CN109419818A - 一种用于治疗肿瘤的埃可病毒 - Google Patents

一种用于治疗肿瘤的埃可病毒 Download PDF

Info

Publication number
CN109419818A
CN109419818A CN201710734483.1A CN201710734483A CN109419818A CN 109419818 A CN109419818 A CN 109419818A CN 201710734483 A CN201710734483 A CN 201710734483A CN 109419818 A CN109419818 A CN 109419818A
Authority
CN
China
Prior art keywords
echo25
sequence
cancer
modified
nucleic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201710734483.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109419818B (zh
Inventor
程通
王玮
万俊凯
徐龙发
叶祥忠
张军
夏宁邵
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
YANGSHENGTANG CO Ltd
Yang Sheng Tang Co Ltd
Xiamen University
Original Assignee
YANGSHENGTANG CO Ltd
Xiamen University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to CN201710734483.1A priority Critical patent/CN109419818B/zh
Application filed by YANGSHENGTANG CO Ltd, Xiamen University filed Critical YANGSHENGTANG CO Ltd
Priority to KR1020207008441A priority patent/KR20200090146A/ko
Priority to JP2020531804A priority patent/JP7373168B2/ja
Priority to EP18849336.5A priority patent/EP3674398A4/en
Priority to PCT/CN2018/100708 priority patent/WO2019037642A1/zh
Priority to CA3073770A priority patent/CA3073770A1/en
Priority to US16/641,117 priority patent/US11707496B2/en
Priority to AU2018320550A priority patent/AU2018320550A1/en
Publication of CN109419818A publication Critical patent/CN109419818A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109419818B publication Critical patent/CN109419818B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/711—Natural deoxyribonucleic acids, i.e. containing only 2'-deoxyriboses attached to adenine, guanine, cytosine or thymine and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/407—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with other heterocyclic ring systems, e.g. ketorolac, physostigmine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/513—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. cytosine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/555—Heterocyclic compounds containing heavy metals, e.g. hemin, hematin, melarsoprol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A61K31/675—Phosphorus compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pyridoxal phosphate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7048—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having oxygen as a ring hetero atom, e.g. leucoglucosan, hesperidin, erythromycin, nystatin, digitoxin or digoxin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A61K35/768—Oncolytic viruses not provided for in groups A61K35/761 - A61K35/766
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/12—Animals modified by administration of exogenous cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0331—Animal model for proliferative diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32311—Enterovirus
    • C12N2770/32321—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32311—Enterovirus
    • C12N2770/32322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32311—Enterovirus
    • C12N2770/32332—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32311—Enterovirus
    • C12N2770/32333—Use of viral protein as therapeutic agent other than vaccine, e.g. apoptosis inducing or anti-inflammatory

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明涉及病毒领域和肿瘤治疗领域。具体而言，本发明涉及埃可病毒25型(ECHO25)或其修饰形式，或包含ECHO25或其修饰形式的基因组序列或cDNA序列，或所述基因组序列或cDNA序列的互补序列的核酸分子，用于在受试者(例如，人)中治疗肿瘤的用途，以及在制备用于在受试者(例如，人)中治疗肿瘤的药物组合物中的用途。本发明还涉及一种治疗肿瘤的方法，其包括向有此需要的受试者施用ECHO25或其修饰形式，或包含ECHO25或其修饰形式的基因组序列或cDNA序列，或所述基因组序列或cDNA序列的互补序列的核酸分子的步骤。

