CN105821009B - 靶向肝癌溶瘤流感病毒的构建及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了靶向肝癌溶瘤流感病毒的构建及其应用。本发明提供的重组流感病毒，表达HRP1与HRP2；HRP1为：A1)序列1所示蛋白质；A2)在序列1中经过取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的由A1)衍生的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；HRP2为：B1)序列3所示蛋白质；B2)在序列3中经过取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的由B1)衍生的蛋白质；B3)在B1)或B2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。本发明提供的溶瘤重组流感病毒可靶向杀伤肝癌细胞，而对正常宿主细胞无明显影响，可用于肝癌靶向治疗。

Description

靶向肝癌溶瘤流感病毒的构建及其应用
技术领域
本发明涉及肿瘤基因治疗及病毒治疗领域中靶向肝癌溶瘤流感病毒的构建及其应用。
背景技术
原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。我国肝癌的发病数高居世界第一，世界上近一半的发病人口位于中国。现有的肝癌治疗手段主要包括手术切除、肝移植、局部消融治疗、经肝动脉化学栓塞、放疗、分子靶向治疗、综合治疗等，但治疗效果并不理想，并对人体造成严重副反应且难以根治。因此治疗肝癌的一大难题是，如何高效、特异性杀伤肿瘤细胞的同时，减少对正常细胞组织的损伤。随着分子生物学的发展及人们在基因水平对肿瘤的全新认识，新的肿瘤治疗方法应运而生。
第一代肿瘤基因治疗载体，是利用病毒载体将抑癌基因导入人体的肿瘤细胞中，使抑癌基因发挥抑制、杀伤肿瘤细胞的作用。但肿瘤机制复杂，基因突变多样，一个或者两个抑癌基因的导入不足以抑制肿瘤细胞的生长，治疗效果并不明显。因此设计一种新的病毒，通过有目的改造并使其选择性杀伤肿瘤细胞，可以克服第一代肿瘤基因治疗载体的缺陷。这种病毒载体被称为溶瘤病毒。
溶瘤病毒治疗肿瘤的关键在于提高杀伤肿瘤的靶向性，利用肿瘤细胞与正常细胞在遗传特性和生理特性方面的差异(例如癌基因的活化、抑癌基因的失活、细胞防御机制的缺陷、特异性受体的高表达、肿瘤细胞的异常增殖等)靶向杀伤肿瘤细胞。溶瘤病毒的分类：溶瘤病毒从来源上可以分为RNA病毒和DNA病毒。RNA病毒又可分为单链RNA病毒和双链RNA病毒，常见的有溶瘤作用的RNA病毒有流感病毒、脊髓灰质炎病毒、水疱性口炎病毒、新城疫病毒等。用作溶瘤病毒的DNA病毒主要有，腺病毒、痘苗病毒、小DNA病毒、单纯疱疹病毒等。
人H1N1流感病毒毒株A/PR/8/34(简称PR8)是一株鸡胚适应病毒株，能在鸡胚中有效地复制。PR8为单股负链、分节段的RNA，共有8个独立的RNA片段组成，编码10种蛋白质。片段1-3编码RNA依赖的RNA聚合酶，片段1编码聚合酶亚基PB2，片段2编码聚合酶亚基PB1，片段3编码聚合酶亚基PA；片段4编码血凝素HA，是一种与病毒附着感染有关的表面糖蛋白；片段5编码核蛋白NP，是病毒RNA的主要结构部分；片段6编码神经氨酸酶NA，是一种包膜糖蛋白；片段7编码两种基质蛋白M1和M2，是非糖基化的结构蛋白；片段8编码两种非结构蛋白NS1和NS2。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何治疗肿瘤，尤其是对肝癌的治疗。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了重组流感病毒，所述重组流感病毒表达名称分别为HRP1与HRP2的蛋白质；所述HRP1为下述A1)或A2)或A3)的蛋白质：
