CN103429258B - 通过施用溶瘤痘苗病毒生成针对肿瘤抗原的抗体和生成肿瘤特异性补体依赖性细胞毒性 - Google Patents

通过施用溶瘤痘苗病毒生成针对肿瘤抗原的抗体和生成肿瘤特异性补体依赖性细胞毒性 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于在具有肿瘤的动物中诱导肿瘤特异性抗体介导的补体依赖性细胞毒性应答的方法和组合物，其包括给所述动物施用包含复制型溶瘤病毒的组合物，其中所述组合物的施用在动物中诱导介导对所述肿瘤特异性的CDC应答的抗体产生。

Description

通过施用溶瘤痘苗病毒生成针对肿瘤抗原的抗体和生成肿瘤特异性补体依赖性细胞毒性
相关申请
本申请要求美国临时申请号61/429,622的优先权利益，所述美国临时申请于2011年1月4日提交且以引用的方式整体并入本文。
联邦资助的研究或开发
本发明是在韩国政府的支持下，在大韩民国卫生、福利和家庭事务部，韩国卫生技术R&D项目给予的基金A060001的资助下进行的，所述项目的名称为“StudyonOncolyticvVirus;translationalresearchandclinicalapplication”，主办单位为釜山国立大学，研究时间为2001年3月至2009年6月。
技术领域
本发明涉及用于干预癌症治疗的新作用机制以及依赖此类新作用机制设计用于癌症治疗的方法和组合物。
背景技术
需要具有新作用机制(MOA)的新癌症治疗。当作为单一试剂使用时，目前治疗通常具有有限功效，因此在实践中组合使用以得到最大效应。新型试剂应理想地缺乏与经批准治疗的交叉抗性，并且应具有多重互补MOA1-4。已开发改造的病毒用于使用不同方法的癌症治疗，包括“基因治疗”（在非复制型病毒中的治疗转基因转移）5-7和癌症疫苗（肿瘤抗原、共刺激分子和/或细胞因子的表达）8-10。然而，由于局部和全身对于足够数目的癌细胞的无效递送，基因治疗迄今为止在患者中已失败。相比之下，基于病毒的癌症疫苗已受限于肿瘤免疫逃避和对于在具有晚期大块癌症的患者中的功效对宿主因子的唯一依赖。免疫逃避对于疫苗方法是最可能的，所述疫苗方法依赖单一肿瘤抗原和/或单一细胞因子的表达。需要广基治疗癌症疫苗以表达多重肿瘤抗原、细胞因子、免疫细胞召募和活化、和免疫应答危险信号。
相比之下，开发溶瘤病毒以利用病毒感染癌细胞、在癌细胞内繁殖且随后溶解癌细胞的本能11-14。第一代溶瘤病毒固有地是癌症选择性的（例如呼肠孤病毒15-16、VSV17-18），而第二代试剂被改造用于癌症选择性（例如腺病毒19-20和单纯疱疹病毒21-22缺失型突变体）。用这些试剂的临床试验数据证实安全性和癌症选择性，但治疗效力在直接瘤内或静脉内注射后是有限的23；然而，对于远侧肿瘤的全身扩散和/或重现性递送是有限的。因此全身抗癌效力和对于转移性肿瘤的血源性传播的递送必须得到改善。
考虑到这三种个别的基于病毒的方法各自的潜力和局限性，我们查询是否能够将各自的最佳属性组合且最佳化成为单一治疗试剂。靶向且有准备(armed)的溶瘤痘病毒具有实现这点的潜力。JX-594是设计为具有三个互补MOA的第三代溶瘤痘病毒治疗剂，所述MOA包括：1）直接复制介导的癌细胞溶解，和2）主动癌症疫苗接种。JX-594是Wyeth痘苗病毒疫苗衍生的溶瘤病毒，伴随病毒胸苷激酶基因的破坏以及在合成早期和p7.5启动子的控制下分别表达人粒细胞单核细胞集落刺激因子(hGM-CSF)和β-半乳糖苷酶转基因24。痘苗由于其在血液中的稳定性用于对肿瘤的血源性传播的递送而用作病毒主链25。JX-594设计为通过下述诱导癌症疫苗接种：同时癌细胞溶解和内源肿瘤抗原释放、hGM-CSF的表达以支持抗原呈递细胞活化、免疫效应细胞的召募和促炎细胞因子诱导。痘苗自身的清除主要经由通过细胞介导的免疫机制的受感染细胞清除。
本发明人现在已发现使用溶瘤病毒治疗癌症的新方法以解决本领域关于新癌症治疗的需要。
发明内容
本发明涉及用于在具有肿瘤的动物中诱导肿瘤特异性抗体介导的补体依赖性细胞毒性应答的方法和组合物，其包括给动物施用包含复制型溶瘤病毒的组合物，其中所述组合物的施用在动物中诱导介导对肿瘤特异性的CDC应答的抗体产生。
在具体实施例中，本发明提供了在具有肿瘤的动物中诱导肿瘤特异性抗体介导的补体依赖性细胞毒性应答的方法，其包括给动物施用包含复制型溶瘤病毒的组合物，其中所述组合物的施用在动物中诱导介导对肿瘤特异性的CDC应答的抗体。更具体而言，溶瘤病毒的施用不在不具有肿瘤的动物中诱导CDC应答。
溶瘤病毒可以是任何溶瘤病毒。示例性此类病毒可以选自痘病毒、腺病毒、腺伴随病毒、单纯疱疹病毒、新城疫病毒、水疱性口炎病毒、腮腺炎病毒、流感病毒、细小病毒、麻疹病毒、人汉坦病毒、粘液瘤病毒、巨细胞病毒(CMV)、慢病毒、柯萨奇病毒、艾可病毒、矽尼卡谷病毒和辛德毕斯病毒。在具体实施例中，溶瘤病毒是溶瘤痘病毒。可以使用的溶瘤病毒的具体例子包括例如表达GM-CSF的突变的痘苗病毒、表达p53的病毒、水疱性口炎病毒(VSV)、ONYX-15、Delta24、在VA1区中突变的腺病毒、在K3L或E3L区中突变的痘苗病毒、Telomelysin、Telomelysin-GFP、在OV20.0L基因中突变的副痘病毒羊口疮病毒、Genelux病毒和在γ(1)34.5基因中突变的疱疹病毒。在具体示例性实施例中，溶瘤痘病毒是JX-594。溶瘤病毒可包含治疗或其他转基因。例如，转基因可以是异源核酸序列，其编码GM-CSF、或其他细胞因子、趋化因子、标记物和/或成像基因、自杀基因、前药酶基因羧基酯酶和胞嘧啶脱氨酶、肿瘤抑制基因等。
针对其产生抗体的肿瘤可以是任何肿瘤，包括但不限于选自下述的肿瘤：星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、神经纤维瘤、成胶质细胞瘤、室管膜瘤、许旺细胞瘤、神经纤维肉瘤、成神经细胞瘤、垂体腺瘤、成髓细胞瘤、头与颈癌、黑素瘤、前列腺癌、肾细胞癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、骨癌、直肠癌、卵巢癌、肉瘤、胃癌、食管癌、宫颈癌、纤维肉瘤、鳞状细胞癌、神经外胚层瘤、甲状腺瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、肝瘤、间皮瘤、表皮样癌和血液的致瘤疾病。
还包括的是在体内生成介导抗瘤CDC应答的抗体的方法，其包括给受试者施用包含复制型溶瘤病毒的组合物，其中所述组合物的施用诱导介导对肿瘤特异性的CDC应答的抗体。该方法还可包括在施用后收获来自受试者的血液且从血液中分离产生CDC应答的抗体。
还考虑的是包含从受试者的血液中分离的产生CDC应答的抗体的组合物，所述受试者已用复制型溶瘤病毒以有效诱导抗体的量和方式进行治疗，所述抗体介导对肿瘤特异性的CDC应答。在具体实施例中，组合物是从受试者中收集的血清。
还考虑的是抑制癌细胞的生长或杀死癌细胞的方法，其包括使癌细胞与本发明的组合物接触。在具体实施例中，接触包括使癌细胞在体外与组合物接触。在其他实施例中，接触包括用组合物输注具有癌症的受试者，所述组合物包含收获的抗体、收获的B细胞、由收获的B细胞产生的抗体或其组合。在本发明的治疗方法中，癌细胞可以在受试者体内并且接触包括施用包含组合物的药物。在另外的实施例中，治疗方法还可包括给受试者施用进一步的抗癌治疗剂。
本发明还包括治疗癌症受试者的方法，其包括给受试者施用包含本发明的组合物的组合物，所述本发明的组合物包含从受试者的血液中分离的产生CDC应答的抗体，所述受试者已用复制型溶瘤病毒以有效诱导抗体的量和方式进行治疗，所述抗体介导对肿瘤特异性的CDC应答。在一些实施例中，组合物对于患者是自体的，并且从癌症患者中分离且再输注到癌症患者内。在其他实施例中，组合物对于癌症患者是异种的，并且从不同于用组合物治疗的癌症患者的癌症患者中分离。在任一情况下，受试者均可用进一步的抗癌治疗剂进行治疗。
在本发明的治疗方法中，癌症受试者可具有实体瘤，并且组合物瘤内、静脉内、腹膜内或其组合施用。在具体实施例中，癌症受试者具有在施用本发明的组合物之前、同时或之后被切除的实体瘤。在一些实施例中，癌症受试者具有实体瘤，并且组合物减少肿瘤的尺寸。在其他实施例中，癌症受试者具有实体瘤，并且施用减少实体瘤的转移性扩散。在治疗方法中，癌症可以选自星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、神经纤维瘤、成胶质细胞瘤、室管膜瘤、许旺细胞瘤、神经纤维肉瘤、成神经细胞瘤、垂体腺瘤、成髓细胞瘤、头与颈癌、黑素瘤、前列腺癌、肾细胞癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、骨癌、直肠癌、卵巢癌、肉瘤、胃癌、食管癌、宫颈癌、纤维肉瘤、鳞状细胞癌、神经外胚层瘤、甲状腺瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、肝瘤、间皮瘤、表皮样癌和血液的致瘤疾病。
