CN101421621A - 检测多种病原体的方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及同时检测多种感染性生物体的方法，包括同时测定样品中存在或不存在包括至少一种病毒病原体和至少一种非病毒病原体的病原体组中的一个或多个成员的方法。本发明也公开了实施本发明方法的试剂盒并要求其权利。

Description

检测多种病原体的方法和试剂盒

发明背景

发明领域

本发明总地涉及医疗诊断领域，尤其涉及同时检测多种感染性生物体的方法，包括同时检测病毒和细菌病原体的方法。

个体受一种以上病原性生物体感染是常见的现象。混合型病毒感染(即同时感染一种以上类型的病毒)并非不寻常(Waner(1994)Clin.Microbiol Rev.，7：143-151)。也有混合型病毒和细菌感染的记录，参见例如，Hietala等(1989)Pediatr.Infect.Dis.J.，8：683-686，和Korppi(1999)Pediatr.Pulmonol.SuppL，18：110，将其全文纳入本文作为参考。

呼吸道的病毒感染是最常见的人类疾病之一，包括但不限于：A型和B型呼吸道合胞病毒(RSV)感染，A、B和C型流感病毒感染，1、2和3型人副流感病毒(hPIV)感染，人肺炎后病毒(hMPV)感染，麻疹病毒感染，腺病毒(AV)感染，鼻病毒感染，冠状病毒感染以及肠道病毒感染。参见例如，Mackie(2003)Paediatr.Respir.Rev.，4：84-90；和Kahn(2003)Curr.Opin.Infect.Dis.，16：255-258，将其全文纳入本文作为参考。免疫削弱的患者易于发生额外病毒如疱疹病毒(Mackie(2003)Paediatr.Respir.Rev.，4：84-90)的呼吸道感染。对有免疫能力的患者的研究证明，高百分数(>30％)的RSV或鼻病毒感染患者显示出伴随感染另一种病毒的血清学迹象。对混合型病毒感染的分析报道，呼吸道合胞病毒、流感病毒、腺病毒和副流感病毒是混合型呼吸道感染中最常见的病毒，RSV和流感病毒的组合是最常见的共同感染(Waner(1994)Clin.Microbiol.Rev.，7：143-151)。也有报道称人肺炎后病毒和呼吸道合胞病毒的共同感染是常见的(Greensill等(2003)Emerg.Infect.Dis.，9：372)。也记录有许多混合型病毒-细菌和病毒-真菌呼吸道感染。参见例如，Korppi等(1989)Pediatr.Infect.Dis.J.，8：687-692；Korppi等(1990)Scand J.Infect.Dis.，22：307-312；Korppi等(1991)ActaPaediatr.Scand，80：413-417；Korppi等(1993)Eur.J.Pediatr.，152：24；Hament等(1999)FEMS Immunol.Med Microbiol.，26：189-195；和Tristram等(1988)Arch.Pediatr.Adolesc.Med，142：834-836，将其全文纳入本文作为参考。

虽然通常认为急性中耳炎是中耳的细菌感染，但它可能与病毒病原体相关或受其影响(Heikkinen和Chonmaitree(2003)Clin.Microbiol.Rev.，16：230-241；Canafax等(1998)Pediatr.Infect.Dis.J.，17：149-156；和Ruuskanen等(1989)Pediatr.Infect Dis.J.，8：94，将其全文纳入本文作为参考)。类似地，某些呼吸道病毒，尤其是A型流感病毒的先前感染似乎能增加肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)引起的中耳炎的发病率和严重性(参见例如，Tong等(2000)Ann.Otol.Rhinol.Laryngol，109：1021-1027；Tong等(2001)Infect.Immun.，69：602-606；和Tong等(2002)Infect.Immun.，70：4292-4301，将其全文纳入本文作为参考)。

脑膜炎和其它中枢神经系统感染的病原可以是病毒或细菌。证明了多种感染物质(参见例如，Eglin等(1984)Lancet，2(8409)：984；Squadrini等(1977)Lancet，1(8026)：1371；和Krasinski等(1987)Am.J.Epidemiol.，125：499-508，将其全文纳入本文作为参考)，在医学文献报道中，脑膜炎中的细菌混合型感染比病毒-细菌混合型感染相对更常见(Sferra和Pacini(1988)Pediatr.Infect.Dis.J.，7：552-556，将其全文纳入本文作为参考)。真核病原体如兰氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia)、溶组织内阿米巴(Entamoebahistolytica)、福氏耐格里阿米巴(Naegleria fowleri)、卡晏环孢子虫(Cyclosporacayetanensis)、冈地弓形体(Toxoplasma gondi)、微小隐孢子虫(Cryptosporidiumparvum)、多棘变形虫(Acanthomoeba)、微孢子虫(microsporidia)和其它原生动物病原体也可引起中枢神经系统感染。

许多病原体能引起消化道感染，包括病毒、细菌和原生动物(Leclerc等(2002)CritRev.Microbiol，28：371-409，将其全文纳入本文作为参考)。混合型感染，包括病毒-细菌混合型感染与肠胃炎相关(参见例如，Cramblett和Siewers(1965)Pediatrics，35：885-898；Zavate等(1988)Virologie，39：131-136；Bettelheim等(2001)Comp.Immunol.Micorbiol Infect.Dis.，24：135-142，将其全文纳入本文作为参考)。

病毒感染可能在细菌感染之前，和与细菌感染重叠。在呼吸道疾病的情况下，相信病毒感染使患者易患细菌引起的疾病(参见例如，Hament等(1999)FEMSImmunol.Med Microbiol，26：189-195；Korppi(2002)APMIS，110：515)。也有证据显示，先感染腺病毒、也可能是B型流感病毒同样可使受试者易患细菌性脑膜炎(Krasinski等(1987)Am.J.Epidemiol.，125：499-508)。类似地，病毒感染呼吸道常常在中耳炎之前发生，并加重中耳炎的症状，现在认为通过免疫预防病毒感染是预防急性中耳炎的重要方式(Heikkinen和Chonmaitree(2003)Clin.Microbiol Rev.，16：230-241)。反之，细菌病原体共同感染(或超感染)可能使病毒感染更严重或拖延更长时间(参见例如，Jarstrand和Tunevall(1975)Scand.J.Infect.Dis.，7：243-247；Krell等(2003)Infection，5：353-358；Thomas等(2003)Pediatr.Infect.Dis.J.，22：201-202，将其全文纳入本文作为参考)。因此，测定可能涉及病症病因的所有病原体(无论是病毒、细菌或真核病原体(包括真菌和原生动物病原体))，对于用适当的抗病毒剂、抗菌剂或其它抗微生物剂进行及时的治疗很重要。在具有高致死率或严重后遗症的疾病如脑膜炎中，快速和准确的诊断尤其重要。准确区分病毒感染与非病毒感染(尤其是细菌感染)对于避免不适当地使用抗生素、抗生素伴随的副作用和出现抗生素抗性的风险是重要的。未并发非病毒感染的病毒感染的诊断结果使医生能选择开抗病毒药的处方。

发明概述

本发明涉及同时检测多种感染性生物体的方法。具体说，本发明涉及同时测定样品中存在或不存在包括至少一种病毒病原体和至少一种非病毒病原体的病原体组中一个或多个成员的方法。本发明也公开了实施本发明方法的试剂盒并要求该试剂盒的权利。

本发明一方面包括同时测定样品中存在或不存在包括至少一种病毒病原体和至少一种非病毒病原体的病原体组中一个或多个成员的方法，该方法包括，对病原体组各成员，进行检测衍生自所述成员的至少一个表位的至少一次测定，其中至少一次测定包括：(a)提供能够特异性结合衍生自所述成员的至少一个表位的至少一种结合剂；(b)使此至少一种结合剂直接接触样品；(c)使提供的至少一种结合剂特异性结合于所述表位并与该表位形成复合物；和(d)检测该复合物，如果样品中该成员的浓度大于或等于参比浓度，检测为阳性；如果该成员的浓度小于参比浓度，检测为阴性。

本发明另一方面包括实施本发明的测定方法和试剂盒。可设计这种测定方法和试剂盒以检测病原体组中一个或多个成员(包括至少一种病毒病原体和至少一种非病毒病原体)，例如其成员可单独或各自引起相似的疾病症状的病原体组。

附图简要说明

图1描述了实施本发明测定方法的装置的非限制性实施例，如实施例中所述。该装置包括铰链连接的硬纸板外壳，外壳上装有窗以便观察多个测试线结果。该装置的一侧有凹陷，含有预成型的塑料孔(1)以接受抽汲样品；覆盖标签(overlabel)(2)；预先装配的测试条(3)，制备方法如实施例1中所述；观察窗(4)；和任选的稍有粘性的衬板(5)。预先装配的测试条(3)包括位于导电垫(7)(用于定向液流)之间的偶联垫(6)。偶联垫含有暂时固定在偶联垫上或偶联垫中的结合剂。测试条也包括含有多个测试线读出区的膜(8)和吸收垫(9)。所述多个测试线读出区包括可被该装置检测到的各病原体的测试线。

