CN105218679A - 人偏肺病毒多表位抗原及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及人偏肺病毒多表位抗原及其应用，所述人偏肺病毒多表位抗原由B细胞表位、Th细胞表位、CTL细胞表位序列组合而成，通过串联方式，并用连接子将上述各类型表位序列连接在一起。本发明还提供所述人偏肺病毒B细胞表位、CTL细胞表位和Th细胞表位基因片段的制备、串联及表达，制备人偏肺病毒多表位抗原，并评价其激活细胞免疫和体液免疫应答水平。通过评价实验表明，本发明的人偏肺病毒多表位抗原既可激活细胞免疫中的CTL免疫和Th免疫，也可激活体液免疫，体外实验对hMPV有一定中和作用，其可用于表位疫苗的开发，建立免疫学诊断方法，疾病流行病学研究以及hMPV感染的免疫治疗等。

Description

人偏肺病毒多表位抗原及其应用

技术领域

本发明涉及人偏肺病毒B细胞、T细胞多表位抗原，属于基因工程领域，依据人偏肺病毒B细胞表位、CTL细胞表位和Th细胞表位基因片段的制备、串联及表达，制备人偏肺病毒多表位抗原，并评价其激活细胞免疫和体液免疫应答水平。

背景技术

人偏肺病毒(Humanmetapneumovirus,hMPV)是荷兰学者于2001年从呼吸道感染的婴幼儿标本中分离到的一种新现病毒，其属于副粘病毒科肺病毒亚科偏肺病毒属。hMPV为有包膜的单负链RNA病毒，基因组含有8个基因编码9种不同蛋白，分别是核衣壳蛋白(N)、磷酸化蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、转录延伸因子(M2-1)、RNA合成调节因子(M2-2)、小疏水蛋白(SH)、主要黏附蛋白(G)、和RNA聚合酶大亚单位(L)。从3’至5’端分别是3’-N-PM-F-M2-1-M2-2-SH-G-L-5’。种系发生分析表明，HMPV可分为A、B两个基因型。A、B两个型别又可根据黏附蛋白G和融合蛋白F基因序列分别分为A1、A2和B1、B2两个亚型。除G蛋白外，hMPV其它蛋白均高度保守。

研究证实，hMPV是仅次于呼吸道合胞病毒的引起儿童急性呼吸道感染的第二位病毒病原，其也是老年人、免疫缺陷患者及有基础疾病人群急性呼吸道感染的重要病原体。hMPV不能引起感染后持久免疫，可反复感染。

目前尚缺乏抗hMPV的有效药物和疫苗。研究表明hMPV甲醛灭活疫苗免疫动物后能使再次感染时疾病加重。表位疫苗具有安全、无毒、稳定、容易生产、可根据需要组合等优点，而成为最具开发前景的新型疫苗之一。一个理想的病毒疫苗不仅要能激发体液免疫，产生特异性的中和抗体，还应该能激活CD8+细胞毒性T细胞(CTL)免疫来清除病毒。而CD4+辅助性T细胞(Th)既参与细胞免疫(Th1细胞)，有利于机体胞内病原体的清除，也有重要的辅助抗体产生的作用(Th2细胞)。为发挥更好的抗病毒作用，T/B细胞联合表位可能更为合理和有效。目前尚未见将hMPVB细胞表位和CTL、Th表位修饰串联构建为多表位抗原，评价其免疫应答的报道。

常用的表位筛选方法有化学或生物法、肽探针扫描技术、随机肽库技术及人工预测法等。前三者有操作繁琐，工作量大，耗时长，成本高，特异性抗体制备困难等缺点，使用受到一定的限制。生物信息学技术的发展，为多表位疫苗的快速发展奠定了基础。近年来，研究者开发了大量的算法和软件来进行T和B细胞表位的预测，有效性及准确率等方面有了很大提高。许多免费的在线软件为研究者的应用提供了方便，每种软件的预测都有其局限性，将多种计算方法和软件综合运用，可使抗原表位预测的有效性和准确率大大提高。

