CN111041005B - 重组人偏肺病毒及其制备方法和应用 - Google Patents

重组人偏肺病毒及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了重组人偏肺病毒及其制备方法和应用。本发明首先公开了重组病毒，该重组病毒的冷适应、减毒流感病毒的NS基因、靶标流感病毒的HA基因和靶标流感病毒的NA基因中任一种基因被替换。本发明进一步公开了上述重组病毒在制备预防和/或治疗流感病毒和/或人偏肺病毒引起的疾病的产品中的应用。本发明从基因水平对HMPV抗原表位和流感病毒基因组进行操作，制备冷适应流感病毒为载体的重组HMPV疫苗株，解决了HMPV疫苗免疫引发的免疫损伤难题，将是呼吸道传染性疾病疫苗领域的新里程碑。另外，本发明提供的HMPV嵌合疫苗保护更多人群免受流感病毒和HMPV之害，为实现“一苗两用”或“一苗多用”目的奠定了基础。

Description

重组人偏肺病毒及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域。具体涉及重组人偏肺病毒及其制备方法和应用。
背景技术
人偏肺病毒(Human metapneumovirus，HMPV)病毒是2001年由荷兰科学家van denHoogen BG发现的一种呼吸道病毒，现已成为人类急性呼吸道感染最终导致急性呼吸综合窘迫症(Acute respiratory distress syndrome，ARDS)的重要病原体。HMPV呈全球流行，在婴幼儿是仅次于呼吸道合胞病毒(Respiraory syncytial virus，RSV)引起呼吸道感染的第二位病原，小于1岁婴儿的感染率最高，也是引起免疫功能低下者和老年人下呼吸道感染的常见病因。权威资料显示，在急性呼吸道感染的婴幼儿中约10-12％是hMPV引起的，也是导致ARDS的重要病因。因此，HMPV防控形势严峻，已成为当今生命科学的重大科学问题。
疫苗接种是预防和控制人类传染病的最有效措施。近年来HMPV疫苗发展迅速，许多灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、病毒载体疫苗已在动物实验中显示较好的免疫原性和免疫保护作用，有望为HMPV的免疫预防提供候选疫苗。然而，HMPV灭活疫苗、亚单位疫苗存在潜在免疫病理损伤，且注射途径不能诱导黏膜免疫及减毒活疫苗存在“毒力返祖”和免疫过激难题，给HMPV疫苗研发提出了挑战。因此，解决HMPV疫苗免疫引发的免疫损伤难题是发展安全、有效HMPV疫苗的关键。
当前，基于流感病毒反向遗传学技术(Reverse Genetics，RG)的冷适应流感减毒活疫苗已批准上市显示安全、有效，使流感病毒作为表达外源基因载体研究备受瞩目(Yamayoshi S，Kawaoka Y.Current and future influenza vaccines.Nature medicine2019；25：212-220.)。将流感病毒作为递送系统成功研制了可实现交叉免疫保护、安全有效、多价的嵌合疫苗候选株，然而将流感病毒作为表达HMPV病毒抗原表位的载体，用于研制重组HMPV病毒株至今尚未报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为如何有效避免HMPV疫苗免疫引发的免疫损伤难题。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了重组病毒。
本发明所述重组病毒按照包括如下步骤的方法制备：将分别含有冷适应、减毒流感病毒的PB2基因、含有冷适应、减毒流感病毒的PB1基因、含有冷适应、减毒流感病毒的PA基因、含有冷适应、减毒流感病毒的NP基因、含有冷适应、减毒流感病毒的M基因和含有冷适应、减毒流感病毒的NS基因的重组质粒，以及分别含有靶标流感病毒的HA基因和含有靶标流感病毒的NA基因的重组质粒共转染宿主细胞，培养得到重组病毒；
所述冷适应、减毒流感病毒的NS基因、所述靶标流感病毒的HA基因和所述靶标流感病毒的NA基因中任一种基因被替换：所述冷适应、减毒流感病毒的NS基因替换为名称为HMPV-PTBE-NS基因的重组DNA分子，所述靶标流感病毒的HA基因替换为名称为HMPV-PTBE-HA基因的重组DNA分子，所述靶标流感病毒的NA基因替换为名称为HMPV-PTBE-NA基因的重组DNA分子；
所述HMPV-PTBE-NS基因是在所述冷适应、减毒流感病毒的NS基因的开放读码框的自5′末端起第375位至第376位核苷酸之间插入HMPV-PTBE基因，并保持所述冷适应、减毒流感病毒的NS基因的其它核苷酸不变得到的重组DNA分子；
所述HMPV-PTBE-HA基因是在所述靶标流感病毒的HA基因的开放读码框的自5′末端起第51位至第52位核苷酸之间插入HMPV-PTBE基因，并保持所述靶标流感病毒的HA基因的其它核苷酸不变得到的重组DNA分子；
所述HMPV-PTBE-NA基因是在所述靶标流感病毒的NA基因的开放读码框的自5′末端起第192位至第193位核苷酸之间插入HMPV-PTBE基因，并保持所述靶标流感病毒的NA基因的其它核苷酸不变得到的重组DNA分子；
所述HMPV-PTBE基因编码人偏肺病毒的T细胞优势抗原表位和人偏肺病毒的B细胞优势抗原表位。
上述重组病毒中，所述HMPV-PTBE基因编码氨基酸序列是SEQ ID NO.5所示的蛋白质。
上述重组病毒中，所述HMPV-PTBE基因的核苷酸序列是SEQ ID NO.1所示的DNA分子。
上述重组病毒中，所述HMPV-PTBE-NS基因是在所述冷适应、减毒流感病毒的NS基因的开放读码框的自5′末端起第375位至第376位核苷酸之间插入HMPV-PTBE基因，所述冷适应、减毒流感病毒的NS基因的开放读码框的自5′末端起第375位核苷酸与所述HMPV-PTBE基因通过5′-TAATG-3′进行连接，所述HMPV-PTBE基因通过5′-TAA-3′与所述冷适应、减毒流感病毒的NS基因的开放读码框的自5′末端起第376位核苷酸连接，并保持所述冷适应、减毒流感病毒的NS基因的其它核苷酸不变得到的重组DNA分子；
所述HMPV-PTBE-HA基因是在所述靶标流感病毒的HA基因的开放读码框的自5′末端起第51位至第52位核苷酸之间插入HMPV-PTBE基因，所述靶标流感病毒的HA基因的开放读码框的自5′末端起第51位核苷酸与所述HMPV-PTBE基因通过5′-GCAGCAGCACCTGGAGCAGCA-3′进行连接，所述HMPV-PTBE基因通过与所述靶标流感病毒的HA基因的开放读码框的自5′末端起第52位核苷酸连接，并保持所述靶标流感病毒的NS基因的其它核苷酸不变得到的重组DNA分子。
上述重组病毒中，
所述HMPV-PTBE-NS基因的核苷酸序列是SEQ ID NO.2第15-1884位所示的DNA分子；
所述HMPV-PTBE-NA基因的核苷酸序列是SEQ ID NO.3第15-2428位所示的DNA分子；
所述HMPV-PTBE-HA基因的核苷酸序列是SEQ ID NO.4第15-2810位所示的DNA分子。
上述重组病毒中，所述靶标流感病毒为未经过任何处理的(如未经过减毒、未经过冷适应)的普通野生型流感病毒，本发明中所述靶标流感病毒可为流感病毒的当年流行株，具体的为A型流感病毒或B型流感病毒。
上述重组病毒中，所述A型流感病毒为H1N1亚型流感病毒，具体的为流感病毒株A/California/07/2009；
所述B型流感病毒为Victoria系或Yamagata系流感病毒；具体的为流感病毒株B/Brisbane/60/2008(Bv)、流感病毒株B/Phuket/3073/2013(By)。上述重组病毒中，所述冷适应、减毒流感病毒为冷适应、减毒A型流感病毒或冷适应、减毒B型流感病毒，具体的所述冷适应、减毒A型流感病毒为冷适应、减毒流感病毒株A/AnnArbor/06/60，所述冷适应、减毒B型流感病毒为冷适应、减毒流感病毒株B/AnnArbor/1/66。
上述重组病毒中，所述宿主细胞为MDCK、Vero、293T、COS细胞或MDCK/293T、MDCK/COS共培养的细胞。
本发明中，所述重组质粒的出发质粒为双向转录表达载体pAD3000；构建所述重组质粒时，均将各基因插在双向转录表达载体pAD3000的BsmBI位点。
所述冷适应、减毒流感病毒的PB2是GenBank号为AY209938.1(update date为31-MAY-2005)所编码的蛋白质；所述冷适应、减毒流感病毒的PB1是GenBank号为M23972.1(update date为05-JUN-2006)所编码的蛋白质；所述冷适应、减毒流感病毒的PA是GenBank号为M23974.1(update date为05-JUN-2006)所编码的蛋白质；所述冷适应、减毒流感病毒的NP是GenBank号为M23976.1(update date为25-MAY-2006)所编码的蛋白质；所述冷适应、减毒流感病毒的M是GenBank号为M23978.1(update date为13-JUL-2006)所编码的蛋白质；所述冷适应、减毒流感病毒的NS是GenBank号为M23968.1(update date为05-JUN-2006)所编码的蛋白质；所述靶标流感病毒的HA是GenBank号为NC_026433.1(update date为13-AUG-2018)所编码的蛋白质；所述靶标流感病毒的NA是GenBank号为NC_026434.1(updatedate为13-AUG-2018)所编码的蛋白质。