Description

一种用于治疗肿瘤的埃可病毒
技术领域
本发明涉及病毒领域和肿瘤治疗领域。具体而言，本发明涉及埃可病毒25型(ECHO25)或其修饰形式，或包含ECHO25或其修饰形式的基因组序列或cDNA序列，或所述基因组序列或cDNA序列的互补序列的核酸分子，用于在受试者(例如，人)中治疗肿瘤的用途，以及在制备用于在受试者(例如，人)中治疗肿瘤的药物中的用途。本发明还涉及一种治疗肿瘤的方法，其包括向有此需要的受试者施用ECHO25或其修饰形式，或包含ECHO25或其修饰形式的基因组序列或cDNA序列，或所述基因组序列或cDNA序列的互补序列的核酸分子的步骤。
背景技术
目前恶性肿瘤的治疗手段主要包括手术治疗、化疗和放疗。这些传统疗法对于已转移的肿瘤治疗效果不尽如人意，并且还会对患者身体健康产生伤害巨大。相比之下，作为新型的治疗方式，利用溶瘤病毒对肿瘤的治疗方法具有特异性高、效果好、副作用小等特点，是一种目前被认为比较有前景的肿瘤治疗手段。
溶瘤病毒是一种能够在肿瘤细胞当中自我复制，从而杀死、溶解肿瘤细胞，或者使肿瘤细胞生长停滞的病毒。当进行体内治疗时，溶瘤病毒表现出对肿瘤细胞的选择特异性，能够直接诱导肿瘤细胞死亡，而对正常细胞影响较小或无影响；同时，溶瘤病毒也能通过激发免疫系统当中的细胞毒性T淋巴细胞反应，间接地杀伤肿瘤细胞。
肠道病毒隶属于小RNA病毒科，其基因组为单股正链RNA。将肠道病毒用作溶瘤病毒有以下几类优点：首先作为单链RNA病毒，其基因组在宿主体内没有DNA阶段，因此不存在由病毒基因组插入到宿主DNA所引起的基因毒性，具有较好的安全性；其次，肠道病毒基因组较小，短时间内即可复制出大量病毒进一步感染其他肿瘤细胞，引起强烈的细胞病变反应；再次，肠道病毒不含致癌基因，因此不会诱发肿瘤；最后，肠道病毒的基因组能够通过反向遗传学技术被改造，从而实现对病毒的减毒，减少其副作用。
目前已有报导的具有溶瘤活性的肠道病毒包括用于治疗恶性神经胶质瘤等人实体肿瘤的嵌合脊髓灰质炎病毒(Dobrikova等人，Mol Ther 2008,16(11):1865-1872)；杀伤人黑色素瘤细胞的柯萨奇病毒A13、A15、A18和A21(Au等人，Virol J 2011,8:22)等等。然而获得兼具肿瘤特异性和肿瘤杀伤活性的病毒仍然是有必要的。
埃可病毒(ECHO)，全称为人肠道致细胞病变孤儿病毒。在20世纪50年代初期，该病毒从健康儿童和无菌性脑膜炎患儿粪便中分离并通过组织培养后鉴定获得。埃可病毒25型属于人肠道病毒B组，其感染多发生于5岁以下儿童，临床症状主要为斑丘疹、腹泻和呼吸道疾病，严重的会出现无菌性脑膜炎、新生儿败血症和心肌炎等。目前本领域尚未有任何埃可病毒25型具有溶瘤活性的报道。
发明内容
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、生物化学、细胞生物学、核酸化学等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的，术语“埃可病毒25型(ECHO25)”是指，小RNA病毒科肠道病毒属B种肠道病毒中的一种，其基因组为单股正链RNA，由5’非编码区(5’UTR)、一个开放阅读框(ORF)、3’非编码区(3’UTR)和多聚腺苷酸尾巴组成；其ORF编码一个前体多聚蛋白，经过自身蛋白酶水解切割，可产生结构蛋白VP1～VP4和非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D；为了更加清楚地描述本发明，ECHO25基因组中上述各蛋白所对应的核酸序列分别称为VP1基因、VP2基因、VP3基因、VP4基因、2A基因、2B基因、2C基因、3A基因、3B基因、3C基因和3D基因。在本发明中，表述“埃可病毒25型(ECHO25)”意指野生型ECHO25，其可从自然中的来源分离并且没有被人为有意地修饰，其实例包括但不限于原型株AY302549(JV-4)，以及各种临床分离株(例如，本发明实施例1中所描述的临床分离株)。野生型ECHO25的基因组序列或cDNA序列是本领域熟知的，并且可参见各种公共数据库(例如，GenBank数据库登录号：KP099941.1)。
如本文中所使用的，术语病毒的“修饰形式”是指，对野生型病毒进行修饰而获得的经修饰的病毒，其保留了野生型病毒的期望的活性(例如，溶瘤活性)。在本发明中，ECHO25的“修饰形式”包括但不限于经修饰的ECHO25病毒，其与野生型ECHO25的基因组序列相比具有一个或多个核苷酸的替换、插入或删除，并且至少保留了ECHO25的溶瘤活性。
如本文中所使用的，术语“溶瘤病毒”是指，能够感染肿瘤细胞，在肿瘤细胞中复制，引起肿瘤细胞死亡、裂解或阻止肿瘤细胞生长的病毒。优选地，该病毒对非肿瘤细胞具有最小的毒性效应。
如本文中所使用的，术语“肿瘤特异性”是指，选择性地在肿瘤细胞内展现出生物功能或活性。例如，在本发明中，当术语“肿瘤特异性”用于描述病毒的杀伤选择性时，意指该病毒能够选择性杀伤肿瘤细胞而不杀伤或基本上不杀伤非肿瘤细胞，或者，该病毒对肿瘤细胞的杀伤比对非肿瘤细胞的杀伤更为有效。
如本文中所使用的，术语“溶瘤活性”主要包括肿瘤杀伤活性。当描述病毒的溶瘤活性时，通常可以通过其病毒感染肿瘤细胞的能力、在肿瘤细胞内复制的能力和/或杀伤肿瘤细胞的能力等指标衡量该病毒的溶瘤活性。病毒的溶瘤活性可以采用本领域已知的任何方法进行测定。例如，病毒感染肿瘤细胞的能力可以通过测量感染给定百分率的肿瘤细胞(例如50％细胞)所需要的病毒剂量进行评价；在肿瘤细胞内复制的能力可以通过测量病毒在肿瘤细胞内的生长情况进行评价；杀伤肿瘤细胞的能力可以通过观察致细胞病变效应(CPE)或测量肿瘤细胞活性进行评价。
如本文中所使用的，表述“ECHO25的cDNA序列”意指，该病毒基因组RNA序列的DNA表示形式，其与所述RNA序列相比差异仅在于所述RNA序列中的核糖核苷酸被对应的脱氧核糖核苷酸替代，例如尿嘧啶核糖核苷酸(UMP)由胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸(dTMP)替代。
如本文中所使用的，术语“外源核酸”是指，人工引入的核苷酸序列，其相对于原始序列而言是外来的。外源核酸包括但不限于，未在所述病毒基因组中发现的任何基因或核苷酸序列。然而，在本发明中，特别优选地，所述外源核酸由至多1500个，例如至多1200个，至多1000个核苷酸组成。在某些情况下，优选地，外源核酸编码具有抗肿瘤杀伤活性的蛋白或多肽，例如细胞因子、或抗肿瘤蛋白或多肽；或者，外源核酸包含微小RNA(microRNA，miRNA)的靶序列。在本发明中，所述微小RNA优选为那些在肿瘤细胞中的表达量显著低于正常细胞和/或具有明显的组织特异性的微小RNA，其实例包括但不限于，肝组织特异性表达的miR-122，miR-192，miR-483等；心脏特异性表达的miR-1，miR-133a/b，miR-208等；肾组织特异性表达的miR-192，miR-196a/b，miR-204，miR-215等；肌肉组织特异性表达的miR-133a/b，miR-206等；脑组织特异性表达的miR-124a，miR-125a/b，miR-128a/b，miR-138等；以及在肝肿瘤组织内低表达的miR-34，miR-122a，miR-26a；在肾肿瘤组织内低表达的miR-34；在膀胱肿瘤组织内低表达的miR-143，miR-133a/b；在肺肿瘤组织内低表达的miR-Let-7，miR-29，等等(参见，例如，Ruiz A J and Russell S J.MicroRNAs and oncolyticviruses.[J].Curr Opin Virol,2015,13:40–48；其全部通过引用并入本文)。
在本发明中，当经修饰的ECHO25包含上述微小RNA的靶序列时，其在该microRNA高表达或特异性表达的细胞/组织中，受到该microRNA的调控，从而可使该溶瘤病毒的复制减弱、甚至丧失杀伤活性，而在该microRNA低表达或不表达的肿瘤细胞/组织中则正常复制、正常杀伤肿瘤细胞。
如本文中所使用的，术语“细胞因子”具有本领域技术人员公知的含义。然而，在本发明中，当使用本发明的溶瘤病毒来治疗肿瘤时，特别优选地，所述细胞因子为能够用于肿瘤治疗的细胞因子。“细胞因子”的实例包括但不限于，白介素(例如IL-2、IL-12和IL-15)、干扰素(例如IFNα、IFNβ、IFNγ)、肿瘤坏死因子(例如TNFα)、集落刺激因子(例如GM-CSF)，及其任何组合(参见例如，Ardolino M,Hsu J,Raulet D H.Cytokine treatment incancer immunotherapy[J].Oncotarget,2015,6(23):19346-19347)。
如本文中所使用的，术语“抗肿瘤蛋白或多肽”是指，具有治疗肿瘤活性的蛋白或多肽，其包括但不限于：(1)对细胞具有毒性、可抑制细胞增殖或诱导细胞凋亡的蛋白或多肽，其实例包括但不限于胸苷激酶TK(TK/GCV)、TRAIL和FasL(参见例如，Candolfi M,KingG D,Muhammad A G,et al.Evaluation of proapototic transgenes to use incombination with Flt3L in an immune-stimulatory gene therapy approach forGlioblastoma multiforme(GBM)[J].FASEB J,2008,22:1077.13)；(2)具有免疫治疗作用的蛋白或多肽，其实例包括但不限于抗细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(anti-CTLA-4)、抗程序性死亡受体1(anti-PD-1)的单链抗体(scFv)和抗程序性死亡配体1(anti-PDL-1)的单链抗体(scFv)(参见例如，Nolan E,Savas P,Policheni A N,et al.Combined immunecheckpoint blockade as a therapeutic strategy for BRCA1-mutated breast cancer[J].Science Trans Med,2017,9:eaal4922；其全部通过引用并入本文)；(3)抑制肿瘤血管生成的蛋白或多肽，其实例包括但不限于抗血管内皮生长因子(anti-VEGF)的单链抗体(scFv)、VEGF来源多肽(例如D(LPR)、KSVRGKGKGQKRKRKKSRYK等)和ATN-161(参见例如，Rosca E V，Koskimaki J E，Rivera C G，et al.Anti-angiogenic peptides for cancertherapeutics[J].Curr Pharm Biotechnol，2011,12(8):1101–1116；其全部通过引用并入本文)。
如本文中所使用的，术语“scFv”是指，包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的单个多肽链，其中所述VL和VH通过接头(linker)相连(参见，例如,Bird等人,Science 242:423-426(1988)；Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988)；和Pluckthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Roseburg和Moore编，Springer-Verlag，纽约，第269-315页(1994))。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。
如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个蛋白/多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个蛋白/多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl Biosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoI Biol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。
如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
如本文中所使用的，术语“内部核糖体进入位点(IRES)”是指，一段位于信使RNA(mRNA)序列中的核苷酸序列，其能够起始翻译而不依赖于5'帽结构。IRES通常位于5'非翻译区(5'UTR)中，但也可能位于在mRNA的其他位置。
如本文中所使用的，术语“人鼻病毒2(HRV2)”是指，小RNA病毒科的一种病毒，其基因组序列或cDNA序列是本领域公知的，可参见各种公共数据库(例如，GenBank数据库登录号X02316.1)。
如本文中所使用的，表述“包含ECHO25或其修饰形式的基因组序列的核酸分子”或“核酸分子包含ECHO25或其修饰形式的基因组序列”具有本领域技术人员通常理解的含义，即当所述核酸分子为DNA时，所述核酸分子包含ECHO25或其修饰形式的基因组序列的DNA表示形式；当所述核酸分子为RNA时，所述核酸分子包含ECHO25或其修饰形式的基因组序列。
如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指，在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，离子强度增强剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，稀释剂，佐剂，防腐剂，稳定剂等。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、NaCl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于水，水性缓冲液(如缓冲盐水)，醇和多元醇(如甘油)等。佐剂包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)，弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂)等。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如硫柳汞，2-苯氧乙醇，对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。稳定剂具有本领域技术人员通常理解的含义，其能够稳定药物中的活性成分的期望活性(例如溶瘤活性)，包括但不限于谷氨酸钠，明胶，SPGA，糖类(如山梨醇，甘露醇，淀粉，蔗糖，乳糖，葡聚糖，或葡萄糖)，氨基酸(如谷氨酸，甘氨酸)，蛋白质(如干燥乳清，白蛋白或酪蛋白)或其降解产物(如乳白蛋白水解物)等。
如本文中所使用的，术语“治疗”是指，治疗或治愈疾病(例如肿瘤)，延缓疾病(例如肿瘤)的症状的发作，和/或延缓疾病(例如肿瘤)的发展。
如本文中所使用的，术语“有效量”是指，可以有效实现预期目的的量。例如，治疗有效量可以是有效地或足以治疗或治愈疾病(例如肿瘤)，延缓疾病(例如肿瘤)症状的发作和/或延缓疾病(例如肿瘤)发展的量。这样的有效量可以由本领域技术人员或医生容易地确定，并且可以与预期目的(例如治疗)、受试者的一般健康状况、年龄、性别、体重、待治疗的疾病的严重程度、并发症、施用方式等相关。这样的有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内。
如本文中使用的，术语“受试者”是指哺乳动物，例如灵长类哺乳动物，例如人。在某些实施方式中，所述受试者(例如人)患有肿瘤，或者，具有患有肿瘤的风险。
本申请的发明人经过大量实验和反复摸索，出人意料地发现，埃可病毒25型对特定肿瘤具有显著的肿瘤细胞杀伤能力。基于这一发现，本发明人开发了新的用于治疗肿瘤的溶瘤病毒以及基于该病毒的肿瘤治疗方法。
因此，在第一方面，本发明提供了埃可病毒25型(ECHO25)或其修饰形式或一种核酸分子，用于在受试者中治疗肿瘤的用途，或者用于制备在受试者中治疗肿瘤的药物的用途；其中，所述核酸分子包含选自下列的序列：
(1)ECHO25或其修饰形式的基因组序列或cDNA序列；和
(2)所述基因组序列或cDNA序列的互补序列。
在某些优选的实施方案中，所述ECHO25为野生型ECHO25。在某些优选的实施方案中，所述ECHO25可以是从感染埃可病毒25型的个体中分离得到的临床分离毒株。
在某些优选的实施方案中，所述ECHO25或其修饰形式的基因组序列与如SEQ IDNO：12所示的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。在某些优选的实施方案中，所述ECHO25或其修饰形式的基因组序列为如SEQID NO：12所示的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述ECHO25或其修饰形式的cDNA序列与如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。在某些优选的实施方案中，所述ECHO25或其修饰形式的cDNA序列为如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述修饰形式为经修饰的ECHO25，其与野生型ECHO25相比在基因组中具有一个或多个核苷酸的替换、插入或删除。
在某些优选的实施方案中，所述经修饰的ECHO25与野生型ECHO25相比，具有一个或多个选自下列的修饰：
(1)位于非翻译区(例如5’UTR或3’UTR)的一个或多个突变；
(2)一个或多个外源核酸的插入；
(3)一个或多个内源基因的缺失或突变；和
(4)上述三项的任意组合。
在某些优选的实施方案中，所述经修饰的ECHO25包括位于5’非翻译区(5’UTR)的一个或多个突变。
在某些优选的实施方案中，所述经修饰的ECHO25的5’UTR序列经全部或部分替换。在某些优选的实施方案中，所述经修饰的ECHO25的5’UTR中的内部核糖体进入位点(IRES)序列替换为外源IRES序列，例如人鼻病毒2(HRV2)的内部核糖体进入位点序列。在某些优选的实施方案中，所述人鼻病毒2(HRV2)的内部核糖体进入位点序列如SEQ ID NO：2所示。
人鼻病毒2(HRV2)的内部核糖体进入位点序列的使用在某些情况下是有利的，例如有益于提高溶瘤病毒的肿瘤特异性。之前已报道，在正常人神经细胞中，人鼻病毒2的内部核糖体进入位点序列会被宿主RNA结合蛋白(DRBP76和NF45)特异结合，从而阻止了elF4G等因子的招募(Merrill等人，J Virol 2006,80(7):3147-3156；Merrill和Gromeier，JVirol 2006,80(14):6936-6942；Neplioueva等人，PLoS One 2010,5(7):e11710)；同时，由于缺乏Raf/Erk1/2/MAPK等信号通路的支持，核糖体难以结合到人鼻病毒2的内部核糖体进入位点序列上，因此无法启动病毒蛋白翻译(Dobrikov等人，Mol Cell Biol 2011,31(14):2947-2959；Dobrikov等人，Mol Cell Biol 2013,33(5):937-946)。在人神经胶质瘤肿瘤细胞中，人鼻病毒2的内部核糖体进入位点却不受以上两个因素影响，可正常启动病毒蛋白转录与翻译。因此，在某些情况下，将ECHO25的内部核糖体进入位点序列替换为人鼻病毒2的内部核糖体进入位点序列有益于避免或减轻本发明所述病毒对正常人神经细胞产生毒副作用，而不影响该病毒用于人神经胶质瘤的治疗。
在某些优选的实施方案中，所述经修饰的ECHO25包含外源核酸。
在某些优选的实施方案中，所述外源核酸编码细胞因子(例如GM-CSF，优选为人GM-CSF)、或抗肿瘤蛋白或多肽(例如，抗PD-1或PD-L1的scFv，优选为抗人PD-1或PD-L1的scFv)。在某些优选的实施方案中，所述外源核酸的插入位点位于所述经修饰的ECHO25基因组的5’UTR与VP4基因之间，或者位于VP1基因与2A基因之间。
在某些优选的实施方案中，所述外源核酸包含微小RNA(microRNA,miRNA)(例如miR-133或miR-206)的靶序列。在某些优选的实施方案中，所述微小RNA的靶序列的插入位点在所述经修饰的ECHO25基因组的3’非翻译区(3’UTR)。
之前已报道，某些微小RNA在肿瘤细胞中的表达量显著低于正常细胞和/或具有明显的组织特异性，因此在某些情况下，本发明的经修饰的ECHO25包含这类微小RNA的靶序列是有利的，因为在正常细胞或组织内高表达的这类微小RNA可以通过对应的靶序列减少甚至阻断经修饰的ECHO25在该正常细胞或组织内的复制，从而减轻甚至避免经修饰的ECHO25对非肿瘤细胞的毒副作用。这类微小RNA包括但不限于miR-133、miR-206、miR-1、miR-143、miR-145、miR-217、let-7、miR-15、miR-16等(参见例如，PCT国际申请WO2008103755A1，美国专利申请US20160143969A1，或Baohong Zhang等人，Developmental Biology，Volume 302,Issue 1,1February 2007,Pages 1–12；其全部通过引用并入本文)。
在某些优选的实施方案中，所述外源核酸包括一个或多个(例如2个，3个或4个)如上所述的微小RNA的靶序列。在某些优选的实施方案中，所述外源核酸包含miR-133和/或miR-206的靶序列。在某些优选的实施方案中，所述miR-133的靶序列如SEQ ID NO:3所示。在某些优选的实施方案中，所述miR-206的靶序列如SEQ ID NO:4所示。在某些情况下，miR-133和/或miR-206的靶序列的插入是有利的。这是由于miR-133和miR-206在肌肉组织中特异性表达，因此通过将miR-133和/或miR-206的靶序列插入所述经修饰的ECHO25中的方式可以改变该溶瘤病毒的组织嗜性，以减小或避免对正常肌肉组织的杀伤。
在某些优选的实施方案中，所述经修饰的ECHO25包含至少一种如上所述的外源核酸的插入和/或至少一种如上所述的位于非翻译区的突变。
在某些优选的实施方案中，所述经修饰的ECHO25的基因组序列与选自下列的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性：如SEQID NO：13-16所示的核苷酸序列。在某些优选的实施方案中，所述经修饰的ECHO25的基因组序列选自如SEQ ID NO：13-16任一项所示的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述经修饰的ECHO25的cDNA序列与选自下列的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性：如SEQID NO：8-11所示的核苷酸序列。在某些优选的实施方案中，所述经修饰的ECHO25的cDNA序列选自如SEQ ID NO：8-11任一项所示的核苷酸序列。
本发明的经修饰的ECHO25可以通过反向遗传学技术获得，所述反向遗传学技术是本领域已知的，例如可参见Yang L S，Li S X，Liu Y J，et al.Virus Res，2015,210:165-168；Hou W H,Yang L S，Li S X，et al.Virus Res，2015,205:41-44；其全部通过引用并入本文。在此类实施方案中，通常对野生型ECHO25的cDNA进行修饰(例如，外源核酸的插入、内源基因的缺失或突变或位于非翻译区的突变)从而获得经修饰的ECHO25。
本发明的ECHO25或其修饰形式可以经预处理以减少或消除受试者对该病毒的免疫反应，其中所述预处理可以包括：将所述ECHO25包装在脂质体或胶束中，和/或使用蛋白酶(例如，糜蛋白酶或胰蛋白酶)去除病毒的衣壳蛋白以减小宿主对病毒的体液和/或细胞免疫。
在本发明中，可以将如本文所述的ECHO25或其修饰形式在肿瘤细胞内连续适应性传代。在某些优选的实施方案中，所述肿瘤细胞可以为本领域已知的肿瘤细胞系或肿瘤细胞株，也可以为从患有肿瘤的个体(例如，受试者)体内经手术切除或临床分离而得到的肿瘤细胞。在某些优选的实施方案中，将所述ECHO25或其修饰形式在获得自患有肿瘤的个体(例如，受试者)体内的肿瘤细胞内连续适应性传代。在某些优选的实施方案中，所述肿瘤细胞从患有肿瘤的个体(例如，受试者)体内经手术切除或临床分离而得到。在某些优选的实施方案中，所述连续适应性传代的方法包括多个(例如至少5个，至少10个，至少15个，至少20个)由下述过程所构成的周期：1)将病毒感染靶肿瘤细胞；2)收获上清中的病毒；和3)将获得的病毒重新感染新鲜靶肿瘤细胞。
在某些优选的实施方案中，可以组合使用如上所述的ECHO25和其修饰形式。因此，所述药物可以包括ECHO25以及其修饰形式中的一种或数种。
在某些优选的实施方案中，所述核酸分子由如本文所述的ECHO25或其修饰形式的基因组序列或cDNA序列，或所述基因组序列或cDNA序列的互补序列组成。在某些优选的实施方案中，所述核酸分子具有如本文所述的ECHO25或其修饰形式的基因组序列。在某些优选的实施方案中，所述核酸分子为RNA。在某些优选的实施方案中，所述核酸分子具有如SEQID NO:12-16任一项所示的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述核酸分子为包含如本文所述的ECHO25或其修饰形式的基因组序列或cDNA序列，或所述基因组序列或cDNA序列的互补序列的载体(例如，克隆载体或表达载体)。在某些优选的实施方案中，所述核酸分子为包含如本文所述的ECHO25或其修饰形式的cDNA序列，或所述cDNA序列的互补序列的载体(例如，克隆载体或表达载体)。
在某些优选的实施方案中，所述核酸分子包含ECHO25或其修饰形式的基因组序列的互补序列。在某些优选的实施方案中，所述互补序列与选自下列的核苷酸序列互补：
(1)如SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列；
(2)与如SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的核苷酸序列；
(3)如SEQ ID NO：13-16任一项所示的核苷酸序列；和
(4)与如SEQ ID NO：13-16任一项所示的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述核酸分子包含ECHO25或其修饰形式的cDNA序列的互补序列。在某些优选的实施方案中，所述互补序列与选自下列的核苷酸序列互补：
(1)如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；
(2)与如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的核苷酸序列；
(3)如SEQ ID NO：8-11任一项所示的核苷酸序列；和
(4)与如SEQ ID NO：8-11任一项所示的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的核苷酸序列。
本发明的核酸分子可以通过本领域已知的任何方式进行递送，例如，直接注射裸露的核酸分子(例如，裸RNA)，或利用非病毒递送系统(non-viral delivery system)。所述非病毒递送系统可通过本领域熟知的各种材料制备获得，其中所述材料包括但不限于详细描述于“Yin H,et al.Nat Rev Genet.2014Aug；15(8):541-55.”以及“Riley MK,Vermerris W.Nanomaterials(Basel).2017Apr 28；7(5).pii:E94.”中的各种材料，其全部通过引用并入本文，例如脂质体、无机纳米粒子(如金纳米颗粒)、多聚物(如PEG)等等。
在某些优选的实施方案中，所述药物包含治疗有效量的ECHO25和/或其修饰形式，或治疗有效量的如本文所述的核酸分子。在某些优选的实施方案中，所述药物可以为医学领域已知的任何形式。例如，所述药物可以是片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、冻干粉剂)等形式。在一些实施方案中，所述药物为注射液或冻干粉剂。
在某些优选的实施方案中，所述药物还包含药学上可接受的载体或赋形剂。在某些优选的实施方案中，所述药物包含稳定剂。
在某些优选的实施方案中，所述药物任选地还包含另外的药学活性剂。在一个优选的实施方案中，所述另外的药学活性剂是具有抗肿瘤活性的药物，例如另外的溶瘤病毒、化学治疗剂或免疫治疗剂。
在本发明中，所述另外的溶瘤病毒包括但不限于疱疹病毒、腺病毒、细小病毒、呼肠孤病毒、新城疫病毒、水疱性口炎病毒、麻疹病毒或其任意组合。所述化学治疗剂包括但不限于5-氟尿嘧啶、丝裂霉素、甲氨蝶呤、羟基脲、环磷酰胺、达卡巴嗪、米托蒽醌、蒽环类(如表柔比星或多柔比星)、依托泊苷、铂类化合物(如卡铂或顺铂)、紫杉烷类(如紫杉醇或紫杉特尔)或其任意组合。所述免疫治疗剂包括但不限于免疫卡控点抑制剂(如PD-L1/PD-1抑制剂或CTLA-4抑制剂)、肿瘤特异性靶向抗体(如利妥昔单抗或赫赛汀)或其任意组合。
在某些优选的实施方案中，所述药物包含单位剂量的ECHO25和/或其修饰形式，例如包含至少1x102pfu、至少1x103pfu、至少1x104pfu、1x105pfu、1x106pfu、至少1x107pfu、至少1x108pfu、至少1x109pfu、至少1x1010pfu、至少1x1011pfu、至少1x1012pfu、至少1x1013pfu、至少1x1014pfu或至少1x1016pfu的ECHO25和/或其修饰形式。在某些优选的实施方案中，所述药物包含1x102pfu～1x1017pfu的ECHO25和/或其修饰形式。
在某些优选的实施方案中，所述药物含有单位剂量的如本文所述的核酸分子，例如含有3×1010～3×1014病毒基因组拷贝数(virus genome copies)的所述核酸分子。
在某些优选的实施方案中，可以将所述药物与额外的疗法一起施用。这种额外的疗法可以是已知用于肿瘤的任何疗法，例如手术、化学治疗、放射治疗、免疫治疗、激素治疗或基因治疗。这种额外的疗法可以在施用所述药物之前、同时或之后施用。
在某些优选的实施方案中，所述肿瘤选自胃癌、肝癌、卵巢癌(如卵巢非透明细胞癌)、子宫内膜癌、黑色素瘤、前列腺癌、神经胶质瘤、食管癌、膀胱癌、淋巴瘤(如组织细胞性淋巴瘤)、白血病(如慢性髓系白血病)、横纹肌肉瘤、结直肠癌、非小细胞肺癌(如非小细胞肺腺癌)、宫颈癌(如HPV阴性宫颈癌)、乳腺癌(如乳腺髓样癌)、肾癌(如肾透明细胞癌)和胰腺癌。
在某些优选的实施方案中，所述肿瘤为胃癌、肝癌、卵巢癌(如卵巢非透明细胞癌)、子宫内膜癌、宫颈癌(如HPV阴性宫颈癌)、黑色素瘤、乳腺癌(如乳腺髓样癌)、前列腺癌、神经胶质瘤、食管癌、膀胱癌、淋巴瘤(如组织细胞性淋巴瘤)或白血病(如慢性髓系白血病)。
在某些优选的实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如人。
在第二方面，本发明提供了一种治疗肿瘤的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效量的ECHO25或其修饰形式，或有效量的核酸分子的步骤；其中，所述核酸分子包含选自下列的序列：
(1)ECHO25或其修饰形式的基因组序列或cDNA序列；和
(2)所述基因组序列或cDNA序列的互补序列。
在某些优选的实施方案中，向所述受试者施用ECHO25。在某些优选的实施方案中，所述ECHO25为野生型ECHO25。在某些优选的实施方案中，所述ECHO25可以是从感染埃可病毒25型的个体中分离得到的临床分离毒株。
在某些优选的实施方案中，所述ECHO25或其修饰形式的基因组序列与如SEQ IDNO：12所示的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。在某些优选的实施方案中，所述ECHO25或其修饰形式的基因组序列为如SEQID NO：12所示的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述ECHO25或其修饰形式的cDNA序列与如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。在某些优选的实施方案中，所述ECHO25或其修饰形式的cDNA序列为如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中，向所述受试者施用ECHO25的修饰形式。在某些优选的实施方案中，所述修饰形式为经修饰的ECHO25，其与野生型ECHO25相比在基因组中具有一个或多个核苷酸的替换、插入或删除。
在某些优选的实施方案中，所述经修饰的ECHO25与野生型ECHO25相比，具有一个或多个选自下列的修饰：
(1)位于非翻译区(例如，5’UTR或3’UTR)的一个或多个突变；
(2)一个或多个外源核酸的插入；
(3)一个或多个内源基因的缺失或突变；和
(4)上述三项的任意组合。
在某些优选的实施方案中，所述经修饰的ECHO25包括位于5’非翻译区(5’UTR)的一个或多个突变。
在某些优选的实施方案中，所述经修饰的ECHO25的5’UTR序列经全部或部分替换。在某些优选的实施方案中，所述经修饰的ECHO25的5’UTR中的内部核糖体进入位点(IRES)序列替换为外源IRES序列，例如人鼻病毒2(HRV2)的内部核糖体进入位点序列。在某些优选的实施方案中，所述人鼻病毒2(HRV2)的内部核糖体进入位点序列如SEQ ID NO：2所示。
在某些优选的实施方案中，所述经修饰的ECHO25包含外源核酸。
在某些优选的实施方案中，所述外源核酸编码细胞因子(例如GM-CSF，优选为人GM-CSF)、或抗肿瘤蛋白或多肽(例如抗PD-1或PD-L1的scFv，优选为抗人PD-1或PD-L1的scFv)。在某些优选的实施方案中，所述外源核酸的插入位点位于所述经修饰的ECHO25基因组的5’UTR与VP4基因之间，或者位于VP1基因与2A基因之间。
在某些优选的实施方案中，所述外源核酸包含微小RNA(microRNA,miRNA)(例如miR-133或miR-206)的靶序列。在某些优选的实施方案中，所述微小RNA的靶序列的插入位点在所述经修饰的ECHO25基因组的3’非翻译区(3’UTR)。
在某些优选的实施方案中，所述外源核酸包括一个或多个(例如2个，3个或4个)如上所述的微小RNA的靶序列。在某些优选的实施方案中，所述外源核酸包含miR-133和/或miR-206的靶序列。在某些优选的实施方案中，所述miR-133的靶序列如SEQ ID NO:3所示。在某些优选的实施方案中，所述miR-206的靶序列如SEQ ID NO:4所示。
在某些优选的实施方案中，所述经修饰的ECHO25包含至少一种如上所述的外源核酸的插入和/或至少一种如上所述的位于非翻译区的突变。
在某些优选的实施方案中，所述经修饰的ECHO25的基因组序列与选自下列的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性：如SEQID NO：13-16所示的核苷酸序列。在某些优选的实施方案中，所述经修饰的ECHO25的基因组序列选自如SEQ ID NO：13-16任一项所示的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述经修饰的ECHO25的cDNA序列与选自下列的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性：如SEQID NO：8-11所示的核苷酸序列。在某些优选的实施方案中，所述经修饰的ECHO25的cDNA序列选自如SEQ ID NO：8-11任一项所示的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中，可以组合使用如上所述的ECHO25和其修饰形式。因此，可以向受试者施用ECHO25以及其修饰形式中的一种或多种。
在某些优选的实施方案中，向所述受试者施用如本文所述的核酸分子。
在某些优选的实施方案中，所述核酸分子由如本文所述的ECHO25或其修饰形式的基因组序列或cDNA序列，或所述基因组序列或cDNA序列的互补序列组成。在某些优选的实施方案中，所述核酸分子具有如本文所述的ECHO25或其修饰形式的基因组序列。在某些优选的实施方案中，所述核酸分子为RNA。在某些优选的实施方案中，所述核酸分子具有如SEQID NO:12-16任一项所示的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述核酸分子为包含如本文所述的ECHO25或其修饰形式的基因组序列或cDNA序列，或所述基因组序列或cDNA序列的互补序列的载体(例如，克隆载体或表达载体)。在某些优选的实施方案中，所述核酸分子为包含如本文所述的ECHO25或其修饰形式的cDNA序列，或所述cDNA序列的互补序列的载体(例如，克隆载体或表达载体)。
在某些优选的实施方案中，所述核酸分子包含ECHO25或其修饰形式的基因组序列的互补序列。在某些优选的实施方案中，所述互补序列与选自下列的核苷酸序列互补：
(1)如SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列；
(2)与如SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的核苷酸序列；
(3)如SEQ ID NO：13-16任一项所示的核苷酸序列；和
(4)与如SEQ ID NO：13-16任一项所示的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述核酸分子包含ECHO25或其修饰形式的cDNA序列的互补序列。在某些优选的实施方案中，所述互补序列与选自下列的核苷酸序列互补：
(1)如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；
(2)与如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的核苷酸序列；
(3)如SEQ ID NO：8-11任一项所示的核苷酸序列；和
(4)与如SEQ ID NO：8-11任一项所示的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的核苷酸序列。
在本发明中，可以通过本领域已知的任何方式递送如本文所述的核酸分子，例如，直接注射裸露的核酸分子(例如，裸RNA)，或利用非病毒递送系统(non-viral deliverysystem)。所述非病毒递送系统可通过本领域熟知的各种材料制备获得，其中所述材料包括但不限于详细描述于“Yin H,et al.Nat Rev Genet.2014Aug；15(8):541-55.”以及“RileyMK,Vermerris W.Nanomaterials(Basel).2017Apr 28；7(5).pii:E94.”中的各种纳米材料，其全部通过引用并入本文，例如脂质体、无机纳米粒子(如金纳米颗粒)、多聚物(如PEG)等等。
在某些优选的实施方案中，可以将ECHO25和/或其修饰形式，或如本文所述的核酸分子，作为药物组合物进行配制和施用。这样的药物组合物可包含治疗有效量的ECHO25和/或其修饰形式，或治疗有效量的如本文所述的核酸分子。在某些优选的实施方案中，所述药物组合物可以是医学领域已知的任何形式。例如，所述药物组合物可以是片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、冻干粉剂)等形式。在一些实施方案中，所述药物组合物为注射液或冻干粉剂。
在某些优选的实施方案中，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体或赋形剂。在某些优选的实施方案中，所述药物组合物包含稳定剂。
在本发明中可以通过各种合适的方式，向受试者施用ECHO25和/或其修饰形式，或如本文所述的核酸分子。在某些情况下，ECHO25和/或其修饰形式，或如本文所述的核酸分子的施用方式取决于肿瘤的位置和类型。例如，对于容易接近的实体肿瘤，任选地通过直接向肿瘤注射(例如，瘤内注射)来施用该病毒或核酸分子；对于造血系统的肿瘤，可以通过静脉内或其他血管内途径施用该病毒或核酸分子；对于体内不容易接近的肿瘤(例如转移瘤)，可以系统地施用该病毒或核酸分子以使其遍布全身并由此到达肿瘤(例如，静脉内或肌肉内注射)。任选地，可以经皮下、腹膜内、鞘内(例如对于脑部肿瘤)、局部(例如对于黑素瘤)、口服(例如对于口腔或食道癌)、经鼻或通过吸入喷雾(例如对于肺癌)等途径施用本发明的病毒或核酸分子。在某些优选的实施方案中，可以通过皮内注射、皮下注射、肌肉注射、静脉注射、口服给予等途径施用本发明的ECHO25和/或其修饰形式，或如本文所述的核酸分子。
在某些优选的实施方案中，所述方法还包括施用具有抗肿瘤活性的另外的药学活性剂。这种另外的药学活性剂可以在施用ECHO25和/或其修饰形式，或如本文所述的核酸分子之前、同时或之后施用。
在某些优选的实施方案中，所述另外的药学活性剂包括另外的溶瘤病毒、化学治疗剂或免疫治疗剂。
在本发明中，所述另外的溶瘤病毒包括但不限于疱疹病毒、腺病毒、细小病毒、呼肠孤病毒、新城疫病毒、水疱性口炎病毒、麻疹病毒或其任意组合。所述化学治疗剂包括但不限于5-氟尿嘧啶、丝裂霉素、甲氨蝶呤、羟基脲、环磷酰胺、达卡巴嗪、米托蒽醌、蒽环类(如表柔比星或多柔比星)、依托泊苷、铂类化合物(如卡铂或顺铂)、紫杉烷类(如紫杉醇或紫杉特尔)或其任意组合。所述免疫治疗剂包括但不限于免疫卡控点抑制剂(如PD-L1/PD-1抑制剂或CTLA-4抑制剂)、肿瘤特异性靶向抗体(如利妥昔单抗或赫赛汀)或其任意组合。
在某些优选的实施方案中，可以以1～1x1015pfu/kg受试者体重的任何量施用ECHO25和/或其修饰形式，例如以至少1x103pfu/kg、至少1x104pfu/kg、1x105pfu/kg、1x106pfu/kg、至少1x107pfu/kg、至少1x108pfu/kg、至少1x109pfu/kg、至少1x1010pfu/kg、至少1x1011pfu/kg或至少1x1012pfu/kg受试者体重的量施用ECHO25和/或其修饰形式。在某些优选的实施方案中，可以以3×1010～3×1014病毒基因组拷贝数(virus genome copies)/kg受试者体重的任何量施用如本文所述的核酸分子。在某些优选的实施方案中，可以以每日3次、每日2次、每日1次、每两日1次或每周1次的方式施用ECHO25和/或其修饰形式，或如本文所述的核酸分子，任选地酌情每周或每月重复如上所述的给药方案。
在某些优选的实施方案中，所述方法还包括施用额外的疗法。这种额外的疗法可以是已知用于肿瘤的任何疗法，例如手术、化学治疗、放射治疗、免疫治疗、激素治疗或基因治疗。这种额外的疗法可以在施用如上所述的方法之前、同时或之后施用。
在某些优选的实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。
在某些优选的实施方案中，所述肿瘤选自胃癌、肝癌、卵巢癌(如卵巢非透明细胞癌)、子宫内膜癌、黑色素瘤、前列腺癌、神经胶质瘤、食管癌、膀胱癌、淋巴瘤(如组织细胞性淋巴瘤)、白血病(如慢性髓系白血病)、横纹肌肉瘤、结直肠癌、非小细胞肺癌(如非小细胞肺腺癌)、宫颈癌(如HPV阴性宫颈癌)、乳腺癌(如乳腺髓样癌)、肾癌(如肾透明细胞癌)和胰腺癌。
在某些优选的实施方案中，所述肿瘤为胃癌、肝癌、卵巢癌(如卵巢非透明细胞癌)、子宫内膜癌、宫颈癌(如HPV阴性宫颈癌)、黑色素瘤、乳腺癌(如乳腺髓样癌)、前列腺癌、神经胶质瘤、食管癌、膀胱癌、淋巴瘤(如组织细胞性淋巴瘤)或白血病(如慢性髓系白血病)。
在第三方面，本发明还涉及一种药物组合物，其包含如在第一方面或第二方面中所定义的ECHO25和/或其修饰形式，或如在第一方面或第二方面中所定义的核酸分子。
在某些优选的实施方案中，所述药物组合物可以为医学领域已知的任何形式。例如，所述药物组合物可以是片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、冻干粉剂)等形式。在一些实施方案中，所述药物组合物为注射液或冻干粉剂。
在某些优选的实施方案中，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体或赋形剂。在某些优选的实施方案中，所述药物组合物包含稳定剂。
在某些优选的实施方案中，所述药物组合物任选地还包含另外的药学活性剂。在一个优选的实施方案中，所述另外的药学活性剂是具有抗肿瘤活性的药物，例如另外的溶瘤病毒、化学治疗剂或免疫治疗剂。
在某些优选的实施方案中，所述药物组合物用于在受试者中治疗肿瘤。
在某些优选的实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。
在某些优选的实施方案中，所述肿瘤选自胃癌、肝癌、卵巢癌(如卵巢非透明细胞癌)、子宫内膜癌、黑色素瘤、前列腺癌、神经胶质瘤、食管癌、膀胱癌、淋巴瘤(如组织细胞性淋巴瘤)、白血病(如慢性髓系白血病)、横纹肌肉瘤、结直肠癌、非小细胞肺癌(如非小细胞肺腺癌)、宫颈癌(如HPV阴性宫颈癌)、乳腺癌(如乳腺髓样癌)、肾癌(如肾透明细胞癌)和胰腺癌。
在某些优选的实施方案中，所述肿瘤为胃癌、肝癌、卵巢癌(如卵巢非透明细胞癌)、子宫内膜癌、宫颈癌(如HPV阴性宫颈癌)、黑色素瘤、乳腺癌(如乳腺髓样癌)、前列腺癌、神经胶质瘤、食管癌、膀胱癌、淋巴瘤(如组织细胞性淋巴瘤)或白血病(如慢性髓系白血病)。
在第四方面，本发明还涉及如在第一方面或第二方面中所定义的ECHO25和/或其修饰形式，或如在第一方面或第二方面中所定义的核酸分子，其用作药物。
在第五方面，本发明提供了一种经修饰的ECHO25，其与野生型ECHO25相比，5’UTR中的内部核糖体进入位点(IRES)序列替换为人鼻病毒2(HRV2)的内部核糖体进入位点序列。
在某些优选的实施方案中，所述人鼻病毒2(HRV2)的内部核糖体进入位点序列如SEQ ID NO：2所示。
在某些优选的实施方案中，所述野生型ECHO25的基因组序列与如SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。在某些优选的实施方案中，所述野生型ECHO25的基因组序列为如SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述野生型ECHO25的cDNA序列与如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。在某些优选的实施方案中，所述野生型ECHO25的cDNA序列为如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述经修饰的ECHO25还包含外源核酸。
在某些优选的实施方案中，所述外源核酸编码细胞因子(例如GM-CSF，优选为人GM-CSF)、或抗肿瘤蛋白或多肽(例如，抗PD-1或PD-L1的scFv，优选为抗人PD-1或PD-L1的scFv)。在某些优选的实施方案中，所述外源核酸的插入位点位于所述经修饰的ECHO25基因组的5’UTR与VP4基因之间，或者位于VP1基因与2A基因之间。
在某些优选的实施方案中，所述外源核酸包含微小RNA(microRNA,miRNA)(例如miR-133或miR-206)的靶序列。在某些优选的实施方案中，所述微小RNA的靶序列的插入位点在所述经修饰的ECHO25基因组的3’非翻译区(3’UTR)。
在某些优选的实施方案中，所述外源核酸包括一个或多个(例如2个，3个或4个)如上所述的微小RNA的靶序列。在某些优选的实施方案中，所述外源核酸包含miR-133和/或miR-206的靶序列。在某些优选的实施方案中，所述miR-133的靶序列如SEQ ID NO:3所示。在某些优选的实施方案中，所述miR-206的靶序列如SEQ ID NO:4所示。
在某些优选的实施方案中，所述经修饰的ECHO25包含至少一种如上所述的外源核酸的插入。
在某些优选的实施方案中，所述经修饰的ECHO25的基因组序列与如SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。在某些优选的实施方案中，所述经修饰的ECHO25的基因组序列为如SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述经修饰的ECHO25的cDNA序列与如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。在某些优选的实施方案中，所述经修饰的ECHO25的cDNA序列为如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述经修饰的ECHO25用于在受试者中治疗肿瘤，或者用于制备在受试者中治疗肿瘤的药物。
在某些优选的实施方案中，所述肿瘤选自胃癌、肝癌、卵巢癌(如卵巢非透明细胞癌)、子宫内膜癌、黑色素瘤、前列腺癌、神经胶质瘤、食管癌、膀胱癌、淋巴瘤(如组织细胞性淋巴瘤)、白血病(如慢性髓系白血病)、咽鳞癌、甲状腺癌、横纹肌肉瘤、结直肠癌、非小细胞肺癌(如非小细胞肺腺癌)、宫颈癌(如HPV阴性宫颈癌)、乳腺癌(如乳腺髓样癌)、肾癌(如肾透明细胞癌)和胰腺癌。
在某些优选的实施方案中，所述肿瘤为胃癌、肝癌、卵巢癌(如卵巢非透明细胞癌)、子宫内膜癌、宫颈癌(如HPV阴性宫颈癌)、黑色素瘤、乳腺癌(如乳腺髓样癌)、前列腺癌、神经胶质瘤、食管癌、膀胱癌、淋巴瘤(如组织细胞性淋巴瘤)、白血病(如慢性髓系白血病)咽鳞癌或甲状腺癌。
在某些优选的实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如人。
在第六方面，本发明提供了一种核酸分子，其包含选自下列的序列：
(1)如第五方面所述的经修饰的ECHO25的基因组序列或cDNA序列；和
(2)所述基因组序列或cDNA序列的互补序列。
在某些优选的实施方案中，所述核酸分子由如上所述的经修饰的ECHO25的基因组序列或cDNA序列，或所述基因组序列或cDNA序列的互补序列组成。
在某些优选的实施方案中，所述核酸分子具有如上所述的经修饰的ECHO25的基因组序列。在某些优选的实施方案中，所述核酸分子为RNA。在某些优选的实施方案中，所述核酸分子具有如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述核酸分子为包含如上所述的经修饰的ECHO25的基因组序列或cDNA序列，或所述基因组序列或cDNA序列的互补序列的载体(例如，克隆载体或表达载体)。在某些优选的实施方案中，所述核酸分子为包含如上所述的经修饰的ECHO25的cDNA序列，或所述cDNA序列的互补序列的载体(例如，克隆载体或表达载体)。
在某些优选的实施方案中，所述核酸分子包含如上所述的经修饰的ECHO25的基因组序列的互补序列。在某些优选的实施方案中，所述互补序列与选自下列的核苷酸序列互补：
(1)如SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列；和
(2)与如SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述核酸分子包含如上所述的经修饰的ECHO25的cDNA序列的互补序列。在某些优选的实施方案中，所述互补序列与选自下列的核苷酸序列互补：
(1)如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列；和
(2)与如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述核酸分子用于在受试者中治疗肿瘤，或者用于制备在受试者中治疗肿瘤的药物。
在某些优选的实施方案中，所述肿瘤选自胃癌、肝癌、卵巢癌(如卵巢非透明细胞癌)、子宫内膜癌、黑色素瘤、前列腺癌、神经胶质瘤、食管癌、膀胱癌、淋巴瘤(如组织细胞性淋巴瘤)、白血病(如慢性髓系白血病)、咽鳞癌、甲状腺癌、横纹肌肉瘤、结直肠癌、非小细胞肺癌(如非小细胞肺腺癌)、宫颈癌(如HPV阴性宫颈癌)、乳腺癌(如乳腺髓样癌)、肾癌(如肾透明细胞癌)和胰腺癌。
在某些优选的实施方案中，所述肿瘤为胃癌、肝癌、卵巢癌(如卵巢非透明细胞癌)、子宫内膜癌、宫颈癌(如HPV阴性宫颈癌)、黑色素瘤、乳腺癌(如乳腺髓样癌)、前列腺癌、神经胶质瘤、食管癌、膀胱癌、淋巴瘤(如组织细胞性淋巴瘤)、白血病(如慢性髓系白血病)咽鳞癌或甲状腺癌。
在某些优选的实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如人。
在第七方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含如第五方面所述的经修饰的ECHO25，或如第六方面所述的核酸分子。
在某些优选的实施方案中，所述药物组合物可以为医学领域已知的任何形式。例如，所述药物组合物可以是片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、冻干粉剂)等形式。在一些实施方案中，所述药物组合物为注射液或冻干粉剂。
在某些优选的实施方案中，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体或赋形剂。在某些优选的实施方案中，所述药物组合物包含稳定剂。
在某些优选的实施方案中，所述药物组合物任选地还包含另外的药学活性剂。在一个优选的实施方案中，所述另外的药学活性剂是具有抗肿瘤活性的药物，例如另外的溶瘤病毒、化学治疗剂或免疫治疗剂。
在第八方面，本发明还涉及如第五方面所述的经修饰的ECHO25，或如第六方面所述的核酸分子，用于在受试者中治疗肿瘤的用途，或者用于制备在受试者中治疗肿瘤的药物的用途。
在某些优选的实施方案中，所述肿瘤选自胃癌、肝癌、卵巢癌(如卵巢非透明细胞癌)、子宫内膜癌、黑色素瘤、前列腺癌、神经胶质瘤、食管癌、膀胱癌、淋巴瘤(如组织细胞性淋巴瘤)、白血病(如慢性髓系白血病)、咽鳞癌、甲状腺癌、横纹肌肉瘤、结直肠癌、非小细胞肺癌(如非小细胞肺腺癌)、宫颈癌(如HPV阴性宫颈癌)、乳腺癌(如乳腺髓样癌)、肾癌(如肾透明细胞癌)和胰腺癌。
在某些优选的实施方案中，所述肿瘤为胃癌、肝癌、卵巢癌(如卵巢非透明细胞癌)、子宫内膜癌、宫颈癌(如HPV阴性宫颈癌)、黑色素瘤、乳腺癌(如乳腺髓样癌)、前列腺癌、神经胶质瘤、食管癌、膀胱癌、淋巴瘤(如组织细胞性淋巴瘤)、白血病(如慢性髓系白血病)咽鳞癌或甲状腺癌。
在某些优选的实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如人。
在第九方面，本发明还涉及一种治疗肿瘤的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效量的如第五方面所述的经修饰的ECHO25，或有效量的如第六方面所述的核酸分子的步骤。
在某些优选的实施方案中，所述肿瘤选自胃癌、肝癌、卵巢癌(如卵巢非透明细胞癌)、子宫内膜癌、黑色素瘤、前列腺癌、神经胶质瘤、食管癌、膀胱癌、淋巴瘤(如组织细胞性淋巴瘤)、白血病(如慢性髓系白血病)、咽鳞癌、甲状腺癌、横纹肌肉瘤、结直肠癌、非小细胞肺癌(如非小细胞肺腺癌)、宫颈癌(如HPV阴性宫颈癌)、乳腺癌(如乳腺髓样癌)、肾癌(如肾透明细胞癌)和胰腺癌。
在某些优选的实施方案中，所述肿瘤为胃癌、肝癌、卵巢癌(如卵巢非透明细胞癌)、子宫内膜癌、宫颈癌(如HPV阴性宫颈癌)、黑色素瘤、乳腺癌(如乳腺髓样癌)、前列腺癌、神经胶质瘤、食管癌、膀胱癌、淋巴瘤(如组织细胞性淋巴瘤)、白血病(如慢性髓系白血病)咽鳞癌或甲状腺癌。
在某些优选的实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如人。
本发明还包含以下示例性实施方案：
1.埃可病毒25型(ECHO25)或其修饰形式或一种核酸分子，用于在受试者中治疗肿瘤的用途，或者用于制备在受试者中治疗肿瘤的药物的用途；其中，所述核酸分子包含选自下列的序列：
(1)ECHO25或其修饰形式的基因组序列或cDNA序列；和
(2)所述基因组序列或cDNA序列的互补序列。
2.项目1的用途，其中，所述ECHO25为野生型ECHO25；
优选地，所述ECHO25是从感染埃可病毒25型的个体中分离得到的临床分离毒株；
优选地，所述ECHO25或其修饰形式的基因组序列与如SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性；更优选地，所述ECHO25或其修饰形式的基因组序列为如SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列；
优选地，所述ECHO25或其修饰形式的cDNA序列与如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性；更优选地，所述ECHO25或其修饰形式的cDNA序列为如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
3.项目1或2的用途，其中，所述修饰形式为经修饰的ECHO25，其与野生型ECHO25相比在基因组中具有一个或多个核苷酸的替换、插入或删除；
优选地，所述经修饰的ECHO25与野生型ECHO25相比，具有一个或多个选自下列的修饰：
(1)位于非翻译区(例如5’UTR或3’UTR)的一个或多个突变；
(2)一个或多个外源核酸的插入；
(3)一个或多个内源基因的缺失或突变；和
(4)上述三项的任意组合。
4.项目3的用途，其中，所述经修饰的ECHO25包括位于5’非翻译区(5’UTR)的一个或多个突变；
优选地，所述经修饰的ECHO25的5’UTR序列经全部或部分替换；
优选地，所述经修饰的ECHO25的5’UTR中的内部核糖体进入位点(IRES)序列替换为外源IRES序列，例如人鼻病毒2(HRV2)的内部核糖体进入位点序列；
优选地，所述人鼻病毒2(HRV2)的内部核糖体进入位点序列如SEQ ID NO：2所示。
5.项目3或4的用途，其中，所述经修饰的ECHO25包含外源核酸；
优选地，所述外源核酸编码细胞因子(例如GM-CSF，优选为人GM-CSF)、或抗肿瘤蛋白或多肽(例如，抗PD-1或PD-L1的scFv，优选为抗人PD-1或PD-L1的scFv)；
优选地，所述外源核酸的插入位点位于所述经修饰的ECHO25基因组的5’UTR与VP4基因之间，或者位于VP1基因与2A基因之间；
优选地，所述外源核酸包含一个或多个(例如2个，3个或4个)微小RNA的靶序列；
优选地，所述微小RNA的靶序列的插入位点在所述经修饰的ECHO25基因组的3’非翻译区(3’UTR)；
优选地，所述外源核酸包含miR-133和/或miR-206的靶序列；
优选地，所述miR-133的靶序列如SEQ ID NO:3所示；
优选地，所述miR-206的靶序列如SEQ ID NO:4所示。
6.项目3-5任一项的用途，其中，所述经修饰的ECHO25包含至少一种如项目5中所定义的外源核酸的插入和/或至少一种如项目4中所定义的位于非翻译区的突变。
7.项目3-6任一项的用途，其中，所述经修饰的ECHO25具有以下特征中的一项：
(1)所述经修饰的ECHO25的基因组序列与选自下列的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性：如SEQ ID NO：13-16所示的核苷酸序列；优选地，所述经修饰的ECHO25的基因组序列选自如SEQ ID NO：13-16任一项所示的核苷酸序列；和
2)所述经修饰的ECHO25的cDNA序列与选自下列的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性：如SEQ ID NO：8-11所示的核苷酸序列；优选地，所述经修饰的ECHO25的cDNA序列选自如SEQ ID NO：8-11任一项所示的核苷酸序列。
8.项目1-7任一项的用途，其中，所述药物包括ECHO25以及其修饰形式中的一种或数种。
9.项目1-8任一项的用途，其中，所述核酸分子由所述ECHO25或其修饰形式的基因组序列或cDNA序列，或所述基因组序列或cDNA序列的互补序列组成；
优选地，所述核酸分子具有所述ECHO25或其修饰形式的基因组序列；
优选地，所述核酸分子具有如SEQ ID NO:12-16任一项所示的核苷酸序列。
10.项目1-8任一项的用途，其中，所述核酸分子为包含所述ECHO25或其修饰形式的基因组序列或cDNA序列，或所述基因组序列或cDNA序列的互补序列的载体(例如，克隆载体或表达载体)；
优选地，所述核酸分子为包含所述ECHO25或其修饰形式的cDNA序列，或所述cDNA序列的互补序列的载体(例如，克隆载体或表达载体)。
11.项目1-10任一项的用途，其中，所述药物包含治疗有效量的所述ECHO25和/或其修饰形式，或治疗有效量的所述核酸分子。
12.项目1-11任一项的用途，其中，所述药物还包含具有抗肿瘤活性的另外的药学活性剂，例如另外的溶瘤病毒、化学治疗剂或免疫治疗剂；
优选地，所述另外的溶瘤病毒选自疱疹病毒、腺病毒、细小病毒、呼肠孤病毒、新城疫病毒、水疱性口炎病毒、麻疹病毒或其任意组合；
优选地，所述化学治疗剂选自5-氟尿嘧啶、丝裂霉素、甲氨蝶呤、羟基脲、环磷酰胺、达卡巴嗪、米托蒽醌、蒽环类(如表柔比星或多柔比星)、依托泊苷、铂类化合物(如卡铂或顺铂)、紫杉烷类(如紫杉醇或紫杉特尔)或其任意组合；
优选地，所述免疫治疗剂选自免疫卡控点抑制剂(如PD-L1/PD-1抑制剂或CTLA-4抑制剂)、肿瘤特异性靶向抗体(如利妥昔单抗或赫赛汀)或其任意组合。
13.项目1-12任一项的用途，其中，所述肿瘤选自胃癌、肝癌、卵巢癌(如卵巢非透明细胞癌)、子宫内膜癌、黑色素瘤、前列腺癌、神经胶质瘤、食管癌、膀胱癌、淋巴瘤(如组织细胞性淋巴瘤)、白血病(如慢性髓系白血病)、横纹肌肉瘤、结直肠癌、非小细胞肺癌(如非小细胞肺腺癌)、宫颈癌(如HPV阴性宫颈癌)、乳腺癌(如乳腺髓样癌)、肾癌(如肾透明细胞癌)和胰腺癌；
优选地，所述肿瘤为胃癌、肝癌、卵巢癌(如卵巢非透明细胞癌)、子宫内膜癌、宫颈癌(如HPV阴性宫颈癌)、黑色素瘤、乳腺癌(如乳腺髓样癌)、前列腺癌、神经胶质瘤、食管癌、膀胱癌、淋巴瘤(如组织细胞性淋巴瘤)或白血病(如慢性髓系白血病)。
14.项目1-13任一项的用途，其中，所述受试者为哺乳动物，例如人。
15.一种经修饰的ECHO25，其与野生型ECHO25相比，5’UTR中的内部核糖体进入位点(IRES)序列替换为人鼻病毒2(HRV2)的内部核糖体进入位点序列。
16.项目15的经修饰的ECHO25，其中，所述经修饰的ECHO25具有以下特征中的至少一项：
1)所述人鼻病毒2(HRV2)的内部核糖体进入位点序列如SEQ ID NO：2所示；
2)所述野生型ECHO25的基因组序列与如SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性；优选地，所述野生型ECHO25的基因组序列为如SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列；
3)所述野生型ECHO25的cDNA序列与如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性；优选地，所述野生型ECHO25的cDNA序列为如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
17.项目15或16的经修饰的ECHO25，其中，所述经修饰的ECHO25还包含外源核酸；
优选地，所述外源核酸编码细胞因子(例如GM-CSF，优选为人GM-CSF)、或抗肿瘤蛋白或多肽(例如，抗PD-1或PD-L1的scFv，优选为抗人PD-1或PD-L1的scFv)；
优选地，所述外源核酸的插入位点位于所述经修饰的ECHO25基因组的5’UTR与VP4基因之间，或者位于VP1基因与2A基因之间；
优选地，所述外源核酸包含一个或多个(例如2个，3个或4个)微小RNA的靶序列；
优选地，所述微小RNA的靶序列的插入位点在所述经修饰的ECHO25基因组的3’非翻译区(3’UTR)；
优选地，所述外源核酸包含miR-133和/或miR-206的靶序列；
