞれのマウスの生存率を解析すると共にマウスの腫瘍体積を週２回測定した。腫瘍体積はデジタルカリパーで測定し、
腫瘍体積＝１／２×（腫瘍の長軸長）×（腫瘍の短軸長）２
として求めた。それぞれのマウスの生存率の解析結果を図４に、腫瘍体積を測定した結果を図５Ａ～５Ｆに示す。データは独立した５回の実験をプールしたものである。
図４及び図５Ａ～５Ｆにおいて、□は未投与マウス（サンプルサイズ＝１５匹；上記第５群）、■は抗ＰＤ－１モノクローナル抗体のみを投与したマウス（サンプルサイズ＝１１匹；上記第６群）、△はｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞を投与したマウス（サンプルサイズ＝１７匹；上記第３群）、▲はｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞に加えて抗ＰＤ－１モノクローナル抗体も投与したマウス（サンプルサイズ＝１４匹；上記第４群）、○はｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞を投与したマウス（サンプルサイズ＝２４匹；上記第１群）、●はｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞に加えて抗ＰＤ－１モノクローナル抗体も投与したマウス（サンプルサイズ＝１９匹；上記第２群）を表す。図４及び図５Ａ～５Ｆにおいて、横軸は、Ｐ８１５マストサイトーマを皮下接種してからの日数（ｄａｙ）を表す。また、図５Ａ～５Ｆには、各群におけるマウスの全個体数（分母）に対する腫瘍拒絶マウスの個体数（分子）も記載した。ログランク検定におけるＰ値は、△群と○群の間でＰ＝０．０００５、▲群と●群の間でＰ＝０．０００２、△群と▲群との間でＰ＝０．７２８４、○群と●群との間でＰ＝０．０２５３であった。
図４及び図５Ａ～５Ｆに示された結果から、ｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞に加えて抗ＰＤ－１モノクローナル抗体も投与したマウス（●）では、ｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞を投与したマウス（○）又はｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞に加えて抗ＰＤ－１モノクローナル抗体も投与したマウス（▲）では達成できないレベルの生存率の上昇及び固形がんの腫瘍体積増加の抑制を達成できたことが分かる。一方、ｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞と抗ＰＤ－１モノクローナル抗体を投与したマウス（▲）では、高い相乗効果は見られなかった。
（ＰＤ－１又はＲＯＳＡ２６を破壊したＰ１Ａ－ＴＣＲＴの作製）
遺伝子編集のため、上記と同様に細胞活性化に適切な量のベクター未導入Ｐ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞をＰ１Ａペプチド（ＬＰＹＬＧＷＬＶＦ；配列番号１２）及びＩＬ－２の存在下で４８時間インキュベートして活性化した。４８時間のインキュベート後に、培養細胞を回収し、mouse Pan T cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)を用いてネガティブマグネティックソーティングによりベクター未導入Ｐ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞を濃縮した。得られたＴ細胞をＰＢＳで洗浄し、Buffer R（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）に再懸濁して、TrueCut（登録商標）Ｃａｓ９タンパク質ｖ２（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）及び遺伝子特異的ガイドＲＮＡから構成されるＣａｓ９－ＲＮＰ複合体と混合した。Ｃａｓ９－ＲＮＰ複合体をNeon Transfection System（Invitrogen社製）を用いてＴ細胞にエレクトロポレーションにより導入した。これにより目的の遺伝子の破壊を行った。さらに、エレクトロポレーション直後に、Ｔ細胞をＩＬ－２含有ｃＲＰＭＩに再懸濁し、上記と同様に７×１９発現ベクターをレトロウイルスにパッケージングしてＴ細胞に導入した。なお、マウスＰＤ－１を標的とするガイドＲＮＡは、Okada M, et al. Blockage of Core Fucosylation Reduces Cell-Surface Expression of PD-1 and Promotes Anti-tumor Immune Responses of T Cells. Cell Rep. 2017;20(5):1017-1028を参照して設計し、ガイドＲＮＡ部分の配列は5’-UCUGGGCAUGUGGGUCCGGC-3’（配列番号１３）であった。また、ガイドＲＮＡの合成はサーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社に委託して行った。コントロールとしてガイドＲＮＡをＲＯＳＡ２６を標的とする5’-CUCCAGUCUUUCUAGAAGAU-3’（配列番号１４）に変えてマウスＲＯＳＡ２６の破壊を行った。ＲＯＳＡ２６を標的とするガイドＲＮＡはサーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社から購入した。
（ＰＤ－１又はＲＯＳＡ２６を破壊したＰ１Ａ－ＴＣＲＴの投与実験）
０日目に、６～８週齢の雌雄のＤＢＡ／２マウスに０．１ｍｌのＨＢＳＳで懸濁した５×１０５個のＰ８１５マストサイトーマ（肥満細胞腫）を側腹に皮下接種した。６日目に、マウスをプレコンディショニングのために亜致死量（３－５Ｇｙ）の照射を行った。マウスを４つの群に分けて、７日目以降にそれぞれ以下の処置を行った。
第１群：Ｔ細胞の投与も抗体の投与も行わなかった。
第２群：７日目に、ＲＯＳＡ２６をノックダウンしたｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞を１×１０６個静脈に投与した。
第３群：７日目に、ＰＤ－１をノックダウンしたｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞を含む細胞集団を１×１０６個静脈に投与した。
第４群：７日目に、ＰＤ－１をノックダウンしたｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞を含む細胞集団を１×１０６個静脈に投与し、さらに、１０日目を初回として週１回の頻度で計６回抗ＰＤ－１モノクローナル抗体を１００μｇ／個体の量で腹腔内注入した。
なお、上記のとおり、記載された細胞数は、ｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞を含むＰ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞集団中のＴ細胞の全数である。
その後、それぞれのマウスの生存率を解析すると共にマウスの腫瘍体積を上記のデジタルカリパーを用いた手法により週２回測定した。それぞれのマウスの生存率の解析結果を図６Ａに、腫瘍体積を測定した結果を図６Ｂ～６Ｅに示す。なお、サンプルサイズはどの群もＮ＝６である。
図６Ａ～６Ｅにおいて、×は未投与マウス（上記第１群）、□はＲＯＳＡ２６領域をノックダウンしたｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞を投与したマウス（上記第２群）、◇は、ＰＤ－１をノックダウンしたｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞を投与したマウス（上記第３群）、◆は、ＰＤ－１をノックダウンしたｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞に加えて抗ＰＤ－１モノクローナル抗体も投与したマウス（上記第４群）を表す。
図６Ａ～６Ｅにおいて、横軸は、Ｐ８１５マストサイトーマを皮下接種してからの日数（ｄａｙ）を表す。また、図６Ｂ～６Ｅには、各群におけるマウスの全個体数（分母）に対する腫瘍拒絶マウスの個体数（分子）も記載した。ログランク検定におけるＰ値は、×群と○群との間でＰ＝０．０４５４、□群と◇群の間でＰ＝０．０４３１、◇群と◆群の間でＰ＝０．０４０２であった。
図６Ａ～６Ｅに示された結果から、ｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞に加えて抗ＰＤ－１モノクローナル抗体も投与したマウスにより得られるがん治療効果は、ｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞において単にＰＤ－１をノックダウンした場合に比べてはるかに高いものであることが分かる。このことは、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体の投与が、単にｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞の免疫応答を促進しているだけでなく、ｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞によってがん細胞周辺に誘導された内因性の免疫細胞の働きも促進していることを示している。