上述重组人偏肺病毒中，所述冷适应、减毒流感病毒的PB2的基因为GenBank号为AY209938.1(update date为31-MAY-2005)；所述冷适应、减毒流感病毒的PB1的基因为GenBank号为M23972.1(update date为05-JUN-2006)；所述冷适应、减毒流感病毒的PA的基因为GenBank号为M23974.1(update date为05-JUN-2006)；所述冷适应、减毒流感病毒的NP的基因为GenBank号为M23976.1(update date为25-MAY-2006)；所述冷适应、减毒流感病毒的M的基因为GenBank号为M23978.1(update date13-JUL-2006)；所述冷适应、减毒流感病毒的NS的基因为GenBank号为M23968.1(update date为05-JUN-2006)；所述靶标流感病毒的HA的基因为GenBank号为NC_026433.1(update date为13-AUG-2018)；所述靶标流感病毒的NA的基因为GenBank号为NC_026434.1(update date为13-AUG-2018)。
上述重组病毒制备得到的嵌合疫苗也在本发明的保护范围之内。
本发明进一步提供了上述重组病毒和/或嵌合疫苗在制备预防和/或治疗流感病毒和/或人偏肺病毒引起的疾病的产品中的应用。
SEQ ID NO.1所示的DNA分子或SEQ ID NO.5所示的蛋白质也在本发明的保护范围之内。
SEQ ID NO.1所示的DNA分子或SEQ ID NO.5所示的蛋白质在制备预防和/或治疗流感病毒和/或人偏肺病毒引起的疾病的产品中的应用也在本发明的保护范围之内。
本发明从基因水平对HMPV抗原表位和流感病毒基因组进行操作，基于RG技术制备冷适应流感病毒为载体的重组HMPV疫苗株，解决了HMPV疫苗免疫引发的免疫损伤难题，将是呼吸道传染性疾病疫苗领域的新里程碑。另外，本发明提供的HMPV嵌合疫苗可以覆盖HMPV传染病病原体，保护更多人群免受流感病毒和HMPV之害，为实现“一苗两用”或“一苗多用”目的奠定了基础。
附图说明
图1为HMPV-PTBE-NS基因的构建策略示意图。
图2为重组病毒rFLU-HMPV-PTBE-NS免疫小鼠后野生HMPV攻击肺组织H&E染色结果。
图3为重组病毒rFLU-HMPV-PTBE-NS免疫小鼠后野生HMPV攻击肺组织病毒载量检测结果。
图4为HMPV-PTBE-NA基因的构建策略示意图。
图5为重组病毒rFLU-HMPV-PTBE-NA免疫小鼠后野生HMPV攻击肺组织H&E染色结果。
图6为重组病毒rFLU-HMPV-PTBE-NA免疫小鼠后野生HMPV攻击肺组织病毒载量检测结果。
图7为HMPV-PTBE-HA基因的构建策略示意图。
图8为重组病毒rFLU-HMPV-PTBE-HA免疫小鼠后野生HMPV攻击肺组织H&E染色结果。
图9为重组病毒rFLU-HMPV-PTBE-HA免疫小鼠后野生HMPV攻击肺组织病毒载量检测结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实验例1嵌合HMPV-PTBE-NS抗原表位的重组人偏肺病毒(HMPV)疫苗制备
本实施例提供了重组人偏肺病毒(HMPV)，该重组人偏肺病毒表达名称为HMPV-PTBE的蛋白质，所述HMPV-PTBE人偏肺病毒HMPV的T、B细胞优势抗原表位(potential T andB cell epitopes，PTBE)，其氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示，由SEQ ID NO.1所示的HMPV-PTBE基因编码。
一、重组质粒的构建：
1、pAD-PTBE-NS的构建
以冷适应、减毒流感病毒株A/AnnArbor/06/60的NS基因片段为插入该表位基因的靶点，构建重组质粒pAD-PTBE-NS。
合成如SEQ ID NO.2所示的基因(结构如图1所示)，其中，SEQ ID No.2中自5’端起第1位至第14位为保护性碱基+酶切位点，SEQ ID NO.2第15-1884位为HMPV-PTBE-NS基因；SEQ ID NO.2第1885-1899位为保护性碱基+酶切位点。在HMPV-PTBE-NS基因中，SEQ IDNO.2第15-40位为3′端非编码区(26nt)，SEQ ID NO.2第41-415位为冷适应、减毒流感病毒株A/AnnArbor/06/60的NS基因前375个核苷酸(即NS基因的开放读码框的自5′末端第1-375位)，SEQ ID NO.2第421-1392位为HMPV-PTBE抗原表位基因，SEQ ID NO.2第1396-1832位为冷适应、减毒流感病毒株A/AnnArbor/06/60的NS基因后437个核苷酸(即NS基因的开放读码框的自5′末端第376-812位)，SEQ ID NO.2第1859-1884位为5′端非编码区(26nt)；所述HMPV-PTBE抗原表位基因的编码序列的5′端连接5′-TAATG-3′，在所述HMPV-PTBE抗原表位基因的编码序列的3′端连接5′-TAA-3′。
利用分子生物学方法，酶切SEQ ID NO.2所示的基因序列与双向转录表达载体pAD3000(具体见专利：CN200610007909.5)，酶切片段连接，挑选阳性克隆，构建好的重组质粒经测序鉴定，片段大小与预期完全一致，并且无基因突变，将经鉴定正确的重组质粒命名为pAD-PTBE-NS。
所述pAD-PTBE-NS为将pAD3000的BsmbI的酶切位点间替换为SEQ ID NO.2第11-1889位所示的基因片段，且保持pAD3000其它序列不变得到的重组质粒。
2、pAD-PB2、pAD-PB1、pAD-PA、pAD-NP、pAD-M的构建
冷适应、减毒流感病毒株A/AA/06/60的5个内部病毒基因骨架PB2(GenBank号为AY209938.1(update date为31-MAY-2005))、PB1(GenBank号为M23972.1(update date为05-JUN-2006))、PA(GenBank号为M23974.1(update date为05-JUN-2006))、NP(GenBank号为M23976.1(update date为25-MAY-2006))和M(GenBank号为M23978.1(update date为13-JUL-2006))分别与双向转录表达载体pAD3000连接，构建重组质粒(具体构建方法见专利：CN200610007909.5)，将经鉴定正确的重组质粒分别命名为pAD-PB2、pAD-PB1、pAD-PA、pAD-NP、pAD-M。
所述pAD-PB2是将pAD3000的Aarl的酶切位点间替换为GenBank号为AY209938.1所示的基因片段，且保持pAD3000其它序列不变得到的重组质粒；
所述pAD-PB1是将pAD3000的BsmbI的酶切位点间替换为GenBank号为M23972.1所示的基因片段，且保持pAD3000其它序列不变得到的重组质粒；
所述pAD-PA是将pAD3000的BsmbI的酶切位点间替换为GenBank号为M23974.1所示的基因片段，且保持pAD3000其它序列不变得到的重组质粒；
所述pAD-NP是将pAD3000的BsmbI的酶切位点间替换为GenBank号为M23976.1所示的基因片段，且保持pAD3000其它序列不变得到的重组质粒；
所述pAD-M是将pAD3000的BsmbI的酶切位点间替换为GenBank号为M23978.1所示的基因片段，且保持pAD3000其它序列不变得到的重组质粒。
3、pAD-HA、pAD-NA的构建
流感病毒当年流行株H1N1亚型(流感病毒株A/California/07/2009，记载在非专利文献“Yang P，Duan Y，Wang C，Xing L，Gao X，Tang C，Luo D，Zhao Z，Jia W，Peng D，LiuX，Wang X.Immunogenicity and protective efficacy of a live attenuated vaccineagainst the 2009 pandemic A H1N1 in mice and ferrets.Vaccine.2011 Jan 17；29(4)：698-705.”)的HA(GenBank号为NC_026433.1(update date为13-AUG-2018))、NA(GenBank号为NC_026434.1(update date为13-AUG-2018))基因分别与双向转录表达载体pAD3000连接，构建的重组质粒(具体构建方法参考：杨鹏辉：重配H1N1亚型流感病毒减毒疫苗株的研究.博士论文)，将经鉴定正确的重组质粒分别命名为pAD-HA和pAD-NA。
所述pAD-HA是将pAD3000的BsmbI的酶切位点间替换为GenBank号为NC_026433.1所示的基因片段，且保持pAD3000其它序列不变得到的重组质粒；
所述pAD-NA是将pAD3000的BsaI的酶切位点间替换为GenBank号为NC_026434.1所示的基因片段，且保持pAD3000其它序列不变得到的重组质粒。
二、重组人偏肺病毒的拯救
1、细胞培养
将COS-1细胞(ATCC编号为CRL-1650TM)与DMEM+10％FBS培养基(购自美国Sigma公司)混匀，得到COS-1细胞培养体系；将MDCK细胞(ATCC编号为CRL-2935TM)与1XDMEM+10％FBS培养基(购自美国Sigma公司)混匀，得到MDCK细胞培养体系。将COS-1细胞培养体系与MDCK细胞培养体系按照体积比2∶1的比例混匀，得到COS-1/MDCK共培养细胞(COS-1细胞数为2×105；MDCK细胞数为1×105)。
2、转染
将步骤一得到的pAD-PTBE-NS、pAD-PB2、pAD-PB1、pAD-PA、pAD-NP、pAD-M、pAD-HA和pAD-NA共8个质粒各0.2μg等量混合后加入10uL转染试剂(Effectene，购自美国QIAGEN公司，目录号：301425)室温作用10min，共转染COS-1/MDCK共培养细胞，于33℃，5％CO2，培养48-60h，得到细胞悬液，将细胞悬液接种9-11日龄SPF鸡胚，于33℃培养72h，收获鸡胚尿囊液，并进行血凝(HA)试验，HA试验结果显示：重组HMPV疫苗株的鸡胚平均HA效价范围为1∶27-1∶28。