已有诸多研究证实副粘病毒科病毒的F蛋白是主要的保护性抗原，可刺激机体产生保护性中和抗体，且hMPVF蛋白相对保守(A、B型间同源性约为94％)，可对所有型别hMPV有交叉免疫，故F蛋白可作为B细胞表位预测蛋白。因hMPV的L蛋白较大(约2000aa)，不适于表位预测，参照hRSV的研究，P蛋白无CTL表位，故hMPV的N、M、F、M2-1、M2-2、SH和G等7个蛋白可进行CTL和Th表位预测。

本发明中3段CTL表位(C1、C2和C3)已有文献报道(MelendiGA,ZavalaF,BuchholzUJ,etal.MappingandcharacterizationoftheprimaryandanamnesticH-2(d)-restrictedcytotoxicT-lymphocyteresponseinmiceagainsthumanmetapneumovirus.Journalofvirology,Oct.2007,p.11461-11467；HerdKA,MahalingamS,MackayIM,etal.CytotoxicT-lymphocyteepitopevaccinationprotectsagainsthumanmetapneumovirusinfectionanddiseaseinmice.Journalofvirology,Feb.2006,p.2034-2044)，可增强CTL细胞免疫应答，可降低攻毒小鼠肺部病毒载量，并减轻肺部组织病理学改变。本发明将文献报道的CTL表位和自行预测的B细胞表位、CTL表位和Th表位进行串联，既可激活细胞免疫中的CTL免疫和Th免疫，也可激活体液免疫，体外实验对hMPV有一定中和作用。

发明内容

本发明首先利用在线软件进行人偏肺病毒的T和B细胞表位的预测，本发明的某些实施例给出了B细胞表位预测、T细胞表位预测的具体方法，预测的各优选表位序列为：

序号表位序列

B1PSCSGKKGNY

B2QLAREEQIENPRQSR

B3CQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHV

B4CNINISTTNYPCKVSTGRHP

B5SKVEGEQHVIK

B6YITNQDADTVTI

C1SPKAGLLSL

C2CYLENIEII

C3GYIDDNQSI

C4NYIKVENNL

T1ARAVSNMPTSAGQIK

T2FPLFQANTPPAVLLD

其中：C1、C2、C3为上文列出的文献报道的CTL表位。

本发明构建的人偏肺病毒的多表位抗原是由B细胞表位(B1、B2、B3、B4、B5、B6)、Th细胞表位(T1、T2)、CTL细胞表位序列(C1、C2、C3、T4)组合而成。通过串联方式，并用连接子将上述各类型表位序列连接在一起。

多表位抗原的构建次序可以为各表位序列的任意排序，优选为：

B1-B2-B3-B4-B5-B6-C1-C2-C3-C4-T1-T2；

或T1-T2-C1-C2-C3-C4-B1-B2-B3-B4-B5-B6；

或T1-T2-B1-B2-B3-B4-B5-B6-C1-C2-C3-C4。

各表位序列之间的连接子可以为以甘氨酸－脯氨酸－甘氨酸－脯氨酸－甘氨酸(GPGPG)、赖氨酸－赖氨酸(KK)、丙氨酸－丙氨酸－酪氨酸(AAY)、甘氨酸－丝氨酸(GS)、甘氨酸－丝氨酸-甘氨酸－甘氨酸－丝氨酸(GSGGS)中的任意一种。

本发明优选的多表位抗原序列为：B1-B2-B3-B4-B5-B6-C1-C2-C3-C4-T1-T2，其中同类型表位间隔序列为GPGPG，不同类型表位间隔序列为KK；其氨基酸序列为SEQIDNO:1：

PSCSGKKGNYGPGPGQLAREEQIENPRQSRGPGPGCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVGPGPGCNINISTTNYPCKVSTGRHPGPGPGSKVEGEQHVIKGPGPGYITNQDADTVTIKKSPKAGLLSLGPGPGCYLENIEIIGPGPGGYIDDNQSIGPGPGNYIKVENNLKKARAVSNMPTSAGQIKGPGPGFPLFQANTPPAVLLD

