CN101603095B

CN101603095B - 贝类gⅰ型扎幌样病毒检测用的引物、探针、检测方法及试剂盒

Info

Publication number: CN101603095B
Application number: CN2009100408382A
Authority: CN
Inventors: 朱家勇; 曾爱华; 金小宝; 禇夫江; 马艳; 梅寒芳
Original assignee: Guangdong Pharmaceutical University
Priority date: 2009-07-03
Filing date: 2009-07-03
Publication date: 2012-07-18
Anticipated expiration: 2029-07-03
Also published as: CN101603095A

Abstract

本发明公开了贝类GI型扎幌样病毒检测用的引物、探针、检测方法及试剂盒。本发明上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；与该引物配合使用的探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，且该探针5’端标记有报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团，上述引物和探针可制备成试剂盒用于贝类GI型扎幌样病毒检测。本发明还公开了一种检测贝类GI型扎幌样病毒的方法，该方法是以样品总RNA为模板，利用上述引物和探针进行实时荧光定量PCR扩增，根据扩增曲线判定样品中是否含有贝类GI型扎幌样病毒。本发明引物和探针特异性好，制备成试剂盒用于贝类GI型扎幌样病毒的检测灵敏度、准确性高；本发明检测方法可以快速直观判断样品是否含有GI型扎幌样病毒，并能准确测定样品中GI型扎幌样病毒的拷贝数含量。

Description

贝类GⅠ型扎幌样病毒检测用的引物、探针、检测方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物检测技术，具体涉及贝类GI型扎幌样病毒的检测。

背景技术

扎幌样病毒(Sapporo-like viruses，SLVs)属于杯状病毒科，是引起人类非菌性急性胃肠炎爆发和流行的重要因素之一，在很多国家均有其爆发流行的相关报道，如日本、越南、泰国、美国和英国等，在我国腹泻人群中也检测出GI和GII两种亚型的扎幌样病毒。目前SLVs还不能进行组织培养，也未能建立合适的动物模型，它的基因序列多变，样本中的病毒含量较低，不易被检测。扎幌样病毒可通过粪口途径在家庭、医院、学校中爆发流行，也可通过人与人接触进行传播。患者感染后，出现腹泻、呕吐和疼痛等症状。生食贝类等水产品是引起扎幌样病毒感染的主要途径之一，因此如果对贝类等水产品进行检测，并对感染的食品源头加以控制，对于保障人民健康有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供贝类GI型扎幌样病毒检测用的引物、探针和试剂盒。

本发明的另一目的在于提供一种贝类GI型扎幌样病毒的检测方法。

本发明目的通过如下方案予以实现：通过分析已报道扎幌样病毒RNA多聚酶与衣壳蛋白的连接区域，分别设计引物和探针序列用于实时荧光定量PCR。上游引物核苷酸序列(SLVs-FP)如SEQ ID NO：1所示，下游引物核苷酸序列(SLVs-RP)如SEQ ID NO：2所示(通用核苷酸符号：y＝c or t；s＝c or g；r＝a or g；h＝a，c or t；v＝a，c or g)；与该引物配合使用的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，且该探针5’端标记有报告基团(如FAM、VIC等)，3’端标记有荧光淬灭基团(如TAMRA等)。以样本总RNA为模板，在50μL反应体系包括：5×荧光定量PCR缓冲液10μL，1μL dNTPs(20ummol/L)，1.5μL引物SLVs-RP(10ummol/L)，1.5μL引物SLVs-FP(10ummol/L)，1μL荧光探针(10ummol/L)，50ng总RNA(3μL)，1μL Taq酶(3U)，用DEPC处理水补充到50μL，进行实时荧光定量PCR扩增，反应条件是：93℃，3min；93℃，30s；53℃，40s共做40个循环。当探针完整的时候，5’端报告基因所发射的荧光能量被3’端淬灭基团吸收，仪器检测不到荧光信号。随着实时荧光定量PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5’→3’外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基因远离淬灭基团，其能量不能被吸收故发出的荧光信号被仪器检测到，每个循环接收采集数据，故每经过一个PCR循环，荧光信号随着目的片段的延伸有一个同步指数增长的过程，反应结束后根据扩增曲线判定结果，从而实现对GI型扎幌样病毒的检测和定量。也可用含有本发明引物和探针的试剂盒通过实时荧光定量PCR检测贝类GI型扎幌样病毒。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明引物和探针特异性好，制备成试剂盒用于贝类GI型扎幌样病毒的检测灵敏度、准确性高；本发明检测方法可以快速直观判断样品是否含有GI型扎幌样病毒，并能准确测定样品中GI型扎幌样病毒的拷贝数含量。

附图说明

图1为实施例3中实时荧光定量PCR检测GI型扎幌样病毒的标准曲线；

图2为实施例4中实时荧光定量PCR检测GI型扎幌样病毒的结果，其中，1为贝类中GI型扎幌样病毒的实时荧光定量PCR扩增结果，2为干净贝类中GI型扎幌样病毒的实时荧光定量PCR扩增结果，3为贝类中诺瓦克样病毒阳性质粒的实时荧光定量PCR扩增结果；

图3为实施例5中实时荧光定量PCR检测GI型扎幌样病毒的灵敏度实验，其中，1表示贝类中GI型扎幌样病毒的量为10⁶拷贝/μL，2表示贝类中GI型扎幌样病毒的量为10⁵拷贝/μL，3表示贝类中GI型扎幌样病毒的量为10⁴拷贝/μL，4表示贝类中GI型扎幌样病毒的量为10³拷贝/μL，5表示贝类中GI型扎幌样病毒的量为10²拷贝/μL，6表示贝类中GI型扎幌样病毒的量为10拷贝/μL，7为阴性对照。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的描述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。

