CN102827925A

CN102827925A - 一种TaqMan探针荧光RT-PCR检测创伤弧菌的非诊断性方法

Info

Publication number: CN102827925A
Application number: CN2012101227600A
Authority: CN
Inventors: 韩辉; 徐宝梁; 李海山; 胡群; 刘丰; 周蕾
Original assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Current assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2012-04-24
Filing date: 2012-04-24
Publication date: 2012-12-19

Abstract

本发明公开了一种TaqMan探针荧光RT-PCR检测创伤弧菌的非诊断性方法，以创伤弧菌溶血素vvhA基因的DNA序列作为靶序列，比对后选取保守区域，确定vvhA基因的保守序列，设计创伤弧菌实时PCR引物和探针，创伤弧菌实时PCR检测方法利用特异性荧光探针，实行完全闭管式操作，大大减少了扩增产物污染的机会、减少了实验步骤、实验时间和对试剂的消耗，不同于常规PCR，无需电泳鉴定，不易污染环境出现假阳性结果，该方法能快速地检测到致病菌，具有很高的灵敏度、特异度和检测下限，可以用于国境口岸环境水体、水产品以及腹泻病人粪便中创伤弧菌的检测，有很高的应用价值。

Description

一种TaqMan探针荧光RT-PCR检测创伤弧菌的非诊断性方法

技术领域

本发明涉及一种TaqMan探针荧光RT-PCR检测创伤弧菌的非诊断性方法。

背景技术

创伤弧菌(Vibrio vulnificus)是一种革兰氏阴性嗜盐弧菌，广泛的存在于温暖的水体环境中，其在河口、海洋环境里是较常见的致病菌。主要通过污染海产品和感染伤口而感染健康人畜，创伤弧菌能够引起败血症和伤口感染。近年来有由于食用被创伤弧菌污染的海产品而发生胃肠炎的相关报道，主要症状为呕吐、腹泻以及腹部疼痛。由创伤弧菌引起伤口感染的病死率高达50％，由创伤弧菌感染引起败血症的病死率高达75％，尤其是在免疫抑制的病人和体内荷铁量过多的人群中。在腹泻病监测中，常不能从标本中分离到法定传染病中监测管理的甲类和乙类肠道感染病原菌以及沙门菌等，使得对病原的确认带来困难，其中一个原因是缺乏对其它致腹泻病原菌的有效检测手段，并且，随着近年海产品食用量的增加、由创伤弧菌引起病例增加以及创伤弧菌感染的高病死率，迅速建立一种能够快速检测创伤弧菌的方法显得至关重要。

创伤弧菌的常规检测方法有分离培养、生化鉴定以及核酸杂交。随着分子生物学技术的发展，PCR技术以及荧光PCR技术已经被广泛的应用于病原菌的检测。有许多研究介绍了借助常规PCR和(或)实时PCR检测能够作为创伤弧菌生物标记的溶血素基因(V.vulnificus hemolysin A，vvhA)来鉴定创伤弧菌的方法。如Mark S.Campbell根据创伤弧菌溶血素基因(vvhA)建立了基于SYBR Green的实时PCR检测方法，但该方法需要借助溶解曲线来区分特异性扩增和非特异性扩增，特异性不高。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种操作简单、省时、特异性好、灵敏度高的利用TaqMan探针荧光RT-PCR检测创伤弧菌的非诊断性方法。