上述氨基酸序列相对应的核苷酸序列即为多表位抗原基因hMPV-mea，hMPV-mea核苷酸序列按大肠杆菌宿主偏爱密码子进行优化并合成；当然任何可翻译为多表位抗原氨基酸序列的核苷酸密码子序列均可用于该发明；本发明优选三种核苷酸序列：

(1)病毒表位自身序列+间隔序列(SEQIDNO:2)

CCTTCTTGTTCAGGAAAAAAGGGAAACTATgggcccgggcccgggCAACTGGCAAGAGAGGAGCAAATTGAAAATCCCAGACAATCTAGAgggcccgggcccgggTGTCAAAATGCAGGGTCAACTGTTTACTACCCAAATGAAAAAGACTGTGAAACAAGAGGAGACCATGTCgggcccgggcccgggTGCAACATAAACATATCTACTACTAATTACCCATGCAAAGTTAGCACAGGAAGACATCCTgggccc gggcccgggAGCAAAGTTGAAGGCGAACAGCATGTTATAAAAgggcccgggcccgggTATATAACCAACCAAGACGCAGACACAGTGACAATAaaaaaaAGCCCAAAAGCTGGACTGTTATCACTAg ggcccgggcccgggTGTTATTTAGAAAACATAGAAATTATAgggcccgggcccgggGGTTATATTGATGATAACCAAAGCATAgggcccgggcccgggAATTATATAAAAGTGGAAAACAATCTGaaaaaaGCCAGAGCTGTTTCCAACATGCCAACATCTGCAGGACAAATAAAAgggcccgggcccgggTTCCCTTTGTTTCAGGCCAACACACCACCAGCAGTGCTGCTCGAT

(2)E.Coli偏爱密码子序列(SEQIDNO:3)

CCGAGCTGTAGCGGTAAAAAAGGTAATTATggtccgggtccgggtCAGCTGGCACGTGAAGAACAAATTGAAAATCCGCGTCAGAGCCGTggccctggtccgggtTGTCAGAATGCAGGTAGCACCGTTTATTATCCGAATGAGAAAGATTGTGAAACCCGTGGTGATCATGTTggtcctggtcctggtTGTAATATCAATATTTCCACCACCAACTATCCGTGCAAAGTTAGCACCGGTCGTCATCCGggtccaggtcc gggtAGCAAAGTTGAAGGTGAACAGCATGTTATTAAAggtccgggaccgggtTACATTACCAATCAGGATGCAGATACCGTGACCATCaaaaaaAGCCCGAAAGCAGGTCTGCTGAGCCTGggtccgggt cctggcTGTTATCTGGAAAATATTGAAATCATTggtccaggaccgggtGGCTATATTGATGATAATCAGAGCATTggtccgggacctggcAATTATATCAAAGTGGAAAACAACCTGaaaaaaGCACGTGCCGTTAGCAATATGCCGACCAGCGCAGGTCAGATCAAAggtccaggtccaggtTTTCCGCTGTTTCAGGCAAATACCCCTCCGGCAGTTCTGCTGGAT

(3)小鼠偏爱密码子序列(SEQIDNO:4)

CCCAGCTGCAGCGGCAAGAAGGGCAACTACggccctggccccggaCAGCTGGCCAGAGAGGAACAGATCGAGAACCCCAGACAGAGCAGAggcccaggccctggcTGTCAGAACGCCGGCAGCACCGTGTACTACCCCAACGAGAAGGACTGCGAGACAAGAGGCGACCACGTGggccctggacccggcTGCAACATCAACATCAGCACCACCAACTACCCCTGCAAGGTGTCCACCGGCAGACACCCTgga cctggccctggcAGCAAGGTGGAAGGCGAGCAGCACGTGATCAAGggacccggcccaggcTACATCAC

CAACCAGGACGCCGACACCGTGACCATCaagaagTCCCCCAAGGCCGGCCTGCTGAGCCTGggaccaggacctggcTGCTACCTGGAAAACATCGAGATCATCggccctgggcctggcGGCTACATCGACGACAACCAGAGCATCggcccaggaccaggcAACTACATCAAGGTGGAAAACAACCTGaag aaaGCCAGGGCCGTGTCCAACATGCCCACCTCTGCCGGCCAGATCAAGggcccagggcccggaTTCCCCCTGTTCCAGGCCAACACACCCCCTGCCGTGCTGCTGGAC