本发明还提供了对于具有癌症的受试者修改癌症治疗的方法的教导，其包括：
a)给受试者施用包含复制型溶瘤病毒的组合物，其中所述组合物的施用在受试者中诱导介导对受试者中的癌症特异性的CDC应答的抗体产生；
b)从受试者中分离血液，其中所述血液包含针对癌症的收获的抗体、收获的B细胞；
c)扩增或分离抗体或由B细胞产生抗体；以产生对受试者特异性的免疫治疗组合物，和
d)给受试者施用步骤(c)的免疫治疗组合物。在此类方法中，免疫治疗组合物可在抗体分离后立即施用。作为另外一种选择，将免疫治疗组合物贮存用于受试者的进一步治疗性处理。
本发明的进一步方面涉及鉴定肿瘤特异性抗原的方法，其包括将由癌细胞制备的cDNA文库克隆到表达载体内；通过使表达载体与来自受试者的血清接触来执行初次免疫筛选，所述受试者已用复制型溶瘤病毒以有效诱导抗体的量和方式进行治疗，所述抗体介导对肿瘤特异性的CDC应答，其中所述血清在溶瘤病毒施用和CDC特异性应答生成后从受试者中分离；和从cDNA文库中分离由血清识别的抗原。
附图说明
为了本发明的更完全理解，现在参考结合下述附图的下述说明书。
图1：注射到荷有VX2肿瘤的兔内的JX-594的血清效应。在基线时、在JX-594或PBS处理后3周和6周时收集血清。从VX2组织中酶促分离VX2，并且在体外用具有10%FBS的达尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)维持8代。图1A，通过注射到荷有VX2而不是正常兔内的JX-594而不是PBS注射血清的分离的VX2肿瘤细胞而不是兔PBMC的死亡。在分离的VX2细胞或兔PBMC中处理（每只动物（对于每种条件n=3，来自每个血清样品一式三份，意味着关于各自的反应数目=9）得自JX-594注射（正常与荷有VX2的兔相比较）或PBS注射的荷有VX2的兔的3%血清。图2B，在JX-594注射到荷有vx2的兔后，血清针对分离的VX2细胞的时间依赖性抗瘤效应。JX-594（对于每只兔109pfu）在第0天和第7天时注射，并且在每个点时连续获得血清。图2C，在JX-594注射到荷有VX2的兔后，血清针对分离的VX2细胞的剂量依赖性抗瘤效应。图2D，JX-594注射的血清的蛋白质印迹。
图2A。在JX-594注射的人血清处理后（在四循环的JX-594注射到#301肾细胞癌患者后第92天时），人RCCSNU349细胞系的代表性共焦显微镜检查。a、d–在血清(5%)添加前；b、e–在血清(5%)添加后10分钟，c、f–在血清(5%)添加后30分钟（在30分钟时无荧光，未展示）；g–在a中的黄色区域的放大，h–在b中的红色区域的放大（请注意经由CDC效应典型的膜攻击形成(MAF)的细胞溶解；红色箭头）。
图2B：在得自#301RCC患者的5%血清后（在四循环的JX-594注射后第92天时），不同类型的人肾细胞癌细胞(RCC)系的细胞生存的变化。星号指示每次JX-594注射。
图2C：在得自#103肺癌患者的5%血清后（在四循环的JX-594注射后第92天时），不同类型的肺癌细胞系的细胞生存的变化。星号指示每次JX-594注射。
图3。在治疗抗性实体瘤患者中的JX-594多次治疗后，生成抗体介导的补体依赖性癌细胞细胞溶解的证据。A.示出来自同一患者的不同类型血清的图。(a)在JX-594治疗前的基线首次用于实验的血清（命名为A血清）；(b)在JX-594治疗后第92天时获得的血清（命名为B血清）；(c)B血清在56℃处理30分钟用于补体热灭活（命名为C血清）；(d)将50%A血清加入50%C血清内（命名为D血清）。图3B：血清通过Ig去除树脂(Albumin/IgKit,Calbiochem)柱进行处理（命名为E血清）。
图3C。在B、C或D血清处理后（各自5%），人癌细胞系的代表性光学显微镜检查。在SNU349RCC细胞系中得自#301RCC患者的B、C或D血清处理后4小时获得显微镜照片。
图3D：热处理的持续时间在癌细胞杀死能力的丧失中的效应。(a)在相同体积的首次用于实验的血清（A血清）加入热灭活的C血清内之后，将这个混合血清加入培养的A2790或SNU349细胞内。血清的杀死效应得到显著恢复，从而显示补体加入含有癌症特异性抗体的B血清内。在CDC中，抗原抗体复合物是补体的主要激活物。抗体决定靶标特异性，而补体活化经由膜攻击复合物(MAC)的形成诱导细胞溶解。(b)最后通过IgG去除柱(Albumin/IgKit,Calbiochem)洗脱B血清，这引起杀死活性的丧失，从而显示IgG对于CDC可能是关键的。
图4：在不同类型的人癌细胞系中关于所选JX-594治疗的患者的补体依赖性细胞毒性(CDC)概况。CDC活性展示为通过来自每个患者的5%血清（对于1期患者使用JX-594治疗后第42-92天的存档样品，和对于2期患者使用JX-594治疗后第56天的存档样品）与通过基线首次用于实验的5%血清的细胞生存的反比。a-d.通过来自JX-594治疗的#301RCC(a)、#304黑素瘤(b)、#1702HCC(c)和#1705HCC(d)患者的血清，在不同人癌细胞系和正常细胞系中的CDC活性概况。
图5。在参加1期（原发性和转移性肝肿块）和2期JX-594临床试验（肝细胞癌）的患者中，在JX-594治疗后的CDC活性的总体分析。图5A，1期患者：在A2780细胞中的存活与CDC活性逆转相比较。图5B，在不同HCC细胞系中的2期患者(n=18)的时间依赖性CDC变化。图5C-5E，在不同人HCC细胞系SUN739(C)、SNU475(D)或SNU449(E)中，来自CDC响应患者的血清的CDC概况。应答者指定为在JX-594治疗后第56天时<80%细胞生存。
图6：得自JX-594注射的患者的人血清的蛋白质印迹。
图7：索拉非尼和舒尼替尼(sunitib)在体外和体内与JX-594注射的血清的协同作用。
图8：关于Serex的方法概述。
图9：溶瘤痘苗、GM-CSF和呼肠孤病毒对诱导介导CDC的肿瘤特异性抗体的作用。这个图显示，当与治疗前对照相比较时，在与所示血清浓度一起温育3小时后的%A2780细胞生存。从用所示干预静脉内处理的荷有VX2肿瘤的兔中收集的血清。
图10：溶瘤痘苗、GM-CSF和VSV对诱导介导对人癌细胞的CDC的肿瘤特异性抗体的作用。这个图显示，当与治疗前对照相比较时，在与所示血清浓度一起温育3小时后的%A2780细胞生存。从用所示干预静脉内处理的荷有VX2肿瘤的兔中收集的血清。
图11：溶瘤HSV和VSV-GM-CSF对诱导介导对人癌细胞的CDC的肿瘤特异性抗体的作用。这个图显示，当与治疗前对照相比较时，在与所示血清浓度一起温育3小时后的%A2780细胞生存。从用所示干预静脉内处理的荷有VX2肿瘤的兔中收集的血清。
图12：溶瘤痘苗、GM-CSF和VSV对诱导介导对衍生自体内靶肿瘤的兔癌细胞的CDC的肿瘤特异性抗体的作用。这个图显示，当与治疗前对照相比较时，在与掺有7%VX2植入前收集的血清的3%治疗后血清一起温育24小时后的%VX2细胞生存。从用溶瘤病毒静脉内处理的荷有VX2肿瘤的兔中收集的血清在x轴上指出。
图13：溶瘤痘苗和鼠GM-CSF表达介导在鼠肿瘤模型中介导CDC的肿瘤特异性抗体的诱导。这个图显示，当与治疗前对照相比较时，在与5%治疗后血清一起温育24小时后的%A2780细胞生存。从用溶瘤病毒静脉内处理的CT26荷瘤小鼠中收集的血清在x轴上指出。
具体实施方式
溶瘤病毒引起病毒复制依赖性癌症细胞溶解作为其主要作用机制，然而，癌症特异性免疫的诱导在临床前模型中也可以是主要功效中介物(mediator)。然而，功能抗癌免疫诱导迄今为止在癌症患者中仍未得到证实。JX-594是改造为表达人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的靶向溶瘤痘苗病毒，以便增强抗癌免疫的诱导。JX-594已证实在临床试验时与患者中的肿瘤应答相关的复制和GM-CSF表达。
在本发明中，发明人发现，JX-594在兔中以及随后在具有原发性或转移性肝肿瘤的患者中介导功能、抗肿瘤免疫的诱导。通过JX-594处理在兔中和在1期试验时具有各种不同肿瘤类型的患者中诱导抗体介导的补体依赖性癌细胞细胞毒性(CDC)。CDC诱导随后在肝细胞癌中的2期试验时在患者中得到证实。显著CDC在许多情况下即使在1-5%血清时也是显而易见的。CDC应答针对与患者那种相同的组织学的肿瘤细胞系更常见。正常细胞对CDC效应是抗性的。具有最长存活持续时间的患者具有最高的CDC活性。就我们所知，这是下述的第一手证据：1）在患者中通过溶瘤病毒的功能抗癌免疫诱导，2）在癌症患者中通过治疗病毒的CDC诱导，和3）产品给具有各种不同肿瘤类型的患者接种疫苗的能力和无需依赖限定靶抗原的表达。