优选地，所述miR-133的靶序列如SEQ ID NO:3所示；
优选地，所述miR-206的靶序列如SEQ ID NO:4所示。
18.项目15-17任一项的经修饰的ECHO25，其中，所述经修饰的ECHO25具有以下特征中的一项：
1)所述经修饰的ECHO25的基因组序列与如SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性；优选地，所述经修饰的ECHO25的基因组序列为如SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列；
2)所述经修饰的ECHO25的cDNA序列与如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性；优选地，所述经修饰的ECHO25的cDNA序列为如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。
19.一种核酸分子，其包含选自下列的序列：
(1)项目15-18任一项所述的经修饰的ECHO25的基因组序列或cDNA序列；和
(2)所述基因组序列或cDNA序列的互补序列。
20.项目19的核酸分子，其中，所述核酸分子由所述经修饰的ECHO25的基因组序列或cDNA序列，或所述基因组序列或cDNA序列的互补序列组成；
优选地，所述核酸分子具有所述经修饰的ECHO25的基因组序列；
优选地，所述核酸分子具有如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列。
21.项目19的核酸分子，其中，所述核酸分子为包含所述经修饰的ECHO25的基因组序列或cDNA序列，或所述基因组序列或cDNA序列的互补序列的载体(例如，克隆载体或表达载体)；
优选地，所述核酸分子为包含所述经修饰的ECHO25的cDNA序列，或所述cDNA序列的互补序列的载体(例如，克隆载体或表达载体)。
22.项目15-18任一项的经修饰的ECHO25或项目19-21任一项的核酸分子，用于在受试者中治疗肿瘤的用途，或者用于制备在受试者中治疗肿瘤的药物的用途；
优选地，所述肿瘤选自胃癌、肝癌、卵巢癌(如卵巢非透明细胞癌)、子宫内膜癌、黑色素瘤、前列腺癌、神经胶质瘤、食管癌、膀胱癌、淋巴瘤(如组织细胞性淋巴瘤)、白血病(如慢性髓系白血病)、咽鳞癌、甲状腺癌、横纹肌肉瘤、结直肠癌、非小细胞肺癌(如非小细胞肺腺癌)、宫颈癌(如HPV阴性宫颈癌)、乳腺癌(如乳腺髓样癌)、肾癌(如肾透明细胞癌)和胰腺癌；
优选地，所述肿瘤为胃癌、肝癌、卵巢癌(如卵巢非透明细胞癌)、子宫内膜癌、宫颈癌(如HPV阴性宫颈癌)、黑色素瘤、乳腺癌(如乳腺髓样癌)、前列腺癌、神经胶质瘤、食管癌、膀胱癌、淋巴瘤(如组织细胞性淋巴瘤)、白血病(如慢性髓系白血病)咽鳞癌或甲状腺癌；
优选地，所述受试者为哺乳动物，例如人。
发明的有益效果
与现有技术相比，本发明的技术方案至少具有以下有益效果：
本申请的发明人首次发现，埃可病毒25型(ECHO25)具有对特定肿瘤具有良好的杀伤活性。基于这一发现，本发明进一步提供了基于ECHO25的溶瘤病毒，其具有更高的肿瘤杀伤活性以及肿瘤特异性，可单独用于肿瘤的治疗，亦可用作传统肿瘤治疗的辅助方法，或作为缺少其他治疗方法时的治疗手段。
本发明的ECHO25或其修饰形式对正常细胞影响较小或无影响，并且不引发受试者(例如人)针对该病毒的免疫原性反应，从而可安全地施用给受试者(例如人)。因此，本发明的ECHO25或其修饰形式具有重大的临床价值。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1显示了实施例2中野生型ECHO25对人脐静脉内皮细胞系HUVEC、人食管癌细胞系TE-1、人子宫内膜癌细胞系HEC-1-A和HEC-1-B的体外杀伤实验结果的显微镜照片，其中，MOCK表示未感染病毒的细胞。结果显示，在感染复数(MOI)为1感染72小时后，ECHO25对人肿瘤细胞系TE-1、HEC-1-A和HEC-1-B均有显著的溶瘤作用，但对人非肿瘤细胞的HUVEC无任何影响。
图2显示了实施例2中野生型ECHO25对人非小细胞肺癌细胞系A549和NCI-H661；人卵巢癌细胞系Caov3；人胰腺癌细胞系HPAF-2；人胃癌细胞系AGS、SGC7901和BGC823；人包皮成纤维细胞系HFF-1和人皮肤角化细胞系HaCat的体外杀伤实验结果的结晶紫染色照片，其中，MOCK表示未感染病毒的细胞。结果显示，在MOI为10、1和0.1感染72小时后，ECHO25对A549、NCI-H661、Caov3、HPAF-2、AGS、SGC7901和BGC823均有显著的溶瘤作用，但对人非肿瘤细胞的HFF-1和HaCat无任何影响。
图3显示了实施例2中通过体外转录方法获得的同批2份野生型ECHO25病毒基因组RNA样品的电泳图。
图4显示了实施例2中野生型ECHO25病毒基因组RNA对人结直肠癌细胞系SW480的杀伤效果。结果显示，转染ECHO25基因组RNA的SW480细胞在转染后24小时出现CPE已十分明显，到48小时几乎全部裂解死亡。
图5A-5D显示了实施例3中野生型ECHO25对人神经胶质瘤细胞系GBM(A)、人子宫内膜癌细胞系Ishikawa(B)、人前列腺癌细胞系PC-3(C)和人乳腺癌细胞系BcaP37(D)的体内抗肿瘤实验结果。结果显示，在攻毒实验组中，每隔2天瘤内注射106TCID50/每瘤块的ECHO25，共计5次后，分别皮下接种了GBM、Ishikawa、PC-3或BcaP37细胞的SCID小鼠所形成的肿瘤的生长明显变慢、停滞，甚至裂解消失；相比之下，未经溶瘤病毒治疗的阴性组(CTRL)的肿瘤则保持正常生长，其肿瘤体积显著大于攻毒实验组。
图6显示了实施例3中ECHO25-WT、ECHO25-HRV2、ECHO25-miR133&206T、ECHO25-GM-CSF和ECHO25-Anti-PD-1对人神经胶质瘤细胞系GBM的体内抗肿瘤实验结果。结果显示，在攻毒实验组中，每隔2天瘤内注射106TCID50/每瘤块的ECHO25或其修饰形式，共5针，在处理10天后，皮下接种了GBM细胞的SCID小鼠所形成的肿瘤生长停滞至裂解消失；相比之下，未经溶瘤病毒治疗的阴性组(CTRL)肿瘤则保持正常生长，其肿瘤体积显著大于攻毒实验组。
图7显示了实施例4中ECHO25-WT在BALB/c小鼠中的毒性检测实验结果。将不同剂量(104、105、106和107TCID50/只)ECHO25分别腹腔注射给1日龄BALB/c小鼠，并获得攻毒后的小鼠存活率和健康分数。结果显示，ECHO25对BALB/c小鼠的毒性很弱，在高剂量的情况下仍不会致病致死，表明ECHO25具有良好的体内安全性。
序列信息
本发明涉及的部分序列的信息提供于下面的表1中。
表1：序列的描述
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons，Inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。本文中提及的全部公开案和其他参考资料以其全文通过引用合并入本文。
实施例1：ECHO25及其修饰形式的获得及制备
1.1从患者临床标本中分离ECHO25
(1)患者的咽拭子和肛拭子来源于中国，厦门市疾病预防与控制中心；非洲绿猴肾细胞(Vero细胞；Number:CCL-81TM)由中国，厦门大学，国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心保存，使用添加有10％胎牛血清、谷氨酰胺、青霉素和链霉素的MEM培养基进行培养。
(2)标本处理：将患者咽拭子和肛拭子在标本保存液中充分搅动，以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等，随后将标本保存液在4℃条件下4000rpm高速离心30min；
(3)接种与观察：
A.将Vero细胞铺24孔板，每孔细胞数量为1×105个，吸去生长液(MEM培养基，10％胎牛血清以及谷氨酰胺、青霉素和链霉素)，每孔换上1mL的维持液(MEM培养基，2％胎牛血清以及谷氨酰胺、青霉素和链霉素)，随后除了阴性对照孔，每孔接种50μL的标本上清液，37℃，5％CO2培养箱培养；
B.一周内每天在显微镜下观察细胞，记录接种孔内是否有特征性的细胞病变效应(CPE)的出现；
C.若7天内接种孔细胞出现肠道病毒特征性CPE时，收集细胞及上清至-80℃冻存；若7天后仍无CPE出现，将细胞进行盲传；
D.盲传6代内出现细胞CPE的，收集细胞及上清至-80℃冻存；盲传6代后仍未出现CPE的，判定为阴性；
(4)病毒的分离与克隆化：
使用RT-PCR(Hou等人，Virus Res 2015,205:41-44)与基于特异性抗体的酶联免疫斑点法(ELISPOT)(李姝璇等人，生物技术通讯(2016)27(1):52-57)鉴定从临床标本中分离获得的病毒，选取埃可病毒25型阳性的培养物进行至少3次克隆化实验；对每一轮由有限稀释法获得的克隆毒株同样使用RT-PCR与ELISPOT鉴定，选取埃可病毒25型阳性的克隆毒株后进行下一轮克隆化；挑选生长活力强的埃可病毒25型单一毒株作为溶瘤病毒候选毒株。
1.2基于感染性克隆与反向遗传学技术获得ECHO25及其修饰形式的拯救毒株
本实施例以野生型ECHO25(SEQ ID NO:1)为示例，展示如何通过反向遗传学技术获得用于本发明的ECHO25及其修饰形式，具体方法如下所述。
(1)病毒感染性克隆构建：野生型ECHO25(命名为ECHO25-WT)的cDNA序列见SEQ IDNO:1，其基因组RNA序列为SEQ ID NO:12；或者在野生型ECHO25的cDNA(SEQ ID NO:1)的基础上做基因插入或替换改造，包括：
修饰形式1：将野生型ECHO25的内部核糖体进入位点序列替换为人鼻病毒2的内部核糖体进入位点序列(其DNA序列见SEQ ID NO:20)，从而获得重组病毒(命名为ECHO25-HRV2)的cDNA(SEQ ID NO:8)，其基因组RNA序列为SEQ ID NO:13；
修饰形式2：将miR-133靶序列(其DNA序列见SEQ ID NO:17)和miR-206靶序列(其DNA序列见SEQ ID NO:18)的串联序列(其DNA序列见SEQ ID NO:19)插入到野生型ECHO25的cDNA(SEQ ID NO:1)的3’非翻译区7337-7338bp之间，从而获得重组病毒(命名为ECHO25-miR133&206T)的cDNA(SEQ ID NO:9)，其基因组RNA序列为SEQ ID NO:14；
修饰形式3：将人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因(SEQ ID NO:6)插入到野生型ECHO25的cDNA(SEQ ID NO:1)的VP1与2A基因之间，从而获得重组病毒(命名为ECHO25-GM-CSF)的cDNA(SEQ ID NO:10)，其基因组RNA序列为SEQ ID NO:15；
修饰形式4：将编码抗人程序性死亡受体1单链抗体(Anti-PD-1scFv)的序列(SEQID NO:7)插入到野生型ECHO25的cDNA(SEQ ID NO:1)的VP1与2A基因之间，从而获得该重组病毒(命名为ECHO25-Anti-PD-1)的cDNA(SEQ ID NO:11)，其基因组RNA序列为SEQ ID NO:16。
然后将上述五种溶瘤病毒的cDNA序列(SEQ ID NO:1,8-11)送到基因合成公司(上海生工生物工程股份有限公司)进行全基因合成，并连接进入pSVA质粒(Hou等人，VirusRes 2015,205:41-44)，获得ECHO25或其修饰形式(即，ECHO25-WT、ECHO25-HRV2、ECHO25-miR133&206T、ECHO25-GM-CSF和ECHO25-Anti-PD-1)的感染性克隆质粒。
(2)质粒小提试剂盒和E coli.DH5α感受态购自北京天根生化科技有限公司；293T细胞(Number:CRL-3216TM)和人横纹肌肉瘤细胞(RD细胞；Number:CCL-136TM)由中国，厦门大学，国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心保存，分别用DMEM和MEM培养基、加10％胎牛血清以及谷氨酰胺、青霉素和链霉素培养；转染试剂Lipofactamine2000和Opti-MEM购自Thermo Fisher Scientific公司。
(3)将分别包含上述五种溶瘤病毒cDNA序列的感染性克隆质粒转化进入Ecoli.DH5α感受态，待克隆长出后直接挑取单克隆菌株摇菌后用质粒小提试剂盒提取质粒，随后送公司(上海生工生物工程股份有限公司)进行测序分析；
(4)将测序正确的感染性克隆质粒与辅助质粒pAR3126共转染细胞拯救病毒(Hou等人，Virus Res 2015,205:41-44)。首先转染293T细胞，具体操作方法参见转染试剂说明书；随后在显微镜下观察，当293T细胞出现CPE时收获细胞及培养上清，并接种至RD细胞进行传代与培养，获得的拯救病毒可作为溶瘤病毒候选毒株。
实施例2：ECHO25及其修饰形式的体外抗肿瘤实验
2.1所使用的病毒与细胞系
(1)病毒：本实施例使用实施例1所提供的ECHO25-WT(SEQ ID NO:12)、ECHO25-HRV2(SEQ ID NO:13)、ECHO25-miR133&206T(SEQ ID NO:14)、ECHO25-GM-CSF(SEQ ID NO:15)和ECHO25-Anti-PD-1(SEQ ID NO:16)。
(2)细胞系：人横纹肌肉瘤细胞RD(Number:CCL-136TM)；人结直肠癌细胞系SW480(Number:CCL-228TM)和HT-29(Number:HTB-38TM)；人胃癌细胞系AGS(Number:CRL-1739TM)、SGC7901(CCTCC保藏编号:GDC150)、BGC823(CCTCC保藏编号:GDC151)和NCI-N87(Number:CRL-5822TM)；人小细胞肺癌细胞系NCI-H1417(Number:CRL-5869TM)；人非小细胞肺癌细胞系SPC-A-1(CCTCC保藏编号:GDC050)、NCI-H1299(Number:CRL-5803TM)、NCI-H1975(Number:CRL-5908TM)、A549(Number:CCL-185TM)、NCI-H661(Number:HTB-183TM)、EBC-1(Thermo Fisher Scientific,Catalog#:11875101)和NCI-H1703(Number:CRL-5889TM)；人肝癌细胞系C3A(Number:CRL-10741TM)、Hep3B(Number:HB-8064TM)、Huh7(CCTCC保藏编号:GDC134)和PLC/PRF/5(Number:CRL-8024TM)；人卵巢癌细胞系ES-2(Number:CRL-1978TM)和Caov3(Number:HTB-75TM)；人子宫内膜癌细胞系Hec-1-A(Number:HTB-112TM)、Hec-1-B(Number:HTB-113TM)和Ishikawa(ECACC No.99040201)；人宫颈癌细胞系Hela(Number:CCL-2TM)、Caski(Number:CRL-1550TM)和C-33A(Number:HTB-31TM)；人黑色素瘤细胞系A-375(Number:CRL-1619TM)和SK-MEL-1(Number:HTB-67TM)；人乳腺癌细胞系BT-474(Number:HTB-20TM)、MDA-MB-231(Number:HTB-26TM)、MDA-MB-453(Number:HTB-131TM)、MCF-7(Number:HTB-22TM)、ZR-75-30(Number:CRL-1504TM)、SK-BR-3(Number:HTB-30TM)和BcaP37(CCTCC保藏编号:GDC206)；人肾癌细胞系A-498(Number:HTB-44TM)、786-O(Number:CRL-1932TM)和Caki-1(Number:HTB-46TM)；人胰腺癌细胞系HPAF-2(Number:CRL-1997TM)；人前列腺癌细胞系PC-3(Number:CRL-1435TM)和DU145(Number:HTB-81TM)；人神经胶质瘤细胞系GBM(病人肿瘤组织分离原代肿瘤细胞系)和U118-MG(Number:HTB-15TM)；人咽鳞癌细胞系FaDu(Number:HTB-43TM)；人舌鳞癌细胞系CAL 27(Number:CRL-2095TM)；人鼻咽癌细胞系CNE(购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心，编号:3131C0001000700013)；人鼻中隔鳞状癌细胞系RPMI 2650(Number:CCL-30TM)；人喉癌细胞系HEp-2(Number:CCL-23TM)；人咽头癌胸水转移细胞Detroit 562(Number:CCL-138TM)；人颌下腺癌细胞系A-235(由国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心保存)；人甲状腺癌细胞系SW579(由国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心保存)和TT(Number:CRL-1803TM)；人食管癌细胞系TE-1(购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，编号:3131C0001000700089)；人膀胱癌细胞系J82(Number:HTB-1TM)和5637(Number:HTB-9TM)；人白血病细胞系Jurkat(Number:TIB-152TM)、THP-1(Number:TIB-202TM)、CCRF-CEM(Number:CCL-119TM)、MOLT-4(Number:CRL-1582TM)、K562(Number:CCL-243TM)；人淋巴瘤细胞系Daudi(Number:CCL-213TM)、Raji(Number:CCL-86TM)和U937(Number:CRL-1593.2TM)；人正常细胞系包括：人包皮成纤维细胞系HFF-1(Number:SCRC-1041TM)、人皮肤角化细胞系HaCat(CCTCC保藏编号:GDC106)、人前列腺基质细胞系WPMY-1(Number:CRL-2854TM)和人脐静脉内皮细胞系HUVEC(Thermo Fisher Scientific,Catalog#:C01510C)。以上细胞均由中国，厦门大学，国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心保存。AGS和TT使用F-12K培养基；RD、C-33A、SK-MEL-1、J82、FaDu、EBC-1、RPMI2650、Detroit 562和DU145使用MEM培养基；NCI-H1417、NCI-H1703、Caski、BT-474、ZR-75-30、SK-BR-3、786-O、Jurkat、THP-1、CCRF-CEM、MOLT-4、Daudi、Raji、K562、U937、5637、TE-1、Caski、NCI-H1975、NCI-H661、SGC7901和BGC823使用RPMI-1640培养基；ES-2、A-235用McCoy's 5A培养基；MDA-MB-231和MDA-MB-453用Leibovitz'sL-15培养基；其他细胞都使用DMEM培养基，这些培养基均需添加10％的胎牛血清、谷氨酰胺与青霉素-链霉素双抗。以上所有细胞在37℃，5％CO2的标准条件下培养。
2.2病毒的培养
将RD细胞均匀铺于10厘米细胞培养板上，培养条件为含有10％胎牛血清以及谷氨酰胺、青霉素和链霉素的MEM培养基，37℃，5％CO2，饱和湿度；待细胞汇合度达到90％以上时，将细胞培养基更换为无血清的MEM培养基，每板接种107TCID50的ECHO25-WT、ECHO25-HRV2、ECHO25-miR133&206T、ECHO25-GM-CSF或ECHO25-Anti-PD-1，继续培养24小时后，ECHO25或其修饰形式在RD细胞内增殖并引起细胞出现CPE；当90％以上细胞出现收缩变圆、颗粒感增加以及脱落裂解时，收获细胞及其培养液上清；经3次反复冻融后，收集培养上清进行离心除去细胞碎片，离心条件为4000rpm，10min，4℃；最后，用0.22μm的一次性滤器(Millipore公司)过滤上清，除尽细胞碎片等杂质。
2.3病毒滴度的测定
将RD细胞铺于96孔板当中，细胞密度为104个/孔；待细胞贴壁之后，对实施例2.2中获得的病毒液用无血清MEM培养基进行10倍起始的10倍梯度稀释。加50μl稀释后的病毒到细胞孔当中，7天后观察并标记出现CPE的细胞孔，利用Karber法进行计算，计算公式为lgTCID50＝L-D(S-0.5)，L：最高稀释度的对数，D：稀释度对数之间的差，S：阳性孔比率总和。此时计算出来的TCID50单位为TCID50/50μl，需换算成TCID50/ml。
2.4病毒的体外抗肿瘤实验
将人肿瘤细胞与正常细胞按照104个/孔接种至96孔板；待细胞贴壁，每孔更换为无血清的对应细胞培养基，并且分别接种MOI为0.1、1、10和100的病毒；随后，每天在显微镜下观察细胞是否产生CPE。
其中，未感染病毒的人脐静脉内皮细胞系HUVEC、人食管癌细胞系TE-1、人子宫内膜癌细胞系HEC-1-A和HEC-1-B(阴性对照组，Mock)，以及使用MOI＝1ECHO25-WT处理72小时后的上述细胞的显微镜照片如图1所示。结果显示，在感染复数(MOI)为1感染72小时后，病毒感染组的肿瘤细胞数量明显减少，且明显皱缩、破裂等现象；而经病毒感染的非肿瘤细胞与Mock组的非肿瘤细胞相比，其细胞形态几乎无变化。上述结果表明，ECHO25对人食管癌细胞系TE-1、人子宫内膜癌细胞系HEC-1-A和HEC-1-B均有显著的溶瘤作用，但对非肿瘤细胞HUVEC无任何影响。
在病毒感染培养72小时后使用Cell Counting Kit-8(CCK-8试剂盒；上海碧云天生物技术有限公司)和结晶紫染色的方法(仅用于贴壁细胞)检测细胞存活率，具体方法如下：
(1)CCK8法检测细胞存活率
在96孔细胞培养板中，贴壁细胞直接弃掉原培养基，悬浮细胞经离心后小心弃掉原培养基，随后更换为每孔100μl的新鲜无血清培养基；在接种细胞的孔中每孔加入10μlCCK-8溶液，同时在空白培养液中也加入等量的CCK-8溶液作为阴性对照；在细胞培养箱内37℃孵育0.5-3小时，在0.5、1、2、3小时分别利用酶标仪在吸光度为450nm进行一次检测，选取吸光度范围比较适宜的时间点作为细胞存活率的参考。ECHO25-WT对各细胞的CCK-8检测结果参见表2，其中，“-”表示病毒处理后的细胞存活率与MOCK组相比无显著性差异；“+”表示病毒处理后的细胞数量减少但存活率仍大于50％，且与MOCK组相比具有显著性差异；“++”表示病毒处理后的细胞存活率小于50％，且与MOCK组相比具有显著性差异。
细胞存活率的计算方法为：
(2)结晶紫染色检测细胞存活率(仅用于贴壁细胞)
在病毒感染细胞3天后，弃去96孔细胞培养板中的培养上清液，每孔加入100μl甲醇，避光固定15min；称量结晶紫粉末(上海生工生物工程股份有限公司)，配成2％(w/v)的结晶紫甲醇溶液于4℃保存；取适量的2％的结晶紫甲醇溶液用PBS溶液配成0.2％的结晶紫工作溶液；固定15min后，弃去96孔细胞培养板中甲醇固定液，加入100μl的结晶紫工作溶液染色30min；弃去结晶紫染液，用PBS溶液洗3～5次，直至多余染液洗净，空气干燥；利用ImmunSpot@S5UV Analyzer(Cellular Technology Limited,USA)进行拍照，记录实验结果。其中，人非小细胞肺癌细胞系A549和NCI-H661；人卵巢癌细胞系Caov3；人胰腺癌细胞系HPAF-2；人胃癌细胞系AGS、SGC7901和BGC823；人正常细胞系的人包皮成纤维细胞系HFF-1和人皮肤角化细胞系HaCat的对照组(MOCK)和实验组(使用MOI分别为0.1，1和10的ECHO25-WT感染72小时)的结晶紫染色结果如图2所示。结果显示，在MOI为10、1和0.1感染72小时后，与未加入病毒的对照组(MOCK)相比，实验组中的各肿瘤细胞的数量明显减少；但非肿瘤细胞的细胞数量变化不明显。上述结果表明ECHO25-WT对人肿瘤细胞系A549、NCI-H661、Caov3、HPAF-2、AGS、SGC7901和BGC823均有显著的溶瘤作用，但对非肿瘤细胞系HFF-1和HaCat无任何影响。
表2：ECHO25-WT体外抗肿瘤实验结果
注：“-”表示病毒处理后的细胞存活率与MOCK组相比无显著性差异；“+”表示病毒处理后的细胞数量减少但存活率仍大于50％，且与MOCK组相比具有显著性差异；“++”表示病毒处理后的细胞存活率小于50％，且与MOCK组相比具有显著性差异。
由表2可知，ECHO25-WT对特定肿瘤细胞类型具有良好的杀伤作用，特别的，该病毒对结直肠癌细胞系、胃癌细胞系、非小细胞肺腺癌细胞系、卵巢癌细胞系、肾透明细胞癌细胞系、子宫内膜癌细胞系、HPV阴性宫颈癌细胞系、乳腺髓样癌细胞系、前列腺癌细胞系、神经胶质瘤细胞系、食管癌细胞系等杀伤显著，另外对肝癌细胞系、胰腺癌细胞系、膀胱癌细胞系、组织细胞性淋巴瘤细胞系和慢性髓性白血病细胞系亦具有良好的杀伤活性；然而，ECHO25-WT对非小细胞肺鳞癌细胞系、小细胞肺癌细胞系、HPV阳性宫颈癌细胞系、乳腺非髓样癌细胞系、肾腺癌细胞系、B细胞淋巴瘤细胞系、T细胞白血病细胞系、鼻中隔鳞状细胞癌细胞系、颌下腺鳞癌细胞系、甲状腺癌细胞系等肿瘤细胞类型均没有明显的杀伤活性。同时，该病毒除了对人脐静脉内皮细胞系HUVEC在MOI＝100时具有一定的毒性，对其他测试的非肿瘤细胞系包括人包皮成纤维细胞系HFF-1、人皮肤角化细胞系HaCat和人前列腺基质细胞系WPMY-1毒性基本没有毒性。
另外，ECHO25-HRV2、ECHO25-miR133&206T、ECHO25-GM-CSF和ECHO25-Anti-PD-1的体外抗肿瘤实验结果显示，上述四种经修饰的ECHO25均保留了母本毒株野生型ECHO25对特定肿瘤细胞的杀伤作用、以及对结直肠癌细胞系、胃癌细胞系、卵巢癌细胞系、肾透明细胞癌细胞系、子宫内膜癌细胞系、HPV阴性宫颈癌细胞系、乳腺髓样癌细胞系、前列腺癌细胞系、神经胶质瘤细胞系、食管癌细胞系等的显著杀伤作用，其中对人结直肠癌细胞系SW480、人胃癌细胞系AGS、人子宫内膜癌细胞系Ishikawa和人神经胶质瘤细胞系U118-MG的溶瘤活性的CCK-8检测结果如表3所示；同时，这四种经修饰的ECHO25对非小细胞肺鳞癌细胞系、小细胞肺癌细胞系、HPV阳性宫颈癌细胞系、乳腺非髓样癌细胞系、肾腺癌细胞系、B细胞淋巴瘤细胞系、T细胞白血病细胞系、鼻中隔鳞状细胞癌细胞系、颌下腺鳞癌细胞系等肿瘤细胞类型亦没有明显的杀伤活性。值得注意的是，ECHO25-HRV2对部分ECHO25-WT几乎无杀伤活性的肿瘤细胞却具有了明显的杀伤活性，其中对人咽鳞癌细胞系FaDu和人甲状腺癌细胞系SW579的溶瘤活性的CCK-8检测结果如表4所示。
表3：ECHO25-HRV2、ECHO25-miR133&206T、ECHO25-GM-CSF和ECHO25-Anti-PD-1的体外抗肿瘤实验结果
注：“-”表示病毒处理后的细胞存活率与MOCK组相比无显著性差异；“+”表示病毒处理后的细胞数量减少但存活率仍大于50％，且与MOCK组相比具有显著性差异；“++”表示病毒处理后的细胞存活率小于50％，且与MOCK组相比具有显著性差异。
表4：ECHO25-WT与ECHO25-HRV2对人咽鳞癌细胞系FaDu和人甲状腺癌细胞系SW579的体外溶瘤实验结果比较
注：“-”表示病毒处理后的细胞存活率与MOCK组相比无显著性差异；“+”表示病毒处理后的细胞数量减少但存活率仍大于50％，且与MOCK组相比具有显著性差异；“++”表示病毒处理后的细胞存活率小于50％，且与MOCK组相比具有显著性差异。
2.5 ECHO25的连续适应性传代
在本实施例中，通过将ECHO25在某一种肿瘤细胞内连续适应性传代以获得对该肿瘤细胞杀伤活性增强毒株。
将野生ECHO25在其溶瘤作用效果不是非常显著的人肝癌细胞系PLC/PRF/5、人黑色素瘤细胞系A-375或人膀胱癌细胞系J82中分别进行连续适应性传代，具体方法如下：
将以上肿瘤细胞其中一种均匀铺于10厘米细胞培养板上，培养条件为含有10％胎牛血清以及谷氨酰胺、青霉素和链霉素的对应细胞培养基，37℃，5％CO2，饱和湿度；待细胞汇合度达到90％以上时，将细胞培养基更换为无血清的细胞培养基，每板接种107TCID50的ECHO25病毒，培养环境更换为33℃，5％CO2，饱和湿度；待ECHO25在肿瘤细胞内增殖并引起细胞出现CPE时(感染最多3天后)，收获细胞及其培养液上清；经三次冻融后，4℃，4000rpm离心10min；取离心上清加入细胞汇合度达到90％以上的新的肿瘤细胞中，完成一次病毒传代。如此反复传代10次以上，每传代一次取出部分病毒液在RD细胞中进行病毒滴度检测，具体方法参照实施例2.3。通常病毒复制能力会随代次增加呈增强趋势，直至可在该肿瘤细胞中达到较高的感染性滴度且病毒复制稳定，即获得该肿瘤细胞的ECHO25适应毒株。
随后，通过实施例2.4中所述的体外抗肿瘤实验的操作方法，将人肿瘤细胞PLC/PRF/5、A-375或J82按照104个/孔接种至96孔板；待细胞贴壁，每孔更换为无血清的对应细胞培养基，37℃孵育30min，再分别接种MOI为0.1、1、10和100的每种细胞相对应的连续传代ECHO25适应毒株(病毒滴度在RD细胞上检测)；随后每天在显微镜下观察细胞是否产生CPE，并在病毒感染培养72小时后使用CCK-8法检测细胞存活率。
结果如表5所示，野生型ECHO25经过在其溶瘤作用效果不好的某一种肿瘤细胞中连续传代后，其对该肿瘤细胞的杀伤活性明显增强，表明可通过上述连续传代的方法获得对该肿瘤细胞溶瘤作用效果增强的ECHO25适应毒株。
表5：通过在某肿瘤细胞内连续适应性传代后的ECHO25对该肿瘤细胞的体外杀伤实验结果
注：“-”表示病毒处理后的细胞存活率与MOCK组相比无显著性差异；“+”表示病毒处理后的细胞数量减少但存活率仍大于50％，且与MOCK组相比具有显著性差异；“++”表示病毒处理后的细胞存活率小于50％，且与MOCK组相比具有显著性差异。
2.6 ECHO25基因组RNA的溶瘤效果评价
在本实施例中，通过将纯化的ECHO25基因组RNA转染某一种肿瘤细胞可产出大量具有感染性的ECHO25活病毒并对肿瘤细胞造成杀伤。
首先通过体外转录的方法以获得病毒基因组RNA，该方法可参见例如Hadac E M,Kelly E J and Russell S J.Mol Ther，2011,19(6):1041–1047。具体而言，将实施例1中所获得的野生型ECHO25的感染性克隆质粒线性化，以该线性化质粒为模板，使用试剂盒MEGAscriptTMT7 Transcription Kit(Thermo Fisher Scientific,AM1333)体外转录并大量生产病毒RNA，再使用MEGAclearTMTranscription Clean-Up Kit(Thermo FisherScientific,AM1908)纯化获得的病毒RNA待用，2份平行样品的RNA电泳图谱如图3所示。
随后，通过实施例2.4中所述的体外抗肿瘤实验的操作方法，将人结直肠癌肿瘤细胞系SW480按照105个/孔接种至24孔板；待细胞贴壁，每孔更换为无血清的对应细胞培养基，37℃孵育30min，再使用转染试剂2000(Thermo FisherScientific,11668019)将纯化好的病毒RNA按照1μg每孔转染SW480细胞，阴性对照组转染无关RNA核酸分子，随后每天在显微镜下观察细胞是否产生CPE。
结果发现，转染ECHO25基因组RNA的SW480细胞在转染后8小时左右开始出现CPE，随后细胞病变逐渐加剧，48小时后使用CCK8法检测存活率，SW480细胞已经几乎全部死亡裂解，SW480细胞感染0、24和48小时后的显微镜照片如图4所示；培养上清接种到新的SW480细胞中又可很快产生CPE。该结果表明，直接施用ECHO25的核酸亦具有良好的杀伤活性，可用于治疗肿瘤。
实施例3：ECHO25及其修饰形式的体内抗肿瘤实验
3.1病毒、细胞系与实验动物
(1)病毒：本实施例中使用实施例1所提供的ECHO25-WT(SEQ ID NO:12)、ECHO25-HRV2(SEQ ID NO:13)、ECHO25-miR133&206T(SEQ ID NO:14)、ECHO25-GM-CSF(SEQ ID NO:15)和ECHO25-Anti-PD-1(SEQ ID NO:16)。病毒的培养与病毒滴度测定方法分别参见实施例2.2和2.3。
(2)细胞系：人神经胶质瘤细胞系GBM(从病人肿瘤组织分离的原代肿瘤细胞系)、人子宫内膜癌细胞系Ishikawa(ECACC No.99040201)、人前列腺癌细胞系PC-3(Number:CRL-1435TM)和人乳腺癌细胞系BcaP37(CCTCC保藏编号:GDC206)。以上细胞均使用DMEM培养基培养，并且该培养基均添加入10％的胎牛血清、谷氨酰胺与青霉素-链霉素双抗。以上所有细胞均在37℃，5％CO2的标准条件下培养。
(3)实验动物：6-8周龄的雌性C.B17SCID小鼠来源于上海斯莱克实验动物有限责任公司；根据厦门大学实验动物中心与伦理委员会所批准的方案，将该小鼠在SPF条件下饲养。
3.2病毒的体内抗肿瘤实验
将用于SCID小鼠皮下成瘤的肿瘤细胞用0.01％胰蛋白酶消化后，再使用含10％的胎牛血清的细胞培养基重悬成单细胞悬液；计数悬液的细胞密度，1000g，3min离心沉淀细胞，再用适量体积的PBS重悬细胞，使达到约106-107个细胞/100μl PBS；按照106-107个细胞/100μl PBS/点在SCID小鼠背部皮下用注射器接种肿瘤细胞，待14-21天左右、肿瘤细胞在SCID小鼠皮下形成大约100mm3的瘤块的时候，将荷瘤SCID小鼠随机分为实验组(施用ECHO25-WT、ECHO25-HRV2、ECHO25-miR133&206T、ECHO25-GM-CSF或ECHO25-Anti-PD-1)与阴性对照组，每组4只(n＝4)，用106TCID50/100μl无血清培养基/每瘤块的溶瘤病毒(ECHO25-WT、ECHO25-HRV2、ECHO25-miR133&206T、ECHO25-GM-CSF或ECHO25-Anti-PD-1)或等量无血清培养基瘤内注射处理，每两天注射1次，共处理5次。每两天用游标卡尺测量并记录肿瘤大小变化，肿瘤大小的计算方法为：
肿瘤大小(mm3)＝肿瘤长度数值×(肿瘤宽度数值)2/2。
ECHO25-WT对上述四种肿瘤的治疗结果分别如图5A-5D所示。结果显示，攻毒ECHO25-WT后，所检测的GBM(A)、Ishikawa(B)、PC-3(C)和BcaP37(D)四种肿瘤生长均出现逐渐变慢和停滞，甚至裂解消失；相比之下，阴性组(CTRL)肿瘤则保持正常生长，其肿瘤大小显著大于实验组。
图6显示了ECHO25-WT、ECHO25-HRV2、ECHO25-miR133&206T、ECHO25-GM-CSF和ECHO25-Anti-PD-1分别治疗GBM肿瘤模型10天后的结果。结果显示，与未经溶瘤病毒治疗的阴性对照组相比，ECHO25-WT、ECHO25-HRV2、ECHO25-miR133&206T、ECHO25-GM-CSF和ECHO25-Anti-PD-1治疗后的肿瘤体积显著减小，且5种溶瘤病毒处理后肿瘤体积减小幅度类似。上述结果表明ECHO25-WT、ECHO25-HRV2、ECHO25-miR133&206T、ECHO25-GM-CSF和ECHO25-Anti-PD-1均展现出显著有利的体内抗肿瘤活性。
实施例4：溶瘤病毒的安全性评价
4.1所用的病毒与实验动物
(1)病毒：本实施例使用由实施例1所提供的ECHO25-WT(SEQ ID NO:12)。病毒的培养与病毒滴度测定方法分别参照实施例2.2和2.3。
(2)实验动物：BALB/c孕鼠来源于上海斯莱克实验动物有限责任公司；根据厦门大学实验动物中心与伦理委员会所批准的方案，将该小鼠在清洁级条件下饲养，随后选取BALB/c孕鼠生产的1日龄小鼠用于ECHO25的体内毒力评估。
4.2病毒在小鼠体内的安全性评价
选取BALB/c 1日龄乳鼠进行ECHO25-WT的腹腔攻毒，攻毒滴度剂量为104、105、106或107TCID50/只，随后每天对不同剂量攻毒组BALB/c小鼠存活率和健康分数进行记录，健康分数的评定标准为：5分，濒死或死亡；4分，肢体重症瘫痪；3分，肢体无力或轻度畸形；2分，消瘦；1分，萎靡、竖毛、颤抖；0分，健康。
结果如图7所示。在攻毒后的14天内，所有剂量的攻毒组小鼠均未发病与死亡，说明ECHO25-WT对BALB/c小鼠毒力弱，即使在极高攻毒剂量下也对小鼠状态无影响。上述结果表明ECHO25-WT具有良好的体内安全性。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。
序列表
<110> 厦门大学
北京万泰生物药业股份有限公司
<120> 一种用于治疗肿瘤的埃可病毒
<130> IDC170044
<160> 20
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 7428
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA sequence of ECHO25-WT
<400> 1
ttaaaacagc ctgtgggttg ttcccaccca tagggcccac tgggcgctag cacactggta 60
ttgtggtacc tttgtgcgcc tgttttatct acccctcccc caaacgtgac ttagaagctc 120
aacacatgtg gtcagcaggt ggcccagtat accaactggg tcttgatcaa gcacttctgt 180
taccccggac cgagtatcaa taggctgctc acgcggctga aggagaaagt gttcgttatc 240
cggccaatta ctacgagaaa cctagtacca ccatggaagt tgcgcggcgt ttcgctccgc 300
acaaccccag tgtagatcag gccgatgagt caccgcactc ctcacgggcg accgtggcgg 360
tggctgcgct ggcggcctgc ccatggggca acccatggga cgcttcaata ccgacatggt 420
gtgaagagtc tattgtgcta attggtaatc ctccggcccc tgaatgcggc taatcccaac 480
tgcggagcag atacccacat gccagtgggc agtctgtcgt aacgggtaac tctgcagcgg 540
aaccgactac tttgggtgtc cgtgtttctt tttattcttt attggctgct tatggtgaca 600
attgagagat tgttgccata tagctattgg attggccatc cggtgacaaa cagaacaata 660
gtttatctat ttgttggttt cataccatta aattttaaag tattaaagac tatcaacttg 720
atcatactac ttaatacagc aaaatgggag ctcatgtgtc aacgcagaaa accggagcgc 780
atgagactgg tttgagcgcc agtgggaatt cggttattca ttacacaaca tcaattatta 840
caaggatgca tcttcaaatt cagcaaacag gcaagacttt tcacaagacc ccagcaaatt 900
taccgaaccc tatgaaggat gtcatgatta aatcactccc ggcgttaaat tcacccactg 960
tggaggaatg tggctacagt gaccgggtgc gctccattac tttgggtaat tcaacaatca 1020
ctacgcagga aagtgcaaat gtggtagttg gctatggtgt ctggccggag tatttgaggg 1080
atgaggaagc cacggcacaa gaccaaccca ctcaaccaga tgttgccacc tgtagattct 1140
acaccctaga atctgttatg tgggagaagt cctcggcggg ctggtggtgg aagtttccag 1200
atgctcttgc agagatgggc ctattcggtc aaaatatgct ataccattat ttgggaaggt 1260
caggctacac aatacacgtg caatgcaatg cgtcaaaatt ccaccaaggg tgccttcttg 1320
tagtctgtgt gccagaagcc gagatgggtt ctgcacagct tgataggaca ttgaatcata 1380
ccaaacttag caacacagaa cacgccagca cattcgggtc catgagttcc aatgaagctg 1440
gggccgtcca aaatgtagtg cacaatgccg ggatgggcgt tggagtgggt aacttgacca 1500
tctaccctca tcagtggatt aatcttagaa ccaacaattg tgccaccata gtaatgccgt 1560
acataaacag tgtgccaatg gataatatgt ttaggcatta caatttcacc cttatggtga 1620
ttccattcgc acagcttgat tatgcaccca gcgcgtccac tcacgttcca ataaccgtga 1680
cagttgcccc catgtgtgcc gaatacaacg ggctaagatt ggcaggtaaa cagggcttac 1740
caacaatgct cactccaggt agcaaccagt tcctcacgtc tgatgatttc cagtccccat 1800
cagcaatgcc acagtttgat gtaacgccgg agattgaaat ccccggtgac gtgaagaatt 1860
taatggaaat ggctgaagtt gattctgtgg tcccagtgaa taatctggat gataaggtaa 1920
attcaattga agcttataca atccccgtca aatcaatgag tggtattgcg acacaagtcg 1980
ttgggttcca attacaaccc ggggacgata gtgcgtttaa gaggacactg ttaggagaga 2040
ttttgaacta ctttgcaaat tggtcgggaa ttatcaaact gacattccca tactgcggtg 2100
cggcgatgac cactggcaca ttcctgatcg cctactcccc tcctggtgct ggcttccctg 2160
ctaaccgcaa ggactcaatg ttgggcactc acattgtctg ggacatagga ttgcaatcga 2220
gttgtgtgct ctgcgtgcca tggatcagtc agacaaacta ccgcttcgtg acgcatgacg 2280
cttatacaga cgctgggttt attacatgct ggtaccaaac aaacatagtg tcacccccag 2340
acatcccggc agacagtaca atcctatgtt ttgtttcagc ttgtaatgat ttctcggtgc 2400
gcttgttaag ggacacgcca ttcatatcac aaaacgcact tctccaaaat gacccggcta 2460
ctgccattgt tagatcagtg gaacgggtgg ccgataccat agcaagtggc ccaatgaatt 2520
ccgagagagt cccagcattg actgccgtcg agacgggtca cacatctcaa gttgttccca 2580
gtgatactat gcaaaccagg catgttgtta accatcacat tagatcggaa tcttcaatag 2640
agaattttct gagtagatcg gcatgcgttt acattgatgt gtatggcaca aaagagaatg 2700
gtgacatcga acgtttcact aactggaaga tcaacacacg ccaggttgtt cagctgaggc 2760
gcaagctgga gatgttcact tacatcagat ttgatgtgga aataacattc gtaattacaa 2820
gtactcaagg gacatcaacc caaacaagca ctggcacccc agtgctcaca catcaagtga 2880
tgtatgtgcc acccggaggc cccatacccg cgtcatatga ggattatagc tggcaaactt 2940
cgacaaaccc cagcgttttc tggacagaag ggaatgcacc ggctcgcatg tcaataccct 3000
ttatgagtgt gggcaatgcc tattgcaact tttatgatgg ctggtcacat ttctcgcaat 3060
ccggcgtgta tggtttcact accctgaaca acatgggaca gctgtttttc agacatgtga 3120
ataaggacac acttggccct tacaacagca cagtgcgtgt ctatttcaaa ccaaagcaca 3180
tcaaagcatg ggtgcccaga ccaccgcgtc tatgcgatta tgtgtatgca cataatgtcg 3240
atttcacccc cagaggagtc acggacataa gggaaaagat cacactggaa agagacgacc 3300
acacgccttc gatggtaaac cacggtgctt ttggacagca gtctggcgcc atttacgtgg 3360
gtaactacag agtggtaaat aggcacctgg ccacctatgc cgattggcag aattgcgtgt 3420
gggaagatta taatagagac ctcttagtga gcacaaccac agcgcacggg tgtgacacca 3480
tcgctaggtg tcaatgctgc acgggtgtct acttttgtgc ctcaaggaac aagcactacc 3540
cagttagctt tgaagggcca ggcctagtgg aagttcagga gagtgagtat tacccaaaga 3600
gataccagtc ccacgtgctg ttagccgcag ggttttctga accaggagac tgtggtggaa 3660
ttctcaggtg cgagcatggt gttatcggac tagttaccat gggtggcgaa ggcgtagtcg 3720
gctttgctga tgtgcgcgac ctgctgtggt tggaggatga tgcaatggaa caaggggtca 3780
agggttatgt agaacaattg ggcaatgcct tcggttccgg gttcaccaat caaatctgcg 3840
aacaagtcaa cctcctcaaa gaatcactag tgggccaaga ttccatacta gagaagtccc 3900
ttaaagctct tgtgaaaatc atttcagcac tggtaatagt agtgaggaac catgatgact 3960
taattactgt gactgccacc ctcgctctaa ttggctgcac ctcatcgccg tggcggtggc 4020
ttaaacagaa ggtgtcacag tattacggga tacccatggc tgagcgacaa aacaacgggt 4080
ggctcaaaaa gtttacagag atgaccaatg cctgcaaagg gatggagtgg attgccgtca 4140
agatccaaaa gtttatagaa tggctcaaga ttaaaatctt accagaggta aaggagaagc 4200
atgagttcct aaccagactt aaacaactcc cccttctgga aagccaaatt gccaccattg 4260
aacaaagtgc accgtcccag agtgatcagg aacaactctt ctcaaatgtt caatacttcg 4320
cccactactg cagaaagtac gcacctctgt atgctactga ggccaaaaga gtgttctccc 4380
ttgagaagaa aatgagtaac tacatacagt tcaagtccaa atgccgtatt gaaccagtat 4440
gtttgctatt gcacgggagt cctggagctg ggaaatcggt tgccaccaac ttaattgggc 4500
gatctctagc tgagaagttg aacagttcag tgtattctct accaccagac cctgaccact 4560
tcgatggcta taaacaacaa gccgttgtga ttatggacga cctatgccaa aatccagatg 4620
ggaaggatgt gtcattattt tgtcagatgg tgtcgagtgt tgactttgtc ccaccaatgg 4680
ctgccttgga agaaaaagga attttgttta cctctccctt tgtcttggcc tcaactaatg 4740
ctggttccat caatgccccg acggtgtcag acagcagggc tttggctaga agattccact 4800
ttgacatgaa catcgaggtt atatcaatgt acagccagaa tggcaagatt aacatgccca 4860
tgtcagtcaa aacatgcgac gaagagtgct gtccagttaa cttcaaaaag tgttgccccc 4920
ttgtgtgtgg aaaagccata cagtttatag atagaagaac tcaagtgagg tactccttgg 4980
acatgttggt cactgagatg tttagggagt acaaccatag gcacagcgtc ggggcaaccc 5040
ttgaggcact atttcaaggt ccaccagtat acagggagat caaaattact gttgcacctg 5100
ataccccacc accaccagct attgcatacc tactgaaatc attggacagt gaagcagtta 5160
gggagtactg taaagagaat ggatggctcg ttcctgaaat tagctctacc cttcatattg 5220
aaaaacatgt aagccgagcc tttatctgtc tccaggcact gacaactttt gtatccgtgg 5280
ccggtattat ctacatcatt tataaactat ttgcagggtt tcaaggcgcc tacacaggga 5340
tgcccaacca aaagccaaaa atacccacac taaggcaagc caaggtgcag ggacctgctt 5400
gtgagtttgc tgtagccatg atgaagagaa actccatcac agtgaagaca gagtatggtg 5460
agtttacaat gttgggcatc tacgacaggt gggccgtact accacgccat gcaaaacccg 5520
ggccaaccat ccttatgaat gaccaggaag ttggcgtact agatgcaaaa gaactagtgg 5580
ataaagatgg cacaaacctt gaactgacgc tgttgaagct tgaccggaat gaaaagttca 5640
gagacatcag aggtttcctg gccaaggaag aagtggaggt caatgaagct gttctagcaa 5700
taaacaccag caagttcccg aacatgtaca taccagttgg gcaagtaaca gactacggtt 5760
tcctgaacct ggggggcact ccgacgaaaa gaatgctcat gtacaatttt cctaccagag 5820
ctggccaatg tggtggtatt cttatgtcta ctggtaaggt gttggggata cacgttggtg 5880
gaaatggcca ccagggcttc tcagcagctc tccttaaaca ctacttcaat gatgaacaag 5940
gtgagattga atttattgaa agctcaaagg aagcaggttt cccagtcatt aatactccaa 6000
gcaagactaa attggaacca agtgtcttcc accaagtgtt tgaaggcaac aaggaacctg 6060
cagttctcag gaatggtgat ccacgactca aagcaaattt tgaggaggca atcttttcca 6120
aatatattgg taatgtgaac acacacgtag atgagtacat gatggaagcc gtggatcact 6180
acgcaggaca attggccaca ctggacatta atacggaacc tatgaaattg gaggatgcag 6240
tgtatggcac agaggggttg gaggcacttg atctaaccac cagtgcaggg tacccgtatg 6300
tagcactggg catcaagaag agagacatct tgtctaagaa gaccagagat ctgactaaat 6360
taaaggagtg tatggacaaa tatggtctaa accttccgat ggtgacctat gtgaaggatg 6420
agctcagatc agcagaaaaa gtggctaaag gcaagtctag acttattgag gcatccagcc 6480
tgaacgactc tgtagcgatg agacaaactt ttggcaatct gtacagaaca tttcatttga 6540
acccagggat tgtaactggc agtgcagttg ggtgtgatcc tgaccttttc tggagcaaaa 6600
tacctgtaat gctagatgga catctcatag cctttgatta ctctggatat gatgccagtt 6660
tgagccccgt gtggtttgct tgtttgaagc tattgctaga aaaactagga tactcacaca 6720
aagaaacaaa ttacattgac tatttgtgca attcccacca tttgtacaga gacaagcatt 6780
acttcgtgcg tggcggcatg ccatcaggtt gctccggtac cagcatcttc aactcaatga 6840
tcaacaacat cataatcagg acgctaatgt tgaaggtgta caaaggaatt gacctggatc 6900
gattcagaat gattgcctat ggcgatgatg ttattgcgtc ttacccctgg ccaatcgatg 6960
cctctttact tgctgaagcc ggcaaggggt atgggctgat catgacacca gcagataaag 7020
gggagtgttt taatgaagtc acctggacta atgtcacctt tttgaagaga tatttcagag 7080
cagatgagca ataccccttt gtggtccatc ctgttatccc aatgaaagac atccatgaat 7140
caattagatg gacaaaagac ccaaagaaca cccaagacca tgtgcgctct ttgtgcttgt 7200
tggcctggca caatggggag cacgaatatg aggaattcat caagaagatc agaagcgtcc 7260
cagtcgggcg ctgtctaacc cttcctgcgt tttggaccct gcgcaggaaa tggttggatt 7320
ccttttagat tagagacaat tttctgcaat ttgaattggc ttaaccctac cacactcacc 7380
gaactagaca acggtgtggt aggggtaaat tctccgcatt cggtgcgg 7428
<210> 2
<211> 507
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNA sequence of IRES for HRV2
<400> 2
aacuuagaag uuuuucacaa agaccaauag ccgguaauca gccagauuac ugaaggucaa 60
gcacuucugu uuccccgguc aauguugaua ugcuccaaca gggcaaaaac aacugcgauc 120
guuaaccgca aagcgccuac gcaaagcuua guagcaucuu ugaaaucguu uggcuggucg 180
auccgccauu uccccuggua gaccuggcag augaggcuag aaauacccca cuggcgacag 240
uguucuagcc ugcguggcug ccugcacacc cuaugggugu gaagccaaac aauggacaag 300
gugugaagag ccccgugugc ucgcuuugag uccuccggcc ccugaaugug gcuaaccuua 360
acccugcagc uagagcacgu aacccaaugu guaucuaguc guaaugagca auugcgggau 420
gggaccaacu acuuugggug uccguguuuc acuuuuuccu uuauauuugc uuauggugac 480
aauauauaca auauauauau uggcacc 507
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNA sequence of the target sequence for miR-133
<400> 3
acagcugguu gaaggggacc aa 22
<210> 4
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNA sequence of the target sequence for miR-206
<400> 4
ccacacacuu ccuuacauuc ca 22
<210> 5
<211> 102
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNA sequence containing target sequences for miR-133 and miR-206 intandem
<400> 5
acagcugguu gaaggggacc aacgauacag cugguugaag gggaccaaac cgguccacac 60
acuuccuuac auuccaucac ccacacacuu ccuuacauuc ca 102
<210> 6
<211> 435
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA sequence of GM-CSF
<400> 6
atgtggctgc agagcctgct gctcttgggc actgtggcct gcagcatctc tgcacccgcc 60
cgctcgccca gccccagcac gcagccctgg gagcatgtga atgccatcca ggaggcccgg 120
cgtctcctga acctgagtag agacactgct gctgagatga atgaaacagt agaagtcatc 180
tcagaaatgt ttgacctcca ggagccgacc tgcctacaga cccgcctgga gctgtacaag 240
cagggcctgc ggggcagcct caccaagctc aagggcccct tgaccatgat ggccagccac 300
tacaagcagc actgccctcc aaccccggaa acttcctgtg caacccagat tatcaccttt 360
gaaagtttca aagagaacct gaaggacttt ctgcttgtca tcccctttga ctgctgggag 420
ccagtccagg agtga 435
<210> 7
<211> 795
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA sequence of Anti-PD-1 scFv
<400> 7
atgaagcacc tgtggttctt cctgctgctg gtggccgctc ctaggtgggt gctgtcccag 60
gtgcagctgg tgcagagcgg cgtggaggtg aagaagcccg gcgcttccgt gaaggtgtcc 120
tgcaaggcct ccggctacac cttcaccaac tactacatgt actgggtgag gcaggcccct 180
ggacagggac tggagtggat gggcggcatc aacccttcca acggcggcac caacttcaac 240
gagaagttca agaaccgggt gaccctgacc accgactcct ccaccaccac cgcctacatg 300
gagctgaagt ccctgcagtt tgacgacacc gccgtgtact actgcgccag gagggactac 360
cggttcgaca tgggcttcga ctactggggc cagggcacaa ccgtgaccgt gtccagcgga 420
ggtggcggat ctggaggggg tggtagcggt ggaggcggga gtgagatcgt gctgacccag 480
tcccctgcta cactgtccct gtcccccggc gagagggcta cactgagctg cagggcctcc 540
aagggcgtgt ccacctccgg ctactcctac ctgcactggt accagcagaa gcctggacag 600
gctcccaggc tgctgatcta cctggcctcc tacctggagt ccggcgtgcc tgctaggttt 660
tccggcagcg gcagcggcac cgatttcacc ctgaccatct cctccctgga gcccgaggac 720
ttcgccgtgt actactgcca gcactccagg gatctgcctc tgaccttcgg cggcggcacc 780
aaggtggaga tcaag 795
<210> 8
<211> 7309
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA sequence of ECHO25-HRV2