其中：带下划线“____”部分为间隔序列GPGPG对应核苷酸，带双下划线“____”为间隔序列KK对应核苷酸。

本发明还提供hMPV-MEA的表达及纯化方法，某实施例给出针对优选的多表位抗原序列(B1-B2-B3-B4-B5-B6-C1-C2-C3-C4-T1-T2，其中同类型表位间隔序列为GPGPG，不同类型表位间隔序列为KK)，以载体pET32a(+)质粒为例进行表达纯化。但不仅限于此载体，其他载体如真核表达载体pcDNA3.1载体，pCMVp-NEO-BAN载体，昆虫杆状病毒表达系统等均可。本发明某实施例中给出了具体的表达及纯化方法。

进一步，本发明针对上述制备的人偏肺病毒的多表位抗原，评价其激活细胞免疫和体液免疫应答水平。本发明某实施例给出了具体的评价方法及结果。

本发明的人偏肺病毒的多表位抗原，通过评价实验表明，其既可激活细胞免疫中的CTL免疫和Th免疫，也可激活体液免疫，体外实验对hMPV有一定中和作用。

本发明的人偏肺病毒的多表位抗原可用于表位疫苗的开发，建立免疫学诊断方法，疾病流行病学研究以及hMPV感染性疾病的免疫治疗等。

附图说明

图1.pET32a(+)-hMPV-mea酶切结果，其中1：DL2000Marker，2：pET32a(+)-mea双酶切后，3：pET32a(+)-mea未酶切

图2.pET32a(+)-hMPV-mea30℃诱导表达5h后产物SDS-PAGE分析，其中1：蛋白分子量Marker，2：pET32a(+)未诱导，3：pET32a(+)-mea诱导后上清，4：pET32a(+)-mea诱导后沉淀

图3.pET32a(+)-hMPV-mea诱导表达产物Westernblot分析(抗His抗体)，其中1：蛋白分子量Marker，2：pET32a(+)未诱导，3：pET32a(+)-mea诱导后

图4.pET32a(+)-hMPV-mea诱导表达产物Westernblot分析(hMPV-MEA抗血清)，其中1：蛋白分子量Marker，2：pET32a(+)未诱导，3：pET32a(+)-mea诱导后

图5.hMPV-MEA抗血清IFA检测结果，其中a：hMPV-MEA抗血清IFA检测；b：阳性对照；c：阴性对照

图6.hMPV-MEA免疫动物后淋巴细胞增殖指数

图7.hMPV-MEA免疫动物后CTL杀伤活性

图8.脾细胞分泌细胞因子

具体实施方式

1.主要试验材料及实验动物

RPMI1640培养液、胎牛血清(GIBCO，美国)；L-谷氨酰胺(L-G)D-Hanks’液：和青、链霉素、Phenazinemethosulfate(PMS)(SIGMA，美国)；CpGODN1826：美国Invitrogen公司；ImjectAlum(ThermoScientific，美国)；抗hMPV单克隆抗体clone507(chemicon，美国)；CellTiterAQueousMTSReagentPowder(Promega，美国)；HRP-羊抗鼠IgG、IgG1、IgG2a、IgA(Santa，美国)；TMB显色液(KPL，美国)；QuickAntibody-mouse5W(北京博奥龙)；CytoTox-ONE^TMHomogeneousMembraneIntegrityAssay(Promega，美国)；FITC-antimouseCD4、CD8(Biolegend，美国)；Bio-PlexPro^TMMouseCytokineTh1/Th2Assay(BIO-RAD，美国)；无特殊病原体(SPF)级4-6周雌性BALB/c小鼠，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心。TJ-hMPV-2(A型)、TJ-hMPV-2(B型)hMPV毒株为本实验分离、鉴定并测序分型保存；Vero-E6和P518细胞为本实验保存。