此外，本发明人执行SEREX筛选以鉴定通过由JX-594处理诱导的多克隆抗体识别的靶抗原。除了指导细胞溶解性效应外，JX-594处理在实体瘤患者中导致功能全身性癌症靶向抗体和CDC的诱导。此外，用JX-594处理可以用作在具有多种癌症类型的患者中鉴定有关肿瘤抗原的方法。
为了简要地进一步描述本发明基于其的发现，本发明人发现在1期临床试验中在具有治疗抗性肝脏肿瘤的患者中，JX-594证实在瘤内注射后（总共2-8次，每三周）的癌症特异性复制、GM-CSF表达、白血细胞刺激（嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和单核细胞）和客观癌症应答；还证实了针对未注射的肿瘤的感染和功效26。起始2期试验以评估在具有肝细胞癌(HCC)的患者中的三次每两周一次的瘤内注射；在2期试验时也已观察到初步抗瘤活性。安全性迄今为止是可接受的，短暂的流行性感冒样症状是最常见的副作用。表达hGM-CSF的HSV缺失型突变体27证实在2期临床试验中对黑素瘤的肿瘤应答。
虽然病毒复制和转基因表达已在临床试验中重现性证实，但全身性抗癌免疫诱导才开始进行研究28。然而，直接功能免疫机制仍未得到证实。如果可阐明在治疗患者中的抗癌免疫应答，那么JX-594和其他免疫刺激病毒的效用和未来溶瘤产品的设计将得到显著改善。本发明人因此寻求评价在JX-594治疗过程中和之后的抗癌免疫。
本发明人另外评估在临床前模型中以及随后在1和2期试验时在具有肝脏肿瘤的患者中的免疫诱导。在基线时和在JX-594治疗后随着时间过去获得的存档的血清样品可用于评价。抗体介导的补体依赖性细胞毒性(CDC)是细胞杀死的有力机制30，并且针对肿瘤细胞系的CDC活性是功能全身性抗癌免疫的直接量度。本发明人还评价了JX-594随着时间过去针对不同组织学的肿瘤细胞系实验对象组在患者的血液中对抗体介导的CDC的诱导的影响。本文呈现的数据提供下述的首次明确证实：1）在患者中通过溶瘤病毒的功能抗癌免疫诱导，2）在癌症患者中通过治疗病毒的CDC诱导，和3）产品给具有各种不同肿瘤类型的患者接种疫苗的能力和无需依赖限定靶抗原的表达。
本发明基于溶瘤病毒可产生抗体介导的肿瘤特异性CDC应答的发现。在具体实施例中，考虑具有一种或多种核酸序列的重组溶瘤病毒，所述核酸序列编码免疫调节多肽，例如减弱先天性免疫应答或炎性应答的多肽。
在用溶瘤病毒执行的具体研究中，本发明人证实病毒复制在诱导介导CDC的抗瘤抗体中是重要的。众多实验（例如参见图9-13）证实在从用UV灭活的对照病毒处理的动物收集的血清中CDC诱导的缺乏。在使用的多种溶瘤病毒中，可见痘苗病毒在诱导介导CDC的抗瘤抗体方面是最佳的，然而，HSV和VSV也是有效的。具体地，HSV随后VSV具有中间表型，但呼肠孤病毒未显示能够在测试的模型中诱导CDC。
基于病毒生物学，可观察到不同水平的CDC应答；并且根据数据观察，可假定（有包膜的）dsDNA病毒在诱导介导CDC的抗瘤抗体方面是最有力的。
此外，研究显示来自溶瘤病毒的GM-CSF表达可增强病毒诱导介导CDC的抗瘤抗体的能力。这些研究原则上显示，在溶瘤病毒复制中表达的免疫刺激因子（其中可使用GM-CSF作为例子）可用于增强此类溶瘤病毒诱导介导CDC的抗瘤抗体的能力。
溶瘤病毒可选自水疱性口炎病毒(VSV)、新城疫病毒(NDV)、逆转录病毒、麻疹病毒、辛德毕斯病毒、流感病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒和腺病毒等，或其重组变体。可以是有用的示例性溶瘤病毒包括选自下述的溶瘤病毒：JX-594、表达p53的病毒、呼肠孤病毒、水疱性口炎病毒(VSV)、ONYX-15、Delta24、在VA1区中突变的腺病毒、在K3L或E3L区中突变的痘苗病毒、Telomelysin、Telomelysin-GFP、在OV20.0L基因中突变的副痘病毒羊口疮病毒、和在γ134.5基因中突变的疱疹病毒。在具体示例性实施例中，溶瘤病毒是JX-594。
异源核酸序列可以是待通过溶瘤病毒递送的任何治疗蛋白质。
在另外一个实施例中，重组溶瘤病毒还包含一个或多个异源病毒内部核糖体进入位点(IRES)，其是神经元沉默的且可操作地连接至至少一个核酸序列，所述核酸序列编码病毒基因表达、复制或繁殖所需的溶瘤病毒多肽，例如聚合酶（例如病毒RNA依赖性RNA聚合酶或DNA聚合酶）；结构蛋白（例如核衣壳蛋白、磷蛋白或基质蛋白）；或糖蛋白（例如包膜蛋白）。在进一步实施例中，重组溶瘤病毒具有两个或三个IRES，并且各自可操作地连接至编码溶瘤病毒多肽的不同核酸序列。例如，一个IRES可连接至溶瘤病毒聚合酶，并且第二个IRES可连接至结构蛋白或糖蛋白。在再进一步的实施例中，重组溶瘤病毒具有可操作地连接至编码溶瘤病毒聚合酶的核酸序列的第一个IRES；可操作地连接至编码溶瘤病毒糖蛋白的核酸序列的第二个IRES；和可操作地连接至编码溶瘤病毒结构蛋白的核酸序列的第三个IRES。在另一实施例中，IRES是小核糖核酸病毒IRES，例如来自鼻病毒例如人鼻病毒2的I型IRES，或口蹄疫病毒或其任何组合。
在本发明的具体方面，溶瘤病毒用于在具有肿瘤的动物中诱导肿瘤特异性抗体介导的补体依赖性细胞毒性应答，其包括给所述动物施用包含复制型溶瘤病毒的组合物，其中所述组合物的施用产生介导对所述肿瘤特异性的CDC应答的抗体。在这种情况下，可使用溶瘤病毒，以便抑制肿瘤细胞的生长或促进肿瘤细胞的杀死。
该方法一般将包括以足以在它施用于其的动物中诱导肿瘤特异性抗体介导的CDC应答的感染复数施用重组溶瘤病毒。肿瘤细胞可以是针对其的抗瘤应答是期望的任何肿瘤细胞。细胞可以在体内、离体或在体外与溶瘤病毒接触。
在一些实施例中，溶瘤病毒在体内施用于动物。施用可以是血管内进入静脉或动脉内。例如，在肝肿瘤的情况下，溶瘤病毒可经由内置医疗装置例如导管施用于肝动脉。在其他实施例中，重组溶瘤病毒可血管内、瘤内或腹膜内施用。
在具体实施例中，本发明的方法涉及治疗人患者中的癌症，其中通过在所述人中生成针对由所述人经历的特异性肿瘤的肿瘤特异性抗体介导的CDC应答。例如，此类方法包括以足以产生肿瘤特异性抗体介导的CDC应答的MOI施用如本文描述的一种或多种溶瘤病毒的步骤。考虑这个应答足以延缓人患者中肿瘤细胞的生长和/或杀死所述肿瘤细胞。在一些实施例中，应答在通过直接给患者施用溶瘤病毒治疗原位肿瘤中将是有用的。在其他实施例中，考虑取出受试者的肿瘤细胞，且离体生成针对所述肿瘤细胞的肿瘤特异性抗体介导的CDC应答。随后将在这个离体应答中产生的抗体在自体治疗中施用于肿瘤患者用于受试者中的癌症。作为另外一种选择，产生的抗体可施用于与肿瘤细胞最初由其获得的个体不同的受试者。
应当理解，本文描述的溶瘤病毒用于生成肿瘤特异性抗体介导的CDC应答的用途将在广泛范围的肿瘤细胞或癌症的治疗中有用，包括例如乳腺癌（例如乳腺细胞癌）、卵巢癌（例如卵巢细胞癌）、肾细胞癌(RCC)、黑素瘤（例如转移性恶性黑素瘤）、前列腺癌、结肠癌、肺癌（包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌）、骨癌、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、软骨肉瘤、胰腺癌、皮肤癌、纤维肉瘤，慢性或急性白血病包括急性淋巴细胞性白血病(ALL)、成人T细胞白血病(T-ALL)、急性髓样白血病、慢性髓样白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、淋巴管肉瘤、淋巴瘤（例如何杰金氏和非何杰金氏淋巴瘤、淋巴细胞淋巴瘤、原发性CNS淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、皮肤T细胞淋巴瘤、结节性小卵裂细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、伦南德氏(Lennert's)淋巴瘤、免疫母细胞性淋巴瘤、T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、中心母细胞性/中心细胞性(cb/cc)滤泡型淋巴瘤癌、B谱系的弥漫性大细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞淋巴结病(AILD)样T细胞淋巴瘤和基于HIV相关体腔的淋巴瘤）、卡斯尔曼病、卡波济氏肉瘤、血管肉瘤、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症及其他B细胞淋巴瘤、鼻咽癌、头或颈癌、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、移行细胞癌、食管癌、恶性胃泌素瘤、小肠癌、胆管细胞癌、腺癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道、阴茎癌、睾丸癌、恶性畸胎瘤、儿童期实体瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、恶性脑膜瘤、中枢神经系统(CNS)赘生物、肿瘤血管生成、脊柱肿瘤、垂体腺瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、环境诱导的癌症包括由石棉诱导的那些例如间皮瘤、和这些癌症的组合。