发明详述

介绍

本发明认识到需要一种快速和准确测定存在或不存在一种或多种病原体，例如测定对象是否感染了病毒病原体、病毒病原体或二者的方法，并且部分提供了这种方法。该方法可用于确定适合于某感染的治疗类型，如是否应用抗病毒剂、抗菌剂或其它抗微生物剂治疗对象。优选地是，该方法廉价且技术上简单，最优选不需要昂贵或复杂的仪器或设备。这些方法优选不需要培养(病原体)的时间和花费，最优选是足够快速以用作护理点(point-of-care)诊断用途，如用于医生办公室以在患者就诊期间提供结果。

作为本发明范围的非限制性介绍，本发明包括几个通用和有用的方面，包括：

1)同时测定样品中存在或不存在包括至少一种病毒病原体和至少一种非病毒病原体的病原体组中一个或多个成员的方法，该方法包括，对病原体组各成员，进行检测衍生自所述成员的至少一个表位的至少一次测定，其中至少一次测定包括：(a)提供能够特异性结合衍生自所述成员的至少一个表位的至少一种结合剂；(b)使此至少一种结合剂直接接触样品；(c)使提供的至少一种结合剂特异性结合于所述表位并与该表位形成复合物；和(d)检测该复合物，如果样品中该成员的浓度大于或等于参比浓度，检测为阳性；如果该成员的浓度小于参比浓度，检测为阴性。

2)实施本发明方法的测定和试剂盒。在继续说明并与附图结合时可明显看出本发明的其它目的和优点。为了全面理解本发明范围，还认识到可组合本发明的各个方面以实现所需的本发明实施方式。

整个本申请中，参考了各种出版物。将这些出版物的公开内容全文纳入本申请作为参考。引用这些文献不是为了承认它们是相关现有技术。关于日期的所有陈述和关于这些文件内容的说明均基于本申请人可获得的信息，不能保证这些文件的日期和内容的正确性。

除非另有定义，本文所用的所有科技术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的涵义相同。通常，本文所用术语和下述生产和实验室方法是本领域熟知和常用的。本文所用技术术语具有其应用领域中的通常涵义，如各种技术词典所列举。当术语是单数形式时，本发明者也考虑了该术语的复数形式。本文所用术语和下述方法是本领域熟知和常用的。纳入本文作为参考的参考文献中所用术语和定义不同时，本申请所用术语应具有本文给出的定义。本文所用其它技术术语具有其应用领域中的通常涵义，如各种技术词典(例如《钱伯斯科技词典》(Chambers Dictionary ofScience and Technology)，Peter M.B.Walker(编)，Chambers Harrap Publishers，Ltd.，Edinburgh，UK，1999，1325页)所列举。本发明者不想受限于作用机制或模式。文中提供参考文献仅为说明目的。

I.同时检测病毒和非病毒病原体的方法

本发明包括同时测定样品中存在或不存在包括至少一种病毒病原体和至少一种非病毒病原体的病原体组中一个或多个成员的方法，该方法包括，对病原体组各成员，进行检测衍生自所述成员的至少一个表位的至少一次测定，其中至少一次测定包括：(a)提供能够特异性结合衍生自所述成员的至少一个表位的至少一种结合剂；(b)使此至少一种结合剂直接接触样品；(c)使提供的至少一种结合剂特异性结合于所述表位并与该表位形成复合物；和(d)检测该复合物，如果样品中该成员的浓度大于或等于参比浓度，检测为阳性；如果该成员的浓度小于参比浓度，检测为阴性。

本发明方法可施用于怀疑含有包括至少一种病毒病原体和至少一种非病毒病原体的病原体组中一个或多个成员的任何样品。所述样品可包括病理学或诊断样品，实验或研究样品，或者环境样品。病理学或诊断样品可来自对象，如人对象或兽类对象，尤其是怀疑患有由感染性生物体引起的疾病的人或兽类对象。人对象可以是任何年龄的婴儿、儿童和成人。兽类对象可以是有经济、圈养或研究用途的未成熟或成熟动物(包括但不限于：犬、猫、牛、绵羊、山羊、猪、兔、大鼠、小鼠、鱼、禽和非人灵长动物)。感兴趣的疾病可以是相信由至少一种病原体引起的任何疾病，具体说此至少一种病原体可以是病毒或非病毒或病原体混合物。所述疾病包括但不限于：呼吸道感染(例如但不限于：肺炎、流感和流感样疾病、鼻窦炎、支气管炎、扁桃体炎、咽炎、喉炎、哮吼、细支气管炎、慢性阻塞性肺病)、急性中耳炎、结膜炎、脑膜炎和其它中枢神经系统感染，以及消化道感染(如肠胃炎或腹泻)。当疾病包括多种病原体感染时，这些感染可以是共同感染或超感染，可同时发生或相继发生(有或无重叠感染)。

当该样品来自人对象时，该样品可包括全细胞、组织、器官、活检样品、生物物质和液体(如血液、血清、血浆、尿、脑脊液、滑液、痰、唾液、精液、眼泪和粪便)，擦拭物、洗液、灌洗液、排出物或吸出物(例如鼻腔、口腔、鼻咽、口咽、食道、胃、直肠或阴道的擦拭物、洗液、灌洗液、排出物或吸出物)，及其提取物或衍生物。为用于本发明方法，可能需要最小规模制备样品(例如，收集到合适的容器中)，或较大规模地制备样品(例如但不限于：去除、失活或阻断不良物质如污染物、不需要的细胞或细胞物质、或者内源酶；用缓冲液、去污剂、表面活性剂、酶、变性剂、还原剂、氧化剂或其它试剂处理；进行加热、冷却、加压、真空或其它物理处理；过滤、离心、大小选择或亲和纯化；细胞固定、通透或裂解；以及浓缩或稀释)。可用一种或多种制备技术或者一种或多种制备试剂处理样品。在一个实施方式中，样品可使用能够测定或有助于测定一种或多种病毒病原体的一种制备技术或试剂和能够测定或有助于测定一种或多种非病毒病原体的另一种制备技术或试剂。在更优选的实施方式中，相同制备技术(例如，收集样品和用相同试剂处理)适用于处理感兴趣病原体组中的所有成员。最优选地，这些相同制备技术简单、快速、廉价。

本发明方法可同时测定样品中存在或不存在包括至少一种病毒病原体和至少一种非病毒病原体的病原体组中的一个或多个成员。“同时测定”指基本上同时或基本上在相同的窄时限内测定。窄时限可以是小于约1秒、或小于约1分钟、或小于约5分钟、或小于约15分钟。最优选地，可在相对短的时间段内，如患者向医生或其它卫生保健提供者咨询期间测定样品中存在或不存在病原体组所有成员，从而允许及时开给合适治疗的处方。

病原体组通常选自各自能够引起相似或相同疾病症状，如上呼吸道感染症状、脑膜炎症状或肠胃不适症状的至少一种病毒病原体和至少一种非病毒病原体。该方法尤其可用于区分病毒感染与细菌或真核感染，还可用于鉴定具体的病原体物种、类型、族或株。