（マウス脾臓におけるＰ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞の維持）
０日目に、６～８週齢の雌雄のＤＢＡ／２マウスに０．１ｍｌのＨＢＳＳで懸濁した５×１０５個のＰ８１５マストサイトーマ（肥満細胞腫）を側腹に皮下接種した。６日目に、マウスをプレコンディショニングのために亜致死量（３－５Ｇｙ）の照射を行った。７日目に、マウスを２つの群に分けて、１つ目の群にはｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞を１×１０６個静脈に投与し、２つ目の群にはｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞を１×１０６個静脈に投与した。腫瘍が完全に退縮したマウス個体を１１９日目に安楽死させ、脾臓細胞を収集し、計数し、フローサイトメトリーで解析し、脾臓におけるＰ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞の維持について評価した。さらに、脾臓細胞からマグネティックソーティング法を用いてＴ細胞を単離し、２×１０６個のＴ細胞をマイトマイシンＣで処理した１×１０６個のＰ８１５細胞と共にインキュベートした。３日後及び５日後に、培養上清を回収しＥＬＩＳＡによりＩＦＮ－γの濃度を測定した。また、Ｐ８１５細胞との培養期間中におけるＰ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞の数（１ウエル当たり）をフローサイトメトリーで測定した。これらの試験により、脾臓におけるＰ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞の機能について評価した。
サンプルサイズは、ｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞を投与した群については５匹、ｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞を投与した群については２匹である。
収集された脾臓細胞について図２に示した実験と同様のフローサイトメトリー（ただし、ゲートは４分割ゲートからＣＤ８－ｅＧＦＰ＋ゲートとＣＤ８＋ｅＧＦＰ＋ゲートを含むカスタムゲートに変更）により、ＣＤ８とｅＧＦＰの発現について測定した結果を図７に示す。また、脾臓細胞中におけるＣＤ８を発現せずｅＧＦＰを発現している細胞（ＣＤ８－ｅＧＦＰ＋細胞）の割合の平均値を図８Ａに白抜きのバーで、細胞数の平均値を図８Ｂに白抜きのバーで示す。また、脾臓細胞中におけるＣＤ８とｅＧＦＰのどちらも発現している細胞（ＣＤ８＋ｅＧＦＰ＋細胞）の割合の平均値を図８Ａに黒塗りのバーで、細胞数の平均値を図８Ｂに黒塗りのバーで示す。図８Ａ及び図８Ｂにおいて、「Conv. P1A-T cells」のデータは値が小さいためにほとんど見えないが、白抜きのバーが黒塗りのバーの左側に位置している。図７、図８Ａ及び図８Ｂにおいて、「Conv. P1A-T cells」はｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞を投与した群を表し、「7×19 P1A-T cells」はｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞を投与した群を表す。図７、図８Ａ及び図８Ｂに示された結果から、ｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞を投与した群では、１１９日目のマウスにおいても、導入された遺伝子を保持するＰ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞が維持されていることが分かる。なお、図７中に記載されたパーセントの値は、ＣＤ８を発現せずｅＧＦＰを発現している細胞（ＣＤ８－ｅＧＦＰ＋細胞）数の割合（ｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞を投与した群において０．０５５％、ｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞を投与した群において０．９７％）及びＣＤ８とｅＧＦＰのどちらも発現している細胞（ＣＤ８＋ｅＧＦＰ＋細胞）数の割合（ｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞を投与した群において０．００６８％、ｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞を投与した群において０．４７％）を示している。
さらに、Ｐ８１５細胞との培養期間中におけるＣＤ８とｅＧＦＰのどちらも発現しているＰ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞の数（１ウエル当たり）をフローサイトメトリーで測定した結果を図８Ｃに示す。また、培養上清をＥＬＩＳＡで測定して得たＩＦＮ－γの濃度を図８Ｄに示す。図８Ｃ及び図８Ｄにおいて、ｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞を投与した群における結果を各時点における左側のバー（白抜きのバー）で表し、ｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞を投与した群を各時点における右側のバー（黒塗りのバー）で表す。ただし、図８Ｃにおいて、ｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞を投与した群における結果を表す左側のバーは横軸と重なっている（つまり、ＣＤ８とｅＧＦＰのどちらも発現しているＰ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞の数がほぼ０である）ため、実際には見えない。図８Ｃ及び図８Ｄにおいて、結果は、平均値及び標準偏差により示し、「＊」はＰ値がＰ＜０．０５であることを、「＊＊」はＰ＜０．０１であることを表す。
図８Ｃ及び図８Ｄに示された結果から、１１９日目のマウスにおいても、導入された遺伝子を保持するＰ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞の機能が保持されていることが分かる。
（がん細胞によるリチャレンジ実験）
０日目に、６～８週齢の雌雄のＤＢＡ／２マウスに０．１ｍｌのＨＢＳＳで懸濁した５×１０５個のＰ８１５細胞を側腹に皮下接種した。６日目に、マウスをプレコンディショニングのために亜致死量（３－５Ｇｙ）の照射を行った。７日目に、ｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞を１×１０６個静脈に投与した（なお、上記のとおり、記載された細胞数は、ｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞を含むＰ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞集団におけるＴ細胞の全数である）。さらに、１０日目を初回として週１回の頻度で計６回抗ＰＤ－１モノクローナル抗体を１００μｇ／個体の量で腹腔内注入した。腫瘍が完全に退縮した４匹のマウスに対し、１１７日目に、０．１ｍｌのＨＢＳＳで懸濁した５×１０５個のＰ８１５マストサイトーマ（肥満細胞腫）を側腹に再度皮下接種した。さらに、コントロールとして、６匹のナイーブＤＢＡ／２マウスに０．１ｍｌのＨＢＳＳで懸濁した５×１０５個のＰ８１５マストサイトーマ（肥満細胞腫）を側腹に皮下接種した。腫瘍が完全に退縮したマウスに対するＰ８１５細胞の再接種の日、又はナイーブＤＢＡ／２マウスへのＰ８１５細胞の接種の日を０日として、マウスの腫瘍体積を測定した結果を２０日目まで経過日数と共に図９に示す。マウスの腫瘍体積は、図５Ａ～５Ｆについて記載したとおりデジタルカリパーで測定したが、本実験では平均値及び標準偏差により示す。
図９において、×はナイーブＤＢＡ／２マウスへのＰ８１５細胞の接種の結果を示し、●は腫瘍が完全に退縮したマウスに対するＰ８１５細胞の再接種の結果を示す。
図９に示された結果から分かるように、ｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞と抗ＰＤ－１モノクローナル抗体との投与により治癒したマウスは、１１７日目においても、がん細胞に対する抵抗力を保持していることが分かる。
［ＩＬ－７及びＣＣＬ１９を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞の作製］