应进一步理解溶瘤病毒可包含可能需要递送给受试者的任何异源核酸。
术语“治疗有效量”或“有效量”是指足以在体外或在受试者（例如人、灵长类动物、犬、猪或牛）中减少、抑制或取消肿瘤细胞生长的重组溶瘤病毒组合物的量。如本文指出的，肿瘤细胞生长的减少、抑制或抵消可以是坏死、细胞凋亡或免疫应答的结果。治疗有效的重组溶瘤病毒组合物的量可依赖于在组合物中使用的具体溶瘤病毒、待治疗的受试者的年龄和状况、或肿瘤形成的程度等等而改变。
待在本发明的方法中使用的重组溶瘤病毒可以方便的方式进行施用，例如通过经口、静脉内、动脉内、瘤内、肌内、皮下、鼻内、真皮内或栓剂途径或通过植入（例如使用缓慢释放分子）。取决于辅助治疗如免疫治疗剂的施用途径，其中含有的试剂可能需要包被在材料中，以保护其不受否则将灭活试剂的酶、酸和其他天然条件的作用。为了通过除肠胃外施用外施用组合物，试剂将由材料覆盖或与材料一起施用以预防灭活。
本发明的重组溶瘤病毒还可以肠胃外或腹膜内施用。重组溶瘤病毒组分的分散体还可以在包括但不限于甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中进行制备。在普通贮存和使用条件下，这些制剂可含有防腐剂以阻止微生物的生长，例如抗生素如庆大霉素。
如本文使用的“可药用的载体和/或稀释剂”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。此类介质和试剂用于生物学活性物质的用途是本领域熟知的。补充性活性成分如抗微生物剂也可掺入组合物内。
载体可以是含有例如水、多元醇（例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等）、其合适混合物和植物油的溶剂或分散介质。适当的流动性可例如通过下述得到维持：使用包衣例如卵磷脂、在分散体的情况下维持所需粒子大小和使用表面活性剂。微生物作用的预防可通过多种抗细菌剂和抗真菌剂实现，例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况下，将优选包括等渗剂例如糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中使用延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来达到。
无菌可注射溶液通过下述进行制备：根据需要，将本公开内容的重组溶瘤病毒掺入所需量的具有本文列举的多种其他成分的合适溶剂中，随后为合适的灭菌方法。一般地，分散体通过将多种灭菌的活性成分掺入无菌媒介物内进行制备，所述无菌媒介物含有基础分散介质和来自上文列举那些的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其获得来自其先前无菌过滤溶液的重组溶瘤病毒加上任何另外所需成分的粉末。
以剂量单位形式配制肠胃外组合物对于容易施用和剂量的一致性可以是有利的。如本文使用的剂量单位形式是指适合作为单元剂量用于待治疗的哺乳动物受试者的物理不连续单位；每个单位含有与所需可药用或兽用载体组合的计算为产生所需疗效的预定数量的活性材料。
包含本公开内容的重组溶瘤病毒的药物组合物可借助于常规混合、溶解、粒化、锭剂制备、水飞、乳化、装入胶囊、诱陷或冻干方法进行制造。药物病毒组合物可以常规方式进行配制，其中使用一种或多种生理学可接受的载体、稀释剂、赋形剂或辅助试剂，其促进将活性重组溶瘤病毒配制成可生物学或药学使用的制剂。重组溶瘤病毒组合物可以与一种或多种生物学活性剂组合，并且可用可药用的载体、稀释剂或赋形剂配制，以生成本公开内容的药物或兽医学组合物。
用于治疗用途的可药用的载体、稀释剂或赋形剂是药学领域熟知的，并且在本文中以及例如在Remington'sPharmaceuticalSciences,MackPublishingCo.(A.R.Gennaro,编辑,18.sup.thEdition(1990))和CRCHandbookofFood,Drug,andCosmeticExcipients,CRCPressLLC(S.C.Smolinski,编辑(1992))中描述。在特定实施例中，重组溶瘤病毒组合物可用可药用或兽用的载体、稀释剂或赋形剂配制，所述载体、稀释剂或赋形剂是含水的，例如水或甘露醇溶液（例如约1%至约20%）、疏水溶液（例如油或脂质）或其组合（例如油和水乳状液）。在特定实施例中，本文描述的任何生物学或药物组合物具有防腐剂或稳定剂（例如抗生素）或是无菌的。
本公开内容的生物学或药物组合物可以配制为允许其中含有的重组溶瘤病毒在组合物施用于受试者后是生物可用的。在施用后在血清、肿瘤和其他组织中的重组溶瘤病毒水平可通过多种充分建立的技术进行监控，所述技术例如基于抗体的测定法（例如ELISA）。在特定实施例中，重组溶瘤病毒组合物配制用于肠胃外施用于有此需要的受试者（例如具有肿瘤的受试者），例如非人动物或人。优选的施用途径包括静脉内、动脉内、皮下、瘤内或肌内。
适当制剂依赖于选择的施用途径，如本领域已知的。例如，全身制剂是这样的实施例，其包括设计用于通过注射例如皮下、动脉内、静脉内、肌内、鞘内或腹膜内注射施用的那些，以及设计用于瘤内、经皮、经粘膜、经口、鼻内或肺施用的那些。在一个实施例中，全身或瘤内制剂是无菌的。在用于注射的实施例中，本公开内容的重组溶瘤病毒组合物可在水性溶液或生理学相容的溶液或缓冲液（例如汉克斯氏溶液、林格氏溶液、甘露醇溶液或生理盐水缓冲液）中配制。在特定实施例中，本文描述的任何重组溶瘤病毒组合物可含有配制试剂，例如悬浮、稳定或分散剂。在用于经粘膜施用的实施例中，适合于待渗透的屏障的渗透剂、增溶剂或润滑剂可用于制剂中。例如，1-十二烷基六氢-2H-氮杂卓-2-酮油酸、丙二醇、薄荷醇、二甘醇乙氧基二醇单乙醚聚山梨醇酯聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯和药物7-氯-1-甲基-5-苯基-3H-1,4-苯并二氮杂卓-2-酮(Diazepam)、肉豆蔻酸异丙酯及其他，例如本领域一般已知的渗透剂、增溶剂或润滑剂可用于本公开内容的任何组合物中。
施用可使用途径的组合来达到，例如使用动脉内途径的首次施用和经由静脉内或瘤内途径的后续施用、或其任何组合。
在具体实施例中，本公开内容提供在体内生成介导抗瘤CDC应答的抗体的方法，其包括给受试者施用包含复制型溶瘤病毒的组合物，其中所述组合物的施用产生介导对肿瘤特异性的CDC应答的抗体。本发明人已显示，通过施用复制型溶瘤病毒生成的肿瘤特异性抗体介导的抗瘤CDC应答可用于抑制癌细胞的生长或甚至杀死癌细胞。因此，通过以足以在动物中生成肿瘤特异性CDC应答的感染复数施用的根据本公开内容的重组溶瘤病毒将抑制肿瘤细胞的生长或杀死肿瘤细胞。在特定实施例中，重组溶瘤病毒施用超过一次，优选两次、三次、或最高达10次。在特定其他实施例中，肿瘤细胞在体内、离体或在体外进行处理。