A1)氨基酸序列是序列1的蛋白质；
A2)在序列1所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由A1)衍生的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
所述HRP2为下述B1)或B2)或B3)的蛋白质：
B1)氨基酸序列是序列3的蛋白质；
B2)在序列3所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由B1)衍生的蛋白质；
B3)在B1)或B2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
上述重组流感病毒的基因组为单股负链、分节段的RNA，所述重组流感病毒的负链RNA转录出与所述负链RNA互补的成套正链RNA，所述成套正链RNA包括PB1-RNA、PB2-RNA、PA-RNA、NP-RNA、M-RNA、HA-RNA、HRP1-RNA和HRP2-RNA；
所述PB1-RNA为编码流感病毒毒株中PB1的RNA；
所述PB2-RNA为编码所述流感病毒毒株中PB2的RNA；
所述PA-RNA为编码所述流感病毒毒株中PA的RNA；
所述NP-RNA为编码所述流感病毒毒株中NP的RNA；
所述M-RNA为编码所述流感病毒毒株中M1和M2的RNA；
所述HA-RNA为编码所述流感病毒毒株中HA的RNA；
所述HRP1-RNA为编码权利要求1所述HRP1的RNA；
所述HRP2-RNA为编码权利要求1所述HRP2的RNA。
上述重组流感病毒中，所述成套正链RNA也可仅由所述PB1-RNA、所述PB2-RNA、所述PA-RNA、所述NP-RNA、所述M-RNA、所述HA-RNA、所述HRP1-RNA和所述HRP2-RNA组成。
上述重组流感病毒中，所述HRP1-RNA的序列为将序列表中序列2的第51-623位中所有T均替换为U，其它核苷酸均不变得到的序列；
所述HRP2-RNA的序列为将序列表中序列4的第35-2332位中所有T均替换为U，其它核苷酸均不变得到的序列。
所述流感病毒毒株可为甲型流感病毒或乙型流感病毒，具体可为A/PR/8/34。
为解决上述技术问题，本发明还提供了所述重组流感病毒的构建方法，所述方法包括将含有编码所述PB1-RNA的DNA分子的重组载体、含有编码所述PB2-RNA的DNA分子的重组载体、含有编码所述PA-RNA的DNA分子的重组载体、含有编码所述NP-RNA的DNA分子的重组载体、含有编码所述M-RNA的DNA分子的重组载体、含有编码所述HA-RNA的DNA分子的重组载体、含有编码所述HRP1-RNA的DNA分子的重组载体和含有编码所述HRP2-RNA的DNA分子的重组载体导入包装细胞中，得到重组流感病毒。
为解决上述技术问题，本发明还提供了下述任一产品：
P1、所述的重组流感病毒的基因组；
P2、用于治疗肿瘤的成套载体，由P2a与P2b组成：
P2a、含有所述HRP1的编码基因的载体；
P2b、含有所述HRP2的编码基因的载体；
P3、用于治疗肿瘤的成套表达盒，由P3a与P3b组成：
P3a、含有所述HRP1的编码基因的表达盒；
P3b、含有所述HRP2的编码基因的表达盒；
P4、用于治疗肿瘤的成套基因，由P4a与P4b组成：
P4a、所述HRP1的编码基因；
P4b、所述HRP2的编码基因；
P5、用于治疗肿瘤的成套蛋白质，由P5a与P5b组成：
P5a、所述HRP1；
P5b、所述HRP2；
P6、所述P2a或所述P2b；
P7、所述P3a或所述P3b；
P8、所述P4a或所述P4b；
P9、所述P5a或所述P5b。
为解决上述技术问题，本发明还提供了与所述重组流感病毒相关的生物材料，所述生物材料为下述E1)至E6)中的任一种：
E1)编码所述重组流感病毒的所述成套正链RNA的成套DNA分子；