<400> 8
ttaaaacagc ctgtgggttg ttcccaccca tagggcccac tgggcgctag cacactggta 60
ttgtggtacc tttgtgcgcc tgttttatct acccctcccc caaacgtgac ttagaagaac 120
ttagaagttt ttcacaaaga ccaatagccg gtaatcagcc agattactga aggtcaagca 180
cttctgtttc cccggtcaat gttgatatgc tccaacaggg caaaaacaac tgcgatcgtt 240
aaccgcaaag cgcctacgca aagcttagta gcatctttga aatcgtttgg ctggtcgatc 300
cgccatttcc cctggtagac ctggcagatg aggctagaaa taccccactg gcgacagtgt 360
tctagcctgc gtggctgcct gcacacccta tgggtgtgaa gccaaacaat ggacaaggtg 420
tgaagagccc cgtgtgctcg ctttgagtcc tccggcccct gaatgtggct aaccttaacc 480
ctgcagctag agcacgtaac ccaatgtgta tctagtcgta atgagcaatt gcgggatggg 540
accaactact ttgggtgtcc gtgtttcact ttttccttta tatttgctta tggtgacaat 600
atatacaata tatatattgg caccatggga gctcatgtgt caacgcagaa aaccggagcg 660
catgagactg gtttgagcgc cagtgggaat tcggttattc attacacaac atcaattatt 720
acaaggatgc atcttcaaat tcagcaaaca ggcaagactt ttcacaagac cccagcaaat 780
ttaccgaacc ctatgaagga tgtcatgatt aaatcactcc cggcgttaaa ttcacccact 840
gtggaggaat gtggctacag tgaccgggtg cgctccatta ctttgggtaa ttcaacaatc 900
actacgcagg aaagtgcaaa tgtggtagtt ggctatggtg tctggccgga gtatttgagg 960
gatgaggaag ccacggcaca agaccaaccc actcaaccag atgttgccac ctgtagattc 1020
tacaccctag aatctgttat gtgggagaag tcctcggcgg gctggtggtg gaagtttcca 1080
gatgctcttg cagagatggg cctattcggt caaaatatgc tataccatta tttgggaagg 1140
tcaggctaca caatacacgt gcaatgcaat gcgtcaaaat tccaccaagg gtgccttctt 1200
gtagtctgtg tgccagaagc cgagatgggt tctgcacagc ttgataggac attgaatcat 1260
accaaactta gcaacacaga acacgccagc acattcgggt ccatgagttc caatgaagct 1320
ggggccgtcc aaaatgtagt gcacaatgcc gggatgggcg ttggagtggg taacttgacc 1380
atctaccctc atcagtggat taatcttaga accaacaatt gtgccaccat agtaatgccg 1440
tacataaaca gtgtgccaat ggataatatg tttaggcatt acaatttcac ccttatggtg 1500
attccattcg cacagcttga ttatgcaccc agcgcgtcca ctcacgttcc aataaccgtg 1560
acagttgccc ccatgtgtgc cgaatacaac gggctaagat tggcaggtaa acagggctta 1620
ccaacaatgc tcactccagg tagcaaccag ttcctcacgt ctgatgattt ccagtcccca 1680
tcagcaatgc cacagtttga tgtaacgccg gagattgaaa tccccggtga cgtgaagaat 1740
ttaatggaaa tggctgaagt tgattctgtg gtcccagtga ataatctgga tgataaggta 1800
aattcaattg aagcttatac aatccccgtc aaatcaatga gtggtattgc gacacaagtc 1860
gttgggttcc aattacaacc cggggacgat agtgcgttta agaggacact gttaggagag 1920
attttgaact actttgcaaa ttggtcggga attatcaaac tgacattccc atactgcggt 1980
gcggcgatga ccactggcac attcctgatc gcctactccc ctcctggtgc tggcttccct 2040
gctaaccgca aggactcaat gttgggcact cacattgtct gggacatagg attgcaatcg 2100
agttgtgtgc tctgcgtgcc atggatcagt cagacaaact accgcttcgt gacgcatgac 2160
gcttatacag acgctgggtt tattacatgc tggtaccaaa caaacatagt gtcaccccca 2220
gacatcccgg cagacagtac aatcctatgt tttgtttcag cttgtaatga tttctcggtg 2280
cgcttgttaa gggacacgcc attcatatca caaaacgcac ttctccaaaa tgacccggct 2340
actgccattg ttagatcagt ggaacgggtg gccgatacca tagcaagtgg cccaatgaat 2400
tccgagagag tcccagcatt gactgccgtc gagacgggtc acacatctca agttgttccc 2460
agtgatacta tgcaaaccag gcatgttgtt aaccatcaca ttagatcgga atcttcaata 2520
gagaattttc tgagtagatc ggcatgcgtt tacattgatg tgtatggcac aaaagagaat 2580
ggtgacatcg aacgtttcac taactggaag atcaacacac gccaggttgt tcagctgagg 2640
cgcaagctgg agatgttcac ttacatcaga tttgatgtgg aaataacatt cgtaattaca 2700
agtactcaag ggacatcaac ccaaacaagc actggcaccc cagtgctcac acatcaagtg 2760
atgtatgtgc cacccggagg ccccataccc gcgtcatatg aggattatag ctggcaaact 2820
tcgacaaacc ccagcgtttt ctggacagaa gggaatgcac cggctcgcat gtcaataccc 2880
tttatgagtg tgggcaatgc ctattgcaac ttttatgatg gctggtcaca tttctcgcaa 2940
tccggcgtgt atggtttcac taccctgaac aacatgggac agctgttttt cagacatgtg 3000
aataaggaca cacttggccc ttacaacagc acagtgcgtg tctatttcaa accaaagcac 3060
atcaaagcat gggtgcccag accaccgcgt ctatgcgatt atgtgtatgc acataatgtc 3120
gatttcaccc ccagaggagt cacggacata agggaaaaga tcacactgga aagagacgac 3180
cacacgcctt cgatggtaaa ccacggtgct tttggacagc agtctggcgc catttacgtg 3240
ggtaactaca gagtggtaaa taggcacctg gccacctatg ccgattggca gaattgcgtg 3300
tgggaagatt ataatagaga cctcttagtg agcacaacca cagcgcacgg gtgtgacacc 3360
atcgctaggt gtcaatgctg cacgggtgtc tacttttgtg cctcaaggaa caagcactac 3420
ccagttagct ttgaagggcc aggcctagtg gaagttcagg agagtgagta ttacccaaag 3480
agataccagt cccacgtgct gttagccgca gggttttctg aaccaggaga ctgtggtgga 3540
attctcaggt gcgagcatgg tgttatcgga ctagttacca tgggtggcga aggcgtagtc 3600
ggctttgctg atgtgcgcga cctgctgtgg ttggaggatg atgcaatgga acaaggggtc 3660
aagggttatg tagaacaatt gggcaatgcc ttcggttccg ggttcaccaa tcaaatctgc 3720
gaacaagtca acctcctcaa agaatcacta gtgggccaag attccatact agagaagtcc 3780
cttaaagctc ttgtgaaaat catttcagca ctggtaatag tagtgaggaa ccatgatgac 3840
ttaattactg tgactgccac cctcgctcta attggctgca cctcatcgcc gtggcggtgg 3900
cttaaacaga aggtgtcaca gtattacggg atacccatgg ctgagcgaca aaacaacggg 3960
tggctcaaaa agtttacaga gatgaccaat gcctgcaaag ggatggagtg gattgccgtc 4020
aagatccaaa agtttataga atggctcaag attaaaatct taccagaggt aaaggagaag 4080
catgagttcc taaccagact taaacaactc ccccttctgg aaagccaaat tgccaccatt 4140
gaacaaagtg caccgtccca gagtgatcag gaacaactct tctcaaatgt tcaatacttc 4200
gcccactact gcagaaagta cgcacctctg tatgctactg aggccaaaag agtgttctcc 4260
cttgagaaga aaatgagtaa ctacatacag ttcaagtcca aatgccgtat tgaaccagta 4320
tgtttgctat tgcacgggag tcctggagct gggaaatcgg ttgccaccaa cttaattggg 4380
cgatctctag ctgagaagtt gaacagttca gtgtattctc taccaccaga ccctgaccac 4440
ttcgatggct ataaacaaca agccgttgtg attatggacg acctatgcca aaatccagat 4500
gggaaggatg tgtcattatt ttgtcagatg gtgtcgagtg ttgactttgt cccaccaatg 4560
gctgccttgg aagaaaaagg aattttgttt acctctccct ttgtcttggc ctcaactaat 4620
gctggttcca tcaatgcccc gacggtgtca gacagcaggg ctttggctag aagattccac 4680
tttgacatga acatcgaggt tatatcaatg tacagccaga atggcaagat taacatgccc 4740
atgtcagtca aaacatgcga cgaagagtgc tgtccagtta acttcaaaaa gtgttgcccc 4800
cttgtgtgtg gaaaagccat acagtttata gatagaagaa ctcaagtgag gtactccttg 4860
gacatgttgg tcactgagat gtttagggag tacaaccata ggcacagcgt cggggcaacc 4920
cttgaggcac tatttcaagg tccaccagta tacagggaga tcaaaattac tgttgcacct 4980
gataccccac caccaccagc tattgcatac ctactgaaat cattggacag tgaagcagtt 5040
agggagtact gtaaagagaa tggatggctc gttcctgaaa ttagctctac ccttcatatt 5100
gaaaaacatg taagccgagc ctttatctgt ctccaggcac tgacaacttt tgtatccgtg 5160
gccggtatta tctacatcat ttataaacta tttgcagggt ttcaaggcgc ctacacaggg 5220
atgcccaacc aaaagccaaa aatacccaca ctaaggcaag ccaaggtgca gggacctgct 5280
tgtgagtttg ctgtagccat gatgaagaga aactccatca cagtgaagac agagtatggt 5340
gagtttacaa tgttgggcat ctacgacagg tgggccgtac taccacgcca tgcaaaaccc 5400
gggccaacca tccttatgaa tgaccaggaa gttggcgtac tagatgcaaa agaactagtg 5460
gataaagatg gcacaaacct tgaactgacg ctgttgaagc ttgaccggaa tgaaaagttc 5520
agagacatca gaggtttcct ggccaaggaa gaagtggagg tcaatgaagc tgttctagca 5580
ataaacacca gcaagttccc gaacatgtac ataccagttg ggcaagtaac agactacggt 5640
ttcctgaacc tggggggcac tccgacgaaa agaatgctca tgtacaattt tcctaccaga 5700
gctggccaat gtggtggtat tcttatgtct actggtaagg tgttggggat acacgttggt 5760
ggaaatggcc accagggctt ctcagcagct ctccttaaac actacttcaa tgatgaacaa 5820
ggtgagattg aatttattga aagctcaaag gaagcaggtt tcccagtcat taatactcca 5880
agcaagacta aattggaacc aagtgtcttc caccaagtgt ttgaaggcaa caaggaacct 5940
gcagttctca ggaatggtga tccacgactc aaagcaaatt ttgaggaggc aatcttttcc 6000
aaatatattg gtaatgtgaa cacacacgta gatgagtaca tgatggaagc cgtggatcac 6060
tacgcaggac aattggccac actggacatt aatacggaac ctatgaaatt ggaggatgca 6120
gtgtatggca cagaggggtt ggaggcactt gatctaacca ccagtgcagg gtacccgtat 6180
gtagcactgg gcatcaagaa gagagacatc ttgtctaaga agaccagaga tctgactaaa 6240
ttaaaggagt gtatggacaa atatggtcta aaccttccga tggtgaccta tgtgaaggat 6300
gagctcagat cagcagaaaa agtggctaaa ggcaagtcta gacttattga ggcatccagc 6360
ctgaacgact ctgtagcgat gagacaaact tttggcaatc tgtacagaac atttcatttg 6420
aacccaggga ttgtaactgg cagtgcagtt gggtgtgatc ctgacctttt ctggagcaaa 6480
atacctgtaa tgctagatgg acatctcata gcctttgatt actctggata tgatgccagt 6540
ttgagccccg tgtggtttgc ttgtttgaag ctattgctag aaaaactagg atactcacac 6600
aaagaaacaa attacattga ctatttgtgc aattcccacc atttgtacag agacaagcat 6660
tacttcgtgc gtggcggcat gccatcaggt tgctccggta ccagcatctt caactcaatg 6720
atcaacaaca tcataatcag gacgctaatg ttgaaggtgt acaaaggaat tgacctggat 6780
cgattcagaa tgattgccta tggcgatgat gttattgcgt cttacccctg gccaatcgat 6840
gcctctttac ttgctgaagc cggcaagggg tatgggctga tcatgacacc agcagataaa 6900
ggggagtgtt ttaatgaagt cacctggact aatgtcacct ttttgaagag atatttcaga 6960
gcagatgagc aatacccctt tgtggtccat cctgttatcc caatgaaaga catccatgaa 7020
tcaattagat ggacaaaaga cccaaagaac acccaagacc atgtgcgctc tttgtgcttg 7080
ttggcctggc acaatgggga gcacgaatat gaggaattca tcaagaagat cagaagcgtc 7140
ccagtcgggc gctgtctaac ccttcctgcg ttttggaccc tgcgcaggaa atggttggat 7200
tccttttaga ttagagacaa ttttctgcaa tttgaattgg cttaacccta ccacactcac 7260
cgaactagac aacggtgtgg taggggtaaa ttctccgcat tcggtgcgg 7309
<210> 9
<211> 7530
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA sequence of ECHO25-miR133&206T
<400> 9
ttaaaacagc ctgtgggttg ttcccaccca tagggcccac tgggcgctag cacactggta 60
ttgtggtacc tttgtgcgcc tgttttatct acccctcccc caaacgtgac ttagaagctc 120
aacacatgtg gtcagcaggt ggcccagtat accaactggg tcttgatcaa gcacttctgt 180
taccccggac cgagtatcaa taggctgctc acgcggctga aggagaaagt gttcgttatc 240
cggccaatta ctacgagaaa cctagtacca ccatggaagt tgcgcggcgt ttcgctccgc 300
acaaccccag tgtagatcag gccgatgagt caccgcactc ctcacgggcg accgtggcgg 360
tggctgcgct ggcggcctgc ccatggggca acccatggga cgcttcaata ccgacatggt 420
gtgaagagtc tattgtgcta attggtaatc ctccggcccc tgaatgcggc taatcccaac 480
tgcggagcag atacccacat gccagtgggc agtctgtcgt aacgggtaac tctgcagcgg 540
aaccgactac tttgggtgtc cgtgtttctt tttattcttt attggctgct tatggtgaca 600
attgagagat tgttgccata tagctattgg attggccatc cggtgacaaa cagaacaata 660
gtttatctat ttgttggttt cataccatta aattttaaag tattaaagac tatcaacttg 720
atcatactac ttaatacagc aaaatgggag ctcatgtgtc aacgcagaaa accggagcgc 780
atgagactgg tttgagcgcc agtgggaatt cggttattca ttacacaaca tcaattatta 840
caaggatgca tcttcaaatt cagcaaacag gcaagacttt tcacaagacc ccagcaaatt 900
taccgaaccc tatgaaggat gtcatgatta aatcactccc ggcgttaaat tcacccactg 960
tggaggaatg tggctacagt gaccgggtgc gctccattac tttgggtaat tcaacaatca 1020
ctacgcagga aagtgcaaat gtggtagttg gctatggtgt ctggccggag tatttgaggg 1080
atgaggaagc cacggcacaa gaccaaccca ctcaaccaga tgttgccacc tgtagattct 1140
acaccctaga atctgttatg tgggagaagt cctcggcggg ctggtggtgg aagtttccag 1200
atgctcttgc agagatgggc ctattcggtc aaaatatgct ataccattat ttgggaaggt 1260
caggctacac aatacacgtg caatgcaatg cgtcaaaatt ccaccaaggg tgccttcttg 1320
tagtctgtgt gccagaagcc gagatgggtt ctgcacagct tgataggaca ttgaatcata 1380
ccaaacttag caacacagaa cacgccagca cattcgggtc catgagttcc aatgaagctg 1440
gggccgtcca aaatgtagtg cacaatgccg ggatgggcgt tggagtgggt aacttgacca 1500
tctaccctca tcagtggatt aatcttagaa ccaacaattg tgccaccata gtaatgccgt 1560
acataaacag tgtgccaatg gataatatgt ttaggcatta caatttcacc cttatggtga 1620
ttccattcgc acagcttgat tatgcaccca gcgcgtccac tcacgttcca ataaccgtga 1680
cagttgcccc catgtgtgcc gaatacaacg ggctaagatt ggcaggtaaa cagggcttac 1740
caacaatgct cactccaggt agcaaccagt tcctcacgtc tgatgatttc cagtccccat 1800
cagcaatgcc acagtttgat gtaacgccgg agattgaaat ccccggtgac gtgaagaatt 1860
taatggaaat ggctgaagtt gattctgtgg tcccagtgaa taatctggat gataaggtaa 1920
attcaattga agcttataca atccccgtca aatcaatgag tggtattgcg acacaagtcg 1980
ttgggttcca attacaaccc ggggacgata gtgcgtttaa gaggacactg ttaggagaga 2040
ttttgaacta ctttgcaaat tggtcgggaa ttatcaaact gacattccca tactgcggtg 2100
cggcgatgac cactggcaca ttcctgatcg cctactcccc tcctggtgct ggcttccctg 2160
ctaaccgcaa ggactcaatg ttgggcactc acattgtctg ggacatagga ttgcaatcga 2220
gttgtgtgct ctgcgtgcca tggatcagtc agacaaacta ccgcttcgtg acgcatgacg 2280
cttatacaga cgctgggttt attacatgct ggtaccaaac aaacatagtg tcacccccag 2340
acatcccggc agacagtaca atcctatgtt ttgtttcagc ttgtaatgat ttctcggtgc 2400
gcttgttaag ggacacgcca ttcatatcac aaaacgcact tctccaaaat gacccggcta 2460
ctgccattgt tagatcagtg gaacgggtgg ccgataccat agcaagtggc ccaatgaatt 2520
ccgagagagt cccagcattg actgccgtcg agacgggtca cacatctcaa gttgttccca 2580
gtgatactat gcaaaccagg catgttgtta accatcacat tagatcggaa tcttcaatag 2640
agaattttct gagtagatcg gcatgcgttt acattgatgt gtatggcaca aaagagaatg 2700
gtgacatcga acgtttcact aactggaaga tcaacacacg ccaggttgtt cagctgaggc 2760
gcaagctgga gatgttcact tacatcagat ttgatgtgga aataacattc gtaattacaa 2820
gtactcaagg gacatcaacc caaacaagca ctggcacccc agtgctcaca catcaagtga 2880
tgtatgtgcc acccggaggc cccatacccg cgtcatatga ggattatagc tggcaaactt 2940
cgacaaaccc cagcgttttc tggacagaag ggaatgcacc ggctcgcatg tcaataccct 3000
ttatgagtgt gggcaatgcc tattgcaact tttatgatgg ctggtcacat ttctcgcaat 3060
ccggcgtgta tggtttcact accctgaaca acatgggaca gctgtttttc agacatgtga 3120
ataaggacac acttggccct tacaacagca cagtgcgtgt ctatttcaaa ccaaagcaca 3180
tcaaagcatg ggtgcccaga ccaccgcgtc tatgcgatta tgtgtatgca cataatgtcg 3240
atttcacccc cagaggagtc acggacataa gggaaaagat cacactggaa agagacgacc 3300
acacgccttc gatggtaaac cacggtgctt ttggacagca gtctggcgcc atttacgtgg 3360
gtaactacag agtggtaaat aggcacctgg ccacctatgc cgattggcag aattgcgtgt 3420
gggaagatta taatagagac ctcttagtga gcacaaccac agcgcacggg tgtgacacca 3480
tcgctaggtg tcaatgctgc acgggtgtct acttttgtgc ctcaaggaac aagcactacc 3540
cagttagctt tgaagggcca ggcctagtgg aagttcagga gagtgagtat tacccaaaga 3600
gataccagtc ccacgtgctg ttagccgcag ggttttctga accaggagac tgtggtggaa 3660
ttctcaggtg cgagcatggt gttatcggac tagttaccat gggtggcgaa ggcgtagtcg 3720
gctttgctga tgtgcgcgac ctgctgtggt tggaggatga tgcaatggaa caaggggtca 3780
agggttatgt agaacaattg ggcaatgcct tcggttccgg gttcaccaat caaatctgcg 3840
aacaagtcaa cctcctcaaa gaatcactag tgggccaaga ttccatacta gagaagtccc 3900
ttaaagctct tgtgaaaatc atttcagcac tggtaatagt agtgaggaac catgatgact 3960
taattactgt gactgccacc ctcgctctaa ttggctgcac ctcatcgccg tggcggtggc 4020
ttaaacagaa ggtgtcacag tattacggga tacccatggc tgagcgacaa aacaacgggt 4080
ggctcaaaaa gtttacagag atgaccaatg cctgcaaagg gatggagtgg attgccgtca 4140
agatccaaaa gtttatagaa tggctcaaga ttaaaatctt accagaggta aaggagaagc 4200
atgagttcct aaccagactt aaacaactcc cccttctgga aagccaaatt gccaccattg 4260
aacaaagtgc accgtcccag agtgatcagg aacaactctt ctcaaatgtt caatacttcg 4320
cccactactg cagaaagtac gcacctctgt atgctactga ggccaaaaga gtgttctccc 4380
ttgagaagaa aatgagtaac tacatacagt tcaagtccaa atgccgtatt gaaccagtat 4440
gtttgctatt gcacgggagt cctggagctg ggaaatcggt tgccaccaac ttaattgggc 4500
gatctctagc tgagaagttg aacagttcag tgtattctct accaccagac cctgaccact 4560
tcgatggcta taaacaacaa gccgttgtga ttatggacga cctatgccaa aatccagatg 4620
ggaaggatgt gtcattattt tgtcagatgg tgtcgagtgt tgactttgtc ccaccaatgg 4680
ctgccttgga agaaaaagga attttgttta cctctccctt tgtcttggcc tcaactaatg 4740
ctggttccat caatgccccg acggtgtcag acagcagggc tttggctaga agattccact 4800
ttgacatgaa catcgaggtt atatcaatgt acagccagaa tggcaagatt aacatgccca 4860
tgtcagtcaa aacatgcgac gaagagtgct gtccagttaa cttcaaaaag tgttgccccc 4920
ttgtgtgtgg aaaagccata cagtttatag atagaagaac tcaagtgagg tactccttgg 4980
acatgttggt cactgagatg tttagggagt acaaccatag gcacagcgtc ggggcaaccc 5040
ttgaggcact atttcaaggt ccaccagtat acagggagat caaaattact gttgcacctg 5100
ataccccacc accaccagct attgcatacc tactgaaatc attggacagt gaagcagtta 5160
gggagtactg taaagagaat ggatggctcg ttcctgaaat tagctctacc cttcatattg 5220
aaaaacatgt aagccgagcc tttatctgtc tccaggcact gacaactttt gtatccgtgg 5280
ccggtattat ctacatcatt tataaactat ttgcagggtt tcaaggcgcc tacacaggga 5340
tgcccaacca aaagccaaaa atacccacac taaggcaagc caaggtgcag ggacctgctt 5400
gtgagtttgc tgtagccatg atgaagagaa actccatcac agtgaagaca gagtatggtg 5460
agtttacaat gttgggcatc tacgacaggt gggccgtact accacgccat gcaaaacccg 5520
ggccaaccat ccttatgaat gaccaggaag ttggcgtact agatgcaaaa gaactagtgg 5580
ataaagatgg cacaaacctt gaactgacgc tgttgaagct tgaccggaat gaaaagttca 5640
gagacatcag aggtttcctg gccaaggaag aagtggaggt caatgaagct gttctagcaa 5700
taaacaccag caagttcccg aacatgtaca taccagttgg gcaagtaaca gactacggtt 5760
tcctgaacct ggggggcact ccgacgaaaa gaatgctcat gtacaatttt cctaccagag 5820
ctggccaatg tggtggtatt cttatgtcta ctggtaaggt gttggggata cacgttggtg 5880
gaaatggcca ccagggcttc tcagcagctc tccttaaaca ctacttcaat gatgaacaag 5940
gtgagattga atttattgaa agctcaaagg aagcaggttt cccagtcatt aatactccaa 6000
gcaagactaa attggaacca agtgtcttcc accaagtgtt tgaaggcaac aaggaacctg 6060
cagttctcag gaatggtgat ccacgactca aagcaaattt tgaggaggca atcttttcca 6120
aatatattgg taatgtgaac acacacgtag atgagtacat gatggaagcc gtggatcact 6180
acgcaggaca attggccaca ctggacatta atacggaacc tatgaaattg gaggatgcag 6240
tgtatggcac agaggggttg gaggcacttg atctaaccac cagtgcaggg tacccgtatg 6300
tagcactggg catcaagaag agagacatct tgtctaagaa gaccagagat ctgactaaat 6360
taaaggagtg tatggacaaa tatggtctaa accttccgat ggtgacctat gtgaaggatg 6420
agctcagatc agcagaaaaa gtggctaaag gcaagtctag acttattgag gcatccagcc 6480
tgaacgactc tgtagcgatg agacaaactt ttggcaatct gtacagaaca tttcatttga 6540
acccagggat tgtaactggc agtgcagttg ggtgtgatcc tgaccttttc tggagcaaaa 6600
tacctgtaat gctagatgga catctcatag cctttgatta ctctggatat gatgccagtt 6660
tgagccccgt gtggtttgct tgtttgaagc tattgctaga aaaactagga tactcacaca 6720
aagaaacaaa ttacattgac tatttgtgca attcccacca tttgtacaga gacaagcatt 6780
acttcgtgcg tggcggcatg ccatcaggtt gctccggtac cagcatcttc aactcaatga 6840
tcaacaacat cataatcagg acgctaatgt tgaaggtgta caaaggaatt gacctggatc 6900
gattcagaat gattgcctat ggcgatgatg ttattgcgtc ttacccctgg ccaatcgatg 6960
cctctttact tgctgaagcc ggcaaggggt atgggctgat catgacacca gcagataaag 7020
gggagtgttt taatgaagtc acctggacta atgtcacctt tttgaagaga tatttcagag 7080
cagatgagca ataccccttt gtggtccatc ctgttatccc aatgaaagac atccatgaat 7140
caattagatg gacaaaagac ccaaagaaca cccaagacca tgtgcgctct ttgtgcttgt 7200
tggcctggca caatggggag cacgaatatg aggaattcat caagaagatc agaagcgtcc 7260
cagtcgggcg ctgtctaacc cttcctgcgt tttggaccct gcgcaggaaa tggttggatt 7320
ccttttagat tagagacaca gctggttgaa ggggaccaac gatacagctg gttgaagggg 7380
accaaaccgg tccacacact tccttacatt ccatcaccca cacacttcct tacattccaa 7440
attttctgca atttgaattg gcttaaccct accacactca ccgaactaga caacggtgtg 7500
gtaggggtaa attctccgca ttcggtgcgg 7530
<210> 10
<211> 7905
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA sequence of ECHO25-GM-CSF
<400> 10
ttaaaacagc ctgtgggttg ttcccaccca tagggcccac tgggcgctag cacactggta 60
ttgtggtacc tttgtgcgcc tgttttatct acccctcccc caaacgtgac ttagaagctc 120
aacacatgtg gtcagcaggt ggcccagtat accaactggg tcttgatcaa gcacttctgt 180
taccccggac cgagtatcaa taggctgctc acgcggctga aggagaaagt gttcgttatc 240
cggccaatta ctacgagaaa cctagtacca ccatggaagt tgcgcggcgt ttcgctccgc 300
acaaccccag tgtagatcag gccgatgagt caccgcactc ctcacgggcg accgtggcgg 360
tggctgcgct ggcggcctgc ccatggggca acccatggga cgcttcaata ccgacatggt 420
gtgaagagtc tattgtgcta attggtaatc ctccggcccc tgaatgcggc taatcccaac 480
tgcggagcag atacccacat gccagtgggc agtctgtcgt aacgggtaac tctgcagcgg 540
aaccgactac tttgggtgtc cgtgtttctt tttattcttt attggctgct tatggtgaca 600
attgagagat tgttgccata tagctattgg attggccatc cggtgacaaa cagaacaata 660
gtttatctat ttgttggttt cataccatta aattttaaag tattaaagac tatcaacttg 720
atcatactac ttaatacagc aaaatgggag ctcatgtgtc aacgcagaaa accggagcgc 780
atgagactgg tttgagcgcc agtgggaatt cggttattca ttacacaaca tcaattatta 840
caaggatgca tcttcaaatt cagcaaacag gcaagacttt tcacaagacc ccagcaaatt 900
taccgaaccc tatgaaggat gtcatgatta aatcactccc ggcgttaaat tcacccactg 960
tggaggaatg tggctacagt gaccgggtgc gctccattac tttgggtaat tcaacaatca 1020
ctacgcagga aagtgcaaat gtggtagttg gctatggtgt ctggccggag tatttgaggg 1080
atgaggaagc cacggcacaa gaccaaccca ctcaaccaga tgttgccacc tgtagattct 1140
acaccctaga atctgttatg tgggagaagt cctcggcggg ctggtggtgg aagtttccag 1200
atgctcttgc agagatgggc ctattcggtc aaaatatgct ataccattat ttgggaaggt 1260
caggctacac aatacacgtg caatgcaatg cgtcaaaatt ccaccaaggg tgccttcttg 1320
tagtctgtgt gccagaagcc gagatgggtt ctgcacagct tgataggaca ttgaatcata 1380
ccaaacttag caacacagaa cacgccagca cattcgggtc catgagttcc aatgaagctg 1440
gggccgtcca aaatgtagtg cacaatgccg ggatgggcgt tggagtgggt aacttgacca 1500
tctaccctca tcagtggatt aatcttagaa ccaacaattg tgccaccata gtaatgccgt 1560
acataaacag tgtgccaatg gataatatgt ttaggcatta caatttcacc cttatggtga 1620
ttccattcgc acagcttgat tatgcaccca gcgcgtccac tcacgttcca ataaccgtga 1680
cagttgcccc catgtgtgcc gaatacaacg ggctaagatt ggcaggtaaa cagggcttac 1740
caacaatgct cactccaggt agcaaccagt tcctcacgtc tgatgatttc cagtccccat 1800
cagcaatgcc acagtttgat gtaacgccgg agattgaaat ccccggtgac gtgaagaatt 1860
taatggaaat ggctgaagtt gattctgtgg tcccagtgaa taatctggat gataaggtaa 1920
attcaattga agcttataca atccccgtca aatcaatgag tggtattgcg acacaagtcg 1980
ttgggttcca attacaaccc ggggacgata gtgcgtttaa gaggacactg ttaggagaga 2040
ttttgaacta ctttgcaaat tggtcgggaa ttatcaaact gacattccca tactgcggtg 2100
cggcgatgac cactggcaca ttcctgatcg cctactcccc tcctggtgct ggcttccctg 2160
ctaaccgcaa ggactcaatg ttgggcactc acattgtctg ggacatagga ttgcaatcga 2220
gttgtgtgct ctgcgtgcca tggatcagtc agacaaacta ccgcttcgtg acgcatgacg 2280
cttatacaga cgctgggttt attacatgct ggtaccaaac aaacatagtg tcacccccag 2340
acatcccggc agacagtaca atcctatgtt ttgtttcagc ttgtaatgat ttctcggtgc 2400
gcttgttaag ggacacgcca ttcatatcac aaaacgcact tctccaaaat gacccggcta 2460
ctgccattgt tagatcagtg gaacgggtgg ccgataccat agcaagtggc ccaatgaatt 2520
ccgagagagt cccagcattg actgccgtcg agacgggtca cacatctcaa gttgttccca 2580
gtgatactat gcaaaccagg catgttgtta accatcacat tagatcggaa tcttcaatag 2640
agaattttct gagtagatcg gcatgcgttt acattgatgt gtatggcaca aaagagaatg 2700
gtgacatcga acgtttcact aactggaaga tcaacacacg ccaggttgtt cagctgaggc 2760
gcaagctgga gatgttcact tacatcagat ttgatgtgga aataacattc gtaattacaa 2820
gtactcaagg gacatcaacc caaacaagca ctggcacccc agtgctcaca catcaagtga 2880
tgtatgtgcc acccggaggc cccatacccg cgtcatatga ggattatagc tggcaaactt 2940
cgacaaaccc cagcgttttc tggacagaag ggaatgcacc ggctcgcatg tcaataccct 3000
ttatgagtgt gggcaatgcc tattgcaact tttatgatgg ctggtcacat ttctcgcaat 3060
ccggcgtgta tggtttcact accctgaaca acatgggaca gctgtttttc agacatgtga 3120
ataaggacac acttggccct tacaacagca cagtgcgtgt ctatttcaaa ccaaagcaca 3180
tcaaagcatg ggtgcccaga ccaccgcgtc tatgcgatta tgtgtatgca cataatgtcg 3240
atttcacccc cagaggagtc acggacataa gggaaaagat cacactggaa agagacgacc 3300
acacgccttc gatggtaaac cacggtgctt ttggacagca gtggctgcag agcctgctgc 3360
tcttgggcac tgtggcctgc agcatctctg cacccgcccg ctcgcccagc cccagcacgc 3420
agccctggga gcatgtgaat gccatccagg aggcccggcg tctcctgaac ctgagtagag 3480
acactgctgc tgagatgaat gaaacagtag aagtcatctc agaaatgttt gacctccagg 3540
agccgacctg cctacagacc cgcctggagc tgtacaagca gggcctgcgg ggcagcctca 3600
ccaagctcaa gggccccttg accatgatgg ccagccacta caagcagcac tgccctccaa 3660
ccccggaaac ttcctgtgca acccagatta tcacctttga aagtttcaaa gagaacctga 3720
aggactttct gcttgtcatc ccctttgact gctgggagcc agtccaggag gacgaccaca 3780
cgccttcgat ggtaaaccac ggtgcttttg gacagcagtc tggcgccatt tacgtgggta 3840
actacagagt ggtaaatagg cacctggcca cctatgccga ttggcagaat tgcgtgtggg 3900
aagattataa tagagacctc ttagtgagca caaccacagc gcacgggtgt gacaccatcg 3960
ctaggtgtca atgctgcacg ggtgtctact tttgtgcctc aaggaacaag cactacccag 4020
ttagctttga agggccaggc ctagtggaag ttcaggagag tgagtattac ccaaagagat 4080
accagtccca cgtgctgtta gccgcagggt tttctgaacc aggagactgt ggtggaattc 4140
tcaggtgcga gcatggtgtt atcggactag ttaccatggg tggcgaaggc gtagtcggct 4200
ttgctgatgt gcgcgacctg ctgtggttgg aggatgatgc aatggaacaa ggggtcaagg 4260
gttatgtaga acaattgggc aatgccttcg gttccgggtt caccaatcaa atctgcgaac 4320
aagtcaacct cctcaaagaa tcactagtgg gccaagattc catactagag aagtccctta 4380
aagctcttgt gaaaatcatt tcagcactgg taatagtagt gaggaaccat gatgacttaa 4440
ttactgtgac tgccaccctc gctctaattg gctgcacctc atcgccgtgg cggtggctta 4500
aacagaaggt gtcacagtat tacgggatac ccatggctga gcgacaaaac aacgggtggc 4560
tcaaaaagtt tacagagatg accaatgcct gcaaagggat ggagtggatt gccgtcaaga 4620
tccaaaagtt tatagaatgg ctcaagatta aaatcttacc agaggtaaag gagaagcatg 4680
agttcctaac cagacttaaa caactccccc ttctggaaag ccaaattgcc accattgaac 4740
aaagtgcacc gtcccagagt gatcaggaac aactcttctc aaatgttcaa tacttcgccc 4800
actactgcag aaagtacgca cctctgtatg ctactgaggc caaaagagtg ttctcccttg 4860
agaagaaaat gagtaactac atacagttca agtccaaatg ccgtattgaa ccagtatgtt 4920
tgctattgca cgggagtcct ggagctggga aatcggttgc caccaactta attgggcgat 4980
ctctagctga gaagttgaac agttcagtgt attctctacc accagaccct gaccacttcg 5040
atggctataa acaacaagcc gttgtgatta tggacgacct atgccaaaat ccagatggga 5100
aggatgtgtc attattttgt cagatggtgt cgagtgttga ctttgtccca ccaatggctg 5160
ccttggaaga aaaaggaatt ttgtttacct ctccctttgt cttggcctca actaatgctg 5220
gttccatcaa tgccccgacg gtgtcagaca gcagggcttt ggctagaaga ttccactttg 5280
acatgaacat cgaggttata tcaatgtaca gccagaatgg caagattaac atgcccatgt 5340
cagtcaaaac atgcgacgaa gagtgctgtc cagttaactt caaaaagtgt tgcccccttg 5400
tgtgtggaaa agccatacag tttatagata gaagaactca agtgaggtac tccttggaca 5460
tgttggtcac tgagatgttt agggagtaca accataggca cagcgtcggg gcaacccttg 5520
aggcactatt tcaaggtcca ccagtataca gggagatcaa aattactgtt gcacctgata 5580
ccccaccacc accagctatt gcatacctac tgaaatcatt ggacagtgaa gcagttaggg 5640
agtactgtaa agagaatgga tggctcgttc ctgaaattag ctctaccctt catattgaaa 5700
aacatgtaag ccgagccttt atctgtctcc aggcactgac aacttttgta tccgtggccg 5760
gtattatcta catcatttat aaactatttg cagggtttca aggcgcctac acagggatgc 5820
ccaaccaaaa gccaaaaata cccacactaa ggcaagccaa ggtgcaggga cctgcttgtg 5880
agtttgctgt agccatgatg aagagaaact ccatcacagt gaagacagag tatggtgagt 5940
ttacaatgtt gggcatctac gacaggtggg ccgtactacc acgccatgca aaacccgggc 6000
caaccatcct tatgaatgac caggaagttg gcgtactaga tgcaaaagaa ctagtggata 6060
aagatggcac aaaccttgaa ctgacgctgt tgaagcttga ccggaatgaa aagttcagag 6120
acatcagagg tttcctggcc aaggaagaag tggaggtcaa tgaagctgtt ctagcaataa 6180
acaccagcaa gttcccgaac atgtacatac cagttgggca agtaacagac tacggtttcc 6240
tgaacctggg gggcactccg acgaaaagaa tgctcatgta caattttcct accagagctg 6300
gccaatgtgg tggtattctt atgtctactg gtaaggtgtt ggggatacac gttggtggaa 6360
atggccacca gggcttctca gcagctctcc ttaaacacta cttcaatgat gaacaaggtg 6420
agattgaatt tattgaaagc tcaaaggaag caggtttccc agtcattaat actccaagca 6480
agactaaatt ggaaccaagt gtcttccacc aagtgtttga aggcaacaag gaacctgcag 6540
ttctcaggaa tggtgatcca cgactcaaag caaattttga ggaggcaatc ttttccaaat 6600
atattggtaa tgtgaacaca cacgtagatg agtacatgat ggaagccgtg gatcactacg 6660
caggacaatt ggccacactg gacattaata cggaacctat gaaattggag gatgcagtgt 6720
atggcacaga ggggttggag gcacttgatc taaccaccag tgcagggtac ccgtatgtag 6780
cactgggcat caagaagaga gacatcttgt ctaagaagac cagagatctg actaaattaa 6840
aggagtgtat ggacaaatat ggtctaaacc ttccgatggt gacctatgtg aaggatgagc 6900
tcagatcagc agaaaaagtg gctaaaggca agtctagact tattgaggca tccagcctga 6960
acgactctgt agcgatgaga caaacttttg gcaatctgta cagaacattt catttgaacc 7020
cagggattgt aactggcagt gcagttgggt gtgatcctga ccttttctgg agcaaaatac 7080
ctgtaatgct agatggacat ctcatagcct ttgattactc tggatatgat gccagtttga 7140
gccccgtgtg gtttgcttgt ttgaagctat tgctagaaaa actaggatac tcacacaaag 7200
aaacaaatta cattgactat ttgtgcaatt cccaccattt gtacagagac aagcattact 7260
tcgtgcgtgg cggcatgcca tcaggttgct ccggtaccag catcttcaac tcaatgatca 7320
acaacatcat aatcaggacg ctaatgttga aggtgtacaa aggaattgac ctggatcgat 7380
tcagaatgat tgcctatggc gatgatgtta ttgcgtctta cccctggcca atcgatgcct 7440
ctttacttgc tgaagccggc aaggggtatg ggctgatcat gacaccagca gataaagggg 7500
agtgttttaa tgaagtcacc tggactaatg tcaccttttt gaagagatat ttcagagcag 7560
atgagcaata cccctttgtg gtccatcctg ttatcccaat gaaagacatc catgaatcaa 7620
ttagatggac aaaagaccca aagaacaccc aagaccatgt gcgctctttg tgcttgttgg 7680
cctggcacaa tggggagcac gaatatgagg aattcatcaa gaagatcaga agcgtcccag 7740
tcgggcgctg tctaaccctt cctgcgtttt ggaccctgcg caggaaatgg ttggattcct 7800
tttagattag agacaatttt ctgcaatttg aattggctta accctaccac actcaccgaa 7860
ctagacaacg gtgtggtagg ggtaaattct ccgcattcgg tgcgg 7905
<210> 11
<211> 8271
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA sequence of ECHO25-Anti-PD1
<400> 11
ttaaaacagc ctgtgggttg ttcccaccca tagggcccac tgggcgctag cacactggta 60
ttgtggtacc tttgtgcgcc tgttttatct acccctcccc caaacgtgac ttagaagctc 120
aacacatgtg gtcagcaggt ggcccagtat accaactggg tcttgatcaa gcacttctgt 180
taccccggac cgagtatcaa taggctgctc acgcggctga aggagaaagt gttcgttatc 240
cggccaatta ctacgagaaa cctagtacca ccatggaagt tgcgcggcgt ttcgctccgc 300
acaaccccag tgtagatcag gccgatgagt caccgcactc ctcacgggcg accgtggcgg 360
tggctgcgct ggcggcctgc ccatggggca acccatggga cgcttcaata ccgacatggt 420
gtgaagagtc tattgtgcta attggtaatc ctccggcccc tgaatgcggc taatcccaac 480
tgcggagcag atacccacat gccagtgggc agtctgtcgt aacgggtaac tctgcagcgg 540
aaccgactac tttgggtgtc cgtgtttctt tttattcttt attggctgct tatggtgaca 600
attgagagat tgttgccata tagctattgg attggccatc cggtgacaaa cagaacaata 660
gtttatctat ttgttggttt cataccatta aattttaaag tattaaagac tatcaacttg 720