可使用本公开内容的方法进行处理的肿瘤细胞或癌症的例子包括肝细胞癌、乳腺癌（例如乳腺细胞癌）、卵巢癌（例如卵巢细胞癌）、肾细胞癌(RCC)、黑素瘤（例如转移性恶性黑素瘤）、前列腺癌、结肠癌、肺癌（包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌）、骨癌、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、软骨肉瘤、胰腺癌、皮肤癌、纤维肉瘤，慢性或急性白血病包括急性淋巴细胞性白血病(ALL)、成人T细胞白血病(T-ALL)、急性髓样白血病、慢性髓样白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、淋巴管肉瘤、淋巴瘤（例如何杰金氏和非何杰金氏淋巴瘤、淋巴细胞淋巴瘤、原发性CNS淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、皮肤T细胞淋巴瘤、结节性小卵裂细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、伦南德氏(Lennert's)淋巴瘤、免疫母细胞性淋巴瘤、T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、中心母细胞性/中心细胞性(cb/cc)滤泡型淋巴瘤癌、B谱系的弥漫性大细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞淋巴结病(AILD)样T细胞淋巴瘤和基于HIV相关体腔的淋巴瘤）、卡斯尔曼病、卡波济氏肉瘤、血管肉瘤、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症及其他B细胞淋巴瘤、鼻咽癌、头或颈癌、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、移行细胞癌、食管癌、恶性胃泌素瘤、小肠癌、胆管细胞癌、腺癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道、阴茎癌、睾丸癌、恶性畸胎瘤、儿童期实体瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、恶性脑膜瘤、中枢神经系统(CNS)赘生物、肿瘤血管生成、脊柱肿瘤、垂体腺瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、环境诱导的癌症包括由石棉诱导的那些例如间皮瘤、和这些癌症的组合。
考虑到本发明显示通过用复制型溶瘤病毒治疗患者能够在癌症患者中产生抗体介导的肿瘤特异性CDC应答，本发明人已发现能够对于具有癌症的受试者具体地修改癌症治疗，其包括通过给受试者施用包含复制型溶瘤病毒的组合物，以产生介导对所述受试者中的所述癌症特异性的CDC应答的抗体。一旦生成这种应答，就从受试者中收集含有针对癌症的肿瘤特异性抗体和B细胞的血清且离体扩增。这个扩增的抗体和/或产生这些抗体的收获的B细胞群用作对癌症患者特异性的免疫治疗组合物。像这样，这种免疫治疗可施用于受试者以产生抗癌效应。免疫治疗组合物可在抗体分离后立即制备且施用于受试者，或它可贮存用于在受试者治疗的稍后阶段的进一步治疗。
离体扩增B细胞和抗体的方法是本领域技术人员熟知的，并且仅涉及抗体生产细胞在培养中的生长，并且涉及使用标准蛋白质纯化技术收获抗体。
在另外一个实施例中，该方法涉及重组溶瘤病毒的肠胃外施用，优选经由动脉或经由内置医疗装置。如上文指出的，重组溶瘤病毒可与免疫治疗剂或免疫调节剂一起施用，例如与肿瘤特异性抗原结合的抗体（例如嵌合、人源化或人单克隆抗体）。在另一实施例中，重组溶瘤病毒治疗可与手术（例如肿瘤切除/切除术）、放射治疗、化学治疗或免疫治疗组合，并且可以在互补治疗前、过程中或后施用。
例如，考虑本发明的方法包括通过给受试者施用溶瘤病毒来生成抗体介导的肿瘤特异性CDC应答，其中与溶瘤病毒的施用组合，受试者用对于人的另外癌症治疗进行治疗。在具体实施例中，另外的癌症治疗是化学治疗、辐射、手术、免疫治疗、基因治疗或其组合。在具体实施例中，癌细胞是在人中和/或引入步骤还定义为给人施用至少约1x109噬斑形成单位(pfu)的溶瘤病毒。
已评估约60%具有癌症的个人将经历某个类型的手术，其包括预防性、诊断或分期、治愈和保守性手术。治愈性手术是可与其他治疗结合使用的癌症治疗，所述其他治疗例如本发明的治疗、化学治疗、放射治疗、激素治疗、基因治疗、免疫治疗和/或替代治疗。
治愈性手术包括其中全部或部分癌性组织被物理去除、切除和/或破坏的切除术。肿瘤切除术是指至少部分肿瘤的物理去除。除了肿瘤切除术外，通过手术的治疗包括激光手术、冷冻手术、电外科手术和显微镜控制的手术（莫氏手术）。还考虑本发明可与浅表癌、初期癌或附带量的正常组织的去除结合使用。
在部分或全部癌性细胞、组织或肿瘤切除后，可在体内形成腔。治疗可通过用另外的抗癌治疗例如本文描述的溶瘤病毒施用的区域灌注、直接注射或局部应用来完成。此类治疗可例如每1、2、3、4、5、6或7天，或每1、2、3、4和5周，或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12月重复。这些治疗可具有不同剂量。
在本发明的治疗方法中，溶瘤病毒用于产生针对受试者中的肿瘤或癌症的抗体介导的应答。应答足以产生癌症或肿瘤的治疗，例如通过杀死癌细胞、在癌细胞中诱导细胞凋亡、减少癌细胞的生长率、减少转移灶的发生或数目、减少肿瘤大小、抑制肿瘤生长、减少对肿瘤或癌细胞的血液供应、促进针对癌细胞或肿瘤的免疫应答、预防或抑制癌症的进展、或增加具有癌症的受试者的寿命。更一般地，抗体或产生抗体的B细胞可与常规抗癌治疗组合使用，以提供组合效应以杀死细胞或抑制细胞的增殖。
提供下述非限制性实例以举例说明本公开内容的多个方面。所有参考文献、专利、专利申请、公开的专利申请等以引用的方式整体并入本文。
实例
包括下述实例以证实本发明的优选实施例。本领域技术人员应当理解，在下文的实例中公开的技术代表由本发明人发现在本发明的实践中良好工作的技术，并且因此可视为构成用于其实践的优选方式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应当理解可以在公开的具体实施例中作出许多变化，并且仍获得相同或相似结果，而不背离本发明的精神和范围。
实例1：方法
病毒和细胞系：在本研究自始至终使用JX-594，Wyeth菌株痘苗病毒（胸苷激酶[TK]灭活的，表达hGM-CSF），并且如先前公开的进行制备24。SNU349、SUN482和SNU267（人肾细胞癌；得自韩国细胞系库[KCLB]）以及SNU475和SNU398（人肝细胞癌；得自KCLB）在补充有10%FBS(Hyclone)与青霉素和链霉素的RPMI1640(Gibco)中培养。HOP62、H157、H460和PC10（人肺癌；得自美国典型培养物中心[ATCC]）、HepG2（人肝细胞癌；得自ATCC）、SF-295（人胆囊癌；得自ATCC）、PC-3（人前列腺癌；得自ATCC）、PANC-1（人胰腺癌；ATCC）、MCF-7（人乳腺癌；ATCC）在含有10%FBS与青霉素和链霉素的DMEM培养基中进行培养。MRC-5未转化的细胞（肺成纤维细胞；ATCC）和HUVEC（内皮细胞；ATCC）MRC-5在补充有2%胎牛血清(FBS)与青霉素和链霉素的内皮细胞培养基EBM-2(Lonza,MD,USA)中进行培养。
兔VX2肿瘤模型和VX2细胞的分离：VX2肿瘤在近交新西兰白兔（Samtako,Oh-San,韩国）的肌肉中生长且维持。JX-594(1×109pfu)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)在VX2片段植入骨骼肌内后3周和4周时注射。在基线时、在JX-594或PBS处理后3周和6周时收集血清。如先前描述的分离VX231。简言之，从VX2组织中酶促（胶原酶0.01%蛋白酶0.1%在4℃下过夜）分离VX2，并且在体外用具有10%胎牛血清(FBS)的达尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)维持8代。新鲜的VX2细胞用于每个细胞生存测试。在平行研究中，将JX-594注射到正常、非荷瘤兔内，并且获得血清。
细胞生存和CDC测定法：当加入血清（非热处理）时，细胞生存减少。通过在96孔板中与5%血清一起温育后测量细胞生存来评价CDC活性。在JX-594施用后的血清中的细胞生存针对在基线时（在JX-594处理前）的兔或患者血清的细胞生存标准化。将每个细胞系种植到96孔板上并且温育过夜。细胞随后与DMEM（无FBS）和血清样品一起在37℃下温育4小时。细胞随后暴露于PBS和10μl细胞计数试剂盒-8(CCK-8)溶液（CCK-8试剂盒，Dojindo,Inc.,Kumamoto,日本），并且在37℃下温育2小时。通过在450nm处的光密度测量细胞生存。
蛋白质印迹：VX2细胞、兔外周血单核细胞、SNU349或SNU739细胞以～1×106细胞/mL在PRO-PREPTM蛋白质提取溶液（iNtRONBiotechology,韩国）中在冰上溶解30分钟。在离心后，使用SDS-PAGE凝胶分离50μg蛋白质，然后将蛋白质转移至PVDF膜(Immunobilon-P;Millipore,Billerica,MA)。将血清在0.1%TBST（5%脱脂奶粉；0.1%Tween20;50mmol/LTris;150mmol/LNaCl）中稀释1/100，并且在PVDF膜上在室温下温育90分钟。膜随后与在0.1%TBST中1/10,00稀释的辣根过氧化物酶缀合的山羊抗兔IgG(StantaCruz)（兔血清初次）或抗人IgG(Sigma#A1543,1:5,000)（人血清初次）一起在室温下温育1小时，并且通过增强化学发光（ECL试剂盒；Pierce,Rockford,IL）进行显现。