E2)成套载体，由下述E2a)、E2b)、E2c)、E2d)、E2e)、E2f)、E2g)和E2h)组成：
E2a)含有编码所述PB1-RNA的DNA分子的重组载体；
E2b)含有编码所述PB2-RNA的DNA分子的重组载体；
E2c)含有编码所述PA-RNA的DNA分子的重组载体；
E2d)含有编码所述NP-RNA的DNA分子的重组载体；
E2e)含有编码所述M-RNA的DNA分子的重组载体；
E2f)含有编码所述HA-RNA的DNA分子的重组载体；
E2g)含有编码所述HRP1-RNA的DNA分子的重组载体；
E2h)含有编码所述HRP2-RNA的DNA分子的重组载体；
E3)含有所述重组流感病毒的微生物；
E4)含有所述重组流感病毒的动物细胞系；
E5)含有所述重组流感病毒的动物组织；
E6)含有所述重组流感病毒的动物器官；
所述成套DNA分子由编码所述PB1-RNA的DNA分子、编码所述PB2-RNA的DNA分子、编码所述PA-RNA的DNA分子、编码所述NP-RNA的DNA分子、编码所述M-RNA的DNA分子、编码所述HA-RNA的DNA分子、编码所述HRP1-RNA的DNA分子和编码所述HRP2-RNA的DNA分子组成。
上述生物材料中，所述编码所述HRP1-RNA的DNA分子可为核苷酸序列是序列表中序列2的第51-623位所示的DNA分子；所述编码所述HRP2-RNA的DNA分子可为核苷酸序列是序列表中序列4的第35-2332位所示的DNA分子。
上述生物材料中，所述编码所述HRP1-RNA的DNA分子还可为核苷酸序列是序列表中序列2的第18-802位所示的DNA分子；所述编码所述HRP2-RNA的DNA分子还可为核苷酸序列是序列表中序列4的第11-2365位所示的DNA分子。
上述生物材料中，所述动物细胞系、所述动物组织和所述动物器官均不包括繁殖材料。
上述生物材料中，E3)所述微生物、E4)所述动物细胞系、E5)所述动物组织和E6)所述动物器官均可为流感病毒的寄主。
在本发明的一个实施例中，E2a)所述重组载体为pHW-PB1；E2b)所述重组载体为pHW-PB2；E2c)所述重组载体为pHW-PA；E2d)所述重组载体为pHW-NP；E2e)所述重组载体为pHW-M；E2f)所述重组载体为pHW-HA；E2g)所述重组载体为pHW-HRP1。E2h)所述重组载体为pHW-HRP2。pHW-HRP1可表达序列1所示的HRP1，pHW-HRP2可表达序列3所示的HRP2。
为解决上述技术问题，本发明还提供了治疗肿瘤药物，所述药物的活性成分为所述重组流感病毒。
上述药物的活性成分还可为将所述重组流感病毒和其它治疗肿瘤药物进行组合得到的组合物作为活性成分。
为解决上述技术问题，本发明还提供了下述任一应用：
Ⅰ、所述重组流感病毒在制备治疗肿瘤药物中的应用；
Ⅱ、所述产品在制备治疗肿瘤药物中的应用；
Ⅲ、所述生物材料在制备治疗肿瘤药物中的应用；
Ⅳ、所述治疗肿瘤药物在在制备治疗肿瘤药物中的应用；
Ⅴ、所述重组流感病毒在治疗肿瘤中的应用；
Ⅵ、所述产品在治疗肿瘤中的应用；
Ⅶ、所述生物材料在治疗肿瘤中的应用；
Ⅷ、所述治疗肿瘤药物在治疗肿瘤中的应用。
本发明中所述肿瘤可为实体肿瘤，如肝癌、肺癌、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、淋巴瘤、神经胶质瘤或黑色素瘤。所述肝癌具体可为肝细胞癌。
实验证明，本发明的重组流感病毒(rFLU-HRP)对肿瘤细胞具有特异的杀伤作用：rFLU-HRP感染细胞后rFLU-HRP对肿瘤细胞产生明显的杀伤作用，但对正常肝细胞L02无明显杀伤作用。本发明的重组流感病毒可以抑制动物体内肿瘤的生长、转移并可以抑制肿瘤的发展：本发明的重组流感病毒治疗荷瘤动物后存活率得到提高，肿瘤的生长得到抑制——rFLU-HRP低剂量组与rFLU-HRP高剂量组肿瘤体积分别为PBS组的0.5和0.3倍,治疗后肿瘤的肿瘤特征得到抑制，肿瘤异型性不明显，核分裂现象不明显。