为实现上述目的，本发明一种TaqMan探针荧光RT-PCR检测创伤弧菌的非诊断性方法，该非诊断性方法包括：

以创伤弧菌溶血素vvhA基因的DNA序列作为靶序列，比对后选取保守区域，确定vvhA基因的保守序列：

tgggtatttg ataagacgaa gttcaaccca atctcttatt ccaacttcaa accgaactat

gacgttttgt acgaagcgcc tgtgtctgaa actggcgtaa cggatttcga gatgggcgtg

aaactcaact atcgtgcacg ctttggtacg gtaatccctt cagcactctt ctcagtttat

ggttctgcgg gctcgtcaac caacagcagt accgtgaaac aacgtattcg catcgactgg

aatcatccac tgtttgaagc ggaagcacac gttacactac aatcactgag caacaacgat

ctctgcctag atgtttatgg tgagaacggt gacaaaacgg ttgcgggtgg ttcggttaac

ggctggagct gtcacggcag ttggaaccaa gtttggggcc tagataaaga agaacgttac

cgtagccgag tggcatccga tcgttgtttg accgtaaacg cagacaaaac gctcacagtc

gaacagtgtg gtgcgaactt agcacagaaa tggtattggg aa；

设计创伤弧菌实时PCR引物和探针：

进一步，所述扩增产物的序列及引物和探针的位置如图8所示。

进一步，所述探针VVH-P的5’端所标记荧光素为FAM，探针3’端连接淬灭基团。

进一步，所述该淬灭基团为BHQ1非荧光淬灭基团。

进一步，所述该非诊断性方法包括步骤：

1)提取细菌染色体DNA；

2)实时荧光RT-PCR反应，配制PCR反应体系，混匀后短暂离心分装到PCR管中；

3)将待测样品加入到反应体系中，进行扩增；

4)在退火阶段收集荧光信号，检测Ct值。

进一步，所述实时荧光RT-PCR反应的体系组分及其体积如下：

循环条件：

进一步，所述引物浓度均为200nmol/L。

进一步，所述探针浓度为100nmol/L。

进一步，反应温度为60℃。

本发明的有益效果在于：创伤弧菌实时PCR检测方法利用特异性荧光探针，实行完全闭管式操作，大大减少了扩增产物污染的机会、减少了实验步骤、实验时间和对试剂的消耗，不同于常规PCR，无需电泳鉴定，不易污染环境出现假阳性结果，该方法能快速地检测到致病菌，具有很高的灵敏度、特异度和检测下限，可以用于国境口岸环境水体、水产品以及腹泻病人粪便中创伤弧菌的检测，有很高的应用价值。

附图说明

图1为不同探针浓度的荧光值图；

图2a为未经增菌粪便标本实时PCR图；

图2b为常规PCR检测下限图；

图3为粪便标本增菌8小时后实时PCR检测下限图；

图4为粪便标本增菌22小时后实时PCR检测下限图；

图5为创伤弧菌实时PCR灵敏度图；

图6为创伤弧菌实时PCR特异度图；

图7为实时PCR DNA检测下限图。

图8为扩增产物的序列及引物和探针的位置图。注：图1中曲线1-4的探针浓度为100nmol/L-400nmol/L；N为阴性对照；

图2a中曲线1-7的浓度分别为8×10⁶CFU/ml-8CFU/ml；

图2b中M为DNA分子量标准；PC为阳性对照；N为阴性对照；

图3中曲线1-7的浓度分别为8×10⁶CFU/ml-8CFU/ml；N为阴性对照；

图4中曲线1-7的浓度分别为8×10⁶CFU/ml-8CFU/ml；N为阴性对照；

图5中N：阴性对照；横坐标为循环数；纵坐标为荧光值；

图6中P：阳性对照；横坐标为循环数；纵坐标为荧光值；

图7中曲线1-8的DNA浓度为10ng/μl-1fg/μl。

具体实施方式

本发明建立了基于TaqMan探针的实时PCR自纯菌和粪便标本中快速检测创伤弧菌的方法，并对该方法进行了优化。在进行引物和探针浓度的优化时，本发明中以产生最小Ct值为依据。所用的DNA聚合酶在60℃时5’→3’外切酶活性最强，且引物的设计是以退火温度60℃为标准，因此本发明未对反应温度等循环参数进行探讨。

本发明用到实验菌株有：创伤弧菌(VV1-VV19)19株、O1群霍乱弧菌32株、O139群霍乱弧菌16株、非O1/非O139群霍乱弧菌17株、拟态弧菌3株、副溶血弧菌25株、嗜水气单胞菌4株、溶藻弧菌1株、麦氏弧菌4株、弗尼斯弧菌1株、河流弧菌15株、少女鱼弧菌1株、类志贺邻单胞菌2株、O157大肠杆菌1株、肠产毒型大肠杆菌(ETEC)1株、沙门菌属细菌10株、志贺菌属细菌10株。以上菌株均经生化和血清学鉴定，为中国检验检疫科学研究院所保存。