国際公開第２０１６／５６２２８号の段落００６１～段落００６６に記載の方法により、コントロール抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲベクター及びＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現－抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲベクターを作製し、ＤＢＡ／２マウスの脾臓及びリンパ節由来の３×１０６個の精製したマウスＴ細胞に導入して抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞又は抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ発現Ｔ細胞を作製した。コントロール抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲベクターは、抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲをコードする核酸を含むベクターであり、ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現－抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲベクターは、抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－Ｆ２Ａ－ＩＬ－７－Ｆ２Ａ－ＣＣＬ１９をこの順でコードする核酸を含むベクターである。
（担がんマウスへの投与による抗がん効果の解析）
０日目に、６～１２週齢の雄ＤＢＡ／２マウスに０．１ｍｌのＨＢＳＳで懸濁した５×１０５個のＰ８１５－ｈＣＤ２０腫瘍細胞（Nat Biotechnol. 2018;36(4):346-351参照）を側腹に皮下接種した。１１日目に、抗がん剤であるシクロホスファミド（ＣＰＡ、１００ｍｇ／ｋｇ）をマウスの腹腔内に投与した。マウスを５つの群に分けて、以降の処理を以下のとおり行った。
第１群には、ＣＡＲ発現Ｔ細胞も抗体も投与しなかった。
第２群には、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体を、１７日目を初日として４～５日毎に計５回腹腔内投与した。
第３群には、０．２５×１０６個の抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ発現Ｔ細胞を１４日目に静脈に投与し、１７日目を初日として４～５日毎に計５回抗ＰＤ－１モノクローナル抗体を１００μｇ／個体の量で腹腔内投与した。
第４群には、０．２５×１０６個の抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を１４日目に静脈に投与し、１７日目を初日として４～５日毎に計５回ＰＤ－１を認識しないハムスターコントロールＩｇＧ抗体を１００μｇ／個体の量で腹腔内投与した。
第５群には、０．２５×１０６個の抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を１４日目に静脈に投与し、１７日目を初日として４～５日毎に計５回抗ＰＤ－１モノクローナル抗体を１００μｇ／個体の量で腹腔内投与した。
それぞれのマウスの生存率を解析すると共にマウスの腫瘍体積を上記のデジタルカリパーを用いた手法により週２回測定した。それぞれのマウスの生存率の解析結果を図１０Ａに、７０日目までの腫瘍体積を測定した結果を図１０Ｂ～１０Ｆに示す。データは独立した２回の実験の結果をプールしたデータを示したものである。
図１０Ａ～１０Ｆにおいて、×は未投与マウス（サンプルサイズ＝１０匹；上記第１群）、□は抗ＰＤ－１モノクローナル抗体のみを投与したマウス（サンプルサイズ＝１０匹；上記第２群）、◆は抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ発現Ｔ細胞に加えて抗ＰＤ－１モノクローナル抗体も投与したマウス（サンプルサイズ＝５匹；上記第３群）、○は抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞に加えてＰＤ－１を認識しないハムスターコントロールＩｇＧ抗体も投与したマウス（サンプルサイズ＝１０匹；上記第４群）、●は抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞に加えて抗ＰＤ－１モノクローナル抗体も投与したマウス（サンプルサイズ＝１０匹；上記第５群）を表す。ただし、図１０Ｂ～１０Ｆにおいてはいずれの群もＮ＝５である。図１０Ａ～１０Ｆにおいて、横軸は、Ｐ８１５－ｈＣＤ２０腫瘍細胞を皮下接種してからの日数（ｄａｙ）を表す。また、図１０Ｂ～１０Ｆには、各群におけるマウスの全個体数（分母）に対する腫瘍拒絶マウスの個体数（分子）も記載した。ログランク検定におけるＰ値は、□群と◆群の間でＰ＝０．７２９３、□群と●群の間でＰ＜０．０００１、◆群と●群との間でＰ＜０．０００１、○群と●群との間でＰ＜０．０００１であった。
図１０Ａ～１０Ｆに示された結果から、抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞に加えて抗ＰＤ－１モノクローナル抗体も投与したマウス（●）では、それぞれ単独で投与した場合には十分な抗がん効果が得られない用量を投与した場合であっても、著しく高い生存率及び固形がんの腫瘍体積増加の抑制を達成することができた。一方、抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ発現Ｔ細胞に加えて抗ＰＤ－１モノクローナル抗体も投与したマウス（▲）又は抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞に加えてコントロールＩｇＧ抗体も投与したマウス（○）ではこのような効果は得られなかった。
また、抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ発現Ｔ細胞の投与量は、上記のとおり０．２５×１０６個と少なく、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体との共投与の場合には少ない細胞数であっても高い効果が得られたことが分かった。
（リンパ球の腫瘍組織への浸潤の解析）
０日目に、ＤＢＡ／２マウスにＰ８１５腫瘍細胞を接種し、ｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞又はｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞を７日目に静脈注射した。なお、これらの細胞は、注射前に、ｅＧＦＰ陽性細胞の割合が９５％超となるまで純度を上げておいた。腫瘍細胞を採取し、シングル細胞懸濁液へと調製し、１２日目に、細胞数を計測すると共に、ｃ－ｋｉｔ、ｅＧＦＰ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ８の発現についてフローサイトメトリー解析により調べた。図１１Ａには、代表的なドットプロットを示す。非腫瘍細胞と同定されたｃ－ｋｉｔ陰性細胞の割合（左上のパネル）、ｃ－ｋｉｔ陰性細胞集団における、ＣＤ－３陰性／ＣＤ１１ｃ陽性である樹状細胞の割合（右上のパネル）、並びにＣＤ－３陽性／ｅＧＦＰ陰性である内在性Ｔ細胞の割合及びＣＤ３－陽性／ｅＧＦＰ陽性である注射されたＰ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞の割合を示す（中央のパネル）。図１１Ａにおいて、「Conv. P1A-T cells」はｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞を投与した群を表し、「7×19 P1A-T cells」はｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞を投与した群を表す。内在性Ｔ細胞集団におけるＣＤ－４陽性細胞又はＣＤ８陽性細胞の割合（左下のパネル）及び注射されたＰ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞の割合を示す（右下のパネル）。図１１Ｂには、Ｐ８１５腫瘍細胞１×１０５個あたりの各種腫瘍浸潤リンパ球の細胞数を、平均値及び標準偏差（ＳＤ）により示す（ｎ＝５）。ＤＣは樹状細胞を表し、Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｔは内在性Ｔ細胞を表し、Ｐ１Ａ－ＴはＰ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞を表す。白抜きのバーは、ｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞で処理されたマウス中における腫瘍浸潤リンパ球サブセットを示し、黒塗りのバーはｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞で処理されたマウス中における腫瘍浸潤リンパ球サブセットを示す。＊はＰ＜０．０５を表し、＊＊はＰ＜０．０１を表し、＊＊＊はＰ＜０．００１を表す。