本发明的重组流感病毒具有杀伤肿瘤特异性强、有效性高、良好安全性的优点：重组流感病毒选择性杀伤肿瘤细胞，而对宿主正常细胞没有明显影响。本发明的重组流感病毒可用于对肿瘤的治疗。
附图说明
图1为rFLU-HRP电镜下形态及病毒颗粒直径大小分布。其中，A图为电镜下rFLU-HRP病毒颗粒形态，B图为病毒颗粒直径大小分布。
图2为通过活细胞比色检测试验研究感染复数MOI为0.1、1、3、5和10，重组流感病毒对细胞的细胞毒特异性。
图3为不同TCID50感染复数MOI条件下重组流感病毒rFLU-HRP对不同肝癌细胞系(HepG2、SMMC-7721)及人正常肝细胞L02的影响。
图4为各组荷瘤裸鼠的生存状况。其中，LOW表示rFLU-HRP低剂量组，HIGH表示rFLU-HRP高剂量组。
图5为各组荷瘤裸鼠的肿瘤体积变化。其中，LOW表示rFLU-HRP低剂量组，HIGH表示rFLU-HRP高剂量组。
图6为各组荷瘤裸鼠的肿瘤、肝脏及肺。其中，LOW表示rFLU-HRP低剂量组，HIGH表示rFLU-HRP高剂量组。
图7为各组荷瘤裸鼠的肿瘤、肝脏及肺的病例分析结果。其中，LOW表示rFLU-HRP低剂量组，HIGH表示rFLU-HRP高剂量组。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的pHW2000(Hoffmann E,Mrauss S,Perez D,etal.Eight一Plasmidsystem for rapid generation of influenza virus vaccines.Vaccine,2002,20:3165～70,)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的非洲绿猴SV40转化的肾细胞(COS-1)为ATCC(American TypeCulture Collection)细胞库产品。下述实施例中的狗肾细胞(MDCK)为ATCC(AmericanType Culture Collection)细胞库产品。
下述实施例中的SPF鸡胚为北京实验动物研究中心产品。
下述实施例中的重组载体pHW-PB1、pHW-PB2、pHW-PA、pHW-NP、pHW-M和pHW-HA(Hoffmann E,Mrauss S,Perez D,etal.Eight-Plasmid system for rapid generationof influenza virus vaccines.Vaccine,2002,20:3165-70)公众可从申请人处获得，这些生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。重组载体pHW-PB1、pHW-PB2、pHW-PA、pHW-NP、pHW-M和pHW-HA分别含有分别与流感病毒株A/PR/8/34(HoffmannE,Mrauss S,Perez D,etal.Eight一Plasmid system for rapid generation ofinfluenza virus vaccines.Vaccine,2002,20:3165-70)的内部病毒基因骨架PB1、PB2、PA、NP、M和HA反向互补的DNA片段，pHW-PB1、pHW-PB2、pHW-PA、pHW-NP和pHW-HA分别编码流感病毒株A/PR/8/34的PB1、PB2、PA、NP和HA，pHW-M编码流感病毒株A/PR/8/34的M1和M2。
下述实施例中的HepG2、SMMC-7721和L02均为中国人民解放军第三〇二医院产品。
实施例1、重组流感病毒的拯救
本发明提供了一种重组流感病毒，该重组流感病毒表达名称分别为HRP1与HRP2的蛋白质；HRP1为氨基酸序列是序列1的蛋白质，HRP2为氨基酸序列是序列3的蛋白质，HRP1由序列表中序列2的第51-623位核苷酸所示的HRP1基因编码，HRP2由序列表中序列4的第35-2332位核苷酸所示的HRP2基因编码。
1、重组载体的构建
将序列2所示的DNA分子用AarI酶切，得到含有HRP1基因的DNA片段，将pHW2000用AarI酶切，得到pHW2000骨架载体1，将含有HRP1基因的DNA片段与pHW2000骨架载体1进行连接，得到重组载体，将该重组载体命名为pHW-HRP1，pHW-HRP1表达序列1所示的HRP1。
将序列4所示的DNA分子用BsaI酶切，得到含有HRP2基因的DNA片段，将pHW2000用BsaI酶切，得到pHW2000骨架载体2，将含有HRP2基因的DNA片段与pHW2000骨架载体2进行连接，得到重组载体，将该重组载体命名为pHW-HRP2，pHW-HRP2表达序列3所示的HRP2。
2、重组流感病毒的拯救
将步骤1的pHW-HRP1和pHW-HRP2与重组载体pHW-PB1、pHW-PB2、pHW-PA、pHW-NP、pHW-M和pHW-HA共8种载体各0.2μg等量混合后加入10μL转染试剂(Effectene，Qiagen公司产品)中室温作用10min，共转染到非洲绿猴SV40转化的肾细胞(COS-1)和狗肾细胞(MDCK)中，于37℃、5％CO2下培养48-60小时，得细胞悬液，将细胞悬液接种9-11日龄SPF鸡胚，37℃培养72h，收获鸡胚尿囊液并按照OIE标准对其进行血凝(HA)试验和血凝抑制(HI)试验。成功获得的重组流感病毒命名为rFLU-HRP，进一步经扩大培养、浓缩、纯化得到rFLU-HRP，-70℃冻存。
3、重组流感病毒的鉴定
步骤2获得的重组流感病毒株rFLU-HRP负染后经透射电镜观察病毒形态，结果表明rFLU-HRP符合流感病毒典型形态特征，有包膜，表面有刺突结构，病毒颗粒大小在80-120nm之间，结果见图1。
将步骤2的rFLU-HRP接种9-11日龄SPF鸡胚传代，取第二代鸡胚尿囊液提取病毒RNA,经过RT-PCR，扩增出正确的PB2、PB1、PA、NP、HA和M基因片段以及HRP1基因和HRP2基因。
将步骤2的rFLU-HRP经鸡胚扩大培养，超滤浓缩、蔗糖梯度离心纯化后，跑SDS-PAGE电泳，凝胶染色、脱色后，可检测到相应大小的NP、HA1、HA2、NEP蛋白，表明抗原的主要成分没有丢失。
实施例2、重组流感病毒rFLU-HRP在肝癌细胞中的特异性作用
1、MTS法检测重组流感病毒rFLU-HRP对肝癌细胞的影响
将实施例1步骤2的rFLU-HRP用PBS重悬，得到rFLU-HRP悬浮液。利用MTS试剂盒(Promega)检测不同感染复数时重组流感病毒rFLU-HRP对肝癌细胞的细胞毒特异性，实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：
将HepG2、SMMC-7721以及L02在96孔板中接种在含有培养基的96孔板中，每孔培养基的量相同，每孔一种细胞，每种细胞两个复孔，每孔104个细胞，于37℃、5％CO2下培养24小时后，按照活细胞TCID50的感染复数MOI为10，分别对每种细胞接种rFLU-HRP悬浮液(每种细胞分别接种等体积的PBS作为对照)，于37℃、5％CO2下进行培养，分别在培养48小时、72小时、96小时加入MTS试剂，37℃保温1小时后，进行490nm吸光值检测，计算各孔细胞的存活率，结果如图2所示。
按照上述方法，将活细胞TCID50的感染复数MOI为10分别替换为0.1、1、3和5，其他步骤均不变，检测不同感染复数时重组流感病毒rFLU-HRP对肝癌细胞的细胞毒特异性，结果如图2所示。
当活细胞TCID50的感染复数MOI为3、5、10时，感染后各时间点均对肝癌细胞SMMC-7721产生明显杀伤作用，当活细胞TCID50的感染复数MOI为0.1、3、5、10时，感染后各时间点均对肝癌细胞HepG2产生明显杀伤作用，而各时间点不同感染复数均对正常肝细胞L02无明显杀伤作用。