实验仪器：Roehe LightCycler荧光PCR仪(瑞士Roche公司)，普通PCR仪(美国Bio-Rad公司)、凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)、NanoDrop紫外分光光度计(美国NanoDrop公司)等。

试剂：细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)；Premix Ex TaqTM(TaqMan实时PCR反应预混液，TaKaRa公司产品)；QIAamp DNA Stool Mini kit(粪便DNA提取试剂盒，Qiagen公司产品)。

具体实验操作步骤如下：

1.用试剂盒提取细菌染色体DNA；

2.实时PCR引物和探针的设计；

1)创伤弧菌溶血素基因(vvhA)保守序列的确定

从GenBank上下载创伤弧菌溶血素基因(vvhA)全部的DNA序列，然后进行序列比对，确定vvhA基因的保守序列：

tgggtatttg ataagacgaa gttcaaccca atctcttatt ccaacttcaa accgaactat

gacgttttgt acgaagcgcc tgtgtctgaa actggcgtaa cggatttcga gatgggcgtg

aaactcaact atcgtgcacg ctttggtacg gtaatccctt cagcactctt ctcagtttat

ggttctgcgg gctcgtcaac caacagcagt accgtgaaac aacgtattcg catcgactgg

aatcatccac tgtttgaagc ggaagcacac gttacactac aatcactgag caacaacgat

ctctgcctag atgtttatgg tgagaacggt gacaaaacgg ttgcgggtgg ttcggttaac

ggctggagct gtcacggcag ttggaaccaa gtttggggcc tagataaaga agaacgttac

cgtagccgag tggcatccga tcgttgtttg accgtaaacg cagacaaaac gctcacagtc

gaacagtgtg gtgcgaactt agcacagaaa tggtattggg aa。

2)引物探针的设计

借助Beacon Designer 7.0软件针对上述保守序列设计引物和探针，如下：

扩增产物的序列及引物和探针的位置如图8所示。

3.实时荧光RT-PCR反应，配制一定组分浓度的20μL PCR反应体系，混匀后短暂离心分装到PCR管中；

4.将待测样品加入到反应体系中，进行扩增；

5.在退火阶段收集荧光信号，检测Ct值；

实时荧光RT-PCR反应的体系组分及其体积如下：

循环条件：

6.创伤弧菌TaqMan探针实时PCR反应参数的优化

1)引物浓度的优化

上下游引物的浓度分别取200nmol/L-700nmol/L 6个浓度梯度，探针浓度保持在100nmol/L。每个浓度梯度做5个平行样。在如下的反应条件下用Roche的LightCycler Real Time PCR扩增仪针对一株创伤弧菌(VV1)的纯培养物DNA提取液进行扩增，

条件如下：

对得到的每个浓度梯度的循环阈值(cycle threshold，Ct)值进行完全随机设计资料的方差分析。

经方差分析后发现，6组浓度梯度的Ct值差异在总体上无统计学意义(表1)，同时考虑到随着引物浓度的增高出现非特异性扩增的可能性就越大，所以选择上下游引物的浓度为200nmol/L。

表16组引物浓度梯度Ct值的比较

2)探针浓度的优化

探针的浓度分别取100nmol/L-400nmol/L 4个浓度梯度，上下游引物的浓度保持在200nmol/L。每个浓度梯度做5个平行样。

反应条件：

对得到的每个浓度梯度的循环阈值值进行完全随机设计资料的方差分析。

经方差分析发现，4组浓度梯度的Ct值差异在总体上具有统计学意义，经SNK法两两比较发现，探针浓度为100nmol/L组总体的Ct值最小，与其他各组的差异具有统计学意义(表2)。同时结合荧光曲线发现，随着探针浓度的升高检测到的荧光值越来越低(图1)。因此，选择探针的浓度为100nmol/L。