成功获得嵌合HMPV-PTBE-NS抗原表位的重组HMPV疫苗株命名为rFLU-HMPV-PTBE-NS。
所述血凝(HA)试验具体步骤如下：
(1)取一次性96孔U型板，在板的边缘标记好所要测定的样品名称。
(2)U型板第一孔对病毒做1∶2稀释，加入100μL稀释的病毒混合液，从第二
孔开始一律加入50μL病毒稀释液。
(3)用200μL移液器反复吹打第一孔，使病毒混合液充分混匀，吸出50μL混合液加入U型板的第二孔，以相同方式一直稀释至倒数第二孔。倒数第二孔混匀后，弃掉50μL病毒混合液，保留最后一排孔做阴性对照孔。
(4)向每个孔中均加入50μL的1％鸡红细胞悬液，混匀后室温静置30min。
(5)观察结果：以++++，+++，++，+表示，一层红细胞均匀铺于孔上者为++++，基本同上，边缘不整齐，面积稍小者为+++，红细胞形成一个环状，边缘不光滑，四周有小凝块记为++，红细胞孔底形成一个小团，边缘光滑并有立体感，将板倾斜片刻，就可见红细胞滑动像人的眼泪样都为-。
(6)血凝效价的计算：结果以++为终点，即为一个凝集单位。最高稀释度病毒能引起++的为红细胞凝集终点，此稀释度的倒数为红细胞凝集效价简称血凝效价。
三、重组人偏肺病毒的鉴定
对rFLU-HMPV-PTBE-NS进行鉴定，电镜观察病毒形态，病毒粒子多呈球形，少数呈丝状，大小不完全一致，其中球形直径80～120nm，有囊膜，符合流感病毒典型形态特征。
将rFLU-HMPV-PTBE-NS接种9-11日龄SPF鸡胚，取第二代鸡胚尿囊液提取病毒RNA，经过RT-PCR，扩增出8个基因片段进行测序，结果与预期基因序列完全一致。其中，各个8个基因片段的扩增引物如表1所示。
表1 8个基因片段的扩增引物序列
Figure BDA0002350054850000081
Figure BDA0002350054850000091
将rFLU-HMPV-PTBE-NS经鸡胚大量培养，超滤浓缩、蔗糖梯度离心纯化后，跑SDS-PAGE电泳，凝胶染色、脱色后，SDS-PAGE可观察到清晰的两条带，大小约为60KD和30KD，证明抗原的主要成分存在。
四、检测rFLU-HMPV-PTBE-NS的温度敏感(Temperature sensitive，ts)、冷适应(Cold adapted，ca)和减毒(Attenuated，att)表型
将rFLU-HMPV-PTBE-NS接种MDCK细胞，分别于25、33、37℃条件下培养，收集细胞上清测定病毒滴度。具体方法如下：
用含有10％的FBS(HYCLONE)的DMEM(SIGMA)培养MDCK细胞(ATCC编号为CRL-2935TM)，并将其种植于96孔板，24h后细胞数需达到90％以上，用不含血清的DMEM培养基洗细胞3遍。然后稀释10倍的病毒样品rFLU-HMPV-PTBE-NS来感染96孔板中的细胞，设6个孔。以未加病毒的细胞做阴性对照，设6个孔；以冷适应、减毒流感病毒株A/AA/06/60和野生型A/California/7/2009为对照，分别设6个孔。为了测定重组rFLU-HMPV-PTBE-NS的温度敏感性，加入病毒的板子分别在33℃、37℃的温度条件的CO2孵箱内培养6天，测定其冷适应性需要在25℃培养10天。病毒滴度用Karber方法计算，用log10平均值(n＝6)TCID50Titer/ml土SD来表示。此值在33-37℃之间的不同代表温度敏感现象，在25-33℃之间的差异代表冷适应性。
结果如表2所示：rFLU-HMPV-PTBE-NS既有温度敏感现象，又有冷适应性。25-33℃之间病毒滴度的差异在0.2-0.4 log10，说明了其具有冷适应性。37℃病毒生长滴度小于33℃病毒滴度2log10，33-37℃之间病毒滴度的差异在原病毒和重组病毒之间的差异是3.3-4.2log10。说明重组rFLU-HMPV-PTBE-NS比较安全，在人体温下不会大量繁殖，可以直接用于疫苗的生产。
表2、rFLU-HMPV-PTBE-NS的温度敏感及冷适应型结果
Figure BDA0002350054850000092
Figure BDA0002350054850000101
注：Ca-ts代表冷适应性和温度敏感性
五、小鼠体内免疫实验
将rFLU-HMPV-PTBE-NS经超滤浓缩、蔗糖密度梯度离心纯化后，以PBS为溶剂制备减毒活疫苗剂。
选用6-8周龄BALB/c小鼠，分为rFLU-HMPV-PTBE-NS组和PBS组，每组20只，设置3次重复。
rFLU-HMPV-PTBE-NS组：将减毒活疫苗剂滴鼻免疫BALB/c小鼠，免疫2次，间隔3周，剂量105TCID50每只小鼠。
PBS组：PBS代替为减毒活疫苗剂，同时免疫方式、免疫体积及免疫时间与rFLU-HMPV-PTBE-NS组一致。
将rFLU-HMPV-PTBE-NS组和PBS组分别于初次免疫后、二次免疫后2周，经眼底采血，离心收集各组小鼠的血清
HI方法(参考OIE推荐标准方法)测定rFLU-HMPV-PTBE-NS针对野生型流感病毒A/California/07/2009的抗体效价，NT方法(记载在非专利文献：Li X，Guo L，Kong M，Su X，Yang D，Zou M，Liu Y，Lu L.Design and Evaluation of a Multi-Epitope Peptide ofHuman Metapneumovirus.Intervirology 2015；58：403-412.)测定rFLU-HMPV-PTBE-NS针对野生型HMPV毒株HMPV A1(BJ-1610)(记载在非专利文献：Whole Genome Sequencing andPhylogenetic Analyses of Sub-genotype A1of the Human Metapneumovirus Detectedin an Infant with Pneumonia，Bing Du Xue Bao.2016Nov；32(6)：758-67)的抗体效价，结果如表3所示，rFLU-HMPV-PTBE-NS免疫动物后，血清中可检测到针对HMPV和流感病毒的抗体效价，表明该疫苗免疫后可诱导机体产生针对HMPV和流感病毒的双重免疫应答。
表3 rFLU-HMPV-PTBE-NS免疫效果检测
Figure BDA0002350054850000102
Figure BDA0002350054850000111
六、BALB/c小鼠免疫和攻毒试验
为了进一步评价重组HMPV病毒株的免疫保护效果，选用6～8周龄SPF雌性BALB/c小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)。该实验在BSL-2实验室完成。共分为2组，rFLU-HMPV-PTBE-NS组和PBS组，每组10只小鼠，按照步骤五“小鼠体内免疫实验”对小鼠进行免疫，免疫2次，间隔两周，在免疫前和二次免疫后14天分别采集血样。第二次免疫后2周攻毒，即rFLU-HMPV-PTBE-NS组和PBS组分别用野生型HMPV毒株HMPV A1(BJ-1610)(WholeGenome Sequencing and Phylogenetic Analyses of Sub-genotype A1 of the HumanMetapneumovirus Detected in an Infant with Pneumonia，Bing Du Xue Bao.2016Nov；32(6)：758-67)攻毒。
野生型HMPV毒株HMPV A1(BJ-1610)攻击后第4天取肺组织H&E染色进行组织病理学检查。H&E染色结果如图2所示，结果显示：与正常小鼠相比，PBS组小鼠在HMPV株攻击后表现为间质性肺炎、肺泡壁增厚、充血、水肿，淋巴细胞单个核细胞浸润，肺泡腔内少量渗出和肺泡上皮细胞增生。相比之下，rFLU-HMPV-PTBE-NS组免疫小鼠也可见明显的炎症改变。并且检测了攻击后4天小鼠肺组织的病毒载量，结果如图3所示，结果显示：rFLU-HMPV-PTBE-NS组病毒载量较PBS组降低，差异无统计学意义。
实验例2：嵌合HMPV-PTBE-NA抗原表位的重组HMPV疫苗制备
本实施例提供了重组人偏肺病毒(HMPV)，该重组人偏肺病毒表达名称为HMPV-PTBE的蛋白质，所述HMPV-PTBE人偏肺病毒HMPV的T、B细胞优势抗原表位(potential T andB cell epitopes，PTBE)，其氨基酸序列为SEQ ID NO.5，由SEQ ID NO.1所示的HMPV-PTBE基因编码。
一、重组质粒的构建：
1、pAD-PTBE-NA的构建
以流感病毒当年流行株H1N1亚型(以流感病毒株A/California/07/2009为例)的NA基因片段为插入该表位基因的靶点，利用分子生物学方法构建重组质粒。
合成如SEQ ID NO.3所示的基因(结构如图4所示)，其中，SEQ ID No.3自5’端起第1位至第14位为保护性碱基+酶切位点，SEQ ID NO.3第15-2428位为HMPV-PTBE-NA基因，SEQID No.3第2429-2438位为保护性碱基+酶切位点。在HMPV-PTBE-NA基因中，SEQ ID NO.3第15-34位为3′端非编码区(20nt)，SEQ ID NO.3第35-226位为流感病毒株A/California/07/2009的NA基因的前192个核苷酸，SEQ ID NO.3第227-1198位为HMPV-PTBE抗原表位基因，SEQ ID NO.3第1199-2395位为流感病毒株A/California/07/2009的NA基因的后1197个核苷酸，SEQ ID NO.3第2396-2428位为5′端非编码区(33nt)。