RT-PCR检测目的基因的表达：在上述490nm吸光值检测后，分别提取各细胞总RNA，反转录为cDNA后分别利用HRP1的引物TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGTG和ATATCATCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGT以及HRP2的引物TATTGGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGGGTT和ATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGAG进行PCR反应，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，以未感染病毒的细胞作为对照。
结果显示，在不同感染复数(0.1、1、3、5和10)及不同感染时间(48小时、72小时和96小时)时的肝癌细胞HepG2和SMMC-7721中均检测到了大小HRP1与HRP2的目的基因片段，说明重组流感病毒在HepG2和SMMC-7721中HRP1与HRP2基因均有表达，而rFLU-HRP感染的L02细胞中未检测到目的基因片段。
2、细胞病变检测重组流感病毒rFLU-HRP对肝癌细胞的影响
为了检测重组流感病毒rFLU-HRP对细胞造成的杀伤效果，通过结晶紫染色法检测细胞感染病毒后病变效果，实验重复三次，具体步骤如下：
将HepG2、SMMC-7721以及L02接种在含有培养基的96孔板中，每孔培养基的量相同(500μl/孔)，每孔一种细胞，每种细胞两个复孔，每孔7×104个细胞，于37℃、5％CO2下培养，待细胞长至单层后按照活细胞TCID50的感染复数MOI为3，分别对每种细胞接种步骤1的rFLU-HRP悬浮液(每种细胞分别接种等体积的PBS作为阴性对照)，吸附1小时后，换无血清培养基，继续培养72小时加入浓度为1％的结晶紫染色液，再用去离子水将染色液洗去，室温下晾干后，观察不同细胞染色情况，结果见图3。
按照上述方法，将活细胞TCID50的感染复数MOI为3分别替换为1和0.1，其他步骤均不变，检测不同感染复数时重组流感病毒rFLU-HRP对肝癌细胞的作用，结果见图3。结果显示，当MOI为3时，感染重组流感病毒的肝癌细胞SMMC-7721，观察到大量细胞病变，当MOI为0.1时，超过半数肝癌细胞HepG2病变死亡，当MOI为1时，几乎全部HepG2细胞病变死亡，而重组流感病毒感染L02细胞后，未造成明显的细胞病变死亡。
实施例3、重组流感病毒rFLU-HRP在荷肝癌裸鼠中的抗肿瘤作用
实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：
将实施例1的rFLU-HRP用PBS重悬，得到滴度分别为6.9×106pfu和2.3×105pfu的rFLU-HRP悬浮液。
取4-6周龄SPF级裸鼠(体重16-18g，北京维通利华实验动物技术有限公司)，每只于右侧背部皮下接种5×106个肝癌细胞HepG2，将接种当天记为第0天。每周两次测量肿瘤长径和短径，肿瘤体积＝(最长直径×最短直径2)/2。约2周后，在注射部位长出米粒大小的硬结。当肿瘤体积为100-150mm3时，对裸鼠进行随机分组，每组5只裸鼠，分别为rFLU-HRP低剂量组、rFLU-HRP高剂量组和PBS组。
在第14天，连续5天对rFLU-HRP低剂量组、rFLU-HRP高剂量组和PBS组分别注射滴度为2.3×105pfu/100μl的rFLU-HRP悬浮液、滴度为6.9×106pfu/100μl的rFLU-HRP悬浮液和PBS，注射体积均为100μl，每天注射一次。同时，测量肿瘤长径和短径，计算肿瘤体积(图5与表1)。在治疗期内观察各组别裸鼠生存死亡情况(图4)，在治疗6周后(第56天)无菌条件下取出肿瘤、肝脏、肺脏，进行组织病变情况检测，结果见图6与7。
表1、不同组别肿瘤体积随时间的变化(mm3)
时间 rFLU-HRP低剂量组 rFLU-HRP高剂量组 PBS组
第14天 154.59±34.62 137.88±10.79 158.07±24.08
第21天 586.52±77.66 326.85±110.83 761.56±229.84
第28天 837.34±380.20 397.45±226.69 1529.87±464.71
第35天 1167.25±701.46 809.75±456.89 2724.39±767.82
第42天 1444.72±808.73 893.85±435.29 2924.92±394.52
图4所示PBS组裸鼠最早出现死亡，并在观察期内全部死亡，而rFLU-HRP低剂量组与rFLU-HRP高剂量组裸鼠存活率从第25天开始一直显著高于对照组。表明通过注射重组流感病毒rFLU-HRP可在不同程度提高荷瘤裸鼠生存率。
图5所示，PBS组裸鼠肿瘤快速增长，而rFLU-HRP低剂量组与rFLU-HRP高剂量组肿瘤体积的增加始终维持在较小水平，且高剂量组裸鼠肿瘤体积较低剂量组减小更加明显，在第42天，rFLU-HRP低剂量组与rFLU-HRP高剂量组肿瘤体积分别为PBS组的0.5和0.3倍，表明rFLU-HRP具有良好的体内抑制肿瘤生长作用，且该抑制作用随剂量的增加而增强。
图6为无菌条件下取出的各组裸鼠肿瘤、肝脏、肺。结果可见，PBS组肿瘤质地坚硬、血管分布明显、且体积较两治疗组明显增大，rFLU-HRP低剂量组与rFLU-HRP高剂量组肿瘤体积较小，说明重组流感病毒rFLU-HRP对肿瘤增长抑制效果明显，该抑制作用具有剂量效应。PBS组肝脏体积明显缩小，表面包膜不平，质地软硬程度不一，rFLU-HRP低剂量组与rFLU-HRP高剂量组可见肝脏质地软硬程度均匀表面光滑。各组裸鼠肺经肉眼观察均未见病理变化。
图7为各组裸鼠肿瘤、肝脏、肺脏病理损伤情况。PBS组肿瘤异型性显著，有多核分裂现象；rFLU-HRP低剂量组与rFLU-HRP高剂量组肿瘤异型性不明显，核分裂现象不明显，表明PBS组肿瘤恶性程度较rFLU-HRP低剂量组与rFLU-HRP高剂量组更高，说明rFLU-HRP有明显的抑制肿瘤的作用。

Claims (9)

1.重组流感病毒，所述重组流感病毒表达名称分别为HRP1与HRP2的蛋白质；所述HRP1为氨基酸序列是序列1的蛋白质；
所述HRP2为氨基酸序列是序列3的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的重组流感病毒，其特征在于：所述重组流感病毒的基因组为单股负链、分节段的RNA，所述重组流感病毒的负链RNA转录出与所述负链RNA互补的成套正链RNA，所述成套正链RNA包括PB1-RNA、PB2-RNA、PA-RNA、NP-RNA、M-RNA、HA-RNA、HRP1-RNA和HRP2-RNA；
所述PB1-RNA为编码流感病毒毒株中PB1的RNA；
所述PB2-RNA为编码所述流感病毒毒株中PB2的RNA；
所述PA-RNA为编码所述流感病毒毒株中PA的RNA；
所述NP-RNA为编码所述流感病毒毒株中NP的RNA；
所述M-RNA为编码所述流感病毒毒株中M1和M2的RNA；
所述HA-RNA为编码所述流感病毒毒株中HA的RNA；
所述HRP1-RNA为编码权利要求1所述HRP1的RNA；
所述HRP2-RNA为编码权利要求1所述HRP2的RNA。
3.根据权利要求2所述的重组流感病毒，其特征在于：所述HRP1-RNA的序列为将序列表中序列2的第51-623位中所有T均替换为U，其它核苷酸均不变得到的序列；
所述HRP2-RNA的序列为将序列表中序列4的第35-2332位中所有T均替换为U，其它核苷酸均不变得到的序列；