なお、Ｐ８１５腫瘍細胞から腫瘍浸潤リンパ球を分離するために、Ｐ８１５マストサイトーマで高度に陽性であり、樹状細胞及びＴ細胞では陽性度の低いことが知られているｃ－ｋｉｔ染色を用いた。図１１Ａ及び図１１Ｂの結果からは、まず、ｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞を注射されたマウスにおけるｃ－ｋｉｔ陰性の腫瘍浸潤リンパ球の割合は、ｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞を注射されたマウスにおけるｃ－ｋｉｔ陰性の腫瘍浸潤リンパ球の割合よりも高いことが分かる。ｃ－ｋｉｔ陰性腫瘍浸潤リンパ球のサブセットにおいて、ＣＤ３陰性／ＣＤ１１ｃ陽性である樹状細胞の割合も図１１Ａに示す。図１１Ａにはさらに、ＣＤ３陽性／ｅＧＦＰ陰性である内在性Ｔ細胞のサブセット、及びＣＤ３陽性／ｅＧＦＰ陽性の注射されたＰ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞若しくはＰ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞のサブセットにおけるＣＤ４及びＣＤ８の発現割合も示す。ＣＤ４／ＣＤ８染色についてのさらなる解析により、ｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞で処理されたマウス中における腫瘍浸潤樹状細胞、ＣＤ－４陽性及びＣＤ８陽性内在性Ｔ細胞、並びにＣＤ８陽性Ｐ１Ａ－Ｔ細胞の数は、ｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞で処理されたマウス中におけるそれらの数よりも顕著に多かった。このことは図１１Ｂに示される。図１１Ｂにおいて白抜きのバー（ｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞で処理されたマウス中における腫瘍浸潤リンパ球サブセット）と比べて黒塗りのバー（ｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞で処理されたマウス中における腫瘍浸潤リンパ球サブセット）において、ＤＣ（樹状細胞）、ＥｎｇｏｇｅｎｏｕｓＴ（内在性Ｔ細胞）、及び注射されたＰ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞若しくはＰ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞のいずれについても細胞数が多いことが示されている。これらの結果は、ｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞による処理における内在性Ｔ細胞の役割が重要であることを裏付けるものである。このことは、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体とｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－ＴＣＲＴ細胞ではなく、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体とｅＧＦＰ発現Ｐ１Ａ－７×１９ＴＣＲＴ細胞との組み合わせにより相乗的な効果が得られたことと合致している。
（抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－抗ＰＤ－１抗体発現ベクターの作製）
配列番号１５の核酸配列を有する構築物を、ＮｃｏＩサイト及びＳａｌＩサイトを用いてｐＭＳＧＶレトロウイルス発現ベクター（Tamada k et al., Clin Cancer Res 18:6436-6445(2002)）に導入して抗ｈＣＤ２０ｓｃＦｖ ＣＡＲ及び抗ｍＰＤ－１ｓｃＦｖを含むｐＭＳＧＶベクター（以降、抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－抗ＰＤ－１抗体発現ベクターとも称する）を作製した。得られたベクターの配置図をconventional ＣＡＲ－ＰＤ－１ ｓｃＦｖとして図１２に示す。配列番号１５の核酸配列において、５’末端から数えて、１番目～５７番目のヌクレオチドはリーダー配列をコードする核酸配列に相当し、５８番目～３７５番目のヌクレオチドは抗ｈＣＤ２０ｓｃＦｖ軽鎖をコードする核酸配列に相当し、３７６番目～４２０番目のヌクレオチドはリンカーをコードする核酸配列に相当し、４２１番目～７８３番目のヌクレオチドは抗ｈＣＤ２０ｓｃＦｖ重鎖をコードする核酸配列に相当し、７９３番目～１６３５番目のヌクレオチドは膜通過ドメイン及び細胞質ドメインをコードする核酸配列に相当し、１６４２番目のヌクレオチド～１７１６番目のヌクレオチドは２Ａペプチドをコードする核酸配列に相当し、１７１７番目～１７７３番目のヌクレオチドはリーダー配列をコードする核酸配列に相当し、１７７４番目～２１０６番目のヌクレオチドは抗ｍＰＤ－１ｓｃＦｖ軽鎖をコードする核酸配列に相当し、２１０７番目～２１５１番目のヌクレオチドはリンカー配列をコードする核酸配列に相当し、２１５２番目～２５０５番目のヌクレオチドは抗ｍＰＤ－１ｓｃＦｖ重鎖をコードする核酸配列に相当し、２５０６番目～２５２９番目のヌクレオチドはＦＬＡＧタグをコードする核酸配列に相当し、２５３９番目～２５５６番目のヌクレオチドはＨｉｓタグをコードする核酸配列に相当する。なお、抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－抗ＰＤ－１抗体発現ベクター及び後述の抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９－抗ＰＤ－１抗体発現ベクターにおいて、２Ａペプチドとしては、口蹄疫ウイルスの２Ａペプチド（Ｆ２Ａペプチドとも称する）を用いた。２Ａペプチドを遺伝子間に挿入することで、複数のポリペプチドを同時に発現することを可能にしている。また、上記のとおり、抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－抗ＰＤ－１抗体発現ベクター及び後述の抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９－抗ＰＤ－１抗体発現ベクターは、ＦＬＡＧタグ及びＨｉｓタグ（Ｈｉｓ×６）の配列を含んでいる。
配列番号１５の核酸配列がコードするアミノ酸配列を配列番号１６に示す。配列番号１６において、Ｎ末端から数えて、１～５４５位のアミノ酸配列は抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲのアミノ酸配列であり、５４８～５７２位のアミノ酸配列は２Ａペプチドのアミノ酸配列であり、５９２～７０２位のアミノ酸配列は、抗ｍＰＤ－１ ＶＬのアミノ酸配列であり、７０３～７１７位のアミノ酸配列はリンカーのアミノ酸配列であり、７１８～８３５位のアミノ酸配列は抗ｍＰＤ－１ ＶＨのアミノ酸配列であり、８３６～８４３位のアミノ酸配列はＦＬＡＧタグのアミノ酸配列であり、８４７～８５２位のアミノ酸配列はＨｉｓタグのアミノ酸配列である。
（抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９－抗ＰＤ－１抗体発現ベクターの作製）
配列番号１７の核酸配列を有する構築物を、ＮｃｏＩサイト及びＳａｌＩサイトを用いてｐＭＳＧＶレトロウイルス発現ベクター（Tamada k et al., Clin Cancer Res 18:6436-6445(2002)）に導入して抗ｈＣＤ２０ｓｃＦｖ ＣＡＲ、ｍＩＬ－７、ｍＣＣＬ１９、及び抗ｍＰＤ－１ｓｃＦｖを含むｐＭＳＧＶベクターを作製した（以降、抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９－抗ＰＤ－１抗体発現ベクターとも称する）。得られたベクターの配置図を図１２に７×１９ＣＡＲ－ＰＤ－１ ｓｃＦｖとして示す。配列番号１７の核酸配列において、５’末端から数えて、１番目～５７番目のヌクレオチドはリーダー配列をコードする核酸配列に相当し、５８番目～３７５番目のヌクレオチドは抗ｈＣＤ２０ｓｃＦｖ軽鎖をコードする核酸配列に相当し、３７６番目～４２０番目のヌクレオチドはリンカーをコードする核酸配列に相当し、４２１番目～７８３番目のヌクレオチドは抗ｈＣＤ２０ｓｃＦｖ重鎖をコードする核酸配列に相当し、７９２番目～１０３８番目のヌクレオチドはマウスＣＤ８をコードする核酸配列に相当し、１０３９番目～１１６１番目のヌクレオチドはマウスＣＤ２８をコードする核酸配列に相当し、１１６２番目～１２９６番目のヌクレオチドはマウス４－１ＢＢをコードする核酸配列に相当し、１２９７番目～１６３５番目のヌクレオチドはマウスＣＤ３ζをコードする核酸配列に相当し、１６４２番目～１７１６番目のヌクレオチドは２Ａペプチドをコードする核酸配列に相当し、１７２０番目～１７９４番目のヌクレオチドはｍＩＬ－７のリーダー配列をコードする核酸配列に相当し、１７２０番目～２１８１番目のヌクレオチドはｍＩＬ－７をコードする核酸配列に相当し、２１８２番目～２２５６番目のヌクレオチドは２Ａペプチドをコードする核酸配列に相当し、２２５７番目～２３３１番目のアミノ酸配列はｍＣＣＬ１９のリーダー配列をコードするアミノ酸配列に相当し、２２５７番目～２５８０番目のヌクレオチドはｍＣＣＬ１９をコードする核酸配列に相当し、２５８４番目～２６５８番目のヌクレオチドは２Ａペプチドをコードする核酸配列に相当し、２６５９番目～２７１５番目のヌクレオチドはリーダー配列をコードする核酸配列に相当し、２７１６番目～３０４８番目のヌクレオチドは抗ｍＰＤ－１ｓｃＦｖ軽鎖をコードする核酸配列に相当し、３０４９番目～３０９３番目のヌクレオチドはリンカー配列をコードする核酸配列に相当し、３０９４番目～３４４７番目のヌクレオチドは抗ｍＰＤ－１ｓｃＦｖ重鎖をコードする核酸配列に相当し、３４４８番目～３４７１番目のヌクレオチドはＦＬＡＧタグをコードする核酸配列に相当し、３４８０番目～３４９７番目のヌクレオチドはＨｉｓタグをコードする核酸配列に相当する。