利用分子生物学方法，酶切SEQ ID NO.3所示的基因与双向转录表达载体pAD3000(具体见专利：CN200610007909.5)，酶切片段连接，挑选阳性克隆，构建好的重组质粒经测序鉴定，片段大小与预期完全一致，并且无基因突变，将经鉴定正确的重组质粒命名为pAD-PTBE-NA。
所述pAD-PTBE-NA为将pAD3000的BsaI的酶切位点间替换为SEQ ID NO.3第11-2428位所示的基因片段，且保持pAD3000其它序列不变得到的重组质粒。
2、pAD-PB2、pAD-PB1、pAD-PA、pAD-NP、pAD-M、pAD-NS的构建
与冷适应、减毒流感病毒株A/AnnArbor/06/60的内部病毒基因骨架PB2、PB1、PA、NP、M和NS分别与双向转录表达载体pAD3000连接，构建重组质粒，将经鉴定正确的重组质粒分别命名为pAD-PB2、pAD-PB1、pAD-PA、pAD-NP、pAD-M、pAD-NS。
所述pAD-NS是将pAD3000的BsmbI的酶切位点间替换为GenBank号为M23968.1(update date为05-JUN-2006)所示的基因片段，且保持pAD3000其它序列不变得到的重组质粒；
其它pAD-PB2、pAD-PB 1、pAD-PA、pAD-NP、pAD-M通实施例1。
3、pAD-HA
与流感病毒当年流行株H1N1亚型的HA基因与双向转录表达载体pAD3000连接，构建重组质粒，构建的重组质粒，将经鉴定正确的重组质粒命名pAD-HA(同实施例1)。
二、重组人偏肺病毒的拯救
1、细胞培养(具体步骤见实施例1)
2、转染
将步骤一得到的pAD-PTBE-NA、pAD-PB2、pAD-PB1、pAD-PA、pAD-NP、pAD-M、pAD-NS和pAD-HA共8个质粒各0.2μg等量混合后加入10uL转染试剂(Effectene，购自美国QIAGEN公司，目录号：301425)室温作用10min，共转染COS-1/MDCK共培养细胞，于33℃，5％CO2，培养48-60h，得到细胞悬液，将细胞悬液接种9-11日龄SPF鸡胚，于33℃培养72h，收获鸡胚尿囊液，并进行血凝(HA)试验(具体步骤见实施例1)，重组HMPV疫苗株的鸡胚平均HA效价范围为1∶28-1∶210。
成功获得嵌合HMPV-PTBE-NA抗原表位的重组HMPV疫苗株，命名为rFLU-HMPV-PTBE-NA。
三、重组人偏肺病毒的鉴定
对rFLU-HMPV-PTBE-NA进行鉴定，电镜观察病毒形态，病毒粒子多多呈球形，少数呈丝状，大小不完全一致，其中球形直径80～120nm，有囊膜，符合流感病毒典型形态特征。
将rFLU-HMPV-PTBE-NA接种9-11日龄SPF鸡胚，取第二代鸡胚尿囊液提取病毒RNA，经过RT-PCR，扩增出8个基因片段(各个基因片段的扩增引物如实施例中表1所示)进行测序，结果与预期基因序列完全一致。
将rFLU-HMPV-PTBE-NA经鸡胚大量培养，超滤浓缩、蔗糖梯度离心纯化后，跑SDS-PAGE电泳，凝胶染色、脱色后，SDS-PAGE可观察到清晰的两条带，大小约为60KD和30KD，证明抗原的主要成分存在。
四、检测rFLU-HMPV-PTBE-NA的温度敏感(Temperature sensitive，ts)、冷适应(Cold adapted，ca)和减毒(Attenuated，att)表型
将rFLU-HMPV-PTBE-NA接种MDCK细胞，分别于25、33、37℃条件下培养，收集细胞上清测定病毒滴度，具体方法见实施例1，结果如表4所示：rFLU-HMPV-PTBE-NA既有温度敏感现象，又有冷适应性。25-33℃之间病毒滴度的差异在0.1-0.7 log10，说明了其具有冷适应性。37℃病毒生长滴度小于33℃病毒滴度2log10，33-37℃之间病毒滴度的差异在原病毒和重组病毒之间的差异是3.2-4.2log10。说明重组rFLU-HMPV-PTBE-NA比较安全，在人体温下不会大量繁殖，可以直接用于疫苗的生产。
表4、rFLU-HMPV-PTBE-NA的温度敏感及冷适应型结果
Figure BDA0002350054850000131
注：Ca-ts代表冷适应性和温度敏感性
五、小鼠体内免疫实验
将rFLU-HMPV-PTBE-NA经超滤浓缩、蔗糖密度梯度离心纯化后，以PBS为溶剂制备减毒活疫苗剂。
选用6-8周龄BALB/c小鼠，分为rFLU-HMPV-PTBE-NA组和PBS组，每组20只，设置3次重复。
rFLU-HMPV-PTBE-NA组：将减毒活疫苗剂滴鼻免疫BALB/c小鼠，免疫2次，间隔3周，剂量为105TCID50每只小鼠。
PBS组：PBS代替为减毒活疫苗剂，同时免疫方式、免疫体积及免疫时间与rFLU-HMPV-PTBE-NA组一致。
将rFLU-HMPV-PTBE-NA组和PBS组分别于初次免疫后、二次免疫后2周，经眼底采血，离心收集各组小鼠的血清。
HI方法(参考OIE推荐标准方法)测定rFLU-HMPV-PTBE-NA针对野生型流感病毒A/California/07/2009的抗体效价，NT方法(记载在非专利文献：Li X，Guo L，Kong M，Su X，Yang D，Zou M，Liu Y，Lu L.Design and Evaluation of a Multi-Epitope Peptide ofHuman Metapneumovirus.Intervirology 2015；58：403-412.)测定rFLU-HMPV-PTBE-NS针对野生型HMPV毒株HMPV A1(BJ-1610)(记载在非专利文献：Whole Genome Sequencing andPhylogenetic Analyses of Sub-genotype A1 of the Human MetapneumovirusDetected in an Infant with Pneumonia，Bing Du Xue Bao.2016Nov；32(6)：758-67)的抗体效价，结果如表5所示，rFLU-HMPV-PTBE-NA免疫动物后，一免后血清中检测到针对HMPV和流感病毒的抗体效价分别为1∶80和1∶200，二免后血清中检测到针对HMPV和流感病毒的抗体效价分别为1∶2560和1∶5120，表明该疫苗免疫后可诱导机体产生针对HMPV-和流感病毒的双重免疫应答。
表5 rFLU-HMPV-PTBE-NA免疫效果检测
Figure BDA0002350054850000141
六、BALB/c小鼠免疫和攻毒试验
选用6～8周龄SPF雌性BALB/c小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)。该实验在BSL-2实验室完成。共分为2组，rFLU-HMPV-PTBE-NA组和PBS组，每组10只小鼠，按照步骤五“小鼠体内免疫实验”对小鼠进行免疫，免疫2次，间隔两周，在免疫前和二次免疫后14天分别采集血样。第二次免疫后2周攻毒，即rFLU-HMPV-PTBE-NA组和PBS组分别用野生型HMPV毒株HMPV A1(BJ-1610)(Whole Genome Sequencing and Phylogenetic Analyses ofSub-genotype A1of the Human Metapneumovirus Detected in an Infant withPneumonia，Bing Du Xue Bao.2016Nov；32(6)：758-67)攻毒。
野生型HMPV毒株HMPVA1(BJ-1610)攻击后第4天取肺组织H&E染色进行组织病理学检查。H&E染色结果如图5所示，结果显示：与正常小鼠相比，PBS组小鼠在HMPV株攻击后表现为间质性肺炎、肺泡壁增厚、充血、水肿，淋巴细胞单个核细胞浸润，肺泡腔内少量渗出和肺泡上皮细胞增生。相反，rFLU-HMPV-PTBE-NA组免疫小鼠仅见轻度炎症改变。并且检测了攻毒后4天小鼠肺组织的病毒载量，结果如图6所示，结果显示：rFLU-HMPV-PTBE-NA组病毒载量显著降低，差异达极显著水平。
实验例3：嵌合HMPV-PTBE-HA抗原表位的重组HMPV疫苗制备
本实施例提供了重组人偏肺病毒(HMPV)，该重组人偏肺病毒表达名称为HMPV-PTBE的蛋白质，所述HMPV-PTBE人偏肺病毒HMPV的T、B细胞优势抗原表位(potential T andB cell epitopes，PTBE)，其氨基酸序列为SEQ ID NO.5，由SEQID NO.1所示的HMPV-PTBE基因编码。
一、重组质粒的构建：
1、pAD-PTBE-HA的构建
以流感病毒当年流行株H1N1亚型(以流感病毒株A/California/07/2009为例)的HA基因片段为插入该表位基因的靶点，利用分子生物学方法构建重组质粒。
合成如SEQ ID NO.4所示的基因(结构如图7所示)，其中，SEQ ID No.4自5’端起第1位至第14位为保护性碱基+酶切位点，SEQ ID NO.4第15-2810位为HMPV-PTBE-HA基因，SEQID No.4第2811-2820位为保护性碱基+酶切位点。在HMPV-PTBE-HA基因中，SEQ ID NO.4第15-46位为3′端非编码区(32nt)，SEQ ID NO.4第47-97位为流感病毒株A/California/07/2009的HA基因的信号肽(51nt)，SEQ ID NO.4第119-1090位为HMPV-PTBE抗原表位基因，SEQID NO.4第1112-2761位为流感病毒株A/California/07/2009的HA基因的后1650个核苷酸，SEQ ID NO.4第2762-2810位为5′端非编码区(49nt)，HMPV-PTBE抗原表位基因的5′端和3′端都加AAAPGAA多肽(基因序列为GCAGCAGCACCTGGAGCAGCA)作为linker。