表24组探针浓度所得Ct值比较

综上所述，创伤弧菌优化的反应条件为：实时PCR采用20微升反应体系

循环条件为：

在退火阶段检测荧光。

实施例

人工粪便标本中创伤弧菌的检测

①取1g健康人粪便于无菌试管中；

②加入9ml无菌蒸馏水，振荡使其均质化；

③用剪掉尖端部位的枪头吸取200μl粪便，用粪便DNA提取试剂盒提取DNA，作为后续实验的阴性对照；

④将前面所得到的菌液，每个浓度梯度取20μl，加入到180μl均质化的粪便中，制成含创伤弧菌8.0×10⁶CFU/ml-8CFU/ml的7个浓度梯度的人工污染粪便标本，每个浓度梯度做4个平行样；

⑤第一组平行样直接用QIAamp DNA Stool Mini kit提取DNA，然后同时进行实时PCR和常规PCR，以不加菌液的粪便作为阴性对照；

⑥其余3组平行样200μl人工污染粪便标本加入到10ml碱性蛋白胨水中，分别在28℃增菌3小时、8小时和16小时。增菌液按如下方式处理：取1ml增菌液，12000rpm，离心3分钟后弃除上清。沉淀物用1ml无菌生理盐水冲洗，离心弃除上清后向沉淀物加入200μl蒸馏水，用QIAamp DNA Stool Mini kit提取DNA进行实时PCR扩增；

结果，未经增菌处理的人工污染粪便标本的实时PCR检测下限为8×10³CFU/ml(图2a)，常规PCR的检测下限为8×10⁵CFU/ml(图2b)。

人工污染粪便标本增菌3小时后，实时PCR检测体系没有提到对标本的检测下限，实时PCR检测下限依然为8×10³CFU/ml；增菌8小时后，检测下限能达到8CFU/ml(图3)，创伤弧菌8CFU/ml组的Ct值均值为33；增菌12小时后，检测下限依然为8CFU/ml(图4)，创伤弧菌8CFU/ml组的Ct值均值为25。

实施例中使用实时PCR检测方法从粪便中检测创伤弧菌。粪便标本中含有的胆汁酸、胆红素、血红素和碳水复合物等PCR抑制物会抑制PCR反应的进行，使从粪便标本中检测创伤弧菌的灵敏度降低。粪便标本中的灵敏度比纯菌的低了100倍，但比Fukushima建立的从粪便中检测创伤弧菌的灵敏度高。粪便标本经8小时和12小时增菌后，检测下限都能达到初始浓度8CFU/ml，可见从粪便中检测创伤弧菌时，尤其是当粪便标本中含菌量较低时，适当的增菌是非常必要的。

创伤弧菌TaqMan实时PCR实验室内评价

1)灵敏度评价。

用优化了的反应体系检测19株创伤弧菌(VV1-VV19)，结果，除阴性对照外19株创伤弧菌均为阳性(图5)。

2)特异度评价。

用优化了的反应体系检测实验材料中提到的除创伤弧菌以外的16种细菌(O1群霍乱弧菌、O139群霍乱弧菌、非O1/非O139群霍乱弧菌、拟态弧菌、副溶血弧菌、嗜水气单胞菌、溶藻弧菌、麦氏弧菌、弗尼斯弧菌、河流弧菌、少女鱼弧菌、类志贺邻单胞菌、O157大肠杆菌、肠产毒型大肠杆菌(ETEC)、沙门菌属细菌、志贺菌属细菌)，结果除阳性对照(VV1)外其他菌株扩增均为阴性(图6)。所以，创伤弧菌实时PCR检测方法的特异度为100％。

1)灵敏度评价和2)特异度评价中所用到的优化的反应体系为：

实时PCR采用20微升反应体系

循环条件为：

在退火阶段检测荧光。

3)检测下限的评价。

本发明中检测下限的评价包括DNA检测下限的评价和菌液检测下限的评价两部分。

i.DNA检测下限的评价

用NanoDrop测VV1纯培养物DNA提取液的浓度为116ng/μl，然后用三蒸水进行倍比稀释成10ng/μl-1fg/μl，共8个稀释度。每个稀释度取2μl分别进行实时PCR和常规PCR扩增，每个浓度梯度做4个平行样。