atcatactac ttaatacagc aaaatgggag ctcatgtgtc aacgcagaaa accggagcgc 780
atgagactgg tttgagcgcc agtgggaatt cggttattca ttacacaaca tcaattatta 840
caaggatgca tcttcaaatt cagcaaacag gcaagacttt tcacaagacc ccagcaaatt 900
taccgaaccc tatgaaggat gtcatgatta aatcactccc ggcgttaaat tcacccactg 960
tggaggaatg tggctacagt gaccgggtgc gctccattac tttgggtaat tcaacaatca 1020
ctacgcagga aagtgcaaat gtggtagttg gctatggtgt ctggccggag tatttgaggg 1080
atgaggaagc cacggcacaa gaccaaccca ctcaaccaga tgttgccacc tgtagattct 1140
acaccctaga atctgttatg tgggagaagt cctcggcggg ctggtggtgg aagtttccag 1200
atgctcttgc agagatgggc ctattcggtc aaaatatgct ataccattat ttgggaaggt 1260
caggctacac aatacacgtg caatgcaatg cgtcaaaatt ccaccaaggg tgccttcttg 1320
tagtctgtgt gccagaagcc gagatgggtt ctgcacagct tgataggaca ttgaatcata 1380
ccaaacttag caacacagaa cacgccagca cattcgggtc catgagttcc aatgaagctg 1440
gggccgtcca aaatgtagtg cacaatgccg ggatgggcgt tggagtgggt aacttgacca 1500
tctaccctca tcagtggatt aatcttagaa ccaacaattg tgccaccata gtaatgccgt 1560
acataaacag tgtgccaatg gataatatgt ttaggcatta caatttcacc cttatggtga 1620
ttccattcgc acagcttgat tatgcaccca gcgcgtccac tcacgttcca ataaccgtga 1680
cagttgcccc catgtgtgcc gaatacaacg ggctaagatt ggcaggtaaa cagggcttac 1740
caacaatgct cactccaggt agcaaccagt tcctcacgtc tgatgatttc cagtccccat 1800
cagcaatgcc acagtttgat gtaacgccgg agattgaaat ccccggtgac gtgaagaatt 1860
taatggaaat ggctgaagtt gattctgtgg tcccagtgaa taatctggat gataaggtaa 1920
attcaattga agcttataca atccccgtca aatcaatgag tggtattgcg acacaagtcg 1980
ttgggttcca attacaaccc ggggacgata gtgcgtttaa gaggacactg ttaggagaga 2040
ttttgaacta ctttgcaaat tggtcgggaa ttatcaaact gacattccca tactgcggtg 2100
cggcgatgac cactggcaca ttcctgatcg cctactcccc tcctggtgct ggcttccctg 2160
ctaaccgcaa ggactcaatg ttgggcactc acattgtctg ggacatagga ttgcaatcga 2220
gttgtgtgct ctgcgtgcca tggatcagtc agacaaacta ccgcttcgtg acgcatgacg 2280
cttatacaga cgctgggttt attacatgct ggtaccaaac aaacatagtg tcacccccag 2340
acatcccggc agacagtaca atcctatgtt ttgtttcagc ttgtaatgat ttctcggtgc 2400
gcttgttaag ggacacgcca ttcatatcac aaaacgcact tctccaaaat gacccggcta 2460
ctgccattgt tagatcagtg gaacgggtgg ccgataccat agcaagtggc ccaatgaatt 2520
ccgagagagt cccagcattg actgccgtcg agacgggtca cacatctcaa gttgttccca 2580
gtgatactat gcaaaccagg catgttgtta accatcacat tagatcggaa tcttcaatag 2640
agaattttct gagtagatcg gcatgcgttt acattgatgt gtatggcaca aaagagaatg 2700
gtgacatcga acgtttcact aactggaaga tcaacacacg ccaggttgtt cagctgaggc 2760
gcaagctgga gatgttcact tacatcagat ttgatgtgga aataacattc gtaattacaa 2820
gtactcaagg gacatcaacc caaacaagca ctggcacccc agtgctcaca catcaagtga 2880
tgtatgtgcc acccggaggc cccatacccg cgtcatatga ggattatagc tggcaaactt 2940
cgacaaaccc cagcgttttc tggacagaag ggaatgcacc ggctcgcatg tcaataccct 3000
ttatgagtgt gggcaatgcc tattgcaact tttatgatgg ctggtcacat ttctcgcaat 3060
ccggcgtgta tggtttcact accctgaaca acatgggaca gctgtttttc agacatgtga 3120
ataaggacac acttggccct tacaacagca cagtgcgtgt ctatttcaaa ccaaagcaca 3180
tcaaagcatg ggtgcccaga ccaccgcgtc tatgcgatta tgtgtatgca cataatgtcg 3240
atttcacccc cagaggagtc acggacataa gggaaaagat cacactggaa agagacgacc 3300
acacgccttc gatggtaaac cacggtgctt ttggacagca gatgaagcac ctgtggttct 3360
tcctgctgct ggtggccgct cctaggtggg tgctgtccca ggtgcagctg gtgcagagcg 3420
gcgtggaggt gaagaagccc ggcgcttccg tgaaggtgtc ctgcaaggcc tccggctaca 3480
ccttcaccaa ctactacatg tactgggtga ggcaggcccc tggacaggga ctggagtgga 3540
tgggcggcat caacccttcc aacggcggca ccaacttcaa cgagaagttc aagaaccggg 3600
tgaccctgac caccgactcc tccaccacca ccgcctacat ggagctgaag tccctgcagt 3660
ttgacgacac cgccgtgtac tactgcgcca ggagggacta ccggttcgac atgggcttcg 3720
actactgggg ccagggcaca accgtgaccg tgtccagcgg aggtggcgga tctggagggg 3780
gtggtagcgg tggaggcggg agtgagatcg tgctgaccca gtcccctgct acactgtccc 3840
tgtcccccgg cgagagggct acactgagct gcagggcctc caagggcgtg tccacctccg 3900
gctactccta cctgcactgg taccagcaga agcctggaca ggctcccagg ctgctgatct 3960
acctggcctc ctacctggag tccggcgtgc ctgctaggtt ttccggcagc ggcagcggca 4020
ccgatttcac cctgaccatc tcctccctgg agcccgagga cttcgccgtg tactactgcc 4080
agcactccag ggatctgcct ctgaccttcg gcggcggcac caaggtggag atcaaggacg 4140
accacacgcc ttcgatggta aaccacggtg cttttggaca gcagtctggc gccatttacg 4200
tgggtaacta cagagtggta aataggcacc tggccaccta tgccgattgg cagaattgcg 4260
tgtgggaaga ttataataga gacctcttag tgagcacaac cacagcgcac gggtgtgaca 4320
ccatcgctag gtgtcaatgc tgcacgggtg tctacttttg tgcctcaagg aacaagcact 4380
acccagttag ctttgaaggg ccaggcctag tggaagttca ggagagtgag tattacccaa 4440
agagatacca gtcccacgtg ctgttagccg cagggttttc tgaaccagga gactgtggtg 4500
gaattctcag gtgcgagcat ggtgttatcg gactagttac catgggtggc gaaggcgtag 4560
tcggctttgc tgatgtgcgc gacctgctgt ggttggagga tgatgcaatg gaacaagggg 4620
tcaagggtta tgtagaacaa ttgggcaatg ccttcggttc cgggttcacc aatcaaatct 4680
gcgaacaagt caacctcctc aaagaatcac tagtgggcca agattccata ctagagaagt 4740
cccttaaagc tcttgtgaaa atcatttcag cactggtaat agtagtgagg aaccatgatg 4800
acttaattac tgtgactgcc accctcgctc taattggctg cacctcatcg ccgtggcggt 4860
ggcttaaaca gaaggtgtca cagtattacg ggatacccat ggctgagcga caaaacaacg 4920
ggtggctcaa aaagtttaca gagatgacca atgcctgcaa agggatggag tggattgccg 4980
tcaagatcca aaagtttata gaatggctca agattaaaat cttaccagag gtaaaggaga 5040
agcatgagtt cctaaccaga cttaaacaac tcccccttct ggaaagccaa attgccacca 5100
ttgaacaaag tgcaccgtcc cagagtgatc aggaacaact cttctcaaat gttcaatact 5160
tcgcccacta ctgcagaaag tacgcacctc tgtatgctac tgaggccaaa agagtgttct 5220
cccttgagaa gaaaatgagt aactacatac agttcaagtc caaatgccgt attgaaccag 5280
tatgtttgct attgcacggg agtcctggag ctgggaaatc ggttgccacc aacttaattg 5340
ggcgatctct agctgagaag ttgaacagtt cagtgtattc tctaccacca gaccctgacc 5400
acttcgatgg ctataaacaa caagccgttg tgattatgga cgacctatgc caaaatccag 5460
atgggaagga tgtgtcatta ttttgtcaga tggtgtcgag tgttgacttt gtcccaccaa 5520
tggctgcctt ggaagaaaaa ggaattttgt ttacctctcc ctttgtcttg gcctcaacta 5580
atgctggttc catcaatgcc ccgacggtgt cagacagcag ggctttggct agaagattcc 5640
actttgacat gaacatcgag gttatatcaa tgtacagcca gaatggcaag attaacatgc 5700
ccatgtcagt caaaacatgc gacgaagagt gctgtccagt taacttcaaa aagtgttgcc 5760
cccttgtgtg tggaaaagcc atacagttta tagatagaag aactcaagtg aggtactcct 5820
tggacatgtt ggtcactgag atgtttaggg agtacaacca taggcacagc gtcggggcaa 5880
cccttgaggc actatttcaa ggtccaccag tatacaggga gatcaaaatt actgttgcac 5940
ctgatacccc accaccacca gctattgcat acctactgaa atcattggac agtgaagcag 6000
ttagggagta ctgtaaagag aatggatggc tcgttcctga aattagctct acccttcata 6060
ttgaaaaaca tgtaagccga gcctttatct gtctccaggc actgacaact tttgtatccg 6120
tggccggtat tatctacatc atttataaac tatttgcagg gtttcaaggc gcctacacag 6180
ggatgcccaa ccaaaagcca aaaataccca cactaaggca agccaaggtg cagggacctg 6240
cttgtgagtt tgctgtagcc atgatgaaga gaaactccat cacagtgaag acagagtatg 6300
gtgagtttac aatgttgggc atctacgaca ggtgggccgt actaccacgc catgcaaaac 6360
ccgggccaac catccttatg aatgaccagg aagttggcgt actagatgca aaagaactag 6420
tggataaaga tggcacaaac cttgaactga cgctgttgaa gcttgaccgg aatgaaaagt 6480
tcagagacat cagaggtttc ctggccaagg aagaagtgga ggtcaatgaa gctgttctag 6540
caataaacac cagcaagttc ccgaacatgt acataccagt tgggcaagta acagactacg 6600
gtttcctgaa cctggggggc actccgacga aaagaatgct catgtacaat tttcctacca 6660
gagctggcca atgtggtggt attcttatgt ctactggtaa ggtgttgggg atacacgttg 6720
gtggaaatgg ccaccagggc ttctcagcag ctctccttaa acactacttc aatgatgaac 6780
aaggtgagat tgaatttatt gaaagctcaa aggaagcagg tttcccagtc attaatactc 6840
caagcaagac taaattggaa ccaagtgtct tccaccaagt gtttgaaggc aacaaggaac 6900
ctgcagttct caggaatggt gatccacgac tcaaagcaaa ttttgaggag gcaatctttt 6960
ccaaatatat tggtaatgtg aacacacacg tagatgagta catgatggaa gccgtggatc 7020
actacgcagg acaattggcc acactggaca ttaatacgga acctatgaaa ttggaggatg 7080
cagtgtatgg cacagagggg ttggaggcac ttgatctaac caccagtgca gggtacccgt 7140
atgtagcact gggcatcaag aagagagaca tcttgtctaa gaagaccaga gatctgacta 7200
aattaaagga gtgtatggac aaatatggtc taaaccttcc gatggtgacc tatgtgaagg 7260
atgagctcag atcagcagaa aaagtggcta aaggcaagtc tagacttatt gaggcatcca 7320
gcctgaacga ctctgtagcg atgagacaaa cttttggcaa tctgtacaga acatttcatt 7380
tgaacccagg gattgtaact ggcagtgcag ttgggtgtga tcctgacctt ttctggagca 7440
aaatacctgt aatgctagat ggacatctca tagcctttga ttactctgga tatgatgcca 7500
gtttgagccc cgtgtggttt gcttgtttga agctattgct agaaaaacta ggatactcac 7560
acaaagaaac aaattacatt gactatttgt gcaattccca ccatttgtac agagacaagc 7620
attacttcgt gcgtggcggc atgccatcag gttgctccgg taccagcatc ttcaactcaa 7680
tgatcaacaa catcataatc aggacgctaa tgttgaaggt gtacaaagga attgacctgg 7740
atcgattcag aatgattgcc tatggcgatg atgttattgc gtcttacccc tggccaatcg 7800
atgcctcttt acttgctgaa gccggcaagg ggtatgggct gatcatgaca ccagcagata 7860
aaggggagtg ttttaatgaa gtcacctgga ctaatgtcac ctttttgaag agatatttca 7920
gagcagatga gcaatacccc tttgtggtcc atcctgttat cccaatgaaa gacatccatg 7980
aatcaattag atggacaaaa gacccaaaga acacccaaga ccatgtgcgc tctttgtgct 8040
tgttggcctg gcacaatggg gagcacgaat atgaggaatt catcaagaag atcagaagcg 8100
tcccagtcgg gcgctgtcta acccttcctg cgttttggac cctgcgcagg aaatggttgg 8160
attcctttta gattagagac aattttctgc aatttgaatt ggcttaaccc taccacactc 8220
accgaactag acaacggtgt ggtaggggta aattctccgc attcggtgcg g 8271
<210> 12
<211> 7428
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> genome sequence of ECHO25-WT
<400> 12
uuaaaacagc cuguggguug uucccaccca uagggcccac ugggcgcuag cacacuggua 60
uugugguacc uuugugcgcc uguuuuaucu accccucccc caaacgugac uuagaagcuc 120
aacacaugug gucagcaggu ggcccaguau accaacuggg ucuugaucaa gcacuucugu 180
uaccccggac cgaguaucaa uaggcugcuc acgcggcuga aggagaaagu guucguuauc 240
cggccaauua cuacgagaaa ccuaguacca ccauggaagu ugcgcggcgu uucgcuccgc 300
acaaccccag uguagaucag gccgaugagu caccgcacuc cucacgggcg accguggcgg 360
uggcugcgcu ggcggccugc ccauggggca acccauggga cgcuucaaua ccgacauggu 420
gugaagaguc uauugugcua auugguaauc cuccggcccc ugaaugcggc uaaucccaac 480
ugcggagcag auacccacau gccagugggc agucugucgu aacggguaac ucugcagcgg 540
aaccgacuac uuuggguguc cguguuucuu uuuauucuuu auuggcugcu uauggugaca 600
auugagagau uguugccaua uagcuauugg auuggccauc cggugacaaa cagaacaaua 660
guuuaucuau uuguugguuu cauaccauua aauuuuaaag uauuaaagac uaucaacuug 720
aucauacuac uuaauacagc aaaaugggag cucauguguc aacgcagaaa accggagcgc 780
augagacugg uuugagcgcc agugggaauu cgguuauuca uuacacaaca ucaauuauua 840
caaggaugca ucuucaaauu cagcaaacag gcaagacuuu ucacaagacc ccagcaaauu 900
uaccgaaccc uaugaaggau gucaugauua aaucacuccc ggcguuaaau ucacccacug 960
uggaggaaug uggcuacagu gaccgggugc gcuccauuac uuuggguaau ucaacaauca 1020
cuacgcagga aagugcaaau gugguaguug gcuauggugu cuggccggag uauuugaggg 1080
augaggaagc cacggcacaa gaccaaccca cucaaccaga uguugccacc uguagauucu 1140
acacccuaga aucuguuaug ugggagaagu ccucggcggg cugguggugg aaguuuccag 1200
augcucuugc agagaugggc cuauucgguc aaaauaugcu auaccauuau uugggaaggu 1260
caggcuacac aauacacgug caaugcaaug cgucaaaauu ccaccaaggg ugccuucuug 1320
uagucugugu gccagaagcc gagauggguu cugcacagcu ugauaggaca uugaaucaua 1380
ccaaacuuag caacacagaa cacgccagca cauucggguc caugaguucc aaugaagcug 1440
gggccgucca aaauguagug cacaaugccg ggaugggcgu uggagugggu aacuugacca 1500
ucuacccuca ucaguggauu aaucuuagaa ccaacaauug ugccaccaua guaaugccgu 1560
acauaaacag ugugccaaug gauaauaugu uuaggcauua caauuucacc cuuaugguga 1620
uuccauucgc acagcuugau uaugcaccca gcgcguccac ucacguucca auaaccguga 1680
caguugcccc caugugugcc gaauacaacg ggcuaagauu ggcagguaaa cagggcuuac 1740
caacaaugcu cacuccaggu agcaaccagu uccucacguc ugaugauuuc caguccccau 1800
cagcaaugcc acaguuugau guaacgccgg agauugaaau ccccggugac gugaagaauu 1860
uaauggaaau ggcugaaguu gauucugugg ucccagugaa uaaucuggau gauaagguaa 1920
auucaauuga agcuuauaca auccccguca aaucaaugag ugguauugcg acacaagucg 1980
uuggguucca auuacaaccc ggggacgaua gugcguuuaa gaggacacug uuaggagaga 2040
uuuugaacua cuuugcaaau uggucgggaa uuaucaaacu gacauuccca uacugcggug 2100
cggcgaugac cacuggcaca uuccugaucg ccuacucccc uccuggugcu ggcuucccug 2160
cuaaccgcaa ggacucaaug uugggcacuc acauugucug ggacauagga uugcaaucga 2220
guugugugcu cugcgugcca uggaucaguc agacaaacua ccgcuucgug acgcaugacg 2280
cuuauacaga cgcuggguuu auuacaugcu gguaccaaac aaacauagug ucacccccag 2340
acaucccggc agacaguaca auccuauguu uuguuucagc uuguaaugau uucucggugc 2400
gcuuguuaag ggacacgcca uucauaucac aaaacgcacu ucuccaaaau gacccggcua 2460
cugccauugu uagaucagug gaacgggugg ccgauaccau agcaaguggc ccaaugaauu 2520
ccgagagagu cccagcauug acugccgucg agacggguca cacaucucaa guuguuccca 2580
gugauacuau gcaaaccagg cauguuguua accaucacau uagaucggaa ucuucaauag 2640
agaauuuucu gaguagaucg gcaugcguuu acauugaugu guauggcaca aaagagaaug 2700
gugacaucga acguuucacu aacuggaaga ucaacacacg ccagguuguu cagcugaggc 2760
gcaagcugga gauguucacu uacaucagau uugaugugga aauaacauuc guaauuacaa 2820
guacucaagg gacaucaacc caaacaagca cuggcacccc agugcucaca caucaaguga 2880
uguaugugcc acccggaggc cccauacccg cgucauauga ggauuauagc uggcaaacuu 2940
cgacaaaccc cagcguuuuc uggacagaag ggaaugcacc ggcucgcaug ucaauacccu 3000
uuaugagugu gggcaaugcc uauugcaacu uuuaugaugg cuggucacau uucucgcaau 3060
ccggcgugua ugguuucacu acccugaaca acaugggaca gcuguuuuuc agacauguga 3120
auaaggacac acuuggcccu uacaacagca cagugcgugu cuauuucaaa ccaaagcaca 3180
ucaaagcaug ggugcccaga ccaccgcguc uaugcgauua uguguaugca cauaaugucg 3240
auuucacccc cagaggaguc acggacauaa gggaaaagau cacacuggaa agagacgacc 3300
acacgccuuc gaugguaaac cacggugcuu uuggacagca gucuggcgcc auuuacgugg 3360
guaacuacag agugguaaau aggcaccugg ccaccuaugc cgauuggcag aauugcgugu 3420
gggaagauua uaauagagac cucuuaguga gcacaaccac agcgcacggg ugugacacca 3480
ucgcuaggug ucaaugcugc acgggugucu acuuuugugc cucaaggaac aagcacuacc 3540
caguuagcuu ugaagggcca ggccuagugg aaguucagga gagugaguau uacccaaaga 3600
gauaccaguc ccacgugcug uuagccgcag gguuuucuga accaggagac ugugguggaa 3660
uucucaggug cgagcauggu guuaucggac uaguuaccau ggguggcgaa ggcguagucg 3720
gcuuugcuga ugugcgcgac cugcuguggu uggaggauga ugcaauggaa caagggguca 3780
aggguuaugu agaacaauug ggcaaugccu ucgguuccgg guucaccaau caaaucugcg 3840
aacaagucaa ccuccucaaa gaaucacuag ugggccaaga uuccauacua gagaaguccc 3900
uuaaagcucu ugugaaaauc auuucagcac ugguaauagu agugaggaac caugaugacu 3960
uaauuacugu gacugccacc cucgcucuaa uuggcugcac cucaucgccg uggcgguggc 4020
uuaaacagaa ggugucacag uauuacggga uacccauggc ugagcgacaa aacaacgggu 4080
ggcucaaaaa guuuacagag augaccaaug ccugcaaagg gauggagugg auugccguca 4140
agauccaaaa guuuauagaa uggcucaaga uuaaaaucuu accagaggua aaggagaagc 4200
augaguuccu aaccagacuu aaacaacucc cccuucugga aagccaaauu gccaccauug 4260
aacaaagugc accgucccag agugaucagg aacaacucuu cucaaauguu caauacuucg 4320
cccacuacug cagaaaguac gcaccucugu augcuacuga ggccaaaaga guguucuccc 4380
uugagaagaa aaugaguaac uacauacagu ucaaguccaa augccguauu gaaccaguau 4440
guuugcuauu gcacgggagu ccuggagcug ggaaaucggu ugccaccaac uuaauugggc 4500
gaucucuagc ugagaaguug aacaguucag uguauucucu accaccagac ccugaccacu 4560
ucgauggcua uaaacaacaa gccguuguga uuauggacga ccuaugccaa aauccagaug 4620
ggaaggaugu gucauuauuu ugucagaugg ugucgagugu ugacuuuguc ccaccaaugg 4680
cugccuugga agaaaaagga auuuuguuua ccucucccuu ugucuuggcc ucaacuaaug 4740
cugguuccau caaugccccg acggugucag acagcagggc uuuggcuaga agauuccacu 4800
uugacaugaa caucgagguu auaucaaugu acagccagaa uggcaagauu aacaugccca 4860
ugucagucaa aacaugcgac gaagagugcu guccaguuaa cuucaaaaag uguugccccc 4920
uugugugugg aaaagccaua caguuuauag auagaagaac ucaagugagg uacuccuugg 4980
acauguuggu cacugagaug uuuagggagu acaaccauag gcacagcguc ggggcaaccc 5040
uugaggcacu auuucaaggu ccaccaguau acagggagau caaaauuacu guugcaccug 5100
auaccccacc accaccagcu auugcauacc uacugaaauc auuggacagu gaagcaguua 5160
gggaguacug uaaagagaau ggauggcucg uuccugaaau uagcucuacc cuucauauug 5220
aaaaacaugu aagccgagcc uuuaucuguc uccaggcacu gacaacuuuu guauccgugg 5280
ccgguauuau cuacaucauu uauaaacuau uugcaggguu ucaaggcgcc uacacaggga 5340
ugcccaacca aaagccaaaa auacccacac uaaggcaagc caaggugcag ggaccugcuu 5400
gugaguuugc uguagccaug augaagagaa acuccaucac agugaagaca gaguauggug 5460
aguuuacaau guugggcauc uacgacaggu gggccguacu accacgccau gcaaaacccg 5520
ggccaaccau ccuuaugaau gaccaggaag uuggcguacu agaugcaaaa gaacuagugg 5580
auaaagaugg cacaaaccuu gaacugacgc uguugaagcu ugaccggaau gaaaaguuca 5640
gagacaucag agguuuccug gccaaggaag aaguggaggu caaugaagcu guucuagcaa 5700
uaaacaccag caaguucccg aacauguaca uaccaguugg gcaaguaaca gacuacgguu 5760
uccugaaccu ggggggcacu ccgacgaaaa gaaugcucau guacaauuuu ccuaccagag 5820
cuggccaaug uggugguauu cuuaugucua cugguaaggu guuggggaua cacguuggug 5880
gaaauggcca ccagggcuuc ucagcagcuc uccuuaaaca cuacuucaau gaugaacaag 5940
gugagauuga auuuauugaa agcucaaagg aagcagguuu cccagucauu aauacuccaa 6000
gcaagacuaa auuggaacca agugucuucc accaaguguu ugaaggcaac aaggaaccug 6060
caguucucag gaauggugau ccacgacuca aagcaaauuu ugaggaggca aucuuuucca 6120
aauauauugg uaaugugaac acacacguag augaguacau gauggaagcc guggaucacu 6180
acgcaggaca auuggccaca cuggacauua auacggaacc uaugaaauug gaggaugcag 6240
uguauggcac agagggguug gaggcacuug aucuaaccac cagugcaggg uacccguaug 6300
uagcacuggg caucaagaag agagacaucu ugucuaagaa gaccagagau cugacuaaau 6360
uaaaggagug uauggacaaa uauggucuaa accuuccgau ggugaccuau gugaaggaug 6420
agcucagauc agcagaaaaa guggcuaaag gcaagucuag acuuauugag gcauccagcc 6480
ugaacgacuc uguagcgaug agacaaacuu uuggcaaucu guacagaaca uuucauuuga 6540
acccagggau uguaacuggc agugcaguug ggugugaucc ugaccuuuuc uggagcaaaa 6600
uaccuguaau gcuagaugga caucucauag ccuuugauua cucuggauau gaugccaguu 6660
ugagccccgu gugguuugcu uguuugaagc uauugcuaga aaaacuagga uacucacaca 6720
aagaaacaaa uuacauugac uauuugugca auucccacca uuuguacaga gacaagcauu 6780
acuucgugcg uggcggcaug ccaucagguu gcuccgguac cagcaucuuc aacucaauga 6840
ucaacaacau cauaaucagg acgcuaaugu ugaaggugua caaaggaauu gaccuggauc 6900
gauucagaau gauugccuau ggcgaugaug uuauugcguc uuaccccugg ccaaucgaug 6960
ccucuuuacu ugcugaagcc ggcaaggggu augggcugau caugacacca gcagauaaag 7020
gggaguguuu uaaugaaguc accuggacua augucaccuu uuugaagaga uauuucagag 7080
cagaugagca auaccccuuu gugguccauc cuguuauccc aaugaaagac auccaugaau 7140
caauuagaug gacaaaagac ccaaagaaca cccaagacca ugugcgcucu uugugcuugu 7200
uggccuggca caauggggag cacgaauaug aggaauucau caagaagauc agaagcgucc 7260
cagucgggcg cugucuaacc cuuccugcgu uuuggacccu gcgcaggaaa ugguuggauu 7320
ccuuuuagau uagagacaau uuucugcaau uugaauuggc uuaacccuac cacacucacc 7380
gaacuagaca acgguguggu agggguaaau ucuccgcauu cggugcgg 7428
<210> 13
<211> 7309
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> genome sequence of ECHO25-HRV2
<400> 13
uuaaaacagc cuguggguug uucccaccca uagggcccac ugggcgcuag cacacuggua 60
uugugguacc uuugugcgcc uguuuuaucu accccucccc caaacgugac uuagaagaac 120
uuagaaguuu uucacaaaga ccaauagccg guaaucagcc agauuacuga aggucaagca 180
cuucuguuuc cccggucaau guugauaugc uccaacaggg caaaaacaac ugcgaucguu 240
aaccgcaaag cgccuacgca aagcuuagua gcaucuuuga aaucguuugg cuggucgauc 300
cgccauuucc ccugguagac cuggcagaug aggcuagaaa uaccccacug gcgacagugu 360
ucuagccugc guggcugccu gcacacccua ugggugugaa gccaaacaau ggacaaggug 420
ugaagagccc cgugugcucg cuuugagucc uccggccccu gaauguggcu aaccuuaacc 480
cugcagcuag agcacguaac ccaaugugua ucuagucgua augagcaauu gcgggauggg 540
accaacuacu uugggugucc guguuucacu uuuuccuuua uauuugcuua uggugacaau 600
auauacaaua uauauauugg caccauggga gcucaugugu caacgcagaa aaccggagcg 660
caugagacug guuugagcgc cagugggaau ucgguuauuc auuacacaac aucaauuauu 720
acaaggaugc aucuucaaau ucagcaaaca ggcaagacuu uucacaagac cccagcaaau 780
uuaccgaacc cuaugaagga ugucaugauu aaaucacucc cggcguuaaa uucacccacu 840
guggaggaau guggcuacag ugaccgggug cgcuccauua cuuuggguaa uucaacaauc 900
acuacgcagg aaagugcaaa ugugguaguu ggcuauggug ucuggccgga guauuugagg 960
gaugaggaag ccacggcaca agaccaaccc acucaaccag auguugccac cuguagauuc 1020
uacacccuag aaucuguuau gugggagaag uccucggcgg gcugguggug gaaguuucca 1080
gaugcucuug cagagauggg ccuauucggu caaaauaugc uauaccauua uuugggaagg 1140
ucaggcuaca caauacacgu gcaaugcaau gcgucaaaau uccaccaagg gugccuucuu 1200
guagucugug ugccagaagc cgagaugggu ucugcacagc uugauaggac auugaaucau 1260
accaaacuua gcaacacaga acacgccagc acauucgggu ccaugaguuc caaugaagcu 1320
ggggccgucc aaaauguagu gcacaaugcc gggaugggcg uuggaguggg uaacuugacc 1380
aucuacccuc aucaguggau uaaucuuaga accaacaauu gugccaccau aguaaugccg 1440
uacauaaaca gugugccaau ggauaauaug uuuaggcauu acaauuucac ccuuauggug 1500
auuccauucg cacagcuuga uuaugcaccc agcgcgucca cucacguucc aauaaccgug 1560
acaguugccc ccaugugugc cgaauacaac gggcuaagau uggcagguaa acagggcuua 1620
ccaacaaugc ucacuccagg uagcaaccag uuccucacgu cugaugauuu ccagucccca 1680
ucagcaaugc cacaguuuga uguaacgccg gagauugaaa uccccgguga cgugaagaau 1740
uuaauggaaa uggcugaagu ugauucugug gucccaguga auaaucugga ugauaaggua 1800
aauucaauug aagcuuauac aauccccguc aaaucaauga gugguauugc gacacaaguc 1860
guuggguucc aauuacaacc cggggacgau agugcguuua agaggacacu guuaggagag 1920
auuuugaacu acuuugcaaa uuggucggga auuaucaaac ugacauuccc auacugcggu 1980
gcggcgauga ccacuggcac auuccugauc gccuacuccc cuccuggugc uggcuucccu 2040
gcuaaccgca aggacucaau guugggcacu cacauugucu gggacauagg auugcaaucg 2100
aguugugugc ucugcgugcc auggaucagu cagacaaacu accgcuucgu gacgcaugac 2160
gcuuauacag acgcuggguu uauuacaugc ugguaccaaa caaacauagu gucaccccca 2220
gacaucccgg cagacaguac aauccuaugu uuuguuucag cuuguaauga uuucucggug 2280
cgcuuguuaa gggacacgcc auucauauca caaaacgcac uucuccaaaa ugacccggcu 2340
acugccauug uuagaucagu ggaacgggug gccgauacca uagcaagugg cccaaugaau 2400
uccgagagag ucccagcauu gacugccguc gagacggguc acacaucuca aguuguuccc 2460
agugauacua ugcaaaccag gcauguuguu aaccaucaca uuagaucgga aucuucaaua 2520
gagaauuuuc ugaguagauc ggcaugcguu uacauugaug uguauggcac aaaagagaau 2580
ggugacaucg aacguuucac uaacuggaag aucaacacac gccagguugu ucagcugagg 2640
cgcaagcugg agauguucac uuacaucaga uuugaugugg aaauaacauu cguaauuaca 2700
aguacucaag ggacaucaac ccaaacaagc acuggcaccc cagugcucac acaucaagug 2760
auguaugugc cacccggagg ccccauaccc gcgucauaug aggauuauag cuggcaaacu 2820
ucgacaaacc ccagcguuuu cuggacagaa gggaaugcac cggcucgcau gucaauaccc 2880
uuuaugagug ugggcaaugc cuauugcaac uuuuaugaug gcuggucaca uuucucgcaa 2940
uccggcgugu augguuucac uacccugaac aacaugggac agcuguuuuu cagacaugug 3000
aauaaggaca cacuuggccc uuacaacagc acagugcgug ucuauuucaa accaaagcac 3060
aucaaagcau gggugcccag accaccgcgu cuaugcgauu auguguaugc acauaauguc 3120
gauuucaccc ccagaggagu cacggacaua agggaaaaga ucacacugga aagagacgac 3180
cacacgccuu cgaugguaaa ccacggugcu uuuggacagc agucuggcgc cauuuacgug 3240
gguaacuaca gagugguaaa uaggcaccug gccaccuaug ccgauuggca gaauugcgug 3300
ugggaagauu auaauagaga ccucuuagug agcacaacca cagcgcacgg gugugacacc 3360
aucgcuaggu gucaaugcug cacggguguc uacuuuugug ccucaaggaa caagcacuac 3420
ccaguuagcu uugaagggcc aggccuagug gaaguucagg agagugagua uuacccaaag 3480
agauaccagu cccacgugcu guuagccgca ggguuuucug aaccaggaga cuguggugga 3540
auucucaggu gcgagcaugg uguuaucgga cuaguuacca uggguggcga aggcguaguc 3600
ggcuuugcug augugcgcga ccugcugugg uuggaggaug augcaaugga acaagggguc 3660
aaggguuaug uagaacaauu gggcaaugcc uucgguuccg gguucaccaa ucaaaucugc 3720
gaacaaguca accuccucaa agaaucacua gugggccaag auuccauacu agagaagucc 3780
cuuaaagcuc uugugaaaau cauuucagca cugguaauag uagugaggaa ccaugaugac 3840
uuaauuacug ugacugccac ccucgcucua auuggcugca ccucaucgcc guggcggugg 3900
cuuaaacaga aggugucaca guauuacggg auacccaugg cugagcgaca aaacaacggg 3960
uggcucaaaa aguuuacaga gaugaccaau gccugcaaag ggauggagug gauugccguc 4020
aagauccaaa aguuuauaga auggcucaag auuaaaaucu uaccagaggu aaaggagaag 4080
caugaguucc uaaccagacu uaaacaacuc ccccuucugg aaagccaaau ugccaccauu 4140
gaacaaagug caccguccca gagugaucag gaacaacucu ucucaaaugu ucaauacuuc 4200
gcccacuacu gcagaaagua cgcaccucug uaugcuacug aggccaaaag aguguucucc 4260
cuugagaaga aaaugaguaa cuacauacag uucaagucca aaugccguau ugaaccagua 4320
uguuugcuau ugcacgggag uccuggagcu gggaaaucgg uugccaccaa cuuaauuggg 4380
cgaucucuag cugagaaguu gaacaguuca guguauucuc uaccaccaga cccugaccac 4440
uucgauggcu auaaacaaca agccguugug auuauggacg accuaugcca aaauccagau 4500
gggaaggaug ugucauuauu uugucagaug gugucgagug uugacuuugu cccaccaaug 4560
gcugccuugg aagaaaaagg aauuuuguuu accucucccu uugucuuggc cucaacuaau 4620
gcugguucca ucaaugcccc gacgguguca gacagcaggg cuuuggcuag aagauuccac 4680
uuugacauga acaucgaggu uauaucaaug uacagccaga auggcaagau uaacaugccc 4740
augucaguca aaacaugcga cgaagagugc uguccaguua acuucaaaaa guguugcccc 4800
cuugugugug gaaaagccau acaguuuaua gauagaagaa cucaagugag guacuccuug 4860
gacauguugg ucacugagau guuuagggag uacaaccaua ggcacagcgu cggggcaacc 4920
cuugaggcac uauuucaagg uccaccagua uacagggaga ucaaaauuac uguugcaccu 4980
gauaccccac caccaccagc uauugcauac cuacugaaau cauuggacag ugaagcaguu 5040
agggaguacu guaaagagaa uggauggcuc guuccugaaa uuagcucuac ccuucauauu 5100
gaaaaacaug uaagccgagc cuuuaucugu cuccaggcac ugacaacuuu uguauccgug 5160
gccgguauua ucuacaucau uuauaaacua uuugcagggu uucaaggcgc cuacacaggg 5220
augcccaacc aaaagccaaa aauacccaca cuaaggcaag ccaaggugca gggaccugcu 5280
ugugaguuug cuguagccau gaugaagaga aacuccauca cagugaagac agaguauggu 5340
gaguuuacaa uguugggcau cuacgacagg ugggccguac uaccacgcca ugcaaaaccc 5400
gggccaacca uccuuaugaa ugaccaggaa guuggcguac uagaugcaaa agaacuagug 5460
gauaaagaug gcacaaaccu ugaacugacg cuguugaagc uugaccggaa ugaaaaguuc 5520
agagacauca gagguuuccu ggccaaggaa gaaguggagg ucaaugaagc uguucuagca 5580
auaaacacca gcaaguuccc gaacauguac auaccaguug ggcaaguaac agacuacggu 5640
uuccugaacc uggggggcac uccgacgaaa agaaugcuca uguacaauuu uccuaccaga 5700
gcuggccaau guggugguau ucuuaugucu acugguaagg uguuggggau acacguuggu 5760
ggaaauggcc accagggcuu cucagcagcu cuccuuaaac acuacuucaa ugaugaacaa 5820
ggugagauug aauuuauuga aagcucaaag gaagcagguu ucccagucau uaauacucca 5880
agcaagacua aauuggaacc aagugucuuc caccaagugu uugaaggcaa caaggaaccu 5940
gcaguucuca ggaaugguga uccacgacuc aaagcaaauu uugaggaggc aaucuuuucc 6000
aaauauauug guaaugugaa cacacacgua gaugaguaca ugauggaagc cguggaucac 6060
uacgcaggac aauuggccac acuggacauu aauacggaac cuaugaaauu ggaggaugca 6120
guguauggca cagagggguu ggaggcacuu gaucuaacca ccagugcagg guacccguau 6180
guagcacugg gcaucaagaa gagagacauc uugucuaaga agaccagaga ucugacuaaa 6240
uuaaaggagu guauggacaa auauggucua aaccuuccga uggugaccua ugugaaggau 6300
gagcucagau cagcagaaaa aguggcuaaa ggcaagucua gacuuauuga ggcauccagc 6360
cugaacgacu cuguagcgau gagacaaacu uuuggcaauc uguacagaac auuucauuug 6420
aacccaggga uuguaacugg cagugcaguu gggugugauc cugaccuuuu cuggagcaaa 6480
auaccuguaa ugcuagaugg acaucucaua gccuuugauu acucuggaua ugaugccagu 6540
uugagccccg ugugguuugc uuguuugaag cuauugcuag aaaaacuagg auacucacac 6600
aaagaaacaa auuacauuga cuauuugugc aauucccacc auuuguacag agacaagcau 6660
uacuucgugc guggcggcau gccaucaggu ugcuccggua ccagcaucuu caacucaaug 6720
aucaacaaca ucauaaucag gacgcuaaug uugaaggugu acaaaggaau ugaccuggau 6780
cgauucagaa ugauugccua uggcgaugau guuauugcgu cuuaccccug gccaaucgau 6840
gccucuuuac uugcugaagc cggcaagggg uaugggcuga ucaugacacc agcagauaaa 6900
ggggaguguu uuaaugaagu caccuggacu aaugucaccu uuuugaagag auauuucaga 6960
gcagaugagc aauaccccuu ugugguccau ccuguuaucc caaugaaaga cauccaugaa 7020
ucaauuagau ggacaaaaga cccaaagaac acccaagacc augugcgcuc uuugugcuug 7080
uuggccuggc acaaugggga gcacgaauau gaggaauuca ucaagaagau cagaagcguc 7140
ccagucgggc gcugucuaac ccuuccugcg uuuuggaccc ugcgcaggaa augguuggau 7200
uccuuuuaga uuagagacaa uuuucugcaa uuugaauugg cuuaacccua ccacacucac 7260
cgaacuagac aacggugugg uagggguaaa uucuccgcau ucggugcgg 7309
<210> 14
<211> 7530
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> genome sequence of ECHO25-miR133&206T
<400> 14
uuaaaacagc cuguggguug uucccaccca uagggcccac ugggcgcuag cacacuggua 60
uugugguacc uuugugcgcc uguuuuaucu accccucccc caaacgugac uuagaagcuc 120
aacacaugug gucagcaggu ggcccaguau accaacuggg ucuugaucaa gcacuucugu 180
uaccccggac cgaguaucaa uaggcugcuc acgcggcuga aggagaaagu guucguuauc 240
cggccaauua cuacgagaaa ccuaguacca ccauggaagu ugcgcggcgu uucgcuccgc 300
acaaccccag uguagaucag gccgaugagu caccgcacuc cucacgggcg accguggcgg 360
uggcugcgcu ggcggccugc ccauggggca acccauggga cgcuucaaua ccgacauggu 420
gugaagaguc uauugugcua auugguaauc cuccggcccc ugaaugcggc uaaucccaac 480
ugcggagcag auacccacau gccagugggc agucugucgu aacggguaac ucugcagcgg 540
aaccgacuac uuuggguguc cguguuucuu uuuauucuuu auuggcugcu uauggugaca 600
auugagagau uguugccaua uagcuauugg auuggccauc cggugacaaa cagaacaaua 660
guuuaucuau uuguugguuu cauaccauua aauuuuaaag uauuaaagac uaucaacuug 720
aucauacuac uuaauacagc aaaaugggag cucauguguc aacgcagaaa accggagcgc 780
augagacugg uuugagcgcc agugggaauu cgguuauuca uuacacaaca ucaauuauua 840
caaggaugca ucuucaaauu cagcaaacag gcaagacuuu ucacaagacc ccagcaaauu 900
uaccgaaccc uaugaaggau gucaugauua aaucacuccc ggcguuaaau ucacccacug 960
uggaggaaug uggcuacagu gaccgggugc gcuccauuac uuuggguaau ucaacaauca 1020
cuacgcagga aagugcaaau gugguaguug gcuauggugu cuggccggag uauuugaggg 1080
augaggaagc cacggcacaa gaccaaccca cucaaccaga uguugccacc uguagauucu 1140
acacccuaga aucuguuaug ugggagaagu ccucggcggg cugguggugg aaguuuccag 1200