配列番号１７の核酸配列がコードするアミノ酸配列を配列番号１８に示す。配列番号１８において、Ｎ末端から数えて、１～２６１位のアミノ酸配列は抗ｈＣＤ２０ ｓｃＦｖのアミノ酸配列であり、２６５～３４６位の配列はｍＣＤ８のアミノ酸配列であり、３４７～３８７位のアミノ酸配列はｍＣＤ２８のアミノ酸配列であり、３８８～４３２位のアミノ酸配列はｍ４－１ＢＢのアミノ酸配列であり、４３３～５４５位のアミノ酸配列はｍＣＤ３のアミノ酸配列であり、５４８～５７２位のアミノ酸配列は２Ａペプチドのアミノ酸配列であり、５７４～７２７位のアミノ酸配列はｍＩＬ－７のアミノ酸配列であり、７２８～７５２位のアミノ酸配列は２Ａペプチドのアミノ酸配列であり、７５３～８６０位のアミノ酸配列はｍＣＣＬ１９のアミノ酸配列であり、８６２～８８６位のアミノ酸配列は２Ａペプチドのアミノ酸配列であり、９０６～１０１６位のアミノ酸配列は、抗ｍＰＤ－１ ＶＬのアミノ酸配列であり、１０１７～１０３１位のアミノ酸配列はリンカーのアミノ酸配列であり、１０３２～１１４９位のアミノ酸配列は抗ｍＰＤ－１ ＶＨのアミノ酸配列であり、１１５０～１１５７位のアミノ酸配列はＦＬＡＧタグのアミノ酸配列であり、１１６１～１１６６位のアミノ酸配列はＨｉｓタグのアミノ酸配列である。
（抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－抗ＰＤ－１抗体発現ベクター、又は抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９－抗ＰＤ－１抗体発現ベクターを導入したレトロウイルスの作製）
マウスＴ細胞の形質導入のために、レトロウイルスベクターを作製した。ＧＰ２－２９３パッケージング細胞（タカラバイオ社製）に、リポフェクタミン（登録商標）２０００又は３０００（ライフテクノロジー社製）を用い、上述の抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－抗ＰＤ－１抗体発現ベクター又は抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９－抗ＰＤ－１抗体発現ベクターと、ｐＣＬ－Ｅｃｏレトロウイルスパッケージングプラスミド（Ｉｍｇｅｎｅｘ社製）をトランスフェクションし、抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－抗ＰＤ－１抗体発現ベクター又は抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９－抗ＰＤ－１抗体発現ベクターを導入したレトロウイルスを作製した。トランスフェクションから４８時間後に前記レトロウイルスを含有する上清を回収した。
前記ＧＰ２－２９３細胞の培養液としては、１０％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを加えたＤＭＥＭを用いた。また、後述の実施例で用いるＴ細胞の培養液としては、１０％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５０ｍＭの２－メルカプトエタノール、２ｍＭのＬ－グルタミンを加えたＲＰＭＩ－１６４０を用いた。
また、同様にして、抗ＰＤ－１ ｓｃＦｖをコードする核酸配列を含まないこと以外は抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－抗ＰＤ－１抗体発現ベクターと同様の発現ベクター（以下、抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ発現ベクターとも称する）、及び、抗ＰＤ－１ ｓｃＦｖをコードする核酸配列を含まないこと以外は抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９－抗ＰＤ－１抗体発現ベクターと同様の発現ベクター（以下、抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現ベクターとも称する）も作製し、それを用いてレトロウイルスベクターを同様に作製した。
（マウスＴ細胞の形質導入）
マウスＴ細胞の形質導入のため、脾臓及びリンパ節由来の精製したマウスＴ細胞を、固層化した抗ＣＤ３モノクローナル抗体（３μｇ／ｍｌ）、抗ＣＤ２８モノクローナル抗体（１μｇ／ｍｌ）、ＩＬ－２（１００ＩＵ／ｍｌ）で４８時間活性化した。次に、上述で作製した抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－抗ＰＤ－１抗体発現ベクター、抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９－抗ＰＤ－１抗体発現ベクター、抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ発現ベクター、又は抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現ベクターを導入したレトロウイルスを含有する上清を、２５μｇ／ｍｌのレトロネクチン（登録商標：タカラバイオ社製）でコートしたプレートで活性化させた上述のマウスＴ細胞（１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）と混合し、１５００ｒｐｍで２時間遠心後、ＩＬ－２（１００ＩＵ／ｍｌ）の存在下で６時間培養した。培養液からレトロウイルスを除去するため、マウスＴ細胞を回収し、ＩＬ－２（１００ＩＵ／ｍｌ）を含有する新しい増殖培養液（ＲＰＭＩ）に移し、さらに４２時間培養し、抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－抗ＰＤ－１抗体発現ベクターを導入したマウスＴ細胞（以下、抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－抗ＰＤ－１抗体発現Ｔ細胞とも称する）、抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９－抗ＰＤ－１抗体発現ベクターを導入したマウスＴ細胞（以下、抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９－抗ＰＤ－１抗体発現Ｔ細胞とも称する）、抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ発現ベクターを導入したマウスＴ細胞（以下、抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ発現Ｔ細胞とも称する）、又は抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現ベクターを導入したマウスＴ細胞（以下、抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞とも称する）を得た。
ＣＡＲ発現を検出するために、形質導入していないＴ細胞（図１３中ではｕｎｉｎｆ．と表記）又は種々の上記ＣＡＲをコードするレトロウイルスベクターを形質導入したＴ細胞を、ビオチン化した組換えｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ（ｐｒｏｔｅｉｎＬ－ｂｉｏとも表記する）で染色し、続いてアロフィコシアニンを結合させたストレプトアビジン（ｓａｖ－ａｐｃとも表記する）で染色した。ＣＡＲの発現レベルをフローサイトメトリーで解析した。結果を図１３に示す。
図１３以降の図面において、ｕｎｉｎｆ．は形質導入していないＴ細胞を、ｃｏｎｖ．は抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ発現Ｔ細胞を、ｃｏｎｖ．／ＰＤ－１は抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－抗ＰＤ－１抗体発現Ｔ細胞を、７×１９は抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を、７×１９／ＰＤ－１は抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９－抗ＰＤ－１抗体発現Ｔ細胞を表す。図１３中の各Ｔ細胞のデータにおいて、左側はＦＳＣ－ＳＳＣプロットであり、右側はアロフィコシアニン染色の陽性度（横軸）と細胞カウント（縦軸）を示すグラフである。また、右側のグラフ中に示されたヒストグラムは、染色で陽性だった細胞の割合（％）を表す。図１３に示されるように、形質導入していないＴ細胞以外の、ＣＡＲをコードするレトロウイルスベクターで形質導入されたＴ細胞は、ＣＡＲを期待通りに発現していることが分かる。