利用分子生物学方法，酶切SEQ ID NO.4所示的基因与双向转录表达载体pAD3000(具体见专利：CN200610007909.5)，酶切片段连接，挑选阳性克隆，构建好的重组质粒经测序鉴定，片段大小与预期完全一致，并且无基因突变，将经鉴定正确的重组质粒命名为pAD-PTBE-HA。
所述pAD-PTBE-HA为将pAD3000的BsmBI的酶切位点间替换为SEQ ID NO.4第11-2810位所示的基因片段，且保持pAD3000其它序列不变得到的重组质粒。
2、pAD-PB2、pAD-PB1、pAD-PA、pAD-NP、pAD-M、pAD-NS的构建
与冷适应、减毒流感病毒株A/AA/06/60的6个内部病毒基因骨架PB2、PB1、PA、NP、M和NS分别与双向转录表达载体pAD3000连接，构建重组质粒，将经鉴定正确的重组质粒分别命名为pAD-PB2、pAD-PB1、pAD-PA、pAD-NP、pAD-M、pAD-NS。
pAD-PB2、pAD-PB1、pAD-PA、pAD-NP、pAD-M、pAD-NS同实施例2。
3、pAD-NA
与流感病毒当年流行株H1N1亚型的NA基因与双向转录表达载体pAD3000连接，构建重组质粒，构建的重组质粒，将经鉴定正确的重组质粒命名pAD-NA(同实施例1)。
二、重组人偏肺病毒的拯救
1、细胞培养(具体步骤见实施例1)
2、转染
将步骤一得到的pAD-PTBE-NA、pAD-PB2、pAD-PB1、pAD-PA、pAD-NP、pAD-M、pAD-NS和pAD-HA共8个质粒各0.2μg等量混合后加入10uL转染试剂(Effectene，购自美国QIAGEN公司，目录号：301425)室温作用10min，共转染COS-1/MDCK共培养细胞，于33℃，5％CO2，培养48-60h，得到细胞悬液，将细胞悬液接种9-11日龄SPF鸡胚，于33℃培养72h，收获鸡胚尿囊液，并进行血凝(HA)试验(具体步骤见实施例1)，重组HMPV疫苗株的鸡胚平均HA效价范围为1∶27-1∶29。
成功获得嵌合HMPV-PTBE-HA抗原表位的重组HMPV疫苗株，命名为rFLU-HMPV-PTBE-HA。
三、重组人偏肺病毒的鉴定
对rFLU-HMPV-PTBE-HA进行鉴定，电镜观察病毒形态，病毒粒子多多呈球形，少数呈丝状，大小不完全一致，其中球形直径80～120nm，有囊膜，符合流感病毒典型形态特征。
将rFLU-HMPV-PTBE-HA接种9-11日龄SPF鸡胚，取第二代鸡胚尿囊液提取病毒RNA，经过RT-PCR，扩增出8个基因片段(各个基因片段的扩增引物如实施例中表1所示)进行测序，结果与预期基因序列完全一致。
将rFLU-HMPV-PTBE-HA经鸡胚大量培养，超滤浓缩、蔗糖梯度离心纯化后，跑SDS-PAGE电泳，凝胶染色、脱色后，可观察到清晰的两条带，大小约为60KD和30KD，证明抗原的主要成分存在。
四、检测rFLU-HMPV-PTBE-HA的温度敏感(Temperature sensitive，ts)、冷适应(Cold adapted，ca)和减毒(Attenuated，att)表型
将rFLU-HMPV-PTBE-HA接种MDCK细胞，分别于25、33、37℃条件下培养，收集细胞上清测定病毒滴度，具体方法见实施例1，结果如表6所示：rFLU-HMPV-PTBE-HA既有温度敏感现象，又有冷适应性。25-33℃之间病毒滴度的差异在0.4-0.6log10，说明了其具有冷适应性。37℃病毒生长滴度小于33℃病毒滴度2log10，33-37℃之间病毒滴度的差异在原病毒和重组病毒之间的差异是3.2-4.0log10。说明重组rFLU-HMPV-PTBE-HA比较安全，在人体温下不会大量繁殖，可以直接用于疫苗的生产。
表6、rFLU-HMPV-PTBE-HA的温度敏感及冷适应型结果
Figure BDA0002350054850000171
注：Ca-ts代表冷适应性和温度敏感性
五、小鼠体内免疫实验
将rFLU-HMPV-PTBE-HA经超滤浓缩、蔗糖密度梯度离心纯化后，以PBS为溶剂制备减毒活疫苗剂。
选用6-8周龄BALB/c小鼠，分为rFLU-HMPV-PTBE-HA组和PBS组，每组20只，设置3次重复。
rFLU-HMPV-PTBE-HA组：将减毒活疫苗剂滴鼻免疫BALB/c小鼠，免疫2次，间隔3周，剂量为105TCID50每只小鼠。
PBS组：PBS代替为减毒活疫苗剂，同时免疫方式、免疫体积及免疫时间与rFLU-HMPV-PTBE-HA组一致。
将rFLU-HMPV-PTBE-HA组和PBS组分别于初次免疫后、二次免疫后2周，经眼底采血，离心收集各组小鼠的血清。
HI方法(参考OIE推荐标准方法)测定rFLU-HMPV-PTBE-HA针对野生型流感病毒A/California/07/2009的抗体效价，NT方法(记载在非专利文献：Li X，Guo L，Kong M，Su X，Yang D，Zou M，Liu Y，Lu L.Design and Evaluation of a Multi-Epitope Peptide ofHuman Metapneumovirus.Intervirology 2015；58：403-412.)测定rFLU-HMPV-PTBE-HA针对野生型HMPV毒株HMPV A1(BJ-1610)(记载在非专利文献：Whole Genome Sequencing andPhylogenetic Analyses of Sub-genotype A1 of the Human MetapneumovirusDetected in an Infant with Pneumonia，Bing Du Xue Bao.2016Nov；32(6)：758-67)的抗体效价，结果如表7所示，rFLU-HMPV-PTBE-HA免疫动物后，一免后血清中检测到针对HMPV和流感病毒的抗体效价分别为1∶80和1∶200，二免后血清中检测到针对HMPV和流感病毒的抗体效价分别为1∶640和1∶5120，表明该疫苗免疫后可诱导机体产生针对HMPV和流感病毒的双重免疫应答。
表7 rFLU-HMPV-PTBE-HA免疫效果检测
Figure BDA0002350054850000181
六、BALB/c小鼠免疫和攻毒
选用6～8周龄SPF雌性BALB/c小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)。该实验在BSL-2实验室完成。共分为2组，rFLU-HMPV-PTBE-HA组和PBS组，每组10只小鼠，按照步骤五“小鼠体内免疫实验”对小鼠进行免疫，免疫2次，间隔两周，在免疫前和二次免疫后14天分别采集血样。第二次免疫后2周攻毒，上述2组分别取用野生型HMPV毒株HMPV A1(BJ-1610)(Whole Genome Sequencing and Phylogenetic Analyses of Sub-genotype A1 ofthe Human Metapneumovirus Detected in an Infant with Pneumonia，Bing Du XueBao.2016Nov；32(6)：758-67)攻毒。
野生型HMPV毒株HMPVA1(BJ-1610)攻击后第4天取肺组织H&E染色进行组织病理学检查。H&E染色结果如图8所示，结果显示：与正常小鼠相比，PBS组小鼠表现为间质性肺炎、肺泡壁增厚、充血、水肿，淋巴细胞单个核细胞浸润，肺泡腔内少量渗出和肺泡上皮细胞增生。相反，rFLU-HMPV-PTBE-HA组免疫小鼠仅见轻度炎症改变。并且检测了攻毒后4天小鼠肺组织的病毒载量，结果如图9所示，结果显示：rFLU-HMPV-PTBE-HA组病毒载量较对照组显著降低。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国人民解放军总医院第五医学中心
<120> 重组人偏肺病毒及其制备方法和应用
<130> GNCFY192832
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 972
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caactggcaa gagaggagca aattgaaaat cccagacaat ctagaggttc aggcggatcg 60
gggcaactgg caagagagga gcaaattgaa aatcccagac aatctagagg ttcaggcgga 120
tcggggcaac tggcaagaga ggagcaaatt gaaaatccca gacaatctag aggttcaggc 180
ggatcggggc aactggcaag agaggagcaa attgaaaatc ccagacaatc tagaggttca 240
ggcggatcgg ggcaactggc aagagaggag caaattgaaa atcccagaca atctagaggt 300
tcaggcggat cggggaggga gctgaaagat tttgtgagca aaaatctaac acgtgcaatc 360
aacaaaaaca agtgcgacat tgatgacctg aaaggttcag gcggatcggg gaagaaaaca 420
aagaaaccca caggagcacc tccagagggt tcaggcggat cggggataca aaaaacctca 480
tctgaatcag aacaccacac cagctcacca cccacagaat ccaacaagga agctggttca 540
ggcggatcgg ggatctccac agacaaccca gacatcaatc caaactcaca gcatccaact 600
caacagtcca cagaaaaccc cacactcggt tcaggcggat cggggagccc atcagaaaca 660