病毒病原体包括但不限于：A型和B型呼吸道合胞病毒(RSV)，A、B和C型流感病毒，1、2和3型人副流感病毒(hPIV)，人肺炎后病毒(hMPV)，巨细胞病毒，腺病毒(AV)，鼻病毒，冠状病毒，肠道病毒，疱疹病毒，肠道腺病毒，A、B和C族轮状病毒，星状病毒，札幌病毒，环状病毒，杯状病毒(包括诺罗病毒、诺沃克样病毒，和诺沃克病毒)，疱疹病毒，人体免疫缺陷病毒，水痘-带状疱疹病毒，脊髓灰质炎病毒，虫媒病毒，腮腺炎病毒，麻疹病毒，痘病毒，牛痘病毒，EB病毒，风疹病毒，汉他病毒，艾柯病毒，柯萨奇病毒和多粘病毒。非病毒病原体包括病原性细菌(包括支原体)和真核病原体(包括真菌和原生动物)。感兴趣的病原性或有潜在病原性的细菌包括但不限于：(1)可能与呼吸道感染相关的细菌，如不动杆菌(Acinetobacter)、绿色链球菌(viridans streptococci)、β-溶血性链球菌(包括A族β-溶血性链球菌如酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes))、非溶血性链球菌、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、葡萄球菌(staphylococci)(包括凝固酶阴性葡萄球菌和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))、球菌、棒状杆菌(Corynebacterium)(包括白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae))、奈瑟球菌(Neisseria)(包括脑膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)和淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae))、新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)、支原体(包括肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae))、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)(血清型和非血清型)、副流感嗜血杆菌(Haemophilusparainfluenzae)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumonia)、粘膜炎摩拉克菌(Moraxellacatarrhalis)(粘膜炎布兰汉菌(Branhamella catarrhalis))、肠杆菌、乳酸杆菌(Lactobacillus)、韦荣球菌(Veillonella)、分支杆菌(Mycobacterium)、假单胞菌(Pseudomonas)、克雷伯菌(Klebsiella)(包括臭鼻克雷伯菌(Klebsiella ozaenae)或肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae))、百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)、啮蚀艾肯菌(Eikenella corrodens)、拟杆菌(Bacteroides)、消化链球菌(Peptostreptococcus)、放线菌(Actinomyces)、诺卡菌(Nocardia)、螺旋原虫；(2)可能与消化道感染相关的细菌，如芽孢杆菌(Bacillus)(包括蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus))、金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、单核细胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes)、病原性大肠杆菌(Escherichia coli)、大肠杆菌O157:H7、沙门菌(Salmonella)、志贺杆菌(Shigella)、弧菌(Vibrio)、耶尔森菌(Yersinia)、气单胞菌(Aeromonas)、邻单胞菌(Pleisiomonas)和幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)；以及(3)与脑膜炎和其它中枢神经系统感染相关的细菌，如B族链球菌(包括酿脓链球菌)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、缓症链球菌(Streptococcus mitis)、非B族链球菌、肺炎链球菌、葡萄球菌(包括表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)和金黄色葡萄球菌)、单核细胞增生利斯特菌、肺炎克雷伯菌、粘质沙雷菌(Serratia marcescens)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、大肠杆菌、侵肺军团菌(Legionella pneumophilia)、棒状杆菌、嗜血杆菌(Haemophilus)(包括流感嗜血杆菌)、奈瑟球菌(包括脑膜炎奈瑟球菌和淋病奈瑟球菌)、腔隙莫拉菌(Moraxella lacunata)、假单胞菌(包括绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)和衣原体(Chlamydia)。感兴趣的真核病原体包括但不限于：荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、假丝酵母(Candida)、曲霉菌(Aspergillus)、毛霉菌(Mucor)、新型隐球菌、卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)和其它真菌病原体，以及兰氏贾第鞭毛虫、溶组织内阿米巴、福氏耐格里阿米巴、卡晏环孢子虫、冈地弓形体、微小隐孢子虫和其它隐孢子虫(Cryptosporidia)、多棘变形虫、微孢子虫和其它原生动物病原体(参见例如，Marshall等(1997)Clin.Microbiol.Rev.，10：67-85，将其全文纳入本文作为参考)。

该方法包括，对感兴趣病原体组的各成员，进行检测衍生自该病原体组成员的至少一个表位的至少一次测定。在该方法的一些实施方式中，可对衍生自该成员的一个以上表位进行测定，(例如)以更加肯定地确认存在或不存在该成员，或区分给定成员的不同株或不同类型。可对感兴趣的给定表位进行一次以上测定。至少一次测定中各测定如下进行：(1)与另一测定平行但互相独立，(2)在另一测定之前或之后连续进行，或(3)与另一测定同时进行。因此，如以下标题“II.同时检测病毒和非病毒病原体的测定和试剂盒”所述，可用测定感兴趣的所有表位的一个测试装置或多个测试装置组成的试剂盒来实施本发明方法，其中所述一个或多个测试装置各自可使用一条或多条流体流径。

本文所用术语“表位”通常包括可被结合剂特异性识别并结合的分子或多分子结构或位点，这种结合通常涉及非共价相互作用。这种结合剂通常非共价结合于表位的例子包括但不限于：抗体或抗体样分子与抗原的结合，T细胞受体与抗原的结合，受体与配体的结合，适体与肽或其它靶的结合，酶与辅因子或酶底物的结合，以及抗生物素蛋白与生物素的结合。表位可代表大得多的抗原或分析靶；例如，由小肽组成的表位可代表大蛋白或蛋白质性质的复合物，或由多糖组成的表位可代表完整的细胞。不直接接触结合剂的分子结构部分可影响表位与结合剂的结合。结合剂与表位的结合还可包括共价键结合，例如，在结合剂和表位之间形成二硫键或其它共价键。衍生自所述成员的至少一个表位可以是任何合适表位，包括但不限于：肽、多肽、蛋白质、糖蛋白、糖(carbohydrates)、脂质、糖脂、脂蛋白、核酸、抗原、酶、受体、细胞壁组分、该成员的全细胞或完整病毒粒子、该成员的片段、该成员产生或分泌的物质(如初级代谢物、次级代谢物、毒素、酶和外聚物(exopolymer))及其组合。表位可包括完整分子或分子的一部分，或可包括一个以上分子的全部或一部分。

可通过(例如)物理或化学修饰任选地修饰所述至少一个表位。所述至少一个表位的修饰可包括任何合适的修饰，包括但不限于：用化学试剂或酶处理，氧化或还原，用可检测或可结合或可读标记进行标记，或将该表位共价或非共价连接于单独部分、分子、分子结构、表面或其组合。所述至少一个表位的修饰的非限制性实施例包括将化学反应性官能团加在该表位上、去除该表位的一部分(例如通过去糖基化、或者还原或酶切割共价键)和引入可结合部分(例如用可结合生物素或其它配体标记该表位)。在一些实施方式中，所述至少一个表位可能天然游离在溶液或悬液中，或(例如)通过合适的化学试剂处理、酶处理或物理处理后游离在溶液或悬液中。在其它实施方式中，所述至少一个表位可能天然连接于一分子结构、分子复合物、膜、细胞组分、全细胞或病毒粒子，多孔性或固体基材，或其组合，或通过共价或非共价方法或其组合连接于上述结构。

用于检测衍生自病原体组成员的至少一个表位的至少一个测定各自包括提供能够特异性结合所述衍生自该成员的至少一个表位的至少一种结合剂的步骤。事实上，结合剂可以是能够识别和结合所述至少一个表位的任何分子或分子组合。这种结合剂可包括但不限于：肽、多肽、抗体、抗体片段、融合蛋白、嵌合或杂交分子，核酸、核酸模拟物(如肽核酸)、糖、细胞表面抗原、受体、配体或其组合。

在一个优选实施方式中，所述至少一种结合剂包括抗体(单克隆或多克隆、天然、修饰或重组抗体)或抗体片段(如Fab片段或单链抗体可变区片段)。抗体可以是天然、修饰或重组抗体。抗体片段包括但不限于：F(ab′)2片段、Fab′片段、Fab片段、Fv片段和互补决定区(CDR)。重组抗体包括但不限于：单链抗体可变区片段(scFv)，小抗体(Muller等(1998)FEBS Lett.，432：45-49)，抗体融合蛋白等(参见例如“抗体工程改造”(Antibody Engineering)，R.Kontermann和S.Dübel编，Springer-Verlag，BerlinHeidelberg，790页)。抗体可以是一价或多价，如二价(Plückthun和Pack(1997)Immunotechnology，3：83-105；Pack等(1995)J.MoI.Biol，246：28-34)。抗体可以是单特异性或多特异性，如双特异性抗体(Miller等(1998)FEBS Lett.，432：45-49)。本领域已知制备、修饰和使用这些抗体或抗体片段的方法(参见例如，“抗体：实验室手册”(Antibodies：A Laboratory Manual)，E.Harlow和D.Lane编，Cold Spring HarborLaboratory，1988，726页；“单克隆抗体：实践方法”(Monoclonal Antibodies：A PracticalApproach)，P.Shepherd和C.Dean编，Oxford University Press，2000，479页；和“鸡蛋黄抗体：生产和应用：IgY-技术(斯普林格实验室手册)”(Chicken Egg YolkAntibodies，Production and Application：IgY-Technology(Springer Lab Manual))，R.Schade等编，Springer-Verlag，2001，255页)。本段引用的所有参考文献全文纳入本文作为参考。

所述至少一种结合剂可包括抗原，如能够特异性结合识别衍生自该病原体组成员的表位的抗体的抗原。在其它实施方式中，所述结合剂可包括结合靶如肽或小分子的核酸或核酸模拟物适体，或结合配体的受体，或结合受体的配体。所述结合剂可能结合模拟表位(mimotope)，例如肽，所述模拟表位模拟衍生自该病原体组成员的表位(参见例如，Kieber-Emmons(1998)Immunol.Res.，17：95-108；Shin等(2001)Infect.Immun.，69：3335-3342；Beenhouwer等(2002)J.Immunol，169：6992-6999；Hou和Gu(2003)J.Immunol.，170：4373-4379；和Tang等(2003)Clin.Diagn.Lab.Immunol，10：1078-1084，将其全文纳入本文作为参考)。