荧光和共焦显微镜检查：将每个细胞系铺平板到6孔板内，并且将细胞温育24小时以达到100%细胞密度。对于荧光染色，将SNU349细胞以3×105细胞种植到玻璃底皿内，并且静置过夜。加入羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CSFE)和7-氨基-放线菌素D(7-AAD)(ACT1TMAssayforCytoToxicity,CellTechnology)，以分别染色活细胞和濒死细胞。在活细胞中，可检测到CSFE（全细胞中的绿色荧光），而红色荧光可在死细胞的核中检测到。
SEREX研究：由从SNU449中提取的mRNA构建cDNA文库，所述SNU449是人肝细胞癌(HCC)细胞系。将cDNA文库克隆到λZAP表达载体(ZAP-cDNASyhthesisKit,[StratageneCA])内。扩增文库的滴度是1×109pfu/ml，并且将5×105pfu用于针对人血清的初次免疫筛选。噬菌斑在42℃下6-8小时温育后出现，并且随后转移到132mm硝酸纤维素膜(Millipore,Bedford)内，所述硝酸纤维素膜先前在10mMIPTG(Sigma-Aldrich,USA)中浸泡30分钟。用5%BSA(SantaCruz,USA)封闭硝酸纤维素膜。来自JX-594治疗的HCC患者的合并血清（在JX-594注射后第57天）用于初次和二次筛选。将来自具有最高CDC活性的患者的血清合并用于这个研究（患者#1702、#1703、#1704、#1705、#1712、#1713和#1715)。加入合并的血清（6ml1:100稀释的血清）用于初次抗体筛选，用1:5000稀释的碱性磷酸酶标记的山羊抗人IgG(Sigma-Aldrich,USA)检测结合的抗体，并且随后膜用预混合的BCIP/NBT溶液(Sigma-Aldrich,USA)显色。蓝色噬斑对应于膜从琼脂平板提取，并且置于含有20μl氯仿的SM缓冲液100mMNaCl、50mMTris-HCl(pH7.5)、10mMMgSO4)内。在筛选70块平板后（5块平板用于1轮），我们分离了70个阳性噬斑。在第二轮筛选（82mm平板）后，将11个噬斑纯化至单克隆性（具有高密度的>90%阳性噬斑）。在来自每个克隆的DNA提取后，测序DNA。
斑点印迹：关于每个阳性克隆的大肠杆菌(E.coli)噬菌体溶解产物在SM缓冲液中稀释5倍，并且将1μL稀释的溶解产物点在Whartman膜（Whartman，德国）的测试条上。在风干5分钟后，将所有测试条浸入封闭溶液中1小时。将膜在1:50JX-594注射前（0周、2周、4周）或注射后（第57天）人血清中温育1小时。用1:2500稀释的碱性磷酸酶标记的山羊抗人IgG(Sigma-Aldrich,USA)检测结合的抗体，并且用BCIP/NBT溶液显色。
实例2：CDC在动物模型和人患者中被诱导
在肿瘤细胞与来自荷瘤、JX-594处理的兔的血清一起温育后观察到减少的细胞生存。为了研究兔模型中的CDC诱导，从用JX-594或PBS对照处理的荷有植入肌肉内的VX2腺癌的兔中收集血清。在注射后第28天时收集的血清在体外以3%的浓度加入VX2细胞或兔外周血单核细胞(PBMC)中。仅在与来自JX-594处理、荷有VX2肿瘤的兔的血清一起温育的细胞中观察到细胞生存的显著减少（约90%）（图1a）。VX2细胞与来自用PBS处理的荷有VX2肿瘤的兔或用JX-594处理的非荷瘤兔的血清一起温育，未显示出减少的细胞生存。此外，在与来自任何处理组的血清一起温育后，PBMC生存未显著减少。随后在与JX-594（或PBS）注射后的多个时间点收集的血清一起温育后评价VX2细胞生存。在与荷有VX2肿瘤的、JX-594处理的兔中从第18天向前收集的血清一起温育后，VX2细胞生存减少（图1b）。增加浓度的血清（直至2%）导致VX2细胞生存的剂量依赖性减少（图1c）。当与用正常兔血清对照处理相比较时，细胞与2%血清一起温育导致约20%VX2细胞生存。为了评价来自荷有VX2、JX-594处理的兔的血清是否结合新型抗原，用来自首次用于实验的兔和JX-594处理的荷瘤兔的血清对VX2和PBMC细胞溶解产物执行蛋白质印迹。仅在VX2细胞系溶解产物中观察到与新抗原的强反应性，并且在荷有VX2肿瘤的兔的JX-594处理后识别多个新条带，从而指示针对VX2肿瘤抗原的多克隆抗体的诱导（图1d）。
在人癌细胞系与来自JX-594治疗的患者的血清一起温育后减少的细胞生存的证据。在检测到通过与来自JX-594处理的、荷瘤兔的兔血清一起温育触发的细胞生存的显著减少后，我们寻求鉴定类似活性是否能够在从JX-594治疗的患者中收集的血清中观察到。本发明人通过测试来自在1期肝脏肿瘤试验时治疗的两个患者的血清开始，所述患者具有显著应答和JX-594治疗后的长期存活（患者103：肺癌，24.5个月存活；患者301：肾细胞癌，44.1+个月存活）26。事实上，类似于在临床前模型中的观察，癌细胞系与JX-594治疗的患者血清(5%)一起温育导致细胞生存的显著减少（图2a）。测试与患者的癌症相同起源的癌细胞系，并且在大多数细胞系中观察到细胞生存的时间依赖性减少。在明视野显微镜检查下的细胞可视化揭示了膜攻击复合物(MAC)的形成，这指示减少的细胞生存通过CDC触发（图2b）。CSFE和7-AAD染料分别用于染色活细胞和死细胞。7-AAD染色证实用来自JX-594免疫患者的血清处理的细胞经历细胞死亡。
实例3：减少的细胞生存是由于抗体介导的补体依赖性细胞毒性
我们接下来测试抗体和补体的贡献，以评估来自JX-594治疗的患者的血清通过其介导癌细胞细胞毒性的机制。将来自JX-594治疗的患者的血清热灭活，以抑制任何补体活性。结合IgG的柱用于去除来自血清的抗体（参考图3a中的实验概述）。基线血清（在JX-594治疗前，血清A）、在JX-594治疗后92天获得的血清（血清B）、热灭活的血清B（血清C）和经过IgG树脂的血清B（血清E）以5%的浓度加入癌细胞单层。在基线时收集的血清未导致减少的细胞生存，而在JX-594治疗起始后92天收集的血清显示出有力的抗瘤活性。然而，细胞在热灭活或IgG耗尽后仍是活的。此外，在血清C中的功能补体的恢复（通过加入在基线时收集的血清A并且本身未显示出减少的细胞生存）导致抗瘤活性的恢复。用来自在1期研究时治疗的总共三个患者（301-肾癌；103-肺癌；304-黑素瘤）的血清样品和对应于患者的肿瘤类型的细胞系得到类似观察（图3b）。在血清温育（患者301）后的细胞系的明视野图像呈现于图3c中。最后，关于热灭活的长度观察到细胞生存的时间依赖性增加（图3d）。
CDC活性对肿瘤细胞特异性且在相同肿瘤类型的细胞中更有效。我们接下来研究来自JX-594治疗的患者的血清是否能够离体引起对正常人细胞的毒性。当与来自测试的五个患者中的任一个的血清一起温育时，HUVEC内皮细胞和MRC-5肺成纤维细胞未显示出显著减少的细胞生存。一般地，在其起源对应于患者的肿瘤类型（肾癌、黑素瘤和HCC）的细胞中观察到减少的细胞生存（图4a-d）。存活与CDC1期相比较。
在随机化2期试验中评价CDC诱导在进行中的随机化2期试验时治疗的HCC患者中分析CDC诱导。在与来自JX-594治疗的患者的血清一起温育后，在HCC细胞系中观察到减少的细胞生存。CDC活性随着时间过去而增加（图4b概括，图c-e个别细胞系）。
实例4：SEREX筛选导致内源、新型肿瘤抗原的鉴定
为了评价患者血清是否结合新型抗原，使用来自与患者的肿瘤相同的组织来源的癌细胞系的细胞溶解产物和患者血清（来自在1和2期试验时显示出显著CDC的患者）执行蛋白质印迹。在JX-594治疗后的血清中观察到与新抗原的强反应性，显示针对患者的内源肿瘤抗原的多克隆抗体的诱导（图6）。为了鉴定新型靶抗原，在由人HCC细胞系(SNU449)生成的cDNA文库上，使用从具有强CDC活性的具有HCC的患者合并的血清，执行SEREX筛选。在两轮筛选后，鉴定17个候选抗原（图7，表1）。抗原亚组例如RecQ蛋白质样（DNA解旋酶Q1样）(RECQL)和瘦素受体(LEPR)先前已鉴定为用于HCC或其他癌症的靶标，而其他[包括ERBB受体反馈抑制剂1(ERRFI1)、溶酶体蛋白质跨膜4α(LAPTM4A)和RAS癌基因家族(RAB1B)]是假定的HCC抗原且代表HCC中的潜在新型靶标。就针对11个鉴定抗原的反应性测试在JX-594治疗前收集的患者血清的反应性。针对抗原亚组的抗体在JX-594治疗前存在，然而，一般反应性在JX-594治疗后更强，从而显示用复制型痘病毒的治疗诱导识别肿瘤抗原的多克隆抗体。