gaaccagcat caacaccaga cacaacaaac cgcggttcag gcggatcggg gtctttgatc 720
ctaataggaa taactacatt gggttcaggc ggatcgggga agttaatatt agctttacta 780
acatttctcg gttcaggcgg atcggggagc ccaaaagctg gactgttatc actaggttca 840
ggcggatcgg ggtgttattt agaaaacata gaaattatag gttcaggcgg atcggggggt 900
tatattgatg ataaccaaag cataggttca ggcggatcgg ggtctttgat actcatagga 960
ataactacat tg 972
<210> 2
<211> 1899
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tattcgtctc agggagcaaa agcagggtga caaagacata atggatccta acactgtgtc 60
aagctttcag gtagattgct tcctttggca tgtccgcaaa caagttgcag accaagaact 120
aggtgatgcc ccattccttg atcggcttcg ccgagatcag aagtccctaa ggggaagagg 180
cagtactctc ggtctgaaca tcgaaacagc cacccgtgtt ggaaagcaga tagtggagag 240
gattctgaag gaagaatccg atgaggcact taaaatgacc atggcctccg cacctgcttc 300
gcgataccta actgacatga ctattgagga aatgtcaagg gactggttca tgctaatgcc 360
caagcagaaa gtggcaggcc ctctttgtat cagaatggac caggcaatca tggattaatg 420
caactggcaa gagaggagca aattgaaaat cccagacaat ctagaggttc aggcggatcg 480
gggcaactgg caagagagga gcaaattgaa aatcccagac aatctagagg ttcaggcgga 540
tcggggcaac tggcaagaga ggagcaaatt gaaaatccca gacaatctag aggttcaggc 600
ggatcggggc aactggcaag agaggagcaa attgaaaatc ccagacaatc tagaggttca 660
ggcggatcgg ggcaactggc aagagaggag caaattgaaa atcccagaca atctagaggt 720
tcaggcggat cggggaggga gctgaaagat tttgtgagca aaaatctaac acgtgcaatc 780
aacaaaaaca agtgcgacat tgatgacctg aaaggttcag gcggatcggg gaagaaaaca 840
aagaaaccca caggagcacc tccagagggt tcaggcggat cggggataca aaaaacctca 900
tctgaatcag aacaccacac cagctcacca cccacagaat ccaacaagga agctggttca 960
ggcggatcgg ggatctccac agacaaccca gacatcaatc caaactcaca gcatccaact 1020
caacagtcca cagaaaaccc cacactcggt tcaggcggat cggggagccc atcagaaaca 1080
gaaccagcat caacaccaga cacaacaaac cgcggttcag gcggatcggg gtctttgatc 1140
ctaataggaa taactacatt gggttcaggc ggatcgggga agttaatatt agctttacta 1200
acatttctcg gttcaggcgg atcggggagc ccaaaagctg gactgttatc actaggttca 1260
ggcggatcgg ggtgttattt agaaaacata gaaattatag gttcaggcgg atcggggggt 1320
tatattgatg ataaccaaag cataggttca ggcggatcgg ggtctttgat actcatagga 1380
ataactacat tgtaaaagaa catcatattg aaagcgaatt tcagtgtgat ttttgaccgg 1440
ctagagaccc taatattact aagggctttc accgaaacgg gagcaattgt tggcgaaatt 1500
tcaccattgc cttctcttcc aggacatact aatgaggatg tcaaaaatgc aattggggtc 1560
ctcatcggag gacttgaatg gaatgataac acagttcgag tctctaaaac tctacagaga 1620
ttcgcttgga gaagcagtga tgagaatggg agacctccac tcactccaaa atagaaacgg 1680
aaaatggcga gaacaattag gtcaaaagtt cgaagaaata agatggctga ttgaagaagt 1740
gagacacaaa ttgaagataa cagagaatag ttttgagcaa ataacattta tgcaagcctt 1800
acagctacta tttgaagtgg aacaagagat aagaactttc tcgtttcagc ttatttaatg 1860
ataaaaaaca cccttgtttc tactaatacg agacgatat 1899
<210> 3
<211> 2438
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tattggtctc agggagcaaa agcaggagtt taaaatgaat ccaaaccaaa agataataac 60
cattggttcg gtctgtatga caattggaat ggctaactta atattacaaa ttggaaacat 120
aatctcaata tggattagcc actcaattca acttgggaat caaaatcaga ttgaaacatg 180
caatcaaagc gtcattactt atgaaaacaa cacttgggta aatcagcaac tggcaagaga 240
ggagcaaatt gaaaatccca gacaatctag aggttcaggc ggatcggggc aactggcaag 300
agaggagcaa attgaaaatc ccagacaatc tagaggttca ggcggatcgg ggcaactggc 360
aagagaggag caaattgaaa atcccagaca atctagaggt tcaggcggat cggggcaact 420
ggcaagagag gagcaaattg aaaatcccag acaatctaga ggttcaggcg gatcggggca 480
actggcaaga gaggagcaaa ttgaaaatcc cagacaatct agaggttcag gcggatcggg 540
gagggagctg aaagattttg tgagcaaaaa tctaacacgt gcaatcaaca aaaacaagtg 600
cgacattgat gacctgaaag gttcaggcgg atcggggaag aaaacaaaga aacccacagg 660
agcacctcca gagggttcag gcggatcggg gatacaaaaa acctcatctg aatcagaaca 720
ccacaccagc tcaccaccca cagaatccaa caaggaagct ggttcaggcg gatcggggat 780
ctccacagac aacccagaca tcaatccaaa ctcacagcat ccaactcaac agtccacaga 840
aaaccccaca ctcggttcag gcggatcggg gagcccatca gaaacagaac cagcatcaac 900
accagacaca acaaaccgcg gttcaggcgg atcggggtct ttgatcctaa taggaataac 960
tacattgggt tcaggcggat cggggaagtt aatattagct ttactaacat ttctcggttc 1020
aggcggatcg gggagcccaa aagctggact gttatcacta ggttcaggcg gatcggggtg 1080
ttatttagaa aacatagaaa ttataggttc aggcggatcg gggggttata ttgatgataa 1140
ccaaagcata ggttcaggcg gatcggggtc tttgatactc ataggaataa ctacattgac 1200
caactttgct gctggacagt cagtggtttc cgtgaaatta gcgggcaatt cctctctctg 1260