augcucuugc agagaugggc cuauucgguc aaaauaugcu auaccauuau uugggaaggu 1260
caggcuacac aauacacgug caaugcaaug cgucaaaauu ccaccaaggg ugccuucuug 1320
uagucugugu gccagaagcc gagauggguu cugcacagcu ugauaggaca uugaaucaua 1380
ccaaacuuag caacacagaa cacgccagca cauucggguc caugaguucc aaugaagcug 1440
gggccgucca aaauguagug cacaaugccg ggaugggcgu uggagugggu aacuugacca 1500
ucuacccuca ucaguggauu aaucuuagaa ccaacaauug ugccaccaua guaaugccgu 1560
acauaaacag ugugccaaug gauaauaugu uuaggcauua caauuucacc cuuaugguga 1620
uuccauucgc acagcuugau uaugcaccca gcgcguccac ucacguucca auaaccguga 1680
caguugcccc caugugugcc gaauacaacg ggcuaagauu ggcagguaaa cagggcuuac 1740
caacaaugcu cacuccaggu agcaaccagu uccucacguc ugaugauuuc caguccccau 1800
cagcaaugcc acaguuugau guaacgccgg agauugaaau ccccggugac gugaagaauu 1860
uaauggaaau ggcugaaguu gauucugugg ucccagugaa uaaucuggau gauaagguaa 1920
auucaauuga agcuuauaca auccccguca aaucaaugag ugguauugcg acacaagucg 1980
uuggguucca auuacaaccc ggggacgaua gugcguuuaa gaggacacug uuaggagaga 2040
uuuugaacua cuuugcaaau uggucgggaa uuaucaaacu gacauuccca uacugcggug 2100
cggcgaugac cacuggcaca uuccugaucg ccuacucccc uccuggugcu ggcuucccug 2160
cuaaccgcaa ggacucaaug uugggcacuc acauugucug ggacauagga uugcaaucga 2220
guugugugcu cugcgugcca uggaucaguc agacaaacua ccgcuucgug acgcaugacg 2280
cuuauacaga cgcuggguuu auuacaugcu gguaccaaac aaacauagug ucacccccag 2340
acaucccggc agacaguaca auccuauguu uuguuucagc uuguaaugau uucucggugc 2400
gcuuguuaag ggacacgcca uucauaucac aaaacgcacu ucuccaaaau gacccggcua 2460
cugccauugu uagaucagug gaacgggugg ccgauaccau agcaaguggc ccaaugaauu 2520
ccgagagagu cccagcauug acugccgucg agacggguca cacaucucaa guuguuccca 2580
gugauacuau gcaaaccagg cauguuguua accaucacau uagaucggaa ucuucaauag 2640
agaauuuucu gaguagaucg gcaugcguuu acauugaugu guauggcaca aaagagaaug 2700
gugacaucga acguuucacu aacuggaaga ucaacacacg ccagguuguu cagcugaggc 2760
gcaagcugga gauguucacu uacaucagau uugaugugga aauaacauuc guaauuacaa 2820
guacucaagg gacaucaacc caaacaagca cuggcacccc agugcucaca caucaaguga 2880
uguaugugcc acccggaggc cccauacccg cgucauauga ggauuauagc uggcaaacuu 2940
cgacaaaccc cagcguuuuc uggacagaag ggaaugcacc ggcucgcaug ucaauacccu 3000
uuaugagugu gggcaaugcc uauugcaacu uuuaugaugg cuggucacau uucucgcaau 3060
ccggcgugua ugguuucacu acccugaaca acaugggaca gcuguuuuuc agacauguga 3120
auaaggacac acuuggcccu uacaacagca cagugcgugu cuauuucaaa ccaaagcaca 3180
ucaaagcaug ggugcccaga ccaccgcguc uaugcgauua uguguaugca cauaaugucg 3240
auuucacccc cagaggaguc acggacauaa gggaaaagau cacacuggaa agagacgacc 3300
acacgccuuc gaugguaaac cacggugcuu uuggacagca gucuggcgcc auuuacgugg 3360
guaacuacag agugguaaau aggcaccugg ccaccuaugc cgauuggcag aauugcgugu 3420
gggaagauua uaauagagac cucuuaguga gcacaaccac agcgcacggg ugugacacca 3480
ucgcuaggug ucaaugcugc acgggugucu acuuuugugc cucaaggaac aagcacuacc 3540
caguuagcuu ugaagggcca ggccuagugg aaguucagga gagugaguau uacccaaaga 3600
gauaccaguc ccacgugcug uuagccgcag gguuuucuga accaggagac ugugguggaa 3660
uucucaggug cgagcauggu guuaucggac uaguuaccau ggguggcgaa ggcguagucg 3720
gcuuugcuga ugugcgcgac cugcuguggu uggaggauga ugcaauggaa caagggguca 3780
aggguuaugu agaacaauug ggcaaugccu ucgguuccgg guucaccaau caaaucugcg 3840
aacaagucaa ccuccucaaa gaaucacuag ugggccaaga uuccauacua gagaaguccc 3900
uuaaagcucu ugugaaaauc auuucagcac ugguaauagu agugaggaac caugaugacu 3960
uaauuacugu gacugccacc cucgcucuaa uuggcugcac cucaucgccg uggcgguggc 4020
uuaaacagaa ggugucacag uauuacggga uacccauggc ugagcgacaa aacaacgggu 4080
ggcucaaaaa guuuacagag augaccaaug ccugcaaagg gauggagugg auugccguca 4140
agauccaaaa guuuauagaa uggcucaaga uuaaaaucuu accagaggua aaggagaagc 4200
augaguuccu aaccagacuu aaacaacucc cccuucugga aagccaaauu gccaccauug 4260
aacaaagugc accgucccag agugaucagg aacaacucuu cucaaauguu caauacuucg 4320
cccacuacug cagaaaguac gcaccucugu augcuacuga ggccaaaaga guguucuccc 4380
uugagaagaa aaugaguaac uacauacagu ucaaguccaa augccguauu gaaccaguau 4440
guuugcuauu gcacgggagu ccuggagcug ggaaaucggu ugccaccaac uuaauugggc 4500
gaucucuagc ugagaaguug aacaguucag uguauucucu accaccagac ccugaccacu 4560
ucgauggcua uaaacaacaa gccguuguga uuauggacga ccuaugccaa aauccagaug 4620
ggaaggaugu gucauuauuu ugucagaugg ugucgagugu ugacuuuguc ccaccaaugg 4680
cugccuugga agaaaaagga auuuuguuua ccucucccuu ugucuuggcc ucaacuaaug 4740
cugguuccau caaugccccg acggugucag acagcagggc uuuggcuaga agauuccacu 4800
uugacaugaa caucgagguu auaucaaugu acagccagaa uggcaagauu aacaugccca 4860
ugucagucaa aacaugcgac gaagagugcu guccaguuaa cuucaaaaag uguugccccc 4920
uugugugugg aaaagccaua caguuuauag auagaagaac ucaagugagg uacuccuugg 4980
acauguuggu cacugagaug uuuagggagu acaaccauag gcacagcguc ggggcaaccc 5040
uugaggcacu auuucaaggu ccaccaguau acagggagau caaaauuacu guugcaccug 5100
auaccccacc accaccagcu auugcauacc uacugaaauc auuggacagu gaagcaguua 5160
gggaguacug uaaagagaau ggauggcucg uuccugaaau uagcucuacc cuucauauug 5220
aaaaacaugu aagccgagcc uuuaucuguc uccaggcacu gacaacuuuu guauccgugg 5280
ccgguauuau cuacaucauu uauaaacuau uugcaggguu ucaaggcgcc uacacaggga 5340
ugcccaacca aaagccaaaa auacccacac uaaggcaagc caaggugcag ggaccugcuu 5400
gugaguuugc uguagccaug augaagagaa acuccaucac agugaagaca gaguauggug 5460
aguuuacaau guugggcauc uacgacaggu gggccguacu accacgccau gcaaaacccg 5520
ggccaaccau ccuuaugaau gaccaggaag uuggcguacu agaugcaaaa gaacuagugg 5580
auaaagaugg cacaaaccuu gaacugacgc uguugaagcu ugaccggaau gaaaaguuca 5640
gagacaucag agguuuccug gccaaggaag aaguggaggu caaugaagcu guucuagcaa 5700
uaaacaccag caaguucccg aacauguaca uaccaguugg gcaaguaaca gacuacgguu 5760
uccugaaccu ggggggcacu ccgacgaaaa gaaugcucau guacaauuuu ccuaccagag 5820
cuggccaaug uggugguauu cuuaugucua cugguaaggu guuggggaua cacguuggug 5880
gaaauggcca ccagggcuuc ucagcagcuc uccuuaaaca cuacuucaau gaugaacaag 5940
gugagauuga auuuauugaa agcucaaagg aagcagguuu cccagucauu aauacuccaa 6000
gcaagacuaa auuggaacca agugucuucc accaaguguu ugaaggcaac aaggaaccug 6060
caguucucag gaauggugau ccacgacuca aagcaaauuu ugaggaggca aucuuuucca 6120
aauauauugg uaaugugaac acacacguag augaguacau gauggaagcc guggaucacu 6180
acgcaggaca auuggccaca cuggacauua auacggaacc uaugaaauug gaggaugcag 6240
uguauggcac agagggguug gaggcacuug aucuaaccac cagugcaggg uacccguaug 6300
uagcacuggg caucaagaag agagacaucu ugucuaagaa gaccagagau cugacuaaau 6360
uaaaggagug uauggacaaa uauggucuaa accuuccgau ggugaccuau gugaaggaug 6420
agcucagauc agcagaaaaa guggcuaaag gcaagucuag acuuauugag gcauccagcc 6480
ugaacgacuc uguagcgaug agacaaacuu uuggcaaucu guacagaaca uuucauuuga 6540
acccagggau uguaacuggc agugcaguug ggugugaucc ugaccuuuuc uggagcaaaa 6600
uaccuguaau gcuagaugga caucucauag ccuuugauua cucuggauau gaugccaguu 6660
ugagccccgu gugguuugcu uguuugaagc uauugcuaga aaaacuagga uacucacaca 6720
aagaaacaaa uuacauugac uauuugugca auucccacca uuuguacaga gacaagcauu 6780
acuucgugcg uggcggcaug ccaucagguu gcuccgguac cagcaucuuc aacucaauga 6840
ucaacaacau cauaaucagg acgcuaaugu ugaaggugua caaaggaauu gaccuggauc 6900
gauucagaau gauugccuau ggcgaugaug uuauugcguc uuaccccugg ccaaucgaug 6960
ccucuuuacu ugcugaagcc ggcaaggggu augggcugau caugacacca gcagauaaag 7020
gggaguguuu uaaugaaguc accuggacua augucaccuu uuugaagaga uauuucagag 7080
cagaugagca auaccccuuu gugguccauc cuguuauccc aaugaaagac auccaugaau 7140
caauuagaug gacaaaagac ccaaagaaca cccaagacca ugugcgcucu uugugcuugu 7200
uggccuggca caauggggag cacgaauaug aggaauucau caagaagauc agaagcgucc 7260
cagucgggcg cugucuaacc cuuccugcgu uuuggacccu gcgcaggaaa ugguuggauu 7320
ccuuuuagau uagagacaca gcugguugaa ggggaccaac gauacagcug guugaagggg 7380
accaaaccgg uccacacacu uccuuacauu ccaucaccca cacacuuccu uacauuccaa 7440
auuuucugca auuugaauug gcuuaacccu accacacuca ccgaacuaga caacggugug 7500
guagggguaa auucuccgca uucggugcgg 7530
<210> 15
<211> 7905
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> genome sequence of ECHO25-GM-CSF
<400> 15
uuaaaacagc cuguggguug uucccaccca uagggcccac ugggcgcuag cacacuggua 60
uugugguacc uuugugcgcc uguuuuaucu accccucccc caaacgugac uuagaagcuc 120
aacacaugug gucagcaggu ggcccaguau accaacuggg ucuugaucaa gcacuucugu 180
uaccccggac cgaguaucaa uaggcugcuc acgcggcuga aggagaaagu guucguuauc 240
cggccaauua cuacgagaaa ccuaguacca ccauggaagu ugcgcggcgu uucgcuccgc 300
acaaccccag uguagaucag gccgaugagu caccgcacuc cucacgggcg accguggcgg 360
uggcugcgcu ggcggccugc ccauggggca acccauggga cgcuucaaua ccgacauggu 420
gugaagaguc uauugugcua auugguaauc cuccggcccc ugaaugcggc uaaucccaac 480
ugcggagcag auacccacau gccagugggc agucugucgu aacggguaac ucugcagcgg 540
aaccgacuac uuuggguguc cguguuucuu uuuauucuuu auuggcugcu uauggugaca 600
auugagagau uguugccaua uagcuauugg auuggccauc cggugacaaa cagaacaaua 660
guuuaucuau uuguugguuu cauaccauua aauuuuaaag uauuaaagac uaucaacuug 720
aucauacuac uuaauacagc aaaaugggag cucauguguc aacgcagaaa accggagcgc 780
augagacugg uuugagcgcc agugggaauu cgguuauuca uuacacaaca ucaauuauua 840
caaggaugca ucuucaaauu cagcaaacag gcaagacuuu ucacaagacc ccagcaaauu 900
uaccgaaccc uaugaaggau gucaugauua aaucacuccc ggcguuaaau ucacccacug 960
uggaggaaug uggcuacagu gaccgggugc gcuccauuac uuuggguaau ucaacaauca 1020
cuacgcagga aagugcaaau gugguaguug gcuauggugu cuggccggag uauuugaggg 1080
augaggaagc cacggcacaa gaccaaccca cucaaccaga uguugccacc uguagauucu 1140
acacccuaga aucuguuaug ugggagaagu ccucggcggg cugguggugg aaguuuccag 1200
augcucuugc agagaugggc cuauucgguc aaaauaugcu auaccauuau uugggaaggu 1260
caggcuacac aauacacgug caaugcaaug cgucaaaauu ccaccaaggg ugccuucuug 1320
uagucugugu gccagaagcc gagauggguu cugcacagcu ugauaggaca uugaaucaua 1380
ccaaacuuag caacacagaa cacgccagca cauucggguc caugaguucc aaugaagcug 1440
gggccgucca aaauguagug cacaaugccg ggaugggcgu uggagugggu aacuugacca 1500
ucuacccuca ucaguggauu aaucuuagaa ccaacaauug ugccaccaua guaaugccgu 1560
acauaaacag ugugccaaug gauaauaugu uuaggcauua caauuucacc cuuaugguga 1620
uuccauucgc acagcuugau uaugcaccca gcgcguccac ucacguucca auaaccguga 1680
caguugcccc caugugugcc gaauacaacg ggcuaagauu ggcagguaaa cagggcuuac 1740
caacaaugcu cacuccaggu agcaaccagu uccucacguc ugaugauuuc caguccccau 1800
cagcaaugcc acaguuugau guaacgccgg agauugaaau ccccggugac gugaagaauu 1860
uaauggaaau ggcugaaguu gauucugugg ucccagugaa uaaucuggau gauaagguaa 1920
auucaauuga agcuuauaca auccccguca aaucaaugag ugguauugcg acacaagucg 1980
uuggguucca auuacaaccc ggggacgaua gugcguuuaa gaggacacug uuaggagaga 2040
uuuugaacua cuuugcaaau uggucgggaa uuaucaaacu gacauuccca uacugcggug 2100
cggcgaugac cacuggcaca uuccugaucg ccuacucccc uccuggugcu ggcuucccug 2160
cuaaccgcaa ggacucaaug uugggcacuc acauugucug ggacauagga uugcaaucga 2220
guugugugcu cugcgugcca uggaucaguc agacaaacua ccgcuucgug acgcaugacg 2280
cuuauacaga cgcuggguuu auuacaugcu gguaccaaac aaacauagug ucacccccag 2340
acaucccggc agacaguaca auccuauguu uuguuucagc uuguaaugau uucucggugc 2400
gcuuguuaag ggacacgcca uucauaucac aaaacgcacu ucuccaaaau gacccggcua 2460
cugccauugu uagaucagug gaacgggugg ccgauaccau agcaaguggc ccaaugaauu 2520
ccgagagagu cccagcauug acugccgucg agacggguca cacaucucaa guuguuccca 2580
gugauacuau gcaaaccagg cauguuguua accaucacau uagaucggaa ucuucaauag 2640
agaauuuucu gaguagaucg gcaugcguuu acauugaugu guauggcaca aaagagaaug 2700
gugacaucga acguuucacu aacuggaaga ucaacacacg ccagguuguu cagcugaggc 2760
gcaagcugga gauguucacu uacaucagau uugaugugga aauaacauuc guaauuacaa 2820
guacucaagg gacaucaacc caaacaagca cuggcacccc agugcucaca caucaaguga 2880
uguaugugcc acccggaggc cccauacccg cgucauauga ggauuauagc uggcaaacuu 2940
cgacaaaccc cagcguuuuc uggacagaag ggaaugcacc ggcucgcaug ucaauacccu 3000
uuaugagugu gggcaaugcc uauugcaacu uuuaugaugg cuggucacau uucucgcaau 3060
ccggcgugua ugguuucacu acccugaaca acaugggaca gcuguuuuuc agacauguga 3120
auaaggacac acuuggcccu uacaacagca cagugcgugu cuauuucaaa ccaaagcaca 3180
ucaaagcaug ggugcccaga ccaccgcguc uaugcgauua uguguaugca cauaaugucg 3240
auuucacccc cagaggaguc acggacauaa gggaaaagau cacacuggaa agagacgacc 3300
acacgccuuc gaugguaaac cacggugcuu uuggacagca guggcugcag agccugcugc 3360
ucuugggcac uguggccugc agcaucucug cacccgcccg cucgcccagc cccagcacgc 3420
agcccuggga gcaugugaau gccauccagg aggcccggcg ucuccugaac cugaguagag 3480
acacugcugc ugagaugaau gaaacaguag aagucaucuc agaaauguuu gaccuccagg 3540
agccgaccug ccuacagacc cgccuggagc uguacaagca gggccugcgg ggcagccuca 3600
ccaagcucaa gggccccuug accaugaugg ccagccacua caagcagcac ugcccuccaa 3660
ccccggaaac uuccugugca acccagauua ucaccuuuga aaguuucaaa gagaaccuga 3720
aggacuuucu gcuugucauc cccuuugacu gcugggagcc aguccaggag gacgaccaca 3780
cgccuucgau gguaaaccac ggugcuuuug gacagcaguc uggcgccauu uacgugggua 3840
acuacagagu gguaaauagg caccuggcca ccuaugccga uuggcagaau ugcguguggg 3900
aagauuauaa uagagaccuc uuagugagca caaccacagc gcacgggugu gacaccaucg 3960
cuagguguca augcugcacg ggugucuacu uuugugccuc aaggaacaag cacuacccag 4020
uuagcuuuga agggccaggc cuaguggaag uucaggagag ugaguauuac ccaaagagau 4080
accaguccca cgugcuguua gccgcagggu uuucugaacc aggagacugu gguggaauuc 4140
ucaggugcga gcaugguguu aucggacuag uuaccauggg uggcgaaggc guagucggcu 4200
uugcugaugu gcgcgaccug cugugguugg aggaugaugc aauggaacaa ggggucaagg 4260
guuauguaga acaauugggc aaugccuucg guuccggguu caccaaucaa aucugcgaac 4320
aagucaaccu ccucaaagaa ucacuagugg gccaagauuc cauacuagag aagucccuua 4380
aagcucuugu gaaaaucauu ucagcacugg uaauaguagu gaggaaccau gaugacuuaa 4440
uuacugugac ugccacccuc gcucuaauug gcugcaccuc aucgccgugg cgguggcuua 4500
aacagaaggu gucacaguau uacgggauac ccauggcuga gcgacaaaac aacggguggc 4560
ucaaaaaguu uacagagaug accaaugccu gcaaagggau ggaguggauu gccgucaaga 4620
uccaaaaguu uauagaaugg cucaagauua aaaucuuacc agagguaaag gagaagcaug 4680
aguuccuaac cagacuuaaa caacuccccc uucuggaaag ccaaauugcc accauugaac 4740
aaagugcacc gucccagagu gaucaggaac aacucuucuc aaauguucaa uacuucgccc 4800
acuacugcag aaaguacgca ccucuguaug cuacugaggc caaaagagug uucucccuug 4860
agaagaaaau gaguaacuac auacaguuca aguccaaaug ccguauugaa ccaguauguu 4920
ugcuauugca cgggaguccu ggagcuggga aaucgguugc caccaacuua auugggcgau 4980
cucuagcuga gaaguugaac aguucagugu auucucuacc accagacccu gaccacuucg 5040
auggcuauaa acaacaagcc guugugauua uggacgaccu augccaaaau ccagauggga 5100
aggauguguc auuauuuugu cagauggugu cgaguguuga cuuuguccca ccaauggcug 5160
ccuuggaaga aaaaggaauu uuguuuaccu cucccuuugu cuuggccuca acuaaugcug 5220
guuccaucaa ugccccgacg gugucagaca gcagggcuuu ggcuagaaga uuccacuuug 5280
acaugaacau cgagguuaua ucaauguaca gccagaaugg caagauuaac augcccaugu 5340
cagucaaaac augcgacgaa gagugcuguc caguuaacuu caaaaagugu ugcccccuug 5400
uguguggaaa agccauacag uuuauagaua gaagaacuca agugagguac uccuuggaca 5460
uguuggucac ugagauguuu agggaguaca accauaggca cagcgucggg gcaacccuug 5520
aggcacuauu ucaaggucca ccaguauaca gggagaucaa aauuacuguu gcaccugaua 5580
ccccaccacc accagcuauu gcauaccuac ugaaaucauu ggacagugaa gcaguuaggg 5640
aguacuguaa agagaaugga uggcucguuc cugaaauuag cucuacccuu cauauugaaa 5700
aacauguaag ccgagccuuu aucugucucc aggcacugac aacuuuugua uccguggccg 5760
guauuaucua caucauuuau aaacuauuug caggguuuca aggcgccuac acagggaugc 5820
ccaaccaaaa gccaaaaaua cccacacuaa ggcaagccaa ggugcaggga ccugcuugug 5880
aguuugcugu agccaugaug aagagaaacu ccaucacagu gaagacagag uauggugagu 5940
uuacaauguu gggcaucuac gacagguggg ccguacuacc acgccaugca aaacccgggc 6000
caaccauccu uaugaaugac caggaaguug gcguacuaga ugcaaaagaa cuaguggaua 6060
aagauggcac aaaccuugaa cugacgcugu ugaagcuuga ccggaaugaa aaguucagag 6120
acaucagagg uuuccuggcc aaggaagaag uggaggucaa ugaagcuguu cuagcaauaa 6180
acaccagcaa guucccgaac auguacauac caguugggca aguaacagac uacgguuucc 6240
ugaaccuggg gggcacuccg acgaaaagaa ugcucaugua caauuuuccu accagagcug 6300
gccaaugugg ugguauucuu augucuacug guaagguguu ggggauacac guugguggaa 6360
auggccacca gggcuucuca gcagcucucc uuaaacacua cuucaaugau gaacaaggug 6420
agauugaauu uauugaaagc ucaaaggaag cagguuuccc agucauuaau acuccaagca 6480
agacuaaauu ggaaccaagu gucuuccacc aaguguuuga aggcaacaag gaaccugcag 6540
uucucaggaa uggugaucca cgacucaaag caaauuuuga ggaggcaauc uuuuccaaau 6600
auauugguaa ugugaacaca cacguagaug aguacaugau ggaagccgug gaucacuacg 6660
caggacaauu ggccacacug gacauuaaua cggaaccuau gaaauuggag gaugcagugu 6720
auggcacaga gggguuggag gcacuugauc uaaccaccag ugcaggguac ccguauguag 6780
cacugggcau caagaagaga gacaucuugu cuaagaagac cagagaucug acuaaauuaa 6840
aggaguguau ggacaaauau ggucuaaacc uuccgauggu gaccuaugug aaggaugagc 6900
ucagaucagc agaaaaagug gcuaaaggca agucuagacu uauugaggca uccagccuga 6960
acgacucugu agcgaugaga caaacuuuug gcaaucugua cagaacauuu cauuugaacc 7020
cagggauugu aacuggcagu gcaguugggu gugauccuga ccuuuucugg agcaaaauac 7080
cuguaaugcu agauggacau cucauagccu uugauuacuc uggauaugau gccaguuuga 7140
gccccgugug guuugcuugu uugaagcuau ugcuagaaaa acuaggauac ucacacaaag 7200
aaacaaauua cauugacuau uugugcaauu cccaccauuu guacagagac aagcauuacu 7260
ucgugcgugg cggcaugcca ucagguugcu ccgguaccag caucuucaac ucaaugauca 7320
acaacaucau aaucaggacg cuaauguuga agguguacaa aggaauugac cuggaucgau 7380
ucagaaugau ugccuauggc gaugauguua uugcgucuua ccccuggcca aucgaugccu 7440
cuuuacuugc ugaagccggc aagggguaug ggcugaucau gacaccagca gauaaagggg 7500
aguguuuuaa ugaagucacc uggacuaaug ucaccuuuuu gaagagauau uucagagcag 7560
augagcaaua ccccuuugug guccauccug uuaucccaau gaaagacauc caugaaucaa 7620
uuagauggac aaaagaccca aagaacaccc aagaccaugu gcgcucuuug ugcuuguugg 7680
ccuggcacaa uggggagcac gaauaugagg aauucaucaa gaagaucaga agcgucccag 7740
ucgggcgcug ucuaacccuu ccugcguuuu ggacccugcg caggaaaugg uuggauuccu 7800
uuuagauuag agacaauuuu cugcaauuug aauuggcuua acccuaccac acucaccgaa 7860
cuagacaacg gugugguagg gguaaauucu ccgcauucgg ugcgg 7905
<210> 16
<211> 8271
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> genome sequence of ECHO25-Anti-PD1
<400> 16
uuaaaacagc cuguggguug uucccaccca uagggcccac ugggcgcuag cacacuggua 60
uugugguacc uuugugcgcc uguuuuaucu accccucccc caaacgugac uuagaagcuc 120
aacacaugug gucagcaggu ggcccaguau accaacuggg ucuugaucaa gcacuucugu 180
uaccccggac cgaguaucaa uaggcugcuc acgcggcuga aggagaaagu guucguuauc 240
cggccaauua cuacgagaaa ccuaguacca ccauggaagu ugcgcggcgu uucgcuccgc 300
acaaccccag uguagaucag gccgaugagu caccgcacuc cucacgggcg accguggcgg 360
uggcugcgcu ggcggccugc ccauggggca acccauggga cgcuucaaua ccgacauggu 420
gugaagaguc uauugugcua auugguaauc cuccggcccc ugaaugcggc uaaucccaac 480
ugcggagcag auacccacau gccagugggc agucugucgu aacggguaac ucugcagcgg 540
aaccgacuac uuuggguguc cguguuucuu uuuauucuuu auuggcugcu uauggugaca 600
auugagagau uguugccaua uagcuauugg auuggccauc cggugacaaa cagaacaaua 660
guuuaucuau uuguugguuu cauaccauua aauuuuaaag uauuaaagac uaucaacuug 720
aucauacuac uuaauacagc aaaaugggag cucauguguc aacgcagaaa accggagcgc 780
augagacugg uuugagcgcc agugggaauu cgguuauuca uuacacaaca ucaauuauua 840
caaggaugca ucuucaaauu cagcaaacag gcaagacuuu ucacaagacc ccagcaaauu 900
uaccgaaccc uaugaaggau gucaugauua aaucacuccc ggcguuaaau ucacccacug 960
uggaggaaug uggcuacagu gaccgggugc gcuccauuac uuuggguaau ucaacaauca 1020
cuacgcagga aagugcaaau gugguaguug gcuauggugu cuggccggag uauuugaggg 1080
augaggaagc cacggcacaa gaccaaccca cucaaccaga uguugccacc uguagauucu 1140
acacccuaga aucuguuaug ugggagaagu ccucggcggg cugguggugg aaguuuccag 1200
augcucuugc agagaugggc cuauucgguc aaaauaugcu auaccauuau uugggaaggu 1260
caggcuacac aauacacgug caaugcaaug cgucaaaauu ccaccaaggg ugccuucuug 1320
uagucugugu gccagaagcc gagauggguu cugcacagcu ugauaggaca uugaaucaua 1380
ccaaacuuag caacacagaa cacgccagca cauucggguc caugaguucc aaugaagcug 1440
gggccgucca aaauguagug cacaaugccg ggaugggcgu uggagugggu aacuugacca 1500
ucuacccuca ucaguggauu aaucuuagaa ccaacaauug ugccaccaua guaaugccgu 1560
acauaaacag ugugccaaug gauaauaugu uuaggcauua caauuucacc cuuaugguga 1620
uuccauucgc acagcuugau uaugcaccca gcgcguccac ucacguucca auaaccguga 1680
caguugcccc caugugugcc gaauacaacg ggcuaagauu ggcagguaaa cagggcuuac 1740
caacaaugcu cacuccaggu agcaaccagu uccucacguc ugaugauuuc caguccccau 1800
cagcaaugcc acaguuugau guaacgccgg agauugaaau ccccggugac gugaagaauu 1860
uaauggaaau ggcugaaguu gauucugugg ucccagugaa uaaucuggau gauaagguaa 1920
auucaauuga agcuuauaca auccccguca aaucaaugag ugguauugcg acacaagucg 1980
uuggguucca auuacaaccc ggggacgaua gugcguuuaa gaggacacug uuaggagaga 2040
uuuugaacua cuuugcaaau uggucgggaa uuaucaaacu gacauuccca uacugcggug 2100
cggcgaugac cacuggcaca uuccugaucg ccuacucccc uccuggugcu ggcuucccug 2160
cuaaccgcaa ggacucaaug uugggcacuc acauugucug ggacauagga uugcaaucga 2220
guugugugcu cugcgugcca uggaucaguc agacaaacua ccgcuucgug acgcaugacg 2280
cuuauacaga cgcuggguuu auuacaugcu gguaccaaac aaacauagug ucacccccag 2340
acaucccggc agacaguaca auccuauguu uuguuucagc uuguaaugau uucucggugc 2400
gcuuguuaag ggacacgcca uucauaucac aaaacgcacu ucuccaaaau gacccggcua 2460
cugccauugu uagaucagug gaacgggugg ccgauaccau agcaaguggc ccaaugaauu 2520
ccgagagagu cccagcauug acugccgucg agacggguca cacaucucaa guuguuccca 2580
gugauacuau gcaaaccagg cauguuguua accaucacau uagaucggaa ucuucaauag 2640
agaauuuucu gaguagaucg gcaugcguuu acauugaugu guauggcaca aaagagaaug 2700
gugacaucga acguuucacu aacuggaaga ucaacacacg ccagguuguu cagcugaggc 2760
gcaagcugga gauguucacu uacaucagau uugaugugga aauaacauuc guaauuacaa 2820
guacucaagg gacaucaacc caaacaagca cuggcacccc agugcucaca caucaaguga 2880
uguaugugcc acccggaggc cccauacccg cgucauauga ggauuauagc uggcaaacuu 2940
cgacaaaccc cagcguuuuc uggacagaag ggaaugcacc ggcucgcaug ucaauacccu 3000
uuaugagugu gggcaaugcc uauugcaacu uuuaugaugg cuggucacau uucucgcaau 3060
ccggcgugua ugguuucacu acccugaaca acaugggaca gcuguuuuuc agacauguga 3120
auaaggacac acuuggcccu uacaacagca cagugcgugu cuauuucaaa ccaaagcaca 3180
ucaaagcaug ggugcccaga ccaccgcguc uaugcgauua uguguaugca cauaaugucg 3240
auuucacccc cagaggaguc acggacauaa gggaaaagau cacacuggaa agagacgacc 3300
acacgccuuc gaugguaaac cacggugcuu uuggacagca gaugaagcac cugugguucu 3360
uccugcugcu gguggccgcu ccuagguggg ugcuguccca ggugcagcug gugcagagcg 3420
gcguggaggu gaagaagccc ggcgcuuccg ugaagguguc cugcaaggcc uccggcuaca 3480
ccuucaccaa cuacuacaug uacuggguga ggcaggcccc uggacaggga cuggagugga 3540
ugggcggcau caacccuucc aacggcggca ccaacuucaa cgagaaguuc aagaaccggg 3600
ugacccugac caccgacucc uccaccacca ccgccuacau ggagcugaag ucccugcagu 3660
uugacgacac cgccguguac uacugcgcca ggagggacua ccgguucgac augggcuucg 3720
acuacugggg ccagggcaca accgugaccg uguccagcgg agguggcgga ucuggagggg 3780
gugguagcgg uggaggcggg agugagaucg ugcugaccca guccccugcu acacuguccc 3840
ugucccccgg cgagagggcu acacugagcu gcagggccuc caagggcgug uccaccuccg 3900
gcuacuccua ccugcacugg uaccagcaga agccuggaca ggcucccagg cugcugaucu 3960
accuggccuc cuaccuggag uccggcgugc cugcuagguu uuccggcagc ggcagcggca 4020
ccgauuucac ccugaccauc uccucccugg agcccgagga cuucgccgug uacuacugcc 4080
agcacuccag ggaucugccu cugaccuucg gcggcggcac caagguggag aucaaggacg 4140
accacacgcc uucgauggua aaccacggug cuuuuggaca gcagucuggc gccauuuacg 4200
uggguaacua cagaguggua aauaggcacc uggccaccua ugccgauugg cagaauugcg 4260
ugugggaaga uuauaauaga gaccucuuag ugagcacaac cacagcgcac gggugugaca 4320
ccaucgcuag gugucaaugc ugcacgggug ucuacuuuug ugccucaagg aacaagcacu 4380
acccaguuag cuuugaaggg ccaggccuag uggaaguuca ggagagugag uauuacccaa 4440
agagauacca gucccacgug cuguuagccg caggguuuuc ugaaccagga gacuguggug 4500
gaauucucag gugcgagcau gguguuaucg gacuaguuac cauggguggc gaaggcguag 4560
ucggcuuugc ugaugugcgc gaccugcugu gguuggagga ugaugcaaug gaacaagggg 4620
ucaaggguua uguagaacaa uugggcaaug ccuucgguuc cggguucacc aaucaaaucu 4680
gcgaacaagu caaccuccuc aaagaaucac uagugggcca agauuccaua cuagagaagu 4740
cccuuaaagc ucuugugaaa aucauuucag cacugguaau aguagugagg aaccaugaug 4800
acuuaauuac ugugacugcc acccucgcuc uaauuggcug caccucaucg ccguggcggu 4860
ggcuuaaaca gaagguguca caguauuacg ggauacccau ggcugagcga caaaacaacg 4920
gguggcucaa aaaguuuaca gagaugacca augccugcaa agggauggag uggauugccg 4980
ucaagaucca aaaguuuaua gaauggcuca agauuaaaau cuuaccagag guaaaggaga 5040
agcaugaguu ccuaaccaga cuuaaacaac ucccccuucu ggaaagccaa auugccacca 5100
uugaacaaag ugcaccgucc cagagugauc aggaacaacu cuucucaaau guucaauacu 5160
ucgcccacua cugcagaaag uacgcaccuc uguaugcuac ugaggccaaa agaguguucu 5220
cccuugagaa gaaaaugagu aacuacauac aguucaaguc caaaugccgu auugaaccag 5280
uauguuugcu auugcacggg aguccuggag cugggaaauc gguugccacc aacuuaauug 5340
ggcgaucucu agcugagaag uugaacaguu caguguauuc ucuaccacca gacccugacc 5400
acuucgaugg cuauaaacaa caagccguug ugauuaugga cgaccuaugc caaaauccag 5460
augggaagga ugugucauua uuuugucaga uggugucgag uguugacuuu gucccaccaa 5520
uggcugccuu ggaagaaaaa ggaauuuugu uuaccucucc cuuugucuug gccucaacua 5580
augcugguuc caucaaugcc ccgacggugu cagacagcag ggcuuuggcu agaagauucc 5640
acuuugacau gaacaucgag guuauaucaa uguacagcca gaauggcaag auuaacaugc 5700
ccaugucagu caaaacaugc gacgaagagu gcuguccagu uaacuucaaa aaguguugcc 5760
cccuugugug uggaaaagcc auacaguuua uagauagaag aacucaagug agguacuccu 5820
uggacauguu ggucacugag auguuuaggg aguacaacca uaggcacagc gucggggcaa 5880
cccuugaggc acuauuucaa gguccaccag uauacaggga gaucaaaauu acuguugcac 5940
cugauacccc accaccacca gcuauugcau accuacugaa aucauuggac agugaagcag 6000
uuagggagua cuguaaagag aauggauggc ucguuccuga aauuagcucu acccuucaua 6060
uugaaaaaca uguaagccga gccuuuaucu gucuccaggc acugacaacu uuuguauccg 6120
uggccgguau uaucuacauc auuuauaaac uauuugcagg guuucaaggc gccuacacag 6180
ggaugcccaa ccaaaagcca aaaauaccca cacuaaggca agccaaggug cagggaccug 6240
cuugugaguu ugcuguagcc augaugaaga gaaacuccau cacagugaag acagaguaug 6300
gugaguuuac aauguugggc aucuacgaca ggugggccgu acuaccacgc caugcaaaac 6360
ccgggccaac cauccuuaug aaugaccagg aaguuggcgu acuagaugca aaagaacuag 6420
uggauaaaga uggcacaaac cuugaacuga cgcuguugaa gcuugaccgg aaugaaaagu 6480
ucagagacau cagagguuuc cuggccaagg aagaagugga ggucaaugaa gcuguucuag 6540
caauaaacac cagcaaguuc ccgaacaugu acauaccagu ugggcaagua acagacuacg 6600
guuuccugaa ccuggggggc acuccgacga aaagaaugcu cauguacaau uuuccuacca 6660
gagcuggcca augugguggu auucuuaugu cuacugguaa gguguugggg auacacguug 6720
guggaaaugg ccaccagggc uucucagcag cucuccuuaa acacuacuuc aaugaugaac 6780
aaggugagau ugaauuuauu gaaagcucaa aggaagcagg uuucccaguc auuaauacuc 6840
caagcaagac uaaauuggaa ccaagugucu uccaccaagu guuugaaggc aacaaggaac 6900
cugcaguucu caggaauggu gauccacgac ucaaagcaaa uuuugaggag gcaaucuuuu 6960
ccaaauauau ugguaaugug aacacacacg uagaugagua caugauggaa gccguggauc 7020
acuacgcagg acaauuggcc acacuggaca uuaauacgga accuaugaaa uuggaggaug 7080
caguguaugg cacagagggg uuggaggcac uugaucuaac caccagugca ggguacccgu 7140
auguagcacu gggcaucaag aagagagaca ucuugucuaa gaagaccaga gaucugacua 7200
aauuaaagga guguauggac aaauaugguc uaaaccuucc gauggugacc uaugugaagg 7260
augagcucag aucagcagaa aaaguggcua aaggcaaguc uagacuuauu gaggcaucca 7320
gccugaacga cucuguagcg augagacaaa cuuuuggcaa ucuguacaga acauuucauu 7380
ugaacccagg gauuguaacu ggcagugcag uuggguguga uccugaccuu uucuggagca 7440
aaauaccugu aaugcuagau ggacaucuca uagccuuuga uuacucugga uaugaugcca 7500
guuugagccc cgugugguuu gcuuguuuga agcuauugcu agaaaaacua ggauacucac 7560
acaaagaaac aaauuacauu gacuauuugu gcaauuccca ccauuuguac agagacaagc 7620
auuacuucgu gcguggcggc augccaucag guugcuccgg uaccagcauc uucaacucaa 7680
ugaucaacaa caucauaauc aggacgcuaa uguugaaggu guacaaagga auugaccugg 7740
aucgauucag aaugauugcc uauggcgaug auguuauugc gucuuacccc uggccaaucg 7800
augccucuuu acuugcugaa gccggcaagg gguaugggcu gaucaugaca ccagcagaua 7860
aaggggagug uuuuaaugaa gucaccugga cuaaugucac cuuuuugaag agauauuuca 7920
gagcagauga gcaauacccc uuuguggucc auccuguuau cccaaugaaa gacauccaug 7980
aaucaauuag auggacaaaa gacccaaaga acacccaaga ccaugugcgc ucuuugugcu 8040
uguuggccug gcacaauggg gagcacgaau augaggaauu caucaagaag aucagaagcg 8100
ucccagucgg gcgcugucua acccuuccug cguuuuggac ccugcgcagg aaaugguugg 8160
auuccuuuua gauuagagac aauuuucugc aauuugaauu ggcuuaaccc uaccacacuc 8220
accgaacuag acaacggugu gguaggggua aauucuccgc auucggugcg g 8271
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA sequence of the target sequence for miR-133
<400> 17
acagctggtt gaaggggacc aa 22
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA sequence of the target sequence for miR-206
<400> 18
ccacacactt ccttacattc ca 22
<210> 19
<211> 102
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA sequence containing target sequences for miR-133 and miR-206 intandem
<400> 19
acagctggtt gaaggggacc aacgatacag ctggttgaag gggaccaaac cggtccacac 60
acttccttac attccatcac ccacacactt ccttacattc ca 102
<210> 20
<211> 507
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA sequence of IRES for HRV2
<400> 20
aacttagaag tttttcacaa agaccaatag ccggtaatca gccagattac tgaaggtcaa 60
gcacttctgt ttccccggtc aatgttgata tgctccaaca gggcaaaaac aactgcgatc 120
gttaaccgca aagcgcctac gcaaagctta gtagcatctt tgaaatcgtt tggctggtcg 180
atccgccatt tcccctggta gacctggcag atgaggctag aaatacccca ctggcgacag 240
tgttctagcc tgcgtggctg cctgcacacc ctatgggtgt gaagccaaac aatggacaag 300
gtgtgaagag ccccgtgtgc tcgctttgag tcctccggcc cctgaatgtg gctaacctta 360
accctgcagc tagagcacgt aacccaatgt gtatctagtc gtaatgagca attgcgggat 420
gggaccaact actttgggtg tccgtgtttc actttttcct ttatatttgc ttatggtgac 480
aatatataca atatatatat tggcacc 507