2.主要仪器

CO₂细胞培养箱：美国ThermoSCIENTIFIC公司，型号：FORMADIRECTHEATCO2Incubator

电子分析天平：德国Sartorius公司，型号：BS110S

倒置显微镜：日本Olympus公司，型号：CK40

离心机：德国Eppendorf公司，型号：5804R

全自动酶标板分析仪：瑞士SUNRISE公司，型号：SUNRISE-3

3.本发明使用的人偏肺病毒分离培养方法

RT-PCR检测为hMPV阳性的呼吸道标本(如咽拭子、鼻拭子，鼻咽吸取物等)，接种于vero-E6细胞或LLC-MK2细胞，37℃吸附1h，弃掉接种液，加入病毒生长液(含2％胎牛血清、0.013％胰酶的MEM，或含终浓度2μg/mlTPCK胰酶的MEM)，5％CO₂37℃培养，每日观察病变，2-3d换一次病毒生长液，75％～100％细胞均出现病变时，收获病毒液，RT-PCR法鉴定培养物。参考文献如下：

1)RegevL,HindiyehM,ShulmanLM,BarakA,LevyV,AzarR,ShalevY,GrossmanZ,MendelsonE(2006)CharacterizationofhumanmetapneumovirusinfectionsinIsrael.JClinMicrobiol44:1484–1489

2)SarasiniA,PercivalleE,RovidaF,CampaniniG,GeniniE,TorselliniM,PaolucciS,BaldantiF,MarchiA,GraziaRevelloM,GernaG(2006)DetectionandpathogenicityofhumanmetapneumovirusrespiratoryinfectioninpediatricItalianpatientsduringawinter–springseason.JClinVirol35:59–68

3)AbikoC,MizutaK,ItagakiT,KatsushimaN,ItoS,MatsuzakiY,OkamotoM,NishimuraH,AokiY,MurataT,HoshinaH,HongoS,OotaniK(2007)OutbreakofhumanmetapneumovirusdetectedbyuseoftheVeroE6celllineinisolatescollectedinYamagata,Japan,in2004and2005.JClinMicrobiol45:1912–1919

4)LiXY,ChenJY,KongM,SuX,YiYP,ZouM,ZhangH.PrevalenceofhumanmetapneumovirusinhospitalizedchildrenwithrespiratorytractinfectionsinTianjin,China.ArchVirol.2009；154(11):1831-6.doi:10.1007/s00705-009-0492-8.Epub2009Sep23.

实施例1：B细胞表位预测：

以hMPVA型参考株NL/1/00F蛋白(539aa，GenBank登录号AF371337)为模板，采用下列软件进行预测：

1)BepiPred(http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/)，阈值设定为0.35，>0.35的位点即可能为B细胞表位；

2)ABCpred(http://www.imtech.res.in/raghava/abcpred/)，阈值设定为0.51；

3)Bcepred(http://www.imtech.res.in/raghava/bcepred/)，当阈值设定为2.38；

4)LEPS(http://leps.cs.ntou.edu.tw/，综合考虑二级结构、亲水性、表面可及性、可塑性、极性和抗原性等参数进行线性表位预测；

5)LBTOPE(http://crdd.osdd.net/raghava/lbtope/index.php)，可能性>60％即为可能的表位，选择软件判断为高抗原性的片段，与其他方法预测片段综合考虑，最终确定候选表位；

6)利用blastp软件(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分别对预测的每个B细胞表位肽进行氨基酸序列保守性分析，选择A、B型间保守的表位，作为B细胞候选表位，见表1。

表1HMPVF蛋白B细胞表位预测结果

*:Y—表示经Bcepred预测为B细胞表位。

实施例2.T细胞表位预测

分别以GenBank上登录的A型参考毒株NL/1/00的N、M、F、G、SH、M2-1和M2-2等7个蛋白的氨基酸序列(GenBank登录号：AF371337)为模板，采用下列软件进行预测，结合力数值>0.426即为可能的CTL和Th表位：