ccctgttagt ggatgggcta tatacagtaa agacaacagt gtaagaatcg gttccaaggg 1320
ggatgtgttt gtcataaggg aaccattcat atcatgctcc cccttggaat gcagaacctt 1380
cttcttgact caaggggcct tgctaaatga caaacattcc aatggaacca ttaaagacag 1440
gagcccatat cgaaccctaa tgagctgtcc tattggtgaa gttccctctc catacaactc 1500
aagatttgag tcagtcgctt ggtcagcaag tgcttgtcat gatggcatca attggctaac 1560
aattggaatt tctggcccag acaatggggc agtggctgtg ttaaagtaca acggcataat 1620
aacagacact atcaagagtt ggagaaacaa tatattgaga acacaagagt ctgaatgtgc 1680
atgtgtaaat ggttcttgct ttactgtaat gaccgatgga ccaagtaatg gacaggcctc 1740
atacaagatc ttcagaatag aaaagggaaa gatagtcaaa tcagtcgaaa tgaatgcccc 1800
taattatcac tatgaggaat gctcctgtta tcctgattct agtgaaatca catgtgtgtg 1860
cagggataac tggcatggct cgaatcgacc gtgggtgtct ttcaaccaga atctggaata 1920
tcagatagga tacatatgca gtgggatttt cggagacaat ccacgcccta atgataagac 1980
aggcagttgt ggtccagtat cgtctaatgg agcaaatgga gtaaaagggt tttcattcaa 2040
atacggcaat ggtgtttgga tagggagaac taaaagcatt agttcaagaa acggttttga 2100
gatgatttgg gatccgaacg gatggactgg gacagacaat aacttctcaa taaagcaaga 2160
tatcgtagga ataaatgagt ggtcaggata tagcgggagt tttgttcagc atccagaact 2220
aacagggctg gattgtataa gaccttgctt ctgggttgaa ctaatcagag ggcgacccaa 2280
agagaacaca atctggacta gcgggagcag catatccttt tgtggtgtaa acagtgacac 2340
tgtgggttgg tcttggccag acggtgctga gttgccattt accattgaca agtaattcgt 2400
tgaaaaaact ccttgtttct actaatacga gaccatat 2438
<210> 4
<211> 2820
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tattcgtctc agggagcaaa agcaggggaa aataaaagca acaaaaatga aggcaatact 60
agtagttctg ctatatacat ttgcaaccgc aaatgcagca gcagcacctg gagcagcaca 120
actggcaaga gaggagcaaa ttgaaaatcc cagacaatct agaggttcag gcggatcggg 180
gcaactggca agagaggagc aaattgaaaa tcccagacaa tctagaggtt caggcggatc 240
ggggcaactg gcaagagagg agcaaattga aaatcccaga caatctagag gttcaggcgg 300
atcggggcaa ctggcaagag aggagcaaat tgaaaatccc agacaatcta gaggttcagg 360
cggatcgggg caactggcaa gagaggagca aattgaaaat cccagacaat ctagaggttc 420
aggcggatcg gggagggagc tgaaagattt tgtgagcaaa aatctaacac gtgcaatcaa 480
caaaaacaag tgcgacattg atgacctgaa aggttcaggc ggatcgggga agaaaacaaa 540
gaaacccaca ggagcacctc cagagggttc aggcggatcg gggatacaaa aaacctcatc 600
tgaatcagaa caccacacca gctcaccacc cacagaatcc aacaaggaag ctggttcagg 660
cggatcgggg atctccacag acaacccaga catcaatcca aactcacagc atccaactca 720
acagtccaca gaaaacccca cactcggttc aggcggatcg gggagcccat cagaaacaga 780
accagcatca acaccagaca caacaaaccg cggttcaggc ggatcggggt ctttgatcct 840
aataggaata actacattgg gttcaggcgg atcggggaag ttaatattag ctttactaac 900
atttctcggt tcaggcggat cggggagccc aaaagctgga ctgttatcac taggttcagg 960
cggatcgggg tgttatttag aaaacataga aattataggt tcaggcggat cggggggtta 1020
tattgatgat aaccaaagca taggttcagg cggatcgggg tctttgatac tcataggaat 1080
aactacattg gcagcagcac ctggagcagc agacacatta tgtataggtt atcatgcgaa 1140
caattcaaca gacactgtag acacagtact agaaaagaat gtaacagtaa cacactctgt 1200
taaccttcta gaagacaagc ataacgggaa actatgcaaa ctaagagggg tagccccatt 1260
gcatttgggt aaatgtaaca ttgctggctg gatcctggga aatccagagt gtgaatcact 1320
ctccacagca agctcatggt cctacattgt ggaaacacct agttcagaca atggaacgtg 1380
ttacccagga gatttcatcg attatgagga gctaagagag caattgagct cagtgtcatc 1440
atttgaaagg tttgagatat tccccaagac aagttcatgg cccaatcatg actcgaacaa 1500
aggtgtaacg gcagcatgtc ctcatgctgg agcaaaaagc ttctacaaaa atttaatatg 1560
gctagttaaa aaaggaaatt catacccaaa gctcagcaaa tcctacatta atgataaagg 1620
gaaagaagtc ctcgtgctat ggggcattca ccatccatct actagtgctg accaacaaag 1680
tctctatcag aatgcagatg catatgtttt tgtggggtca tcaagataca gcaagaagtt 1740
caagccggaa atagcaataa gacccaaagt gaggggtcaa gaagggagaa tgaactatta 1800
ctggacacta gtagagccgg gagacaaaat aacattcgaa gcaactggaa atctagtggt 1860
accgagatat gcattcgcaa tggaaagaaa tgctggatct ggtattatca tttcagatac 1920
accagtccac gattgcaata caacttgtca aacacccaag ggtgctataa acaccagcct 1980
cccatttcag aatatacatc cgatcacaat tggaaaatgt ccaaaatatg taaaaagcac 2040
aaaattgaga ctggccacag gattgaggaa tatcccgtct attcaatcta gaggcctatt 2100
tggggccatt gccggtttca ttgaaggggg gtggacaggg atggtagatg gatggtacgg 2160
ttatcaccat caaaatgagc aggggtcagg atatgcagcc gacctgaaga gcacacagaa 2220
tgccattgac gagattacta acaaagtaaa ttctgttatt gaaaagatga atacacagtt 2280
cacagcagta ggtaaagagt tcaaccacct ggaaaaaaga atagagaatt taaataaaaa 2340