Claims (10)

1.埃可病毒25型(ECHO25)或其修饰形式或一种核酸分子，用于在受试者中治疗肿瘤的用途，或者用于制备在受试者中治疗肿瘤的药物的用途；其中，所述核酸分子包含选自下列的序列：
(1)ECHO25或其修饰形式的基因组序列或cDNA序列；和
(2)所述基因组序列或cDNA序列的互补序列。
2.权利要求1的用途，其中，所述ECHO25为野生型ECHO25；
优选地，所述ECHO25是从感染埃可病毒25型的个体中分离得到的临床分离毒株；
优选地，所述ECHO25或其修饰形式的基因组序列与如SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性；更优选地，所述ECHO25或其修饰形式的基因组序列为如SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列；
优选地，所述ECHO25或其修饰形式的cDNA序列与如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性；更优选地，所述ECHO25或其修饰形式的cDNA序列为如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
3.权利要求1或2的用途，其中，所述修饰形式为经修饰的ECHO25，其与野生型ECHO25相比在基因组中具有一个或多个核苷酸的替换、插入或删除；
优选地，所述经修饰的ECHO25与野生型ECHO25相比，具有一个或多个选自下列的修饰：
(1)位于非翻译区(例如5’UTR或3’UTR)的一个或多个突变；
(2)一个或多个外源核酸的插入；
(3)一个或多个内源基因的缺失或突变；和
(4)上述三项的任意组合；
优选地，所述经修饰的ECHO25包括位于5’非翻译区(5’UTR)的一个或多个突变；
优选地，所述经修饰的ECHO25的5’UTR中的内部核糖体进入位点(IRES)序列替换为外源IRES序列，例如人鼻病毒2(HRV2)的内部核糖体进入位点序列；
优选地，所述人鼻病毒2(HRV2)的内部核糖体进入位点序列如SEQ ID NO：2所示；
优选地，所述经修饰的ECHO25包含外源核酸；
优选地，所述外源核酸编码细胞因子(例如GM-CSF，优选为人GM-CSF)、或抗肿瘤蛋白或多肽(例如，抗PD-1或PD-L1的scFv，优选为抗人PD-1或PD-L1的scFv)；
优选地，所述外源核酸包含一个或多个(例如2个，3个或4个)微小RNA的靶序列；优选地，所述外源核酸包含miR-133和/或miR-206的靶序列；优选地，所述miR-133的靶序列如SEQ ID NO:3所示；优选地，所述miR-206的靶序列如SEQ ID NO:4所示。
优选地，所述经修饰的ECHO25具有以下特征中的一项：
1)所述经修饰的ECHO25的基因组序列与选自下列的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性：如SEQ ID NO：13-16所示的核苷酸序列；优选地，所述经修饰的ECHO25的基因组序列选自如SEQ ID NO：13-16任一项所示的核苷酸序列；和
2)所述经修饰的ECHO25的cDNA序列与选自下列的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性：如SEQ ID NO：8-11所示的核苷酸序列；优选地，所述经修饰的ECHO25的cDNA序列选自如SEQ ID NO：8-11任一项所示的核苷酸序列。
4.权利要求1-3任一项的用途，其中，所述核酸分子具有以下特征中的一项：
1)所述核酸分子由所述ECHO25或其修饰形式的基因组序列或cDNA序列，或所述基因组序列或cDNA序列的互补序列组成；优选地，所述核酸分子具有所述ECHO25或其修饰形式的基因组序列；优选地，所述核酸分子具有如SEQ ID NO:12-16任一项所示的核苷酸序列；
2)所述核酸分子为包含所述ECHO25或其修饰形式的基因组序列或cDNA序列，或所述基因组序列或cDNA序列的互补序列的载体(例如，克隆载体或表达载体)；优选地，所述核酸分子为包含所述ECHO25或其修饰形式的cDNA序列，或所述cDNA序列的互补序列的载体(例如，克隆载体或表达载体)。
5.权利要求1-4任一项的用途，其中，所述药物包含治疗有效量的所述ECHO25和/或其修饰形式，或治疗有效量的所述核酸分子；
优选地，所述药物还包含具有抗肿瘤活性的另外的药学活性剂，例如另外的溶瘤病毒、化学治疗剂或免疫治疗剂；
优选地，所述另外的溶瘤病毒选自疱疹病毒、腺病毒、细小病毒、呼肠孤病毒、新城疫病毒、水疱性口炎病毒、麻疹病毒或其任意组合；
优选地，所述化学治疗剂选自5-氟尿嘧啶、丝裂霉素、甲氨蝶呤、羟基脲、环磷酰胺、达卡巴嗪、米托蒽醌、蒽环类(如表柔比星或多柔比星)、依托泊苷、铂类化合物(如卡铂或顺铂)、紫杉烷类(如紫杉醇或紫杉特尔)或其任意组合；
优选地，所述免疫治疗剂选自免疫卡控点抑制剂(如PD-L1/PD-1抑制剂或CTLA-4抑制剂)、肿瘤特异性靶向抗体(如利妥昔单抗或赫赛汀)或其任意组合。
6.权利要求1-5任一项的用途，其中，所述肿瘤选自胃癌、肝癌、卵巢癌(如卵巢非透明细胞癌)、子宫内膜癌、黑色素瘤、前列腺癌、神经胶质瘤、食管癌、膀胱癌、淋巴瘤(如组织细胞性淋巴瘤)、白血病(如慢性髓系白血病)、横纹肌肉瘤、结直肠癌、非小细胞肺癌(如非小细胞肺腺癌)、宫颈癌(如HPV阴性宫颈癌)、乳腺癌(如乳腺髓样癌)、肾癌(如肾透明细胞癌)和胰腺癌；
优选地，所述肿瘤为胃癌、肝癌、卵巢癌(如卵巢非透明细胞癌)、子宫内膜癌、宫颈癌(如HPV阴性宫颈癌)、黑色素瘤、乳腺癌(如乳腺髓样癌)、前列腺癌、神经胶质瘤、食管癌、膀胱癌、淋巴瘤(如组织细胞性淋巴瘤)或白血病(如慢性髓系白血病)。
7.一种经修饰的ECHO25，其与野生型ECHO25相比，5’UTR中的内部核糖体进入位点(IRES)序列替换为人鼻病毒2(HRV2)的内部核糖体进入位点序列；
优选地，所述经修饰的ECHO25具有以下特征中的至少一项：
1)所述人鼻病毒2(HRV2)的内部核糖体进入位点序列如SEQ ID NO：2所示；
2)所述野生型ECHO25的基因组序列与如SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性；优选地，所述野生型ECHO25的基因组序列为如SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列；
3)所述野生型ECHO25的cDNA序列与如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性；优选地，所述野生型ECHO25的cDNA序列为如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；
优选地，所述经修饰的ECHO25还包含外源核酸；
优选地，所述外源核酸编码细胞因子(例如GM-CSF，优选为人GM-CSF)、或抗肿瘤蛋白或多肽(例如，抗PD-1或PD-L1的scFv，优选为抗人PD-1或PD-L1的scFv)；
优选地，所述外源核酸包含一个或多个(例如2个，3个或4个)微小RNA的靶序列；优选地，所述外源核酸包含miR-133和/或miR-206的靶序列；优选地，所述miR-133的靶序列如SEQ ID NO:3所示；优选地，所述miR-206的靶序列如SEQ ID NO:4所示。
8.权利要求7的经修饰的ECHO25，其中，所述经修饰的ECHO25具有以下特征中的一项：
1)所述经修饰的ECHO25的基因组序列与如SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性；优选地，所述经修饰的ECHO25的基因组序列为如SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列；
2)所述经修饰的ECHO25的cDNA序列与如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性；优选地，所述经修饰的ECHO25的cDNA序列为如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。
9.一种核酸分子，其包含选自下列的序列：
(1)权利要求7或8所述的经修饰的ECHO25的基因组序列或cDNA序列；和
(2)所述基因组序列或cDNA序列的互补序列；
优选地，所述核酸分子具有以下特征中的一项：
1)所述核酸分子由所述经修饰的ECHO25的基因组序列或cDNA序列，或所述基因组序列或cDNA序列的互补序列组成；优选地，所述核酸分子具有所述经修饰的ECHO25的基因组序列；优选地，所述核酸分子具有如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列；
2)所述核酸分子为包含所述经修饰的ECHO25的基因组序列或cDNA序列，或所述基因组序列或cDNA序列的互补序列的载体(例如，克隆载体或表达载体)；优选地，所述核酸分子为包含所述经修饰的ECHO25的cDNA序列，或所述cDNA序列的互补序列的载体(例如，克隆载体或表达载体)。
10.权利要求7或8的经修饰的ECHO25或权利要求9的核酸分子，用于在受试者中治疗肿瘤的用途，或者用于制备在受试者中治疗肿瘤的药物的用途；
优选地，所述肿瘤选自胃癌、肝癌、卵巢癌(如卵巢非透明细胞癌)、子宫内膜癌、黑色素瘤、前列腺癌、神经胶质瘤、食管癌、膀胱癌、淋巴瘤(如组织细胞性淋巴瘤)、白血病(如慢性髓系白血病)、咽鳞癌、甲状腺癌、横纹肌肉瘤、结直肠癌、非小细胞肺癌(如非小细胞肺腺癌)、宫颈癌(如HPV阴性宫颈癌)、乳腺癌(如乳腺髓样癌)、肾癌(如肾透明细胞癌)和胰腺癌；
优选地，所述肿瘤为胃癌、肝癌、卵巢癌(如卵巢非透明细胞癌)、子宫内膜癌、宫颈癌(如HPV阴性宫颈癌)、黑色素瘤、乳腺癌(如乳腺髓样癌)、前列腺癌、神经胶质瘤、食管癌、膀胱癌、淋巴瘤(如组织细胞性淋巴瘤)、白血病(如慢性髓系白血病)、咽鳞癌或甲状腺癌。
CN201710734483.1A 2017-08-24 2017-08-24 一种用于治疗肿瘤的埃可病毒 Active CN109419818B (zh)