实施例1引物及探针的设计和合成

从GenBank下载GI型扎幌样病毒所有同源基因序列，引物和探针由Invitrogen公司合成。根据与GI型扎幌样病毒标准株(GenBankNo.X86560)的所有同源基因序列，用Bioedit软件进行同源性比对，用primer Express3.0软件，设计出引物及TaqMan探针，扩增目的片段长度为121bp。

上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

与上述引物配合使用的探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。该探针5’端标记有报告FAM荧光染料，3’端标记有淬灭TAMRA荧光染料。

实施例2总RNA的提取

提取步骤如下：

1)取20g污染了病毒的贝类胃、肠组织，加入20mL甘氨酸缓冲液，匀浆器快速匀浆3min；

2)取10mL匀浆液装于离心管中，室温下充分振荡后，4℃6000r/min离心30min；

3)调上清液pH至7.5，加入等体积的8％PEG6000，4℃沉淀4h后，4℃6000r/min离心30min；

4)弃上清，加入10mL pH9.0的PBS振荡；加入等体积氯仿，充分混匀，4℃6000r/min离心30min，弃去沉淀，保留上清液；

5)调节上清液pH值至7.0，再用16％PEG60004℃沉淀2h后，4℃6000r/min离心30min；

6)弃上清，加入1ml的Trizol试剂提取RNA，反应管室温静置5min，加入0.2ml氯仿，置4℃，12000rpm离心15min；

7)取上层水相的1/3体积转入灭菌离心管，加入等体积异丙醇，置-20℃静置2h，然后4℃，12000rpm离心15min，弃去上清；

8)用1ml含75％DEPC的乙醇洗涤沉淀，吹打混匀。置4℃，12000rpm离心5min。吸去大部分乙醇，空气干燥10min，加适量灭菌DEPC双蒸水溶解沉淀，-70℃保存。

实施例3实时荧光定量PCR扩增方法的建立

1、实时荧光定量PCR反应体系

以总RNA为模板，进行实时荧光定量PCR反应，即在50μL反应体系中含：5×定量PCR缓冲液10μL，1μL dNTPs(20ummol/L)，1.5μL引物SLVs-RP(10ummol/L)，1.5μL引物SLVs-FP(10ummol/L)，1μL荧光探针(10ummol/L)，50ng总RNA(3μL)，1μL Taq酶(3U)，并用DEPC处理水补充到50μL。

2、实时荧光定量PCR反应条件

将样品管放入ABI公司PE7000荧光PCR仪后，设置如下条件进行：93℃，3min；93℃，30s；53℃，40s共做40个循环。每个循环结束后采集数据。反应结束后根据扩增曲线和标准曲线判定结果。

3.实时荧光定量PCR标准曲线的建立

将GI型扎幌样病毒121bp基因片段克隆到pcDNAII载体中构建成GI型SLVs的阳性质粒，调整质粒至1×10¹⁰拷贝/μL。然后以10倍系列稀释的阳性质粒为定量阳性标准模板，建立GI型扎幌样病毒的实时荧光定量PCR反应。结果显示在10²～10⁶拷贝范围内GI型扎幌样病毒检测的标准曲线有很好的线性关系(图1)。

实施例4GI型扎幌样病毒实时荧光定量PCR方法的特异性确定

以污染病毒的贝类总RNA为模板，以干净贝类、诺瓦克样病毒阳性质粒为对照，通过实时荧光定量PCR检测荧光强度变化。结果显示，以污染GI型扎幌样病毒的贝类总RNA为模板，通过实时荧光定量PCR检测可观察到明显的荧光强度变化和很好的阳性扩增结果，而干净贝类、诺瓦克样病毒阳性质粒的荧光强度没有变化。提示本发明所建立的实时荧光定量PCR体系对GI型扎幌样病毒有很好的特异性(图2)。

实施例5灵敏度实验

用DEPC处理水分别稀释GI型扎幌样病毒阳性模板，以污染GI型扎幌样病毒的贝类总RNA为模板，通过实时荧光定量PCR检测荧光强度变化。实验结果显示，通过实时荧光定量PCR检测可观察到明显的荧光强度变化和很好的阳性扩增结果，贝类中GI型扎幌样病毒的实时荧光定量PCR动力学曲线显示，浓度在10²拷贝以上的反应体系有明显的荧光增长，而10¹拷贝和阴性对照均无荧光增长，因此该实时荧光定量PCR检测体系的最低检出限为10²拷贝，即其灵敏度为10²拷贝/μL(图3)。

贝类GI型扎幌样病毒检测用的引物、探针、检测方法及试剂盒

SEQUENCE LISTING

<110>广东药学院

<120>贝类GI型扎幌样病毒检测用的引物、探针、检测方法及试剂盒

<130>

<160>3

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

tccaatgtccy ctgasgcaat a 21

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

acgrgttaht gttgvgatga a 21

<210>3

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<200>2

acaggatgca cacgsgaact yttctt 26

Claims

1.一种贝类GI型扎幌样病毒检测用的引物，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.一种与权利要求1所述贝类GI型扎幌样病毒检测用的引物配合使用的探针，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于该探针5’端标记有报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

4.一种贝类GI型扎幌样病毒检测用的试剂盒，其特征在于该试剂盒含有权利要求1所述的引物和权利要求2所述的探针。