实例5：讨论
用于癌症的首个免疫治疗(Provenge,Dendreon,SeattleWA)的批准已验证对癌症治疗的这种新型方法。使自体树突状细胞群在再输注到患者内之前暴露于融合至GM-CSF的前列腺癌抗原，并且这种方法已证实改善具有去势抗性前列腺癌的患者的存活32。非特异性免疫刺激方法也已作为癌症免疫治疗进行评估，包括用免疫刺激细胞因子例如IL-2的治疗。在免疫刺激细胞因子或共刺激分子的背景下表达肿瘤抗原的许多非复制型病毒疫苗已作为肿瘤疫苗进行评估。虽然在诱导肿瘤特异性免疫应答方面是有效的，但这些策略未导致对患者的显著存活益处，并且没有病毒癌症疫苗已由管理机构批准。虽然已观察到针对肿瘤抗原的抗体的泛发诱导9,33，但未知这些抗体是否是功能的，例如它们是否介导CDC。
虽然溶瘤病毒复制和转基因表达已在临床试验中重现性证实，但全身功能的抗癌免疫诱导迄今为止仍未在用JX-594或其他溶瘤病毒的任何试验上进行系统评估。CD3+CD4+和CD3+CD8+淋巴细胞、天然杀伤细胞和多种炎症细胞因子的泛发诱导已得到证实26。在用HSV-hGM-CSF(Oncovex,Biovex,CambridgeMA)的黑素瘤临床试验中，衍生自肿瘤样品的T细胞的表型分析显示与外周血T细胞的独特差异。与衍生自未治疗的对照患者的T细胞相比较，在疫苗接种后经历消退的肿瘤中存在由T细胞(MART-1)特异性T细胞识别的黑素瘤相关抗原的增加；未评价功能抗瘤免疫28。临床前研究已证实溶瘤病毒可诱导功能癌症特异性免疫，但缺乏临床数据24、34-38。
补体系统包含一系列血清蛋白质，其是先天性免疫系统的一部分。补体系统在针对感染的防御中起作用（例如通过调理作用或直接溶解侵入细菌）并且还形成在先天性和适应性免疫之间的联系30。特别地，补体蛋白质具有溶解由抗体调理的细胞的潜力，所述抗体响应外源抗原被诱导。事实上，补体介导的细胞毒性(CDC)是最有力的细胞杀死系统之一30。CDC活性通过目前在恶性肿瘤治疗中使用的单克隆抗体(mAb)利用。CDC对利妥昔单抗（CD20特异性mRNA）的抗瘤功效的贡献已在临床前广泛评估39-41。此外，补体系统在具有滤泡型淋巴瘤的患者中的利妥昔单抗治疗中的牵涉得到下述观察支持：在C1q补体级联基因中具有多态性的患者具有增加的进展时间42。其他抗体已显示介导癌细胞系或患者样品中的CDC，包括用于慢性淋巴细胞性白血病的阿仑珠单抗43以及不同起源的癌细胞系的帕木单抗和西妥昔单抗44。这些观察已导致改善肿瘤靶向的mAb的固有CDC活性的策略的开发45-47以及用改善CDC活性的试剂的联合治疗的开发48。然而，存在用治疗剂的CDC活性的进一步增强的一些关注，所述治疗剂不是癌症特异性的，例如利妥昔单抗，因为可观察到与正常CD20表达PBMC相比较的细胞毒性的增强48。
痘苗病毒已显示对补体介导的中和是抗性的，以便促进病毒的全身扩散。这归于补体调节蛋白质包括在细胞外有包膜的病毒(EEV)形式的痘苗的外衣壳内49。然而，已证实由于用于掺入释放的病毒粒子的包膜内的补体调节蛋白质的耗尽，由痘苗病毒感染的肿瘤细胞可能对补体介导的中和更敏感49、50。在肿瘤微环境内来自JX-594感染的细胞的GM-CSF表达可增强CDC介导的通过NK细胞和巨噬细胞的刺激和扩增的杀死51。事实上，JX-594复制可触发肿瘤内的炎症，并且炎性浸润已在用JX-594瘤内治疗的黑素瘤病灶中检测到29。
此处，我们证实在用溶瘤病毒治疗的患者中的功能抗瘤免疫诱导的第一手证据。JX-594离体诱导肿瘤细胞的抗体依赖性CDC，如在得自荷瘤兔以及具有多种晚期、治疗抗性肿瘤的患者的血清中证实的。复制型溶瘤痘病毒作为抗癌免疫治疗的用途具有超过其他免疫治疗策略的主要优点：1）抗癌免疫应答的诱导代表治疗的一种作用机制；其他包括肿瘤细胞的直接感染和溶解以及急性肿瘤血管关闭；2）溶瘤痘病毒感染触发患者特异性/修改的免疫应答；3）不需要离体操作步骤用于治疗（尽管有效，但临床验证的Provenge方法是费力的，要求每个患者的免疫细胞的离体操作），和4）免疫刺激通过肿瘤细胞的活性病毒感染触发，所述活性病毒感染触发肿瘤微环境内的炎症反应。免疫治疗领域中的主要障碍是活化的免疫效应细胞被召募至肿瘤且在肿瘤内活化。溶瘤痘病毒代表通过其刺激适应性免疫应答的诱导的最佳媒介物，同时触发在肿瘤微环境内的促炎细胞因子的诱导和局部炎性应答，其确保免疫细胞在肿瘤中的召募和活化。
此处概述的系统代表通过其可鉴定新型、患者内源肿瘤抗原的机制。SEREX筛选鉴定先前表征的肿瘤抗原，从而验证目前方法，以及鉴定代表用于HCC治疗的新潜在靶标的新型肿瘤相关抗原。此处概述的实验设计涉及(1)用复制型溶瘤痘病毒治疗患者，(2)离体测量功能抗瘤免疫（CDC测定法），和(3)对具有高CDC活性的患者血清执行SEREX筛选，以鉴定靶抗原，代表用于发现新型肿瘤抗原的新型方法。这种方法允许鉴定多重有关抗原（能够由抗体识别的患者内源抗原），针对所述抗原的抗体的生成是安全的（因为抗体在人中生成，无有害作用）。此处我们已证实在具有HCC的患者中关于这种方法的概念证明，然而，这种方法可类似地用于任何其他肿瘤类型。
此外，目前评价在JX-594治疗的患者中针对肿瘤抗原、痘苗病毒以及JX-594转基因β-半乳糖苷酶的细胞毒性T淋巴细胞的诱导。研究用抗血管生成剂包括索拉非尼的联合治疗（在2期试验中测试的方案）对JX-594诱导的CDC的作用。
实例6：溶瘤痘苗、GM-CSF和呼肠孤病毒对介导CDC的肿瘤特异性抗体诱导的作用
设计研究以显示复制型溶瘤病毒差异诱导介导CDC的肿瘤特异性抗体。抗体诱导可通过免疫刺激细胞因子的表达增强。在这些的第一个中，评价溶瘤痘苗、GM-CSF和呼肠孤病毒对介导CDC应答的肿瘤特异性抗体诱导的作用，并且数据显示于图9中。
用PBS、UV灭活的表达人GM-CSF的JX-594、表达人GM-CSF的JX-594、表达鼠JX-594的JX-594、JX-963或呼肠孤病毒(n=2)两次每周一次的静脉内输注处理荷有VX2肿瘤的兔。病毒以1×109pfu的剂量施用。在基线时和在治疗起始后3周收集血清。使兔血清在体外与以所述浓度的A2780细胞一起温育3小时。使用CCK-8试剂盒评价相对于与治疗前血清一起温育的A2780细胞生存的细胞生存。
根据这些研究可见，表达人GM-CSF（在兔中生物学活性的细胞因子）的JX-594在2.5%的血清浓度时开始诱导CDC。完全CDC活性在5%血清浓度时达到。类似地，JX-963在2.5%血清浓度时诱导CDC，其中最大CDC在5%血清浓度时达到。介导CDC的抗体的诱导依赖于兔中的溶瘤痘苗复制，因为与从用UV灭活的表达人GM-CSF的JX-594（致使非复制）或PBS处理的兔中收集的血清一起温育的A2780在测试的任何浓度均未诱导CDC。类似地，从用呼肠孤病毒（目前在作为溶瘤试剂的临床开发中的双链RNA病毒）处理的兔中收集的血清在测试的任何浓度均未诱导CDC。最后，用表达鼠GM-CSF（其不像人GM-CSF一样在兔中是生物学活性的）的JX-594处理仅在较高的血清浓度时诱导CDC。这些结果指示免疫刺激细胞因子GM-CSF的表达可增强介导CDC的抗瘤抗体的诱导。
实例7：溶瘤痘苗、GM-CSF和VSV对介导对于人癌细胞的CDC的肿瘤特异性抗体诱导的作用
在下一组研究中，评价溶瘤痘苗、GM-CSF和VSV对介导CDC应答的肿瘤特异性抗体诱导的作用，并且数据显示于图10中。
对于这些实验，用表达人GM-CSF的JX-594(1×109pfu)、表达鼠JX-594的JX-594(1×109pfu)、西部储备(WesternReserve)痘苗(1×109pfu)、水疱性口炎病毒(VSV)(6×108pfu)或表达鼠GM-CSF的VSV(6×108pfu)(n=2)两次每周一次的静脉内输注处理荷有VX2肿瘤的兔。在基线时和在治疗起始后3周收集血清。使兔血清在体外与以所述浓度的A2780细胞一起温育3小时。使用CCK-8试剂盒评价相对于与治疗前血清一起温育的A2780细胞生存的细胞生存。
在这个实验中，表达人GM-CSF(JX-594)的JX-594在诱导介导CDC的抗体方面是最有效的，其中细胞生存的减少在与1.25%和2.5%血清一起温育后是显而易见的。相比之下，用表达鼠GM-CSF（其不像人GM-CSF一样在兔中是生物学活性的）的JX-594处理仅在较高的血清浓度时诱导CDC（注：作为另外对照，表达鼠GM-CSF的VSV在测试的任何浓度时均未诱导CDC）。此外，用痘苗的野生型西部储备株（其不编码GM-CSF）处理兔在诱导介导CDC的抗体方面是较不有效的。最后，用单链负义RNA病毒VSV处理仅在测试的最高血清浓度(10%)时诱导介导CDC的抗体。这些结果显示，依赖于溶瘤病毒生物学，可观察到不同水平的CDC应答。