agttgatgat ggtttcctgg acatttggac ttacaatgcc gaactgttgg ttctattgga 2400
aaatgaaaga actttggact accacgattc aaatgtgaag aacttatatg aaaaggtaag 2460
aagccagcta aaaaacaatg ccaaggaaat tggaaacggc tgctttgaat tttaccacaa 2520
atgcgataac acgtgcatgg aaagtgtcaa aaatgggact tatgactacc caaaatactc 2580
agaggaagca aaattaaaca gagaagaaat agatggggta aagctggaat caacaaggat 2640
ttaccagatt ttggcgatct attcaactgt cgccagttca ttggtactgg tagtctccct 2700
gggggcaatc agtttctgga tgtgctctaa tgggtctcta cagtgtagaa tatgtattta 2760
acattaggat ttcagaagca tgagaaaaac acccttgttt ctactaatac gagacgatat 2820
<210> 5
<211> 324
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gln Leu Ala Arg Glu Glu Gln Ile Glu Asn Pro Arg Gln Ser Arg Gly
1 5 10 15
Ser Gly Gly Ser Gly Gln Leu Ala Arg Glu Glu Gln Ile Glu Asn Pro
20 25 30
Arg Gln Ser Arg Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gln Leu Ala Arg Glu Glu
35 40 45
Gln Ile Glu Asn Pro Arg Gln Ser Arg Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gln
50 55 60
Leu Ala Arg Glu Glu Gln Ile Glu Asn Pro Arg Gln Ser Arg Gly Ser
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gln Leu Ala Arg Glu Glu Gln Ile Glu Asn Pro Arg
85 90 95
Gln Ser Arg Gly Ser Gly Gly Ser Gly Arg Glu Leu Lys Asp Phe Val
100 105 110
Ser Lys Asn Leu Thr Arg Ala Ile Asn Lys Asn Lys Cys Asp Ile Asp
115 120 125
Asp Leu Lys Gly Ser Gly Gly Ser Gly Lys Lys Thr Lys Lys Pro Thr
130 135 140
Gly Ala Pro Pro Glu Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ile Gln Lys Thr Ser
145 150 155 160
Ser Glu Ser Glu His His Thr Ser Ser Pro Pro Thr Glu Ser Asn Lys
165 170 175
Glu Ala Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ile Ser Thr Asp Asn Pro Asp Ile
180 185 190
Asn Pro Asn Ser Gln His Pro Thr Gln Gln Ser Thr Glu Asn Pro Thr
195 200 205
Leu Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Pro Ser Glu Thr Glu Pro Ala Ser
210 215 220
Thr Pro Asp Thr Thr Asn Arg Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Leu Ile
225 230 235 240
Leu Ile Gly Ile Thr Thr Leu Gly Ser Gly Gly Ser Gly Lys Leu Ile
245 250 255
Leu Ala Leu Leu Thr Phe Leu Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Pro Lys
260 265 270
Ala Gly Leu Leu Ser Leu Gly Ser Gly Gly Ser Gly Cys Tyr Leu Glu
275 280 285
Asn Ile Glu Ile Ile Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Tyr Ile Asp Asp
290 295 300
Asn Gln Ser Ile Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Leu Ile Leu Ile Gly
305 310 315 320
Ile Thr Thr Leu

Claims (5)

1.一种重组病毒，所述重组病毒按照包括如下步骤的方法制备：将分别含有冷适应、减毒流感病毒的PB2基因、含有冷适应、减毒流感病毒的PB1基因、含有冷适应、减毒流感病毒的PA基因、含有冷适应、减毒流感病毒的NP基因、含有冷适应、减毒流感病毒的M基因和含有冷适应、减毒流感病毒的NS基因的重组质粒，以及分别含有靶标流感病毒的HA基因和含有靶标流感病毒的NA基因的重组质粒共转染宿主细胞，培养得到重组病毒；其特征在于：
所述冷适应、减毒流感病毒的NS基因、所述靶标流感病毒的HA基因和所述靶标流感病毒的NA基因中任一种基因被替换：所述冷适应、减毒流感病毒的NS基因替换为名称为HMPV-PTBE-NS基因的重组DNA分子，所述靶标流感病毒的HA基因替换为名称为HMPV-PTBE-HA基因的重组DNA分子，所述靶标流感病毒的NA基因替换为名称为HMPV-PTBE-NA基因的重组DNA分子；
所述HMPV-PTBE-NS基因是在所述冷适应、减毒流感病毒的NS基因的开放读码框的自5′末端起第375位至第376位核苷酸之间插入HMPV-PTBE基因，并保持所述冷适应、减毒流感病毒的NS基因的其它核苷酸不变得到的重组DNA分子；
所述HMPV-PTBE-HA基因是在所述靶标流感病毒的HA基因的开放读码框的自5′末端起第51位至第52位核苷酸之间插入所述HMPV-PTBE基因，并保持所述靶标流感病毒的HA基因的其它核苷酸不变得到的重组DNA分子；
所述HMPV-PTBE-NA基因是在所述靶标流感病毒的NA基因的开放读码框的自5′末端起第192位至第193位核苷酸之间插入所述HMPV-PTBE基因，并保持所述靶标流感病毒的NA基因的其它核苷酸不变得到的重组DNA分子；
所述HMPV-PTBE-NS基因是在所述冷适应、减毒流感病毒的NS基因的开放读码框的自5′末端起第375位至第376位核苷酸之间插入HMPV-PTBE基因，所述冷适应、减毒流感病毒的NS基因的开放读码框的自5′末端起第375位核苷酸与所述HMPV-PTBE基因通过5′-TAATG-3′进行连接，所述HMPV-PTBE基因通过5′-TAA-3′与所述冷适应、减毒流感病毒的NS基因的开放读码框的自5′末端起第376位核苷酸连接，并保持所述冷适应、减毒流感病毒的NS基因的其它核苷酸不变得到的重组DNA分子；
所述HMPV-PTBE-HA基因是在所述靶标流感病毒的HA基因的开放读码框的自5′末端起第51位至第52位核苷酸之间插入HMPV-PTBE基因，所述靶标流感病毒的HA基因的开放读码框的自5′末端起第51位核苷酸与所述HMPV-PTBE基因通过5′- GCAGCAGCACCTGGAGCAGCA-3′进行连接，所述HMPV-PTBE基因通过与所述靶标流感病毒的HA基因的开放读码框的自5′末端起第52位核苷酸连接，并保持所述靶标流感病毒的NS基因的其它核苷酸不变得到的重组DNA分子；
所述HMPV-PTBE基因编码人偏肺病毒的T细胞优势抗原表位和人偏肺病毒的B细胞优势抗原表位；
所述靶标流感病毒为流感病毒株A/California/07/2009；
所述冷适应、减毒流感病毒为冷适应、减毒流感病毒株A/AnnArbor/06/60；
所述HMPV-PTBE基因编码氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示的蛋白质；
所述HMPV-PTBE-NS基因的核苷酸序列是SEQ ID NO.2第15-1884位所示的DNA分子；
所述HMPV-PTBE-NA基因的核苷酸序列是SEQ ID NO.3第15-2428位所示的DNA分子；
所述HMPV-PTBE-HA基因的核苷酸序列是SEQ ID NO.4第15-2810位所示的DNA分子。
2.根据权利要求1所述的重组病毒，其特征在于：所述HMPV-PTBE基因的核苷酸序列是SEQ ID NO.1所示的DNA分子。
3.由权利要求1或2所述的重组病毒制备得到的嵌合疫苗。
4.权利要求1或2所述的重组病毒在制备预防流感病毒和/或人偏肺病毒引起的疾病的产品中的应用。
5.权利要求3所述的嵌合疫苗在制备预防流感病毒和/或人偏肺病毒引起的疾病的产品中的应用。
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