各種ＣＡＲ－Ｔ細胞を実験に使用する前に、ＩＬ－７の濃度及びＣＣＬ１９の濃度をＥＬＩＳＡキットにより測定した。具体的には、形質転換していないＴ細胞、抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ発現Ｔ細胞、抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞、抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－抗ＰＤ－１抗体発現Ｔ細胞、又は抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９－抗ＰＤ－１抗体発現Ｔ細胞を２日間培養した培養上清を回収し、培養上清中のＩＬ－７及びＣＣＬ１９の濃度を市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて測定した。結果を図１４に示す。図１４には、３連のウエルの平均値と共に標準偏差もグラフには示した。なお、各グラフ中で、データは、左側から、形質転換していないＴ細胞（ｕｎｉｎｆ．）、抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ発現Ｔ細胞（ｃｏｎｖ．）、抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞（７×１９）、抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－抗ＰＤ－１抗体発現Ｔ細胞（ｃｏｎｖ．／ＰＤ－１）、抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９－抗ＰＤ－１抗体発現Ｔ細胞（７×１９／ＰＤ－１）、及び培地のみ（培養液にＴ細胞を含ませなかった場合に同様の処理をして得られたデータ）の順で並んでいる。図１４に示されるように、抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞（７×１９）及び抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９－抗ＰＤ－１抗体発現Ｔ細胞（７×１９／ＰＤ－１）の場合に、ＩＬ－７及びＣＣＬ１９の発現が見られた。
各種ＣＡＲ－Ｔ細胞を実験に使用する前に、抗ｍＰＤ－１ｓｃＦｖ（ＰＤ－１ｓｃＦｖとも称する）の濃度を２種類のＥＬＩＳＡキットにより測定した。具体的には、形質転換していないＴ細胞、抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ発現Ｔ細胞、抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞、抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－抗ＰＤ－１抗体発現Ｔ細胞、又は抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９－抗ＰＤ－１抗体発現Ｔ細胞を２日間培養した培養上清を回収し、培養上清中のＩＬ－７及びＣＣＬ１９の濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。ＥＬＩＳＡでは、マウスＰＤ－１とイムノグロブリンＦｃ部分からなる組換え融合タンパク質をウエル中に固定してＰＤ－１ｓｃＦｖを捕捉し、抗ＦＬＡＧタグ又は抗６×Ｈｉｓタグを検出に用いた。結果を図１５に示す。図１５には、３連のウエルの平均値と共に標準偏差もグラフには示した。なお、各グラフ中で、データは、左側から、形質転換していないＴ細胞（ｕｎｉｎｆ．）、抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ発現Ｔ細胞（ｃｏｎｖ．）、抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞（７×１９）、抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－抗ＰＤ－１抗体発現Ｔ細胞（ｃｏｎｖ．／ＰＤ－１）、抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９－抗ＰＤ－１抗体発現Ｔ細胞（７×１９／ＰＤ－１）、及び培地のみ（培養液にＴ細胞を含ませなかった場合に同様の処理をして得られたデータ）の順で並んでいる。図１５に示されるように、抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－抗ＰＤ－１抗体発現Ｔ細胞（ｃｏｎｖ．／ＰＤ－１）及び抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９－抗ＰＤ－１抗体発現Ｔ細胞（７×１９／ＰＤ－１）の場合に、抗ＰＤ－１ｓｃＦｖの発現が見られた。
（担がんマウスへの投与による抗がん効果の解析）
０日目に、６～１２週齢の雄ＤＢＡ／２マウスに０．１ｍｌのＨＢＳＳで懸濁した５×１０５個のＰ８１５－ｈＣＤ２０腫瘍細胞（Nat Biotechnol. 2018;36(4):346-351参照）を側腹に皮下接種した。１１日目に、抗がん剤であるシクロホスファミド（ＣＰＡ、１００ｍｇ／ｋｇ）をマウスの腹腔内に投与した。マウスを５つの群に分けて、以降の処理を以下のとおり行った。
第１群には、いかなるＣＡＲ発現Ｔ細胞も投与しなかった。
第２群には、０．２５×１０６個の抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ発現Ｔ細胞を１４日目に静脈に投与した。
第３群には、０．２５×１０６個の抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を１４日目に静脈に投与した。
第４群には、０．２５×１０６個の抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－抗ＰＤ－１抗体発現Ｔ細胞を１４日目に静脈に投与した。
第５群には、０．２５×１０６個の抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９－抗ＰＤ－１抗体発現Ｔ細胞を１４日目に静脈に投与した。
それぞれのマウスの生存率を解析すると共にマウスの腫瘍体積を上記のデジタルカリパーを用いた手法により週２回測定した。それぞれのマウスの生存率の解析結果を図１６に、７０日目までの腫瘍体積を測定した結果を図１７に示す。図１７において、最初の１４日間の腫瘍体積は各グラフの右側に拡大して示した。
図１７において、ｃｐａ ｏｎｌｙは、第１群（シクロホスファミド投与は行ったものの、ＣＡＲ発現Ｔ細胞の投与は行わなかった）を表す。図１７においてはいずれの群もＮ＝１０である。図１７において、横軸は、Ｐ８１５－ｈＣＤ２０腫瘍細胞を皮下接種してからの日数（ｄａｙ）を表す。マウスの生存時間について、各群の間のログランク検定の結果を、Ｐ値の値で、図１６の下側の表に示す。
図１６に示された結果から、本開示に係る免疫応答性細胞Ｃに該当する抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９－抗ＰＤ－１抗体発現Ｔ細胞を用いることで、Ｐ８１５－ｈＣＤ２０を有するマウスの生存時間が顕著に増加していることが分かる。特に、抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－抗ＰＤ－１抗体発現Ｔ細胞を用いた場合や抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を用いた場合でも試験期間中にほとんどのマウスが死亡しているのに対して、抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９－抗ＰＤ－１抗体発現Ｔ細胞では９８日経過後でも５０％のマウスが生存していることは特筆すべきことである。このことから、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、インターロイキン７、及びＣＣＬ１９を発現するが免疫抑制阻害性ポリペプチドを発現しない免疫応答性細胞を用いた場合、及びがん抗原を特異的に認識する細胞表面分子及び免疫抑制阻害性ポリペプチドを発現するが、インターロイキン７及びＣＣＬ１９を発現しない免疫応答性細胞を用いた場合には治療困難ながん治療の場合でも、本開示に係る免疫応答性細胞Ｃを用いれば治療可能となりうることが分かる。また、Ｐ値から、抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９－抗ＰＤ－１抗体発現Ｔ細胞による治療効果は、他の各群で得られた結果とは統計的に明らかに差異がある、高い治療効果であることが分かる。
図１５に記載の、抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－抗ＰＤ－１抗体発現Ｔ細胞による抗ＰＤ－１ｓｃＦｖの発現量と、抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９－抗ＰＤ－１抗体発現Ｔ細胞による抗ＰＤ－１ｓｃＦｖの発現量との比較から分かるように、抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９－抗ＰＤ－１抗体発現Ｔ細胞は、導入遺伝子の数が多くヌクレオチド長が長いために、導入及び発現における不利を被ることを考慮すると、抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９－抗ＰＤ－１抗体発現Ｔ細胞による上記の治療効果は驚くべきものであることが理解される。
また、図１７に示された結果から、抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９－抗ＰＤ－１抗体発現Ｔ細胞が投与されたマウスでは、腫瘍体積の増加自体が抑えられていることが理解できる。この腫瘍体積増加の抑制は、ＣＡＲ発現Ｔ細胞を投与しなかった場合（ｃｐａ ｏｎｌｙ）及び抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ発現Ｔ細胞を投与した場合（ｃｏｎｖ．）と比較して顕著なだけではなく、抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を投与した場合及び抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ－抗ＰＤ－１抗体発現Ｔ細胞を投与した場合と比較しても顕著なものである。