当通过物理或化学方法任选地修饰所述至少一个表位时，所述至少一种结合剂能够特异性结合修饰的至少一个表位。在一个实施方式中，该结合剂可特异性结合于所述至少一个表位的修饰，如所述至少一个表位上的可结合部分。在另一实施方式中，该结合剂可通过共价相互作用结合于该表位，然后通过共价相互作用连接于该表位。

所述至少一种结合剂可任选地包括官能团(如化学反应性部分或交联部分)或可检测标记。可检测标记包括但不限于：荧光团、发光团、染料、颜料、能量共振转移对成员、可检测核(包括放射性同位素和非放射性同位素)、自旋标记物、镧系元素、磁性标记、可检测核酸、金属、颗粒(例如但不限于：由金或其它金属、磁性或顺磁性物质、玻璃、硅酸盐、陶瓷、胶乳、聚合物或复合材料制成的珠、纤维或颗粒)、酶、抗原可识别结构(如地高辛或地高辛配基)和可结合部分(如受体、配体、聚组氨酸标签、生物素或抗生物素蛋白)。引入这些官能团或可检测标记的方法是本领域已知的(参见例如，R.P.Haugland，《荧光探针和研究产物手册》(Handbook of FluorescentProbes and Research Products)，第9版，J.Gregory(编)，Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR，USA，2002，966页；Seitz和Kohler(2001)，Chemistry，7：3911-3925；Pierce技术手册，Pierce Biotechnology，Inc.，1994，Rockford，IL；和Pierce 2003-2004《应用手册和目录》(Applications Handbook and Catalog)，Pierce Biotechnology，Inc.，2003，Rockford，IL，将其全文纳入本文作为参考)。

所述至少一种结合剂可以游离在溶液中，或可暂时或永久地、直接或间接地连接在单独部分、分子、分子结构或表面上。在直接固定的一个非限制性实施例中，所述至少一种结合剂可通过干燥或瞬时结合在表面上或基质中而暂时固定，其中加入流体可使结合剂变得流动。暂时固定可包括采用共价或非共价手段。在一个实施方式中，可采用可通过(例如)还原或酶反应或其它物理或化学处理而切割的共价键暂时固定结合剂。在另一实施方式中，可通过非共价方式暂时固定结合剂，非共价方式包括但不限于：特异性相互作用(如结合剂与识别和结合该结合剂的分子之间的相互作用)、物理吸附、亲水或疏水相互作用、磁力、离子相互作用、静电相互作用、范德华力及其组合。在直接固定的另一非限制性实施例中，可通过共价或非共价连接将该结合剂永久地固定于多孔性或非多孔性表面上，如固定在珠、纤维、颗粒、基质、膜、微量培养板孔、管、芯片或玻片上。在间接固定的非限制性实施例中，可通过共价或非共价方法(如被动吸附或抗生物素蛋白/生物素结合)将所述至少一种结合剂连接于颗粒(如胶乳、金或其它金属、或磁性或顺磁性材料的珠或纤维或颗粒)，将带有结合剂的颗粒暂时或永久地固定在表面上或基质中。在间接固定的另一个非限制性实施例中，可用连接部分如交联分子或多价分子(如抗生物素蛋白)将所述至少一种结合剂连接于单独部分、分子、分子结构、基质或表面。

在一个实施方式中，所述至少一种结合剂以单价结合于感兴趣的表位。在另一实施方式中，该结合剂以多价如二价、和任选多特异性地结合于感兴趣的表位(或模拟表位)，并可结合多表位(任选地多结合剂)复合物中的一个以上表位。在一些实施方式中，该结合剂的一个单位可结合于感兴趣表位的一个单位，在其它实施方式中，结合剂的一个以上单位可结合于感兴趣表位的一个单位并形成多结合剂(任选地多表位)复合物。

可以一种以上形式或类型施用所述至少一种结合剂，例如，该结合剂是抗体或抗体片段，并用于包括用于固定表位的未标记结合剂和结合相同表位的可检测标记的结合剂的夹心测定。在采用这种夹心测定的本发明方法中，可采用任何合适的结合步骤顺序。因此，在一个非限制性实施例中，可用第一种形式的结合剂捕获并固定该表位，然后用结合于固定表位的第二种形式的结合剂形成可检测复合物。在另一非限制性实施例中，第一种形式的结合剂结合该表位，形成可检测复合物，然后用第二种形式的结合剂捕获以固定该复合物。

可用本领域已知方法提高所述至少一种结合剂特异性结合衍生自病原体组成员的表位的能力，例如，通过根据淘选法选择肽序列(参见例如，Coomber(2001)MethodsMoI Biol，178：133-145；Zhou等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，99：5241-5246；Fehrsen和du Plessis(1999)Immunotechnology，4：175-184；Deng等(1994)J.Biol.Chem.，269：9533-9538；Burioni等(1998)Res.Virol.，149：327-330；Boel等(1998)Infect.Immun.，66：83-88；和Parsons等(1996)Protein Eng.，9：1043-1049，将其全文纳入本文作为参考)。

提高所述至少一种结合剂结合衍生自病原体组成员的表位(或模拟该表位的模拟表位)的能力可采用本领域已知的展示法(display method)，包括展示在多肽上(Kamb等，美国专利6,025,485；Christmann等，1999，Protein Eng.，12：797；Abedi等，1998，Nucleic Acids Res.，26：623；Peelle等，2001，J.Protein Chem.，20：507)、噬菌体上(He，1999，J.Immunol Methods，231：105；Smith，1985，Science，228：1315)、核糖体上(Schaffitzel等，1999，J.Immunol Methods，231：119；Roberts，1999，Cum Opin.Chem.Biol，3：268)、mRNA上(Wilson等，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.，98：3750)或酵母细胞表面上(Yeung和Wittrup，2002，Biotechnol Prog.，18：212；Shusta等，1999，J.Mol.Biol，292：949)、细菌细胞表面上(Leenhouts等，1999，Antonie Van Leeuwenhoek，76：367；Christmann等，2001，J.Immunol.Methods，257：163)，或细菌孢子表面上(Wittrup，2001，Curr.Opin.Biotechnol，12：395；Boder和Wittrup，1998，Biotechnol.Prog.，14：55)。将本段引用的所有参考文献全文纳入本文作为参考。

检测衍生自病原体组成员的至少一个表位的至少一个测定还各自包括将至少一种结合剂直接接触样品的步骤。使该结合剂直接接触该样品，该样品是先前最小规模或较大规模制备的，但未进行培养或扩增病原体组成员的核酸。

检测衍生自病原体组成员的至少一个表位的至少一个测定还各自包括使提供的至少一种结合剂特异性结合于表位并与其形成复合物的步骤。至少一种结合剂与表位的结合可以是任何合适方式，包括但不限于：共价结合、非共价结合、抗体-抗原识别、受体-配体结合、适体-核酸结合、物理吸附、静电力、离子相互作用、氢键、亲水-疏水相互作用、范德华力、磁力及其组合。当采用一种以上结合剂时(例如，在夹心测定中采用结合相同表位、或结合衍生自感兴趣的相同病原体的不同表位的两种抗体或其它结合剂)，多结合剂可通过一种以上方式结合于该表位。结合剂优选结合于该表位，其特异性足以使结合剂和衍生自感兴趣成员之外的来源(如不感兴趣的人对象的细胞或组织、或其它感染或非感染物种或株系)的表位之间非特异性或交叉反应结合很小或无非特异性或交叉反应结合。结合剂与表位的特异性结合优选产生足够稳定的复合物，以进行检测。

当修饰所述至少一个表位时，所述至少一个表位的修饰可发生在：(1)任何时间或至少一种结合剂接触样品之前、期间或之后的时间，(2)任何时间或至少一种结合剂特异性结合于表位并与其形成复合物之前、期间或之后的时间，(3)任何时间或检测到该复合物之前、期间或之后的时间，或(4).(1)、(2)和(3)的任何组合。可以一种以上的方式修饰所述至少一个表位一次以上。在非限制性实施例中，在至少一种结合剂(如(例如)通过用可检测标记进行标记或通过永久或暂时、共价或非共价地连接于多孔性或非多孔性表面任选修饰的抗体或抗体片段)接触样品并特异性结合于该表位并与其形成复合物之前，通过共价或非共价连接将所述至少一个表位连接在多孔性或固体基材上(如纤维性支持物、硝酸纤维素膜、硅质表面、磁性珠等)。在另一非限制性实施例中，在至少一个表位结合于至少一种结合剂和与其复合之后修饰所述至少一个表位(例如，通过引入化学反应性部分或可检测标记)。在另一非限制性实施例中，通过引入可结合部分修饰所述至少一个表位，然后所述表位结合于至少一种结合剂并与其复合，然后再通过共价或非共价连接于多孔性或固体支持物进行修饰(例如通过引入可结合部分的方式)。

检测衍生自病原体组成员的至少一个表位的至少一个测定还各自包括检测复合物的步骤，如果样品中该成员的浓度大于或等于参比浓度，该检测为阳性，如果该成员的浓度小于参比浓度，该检测为阴性。

复合物的检测可以是直接检测，如检测至少一种结合剂上的标记。或者，复合物的检测可以是通过任何合适方法的间接检测，包括但不限于：采用第二种结合剂，如带有可检测标记的第二抗体，或如可检测标记的抗生物素蛋白部分，其中该复合物包括可结合生物素。有用的可检测标记包括但不限于：荧光团、发光团、染料、颜料、能量共振转移对成员、可检测核、自旋标记物、镧系元素、磁性标记、可检测核酸、金属、颗粒(例如但不限于：由金或其它金属、磁性或顺磁性物质、玻璃、硅酸盐、陶瓷、胶乳、聚合物或复合材料制成的珠、纤维或颗粒)、酶、酶反应产物、抗原可识别结构和可结合部分(如抗生物素蛋白、生物素、抗原、抗体等、配体和受体)。

在一些实施方式中，可利用仪器检测复合物。可适合用于本发明方法的仪器包括但不限于：分光光度仪(如能够进行紫外线、可见光、红外线、拉曼射线、发光、荧光和磷光检测的仪器)、电化学检测(如库仑法、伏安法、电势法和特定离子检测)的仪器、比重测定仪、质谱仪、电泳装置、层析装置、表面等离子体激元共振检测器、磁共振检测器、照相机或显微镜(光学、电子、原子力显微镜)、电荷耦合器件、热分析仪及其组合。一些实施方式也可采用计算机化方法检测或放大复合物的检测，例如用计算机随时间积分信号、在已知数据点之间插值、或提高信噪比。在其它实施方式中，可以不用仪器检测复合物，例如，通过简单的裸眼目测(不用放大)、物理放大目测信号、或计算机放大数字化信号检测。优选不需要昂贵或复杂装置的实施方式，因为它们简单且在临床上容易使用，尤其是在采用需要特殊技术训练的实施方式不实际或不经济时。

如果样品中该病原体组成员的浓度大于或等于参比浓度，该复合物的检测为阳性。相反，如果样品中该病原体组成员的浓度小于参比浓度，该复合物的检测为阴性。为给定病原体组成员选择的参比浓度取决于几项因素，包括但不限于：结合剂和衍生自该成员的表位的特性、样品类型以及当样品来自对象时对象的类型(例如成人或儿童)。参比浓度可以是任何合适浓度，可用常规测试建立参比浓度。检测可以是线性(如分光光度计测量酶反应形成的产物)或非线性(如目测金标记)。任选地，检测至少是半定量检测，例如，能够判断大于或等于、或小于参比值。任选地，检测可以是定量检测，其中阳性检测信号可以与病原体组成员的浓度范围相关。

在本发明的一个实施方式中，样品来自怀疑被病原体组的至少一个成员致病的对象。对象可以是人或兽类。在一些情况下，对象可以是病原体组成员的无症状“携带者”，就是说，该对象是健康的但通常感染了相对较低浓度的该成员，而相对较高浓度的该成员与该病原体引起的疾病症状相关。在这种情况下，理想的参比浓度是这样一个浓度，即在该浓度以下，来自未感染所述成员、或感染了所述成员但仍健康的对象的样品产生阴性检测结果。相同的参比浓度优选为在该浓度时或该浓度以上来自被该成员感染并致病的对象的样品产生阳性检测结果的浓度。

因此，在本发明的一个实施方式中，阳性检测结果说明该对象至少感染了该病原体组成员，或被该病原体感染并致病。在本发明的另一实施方式中，阴性检测结果优选说明该对象没有被病原体组成员感染到与该病原体引起的疾病相关的水平。

在本发明的又一实施方式中，样品来自怀疑被病原体组的至少一个成员致病的对象，其中非常低浓度的所述至少一个成员足以说明该对象可能被所述至少一个成员致病。在这样的实施方式中，所述至少一个成员的参比浓度可能非常低，任选接近或等于零。

理想的参比浓度产生的阳性预测值(即阳性检测结果的对象被该病原体组成员致病的概率)优选至少约80％，更优选至少约90％，最优选至少约95％。所需参比浓度产生的阴性预测值(即阴性检测结果的对象不被该病原体组成员致病的概率)优选至少约80％，更优选至少约90％，最优选至少约95％。

II.同时检测病毒和非病毒病原体的测定和试剂盒

可通过合适的测定方法进行本发明方法。进行该方法的合适测定的非限制性实施例包括测验片(dipstick)或测试条(test strip)测定、流通(flow-through)测定、层析测定、亲和分离测定、侧向流测定、胶乳凝集测定、放射性免疫测定、酶联免疫吸附测定、荧光测定、发光测定、点印迹测定及其组合。可以任何合适形式进行测定，合适形式包括但不限于：测试条、测验片、膜、滤器、微量滴定板、管、芯片、玻片和流通室。该测定优选快速，最优选足够快以在相对短的时间内，如在对象向医生或其它卫生保健提供者咨询期间产生结果。

可设计试剂盒，以便于根据所用测定进行该方法。除用于进行该测定的工具外，试剂盒可包括收集和适当地处理样品的工具(如合适的收集容器、药签、吸干样品的工具、样品的活检工具、洗涤溶液或缓冲液、化学或酶试剂、滤器、离心管等)。在一些实施方式中，收集和适当处理样品的工具可包括一种以上用于收集的工具和一种以上样品处理方法。更优选地，一种收集工具和一种样品处理方法就足以进行该方法。试剂盒可包括帮助安全地处理可能有害的样品的材料(如手套和其它个人安全装备、生物危害性废弃物容器或净化材料)。试剂盒可包括该试剂盒的使用说明书，如手册、传单、小册子、目录单或音像资料形式的说明书。

本发明试剂盒的非限制性实施例如下：

1.流感和流感样疾病的试剂盒(参见例如，Centers for Disease Control(2001)Morbidity Mortality Weekly Report，50(44)：984-986，将其全文纳入本文作为参考)，经设计用于检测包括至少一种病毒病原体(例如但不限于：流感病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒、冠状病毒和肺炎后病毒)和至少一种非病毒病原体(例如但不限于：肺炎链球菌、肺炎衣原体和肺炎支原体)的病原体组的一个或多个成员。合适的分析样品包括但不限于：鼻咽、口咽或食道的擦拭物、洗液或排出物等，以及血液、尿、痰或唾液，及其提取物或衍生物。

2.肺炎试剂盒，经设计用于检测包括至少一种病毒病原体(例如但不限于：流感病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒、冠状病毒、汉他病毒、巨细胞病毒和肺炎后病毒)和至少一种非病毒病原体(例如但不限于：A族链球菌、酿脓链球菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、葡萄球菌、流感嗜血杆菌、肺炎衣原体、肺炎支原体、假单胞菌、荚膜组织胞浆菌、粗球孢子菌、皮炎芽生菌、巴西副球孢子菌、假丝酵母、曲霉菌、毛霉菌、新型隐球菌和卡氏肺囊虫)的病原体组的一个或多个成员。合适的分析样品包括但不限于：鼻咽、口咽或食道的擦拭物、洗液或排出物等，以及血液、尿、痰或唾液，及其提取物或衍生物。

3.支气管炎试剂盒，经设计用于检测包括至少一种病毒病原体(例如但不限于：流感病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒、冠状病毒、汉他病毒、巨细胞病毒和肺炎后病毒)和至少一种非病毒病原体(例如但不限于：支原体如肺炎支原体、肺炎衣原体、百日咳博德特菌、A族链球菌、酿脓链球菌、粘膜炎摩拉克菌、流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌和金黄色葡萄球菌)的病原体组的一个或多个成员。合适的分析样品包括但不限于：鼻咽、口咽或食道的擦拭物、洗液或排出物等，以及血液、尿、痰或唾液，及其提取物或衍生物。

4.鼻窦炎试剂盒，经设计用于检测包括至少一种病毒病原体(例如但不限于：流感病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒、冠状病毒、汉他病毒、巨细胞病毒，和肺炎后病毒)和至少一种非病毒病原体(例如但不限于：链球菌如肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、葡萄球菌如金黄色葡萄球菌和奈瑟球菌、或真菌病原体)的病原体组的一个或多个成员。合适的分析样品包括但不限于：鼻咽、口咽或食道的擦拭物、洗液或排出物等，窦吸出物或活检样品，血液、尿、痰或唾液，及其提取物或衍生物。

5.急性中耳炎试剂盒(参见例如，Jones和Wilson(2002)，“中耳炎”(Otitis Media)，在线文章：http://www.emedicine.coin/pecl/topic1689.htm，2004年1月21日登录)，经设计用于检测包括至少一种病毒病原体(例如但不限于：流感病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒、冠状病毒和肺炎后病毒)和至少一种非病毒病原体(例如但不限于：非典型性流感嗜血杆菌和粘膜炎摩拉克菌、肺炎链球菌)的病原体组的一个或多个成员。合适的分析样品包括但不限于：鼻咽、口咽或食道的擦拭物、洗液或排出物等，中耳液、流出物、吸出物或活检样品，血液、尿、痰或唾液，及其提取物或衍生物。

6.结膜炎试剂盒(参见例如，Scott和Luu(2001)，“病毒性结膜炎”(ViralConjunctivitis)，在线文章：www.emedicine.com/oph/topic84.htm，2004年1月22日登录；和Marlin(2003)，“细菌性结膜炎”(Bacterial Conjunctivitis)，在线文章：www.emedicine.com/OPH/topic88.htm，2004年1月22日登录)，经设计用于检测包括至少一种病毒病原体(例如但不限于：腺病毒、疱疹病毒、如单纯疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、肠道病毒、柯萨奇病毒、传染性软疣痘病毒、牛痘痘病毒、流感病毒、EB病毒、副粘病毒和风疹病毒)和至少一种非病毒病原体(例如但不限于：A族链球菌、酿脓链球菌、缓症链球菌(Streptococcus mitis)、肺炎链球菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、棒状杆菌、嗜血杆菌、流感嗜血杆菌、奈瑟球菌如脑膜炎奈瑟球菌和淋病奈瑟球菌、腔隙莫拉菌(Moraxella lacunata)、假单胞菌如绿脓假单胞菌、和衣原体)的病原体组的一个或多个成员。合适的分析样品包括但不限于：鼻咽、口咽或食道的擦拭物、洗液或排出物等，以及血液、尿、痰、眼泪、眼排出物或唾液，及其提取物或衍生物。

7.中枢神经系统感染如脑膜炎试剂盒(参见例如，Incesu和Khosla(2003)，“细菌性脑膜炎”(Bacterial Meningitis)，在线文章：www.emedicine.com/radio/topic441.htm，2004年1月22日登录；Vokshoor和Moore(2004)，“病毒性脑膜炎”(Viral Meningitis)，在线文章：www.emedicine.com/neuro/topic607.htm，2004年1月22日登录)，经设计用于检测包括至少一种病毒病原体(例如但不限于：疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、肠道病毒、脊髓灰质炎病毒、虫媒病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、艾柯病毒、柯萨奇病毒、人体免疫缺陷病毒和腺病毒)和至少一种非病毒病原体(例如但不限于：b型流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟球菌、B族链球菌、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、酿脓链球菌、非B族链球菌、葡萄球菌、单核细胞增生利斯特菌(Listeriamonocytogenes)、肺炎克雷伯菌、粘质沙雷菌、绿脓假单胞菌、屎肠球菌、粪肠球菌、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、大肠杆菌、结核分支杆菌、侵肺军团菌(Legionellapneumophilia)、布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi))的病原体组的一个或多个成员。合适的分析样品包括但不限于：鼻咽、口咽或食道的擦拭物、洗液或排出物等，以及血液、尿、脑脊液、眼泪、痰或唾液，及其提取物或衍生物。

8.肠胃炎试剂盒(参见例如，Goodgame(2003)“病毒性肠胃炎”(ViralGastroenteritis)，在线文章：www.emedicine.com/med/topic856.htm，2004年1月22日登录；Frye等(2002)“细菌性肠胃炎”(Bacterial Gastroenteritis)，在线文章：www.emedicine.com/MED/topic855.htm，2004年1月22日登录)，经设计用于检测包括至少一种病毒病原体(例如但不限于：轮状病毒，杯状病毒如诺罗病毒、诺沃克样病毒、诺沃克病毒和札幌病毒，星状病毒，和腺病毒)和至少一种非病毒病原体(例如但不限于：大肠杆菌、大肠杆菌O157:H7、芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、志贺菌、沙门菌、弯曲杆菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、弧菌、单核细胞增生利斯特菌、气单胞菌、耶尔森菌(Yersinia)、邻单胞菌、兰氏贾第鞭毛虫、溶组织内阿米巴、冈地弓形体和隐孢子虫)的病原体组的一个或多个成员。合适的分析样品包括但不限于：鼻咽、口咽、食道、胃或直肠的擦拭物、洗液或排出物等，以及血液、尿、痰、唾液、粪，及其提取物或衍生物。

实施例

实施例1：制备测试条

本实施例描述了用于确定样品中存在或不存在包括至少一种病毒病原体和至少一种非病毒病原体的病原体组中一个或多个成员的装置中所用测试条的制备。

测试条包括偶联垫，例如但不限于：由玻璃纤维材料或无纺聚酯制成的垫(例如，Hollingworth & Vose 7304，Web Converting，Holliston，MA，USA)，位于传导垫之间，例如但不限于：由纤维素纸(如Ahlstrom 1281纸，90％纤维素纤维、10％人造纤维以及痕量聚丙烯酰胺，Web Converting，Holliston，MA，USA)制成的指导液体流动的传导垫。偶联垫含有通过干燥暂时固定在偶联垫上的结合剂(如可检测标记的抗体)。测试条也包括含有多个测试线读出区的硝酸纤维素膜(如Millipore STHF硝酸纤维素，目录号SA3J727H5，Millipore，Inc.，Bedford，MA，USA)或其它合适的膜(例如但不限于：由尼龙或聚乙烯砜制成的膜)。多个测试线读出区包括该装置可检测的各病原体的测试线。各测试线含有对特定病原体特异的抗体，通过吸附永久地固定在条带中。测试条也包括用作液体储存库并促进样品以毛细管作用流过偶联垫、然后流过硝酸纤维素膜的吸收垫。在此实施方式中，在单一液流流径中沿该流径免疫层析分析感兴趣的病原体，其中液体流过各测试线。本装置的另一实施方式可设计为用离散的液流流径(各自含有一条或多条测试线等)进行上述单个病原体的免疫层析分析的装置，例如但不限于：在多条离散的测试条中，或在用分开多股液流流径的任何合适方法(例如用防止水性液体流过处理区域的疏水性试剂处理)划分液流的测试条中。

根据感兴趣的抗原或病原体选择合适的抗体。用本领域熟知的方法按需进行亲和纯化(参见例如，P.Tijssen，“酶学免疫测定的实践和理论”(Practice and theory ofenzyme immunoassays)，173-189页，《生物化学和分子生物学实验室技术》(Laboratorytechniques in biochemistry and molecular biology)，R.Burden和P.VanKnippenberg(编)，Elsevier，Amsterdam，The Netherlands，1985；《抗体：实验室手册》(Antibodies：ALaboratory Manual)，E.Harlow和D.Lane编，Cold Spring Harbor Laboratory，1988，726页；“单克隆抗体：实践方法”(Monoclonal Antibodies：A Practical Approach)，P.Shepherd和C.Dean编，Oxford University Press，2000，479页；“鸡蛋黄抗体，生产和应用：Ig-Y技术”(Chicken Egg Yolk Antibidy，Production and Application：IgY-Technology)(Springer Lab Manual)＂，R.Schade等编，Springer-Verlag，2001，255页，将其全文纳入本文作为参考)。

将金颗粒偶联于所选抗体。可采用任何偶联方法，偶联方法的非限制性实施例见DeMay，“金探针的制备和使用”(The Preparation and Use of Gold Probes)(《免疫细胞化学：现代方法和应用》(Immunocytochemistry：Modern Methods andApplications)，第二版，J.M.Polak和S.VanNoorden(编)，Wright，Bristol，England，1986，703页)。在其它实施方式中，可采用除金之外的可检测标记(例如但不限于：可见染料、颜料、磁性颗粒或其它粒子、酶、放射性同位素、自旋标记或核酸)。将标记的抗体与干燥剂(5毫摩尔硼砂水溶液，pH8.0，含有1.0％牛血清白蛋白，0.1％Triton X-100，2.0％吐温20，6.0％蔗糖和0.02％叠氮化钠)混合，暂时固定在合适的惰性吸附材料(称为“偶联垫”)上，如能保持干燥的标记抗体并在湿润时能释放它们的无纺聚酯垫上。充分加热偶联垫(例如加热到60摄氏度20分钟)以基本上去除所有液体，让标记抗体暂时固定在偶联垫上。

通过在多条测试线读出区的区域内将合适的捕获抗体固定在单个条带上(称为“捕获线”或“测试线”)来制备硝酸纤维素膜。将溶于盐水溶液(0.01摩尔磷酸盐缓冲盐水、pH7.4、1％蔗糖和0.02％内白(intrawhite)染料、0.05％叠氮化钠)的捕获抗体施加在条带上。充分加热硝酸纤维素(例如，加热到50摄氏度2分钟)以基本上去除所有液体，让捕获抗体固定在硝酸纤维素膜上，然后优选以干燥形式储存在约15-30摄氏度，促使该抗体永久吸附于硝酸纤维素。

用作液体储存库并促进毛细流动的吸收垫可由任何合适材料制成。合适材料的非限制性实施例是市售纤维素材料如Ahlstrom 939(Ahlstrom，Mount Holly Spring，PA，USA)。

将传导垫、偶联垫、硝酸纤维素膜和吸收垫装配在一起形成测试条，其装配方式应允许液体流动，如在粘性条上装配。这样装配的测试条还可整合到检测装置中，如实施例2所述。

实施例2：免疫层析测定

本实施例描述了确定样品中存在或不存在包括至少一种病毒病原体和至少一种非病毒病原体的病原体组中一个或多个成员的方法的非限制性实施方式。

在本实施例中，免疫层析测定利用本发明方法检测存在或不存在病毒病原体(A型流感病毒)和两种非病毒病原体(病原性细菌肺炎链球菌和肺炎军团菌(Legionellapneumoniae))。需要这样的测定来(例如)确定怀疑有肺炎的对象是否由这些病原体致病，并确立合适的治疗(如用或不用抗生素)。可设计类似测定以检测存在或不存在另外的或不同的病原体。在一个非限制性实施例中，可设计脑膜炎测定以检测脑脊液或鼻咽样品中存在或不存在肠道病毒和非病毒病原体肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟球菌和流感嗜血杆菌。在另一非限制性实施例中，可设计肠胃炎测定以检测粪便样品中存在或不存在肠道病毒和杯状病毒以及非病毒病原体弯曲杆菌、沙门菌、志贺菌、大肠杆菌和兰氏贾第鞭毛虫。

用侧向流、免疫层析装置(如1999年3月2日批准授予Chandler等的美国专利号5,877,028，“免疫层析测定装置”(Immunochromatographic assay device)，和美国专利申请号09/156,486和09/518,165所述)进行该测定，将其全文纳入本文作为参考。该装置包含铰链连接的硬纸板外壳，外壳上装有窗以便观察多个测试线结果(图1)。

该装置的一侧有凹陷，含有预成型的塑料孔(1)以接受抽汲样品。装有两个开口的覆盖标签(overlabel)(2)位于该装置这一侧，开口位于位于孔(1)上以通过底部开口(A)插入药签，从而在向前推药签时，其顶端通过顶部开口(B)暴露出来。覆盖标签、其开口以及孔的位置安排一起在测定期间将药签保持在所需位置中并促进从药签中排出样品液体。

在有孔(1)一侧的对侧，将预先装配的测试条(3)(制备方法如实施例1中所述)粘附在装置关闭时可以通过窗(4)观察多个测试线读出区的位置上；任选地，该装置包括保持装置关闭的方式，如稍有粘性的衬板(5)。预先装配的测试条(3)包括位于定向液流的导电垫(7)之间的偶联垫(6)。参见图1。偶联垫含有通过干燥暂时固定在偶联垫上的结合剂。在这个非限制性实施例中，结合剂包括偶联于可检测标记(金颗粒)的小鼠抗-流感A单克隆抗体和亲和纯化的兔抗-肺炎军团菌多克隆抗体和兔抗-肺炎链球菌多克隆抗体。测试条也包括含有多个测试线读出区的硝酸纤维素膜(8)和吸收垫(9)。多个测试线读出区包括可被该装置检测的各病原体的测试线。各测试线含有通过吸附在条带中而固定的对特定病原体特异的抗体(亲和纯化的小鼠抗流感A、兔抗肺炎军团菌和兔抗肺炎链球菌抗体)。

用装配的铰接装置进行该测定。将纤维性达可纶药签从开口A插入孔(1)，导致药签顶端通过开口B暴露出来。用移液器将液体样品(100微升)吸入开口A湿润药签。将3滴“试剂A”(0.05摩尔柠檬酸盐，0.25摩尔磷酸盐，pH7.0，含有1.4％吐温20，0.5％十二烷基硫酸钠和0.05％叠氮化钠)通过开口A加入抽汲样品中。关闭铰接装置，任选地用粘性条保持装置关闭。当装置关闭时，样品液体接触底部测试条(3)的传导垫，启动测定液流。然后，样品液体接触偶联垫并溶解金标记的抗体，使它们转移到硝酸纤维素膜上，过量液体流动到吸收垫中。样品中存在的抗原与金标记的抗体结合形成复合物，该复合物与固定在测试线中的抗体结合。在形成足量复合物时就能观察到目测信号(粉红至紫色的线)。足够时间(如15分钟)后，通过该装置的窗观察多个测试线读出区，结果见表1。

表1

实施例3：免疫层析测定

本实施例描述了确定样品中存在或不存在包括至少一种病毒病原体和至少一种非病毒病原体的病原体组中一个或多个成员的方法的非限制性实施方式。具体说，本实施例描述了同时测定样品中存在或不存在能够在人对象中引起相似疾病症状的病毒和细菌的方法的非限制性实施方式。

构建了与(例如)美国专利号5,877,028、美国专利申请号09/156,486和美国专利申请号09/518,16，和美国专利申请号09/397,110所述装置类似的侧向流装置，以确定样品中存在或不存在A型流感病毒、B型流感病毒和肺炎链球菌。将亲和纯化的肺炎链球菌特异性多克隆抗体以及分别对A型流感病毒和B型流感病毒特异的两种单克隆抗体固定在硝酸纤维素上单独的捕获线中。通过将胶体金颗粒与合适抗体共价偶联，然后将标记的抗体暂时固定在偶联垫上来制备对此病原体组各成员特异的金标记亲和纯化抗体，如上面的实施例1所述。

样品可由鼻腔、口腔、口咽或鼻咽的擦拭物、吸出物、洗液、灌洗液或排出物组成。在另一实施方式中，其它材料(包括但不限于：尿、血液、血清、血浆、痰、活检组织、细胞提取物、环境样品，及其衍生物)也可用作合适样品。

在一个特定实施方式中，可能涉及至少一个组成员的感染的感兴趣病症是急性中耳炎，所述组由以下病原体组成：A型流感病毒、B型流感病毒和肺炎链球菌。急性中耳炎可由病毒病原体(包括呼吸道合胞病毒、流感病毒、副流感病毒、鼻病毒和腺病毒)或细菌病原体(包括肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌和粘膜炎摩拉克菌、A族链球菌、酿脓链球菌、绿脓假单胞菌)引起。中耳炎常常伴有呼吸道病毒感染，一些中耳炎病例可能涉及连续或同时的病毒和细菌感染(参见例如，Ruuskanen等(1989)Pediatr.Infect.Dis.J.，8：94；Andrade等(1998)Pediatrics，101：617；和Jones和Wilson(2002)，“中耳炎”(Otitis Media)，在线文章：http://www.emedicine.com/ped/topic1689.htm，2004年1月21日登录，将其全文纳入本文作为参考)。

用类似于实施例1和2所述的一个或多个测试条进行不同病原体的测定。在一个实施方式中，在单独测试条上测定各病原体。在另一实施方式中，在一个测试条上测定一种以上病原体。在各种实施方式中，例如，可以在一个测试条上测定A型流感病毒和B型流感病毒，在第二个测试条上测定肺炎链球菌，或可在单独测试条上测定各病原体，或可用一个测试条用单一流径或一条以上流径测定所有三种病原体。

当测定引起中耳炎的病原体时，合适样品可以是插入人对象鼻孔的鼻腔或鼻咽药签(swab)。从患者鼻孔中取出药签，接触溶液如运输培养基，以洗脱样品。(例如)通过将药签插入类似于实施例2所述的装置使样品接触测试条，关闭该装置使样品液体转移到测试条的底部传导垫上，从而启动测定液流。然后样品液体接触偶联垫并溶解金标记抗体，使它们转移到硝酸纤维素膜上，过量液体流动到吸收垫中。样品中存在的抗原与金标记的抗体结合形成复合物，该复合物与测试线中固定的抗体结合。在形成足量复合物时就能观察到目测信号(粉红至紫色的线)。足够时间(如15分钟)后，观察测试线，记录结果。

所有标题都是为了便于读者阅读，不应用于限制标题后正文的含义，除非另有说明。可对本发明作出各种改变和偏离，而不背离本发明精神和范围。因此，本发明不应受限于说明书或附图所述的内容，仅受限于权利要求书所列权利。

Claims (68)

1.一种同时测定样品中存在或不存在包括至少一种病毒病原体和至少一种非病毒病原体的病原体组中一个或多个成员的方法，所述方法包括：

对所述病原体组各成员，进行检测衍生自所述成员的至少一个表位的至少一次测定，

其中所述至少一次测定包括：

a)提供能够特异性结合衍生自所述成员的所述至少一个表位的至少一种结合剂；

b)使所述至少一种结合剂直接接触所述样品；

c)使提供的所述至少一种结合剂特异性结合于所述表位并与所述表位形成复合物；和

d)检测所述复合物，如果所述样品中所述成员的浓度大于或等于参比浓度，所述检测为阳性；如果所述成员的浓度小于参比浓度，所述检测为阴性。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品来自怀疑被至少一个所述成员致病的对象。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述阳性检测任选地为定量的。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，阳性检测说明所述对象被作出所述阳性检测的成员致病。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，阴性检测说明所述对象未被作出所述阴性检测的成员致病。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述疾病包括呼吸道感染。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述呼吸道感染包括肺炎。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述呼吸道感染包括流感或流感样疾病。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述呼吸道感染包括鼻窦炎。

10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述呼吸道感染包括支气管炎。

11.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述呼吸道感染包括扁桃体炎。

12.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述呼吸道感染包括咽炎。

13.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述呼吸道感染包括哮吼。

14.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述呼吸道感染包括细支气管炎。

15.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述呼吸道感染包括慢性阻塞性肺病。

16.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述呼吸道感染包括急性中耳炎。

17.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述疾病包括结膜炎。

18.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述疾病包括脑膜炎。

19.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述疾病包括中枢神经系统感染。

20.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述疾病包括肠胃感染。

21.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述疾病包括细菌超感染。

22.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述疾病包括病毒超感染。

23.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一种病毒病原体包括选自以下病毒的至少一种：鼻病毒、流感病毒、人肺炎后病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒、冠状病毒、汉他病毒、巨细胞病毒、柯萨奇病毒、单纯疱疹病毒和艾柯病毒。

24.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一种非病毒病原体包括至少一种细菌病原体。

25.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一种非病毒病原体包括至少一种真核病原体。

26.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一种非病毒病原体包括至少一种细菌病原体和至少一种真核病原体。

27.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一种病毒病原体是选自以下病毒的至少一种：A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒、人肺炎后病毒、A型呼吸道合胞病毒、B型呼吸道合胞病毒、1型人副流感病毒、2型人副流感病毒、3型人副流感病毒、鼻病毒、冠状病毒、腺病毒、汉他病毒和巨细胞病毒，其中所述至少一种非病毒病原体是选自以下病原体的至少一种：肺炎链球菌、肺炎衣原体、粘膜炎摩拉克菌、流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、支原体、肺炎支原体、A族链球菌、酿脓链球菌、肺炎克雷伯菌、假单胞菌、葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、百日咳博德特菌、奈瑟球菌、荚膜组织胞浆菌、粗球孢子菌、皮炎芽生菌、巴西副球孢子菌、假丝酵母、曲霉菌、毛霉菌、新型隐球菌和卡氏肺囊虫。

28.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一种病毒病原体包括以下病毒的至少一种：流感病毒、呼吸道合胞病毒、人肺炎后病毒、副流感病毒、鼻病毒和腺病毒，所述至少一种非病毒病原体包括以下病原体的至少一种：肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、粘膜炎摩拉克菌、肺炎衣原体、副流感嗜血杆菌、奈瑟球菌和A族链球菌。

29.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一种病毒病原体是选自以下病毒的至少一种：腺病毒、疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、肠道病毒、柯萨奇病毒、传染性软疣痘病毒、牛痘痘病毒、流感病毒、EB病毒、副粘病毒和风疹病毒，其中所述至少一种非病毒病原体是选自以下病原体的至少一种：A族链球菌、酿脓链球菌、缓症链球菌、肺炎链球菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、棒状杆菌、嗜血杆菌、流感嗜血杆菌、奈瑟球菌如脑膜炎奈瑟球菌和淋病奈瑟球菌、腔隙莫拉菌、假单胞菌如绿脓假单胞菌，和衣原体。

30.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一种病毒病原体是选自以下病毒的至少一种：疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、肠道病毒、脊髓灰质炎病毒、虫媒病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、艾柯病毒、柯萨奇病毒、人体免疫缺陷病毒和腺病毒，其中所述至少一种非病毒病原体是选自以下病原体的至少一种：b型流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟球菌、B族链球菌、无乳链球菌、酿脓链球菌、非B族链球菌、葡萄球菌、单核细胞增生利斯特菌、肺炎克雷伯菌、粘质沙雷菌、绿脓假单胞菌、屎肠球菌、粪肠球菌、奇异变形杆菌、大肠杆菌、结核分支杆菌、侵肺军团菌和布氏疏螺旋体。

31.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一种病毒病原体是选自以下病毒的至少一种：肠道病毒、艾柯病毒、轮状病毒、杯状病毒、诺罗病毒、诺沃克样病毒、诺沃克病毒、札幌病毒、星状病毒和腺病毒，其中所述至少一种非病毒病原体是选自以下病原体的至少一种：大肠杆菌、大肠杆菌O157：H7、芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、志贺菌、沙门菌、弯曲杆菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、弧菌、单核细胞增生利斯特菌、气单胞菌、耶尔森菌、邻单胞菌、兰氏贾第鞭毛虫、溶组织内阿米巴、冈地弓形体和隐孢子虫。

32.如权利要求1所述的方法，其特征在于，修饰了所述至少一个表位。

33.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一种结合剂包括抗体或抗体片段。

34.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一种结合剂包括官能团或可检测标记。

35.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一种结合剂还能够结合模拟衍生自所述成员的所述至少一个表位的模拟表位。

36.如权利要求1所述的方法，其特征在于，以一种以上形式使用所述至少一种结合剂。

37.如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述测定包括至少一次夹心免疫测定。

38.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测定包括至少一次免疫层析测定。

39.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述至少一次免疫层析测定包括至少一次夹心测定。

40.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测定平行运行。

41.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测定连续运行。

42.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测定同时运行。

43.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测定在单一液流流径中运行。

44.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测定在多股液流流径中运行。

45.一种实施权利要求1所述方法的试剂盒。

46.如权利要求45所述的试剂盒，包括至少一个免疫层析装置。

47.如权利要求45所述的试剂盒，其特征在于，所述测定在单一液流流径中运行。

48.如权利要求45所述的试剂盒，其特征在于，所述测定在多股液流流径中运行。

49.一种实施权利要求27所述方法的试剂盒。

50.如权利要求49所述的试剂盒，包括至少一个免疫层析装置。

51.如权利要求49所述的试剂盒，其特征在于，所述测定在单一液流流径中运行。

52.如权利要求49所述的试剂盒，其特征在于，所述测定在多股液流流径中运行。

53.一种实施权利要求28所述方法的试剂盒。

54.如权利要求53所述的试剂盒，包括至少一个免疫层析装置。

55.如权利要求53所述的试剂盒，其特征在于，所述测定在单一液流流径中运行。

56.如权利要求53所述的试剂盒，其特征在于，所述测定在多股液流流径中运行。

57.一种实施权利要求29所述方法的试剂盒。

58.如权利要求57所述的试剂盒，包括至少一个免疫层析装置。

59.如权利要求57所述的试剂盒，其特征在于，所述测定在单一液流流径中运行。

60.如权利要求57所述的试剂盒，其特征在于，所述测定在多股液流流径中运行。

61.一种实施权利要求30所述方法的试剂盒。

62.如权利要求61所述的试剂盒，包括至少一个免疫层析装置。

63.如权利要求61所述的试剂盒，其特征在于，所述测定在单一液流流径中运行。

64.如权利要求61所述的试剂盒，其特征在于，所述测定在多股液流流径中运行。

65.一种实施权利要求31所述方法的试剂盒。

66.如权利要求65所述的试剂盒，包括至少一个免疫层析装置。

67.如权利要求65所述的试剂盒，其特征在于，所述测定在单一液流流径中运行。

68.如权利要求65所述的试剂盒，其特征在于，所述测定在多股液流流径中运行。

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