针对小鼠MHC-Ⅰ限制性的CTL表位：

1)NetMHCpan2.8server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)；

2)NetMHC3.4server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/)；

针对小鼠MHC-Ⅱ限制性Th表位：

3)NetMHCⅡ2.2server(http://genome.cbs.dtu.dk/services/NetMHCII/)：

4)ClustalX将筛选出的CTL和Th候选表位与GenBank上登录的不同型别hMPV进行氨基酸保守性比对，选择A、B型间保守的表位，作为CTL和Th候选表位，表2、3。

表2HMPV小鼠CTL细胞表位

#：文献报道的CTL表位

表3HMPV小鼠限制性Th表位

^&：SB-Strongbinding，强结合力

实施例3：

hMPV-mea核苷酸序列由Invitrogen德国公司合成，具体方法是采用化学法合成Oligo，通过PCR拼接而成，全长hMPV-mea片段两端加入酶切位点，将该片段与T载体连接，转化E.Coli宿主细胞进行大量扩增。

实施例4：hMPV-MEA表达及纯化

以下为以载体pET32a(+)质粒为例进行表达纯化。

限制性内切酶BamHI、HindIII双酶切人工合成hMPV-mea(627bp)及pET32a(+)质粒(5900bp)，T4DNA连接酶连接获得pET32a-hMPV-mea表达重组质粒，转化E.coliBL21(DE3)宿主菌，经含100μg/mlAmp的LB平板培养基筛选，选取抗性菌落培养后，提取重组质粒，酶切(图1)、测序鉴定重组质粒。鉴定正确菌株用1mol/LIPTG分别于30℃诱导表达外源蛋白，于诱导后5h取菌液超声破碎后上清及沉淀分别进行SDS-PAGE(图2)。采用镍亲和层析法进行纯化，0.01MPBS(pH7.5)透析，Bradford法测定蛋白含量。重组外源蛋白对应核苷酸长度为1158bp，编码氨基酸长度为385aa，预测分子量为40.55KD，pI为6.21。用抗His抗体或免疫小鼠后获得的hMPV-MEA抗血清进行WesternBlot检测，鉴定表达蛋白，在45kD附近见特异条带(图3，图4)，表明表达的hMPV-MEA可与抗His抗体及hMPV-MEA抗血清发生结合反应。

实施例5：hMPV-MEA动物免疫

4-6w龄SPF级雌性BALB/c小鼠分为以下三组，6只/组，如下：hMPV-MEA20μg+Quickantibody5W/肌肉注射组(以下称为hMPV-MEAQ组)，于初次免疫后3周加强免疫一次，剂量及免疫方式同前；hMPV-MEA20μg+Alum100μl+CpGODN5μg腹腔注射组(以下称为hMPV-MEAA+C组)，于0、2、4周各免疫一次，剂量及免疫方式同前；正常对照组。末次免疫后2周采血进行蛋白抗体效价测定，免疫荧光法对特异性进行检测，同时取脾细胞进行淋巴细胞增殖试验、CTL细胞杀伤活性检测，脾细胞分泌细胞因子检测。

实施例6：间接免疫荧光法(IFA)检测抗hMPV-MEA血清

分别以A型和B型hMPV病毒株感染vero-E6细胞，细胞病变达+++～++++时收集细胞，制备抗原片，从1:10始，倍比稀释小鼠抗hMPV-MEA血清，滴于抗原片上，抗hMPV单克隆抗体作为阳性对照，37℃孵育1h，洗涤后滴加1:100稀释的FITC-羊抗鼠IgG抗血清，37℃0.5h，洗涤后封片，镜检。以能观察到明显特异性荧光反应(“+”)的血清稀释度的倒数为抗体效价。结果显示hMPV-MEA免疫后血清与A型和B型hMPV均可发生特异性结合，荧光抗体效价均为160，图5。表明抗hMPV-MEA抗体与A型及B型hMPV病毒均可发生特异性结合反应。

实施例7：ELISA法检测小鼠抗hMPV-MEA抗体

2μg/ml纯化hMPV-MEA包被反应孔，100μl/孔，加入10倍系列稀释小鼠抗hMPV-MEA血清，100μl/孔，37℃孵育1h，洗涤后加入1:5000稀释的HRP-羊抗鼠IgG/IgG1/IgG2a抗体100μl/孔，37℃1h，洗涤后加入100μl/孔TMB显色液，37℃孵育15min，加入100μl/孔终止液，酶标仪读取OD450/630nm。OD值大于未免疫小鼠血清(阴性对照)OD值的2.1倍，即P/N>2.1判为阳性，出现阳性的最高稀释度的倒数为血清抗体效价。经ELISA检测，hMPV-MEAQ组和hMPV-MEAA+C组免疫后小鼠抗hMPV-MEA血清IgG、IgG1、IgG2a抗体效价均较高(>10⁴)见表4。hMPV-MEAQ组和hMPV-MEAA+C组IgG1/IgG2a比值为分别为1.19和1.18。表明hMPV-MEA激活了高水平体液免疫，免疫后IgG1与IgG2a抗体均显著存在，IgG1稍多于IgG2a。

表4hMPV-MEA免疫动物产生抗体效价的几何均数

实施例8：淋巴细胞增殖检测

96孔板中加入脾淋巴细胞悬液5×10⁵/孔，hMPV-MEA(终浓度为50μg/ml)作为刺激物，另外设立未刺激对照孔。脾淋巴细胞培养物于37℃5％CO2培养箱培养72h。向2ml的MTS溶液(2mg/ml，PH6.5，DPBS配制)中加入100μl的PMS(0.92mg/ml，DPBS配制)，混匀，制成MTS工作液。PMS作用结束后，每个细胞培养孔中加入20μl的MTS工作液。5％CO₂、37℃下孵育2h，490nm处检测OD值。计算增殖指数，增殖指数＝刺激组OD值/对照组OD值。hMPV-MEAQ组和hMPV-MEAA+C组淋巴细胞增殖系数均高于对照组(P<0.05)，见图6，说明hMPV-MEA可以刺激淋巴细胞增殖。

实施例9：CTL介导的细胞杀伤作用检测

脾淋巴细胞(5×10⁵/孔)作为效应细胞，P815(小鼠肥大细胞瘤细胞)(2×10⁴/孔)作为靶细胞，每只小鼠脾细胞分为：自然释放孔(靶细胞+RPMI1640)；最大释放孔(靶细胞+1％TritonX-100)；实验孔(靶细胞+效应细胞)。5％CO₂、37℃下孵育4h，1500r/min离心5min，取上清100μl加入等体积CTL检测工作液，室温下孵育10min，加入停止液50μl，560nm处检测OD值。杀伤率(％)＝(实验孔OD均值－自然释放孔OD均值)/(最大释放孔OD均值－自然释放孔OD均值)×100％。hMPV-MEAQ组和hMPV-MEAA+C组CTL细胞杀伤率均高于对照组(P<0.05)，见图7，说明hMPV-MEA激活了CTL细胞特异性杀伤活性。

实施例10：脾淋巴细胞分泌的细胞因子检测

96孔板中以200μl/孔加样，脾淋巴细胞悬液为5×10⁵/孔，以hMPV-MEA(终浓度为50μg/ml)作为刺激物，另外设立未刺激对照孔。脾淋巴细胞培养物于37℃5％CO2培养箱培养72h，收集细胞培养上清，5000r/min离心5min。采用悬浮芯片法检测脾细胞分泌因子IL-2、IL-12、IFN-γ(Th1细胞分泌)和IL-4、IL-5、IL-10(Th2细胞分泌)及TNF-α、GM-CSF(Th1和Th2细胞共分泌)(Bio-PlexPro^TMMouseCytokineTh1/Th2Assay)。

hMPV-MEAQ组和hMPV-MEAA+C组，Th1型细胞因子中IFN-γ分泌均明显高于对照组(P<0.05)；Th2型细胞因子中IL-5和IL-10明显高于对照组(P<0.05)，hMPV-MEAA+C组IL-4稍高于对照组(P<0.05)；共分泌细胞因子中GM-CSF明显高于对照组(P<0.05)(图8)，表明hMPV-MEA既可引起Th1型细胞免疫反应，也可引起Th2型细胞免疫反应。