Priority Applications (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710734483.1A CN109419818B (zh) 2017-08-24 2017-08-24 一种用于治疗肿瘤的埃可病毒
JP2020531804A JP7373168B2 (ja) 2017-08-24 2018-08-15 腫瘍を治療するためのエコーウイルス
EP18849336.5A EP3674398A4 (en) 2017-08-24 2018-08-15 ECHOVIRUS FOR TUMOR TREATMENT
PCT/CN2018/100708 WO2019037642A1 (zh) 2017-08-24 2018-08-15 一种用于治疗肿瘤的埃可病毒
KR1020207008441A KR20200090146A (ko) 2017-08-24 2018-08-15 종양 치료용 에코바이러스
CA3073770A CA3073770A1 (en) 2017-08-24 2018-08-15 An echovirus for treatment of tumors
US16/641,117 US11707496B2 (en) 2017-08-24 2018-08-15 Echovirus for treatment of tumors
AU2018320550A AU2018320550A1 (en) 2017-08-24 2018-08-15 Echovirus for treating tumor

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710734483.1A CN109419818B (zh) 2017-08-24 2017-08-24 一种用于治疗肿瘤的埃可病毒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109419818A true CN109419818A (zh) 2019-03-05
CN109419818B CN109419818B (zh) 2021-08-10

Family

ID=65439346

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710734483.1A Active CN109419818B (zh) 2017-08-24 2017-08-24 一种用于治疗肿瘤的埃可病毒

Country Status (8)

Country Link
US (1) US11707496B2 (zh)
EP (1) EP3674398A4 (zh)
JP (1) JP7373168B2 (zh)
KR (1) KR20200090146A (zh)
CN (1) CN109419818B (zh)
AU (1) AU2018320550A1 (zh)
CA (1) CA3073770A1 (zh)
WO (1) WO2019037642A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113302307A (zh) * 2019-11-26 2021-08-24 南克维斯特公司 原代nk car构建体和方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111867609A (zh) * 2018-03-12 2020-10-30 梅约医学教育与研究基金会 用感染性核酸治疗癌症

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1784242A (zh) * 2002-12-18 2006-06-07 维若塔歌私人有限公司 通过小核糖核酸病毒直接介导的溶瘤作用治疗受试者恶性肿瘤的方法
CN101132798A (zh) * 2005-01-17 2008-02-27 溶瘤病毒有限公司 治疗肿瘤的方法和组合物
CN105518128A (zh) * 2013-07-16 2016-04-20 迪特桑有限公司 遗传稳定的溶瘤性rna病毒、其制备方法及用途

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2125032A4 (en) 2007-02-20 2011-02-23 Mayo Foundation TREATMENT OF CANCER USING VIRAL NUCLEIC ACID
RU2436873C2 (ru) 2010-01-20 2011-12-20 Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "РОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ ЗАОЧНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ" Устройство для нанесения покрытий
WO2012094386A1 (en) 2011-01-04 2012-07-12 Jennerex Inc. Generation of antibodies to tumor antigens and generation of tumor specific complement dependent cytotoxicity by administration of oncolytic vaccinia virus
RU2496873C1 (ru) * 2012-06-04 2013-10-27 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Новосибирский национальный исследовательский государственный университет" (НГУ) ШТАММ ЭНТЕРОВИРУСА КОКСАКИ В6, СЕЛЕКТИВНО ИНФИЦИРУЮЩИЙ И ЛИЗИРУЮЩИЙ ОПУХОЛЕВЫЕ КЛЕТКИ ЧЕЛОВЕКА in vitro
EP2987858B1 (en) 2013-04-17 2019-08-14 Kyushu University, National University Corporation Gene-modified coxsackievirus
CN107669707A (zh) 2017-11-16 2018-02-09 邹罡 埃可病毒作为溶瘤病毒在抗肿瘤中的应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1784242A (zh) * 2002-12-18 2006-06-07 维若塔歌私人有限公司 通过小核糖核酸病毒直接介导的溶瘤作用治疗受试者恶性肿瘤的方法
CN101132798A (zh) * 2005-01-17 2008-02-27 溶瘤病毒有限公司 治疗肿瘤的方法和组合物
CN105518128A (zh) * 2013-07-16 2016-04-20 迪特桑有限公司 遗传稳定的溶瘤性rna病毒、其制备方法及用途

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DARREN R. SHAFREN ET AL.: "Oncolysis of human ovarian cancers by Echovirus Type 1", 《INT. J. CANCER》 *
GENBANK: "KP099941.1", 《GENBANK》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113302307A (zh) * 2019-11-26 2021-08-24 南克维斯特公司 原代nk car构建体和方法
CN113302307B (zh) * 2019-11-26 2024-04-05 南克维斯特公司 原代nk car构建体和方法

Also Published As

Publication number Publication date
JP2020537534A (ja) 2020-12-24
JP7373168B2 (ja) 2023-11-02
EP3674398A1 (en) 2020-07-01
AU2018320550A1 (en) 2020-03-12
US20200323933A1 (en) 2020-10-15
KR20200090146A (ko) 2020-07-28
CN109419818B (zh) 2021-08-10
WO2019037642A1 (zh) 2019-02-28
CA3073770A1 (en) 2019-02-28
US11707496B2 (en) 2023-07-25
EP3674398A4 (en) 2021-06-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10434169B2 (en) Generation of antibodies to tumor antigens and generation of tumor specific complement dependent cytotoxicity by administration of oncolytic vaccinia virus
CN109982708B (zh) 优化的溶瘤病毒及其用途
CN110996980B (zh) 一种用于治疗肿瘤的病毒
CN109554353A (zh) 分离的重组溶瘤痘病毒、药物组合物及其在治疗肿瘤和/或癌症的药物中的用途
CN107787364A (zh) 用于治疗癌症的治疗组合物及使用方法
CN109419818A (zh) 一种用于治疗肿瘤的埃可病毒
CN109568350A (zh) 一种用于治疗肿瘤的柯萨奇病毒
CN110387353A (zh) 一种用于治疗肿瘤的柯萨奇b组病毒
CN107223055A (zh) 具有增强的促凋亡特性的基因修饰的传染性麻疹病毒(mv-deltac病毒)在癌症治疗中的用途
CN105821009B (zh) 靶向肝癌溶瘤流感病毒的构建及其应用
WO2021197506A1 (zh) 重组新城疫病毒及制备方法、重组质粒、及其应用
WO2021197507A1 (zh) 重组新城疫病毒及制备方法、重组质粒、及其应用
WO2024114576A1 (zh) 用于治疗肿瘤的柯萨奇b组1型病毒
WO2018120496A1 (zh) 重组溶瘤流感病毒制备方法和应用
CN109294983A (zh) 一种lff2细胞
CN107868782A (zh) 核酸分子ctl4hsh3、其制备方法及应用
Wan et al. Anti-Tumor Effect of Newcastle Disease Virus Vaccine for Human Use Preparation Process

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant