CN109414488A - 马流感病毒减毒活疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了与减毒活流感疫苗有关的组合物和方法。

Description

马流感病毒减毒活疫苗
相关申请的引用
本申请要求2016年6月3日提交的美国临时专利申请号62/345,293的优先权，所述美国临时专利申请的内容以引用的方式整体并入本文。
发明背景
由马流感病毒(EIV)H3N8引起的马流感是马的最常见且重要的呼吸道传染病。EIV是高度传染性的并且具有以通过咳嗽散布的雾化液滴形式在天然马群体中快速传播。马的EIV H3N8感染一直是干扰重大马术事件和造成重大经济损失的原因。马群体是高度流动性的，并且出于竞争和繁殖目的，马就公路和空气(除其他之外)而言行进长距离。当受感染的马被引入易感群体时，EIV传播可能是爆发性的。H3N8 EIV的大爆发通常与马术比赛的马的聚集相关。它们在事件后的散布可导致病毒的广泛传播，在世界各地都有大量的实例。
疫苗接种是预防马的H3N8 EIV感染并限制其后果的最有效的工具之一。目前用于治疗H3N8 EIV的疫苗效率低，因为它们使用灭活的病毒；或者有效性非常有限，像马减毒活流感疫苗(LAIV)，因为它是25年前产生的，并且自那以后未更新。
因此，本领域中需要针对EIV的改进的疫苗。本发明满足了这种尚未满足的需求。
发明内容
在一个方面，本发明提供了一种包含马减毒活流感病毒的免疫组合物，其中所述病毒包含病毒基因组的区段1和区段2中的一者或多者中的一个或多个突变。在一个实施方案中，所述组合物用于治疗受试者的马流感。
在一个实施方案中，所述组合物包含突变的区段1，所述区段1包含SEQ ID NO:1中列出的核酸序列。在一个实施方案中，所述组合物包含突变的区段2，所述区段2包含SEQ IDNO:3中列出的核酸序列。
在一个实施方案中，所述病毒包含区段1中的一个或多个突变，所述区段1编码突变型PB2。在一个实施方案中，突变型PB2包含N265S点突变。在一个实施方案中，突变型PB2包含SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述病毒包含区段2中的一个或多个突变，所述区段2编码突变型PB1。在一个实施方案中，突变型PB1包含以下中的一者或多者：K391E点突变、E581G点突变和A661T点突变。在一个实施方案中，突变型PB1包含K391E点突变、E581G点突变和A661T点突变。在一个实施方案中，突变型PB1包含SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述病毒包含区段1中的一个或多个突变，所述区段1编码突变型PB2；以及区段2中的一个或多个突变，所述区段2编码突变型PB1。在一个实施方案中，突变型PB2包含N265S点突变，并且突变型PB1包含K391E点突变、E581G点突变和A661T点突变。
在一个实施方案中，所述病毒是源自马甲型流感病毒的H3N8亚型。在一个实施方案中，所述病毒是表达突变型EIV H3N8 PB2、突变型EIV H3N8 PB1以及不同EIV毒株的HA和NA的主供体病毒(MDV)。
在一个方面，本发明提供了一种在受试者中诱导针对马流感病毒的免疫应答的方法。在一个实施方案中，本发明提供了一种治疗或预防受试者的马流感感染的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用包含马减毒活流感病毒的免疫组合物，其中所述病毒包含病毒基因组的区段1和区段2中的一者或多者中的一个或多个突变。
在一个实施方案中，所述组合物包含突变的区段1，所述区段1包含SEQ ID NO:1中列出的核酸序列。在一个实施方案中，所述组合物包含突变的区段2，所述区段2包含SEQ IDNO:3中列出的核酸序列。
在一个实施方案中，所述病毒包含区段1中的一个或多个突变，所述区段1编码突变型PB2。在一个实施方案中，突变型PB2包含N265S点突变。在一个实施方案中，突变型PB2包含SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述病毒包含区段2中的一个或多个突变，所述区段2编码突变型PB1。在一个实施方案中，突变型PB1包含以下中的一者或多者：K391E点突变、E581G点突变和A661T点突变。在一个实施方案中，突变型PB1包含K391E点突变、E581G点突变和A661T点突变。在一个实施方案中，突变型PB1包含SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述病毒包含区段1中的一个或多个突变，所述区段1编码突变型PB2；以及区段2中的一个或多个突变，所述区段2编码突变型PB1。在一个实施方案中，突变型PB2包含N265S点突变，并且突变型PB1包含K391E点突变、E581G点突变和A661T点突变。
在一个实施方案中，所述病毒是源自马甲型流感病毒的H3N8亚型。在一个实施方案中，所述病毒是表达突变型EIV H3N8 PB2、突变型EIV H3N8 PB1以及不同EIV毒株的HA和NA的主供体病毒(MDV)。
在一个实施方案中，所述受试者不患有马流感，并且其中所述方法诱导针对马流感的免疫。在一个实施方案中，所述受试者感染马流感，并且其中所述方法诱导治疗性免疫应答。
在一个实施方案中，鼻内、气管内、口服、皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内或皮下施用所述免疫组合物。在一个实施方案中，所述受试者是马。
附图说明
在结合附图阅读时，将更好地理解本发明的优选实施方案的以下详细描述。为了说明本发明，附图中示出了目前优选的实施方案。然而，应理解，本发明不限于附图中所示的实施方案的精确安排和手段。
图1描绘A/马/俄亥俄州/1/2003 H3N8野生型(WT)和减毒活流感病毒(LAIV)的区段1(PB2)和区段2(PB1)的示意性图示：指示了聚合酶PB2(N265S)和PB1(K391E、E581G和A661T)亚基中的氨基酸取代。
图2描绘实施例实验的结果，所述结果证明温度对A/马/俄亥俄州/1/2003 H3N8野生型(WT)和减毒活流感病毒(LAIV)的聚合酶活性的影响：将犬MDCK(12孔板格式，6.5x105个细胞/孔，一式三份)用200ng的编码病毒复制和转录的最低要求(PB2、PB1、PA和NP)的双义pDZ表达质粒以及500ng的编码高斯荧光素酶(Gluc)的小基因组(MG)病毒(v)RNA样表达质粒和100ng的组成型表达Cypridinia荧光素酶质粒的pCAGGS共转染。在6小时后，将细胞置于33℃、37℃或39℃下。在转染后48小时，将细胞溶解用于发光评价。将FFluc活性标准化至海肾荧光素酶的活性。数据表示对于一式三份测定确定的结果的平均值SD。标准化的报告基因表达是相对于不存在NP情况下的MG活性。考虑A/马/俄亥俄州/1/2003 WT为100％，数据被表示为相对活性。在马E-Derm细胞中获得了相同的结果。
图3(包括图3A至图3C)描绘实施例实验的结果，所述结果证明A/马/俄亥俄州/1/2003 H3N8野生型(WT)和减毒活流感疫苗(LAIV)的多周期生长动力学：将犬MDCK细胞(12孔板格式，6.5x105个细胞/孔，一式三份)用A/马/俄亥俄州/1/2003 H3N8 WT和LAIV以低感染复数(MOI，0.001)感染，并在33℃(图3A)、37℃(图3B)和39℃(图3C)下孵育。作为内部对照，MDCK细胞也用Flu Avert(来自Merck的马LAIV)感染。在感染后12、24、48和96小时收集组织培养上清液。使用抗NP单克隆抗体(HB-65)通过免疫聚焦测定(焦点形成单位，FFU/ml)来测定组织培养上清液中的病毒滴度。数据表示一式三份测定的结果的平均值和SD。黑色虚线指示检测限(200FFU/ml)。
图4描绘实施例实验的结果，所述结果证明温度对A/马/俄亥俄州/1/2003野生型(WT)和减毒活流感疫苗(LAIV)的空斑表型的影响：将犬MDCK细胞(6孔板格式，106个细胞/孔)用A/马/俄亥俄州/1/2003WT和LAIV感染，并用含有琼脂的培养基覆盖。包括用FluAvert感染的MDCK细胞作为内部对照。感染后三天，用抗NP单克隆抗体(HB-65)对单层进行免疫染色。
图5(包括图5A和图5B)描绘实施例实验的结果，所述结果证明甲型流感/马/俄亥俄州/1/2003 H3N8 LAIV的减毒：将雌性6至8周龄C57BL/6小鼠(N＝6)用1x105FFU的A/马/俄亥俄州/1/2003 H3N8 WT或LAIV或作为内部对照的Flu Avert鼻内感染。在感染后第2天(N＝3)和第4天(N＝3)通过免疫聚焦测定(FFU/ml)使用抗NP单克隆抗体(HB-65)对感染的小鼠的肺(图5A)和鼻甲(图5B)中病毒的存在进行评价。数据表示平均值和SD。黑色虚线指示检测限(200FFU/ml)。
图6描绘实施例实验的结果，所述结果证明甲型流感/马/俄亥俄州/1/2003 H3N8LAIV诱导体液应答：将雌性6至8周龄C57BL/6小鼠用1x103FFU的A/马/俄亥俄州/1/2003H3N8 WT或LAIV免疫。小鼠也模拟免疫或用1x103FFU的Flu Avert免疫分别作为阴性对照和阳性对照。在感染后14天，将小鼠放血并收集血清且使用用A/马/俄亥俄州/1/2003 WT病毒感染的MDCK细胞的细胞提取物通过ELISA评价针对总流感病毒蛋白的IgG抗体。使用模拟感染的细胞提取物来评价抗体应答的特异性。OD，光密度。数据表示6只单独小鼠的结果的平均值+/-SD。
图7描绘实施例实验的结果，所述结果证明甲型流感/马/俄亥俄州/1/2003 H3N8LAIV的保护功效：将雌性6至8周龄C57BL/6小鼠(N＝6)用1x103FFU的A/马/俄亥俄州/1/2003 H3N8 WT或LAIV疫苗接种。小鼠也模拟疫苗接种或用1x103FFU的Flu Avert疫苗接种分别作为阴性对照和阳性对照。疫苗接种后两周，将小鼠用1x105FFU的甲型流感/马/俄亥俄州/1/2003 H3N8 WT激发，并且使用抗NP单克隆抗体(HB-65)通过免疫聚焦测定(FFU/ml)从肺匀浆评价激发后第2天(N＝3)和第4天(N＝4)的病毒滴度。黑色虚线指示检测限(200FFU/ml)。数据表示平均值+/-SD。
具体实施方式
本发明涉及用于治疗和预防马流感病毒(CIV)和EIV相关病理的组合物和方法。本发明部分基于以下发现：EIV基因组的区段1和区段2中的各种突变、从而编码突变型PB2和PB1蛋白，使得病毒对温度敏感。例如，本文描述了与野生型EIV相比，此类突变导致EIV在正常和升高的体温下表现出降低的病毒复制。然而，温度敏感的EIV能够诱导EIV特异性免疫应答。因此，本文描述的温度敏感的EIV是减毒活流感疫苗(LAIV)，有时在本文中称为EIVLAIV。重要的是，与可商购的疫苗相比，当前描述的EIV LAIV在治疗EIV方面更有效。
本文描述了用于预防和控制马的H3N8 EIV的有效且安全的LAIV的开发。使用反向遗传方法以及甲型流感/马/俄亥俄州/1/2003 H3N8病毒的病毒PB2(N265S)和PB1(K391E、E581G和A661T)聚合酶亚基中的修饰来制备冷适应的、温度敏感的EIV H3N8 LAIV。与目前的灭活疫苗相比，当前描述的冷适应的、温度敏感的LAIV方法提供了针对由H3N8 EIV引起的疾病的更好和持久的保护，因为LAIV在呼吸道的靶组织中诱导更快且更强的先天性和适应性体液和T细胞免疫应答的产生。此外，在某些情况下，LAIV通过鼻喷雾施用，这避免了与灭活疫苗的肌内感染相关的肿胀和肌肉酸痛。此外，在一些实施方案中，与目前的灭活疫苗所需的多剂量相比，用冷适应的、温度敏感的LAIV单次免疫足以在较短的时间段内赋予针对H3N8 EIV的完全保护。此外，本发明的LAIV技术将提供与由目前的灭活疫苗提供的保护相比，针对抗原性不同的EIV H3N8毒株的更好交叉保护，从而减少H3N8 EIV爆发的机会。
与唯一可用的EIV H3N8 LAIV相比，本发明技术还提供许多优点。在甲型流感/马/俄亥俄州/1/2003 H3N8的PB2和PB1聚合酶亚基中引入的突变不同于通过当前甲型流感/马/肯塔基州/1/91 H3N8 LAIV的冷适应产生的那些突变；但能够赋予所述病毒类似的冷适应的、温度敏感的表型。此外，与人LAIV的情况类似，使用现有技术反向遗传技术促进了用于治疗当前流行的佛罗里达进化枝1和2亚型或新引入的H3N8 EIV毒株的LAIV候选物的快速和准确开发。因此，由于毒株匹配，本发明的LAIV方法比目前可用的LAIV更有效地治疗马的H3N8 EIV感染。重要的是，并且与目前的LAIV相反，本发明的冷适应的、温度敏感的甲型流感/马/俄亥俄州/1/2003 H3N8病毒可用作主供体病毒(MDV)，以通过引入来自抗原性不同的流行EIV毒株的HA和NA糖蛋白来每年产生更新的LAIV，最终目的是预防和控制马群体中目前流行的或潜在新的抗原性不同的H3N8马流感病毒。
定义
除非另外定义，否则本文使用的所有技术性和科学性术语具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的相同的含义。虽然可在本发明的实践或测试中使用与本文描述的那些方法和材料类似或等效的任何方法和材料，但是描述了优选的方法和材料。
如本文所用，以下术语中的每一个均具有与其在本章节中相关的含义。
冠词“一个/种(a/an)”在本文中用来指代冠词的语法对象中的一个或多于一个(即，“至少一个”)。作为举例，“一个/种要素”是指一个/种要素或多于一个/种要素。
当涉及可测量的值(如量、持续时间等)时，如本文所用的“约”是指涵盖指定值的±20％、±10％、±5％、±1％或±0.1％偏差，因为此类偏差对于执行所公开的方法是适当的。
如本文所用的术语“抗体”是指与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子。抗体可以是源自天然来源或重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反应性部分。本发明中的抗体可以多种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab)2以及单链抗体和人源化抗体(Harlow等人,1999,In:Using Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Harlow等人,1989,In:Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York；Houston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird等人,1988,Science 242:423-426)。
如本文所用的术语“抗原”或“Ag”被定义为引起免疫应答的分子。这种免疫应答可涉及抗体产生或特定免疫活性细胞的活化或两者。本领域技术人员将理解实际上包括所有蛋白质或肽的任何大分子都可充当抗原。此外，抗原可源自重组或基因组DNA。本领域技术人员将理解包含编码引发免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA因此编码如本文使用的术语的“抗原”。此外，本领域技术人员将理解抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，本发明包括但不限于使用多于一种基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列被安排在多种组合中以引发所需的免疫应答。此外，本领域技术人员将理解抗原根本不需要由“基因”编码。显而易见的是，抗原可合成产生或者可来源于生物样品。
如本文所用，术语“自体的”意思是指来源于同一个体且稍后重新引入所述个体中的任何材料。
如本文所用，“组合疗法”是指第一剂与另一剂组合施用。“结合”是指施用一种治疗模式以及另一种治疗模式。因此，“结合”是指在将另一治疗模式递送至个体之前、期间或之后，施用一种治疗模式。此类组合被认为是单一治疗方案或体系的一部分。
如本文所用，术语“同时施用”是指在组合疗法中第一疗法的施用和第二疗法的施用彼此重叠。
“疾病”是动物的一种健康状态，其中所述动物不能维持体内平衡，并且其中如果所述疾病得不到改善，则动物的健康状况将继续恶化。相比之下，动物的“病症”是所述动物能够维持体内平衡但动物的健康状态比没有病症的情况下不利的一种健康状态。如果不进行治疗，病症不一定会导致动物的健康状态进一步下降。
如本文所用的“有效量”是指提供治疗性或预防性益处的量。
如本文所用的术语“表达”被定义为特定核苷酸序列由其启动子驱动的转录和/或翻译。
“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含可操作地连接至待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包含足够的顺式作用表达元件；其他表达元件可由宿主细胞或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域中已知的所有表达载体，如粘粒、质粒(例如，裸露或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，所述表达载体并入有重组多核苷酸。
“同源的”是指两个多肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性或序列同一性。当两个相比较序列中均有一个位置被相同的碱基或氨基酸单体亚基所占据时，例如，如果两个DNA分子中各有一个位置被腺嘌呤占据，则所述分子在所述位置处是同源的。两个序列之间的同源性百分比是两个序列共享的匹配或同源位置数除以相比位置数乘以100的函数。例如，如果两个序列中的10个位置中有6个位置是匹配的或同源的，则所述两个序列是60％同源。作为举例，DNA序列ATTGCC和TATGGC共享50％同源性。一般来说，当比对两个序列时进行比较以提供最大的同源性。
如本文所用的术语“免疫球蛋白”或“Ig”被定义为一类充当抗体的蛋白质。由B细胞表达的抗体有时被称为BCR(B细胞受体)或抗原受体。包括在这类蛋白质中的五名成员是IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。IgA是存在于身体分泌物中的第一抗体，所述身体分泌物诸如唾液、眼泪、乳汁、胃肠分泌物以及呼吸道和泌尿生殖道的粘液分泌物。IgG是最常见的循环抗体。IgM是大多数受试者在初次免疫应答中产生的主要免疫球蛋白。IgM在凝集、补体结合和其他抗体应答中是最高效的免疫球蛋白，并且在防御细菌和病毒中是重要的。IgD是没有已知抗体功能的免疫球蛋白，但可充当抗原受体。IgE是通过导致在暴露于过敏原后从肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放介质来介导速发型超敏反应的免疫球蛋白。
如本文所用，术语“免疫应答”包括T细胞介导的免疫应答和/或B细胞介导的免疫应答。示例性免疫应答包括T细胞应答(例如，细胞因子产生和细胞毒性)和B细胞应答(例如，抗体产生)。此外，术语免疫应答包括受T细胞活化间接影响的免疫应答，例如抗体产生(体液应答)和细胞因子应答细胞(例如，巨噬细胞)的活化。参与免疫应答的免疫细胞包括淋巴细胞，如B细胞和T细胞(CD4+、CD8+、Th1和Th2细胞)；抗原呈递细胞(例如，专职抗原递呈细胞，如树突状细胞、巨噬细胞、B淋巴细胞、朗格汉斯细胞；和非专职抗原呈递细胞，如角化细胞，内皮细胞、星形胶质细胞、成纤维细胞、少突胶质细胞)；天然杀伤细胞；骨髓细胞，如巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和粒细胞。
“分离的”是指从天然状态发生改变或去除。例如，在活动物体内天然存在的核酸或肽不是“分离的”，但部分地或完全地从其天然状态的共存物质分离出来的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以基本上纯化的形式存在，或者可存在于非天然环境(例如像宿主细胞)中。
免疫原性组合物的“胃肠外”施用包括例如皮下(s.c.)注射、静脉内(i.v.)注射、肌肉内(i.m.)注射或胸骨内注射或输注技术。
术语“患者”、“受试者”、“个体”等在本文中可互换使用，并且是指无论在体外或是在原位可顺从本文所述方法的任何动物或其细胞。
如本文所用的术语“同时施用”是指在组合疗法中，第一疗法与第二疗法施用时的时间间隔不超过约15分钟，如不超过约10分钟、5分钟或者1分钟中的任一者。当同时施用第一疗法和第二疗法时，第一疗法和第二疗法可包含在同一组合物中(例如，包含第一疗法和第二疗法两者的组合物)，或者在单独的组合物中(例如，第一疗法包含在一种组合物中，并且第二疗法包含在另一种组合物中)。
如本文关于抗体使用的术语“特异性结合”是指识别特定抗原但基本上不识别或结合样品中的其他分子的抗体。例如，特异性结合来自一种物种的抗原的抗体也可结合来自一种或多种物种的抗原。但是，这种物种交叉反应性本身不会改变抗体的特定分类。在另一实例中，特异性结合抗原的抗体也可结合所述抗原的不同等位基因形式。然而，这种交叉反应性本身不会改变抗体的特定分类。在一些情况下，术语“特异性结合”或“特异性地结合”可关于抗体、蛋白质或具有第二化学物质的肽的相互作用被用来指所述相互作用依赖于所述化学物质上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体识别并结合特定的蛋白质结构，而不是广泛地结合蛋白质。如果抗体对表位“A”是特异性的，那么在含被标记的“A”和抗体的反应中，含表位A的分子(或者游离的未标记A)的存在将会降低与所述抗体结合的被标记的A的量。
如本文所用的术语“正常温度”或“正常体温”是指健康受试者的温度。例如，在某些情况下，人受试者的“正常体温”在约36℃至约38℃的范围内。在某些情况下，在马受试者中，“正常体温”在约37.5℃至约38.7℃的范围内。
如本文所用的术语“升高的温度”或“升高的体温”是指受试者的温度高于给定生物体的受试者的“正常体温”。在某些情况下，“升高的体温”可能指示发热、感染或其他疾病。在某些情况下，人受试者的升高的体温是大于约37℃。在某些情况下，马受试者的升高的体温是大于约38.9℃。
如本文所用的术语“治疗”是指治疗和/或预防。通过遏制、缓解或根除疾病状态获得治疗作用。
术语“治疗有效量”是指将引发由研究者、兽医、医师或其他临床医生所研究的组织、系统或受试者的生物学或医学应答的主题化合物的量。术语“治疗有效量”包括当施用时足以预防正治疗的病症或疾病的一种或多种病征或症状发展，或在某种程度上减轻所述一种或多种病征或症状的化合物的量。治疗有效量将根据化合物、疾病和其严重程度以及待治疗受试者的年龄、体重等而变化。
如本文所用的术语“治疗”疾病是指降低受试者所经受的疾病或病症的至少一种病征或症状的频率或严重程度。
如本文所用的术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移到或引入宿主细胞中的方法。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是使用外源核酸转染、转化或转导的细胞。所述细胞包括原代主题细胞及其子代。
范围：贯穿本公开，本发明的各个方面可以范围形式呈现。应当了解，呈范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应解释为对本发明范围的硬性限制。因此，范围的描述应被认为具有确切公开的所有可能的子范围以及所述范围内的单独数值。例如，诸如1至6的范围的描述应被认为已经特定地公开了子范围，如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及所述范围内的单独数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。无论范围的宽度如何，这都适用。
描述
本发明提供了适用于抑制、预防和治疗马流感以及马流感相关疾病和病症的免疫组合物和方法。在一个实施方案中，所述免疫组合物包含减毒活病毒(LAV)。
在一个实施方案中，本发明提供了马流感病毒的温度敏感的LAV。例如，本文证明EIV基因组的区段1和/或区段2中的一个或多个突变使得病毒对温度敏感。与野生型EIV相比，本发明的温度敏感的EIV LAIV在正常体温和升高的温度或发热温度下表现出降低的病毒复制。然而，温度敏感的EIV LAIV提供针对EIV的抗原特异性免疫应答和保护。在一个实施方案中，与野生型EIV相比，所述EIV LAIV提供针对EIV的至少相同的抗原特异性免疫应答和保护。在某些实施方案中，与灭活的EIV相比，所述EIV LAIV提供针对EIV的更强抗原特异性免疫应答和保护。
在一个实施方案中，所述组合物包含在病毒基因组的区段1和/或区段2中具有一个或多个突变的EIV LAIV。例如，在一个实施方案中，所述EIV LAIV编码突变型PB2和/或突变型PB1。在某些实施方案中，突变型PB2包含N265S点突变。在某些实施方案中，突变型PB1包含K391E点突变、E581G点突变或A661T点突变中的至少一者。
在某些实施方案中，本发明提供了一种包含主供体病毒(MDV)的组合物，所述主供体病毒在病毒基因组的区段1和/或区段2中具有一个或多个突变。在一个实施方案中，所述MDV包含突变型H3N8区段1和/或区段2，如本文所述。在某些实施方案中，所述MDV可用于产生针对其他病原体具有保护作用的LAIV。例如，在某些实施方案中，可通过使用MDV来表达另一种毒株的一种或多种病毒蛋白(例如，HA或NA)而产生针对另一种流感毒株的LAV。
在某些实施方案中，本发明提供了一种治疗或预防EIV和EIV相关病理的方法，所述方法包括施用包含EIV LAIV的组合物。在某些实施方案中，所述方法包括鼻内递送EIVLAIV。
一般来说，野生型流感病毒含有具有如以下表1中描述的8个区段的分段基因组：
表1：
区段 基因产物
1 PB2(聚合酶(碱性)蛋白2)
2 PB1(聚合酶(碱性)蛋白1)
3 PA(聚合酶(酸性)蛋白)
4 HA(血凝素)
5 NP(核蛋白)
6 NA(神经氨酸酶)
7 M1(基质蛋白1)和M2(基质蛋白2)
8 NS1(非结构蛋白1)和NEP/NS2(非结构蛋白2)
在某些实施方案中，本发明提供了一种包含区段1和/或区段2的免疫组合物，其中区段1和/或区段2包含一个或多个突变。例如，在某些实施方案中，所述免疫组合物包含LAIV，所述LAIV包含区段1和/或区段2中的一个或多个突变。在一个实施方案中，所述免疫组合物包含EIV LAIV，所述EIV LAIV包含区段1和/或区段2中的一个或多个突变。
本发明还提供了预防、抑制和治疗EIV和EIV相关疾病和病症的方法。在一个实施方案中，本发明的方法通过产生针对EIV的免疫应答来诱导针对EIV的免疫。在一个实施方案中，本发明的方法诱导EIV特异性抗体的产生。在一个实施方案中，本发明的方法预防EIV相关病理。在一个实施方案中，本发明的方法包括向有需要的受试者施用包含LAV的免疫组合物，其中所述LAV包含区段1和/或区段2中的一个或多个突变。在一个实施方案中，所述方法包括向有需要的受试者施用免疫组合物，从而诱导针对EIV的免疫。
组合物
本发明提供了免疫组合物，所述免疫组合物当向有需要的受试者施用时引发针对马流感病毒(EIV)的免疫应答。在一些实施方案中，所述组合物包括多肽、核苷酸、载体或疫苗。此外，当将所述组合物施用至受试者时，所述组合物引发用于保护接种的受试者抵御马流感的免疫应答。如本文所例示的，可大量获得所述组合物以用作疫苗。
在一个实施方案中，本发明提供了组合物，所述组合物例如在刺激免疫应答中以及在预防马流感和马流感相关病理中可用作免疫调节剂。
减毒活病毒可用作免疫刺激剂，以诱导EIV特异性抗体的产生并保护免于马流感和马流感相关病理。因此，在一个实施方案中，本发明的组合物包含减毒活EIV(EIV LAIV)，其中所述EIV LAIV包含病毒基因组中的一个或多个突变以使得所述EIV LAIV对温度敏感。例如，在一个实施方案中，所述EIV LAIV包含病毒基因组的区段1中的一个或多个突变。所述病毒基因组的区段1中的一个或多个突变编码突变型PB2蛋白。在一个实施方案中，所述EIV LAIV包含病毒基因组的区段2中的一个或多个突变。所述病毒基因组的区段2中的一个或多个突变编码突变型PB1蛋白。在一个实施方案中，所述EIV LAIV包含区段1中的一个或多个突变和区段2中的一个或多个突变。
在一个实施方案中，所述EIV LAIV是基于甲型流感/马/俄亥俄州/1/2003 H3N8的基因组。甲型流感/马/俄亥俄州/1/2003 H3N8的每个区段的野生型核酸序列和编码的蛋白质的野生型氨基酸序列总结在以下表2中：
表2
在一个实施方案中，所述组合物包含编码PB2的区段1和/或编码PB1的区段2的核酸序列中的一个或多个突变。因此，在某些实施方案中，所述组合物编码突变型PB1和/或突变型PB2。如本文所述，所述一个或多个突变使得所述病毒对温度敏感，在正常或升高的温度下表现出降低的病毒复制。
在一些实施方案中，本发明提供了一种包含区段1中的一个或多个突变的组合物。例如，在一个实施方案中，所述组合物包含具有一个或多个突变的区段1，所述区段1导致在氨基酸残基265处具有点突变的突变型PB2的产生。例如，在一个实施方案中，所述突变型PB2包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，除了在氨基酸残基265处具有点突变。例如，在一个实施方案中，所述突变型PB2包含N265S点突变，其中所述突变型PB2在氨基酸残基265处包含丝氨酸。
在一个实施方案中，所述组合物包含核酸序列，所述核酸序列编码具有SEQ IDNO:2的氨基酸序列的突变型PB2。在一个实施方案中，所述组合物包含核酸序列，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:2基本上同源的突变型PB2。例如，在某些实施方案中，所述组合物包含核酸序列，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:2至少50％同源、至少60％同源、至少70％同源、至少80％同源、至少90％同源、至少95％同源、至少98％同源、至少99％同源或至少99.5％同源的突变型PB2。在一个实施方案中，所述组合物包含核酸序列，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:2基本上同源的突变型PB2，其中与SEQ ID NO:2基本上同源的突变型PB2包含N265S点突变。
在一个实施方案中，所述组合物包含突变型区段1，所述区段1包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列。在一个实施方案中，所述组合物包含与SEQ ID NO:1基本上同源的核苷酸序列。例如，在某些实施方案中，所述组合物包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:1至少50％同源、至少60％同源、至少70％同源、至少80％同源、至少90％同源、至少95％同源、至少98％同源、至少99％同源或至少99.5％同源。在一个实施方案中，所述组合物包含与SEQ ID NO:1基本上同源的核苷酸序列，其中由与SEQ ID NO:1基本上同源的核苷酸序列编码的突变型PB2包含N265S点突变。
在一些实施方案中，本发明提供了一种包含区段2中的一个或多个突变的组合物。例如，在一个实施方案中，所述组合物包含具有一个或多个突变的区段2，所述区段2导致在以下中的一者或多者处具有点突变的突变型PB1的产生：氨基酸残基391、氨基酸残基581和氨基酸残基661。例如，在一个实施方案中，所述突变型PB2包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，除了在以下中的一者或多者处具有点突变：氨基酸残基391、氨基酸残基581和氨基酸残基661。例如，在一个实施方案中，所述突变型PB1包含K391E点突变，其中所述突变型PB1在氨基酸残基391处包含谷氨酸。在一个实施方案中，所述突变型PB1包含E581G点突变，其中所述突变型PB1在氨基酸残基581处包含甘氨酸。在一个实施方案中，所述突变型PB1包含A661T点突变，其中所述突变型PB1在氨基酸残基661处包含苏氨酸。
在一个实施方案中，所述组合物包含核酸序列，所述核酸序列编码具有SEQ IDNO:4的氨基酸序列的突变型PB1。在一个实施方案中，所述组合物包含核酸序列，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:4基本上同源的突变型PB1。例如，在某些实施方案中，所述组合物包含核酸序列，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:4至少50％同源、至少60％同源、至少70％同源、至少80％同源、至少90％同源、至少95％同源、至少98％同源、至少99％同源或至少99.5％同源的突变型PB1。在一个实施方案中，所述组合物包含核酸序列，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:4基本上同源的突变型PB1，其中与SEQ ID NO:4基本上同源的突变型PB1包含K391E点突变、E581G点突变和A661T点突变中的一者或多者。
在一个实施方案中，所述组合物包含突变型区段2，所述区段2包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列。在一个实施方案中，所述组合物包含与SEQ ID NO:3基本上同源的核苷酸序列。例如，在某些实施方案中，所述组合物包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:3至少50％同源、至少60％同源、至少70％同源、至少80％同源、至少90％同源、至少95％同源、至少98％同源、至少99％同源或至少99.5％同源。在一个实施方案中，所述组合物包含与SEQ ID NO:3基本上同源的核苷酸序列，其中由与SEQ ID NO:3基本上同源的核苷酸序列编码的突变型PB1包含K391E点突变、E581G点突变和A661T点突变中的一者或多者。
在某些实施方案中，所述组合物包含区段1中的一个或多个突变和区段2中的一个或多个突变。例如，在某些实施方案中，所述组合物包含具有N265S点突变的区段1和具有K391E点突变、E581G点突变和A661T点突变中的一者或多者的区段2。
在某些实施方案中，所述组合物包含区段1和/或区段2的核酸序列中的一个或多个突变，而对于分段基因组的其余部分包含野生型核酸序列。例如，在一个实施方案中，所述EIV LAIV包含区段1中的一个或多个突变并且包含野生型区段2、区段3、区段4、区段5、区段6、区段7和区段8。在一个实施方案中，所述EIV LAIV包含区段2中的一个或多个突变并且包含野生型区段1、区段3、区段4、区段5、区段6、区段7和区段8。在一个实施方案中，所述EIVLAIV包含区段1和区段2中的一个或多个突变，并且包含野生型区段3、区段4、区段5、区段6、区段7和区段8。
在某些实施方案中，所述组合物包含区段1和/或区段2中的一个或多个突变与病毒基因组的一个或多个其他区段中的一个或多个突变的组合。
在某些实施方案中，所述组合物包含如本文所述的突变型区段1、突变型区段2或其组合，与编码另一种抗原的一个或多个核苷酸序列的组合。例如，在某些实施方案中，所述组合物包含如本文所述的突变型区段1、突变型区段2或其组合，与编码另一种病毒或毒株的一种或多种抗原的一个或多个核苷酸序列的组合。例如，在某些方面，包含突变型区段1、突变型区段2或其组合的本文所述的H3N8 EIV LAIV可用作主供体病毒(MDV)。例如，可修饰包含含有本文所述的突变型区段1、突变型区段2或其组合的H3N8的MDV，以包含编码来自另一种流感毒株的PB2、PB1、PA、NP、HA、NA、M1、M2、NS1或NEP/NS2中的一者或多者的一个或多个核苷酸序列。因此，当包含含有本文所述的突变型区段1、突变型区段2或其组合的H3N8的组合物表达不同毒株的抗原时，所述组合物可提供针对不同毒株的保护。例如，在一个实施方案中，组合物包含H3N8 EIV LAIV的主链，所述H3N8 EIV LAIV包含本文所述的突变型区段1、突变型区段2或其组合；还包含编码来自另一种流感毒株的PB2、PB1、PA、NP、HA、NA、M1、M2、NS1或NEP/NS2中的一者或多者的一个或多个核苷酸序列。在一个实施方案中，所述组合物包含H3N8 EIV LAIV的主链，所述H3N8 EIV LAIV包含本文所述的突变型区段1、突变型区段2或其组合；还包含编码不同流感毒株的HA或NA中的一者或多者的一个或多个核苷酸序列。例如，可修饰包含本文所述的H3N8 EIV LAIV的主链的组合物以表达新出现的毒株的一种或多种病毒蛋白，从而提供针对所述新出现的毒株的保护。
在一个实施方案中，所述组合物包含本文所述的H3N8 EIV LAIV的区段1、区段2、区段3、区段5、区段7和区段8，从而包含区段1和区段2中的一者或多者中的一个或多个点突变，其中所述组合物还包含不同EIV毒株的区段4和区段6。
在一个实施方案中，所述组合物包含H3N8的突变型区段1、H3N8的突变型区段2或其组合，还包含不同EIV毒株的区段4、区段6或其组合。在某些方面，H3N8的突变型区段1、突变型区段2或其组合提供EIV LAIV的温度敏感的减毒表型，而不同EIV毒株的区段4、区段6或其组合编码不同EIV毒株的HA、NA或其组合，以引发对受试者中的不同EIV毒株的特异性免疫应答。
在一个实施方案中，所述组合物包含本文所述的多种EIV LAIV。例如，在一个实施方案中，所述组合物包含第一EIV LAIV，其包含H3N8的突变型区段1、突变型区段2或其组合，其中所述第一EIV LAIV包含H3N8的区段4、区段6或其组合；并且所述组合物还包含第二EIV LAIV，其包含H3N8的突变型区段1、突变型区段2或其组合，其中所述第二EIV LAIV包含不同EIV毒株的区段4、区段6或其组合。在某些实施方案中，所述组合物诱导针对H3N8和另一种EIV毒株两者的免疫应答。
在某些实施方案中，所述组合物包含编码突变型PB2和/或突变型PB1的多核苷酸。所述多核苷酸可以是RNA或DNA。在一个实施方案中，所述组合物包含DNA疫苗。
核酸序列包括被转录成RNA的DNA序列和被翻译成多肽的RNA序列。根据其他实施方案，从本发明多肽的氨基酸序列推断本发明的多核苷酸。如本领域所已知的，由于存在冗余密码子，所以在保留翻译的多肽的生物学活性的同时，可能存在若干替代性多核苷酸。
此外，本发明涵盖分离的核酸，其包含与编码本文公开的多肽的分离的核酸的核苷酸序列具有基本同源性的核苷酸序列。优选地，编码本发明多肽的分离的核酸的核苷酸序列是“基本上同源的”，也就是说，与编码本发明多肽的分离的核酸的核苷酸序列是约60％同源、更优选约70％同源、甚至更优选约80％同源、更优选约90％同源、甚至更优选约95％同源且甚至更优选约99％同源。
应明确地了解，如本领域所已知的，本发明的范围涵盖同源物、类似物、变体、片段、衍生物和盐，包括较短和较长的多肽和多核苷酸，以及具有一个或多个氨基酸或核酸取代的多肽和多核苷酸类似物，以及氨基酸或核酸衍生物、非天然氨基酸或核酸和合成氨基酸或核酸，其中规定这些修饰必须保留原始分子的免疫学活性。具体来说，根据本发明的原理，活性多肽的任何活性片段以及延伸物、结合物和混合物均包括在内并在本文中公开。
本发明应解释为包括与本文所描述和引用的核酸同源的任何和所有分离的核酸，前提是这些同源的核酸编码具有本文所公开的多肽的生物学活性的多肽。
本领域技术人员将理解，本发明的核酸涵盖编码本发明多肽的RNA或DNA序列，和其任何修饰的形式，包括DNA或RNA的化学修饰，所述修饰使核苷酸序列在脱离细胞时或在与细胞缔合时更稳定。核苷酸的化学修饰也可用于提高细胞吸收核苷酸序列的效率或核苷酸在细胞中表达的效率。核苷酸序列的修饰的任何和所有组合均涵盖在本发明中。
另外，许多程序可用于使用本领域熟知的重组DNA方法来产生本发明蛋白质的突变体、衍生物或变体形式，所述方法例如像在Sambrook等人(2012,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)和Ausubel等人(1997,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York)中描述的方法。通过改变编码多肽的DNA序列将氨基酸变化引入多肽或多肽中的程序是本领域熟知的，并且在这些文献和其他论文中也有描述。
根据另一个实施方案，包含本发明的核酸序列或核酸序列的组合的本发明组合物能够产生EIV特异性免疫应答。在另一个实施方案中，包含本发明的核酸序列或核酸序列的组合的本发明组合物能够产生EIV特异性抗体。在某些实施方案中，所述组合物能够保护免于EIV，包括H3N8 EIV。
在一个实施方案中，本发明的组合物包含多肽，或多肽的片段，多肽的同源物、变体、衍生物或盐，所述多肽具有SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4中的任何一个或多个的序列。
本发明还应被解释为包括任何形式的与本文所公开的多肽具有基本同源性的多肽。优选地，“基本上同源的”多肽与本文公开的多肽的氨基酸序列是约50％同源、更优选约70％同源、甚至更优选约80％同源、更优选约90％同源、甚至更优选约95％同源并且甚至更优选约99％同源。
根据另一个实施方案，包含本发明的多肽或多肽的组合的本发明组合物能够产生EIV特异性免疫应答。在另一个实施方案中，包含本发明的多肽或多肽的组合的本发明组合物能够产生EIV特异性抗体。在某些实施方案中，所述组合物能够保护免于EIV，包括H3N8EIV。
本发明还应被解释为涵盖本发明多肽(或者编码所述多肽的DNA)的“突变体”、“衍生物”和“变体”，所述突变体、衍生物和变体是在一个或多个氨基酸中发生改变(或当涉及编码所述多肽的核苷酸序列时，在一个或多个碱基对中发生改变)的多肽，以使得所得多肽(或DNA)与本文所述序列不相同，但具有与本文所公开的多肽相同的生物学性质。
减毒活病毒(LAV)
本发明部分涉及产生EIV特异性免疫应答的减毒活病毒(LAV)的产生、选择和鉴定，以及此类病毒在疫苗和药物制剂中的用途。
如本文所述，在某些实施方案中，EIV LAIV包含区段1中的一个或多个突变和/或区段2中的一个或多个突变，所述突变使得病毒对温度敏感。例如，在一个实施方案中，所述温度敏感的EIV LAIV在正常温度和升高的温度下表现出降低的病毒复制。然而，所述温度敏感的EIV LAIV诱导EIV特异性免疫应答和抗体产生，并且因此能够保护免于EIV和EIV相关的病理。
可根据本发明选择和使用具有至少一个突变的任何突变病毒或毒株。在一个实施方案中，可选择天然存在的突变体或变体或自发突变体，所述突变体或变体或自发突变体包含如本文其他地方所述的区段1和/或区段2中的至少一个突变。在另一个实施方案中，突变病毒可通过使病毒暴露于诱变剂(如紫外线照射或化学诱变剂)或通过多次传代和/或在非许可宿主中传代来产生。可使用差异生长系统中的筛选来选择在如本文其他地方所述的区段1和/或区段2中具有至少一个突变的那些突变体。对于具有分段基因组的病毒，可通过重配将减毒表型转移至具有所需抗原的另一毒株(即，通过共感染减毒病毒和所需毒株，并选择显示两种表型的重配株)。
在另一个实施方案中，可使用“反向遗传学”方法来将突变工程化到流感病毒，包括但不限于H3N8 EIV中。以这种方式，可将赋予减毒表型的天然或其他突变工程化到疫苗株中。例如，可工程化编码PB2的区段1和/或编码PB1的区段2的编码区的缺失、插入或取代。还考虑区段1和/或区段2的非编码区中的缺失、取代或插入。为此，可工程化负责区段1和/或区段2的转录、复制、多腺苷酸化和/或包装的信号的突变。
在某些情况下，反向遗传学技术涉及制备合成的重组病毒RNA，所述重组病毒RNA含有负链病毒RNA的非编码区，所述非编码区对于由病毒聚合酶识别和产生成熟病毒粒子所必需的包装信号是必需的。重组RNA由重组DNA模板合成并在体外用纯化的病毒聚合酶复合物重构，以形成可用于转染细胞的重组核糖核蛋白(RNP)。在一些情况下，如果在体外或体内转录合成RNA期间存在病毒聚合酶蛋白，则实现更有效的转染。合成的重组RNP可被挽救成感染性病毒颗粒。前述技术描述于以下中：1992年11月24日发布的美国专利号5,166,057；1998年12月29日发布的美国专利号5,854,037；1996年2月20日公布的欧洲专利公布EP0702085A1；美国专利申请序列号09/152,845；1997年4月3日公布的国际专利公布PCTWO97/12032；1996年11月7日公布的WO96/34625；欧洲专利公布EP-A780475；1999年1月21日公布的WO 99/02657；1998年11月26日公布的WO 98/53078；1998年1月22日公布的WO 98/02530；1999年4月1日公布的WO 99/15672；1998年4月2日公布的WO 98/13501；1997年2月20日公布的WO 97/06270；以及1997年6月25日公布的EPO 780 47SA1，其各自以引用的方式整体并入本文。
通过反向遗传学方法产生的减毒病毒可用于本文所述的疫苗和药物制剂中。反向遗传学技术也可用于工程化对疫苗生产来说重要的其他病毒基因的另外突变—即，可将有用的疫苗株变体的表位工程化到减毒病毒中。或者，可将完全外来表位(包括源自其他病毒或非病毒病原体的抗原)工程化到减毒株中。
在另一个实施方案中，反向遗传学技术和重配技术的组合可用于工程化具有所需表位的减毒病毒。例如，减毒病毒(通过自然选择、诱变或通过反向遗传学技术产生的)和携带所需疫苗表位的毒株(通过自然选择、诱变或通过反向遗传学技术产生的)可在允许分段的基因组重配的宿主中共感染。然后可选择展示减毒表型和所需表位两者的重配株。
本发明的减毒病毒本身可用作疫苗或药物制剂中的活性成分。在某些实施方案中，减毒病毒可用作重组产生的疫苗的载体或“主链”。为此，“反向遗传学”技术可用于将突变工程化或将外来表位引入到减毒病毒中，所述减毒病毒将充当“亲本”毒株。以这种方式，疫苗可被设计用于针对毒株变体的免疫，或者替代地，针对完全不同的传染因子或疾病抗原的免疫。
例如，在一个实施方案中，本发明的免疫组合物包含减毒活病毒，所述减毒活病毒被工程化以表达EIV的一种或多种表位或抗原以及另一种病原体的表位或抗原。例如，可工程化减毒病毒以表达其他预先选择的毒株的中和表位。或者，可将其他病毒的表位构建到减毒突变病毒中。或者，可将非病毒感染性病原体(例如，寄生虫、细菌、真菌)的表位工程化到病毒中。
在一个实施方案中，被选择用于本发明的减毒病毒能够在宿主中诱导稳健抗EIV应答—当用作疫苗时有助于产生强免疫应答的特征，并且其具有使病毒可用作预防和/或治疗其他病毒感染或其他疾病的药物剂的其他生物学后果。
在宿主中诱导EIV特异性免疫应答的减毒病毒也可在用于预防或治疗其他流感感染或流感相关病理的药物制剂中使用。在这方面，可改变减毒病毒的趋向性以在体内或离体使病毒靶向所需的靶器官、组织或细胞。使用这种方法，可在靶部位局部诱导EIV特异性免疫应答，从而避免或最小化全身治疗的副作用。为此，可工程化减毒病毒以表达对靶器官、组织或细胞的受体具有特异性的配体。
疫苗
在某些方面，所述免疫组合物可用作疫苗，其中所述免疫组合物在细胞、组织或哺乳动物中诱导针对抗原的免疫应答。优选地，所述疫苗在哺乳动物中诱导保护性免疫应答。如本文所用，“免疫组合物”可包含例如减毒活病毒(LAV)、抗原(例如多肽)、编码抗原的核酸(例如，抗原表达载体)或者表达或呈递抗原的细胞或细胞组分。在具体实施方案中,所述免疫组合物包含或编码本文所述的任何多肽抗原的全部或部分，或其免疫学功能等效物。在其他实施方案中，所述免疫组合物是在包含额外免疫刺激剂或编码这种剂的核酸的混合物中。免疫刺激剂包括但不限于额外抗原、免疫调节剂、抗原呈递细胞或佐剂。在其他实施方案中，一种或多种所述额外剂以任何组合共价键合至所述抗原或免疫刺激剂。在某些实施方案中，所述抗原组合物缀合至或包含HLA锚定基序氨基酸。
在本发明的上下文中，术语“疫苗”是指在接种到动物中后诱导抗EIV免疫或抑制EIV的物质。
本发明涵盖包含减毒活病毒(LAV)的疫苗制剂，其中所述LAV是减毒活马流感病毒(本文称为EIV LAIV)。例如，在某些实施方案中，与野生型EIV相比，所述EIV LAIV是温度敏感的，从而在正常温度和升高的温度下表现出降低的病毒复制。在一个实施方案中，所述疫苗包含EIV LAIV和合适的赋形剂，所述EIV LAIV包含区段1和/或区段2中的一个或多个突变。疫苗制剂中使用的病毒可选自天然存在的突变体或变体、诱变的病毒或遗传工程化病毒。还可通过重配技术或者通过使用反向遗传学方法与重配技术的组合来产生EIV的减毒株。天然存在的变体包括从自然界分离的病毒以及在病毒繁殖期间产生的自发发生的变体。减毒病毒本身可用作疫苗制剂中的活性成分。或者，减毒病毒可用作重组产生的疫苗的载体或“主链”。为此，可使用重组技术如反向遗传学(或对于分段的病毒，反向遗传学与重配技术的组合)来将突变工程化或将外来抗原引入到疫苗制剂中使用的减毒病毒中。以这种方式，疫苗可被设计用于针对毒株变体的免疫，或者替代地，针对完全不同的传染因子或疾病抗原的免疫。
在一个实施方案中，所述疫苗制剂包含多种突变型EIV。在一个实施方案中，所述疫苗制剂包含二价疫苗，所述二价疫苗包含本文所述的H3N8 EIV LAIV与第二LAIV的组合，其中所述第二LAIV是基于H3N8 EIV LAIV主链、但被工程化以表达另一种毒株的HA和NA病毒蛋白。
在一个实施方案中，所述疫苗制剂可包含一种或多种本文所述的EIV LAIV与诱导抗EIV免疫应答的其他突变型EIV的组合。在一个实施方案中，本发明包括一种产生EIVLAIV的方法，所述方法包括使宿主细胞与包含如本文其他地方所述的具有一个或多个突变的区段1和/或区段2的核酸序列的多核苷酸接触。
病毒在培养物中的繁殖是本领域技术人员已知的。简言之，病毒在通常培养宿主细胞的培养基组合物中生长。用于EIV复制的合适的宿主细胞包括例如Vero细胞、BHK细胞、MDCK细胞、293细胞、COS细胞和CEK细胞，包括293T细胞、COS7细胞。通常，包括两种上述细胞系(例如MDCK细胞和293T或COS细胞)的共培养物以例如1:1的比例使用，以提高复制效率。通常，将细胞在标准商业培养基，如补充有血清(例如，10％胎牛血清)的杜氏改良的伊格尔氏培养基中或在无血清培养基中在受控的湿度和适于维持中性缓冲pH(例如，在7.0与7.2之间的pH)的CO2浓度下培养。任选地，培养基含有防止细菌生长的抗生素，例如青霉素、链霉素等；和/或额外营养素，如L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、非必需氨基酸；促进有利生长特征的额外补充剂，例如胰蛋白酶、β-巯基乙醇等。
已经广泛报道了在培养物中维持哺乳动物细胞的程序，并且所述程序是本领域技术人员已知的。一般方案提供于例如Freshney(1983)Culture of Animal Cells:Manualof Basic Technique,Alan R.Liss,New York；Paul(1975)Cell and Tissue Culture,第5版,Livingston,Edinburgh；Adams(1980)Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology-Cell Culture for Biochemists,Work和Burdon(编)Elsevier,Amsterdam中。关于在体外生产流感病毒特别感兴趣的组织培养程序的另外细节包括例如Merten等人.(1996)Production of influenza virus in cell cultures for vaccinepreparation.在Cohen和Shafferman(编)Novel Strategies in Design and Productionof Vaccines 中，其整体并入本文。另外，适于本发明的此类程序的变化可通过常规实验容易地确定。
用于产生病毒的细胞可在含血清或无血清培养基中培养。在一些情况下，例如，为了制备纯化的病毒，希望在无血清条件下生长宿主细胞。细胞可在小规模，例如小于25ml培养基、培养管或烧瓶中或在伴随搅拌的大烧瓶中、旋转瓶中或在烧瓶、瓶子或反应器培养物中的微载体珠粒上(例如，DEAE-葡聚糖微载体珠粒，如Dormacell，Pfeifer&Langen；Superbead，Flow Laboratories；苯乙烯共聚物-三甲胺珠粒，如Hillex、SoloHill、AnnArbor)培养。微载体珠粒是小球(直径在100-200微米的范围内)，其为每体积细胞培养物的粘附细胞生长提供大的表面积。例如，单升培养基可包括超过2000万个微载体珠粒，从而提供大于8000平方厘米的生长表面。对于病毒的商业生产，例如，对于疫苗生产，通常希望在生物反应器或发酵罐中培养细胞。生物反应器可以从不到1升至超过100升的体积获得，例如，Cyto3生物反应器(Osmonics,Minnetonka,Minn.)；NBS生物反应器(New BrunswickScientific,Edison,N.J.)；来自B.Braun Biotech International(B.Braun Biotech,Melsungen,Germany)的实验室和商业规模生物反应器。
实际上，任何异源基因序列都可被构建到用于疫苗的本发明的病毒中。优选地，诱导针对多种病原体中的任一种的保护性免疫应答的表位或结合中和抗体的抗原可由病毒表达或作为病毒的一部分。例如，可构建到用于疫苗的本发明的病毒中的异源基因序列包括但不限于人免疫缺陷病毒(HIV)的表位，如gp120；乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)；疱疹病毒的糖蛋白(例如gD、gE)；脊髓灰质炎病毒的VP1；非病毒病原体如细菌和寄生虫的抗原决定簇，仅举几个例子。在另一个实施方案中，可表达免疫球蛋白基因的全部或部分。例如，模拟此类表位的抗独特型免疫球蛋白的可变区可构建到本发明的病毒中。在另一个实施方案中，可表达肿瘤相关抗原。
可配制活的重组病毒疫苗或灭活的重组病毒疫苗。活疫苗可以是优选的，因为宿主中的增殖导致与自然感染中发生的相似种类和程度的延长刺激，并且因此赋予显著持久的免疫。此类活重组病毒疫苗制剂的生产可使用常规方法完成，所述方法涉及将病毒在细胞培养物中或在鸡胚的尿囊中繁殖、然后纯化。
许多方法可用于引入上述疫苗制剂，这些方法包括但不限于鼻内、气管内、口服、皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内和皮下引入。可能优选通过针对其设计疫苗的病原体的自然感染途径或者通过亲本减毒病毒的自然感染途径引入病毒疫苗制剂。
包含EIV LAIV的本发明的疫苗可施用一次。或者，包含EIV LAIV的本发明的疫苗可在剂量之间以合适的间隔施用两次或三次或更多次。或者，包含EIV LAIV的本发明的疫苗可根据需要经常施用至动物，优选哺乳动物。
方法
本发明提供了一种治疗或预防马流感感染或EIV相关疾病或病症的方法。在一个实施方案中，所述方法包括施用包含减毒活病毒(LAV)的免疫组合物，其中所述LAV是EIVLAIV。在一个实施方案中，所述方法包括向有需要的受试者施用包含EIV LAIV的免疫组合物，所述EIV LAIV包含区段1和/或区段2中的一个或多个突变。
如本文所述，在某些实施方案中，与野生型EIV相比，所述EIV LAIV是温度敏感的，从而在正常温度和升高的温度下表现出降低的病毒复制。例如，在某些实施方案中，在正常或升高的体温下EIV LAIV的病毒复制比野生型EIV低2倍、低3倍、低5倍、低10倍、低15倍、低20倍、低50倍、低100倍、低500倍或低1000倍。
在某些实施方案中，与灭活的EIV相比，所述EIV LAIV诱导增强的免疫应答。例如，在某些实施方案中，EIV LAIV的诱导的免疫应答比灭活的EIV高2倍、高3倍、高5倍、高10倍、高15倍、高20倍、高50倍、高100倍、高500倍或高1000倍。可使用标准测定来测量由EIV LAIV诱导的免疫应答。例如，在某些实施方案中，通过检测在施用EIV LAIV后受试者中产生的EIV特异性抗体的量来测量由EIV LAIV诱导的免疫应答。
本发明的治疗性组合物可预防性或治疗性地施用于受试者，所述受试者患有疾病或病状，或者处于发展所述疾病或病状的风险中，或者容易发展所述疾病或病状。可使用标准临床方法来鉴别此类受试者。在本发明的上下文中，预防性施用在明显的临床疾病症状显现前发生，以使得疾病或病症的进展可被预防或者被延迟。在药物领域的上下文中，术语“预防”涵盖降低来自疾病的死亡率或发病率负担的任何活动。预防可在一级、二级和三级预防水平下发生。一级预防避免了疾病的发展，二级和三级水平的预防涵盖旨在预防疾病的进展和症状的出现以及通过恢复功能并减少疾病相关并发症来降低已确定的疾病的消极影响的活动。
在某些实施方案中，受试者是哺乳动物。例如，受试者可包括但不限于人、灵长类动物、牛、马、绵羊、猪、狗、猫或啮齿类动物。在一个实施方案中，受试者是马。所述方法可用于治疗或预防任何品种或物种的马的EIV或EIV相关病理。在某些实施方案中，单剂量中活性成分的相对量或剂量频率将根据受试者(例如马)的年龄、性别、体重或品种而变化。
所述组合物可与佐剂组合。佐剂是指当与免疫组合物一起(或相继)施用时增强免疫应答的化合物。合适的佐剂的实例包括霍乱毒素、沙门氏菌毒素、明矾等，但不限于这些实例。此外，本发明的疫苗可适当地与药学上可接受的载体组合。此类载体的实例是无菌水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、培养液等。此外，必要时所述疫苗可含有稳定剂、悬浮剂、防腐剂、表面活性剂等。所述疫苗可全身或局部施用。疫苗施用可通过单次施用来进行或者通过多次施用来强化。
施用
在一个实施方案中，本发明的方法包括将本发明的免疫组合物直接施用于有需要的受试者。所述组合物的施用可包括例如鼻内、肌肉内、静脉内、腹膜、皮下、皮内以及局部施用。
此外，实际剂量和方案可根据所述组合物是否与其他药物组合物组合施用或根据个体间药代动力学、药物处置和代谢方面的差异而变化。本领域技术人员可根据具体情形的紧急程度容易地作出任何必要的调整。
施用方案可影响有效量的构成。可在感染或疾病诊断之前或之后向受试者施用治疗性制剂。此外，若干分开的剂量以及交错的剂量可每天或依次施用，或者所述剂量可连续输注，或者可以是快速浓注。此外，治疗性制剂的剂量可如治疗或预防情形的紧急程度所示按比例增加或减少。
向受试者施用本发明的组合物可使用已知程序、以有效预防或治疗疾病的剂量和时间段进行。实现治疗作用所需的治疗性化合物的有效量可根据诸如以下的因素而变化：所使用的具体化合物的活性；施用时间；化合物的排泄率；治疗的持续时间；与化合物组合使用的其他药物、化合物或物质；所治疗的受试者的疾病或病症的状态、年龄、性别、体重、状况、一般健康状况以及以前的病史，以及医学领域中熟知的类似因素。可调整剂量方案以提供最佳治疗反应。例如，可每日施用若干分开的剂量或可如治疗情况的紧急程度所示按比例减少所述剂量。本发明治疗性化合物的有效剂量范围的非限制性实例是约1至5,000mg/kg体重/天。本领域普通技术人员将能够研究相关因素，并且在不进行过度实验的情况下作出关于治疗性化合物的有效量的决定。
所述化合物可每天数次向受试者施用，或者其可不太频繁地施用，如每天一次、每周一次、每两周一次、每月一次或甚至更不频繁地，如每几个月一次或甚至每年一次或更不频繁。
药物组合物
本发明预期在哺乳动物中通过向有需要的哺乳动物施用本发明的治疗性组合物来治疗或预防EIV或EIV相关病理。取决于例如接受者的生理状况、施用目的是治疗性的还是预防性的和熟练从业人员已知的其他因素，施用根据本发明的组合物可以是连续的或间断的。本发明的组合物的施用可在预先选择的时间段内基本上连续或者可以是一系列间隔的剂量。考虑了局部和全身施用两者。所施用的量将根据各种因素而变化，所述因素包括但不限于：所选组合物、具体疾病、哺乳动物的重量、身体状况和年龄、以及想要实现预防还是治疗。此类因素可由临床医生使用动物模型或本领域熟知的其他测试系统容易地确定。
本发明涵盖包含EIV LAIV的药物组合物，其待用作抗病毒剂或诊断EIV相关疾病和病症的剂。所述药物组合物具有作为抗病毒预防剂的效用，并且可施用于处于感染风险或预期暴露于病毒的受试者。例如，前往EIV盛行的世界的地区的受试者可施用本发明的药物组合物。在某些实施方案中，预期与其他处于风险的受试者接触的受试者可施用本发明的药物组合物。
可使用本文所述的方法工程化本发明的EIV LAIV，以表达将使病毒靶向特定部位的蛋白质或肽。在一个实施方案中，当待靶向的部位表达生长因子(例如VEGF、EGF或PDGF)的受体时，可将EIV LAIV工程化以表达适当的生长因子或其一个或多个部分。因此，根据本发明，可将所述EIV LAIV工程化以表达任何靶基因产物，包括肽、蛋白质，如酶、激素、生长因子、抗原或抗体，所述靶基因产物将用于使病毒靶向需要抗病毒、抗菌、抗微生物或抗癌活性的部位。
引入方法包括但不限于，皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外以及口服途径。本发明的药物组合物可以任何方便的途径，例如通过输注或快速浓注、通过经由上皮或皮肤粘膜内层(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收来施用，并且可与其他生物活性剂一起施用。施用可以是全身施用或局部施用。此外，在优选的实施方案中，可能希望通过任何合适的途径将本发明的药物组合物引入肺部。还可采用肺部施用，例如通过使用吸入器或喷雾器，并与雾化剂一起配制。
在具体的实施方案中，可能希望将本发明的药物组合物局部施用至需要治疗的区域；这可通过例如但不限于以下方式来实现：在外科手术期间局部输注；局部施加，例如在外科手术之后与伤口敷料结合；通过注射；借助于导管；借助于栓剂；或借助于植入物，所述植入物是多孔、非多孔或凝胶状材料，包括膜(如硅橡胶膜)或纤维。
在某些实施方案中，所述药物组合物是适合施用于兽医受试者(包括但不限于马受试者)的兽医用药物组合物。示例性马受试者包括马属的任何成员，包括但不限于马、斑马、驴(ass)和驴(donkey)。
在某些实施方案中，兽医用药物组合物是“可口的”，意指口服兽医用组合物容易被马(包括马)接受而无任何哄骗或具有一些哄骗。
在另一个实施放那中，可在受控释放系统中递送所述药物组合物。在一个实施方案中，可使用泵(参见Langer,同上；Sefton,1987,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201；Buchwald等人,1980,Surgery 88:507；Saudek等人,1989,N.Engl.J.Med.321:574)。在另一个实施方案中，可使用聚合物材料(参见Medical Applications of Controlled Release,Langer和Wise(编),CRC Pres.,Boca Raton,Fla.(1974)；Controlled DrugBioavailability,Drug Product Design and Performance,Smolen和Ball(编),Wiley,New York(1984)；Ranger&Peppas,1983,J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61；还参见Levy等人,1985,Science 228:190；During等人,1989,Ann.Neurol.25:351(1989)；Howard等人,1989,J.Neurosurg.71:105)。在另一个实施方案中，受控释放系统可邻近组合物的靶标(例如肺)放置，因此仅要求全身性剂量的一部分(参见例如，Goodson,1984,Medical Applications of Controlled Release,同上,第2卷,第115-138页)。其他受控制释放系统在Langer(1990,Science 249:1527-1533)的综述中进行了论述。
本发明的药物组合物包含治疗有效量的减毒病毒和药学上可接受的载体。在具体实施方案中，术语“药学上可接受的”是指由联邦政府或州政府的监管机构批准的或在美国药典或其他普遍认可的药典中列出的，用于在动物体内使用。术语“载体”是指与药物组合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。盐水溶液以及水性右旋糖和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水等。这些组合物可呈溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、持续释放制剂等形式。这些组合物可配制为栓剂。口服制剂可包含标准载体，如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的实例描述于E.W.Martin.的“Remington's Pharmaceutical Sciences”中。此类制剂将含有治疗有效量的治疗剂(优选呈纯化形式)连同合适量的载体以便提供用于适当施用至患者的形式。制剂应该适合于施用模式。
在治疗或预防特定病症或病症中有效的本发明的药物组合物的量将取决于所述疾病或病症的性质，并且可通过标准临床技术来确定。此外，可任选地采用体外测定来帮助鉴定最佳剂量范围。待用于制剂的精确剂量还将取决于施用途径和疾病或病症的严重性，并且应根据执业医生的判断和每个患者的情况决定。可由从体外或动物模型测试系统得到的剂量-反应曲线推断有效剂量。
在一个实施方案中，可施用适用于实践本发明的方法的药物组合物以递送1ng/kg/天与100mg/kg/天之间的剂量。在另一个实施方案中，可施用适用于实践本发明的药物组合物以递送1ng/kg/天与500mg/kg/天之间的剂量。
本发明的药物组合物中活性成分、药学上可接受的载体以及任何另外成分的相对量将根据所治疗受试者的身份、体型以及病状而变化，并且进一步取决于待施用组合物的途径。举例来说，所述组合物可包含0.1％与100％(w/w)之间的活性成分。
实验实施例
通过参考以下实验实施例进一步详细地描述本发明。除非另外指明，否则提供这些实施例仅仅是为了说明的目的，并非旨在为限制性。因此，本发明不应以任何方式被解释为限于以下实施例，而是应被解释为涵盖因本文提供的教义而变得显而易见的任何和所有变型。
无需进一步描述，据信本领域的普通技术人员可使用前述的描述和以下说明性实施例，制备和利用本发明并实践所要求保护的方法。因此，以下工作实施例特别指出本发明的优选实施方案，并且不应被解释为以任何方式限制本公开的其余部分。
实施例1：温度敏感的H3N8 EIV LAIV
使用现有技术的基于质粒的反向遗传方法，产生了冷适应的、温度敏感的重组H3N8马流感病毒(EIV)减毒活流感疫苗(LAIV)。为了产生当前描述的H3N8 EIV LAIV，在甲型流感/马/俄亥俄州/1/2003 H3N8的病毒聚合酶PB2(N265S)和PB1(K391E、E581G和A661T)亚基中引入氨基酸取代(图1)。使用小基因组复制测定，据发现引入这些PB2和PB1突变使得病毒基因组复制和基因转录在高温(37℃-39℃)而不是低温(33℃)下降低(图2)。这些结果证明，甲型流感/马/俄亥俄州/1/2003 H3N8的PB2和PB1聚合酶亚基中的氨基酸取代产生冷适应的、温度敏感的表型。接下来评估甲型流感/马/俄亥俄州/1/2003 H3N8的病毒聚合酶PB2和PB1亚基中的这些突变是否会导致限制性温度(37℃-39℃)而不是许可温度(33℃)下的生长动力学受损。在以低感染复数(MOI，0.001)感染的两种犬MDCK细胞中比较了冷适应的、温度敏感的LAIV和野生型甲型流感/马/俄亥俄州/1/2003 H3N8病毒的复制动力学。在33℃下，野生型和LAIV A/马/俄亥俄州/1/2003 H3N8病毒类似地生长并且在峰值感染(感染后约48小时)下达到约108个焦点形成单位(FFU/ml)的病毒滴度。然而，与WT EIV相比，冷适应的、温度敏感的EIV LAIV的复制分别在37℃和39℃下显著降低或受损(图3A-图3C)。值得注意的是，当前描述的EIV LAIV的温度敏感性类似于可商购的EIV LAIV Flu Avert(Merck)的温度敏感性。此外，通过MDCK细胞中的空斑测定进一步证实了当前描述的EIVLAIV的温度敏感性(图4)。这些结果证明，甲型流感/马/俄亥俄州/1/2003 H3N8的PB2和PB1聚合酶亚基中的突变产生冷适应的、温度敏感的表型，在许可(33℃)温度下其仍然能够复制到与WT A/马/俄亥俄州/1/2003 H3N8病毒相当的水平，这对于LAIV制造是重要的。还进行了小鼠中的实验以评价当前描述的EIV LAIV的安全性、免疫原性和保护功效。这些体内实验表明，与EIV WT相比，当前描述的EIV LAIV在下呼吸道中减弱，因为在感染(105FFU)小鼠的肺中无法检测到EIV LAIV的存在(图5A)。另一方面，在感染小鼠的鼻粘膜中EIV LAIV比商业EIV LAIV Flu Avert更好地复制(图5B)。值得注意的是，当前描述的EIV LAIV诱导了与通过感染EIV WT诱导的那些相比类似的体液应答(图6)(包括中和抗体(表3))，并且高于当前EIV LAIV Flu Avert的那些。重要的是，用当前描述的EIV LAIV进行单次鼻内免疫赋予针对EIV WT激发的完全保护(图7)。值得注意的是，保护优于用Flu Avert获得的保护。
除了小鼠研究外，已经在马中评价了当前描述的H3N8 EIV LAIV的安全性、免疫原性和保护功效。来自马研究的数据表明H3N8 EIV LAIV是安全的并且能够赋予针对野生型H3N8 EIV激发的保护。所观察到的保护包括在疫苗接种的马中感染后不同天数缺乏临床症状以及激发野生型病毒的水平降低，而对照模拟疫苗接种的马在激发后2-6天发展EIV感染症状(例如咳嗽和发热)和鼻洗液中高水平的病毒复制。还进行了测定以评价来自模拟疫苗接种的马和疫苗接种的马的保护性免疫应答，包括中和抗体。
总之，这些结果证明了通过将现有技术的基于质粒的反向遗传方法与在A/马/俄亥俄州/1/2003 H3N8的病毒PB2(N265S)和PB1(K391E、E581G和A661T)聚合酶亚基中引入突变组合以产生冷适应的、温度敏感的LAIV来开发用于治疗和控制H3N8EIV的新LAIV候选物的可行性。
实施例2：基于A/马/俄亥俄州/1/2003 H3N8的温度敏感的减毒活马流感病毒
突变的区段1或PB2：
1.区段1(PB2)的突变的核苷酸序列：粗体表示导致PB2蛋白中的N265S氨基酸变化的核苷酸变化。在修饰的PB2区段中引入的ClaI限制性位点加下划线。
2.突变型EIV PB2蛋白的氨基酸序列：粗体表示氨基酸变化N265S。
突变的区段2或PB1：
1.区段2(PB1)的突变的核苷酸序列：粗体表示导致PB2蛋白中的K391E、E581G和A661T氨基酸变化的核苷酸变化。在修饰的PB1区段中引入AatI限制性位点(由下划线表示)和Hind III限制性位点(由下划线+斜体表示)。以下划线+粗体表示从原始PB1序列突变的核苷酸以除去BamHI限制性位点。
2.突变型EIV PB1蛋白的氨基酸序列：粗体表示氨基酸变化K391E、E581G和A661T。
野生型区段1或PB2：
1.野生型EIV H3N8区段1(PB2)的核苷酸序列：
2.野生型EIV H3N8PB2蛋白的氨基酸序列：
野生型区段2或PB1：
1.野生型EIV H3N8区段2(PB1)的核苷酸序列：
2.野生型EIV H3N8 PB1蛋白的氨基酸序列：
本文中引用的每一和各个专利、专利申请和公布的公开内容特此以引用的方式整体并入本文。虽然已参考具体实施方案公开了本发明，但是显而易见的是，本发明的其他实施方案和变化可在不脱离本发明的真实精神和范围的情况下由本领域其他技术人员设计。所附权利要求书意图被解释为包括所有此类实施方案和等效变化。
序列表
<110> 罗切斯特大学(University of Rochester)
路易斯·马丁兹-绍布里多(Martinez-Sobrido, Luis)
<120> 马流感病毒减毒活疫苗
<130> 204606-0093-00-WO.606419
<150> US 62/345,293
<151> 2016-06-03
<160> 22
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 2341
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成的 - 基于A/马/俄亥俄州/1/2003 H3N8 EIV的突变型区段1
<400> 1
agcgaaagca ggtcaaatat attcaatatg gagagaataa aagaactgag agatctgatg 60
ttacaatccc gcacccgcga gatactaaca aaaactactg tggaccacat ggccataatc 120
aagaaataca catcaggaag acaagagaag aaccctgcac ttaggatgaa atggatgatg 180
gcaatgaaat acccaatcac ggcagataag aggataatgg agatgattcc tgagagaaat 240
gaacagggac aaaccctttg gagcaaaacg aacgatgctg gctcagaccg cgtaatggta 300
tcacctctgg cagtgacatg gtggaatagg aatggaccaa caacaagcac aattcattat 360
ccaaaagtct acaaaactta ttttgaaaag gttgaaagat tgaaacacgg aacctttggc 420
cccgttcatt ttaggaatca agtcaagata agacgaagag ttgatgtaaa ccctggtcac 480
gcggacctca gtgccaaaga agcacaagat gtgatcatgg aagttgtttt cccaaatgaa 540
gtgggagcca gaattctaac atcggaatca caactaacaa taaccaaaga gaaaaaggaa 600
gaacttcagg actgcaaaat tgctcccttg atggtagcat acatgctaga aagagagttg 660
gtccgaaaaa caaggttcct cccagtagca ggcggaacaa gcagtgtata cattgaagtg 720
ttgcatctga ctcagggaac atgctgggag caaatgtaca ccccaggagg agaagttaga 780
aacgatgata ttgatcaaag tttaattatt gcagcacgat cgatagtgag aagagcaaca 840
gtatcagcag atccactagc atccctactg gaaatgtgcc acagtacaca gattggtgga 900
ataaggatgg tagacatcct taagcagaat ccaacagagg aacaagctgt ggatatatgc 960
aaagcagcaa tgggattgag aattagctca tcattcagct ttggtggatt caccttcaaa 1020
agaacaagtg gatcatcagt caagagagaa gaagaaatgc ttacgggcaa ccttcaaaca 1080
ttgaaaataa gaatgcatga gggctatgaa gaattcacaa tggtcggaag aagagcaaca 1140
gctattctca gaaaggcaac cagaagattg attcaattga tagtaagtgg gagagatgaa 1200
caatcaattg ctgaagcaat aattgtagcc atggtgtttt cgcaagaaga ttgcatgata 1260
aaagcagttc gaggcgattt gaactttgtt aatagagcaa atcagcgttt gaaccccatg 1320
catcaactct tgaggcattt ccaaaaagat gcaaaagtgc ttttccaaaa ttggggaatt 1380
gaacccatcg acaatgtaat ggggatgatt ggaatattgc ctgacatgac cccaagcacc 1440
gagatgtcat tgagaggagt gagagtcagc aaaatgggag tggatgagta ctccagcact 1500
gagagagtgg tggtgagcat tgaccgtttt ttaagagttc gggatcaaag gggaaacata 1560
ctactgtccc ctgaagaagt cagtgaaaca caaggaacgg aaaagctgac aataatttat 1620
tcgtcatcaa tgatgtggga gattaatggt cccgaatcag tgttggtcaa tacttatcaa 1680
tggatcatca ggaactggga aattgtaaaa attcagtggt cacaggaccc cacaatgtta 1740
tacaataaga tagaatttga gccattccaa tccctggtcc ctagggccac cagaagccaa 1800
tacagcggtt tcgtaagaac cctgtttcag caaatgcgag atgtacttgg aacatttgat 1860
actgctcaaa taataaaact cctccctttt gccgctgctc ctccggaaca gagtaggatg 1920
cagttctctt ctttgactgt taatgtaaga ggttcgggaa tgaggatact tgtaagaggc 1980
aattccccag tgttcaacta caataaagcc actaaaaggc tcacagtcct cggaaaggat 2040
gcaggtgcgc ttactgagga cccagatgaa ggtacggctg gagtagaatc tgctgttcta 2100
agagggtttc tcattttagg taaagaaaac aagagatatg gcccagcact aagcatcaat 2160
gaactaagca aacttgcaaa aggggagaaa gccaatgtac taattgggca aggggacgta 2220
gtgttggtaa tgaaacggaa acgtgactct agcatactta ctgacagcca gacagcgacc 2280
aaaaggattc ggatggccat caattagtgt tgaattgttt aaaaacgacc ttgtttctac 2340
t 2341
<210> 2
<211> 759
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成的 - 基于A/马/俄亥俄州/1/2003 H3N8 EIV的突变型PB2
<400> 2
Met Glu Arg Ile Lys Glu Leu Arg Asp Leu Met Leu Gln Ser Arg Thr
1 5 10 15
Arg Glu Ile Leu Thr Lys Thr Thr Val Asp His Met Ala Ile Ile Lys
20 25 30
Lys Tyr Thr Ser Gly Arg Gln Glu Lys Asn Pro Ala Leu Arg Met Lys
35 40 45
Trp Met Met Ala Met Lys Tyr Pro Ile Thr Ala Asp Lys Arg Ile Met
50 55 60
Glu Met Ile Pro Glu Arg Asn Glu Gln Gly Gln Thr Leu Trp Ser Lys
65 70 75 80
Thr Asn Asp Ala Gly Ser Asp Arg Val Met Val Ser Pro Leu Ala Val
85 90 95
Thr Trp Trp Asn Arg Asn Gly Pro Thr Thr Ser Thr Ile His Tyr Pro
100 105 110
Lys Val Tyr Lys Thr Tyr Phe Glu Lys Val Glu Arg Leu Lys His Gly
115 120 125
Thr Phe Gly Pro Val His Phe Arg Asn Gln Val Lys Ile Arg Arg Arg
130 135 140
Val Asp Val Asn Pro Gly His Ala Asp Leu Ser Ala Lys Glu Ala Gln
145 150 155 160
Asp Val Ile Met Glu Val Val Phe Pro Asn Glu Val Gly Ala Arg Ile
165 170 175
Leu Thr Ser Glu Ser Gln Leu Thr Ile Thr Lys Glu Lys Lys Glu Glu
180 185 190
Leu Gln Asp Cys Lys Ile Ala Pro Leu Met Val Ala Tyr Met Leu Glu
195 200 205
Arg Glu Leu Val Arg Lys Thr Arg Phe Leu Pro Val Ala Gly Gly Thr
210 215 220
Ser Ser Val Tyr Ile Glu Val Leu His Leu Thr Gln Gly Thr Cys Trp
225 230 235 240
Glu Gln Met Tyr Thr Pro Gly Gly Glu Val Arg Asn Asp Asp Ile Asp
245 250 255
Gln Ser Leu Ile Ile Ala Ala Arg Ser Ile Val Arg Arg Ala Thr Val
260 265 270
Ser Ala Asp Pro Leu Ala Ser Leu Leu Glu Met Cys His Ser Thr Gln
275 280 285
Ile Gly Gly Ile Arg Met Val Asp Ile Leu Lys Gln Asn Pro Thr Glu
290 295 300
Glu Gln Ala Val Asp Ile Cys Lys Ala Ala Met Gly Leu Arg Ile Ser
305 310 315 320
Ser Ser Phe Ser Phe Gly Gly Phe Thr Phe Lys Arg Thr Ser Gly Ser
325 330 335
Ser Val Lys Arg Glu Glu Glu Met Leu Thr Gly Asn Leu Gln Thr Leu
340 345 350
Lys Ile Arg Met His Glu Gly Tyr Glu Glu Phe Thr Met Val Gly Arg
355 360 365
Arg Ala Thr Ala Ile Leu Arg Lys Ala Thr Arg Arg Leu Ile Gln Leu
370 375 380
Ile Val Ser Gly Arg Asp Glu Gln Ser Ile Ala Glu Ala Ile Ile Val
385 390 395 400
Ala Met Val Phe Ser Gln Glu Asp Cys Met Ile Lys Ala Val Arg Gly
405 410 415
Asp Leu Asn Phe Val Asn Arg Ala Asn Gln Arg Leu Asn Pro Met His
420 425 430
Gln Leu Leu Arg His Phe Gln Lys Asp Ala Lys Val Leu Phe Gln Asn
435 440 445
Trp Gly Ile Glu Pro Ile Asp Asn Val Met Gly Met Ile Gly Ile Leu
450 455 460
Pro Asp Met Thr Pro Ser Thr Glu Met Ser Leu Arg Gly Val Arg Val
465 470 475 480
Ser Lys Met Gly Val Asp Glu Tyr Ser Ser Thr Glu Arg Val Val Val
485 490 495
Ser Ile Asp Arg Phe Leu Arg Val Arg Asp Gln Arg Gly Asn Ile Leu
500 505 510
Leu Ser Pro Glu Glu Val Ser Glu Thr Gln Gly Thr Glu Lys Leu Thr
515 520 525
Ile Ile Tyr Ser Ser Ser Met Met Trp Glu Ile Asn Gly Pro Glu Ser
530 535 540
Val Leu Val Asn Thr Tyr Gln Trp Ile Ile Arg Asn Trp Glu Ile Val
545 550 555 560
Lys Ile Gln Trp Ser Gln Asp Pro Thr Met Leu Tyr Asn Lys Ile Glu
565 570 575
Phe Glu Pro Phe Gln Ser Leu Val Pro Arg Ala Thr Arg Ser Gln Tyr
580 585 590
Ser Gly Phe Val Arg Thr Leu Phe Gln Gln Met Arg Asp Val Leu Gly
595 600 605
Thr Phe Asp Thr Ala Gln Ile Ile Lys Leu Leu Pro Phe Ala Ala Ala
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Pro Pro Glu Gln Ser Arg Met Gln Phe Ser Ser Leu Thr Val Asn Val
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Arg Gly Ser Gly Met Arg Ile Leu Val Arg Gly Asn Ser Pro Val Phe
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Asn Tyr Asn Lys Ala Thr Lys Arg Leu Thr Val Leu Gly Lys Asp Ala
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Gly Ala Leu Thr Glu Asp Pro Asp Glu Gly Thr Ala Gly Val Glu Ser
675 680 685
Ala Val Leu Arg Gly Phe Leu Ile Leu Gly Lys Glu Asn Lys Arg Tyr
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Gly Pro Ala Leu Ser Ile Asn Glu Leu Ser Lys Leu Ala Lys Gly Glu
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<210> 3
<211> 2341
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成的 - 基于A/马/俄亥俄州/1/2003 H3N8 EIV的突变型区段2
<400> 3
agcgaaagca ggcaaaccat ttgaatggat gtcaatccga ctctactttt cttaaaggtg 60
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ggaacaggga caggatacac catggatact gtcaacagaa cacaccaata ttcagaaaaa 180
gggaaatgga caacaaacac tgagattgga gcaccacaac ttaatccaat cgatggacca 240
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gctttccttg aagaatccca tcccggaatc tttgaaaatt cgtgtcttga aacgatggag 360
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gttggcggta atgagaaaaa ggccaaactg gctaatgtcg tcagaaaaat gatgactaat 900
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ttcagaaatg ttctaagcat tgcaccgatt atgttctcaa ataaaatggc aagactgggg 1080
aaaggatata tgtttgaaag caaaagtatg aaattgagaa ctcaaatacc agcagaaatg 1140
ctagcaagca ttgacctgaa atatttcaat gattcaacaa aaaagaaaat tgaagaaata 1200
aggcctcttc tggttgacgg gactgcttca ctgagtcctg gcatgatgat gggaatgttc 1260
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<210> 4
<211> 757
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成的 - 基于A/马/俄亥俄州/1/2003 H3N8 EIV的突变型PB1
<400> 4