所述流感病毒毒株为甲型流感病毒或乙型流感病毒。
4.权利要求1-3中任一所述重组流感病毒的构建方法，其特征在于：所述方法包括将含有编码所述PB1-RNA的DNA分子的重组载体、含有编码所述PB2-RNA的DNA分子的重组载体、含有编码所述PA-RNA的DNA分子的重组载体、含有编码所述NP-RNA的DNA分子的重组载体、含有编码所述M-RNA的DNA分子的重组载体、含有编码所述HA-RNA的DNA分子的重组载体、含有编码所述HRP1-RNA的DNA分子的重组载体和含有编码所述HRP2-RNA的DNA分子的重组载体导入包装细胞中，得到重组流感病毒。
5.下述任一产品：
P1、权利要求1-4中任一所述的重组流感病毒的基因组；
P2、用于抗肝癌的成套流感病毒表达盒，由P2a、P2b、P2c、P2d、P2e、P2f、P2g、和P2h组成：
P2a、含有权利要求1-4中任一所述HRP1的编码基因的表达盒；
P2b、含有权利要求1-4中任一所述HRP2的编码基因的表达盒；
P2c、含有权利要求2-4中任一所述PB1-RNA的编码基因的表达盒；
P2d、含有权利要求2-4中任一所述PB2-RNA的编码基因的表达盒；
P2e、含有权利要求2-4中任一所述PA-RNA的编码基因的表达盒；
P2f、含有权利要求2-4中任一所述NP-RNA的编码基因的表达盒；
P2g、含有权利要求2-4中任一所述M-RNA的编码基因的表达盒；
P2h、含有权利要求2-4中任一所述HA-RNA的编码基因的表达盒。
6.与权利要求1-4中任一所述重组流感病毒相关的生物材料，为下述E1）至E6）中的任一种：
E1）编码权利要求1-4中任一所述重组流感病毒的所述成套正链RNA的成套DNA分子；
E2）成套载体，由下述E2a）、E2b）、E2c）、E2d）、E2e）、E2f）、E2g）和E2h）组成：
E2a）含有编码所述PB1-RNA的DNA分子的重组载体；
E2b）含有编码所述PB2-RNA的DNA分子的重组载体；
E2c）含有编码所述PA-RNA的DNA分子的重组载体；
E2d）含有编码所述NP-RNA的DNA分子的重组载体；
E2e）含有编码所述M-RNA的DNA分子的重组载体；
E2f）含有编码所述HA-RNA的DNA分子的重组载体；
E2g）含有编码所述HRP1-RNA的DNA分子的重组载体；
E2h）含有编码所述HRP2-RNA的DNA分子的重组载体；
E3）含有权利要求1-4中任一所述重组流感病毒的微生物；
E4）含有权利要求1-4中任一所述重组流感病毒的动物细胞系；
E5）含有权利要求1-4中任一所述重组流感病毒的动物组织；
E6）含有权利要求1-4中任一所述重组流感病毒的动物器官；
所述成套DNA分子由编码所述PB1-RNA的DNA分子、编码所述PB2-RNA的DNA分子、编码所述PA-RNA的DNA分子、编码所述NP-RNA的DNA分子、编码所述M-RNA的DNA分子、编码所述HA-RNA的DNA分子、编码所述HRP1-RNA的DNA分子和编码所述HRP2-RNA的DNA分子组成。
7.根据权利要求6所述的生物材料，其特征在于：所述编码所述HRP1-RNA的DNA分子为核苷酸序列是序列表中序列2的第51-623位所示的DNA分子；所述编码所述HRP2-RNA的DNA分子为核苷酸序列是序列表中序列4的第35-2332位所示的DNA分子。
8.一种抗肿瘤药物，其活性成分为权利要求1-4中任一所述的重组流感病毒；所述肿瘤为肝癌。
9.下述任一应用：
Ⅰ、权利要求1-4中任一所述的重组流感病毒在制备抗肿瘤药物中的应用；
Ⅱ、权利要求5所述产品在制备抗肿瘤药物中的应用；
Ⅲ、权利要求6或7所述的生物材料在制备抗肿瘤药物中的应用；
Ⅳ、权利要求8所述抗肿瘤药物在制备抗肿瘤药物中的应用；
所述肿瘤为肝癌。
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