また、抗ｈＣＤ２０ ＣＡＲ発現Ｔ細胞の投与量は、上記のとおり０．２５×１０６個と少なく、少ない細胞数であっても高い効果が得られたことが分かった。
以上のとおり、実施例により、本開示の種々の態様に係る組み合わせ医薬及び免疫応答性細胞により、がん細胞に対する高い治療効果が得られることが示された。
本開示の例示的な実施形態は、以下の実施形態も含む。
＜１＞
（ａ）がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、インターロイキン７及びＣＣＬ１９を発現する免疫応答性細胞、並びに
（ｂ）免疫抑制阻害剤
を含む、対象におけるがんを治療するための組み合わせ医薬。
＜２＞ 前記免疫応答性細胞と、前記免疫抑制阻害剤とが、異なる時点で別々に投与される、＜１＞に記載の組み合わせ医薬。
＜３＞ インターロイキン７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸が、前記免疫応答性細胞のゲノムに組み込まれているか、又は前記免疫応答性細胞中に存在する１個又は複数個のベクターに一緒に若しくは別個に組み込まれている、＜１＞又は＜２＞に記載の組み合わせ医薬。
＜４＞ 前記免疫応答性細胞が、前記対象自身に由来する免疫応答性細胞である、＜１＞～＜３＞のうちいずれか１つに記載の組み合わせ医薬。
＜５＞ 前記免疫応答性細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、及びＢ細胞等のリンパ球系細胞、単球、マクロファージ、及び樹状細胞等の抗原提示細胞、好中球、好酸球、好塩基球、並びに肥満細胞からなる群から選択される、＜１＞～＜４＞のうちいずれか１つに記載の組み合わせ医薬。
＜６＞
（ａ）インターロイキン７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸を協同して含む１種類又は複数種類の細胞若しくは核酸送達媒体又はそれらの組み合わせ、並びに
（ｂ）免疫抑制阻害剤
を含む、対象におけるがんを治療するための組み合わせ医薬。
＜７＞ 前記１種類又は複数種類の細胞若しくは核酸送達媒体又はそれらの組み合わせが、免疫応答性細胞、ウイルス、嫌気性菌、リポソーム、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、及びナノ粒子から選択される少なくとも１種を含む、＜６＞に記載の組み合わせ医薬。
＜８＞ 前記１種類又は複数種類の細胞若しくは核酸送達媒体又はそれらの組み合わせが、がん抗原を特異的に認識する分子を表面に有する、＜６＞又は＜７＞に記載の組み合わせ医薬。
＜９＞ 前記１種類又は複数種類の細胞若しくは核酸送達媒体又はそれらの組み合わせが、がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸をさらに含み、前記がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である、＜６＞又は＜７＞に記載の組み合わせ医薬。
＜１０＞ 前記免疫抑制阻害剤がポリペプチドであって、前記細胞若しくは核酸送達媒体又はそれらの組み合わせは、免疫抑制阻害剤ポリペプチドをコードずる核酸をさらに協同して含む＜６＞～＜９＞のうちいずれか１つに記載の組み合わせ医薬。
＜１１＞ 前記細胞若しくは核酸送達媒体又はそれらの組み合わせと、前記免疫抑制阻害剤とが、異なる時点で別々に投与される、＜６＞～＜９＞のうちいずれか１つに記載の組み合わせ医薬。
＜１２＞ 前記がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である、＜１＞～＜５＞のうちいずれか１つに記載の組み合わせ医薬。
＜１３＞ 前記免疫抑制阻害剤が、ＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＰＤ－Ｌ２阻害剤、ＣＴＬＡ－４阻害剤、ＢＴＬＡ（B- and T-lymphocyte attenuator）阻害剤、ＴＩＭ－３（T-cell immunoglobulin and mucin domain 3）阻害剤、ＴＩＧＩＴ（T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains）阻害剤、ＬＡＧ－３（Lymphocyte Activation Gene-3）阻害剤、及びＳｉｇｌｅｃ－１５阻害剤からなる群から選択される１種以上を含む、＜１＞～＜１２＞のうちいずれか１つに記載の組み合わせ医薬。
＜１４＞ 前記免疫抑制阻害剤が抗体である、＜１＞～＜１３＞のうちいずれか１つに記載の組み合わせ医薬。
＜１５＞ 前記抗体が、ＩｇＧモノクローナル抗体又は抗体断片である、＜１４＞に記載の組み合わせ医薬。
＜１６＞ 前記がんが固形がんである、＜１＞～＜１５＞のうちいずれか１つに記載の組み合わせ医薬。
＜１７＞ 免疫抑制阻害剤と併用されて対象におけるがんを治療するために用いられる、（ｉ）がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、インターロイキン７及びＣＣＬ１９を発現する免疫応答性細胞、又は（ｉｉ）インターロイキン７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸を協同して含む１種類又は複数種類の細胞若しくは核酸送達媒体若しくはそれらの組み合わせ、を含む医薬。
＜１８＞
（ｉ）がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、インターロイキン７及びＣＣＬ１９を発現する免疫応答性細胞、又は（ｉｉ）インターロイキン７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸を協同して含む１種類又は複数種類の細胞若しくは核酸送達媒体若しくはそれらの組み合わせ、と併用されて対象におけるがんを治療するために用いられる、免疫抑制阻害剤を含む医薬。
＜１９＞ 前記免疫抑制阻害剤と前記免疫応答性細胞又は前記１種類又は複数種類の細胞若しくは核酸送達媒体若しくはそれらの組み合わせとが異なる時点で別々に投与される形態にて用いるための、＜１７＞又は＜１８＞に記載の医薬。
＜２０＞ 免疫抑制阻害剤と併用されることが表示された容器に収容され、かつ、（ｉ）がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、インターロイキン７及びＣＣＬ１９を発現する免疫応答性細胞、又は（ｉｉ）インターロイキン７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸を協同して含む１種類又は複数種類の細胞若しくは核酸送達媒体若しくはそれらの組み合わせ、を含む医薬。
＜２１＞
免疫抑制阻害剤と併用されることが記載された添付文書と、
（ｉ）がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、インターロイキン７及びＣＣＬ１９を発現する免疫応答性細胞、又は（ｉｉ）インターロイキン７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸を協同して含む１種類又は複数種類の細胞若しくは核酸送達媒体若しくはそれらの組み合わせ、を含む医薬を収容した容器と、
を含む製品。
＜２２＞
（ａ）（ｉ）がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、インターロイキン７及びＣＣＬ１９を発現する免疫応答性細胞、又は（ｉｉ）インターロイキン７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸を協同して含む１種類又は複数種類の細胞若しくは核酸送達媒体若しくはそれらの組み合わせ、並びに
（ｂ）免疫抑制阻害剤
を含む、対象におけるがんを治療するための医薬組成物。
＜２３＞ 前記がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である、＜２２＞に記載の医薬組成物。
＜２４＞ がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、インターロイキン７、ＣＣＬ１９、及び免疫抑制阻害性ポリペプチドを発現する免疫応答性細胞。
＜２５＞ インターロイキン７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸が、前記免疫応答性細胞のゲノムに組み込まれているか、又は前記免疫応答性細胞中に存在する１個又は複数個のベクターに一緒に若しくは別個に組み込まれている、＜２４＞に記載の免疫応答性細胞。
＜２６＞ 免疫抑制阻害性ポリペプチドをコードする核酸が、前記免疫応答性細胞のゲノムに組み込まれているか、又は前記免疫応答性細胞中に存在する、前記１個又は複数個のベクターのうちいずれかと同じであっても異なっていてもよいベクターに組み込まれている、＜２５＞に記載の免疫応答性細胞。
＜２７＞ 前記がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である、＜２４＞～＜２６＞のうちいずれか１つに記載の免疫応答性細胞。