Met Asp Val Asn Pro Thr Leu Leu Phe Leu Lys Val Pro Ala Gln Asn
1 5 10 15
Ala Ile Ser Thr Thr Phe Pro Tyr Thr Gly Asp Pro Pro Tyr Ser His
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Asn Thr Ile Glu Val Phe Arg Ser Asn Gly Leu Thr Ser Asn Glu Ser
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Gly Arg Leu Met Asp Phe Leu Lys Asp Val Met Glu Ser Met Asn Lys
165 170 175
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Val Gly Gly Asn Glu Lys Lys Ala Lys Leu Ala Asn Val Val Arg Lys
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Lys Thr Thr Tyr Trp Trp Asp Gly Leu Gln Ser Ser Asp Asp Phe Ala
435 440 445
Leu Ile Val Asn Ala Pro Asn His Glu Gly Ile Gln Ala Gly Val Asp
450 455 460
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Lys Lys Leu Trp Gly Gln Thr Arg Ser Lys Thr Gly Leu Leu Val Ser
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Leu Arg Arg Gln Lys
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<211> 2341
<212> DNA
<213> 甲型流感病毒
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agcgaaagca ggtcaaatat attcaatatg gagagaataa aagaactgag agatctgatg 60
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aacgatgata ttgatcaaag tttaattatt gcagcacgga acatagtgag aagagcaaca 840
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ataaggatgg tagacatcct taagcagaat ccaacagagg aacaagctgt ggatatatgc 960
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agaacaagtg gatcatcagt caagagagaa gaagaaatgc ttacgggcaa ccttcaaaca 1080
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tcgtcatcaa tgatgtggga gattaatggt cccgaatcag tgttggtcaa tacttatcaa 1680
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tacaataaga tagaatttga gccattccaa tccctggtcc ctagggccac cagaagccaa 1800
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atgtgaacaa agttacatat ggaaaatgcc ccaagtatat caggcaaaac actttaaagc 1020
tggccactgg gatgaggaat gtaccagaaa agcaaatcag aggaatcttc ggagcaatag 1080
cgggattcat cgaaaacggc tgggaaggaa tggttgatgg gtggtatggg ttccgatatc 1140
aaaactctga aggaacaggg caagctgcag atctaaagag cactcaagca gccatcgacc 1200
agattaatgg aaagttaaac agagtgattg aaagaaccaa tgagaaattc catcaaatag 1260
agaaggaatt ctcagaagta gaaggaagaa ttcaggactt ggagaaatat gtagaagaca 1320
ccaaaataga cctatggtcc tacaatgcag aattgctggt ggctctagaa aatcaacata 1380
caattgactt aacagatgca gaaatgaata aattatttga gaagactaga cgccagttaa 1440
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<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 12
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1 5 10 15
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Gln Ser Gly Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly Asp
245 250 255
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260 265 270
Phe Lys Leu Lys Thr Gly Lys Ser Ser Val Met Arg Ser Asp Val Pro
275 280 285
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325 330 335
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<212> DNA
<213> 甲型流感病毒
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<213> 甲型流感病毒
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<213> 甲型流感病毒
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Glu Glu Val Arg His Arg Leu Lys Asn Thr Glu Asn Ser Phe Glu Gln
85 90 95
Ile Thr Phe Met Gln Ala Leu Gln Leu Leu Leu Glu Val Glu Gln Glu
100 105 110
Ile Arg Thr Phe Ser Phe Gln Leu Ile
115 120

Claims (33)

1.一种包含马减毒活流感病毒的免疫组合物，其中所述病毒包含病毒基因组的区段1和区段2中的一者或多者中的一个或多个突变。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述区段1包含SEQ ID NO:1中列出的核酸序列。
3.如权利要求1-2中任一项所述的组合物，其中所述区段2包含SEQ ID NO:3中列出的核酸序列。
4.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述病毒包含区段1中的一个或多个突变，所述区段1编码突变型PB2。
5.如权利要求4所述的组合物，其中突变型PB2包含N265S点突变。
6.如权利要求4-5中任一项所述的组合物，其中突变型PB2包含SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列。
7.如权利要求1-6中任一项所述的组合物，其中所述病毒包含区段2中的一个或多个突变，所述区段2编码突变型PB1。
8.如权利要求7所述的组合物，其中突变型PB1包含以下中的一者或多者：K391E点突变、E581G点突变和A661T点突变。
9.如权利要求7-8中任一项所述的组合物，其中突变型PB1包含K391E点突变、E581G点突变和A661T点突变。
10.如权利要求7-9中任一项所述的组合物，其中突变型PB1包含SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列。
11.如权利要求1所述的组合物，其中所述病毒包含区段1中的一个或多个突变，所述区段1编码突变型PB2；以及区段2中的一个或多个突变，所述区段2编码突变型PB1。
12.如权利要求11所述的组合物，其中突变型PB2包含N265S点突变，并且其中突变型PB1包含K391E点突变、E581G点突变和A661T点突变。
13.如权利要求1-12中任一项所述的组合物，其中所述病毒是源自马甲型流感病毒的H3N8亚型。
14.如权利要求1-13中任一项所述的组合物，其中所述组合物用于治疗受试者的马流感。
15.如权利要求1-13中任一项所述的组合物，其中所述病毒是表达突变型EIVH3N8PB2、突变型EIV H3N8PB1以及不同EIV毒株的HA和NA的主供体病毒(MDV)。
16.一种在受试者中诱导针对马流感病毒的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含马减毒活流感病毒的免疫组合物，其中所述病毒包含病毒基因组的区段1和区段2中的一者或多者中的一个或多个突变。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述区段1包含SEQ ID NO:1中列出的核酸序列。
18.如权利要求16-17中任一项所述的方法，其中所述区段2包含SEQ ID NO:3中列出的核酸序列。
19.如权利要求16-18中任一项所述的方法，其中所述病毒包含区段1中的一个或多个突变，所述区段1编码突变型PB2。
20.如权利要求19所述的方法，其中突变型PB2包含N265S点突变。
21.如权利要求19-20中任一项所述的方法，其中突变型PB2包含SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列。
22.如权利要求16-21中任一项所述的方法，其中所述病毒包含区段2中的一个或多个突变，所述区段2编码突变型PB1。
23.如权利要求22所述的方法，其中突变型PB1包含以下中的一者或多者：K391E点突变、E581G点突变和A661T点突变。
24.如权利要求22-23中任一项所述的方法，其中突变型PB1包含K391E点突变、E581G点突变和A661T点突变。
25.如权利要求22-24中任一项所述的方法，其中突变型PB1包含SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列。
26.如权利要求16所述的方法，其中所述病毒包含区段1中的一个或多个突变，所述区段1编码突变型PB2；以及区段2中的一个或多个突变，所述区段2编码突变型PB1。
27.如权利要求26所述的方法，其中突变型PB2包含N265S点突变，并且其中突变型PB1包含K391E点突变、E581G点突变和A661T点突变。
28.如权利要求16-27中任一项所述的方法，其中所述病毒是源自马甲型流感病毒的H3N8亚型。
29.如权利要求16-28中任一项所述的方法，其中所述受试者不患有马流感，并且其中所述方法诱导针对马流感的免疫。
30.如权利要求16-28中任一项所述的方法，其中所述受试者感染马流感，并且其中所述方法诱导治疗性免疫应答。
31.如权利要求16-30中任一项所述的方法，其中鼻内、气管内、口服、皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内或皮下施用所述免疫组合物。
32.如权利要求16-31中任一项所述的方法，其中所述受试者是马。
33.如权利要求16-32中任一项所述的方法，其中所述病毒是表达突变型EIV H3N8PB2、突变型EIV H3N8PB1以及不同EIV毒株的HA和NA的主供体病毒(MDV)。
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