实例8：溶瘤HSV和VSV-GM-CSF对介导对于人癌细胞的CDC的肿瘤特异性抗体诱导的作用
在这组实验中，评价溶瘤HSV和VSV-GM-CSF对介导对于人癌细胞的CDC的肿瘤特异性抗体的诱导，并且数据显示于图11中。
用表达鼠GM-CSF的VSV(6×108pfu)或单纯疱疹病毒(HSV)(1×109pfu)(n=2)两次每周一次的静脉内输注处理荷有VX2肿瘤的兔。在基线时和在治疗起始后3周收集血清。使兔血清在体外与以所述浓度的A2780细胞一起温育3小时。使用CCK-8试剂盒评价相对于与治疗前血清一起温育的A2780细胞生存的细胞生存。
在这个实验中，HSV在诱导介导CDC的抗体方面是最有效的，其中细胞生存的减少在与5%和10%血清一起温育后是显而易见的。表达GM-CSF的VSV在这个实验中未诱导CDC（尽管在10%血清浓度时观察到高变异性）。
实例9：溶瘤痘苗、GM-CSF和VSV对介导对于衍生自体内靶细胞的兔癌细胞的CDC的肿瘤特异性抗体诱导的作用
在这组实验中，评价溶瘤痘苗、GM-CSF和VSV对介导对于来自体内靶肿瘤的兔癌细胞的CDC的肿瘤特异性抗体诱导的作用b并且数据显示于图12中。
用表达人GM-CSF的JX-594(1×109pfu)、表达鼠JX-594的JX-594(1×109pfu)、西方储备痘苗(1×109pfu)、水疱性口炎病毒(VSV)(6×108pfu)、或表达鼠GM-CSF的VSV(6×108pfu)、或UV灭活的表达人GM-CSF的JX-594(n=2)两次每周一次的静脉内输注处理荷有VX2肿瘤的兔。在基线时和在治疗起始后3周收集血清。使兔血清在体外与VX2细胞一起温育24小时。使用CCK-8试剂盒评价相对于与治疗前血清一起温育的VX2细胞生存的细胞生存。
为了诱导对于VX2靶细胞的CDC，将在溶瘤病毒施用前收集的血清中含有的另外补体掺料到3%治疗后血清内。如先前实验中，UV灭活的JX-594在这个背景中不能诱导介导CDC的抗体。表达人GM-CSF的JX-594、表达鼠GM-CSF的JX-594和西部储备痘苗均在这个测定法中诱导CDC，从而支持复制型痘苗病毒诱导介导CDC的抗瘤抗体的能力（在这个背景中，靶细胞衍生自在溶瘤病毒处理的兔中产生针对其的抗体的肿瘤）。VSV（+/-鼠GM-CSF）在诱导抗瘤抗体方面不像测试的任何溶瘤痘苗病毒一样有效。
实例10：溶瘤痘苗和鼠GM-CSF表达介导在鼠肿瘤模型中介导CDC的肿瘤特异性抗体的诱导
在这个实例中，评价溶瘤痘苗和鼠GM-CSF介导在鼠肿瘤模型上介导CDC的肿瘤特异性抗体的诱导的作用,并且数据显示于图13中。
用表达人GM-CSF的JX-594、表达鼠JX-594的JX-594、PBS或UV灭活的表达人GM-CSF的JX-594(n=3)四次每周一次的静脉内输注处理荷有CT26肿瘤的小鼠。病毒以1×107pfu的剂量施用。在基线时和在治疗起始后4周收集血清。使小鼠血清在体外与A2780细胞一起温育24小时。使用CCK-8试剂盒评价相对于与治疗前血清一起温育的A2780细胞生存的细胞生存。
在同基因小鼠模型（荷有皮下CT26肿瘤的Balb/C小鼠）中重复CDC实验。表达鼠GM-CSF的JX-594在诱导介导CDC的抗瘤抗体方面是最有效的。表达人GM-CSF的JX-594（JX-594；已知人GM-CSF在啮齿类动物中不是活性的）以及UV灭活的表达鼠GM-CSF的JX-594对CDC诱导具有中间作用（当与PBS和表达鼠GM-CSF的JX-594相比较时）。这可能指示在这个小鼠模型中，复制以及高水平的鼠GM-CSF表达（其仅在用复制型痘苗主链处理后出现）是诱导在体外介导CDC的高滴度抗瘤抗体必需的。
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表格

Claims (18)

1.复制型溶瘤病毒在制备药物中的用途，所述药物用于在具有肿瘤的动物中诱导肿瘤特异性抗体介导的补体依赖性细胞毒性应答的方法中，所述方法包括：
(a)施用所述药物，所述药物的量在所述动物中有效诱导介导对所述肿瘤特异性的CDC应答的抗体，和然后
(b)从包含所述抗体和/或产生所述抗体的B细胞的所述动物收获血液样品，和
(c)确认所述抗体和/或产生所述抗体的B细胞在所述血液样品中的存在。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述溶瘤病毒选自痘苗病毒，水疱性口炎病毒和单纯疱疹病毒。
3.根据权利要求2所述的用途，其中所述病毒是痘苗病毒。
4.根据权利要求2所述的用途，其中所述溶瘤病毒是JX-594。
5.根据权利要求1所述的用途，其中所述溶瘤病毒包含异源核酸，所述异源核酸序列编码GM-CSF、胞嘧啶脱氨酶、羧基酯酶、NIS、或生长抑素受体。
6.根据权利要求5所述的用途，其中所述异源核酸序列编码GM-CSF。
7.根据权利要求1所述的用途，其中所述肿瘤选自星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、神经纤维瘤、成胶质细胞瘤、室管膜瘤、许旺细胞瘤、神经纤维肉瘤、成神经细胞瘤、垂体腺瘤、成髓细胞瘤、头与颈癌、黑素瘤、前列腺癌、肾细胞癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、骨癌、直肠癌、卵巢癌、肉瘤、食管癌、宫颈癌、纤维肉瘤、鳞状细胞癌、神经外胚层瘤、甲状腺瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、肝瘤、间皮瘤、表皮样癌和血液的致瘤疾病。
8.根据权利要求1所述的用途，其中所述方法还包括，从所述血液中分离产生CDC应答的抗体。
9.根据权利要求1所述的用途，其中所述方法还包括，扩增或分离所述抗体和/或由所述B细胞产生抗体，以产生免疫治疗药物，和给所述动物施用所述免疫治疗药物。
10.根据权利要求1所述的用途，其中所述方法还包括，扩增或分离所述抗体和/或由所述B细胞产生抗体，以产生免疫治疗药物，和给患有相同癌症的不同动物施用所述免疫治疗药物。
11.根据权利要求1、9和10任一项所述的用途，其中在所述方法中，给所述动物施用进一步的抗癌治疗剂。
12.根据权利要求9或10所述的用途，其中所述动物或所述不同的动物具有实体瘤，并且所述免疫治疗药物以瘤内、静脉内、腹膜内或其组合施用，任选地，所述实体瘤在施用所述免疫治疗药物之前、同时或之后被切除。
13.根据权利要求9或10所述的用途，其中所述动物或所述不同的动物具有实体瘤，并且所述肿瘤的尺寸和/或所述实体瘤的转移性扩散得以减少。
14.根据权利要求10所述的用途，其中所述癌症选自星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、神经纤维瘤、成胶质细胞瘤、室管膜瘤、许旺细胞瘤、神经纤维肉瘤、成神经细胞瘤、垂体腺瘤、成髓细胞瘤、头与颈癌、黑素瘤、前列腺癌、肾细胞癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、骨癌、直肠癌、卵巢癌、肉瘤、食管癌、宫颈癌、纤维肉瘤、鳞状细胞癌、神经外胚层瘤、甲状腺瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、肝瘤、间皮瘤、表皮样癌和血液的致瘤疾病。
15.根据权利要求1所述的用途，其中在所述方法中，将从步骤(b)的血液样品获得的血清与表达载体接触，所述表达载体包含由癌细胞制备的cDNA文库，和鉴定由所述血清识别的一种或多种抗原。
16.根据权利要求1～10和15任一项所述的用途，其中所述动物是人。
17.一种组合物，其包含根据权利要求8分离的产生CDC应答的抗体，其中所述抗体识别选自下列的多重肿瘤细胞抗原：RecQ蛋白样(DNA解螺旋酶Q1样)(RECQL)、瘦素受体(LEPR)、ERBB受体反馈抑制剂1(ERRFI1)、溶酶体蛋白跨膜4α(LAPTM4A)、RAS癌基因家族(RAB1B)、CD24、智人胸腺肽β4，X连锁的(TMSB4X)、智人S100钙结合蛋白A6(S100A6)、智人腺苷A2b受体(ADORA2B)、染色体16开放阅读框61(C16orf61)、ROD1分化调节因子1(ROD1)、NAD-依赖性脱乙酰基酶sirturin-2(SIR2L)、微管蛋白α1c(TUBA1C)、ATP酶抑制因子1(ATPIF1)、基质抗原2(STAG2)、真核细胞翻译延伸因子1α1(EEF1A1)、核酪蛋白激酶和周期蛋白依赖性激酶底物1(NUCKS1)及APEX核酸酶1(APEX1)。
18.根据权利要求17的组合物，其中所述组合物是从所述动物收集的血清。
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