＜２８＞ 前記免疫抑制阻害性ポリペプチドが、ＰＤ－１阻害性ポリペプチド、ＰＤ－Ｌ１阻害性ポリペプチド、ＰＤ－Ｌ２阻害性ポリペプチド、ＣＴＬＡ－４阻害性ポリペプチド、ＢＴＬＡ（B- and T-lymphocyte attenuator）阻害性ポリペプチド、ＴＩＭ－３（T-cell immunoglobulin and mucin domain 3）阻害性ポリペプチド、ＴＩＧＩＴ（T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains）阻害性ポリペプチド、ＬＡＧ－３（Lymphocyte Activation Gene-3）阻害性ポリペプチド、及びＳｉｇｌｅｃ－１５阻害性ポリペプチドからなる群から選択される１種以上を含む、＜２４＞～＜２７＞のうちいずれか１つに記載の免疫応答性細胞。
＜２９＞ 前記免疫抑制阻害性ポリペプチドが抗体である、＜２４＞～＜２８＞のうちいずれか１つに記載の免疫応答性細胞。
＜３０＞ 前記抗体が、ＩｇＧモノクローナル抗体又は抗体断片である、＜２９＞に記載の免疫応答性細胞。
＜３１＞ Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、及びＢ細胞等のリンパ球系細胞、単球、マクロファージ、及び樹状細胞等の抗原提示細胞、好中球、好酸球、好塩基球、並びに肥満細胞からなる群から選択される、＜２４＞～＜３０＞のうちいずれか１つに記載の免疫応答性細胞。
＜３２＞ ＜２４＞～＜３１＞のうちいずれか１つに記載の免疫応答性細胞を含む医薬。
＜３３＞ 対象におけるがんを治療するために用いられる、＜３２＞に記載の医薬。
＜３４＞ 前記がんが固形がんである、＜３３＞に記載の医薬。
＜３５＞ 前記免疫応答性細胞が前記対象自身に由来する免疫応答性細胞である、＜３３＞又は＜３４＞に記載の医薬。
＜３６＞ インターロイキン７をコードする核酸、ＣＣＬ１９をコードする核酸、及び免疫抑制阻害性ポリペプチドをコードする核酸を協同して含む１種類又は複数種類の核酸送達媒体。
＜３７＞ がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸をさらに含む、＜３６＞に記載の核酸送達媒体。
本願は２０１９年１０月２８日出願の日本国特許出願２０１９－１９５４０７からの優先権を主張し、日本国特許出願２０１９－１９５４０７の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。

Claims (27)

  1. （ａ）がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、インターロイキン７及びＣＣＬ１９を発現する免疫応答性細胞、並びに
    （ｂ）ＰＤ－１に対する抗体及びＰＤ－Ｌ１に対する抗体の少なくとも一方である免疫抑制阻害剤
    を含む、対象におけるがんを治療するための組み合わせ医薬。
  2. 前記免疫応答性細胞と、前記免疫抑制阻害剤とが、異なる時点で別々に投与される、請求項１に記載の組み合わせ医薬。
  3. インターロイキン７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸が、前記免疫応答性細胞のゲノムに組み込まれているか、又は前記免疫応答性細胞中に存在する１個又は複数個のベクターに一緒に若しくは別個に組み込まれている、請求項１又は請求項２に記載の組み合わせ医薬。
  4. 前記免疫応答性細胞が、前記対象自身に由来する免疫応答性細胞である、請求項１～３のうちいずれか一項に記載の組み合わせ医薬。
  5. 前記免疫応答性細胞が、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、好中球、好酸球、好塩基球、及び肥満細胞からなる群から選択される、請求項１～４のうちいずれか一項に記載の組み合わせ医薬。
  6. 前記がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である、請求項１～５のうちいずれか一項に記載の組み合わせ医薬。
  7. 前記ＰＤ－１に対する抗体及び前記ＰＤ－Ｌ１に対する抗体が、ＩｇＧモノクローナル抗体又は抗体断片である、請求項１～６のうちいずれか一項に記載の組み合わせ医薬。
  8. 前記がんが固形がんである、請求項１～７のうちいずれか一項に記載の組み合わせ医薬。
  9. ＰＤ－１に対する抗体及びＰＤ－Ｌ１に対する抗体の少なくとも一方である免疫抑制阻害剤と併用されて対象におけるがんを治療するために用いられる医薬であって、
    がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、インターロイキン７及びＣＣＬ１９を発現する免疫応答性細胞を含む、医薬。
  10. がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、インターロイキン７及びＣＣＬ１９を発現する免疫応答性細胞と併用されて対象におけるがんを治療するために用いられる医薬であって、
    ＰＤ－１に対する抗体及びＰＤ－Ｌ１に対する抗体の少なくとも一方である免疫抑制阻害剤を含む、医薬。
  11. 前記免疫抑制阻害剤と前記免疫応答性細胞とが異なる時点で別々に投与される形態にて用いるための、請求項９又は請求項１０に記載の医薬。
  12. ＰＤ－１に対する抗体及びＰＤ－Ｌ１に対する抗体の少なくとも一方である免疫抑制阻害剤と併用されることが表示された容器に収容される
    請求項９に記載の医薬。
  13. 請求項９に記載の医薬を収容した容器を含む、ＰＤ－１に対する抗体及びＰＤ－Ｌ１に対する抗体の少なくとも一方である免疫抑制阻害剤と併用されて対象におけるがんを治療するために用いられる、製品。
  14. （ａ）がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、インターロイキン７及びＣＣＬ１９を発現する免疫応答性細胞、並びに
    （ｂ）ＰＤ－１に対する抗体及びＰＤ－Ｌ１に対する抗体の少なくとも一方である免疫抑制阻害剤
    を含む、対象におけるがんを治療するための医薬組成物。
  15. 前記がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である、請求項１４に記載の医薬組成物。
  16. がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子、インターロイキン７、ＣＣＬ１９、並びにＰＤ－１阻害性ポリペプチド及びＰＤ－Ｌ１阻害性ポリペプチドの少なくとも一方の免疫抑制阻害性ポリペプチドを発現し、
    前記免疫抑制阻害性ポリペプチドが、ＰＤ－１に対する抗体及びＰＤ－Ｌ１に対する抗体の少なくとも一方である、免疫応答性細胞。
  17. インターロイキン７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸が、前記免疫応答性細胞のゲノムに組み込まれているか、又は前記免疫応答性細胞中に存在する１個又は複数個のベクターに一緒に若しくは別個に組み込まれている、請求項１６に記載の免疫応答性細胞。
  18. 免疫抑制阻害性ポリペプチドをコードする核酸が、前記免疫応答性細胞のゲノムに組み込まれているか、又は前記免疫応答性細胞中に存在する、前記１個又は複数個のベクターのうちいずれかと同じであっても異なっていてもよいベクターに組み込まれている、請求項１７に記載の免疫応答性細胞。
  19. 前記がん抗原を特異的に認識する細胞表面分子が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である、請求項１６～１８のうちいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
  20. 前記ＰＤ－１に対する抗体及び前記ＰＤ－Ｌ１に対する抗体が、ＩｇＧモノクローナル抗体又は抗体断片である、請求項１６～１９のうちいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
  21. ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、好中球、好酸球、好塩基球、及び肥満細胞からなる群から選択される、請求項１６～２０のうちいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
  22. 請求項１６～２１のうちいずれか一項に記載の免疫応答性細胞を含む医薬。
  23. 対象におけるがんを治療するために用いられる、請求項２２に記載の医薬。
  24. 前記がんが固形がんである、請求項２３に記載の医薬。
  25. 前記免疫応答性細胞が前記対象自身に由来する免疫応答性細胞である、請求項２３又は請求項２４に記載の医薬。
  26. 免疫応答性細胞へ導入するための、１種又は複数種類の核酸送達組成物であって、
    インターロイキン７をコードする核酸、ＣＣＬ１９をコードする核酸、ＰＤ－１に対する抗体及びＰＤ－Ｌ１に対する抗体の少なくとも一方をコードする核酸、並びにがん抗原を特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸を協同して含む、
    １種類又は複数種類の核酸送達組成物。
  27. 免疫応答性細胞へ導入するための、１種又は複数種類の核酸送達組成物であって、
    インターロイキン７をコードする核酸、ＣＣＬ１９をコードする核酸、並びにＰＤ－１に対する抗体及びＰＤ－Ｌ１に対する抗体の少なくとも一方をコードする核酸を協同して含み、
    前記免疫応答性細胞はがん抗原を特異的に認識する細胞表面分子を発現する細胞である、
    １種類又は複数種類の核酸送達組成物。
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