实施例11：抗hMPV-MEA血清体外中和试验

抗hMPV-MEA血清56℃灭活0.5h，从1:10始，倍比稀释小鼠抗hMPV-MEA血清，与等体积100TCID50的hMPV病毒培养物混合，37℃孵育1h，将血清与病毒混合液50μl加于96孔板培养的单层vero-E6细胞上，每一血清稀释度做4个复孔，同时设病毒对照孔(加25μl100TCID50病毒，25μlMEM)及细胞对照孔(加50μlMEM)，37℃吸附1h，弃掉接种液，加入病毒生长液(含有与病毒孵育时相同稀释度的抗hMPV-MEA血清、终浓度2μg/mlTPCK胰酶的MEM)，5％CO₂37℃培养5d，观察细胞病毒。以能保护50％细胞培养孔不被感染的最高血清稀释度的倒数作为中和抗体效价，用公式计算：

log50％中和滴度＝L-d(S-0.5)，其中：

L＝实验中使用的最低稀释度的log值；

d＝稀释梯度的log值；

S＝终判时阳性部分的总和(即未出现CPE的细胞孔所占的比例之和)。

hMPV-MEAQ组抗hMPV-MEA血清中和抗体效价的几何均数为89；hMPV-MEAA+C组抗hMPV-MEA血清中和抗体效价的几何均数为93。表明抗hMPV-MEA血清体外对hMPV有中和作用。

Claims (10)

1.人偏肺病毒多表位抗原，由B细胞表位、Th细胞表位、CTL细胞表位序列组合而成，通过串联方式，并用连接子将上述各类型表位序列连接在一起；其中

B细胞表位序列如下：

B1PSCSGKKGNY

B2QLAREEQIENPRQSR

B3CQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHV

B4CNINISTTNYPCKVSTGRHP

B5SKVEGEQHVIK

B6YITNQDADTVTI

Th细胞表位序列如下：

T1ARAVSNMPTSAGQIK

T2FPLFQANTPPAVLLD

CTL细胞表位序列如下：

C1SPKAGLLSL

C2CYLENIEII

C3GYIDDNQSI

C4NYIKVENNL。

2.根据权利要求1所述的人偏肺病毒多表位抗原，其构建次序为以下各表位序列中的任意一种，

B1-B2-B3-B4-B5-B6-C1-C2-C3-C4-T1-T2；

或T1-T2-C1-C2-C3-C4-B1-B2-B3-B4-B5-B6；

或T1-T2-B1-B2-B3-B4-B5-B6-C1-C2-C3-C4。

3.根据权利要求1所述的人偏肺病毒多表位抗原，各表位序列之间的连接子为GPGPG、KK、AAY、GS、GSGGS中的任意一种。

4.根据权利要求2所述的人偏肺病毒多表位抗原，多表位抗原的构建次序为B1-B2-B3-B4-B5-B6-C1-C2-C3-C4-T1-T2，其中同类型表位间隔序列为GPGPG，不同类型表位间隔序列为KK；其氨基酸序列为SEQIDNO:1。

5.任何翻译为权利要求1-4任意一项所述的人偏肺病毒多表位抗原的氨基酸序列的核苷酸序列。

6.根据权利要求5所述的核苷酸序列，选择如下三种序列中的任意一种：

(1)病毒表位自身序列+间隔序列：SEQIDNO:2；

(2)E.Coli偏爱密码子序列：SEQIDNO:3；

(3)小鼠偏爱密码子序列：SEQIDNO:4。

7.根据权利要求5或6任意一项所述的核苷酸序列，其表达载体选择pET32a(+)质粒、真核表达载体pcDNA3.1载体、pCMVp-NEO-BAN载体、昆虫杆状病毒表达系统中的任意一种。

8.权利要求1-4任意一项所述的多表位抗原在制备表位疫苗中的应用。

9.权利要求1-4任意一项所述的多表位抗原在制备免疫学诊断制剂中的应用。

10.权利要求1-4任意一项所述的多表位抗原在制备治疗hMPV感染性疾病药物中的应用。