结果当DNA的浓度小于1pg/μl时，4个平行样不全扩增。所以，创伤弧菌实时PCR DNA的检测下限为1pg/μl(图7)，而常规PCR的检测下限为10pg/μl。

ii.菌液检测下限的评价

①将在普通琼脂平板上生长的创伤弧菌菌株(VV1)接种于5ml碱性蛋白胨水(APW)，28℃增菌过夜后，进行10倍稀释，依次取8个稀释度的1ml菌液提取DNA；

②菌落计数。采用涂布平板法菌落计数，即分别从上述10⁴、10⁵和10⁶稀释倍数的菌液中取200μl加入到普通琼脂培养基中，再用无菌玻璃刮棒在平板上均匀涂布，平放20-30分钟，培养基倒置放入培养箱中，28℃过夜培养，每个浓度梯度做3个平行样；

结果，10⁴稀释度的菌落数大于300，10⁵和10⁶稀释倍数的菌落数平均分别为171和15个。

所以，菌液的原始浓度为(171×10⁵×5+15×10⁶×5)/2＝8.0×10⁷CFU/ml。

③从上述菌液中每个浓度梯度中取2μl分别进行实时PCR和常规PCR 扩增，每个浓度梯度做4个平行样；

结果，菌液的检测下限为80CFU/ml，而常规PCR菌液的检测下限为8×10³CFU/ml。

上述病原菌DNA是从试剂盒中提取的，本发明公开的检测方法并非以人体和动物为对象，只是为了检测是否具有病原菌，如检测粉末、食品、海关进出口物品等，不是以诊断为目的，不属于疾病的诊断方法。

除非特殊定义，本发明描述所用的术语是在有关技术领域中公知的术语。标准的化学符号及缩写符号可以与其全名互换使用。

除非特殊指明，本发明所用到但未明确阐述或简单阐述的技术和方法是指本技术领域通常使用的技术和方法，可按照本领域公知的技术和方法进行。试剂盒的使用是根据制造商或供应商提供的说明书进行。

Claims

1.一种TaqMan探针荧光RT-PCR检测创伤弧菌的非诊断性方法，其特征在于，该非诊断性方法包括：

tgggtatttg ataagacgaa gttcaaccca atctcttatt ccaacttcaa accgaactat

gacgttttgt acgaagcgcc tgtgtctgaa actggcgtaa cggatttcga gatgggcgtg

aaactcaact atcgtgcacg ctttggtacg gtaatccctt cagcactctt ctcagtttat

ggttctgcgg gctcgtcaac caacagcagt accgtgaaac aacgtattcg catcgactgg

aatcatccac tgtttgaagc ggaagcacac gttacactac aatcactgag caacaacgat

ctctgcctag atgtttatgg tgagaacggt gacaaaacgg ttgcgggtgg ttcggttaac

ggctggagct gtcacggcag ttggaaccaa gtttggggcc tagataaaga agaacgttac

cgtagccgag tggcatccga tcgttgtttg accgtaaacg cagacaaaac gctcacagtc

gaacagtgtg gtgcgaactt agcacagaaa tggtattggg aa；

设计创伤弧菌实时PCR引物和探针：

2.如权利要求1所述的非诊断性方法，其特征在于，所述扩增产物的序列及引物和探针的位置如图8所示。

3.如权利要求1所述的非诊断性方法，其特征在于，所述探针VVH-P的5’端所标记荧光素为FAM，探针3’端连接淬灭基团。

4.如权利要求3所述的非诊断性方法，其特征在于，所述该淬灭基团为BHQ1非荧光淬灭基团。

5.如权利要求1所述的非诊断性方法，其特征在于，所述该非诊断性方法包括步骤：

1)提取细菌染色体DNA；

3)将待测样品加入到反应体系中，进行扩增；

4)在退火阶段收集荧光信号，检测Ct值。

6.如权利要求5所述的非诊断性方法，其特征在于，所述实时荧光RT-PCR反应的体系组分及其体积如下：

循环条件：

7.如权利要求5所述的非诊断性方法，其特征在于，所述VVH-F和VVH-R浓度均为200nmol/L。

8.如权利要求5所述的非诊断性方法，其特征在于，所述VVH-P探针浓度为100nmol/L。

9.如权利要求5所述的非诊断性方法，其特征在于，反应温度为60℃。